ES2582405T3 - Anticuerpos humanos de alta afinidad para la angiopoyetina-2 humana - Google Patents

Anticuerpos humanos de alta afinidad para la angiopoyetina-2 humana

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ES2582405T3
ES2582405T3 ES10737224.5T ES10737224T ES2582405T3 ES 2582405 T3 ES2582405 T3 ES 2582405T3 ES 10737224 T ES10737224 T ES 10737224T ES 2582405 T3 ES2582405 T3 ES 2582405T3
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Abstract

Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (hAng2) con una KD de inferior a 80 pM, pero que no presenta ninguna unión a hAng-1 cuando se prueba en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales y que comprende una CDR-1 de la cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una cadena ligera CDR-1 (LCDR-1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

Description

Anticuerpos humanos de alta afinidad para la angiopoyetina-2 humana
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno, que son específicos para la angiopoyetina-2 (Ang-2).
Antecedentes
La angiogénesis es el proceso biológico por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis aberrante se asocia con varias patologías que incluyen, por ejemplo, retinopatías proliferativas, artritis reumatoide y psoriasis. Además, está bien establecido que la angiogénesis es crítica para el crecimiento y mantenimiento de los tumores. La angiopoyetina-2 (Ang-2) es un ligando para el receptor Tie-2 (Tie-2) y se ha demostrado que desempeña una función en la angiogénesis. La Ang-2 también se denomina en la técnica ligando Tie-2. (Documento US 5.643.755; Yancopoulos et al., 2000, Nature 407:242-248).
Los anticuerpos y otros inhibidores peptídicos que se unen a la Ang-2 se mencionan en los documentos US 6.166.185; 7.521.053; 7.205.275; 2006/0018909 y 2006/0246071. Existe la necesidad en la técnica de novedosos agentes moduladores de la Ang-2, incluyendo anticuerpos para Ang-2, que puedan usarse para tratar enfermedades y afecciones causadas o agravadas por la angiogénesis.
El documento US 2006/018909 desvela agentes de unión específica, tales como anticuerpos completamente humanos, que se unen a la angiopoyetina-2.
El documento WO 2010/0695332 también desvela anticuerpos contra la angiopoyetina-2 humana.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos humanos como se definen en las reivindicaciones que se unen a la Ang-2 humana. Los presentes inventores, en vista de diferentes líneas de datos e investigación, han reconocido la necesidad de inhibidores de la Ang-2 que no se unan a ni antagonicen la molécula relacionada Ang-1. Por ejemplo, estudios previos han demostrado o sugerido una función beneficiosa de la Ang-1 en la hemostasia (véase, por ejemplo, Li et al., 2001, Thrombosis and Haemostasis 85:191-374) y en la protección de la vasculatura adulta frente a la fuga de plasma (véase, por ejemplo, Thurston et al., 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston et al., 1999, Science 286:2511-2514). Por tanto, los presentes inventores reconocen que, en ciertas situaciones terapéuticas antiangiogénicas, puede ser beneficioso preservar la actividad de la Ang-1. Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 (hAng2) con una KD inferior a 80 pM, pero no presenta ninguna unión a hAng-1 cuando se prueba en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales y que comprende una CDR-1 de la cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una CDR-1 de la cadena ligera (LCDR-1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
16. La presente invención también incluye anticuerpos que bloquean la interacción entre la Ang-2 y su receptor Tie2, pero que no bloquean sustancialmente la interacción entre Ang-1 y Tie-2. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir las actividades de promoción de la angiogénesis de la Ang-2 y para tratar enfermedades y trastornos causados por o relacionados con el proceso de la angiogénesis.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 o lgG4) o pueden comprender solamente una porción de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab’)2 o scFv), y pueden estar modificados para afectar la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 514 y 516, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%
o al menos el 99 º% de identidad de secuencia. El anticuerpo o porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266 y 434.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que comprenden una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500 y 504, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º% o al menos el 99 º% de identidad de secuencia. El anticuerpo o porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20, 44, 68, 164, 212, 274 y 442.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 y 502/504. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una HCVR y LCVR seleccionada de los pares de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 y 434/442.
También en el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio CDR3 de la cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488 y 512, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º% o al menos el 99 º% de identidad de secuencias; y un dominio CDR3 de la cadena ligera (LCDR3) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472 y 496, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º% o al menos el 99 º% de identidad de secuencias.
El anticuerpo o porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 296/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472 y 488/496. El anticuerpo o porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender un par de secuencia de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280 y 440/448. Ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-Ang-2 que tienen estos pares de HCDR3/LCDR3 son los anticuerpos designados H1H685, H1H690, H1H691, H1H696, H1H706, H1M724 y H2M744, respectivamente.
También en el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden además un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484 y 508, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%
o al menos el 99 º% de identidad de secuencias; un dominio CDR2 de la cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486 y 510, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º% o al menos el 99 º% de identidad de secuencias; dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468 y 492, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%
o al menos el 99 º% de identidad de secuencias; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470 y 494, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º% o al menos el 99 º% de identidad de secuencias.
Ciertos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno a modo de ejemplo no limitantes comprenden dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8,12,14 y 16 (por ejemplo, H1H685); (ii) SEQ ID NO: 28, 30, 32, 36, 38 y 40 (por ejemplo, H1H690); (iii) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 y 64 (por ejemplo, H1H691); (iv) SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 y 160 (por ejemplo, H1H696); (v) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 y 208 (por ejemplo, H1H706); (vi) SEQ ID NO: 268, 270, 272, 276, 278 y 280 (por ejemplo, H1M724); y (vii) SEQ ID NO: 436, 438, 440, 444, 446 y 448 (por ejemplo, H2M744).
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo que se unen específicamente a Ang-2, en el que el anticuerpo o fragmento comprende dominios CDR de la cadena pesada y ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) contenidos dentro de secuencias de dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164,
166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 y 502/504. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender las secuencias de CDR contenidas dentro de HCVR y LCVR seleccionadas de los pares de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 y 434/442.
También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-Ang-2 o fragmentos de los mismos. También se describen en el presente documento vectores de expresión recombinantes que llevan los ácidos nucleicos, y células huésped en las que tales vectores se han introducido, ya que son métodos de producción de los anticuerpos cultivando las células huésped en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos, y recuperando los anticuerpos producidos.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una HCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, ,433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 513 y 515, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos 99 º% de identidad a las mismas. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una HCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 41, 65, 161, 209, 265 y 433.
También en el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una LCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499 y 503, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos 99 º% de identidad a las mismas. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender una LCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211, 273 y 441.
En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439, 463, 487 y 511, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos el 99 º% de identidad a las mismas; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471 y 495, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos el 99 º% de identidad a las mismas. El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender secuencias de HCDR3 y LCDR3 codificadas por los pares de secuencias de ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279 y 439/447.
También en el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden además: un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483 y 507, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al el menos 99 º% de identidad a las mismas; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485 y 509, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos el 99 º% de identidad a las mismas; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467 y 491, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos el 99 º% de identidad a las mismas; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469 y 493, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos el 90 º%, al menos el 95 º%, al menos el 98 º%, o al menos el 99 º% de identidad a las mismas.
El anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender las secuencias de CDR de la cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 17 y 19; SEQ ID NO: 41 y 43; SEQ ID NO: 65 y 67; SEQ ID NO: 161 y 163; SEQ ID NO: 209 y 211; SEQ ID NO: 265 y 273; o SEQ ID NO: 433 y 441.
La invención incluye anticuerpos anti-Ang-2 que tienen un patrón de glucosilación modificada. En algunas aplicaciones puede ser útil la modificación para eliminar los sitios de glucosilación no deseable. Por ejemplo, la presente invención engloba versiones modificadas de cualquier anticuerpo expuesto en el presente documento en el
que la versión modificada carece de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones puede realizarse la modificación de la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o un fragmento del mismo como se define en las reivindicaciones que se une específicamente a la Ang-2 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención incluye una composición que es una combinación de un anticuerpo como se define en las reivindicaciones y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con un anticuerpo como se define en las reivindicaciones. Agentes a modo de ejemplo que pueden combinarse ventajosamente con un inhibidor de la Ang-2 incluyen, sin limitación, cualquier agente que inhiba o reduzca la angiogénesis, otros agentes terapéuticos del cáncer, agentes antiinflamatorios, inhibidores de citocinas, inhibidores del factor de crecimiento, factores anti-hematopoyéticos, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), agentes antivirales y antibióticos.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la actividad de la Ang-2 usando el anticuerpo anti-Ang2 o porción de unión al antígeno del anticuerpo de la invención, en el que los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado puede ser cualquier enfermedad o afección que se alivia, mejora, inhibe o previene mediante la eliminación, inhibición o reducción de la actividad de la Ang-2. Preferiblemente, el anticuerpo anti-Ang-2 o fragmento de anticuerpo de la invención es útil para tratar cualquier enfermedad o afección causada, asociada a o perpetuada por el proceso de la angiogénesis. Los anticuerpos anti-Ang-2 o porciones de unión al antígeno de los mismos son útiles para el tratamiento del cáncer. En el contexto de las terapias del cáncer, los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención o porciones de unión al antígeno de los mismos pueden administrarse solos o en combinación con otros anticuerpos terapéuticos anti-cáncer, agentes quimioterapéuticos y/o radioterapia. Los anticuerpos anti-Ang-2 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también son útiles para el tratamiento de uno o más trastornos oculares, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, etc., y/o una o más enfermedades inflamatorias o infecciosas.
En particular, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene:
(a)
un tumor; o
(b)
una enfermedad ocular asociada a la angiogénesis.
La invención también proporciona el uso del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno como se define en las reivindicaciones en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene:
(a)
un tumor; o
(b)
una enfermedad ocular asociada a la angiogénesis.
Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es un alineamiento de los últimos 88 aminoácidos del extremo C de la Ang-2 humana (residuos 409 a 496 de la SEQ ID NO: 518) con la secuencia de aminoácidos correspondiente de la Ang-1 humana (SEQ ID NO: 531). Los residuos que difieren entre hAng-1 y hAng-2 se indican por el texto blanco y el sombreado negro. Los asteriscos (*) indican los aminoácidos de la hAng-2 que se mostró que interaccionaron con Tie-2 humano mediante análisis de la estructura cristalina. Véase Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (2006). Los triángulos (▲) indican las posiciones de los aminoácidos que interaccionan con Tie-2 que difieren entre hAng-2 y hAng-1. La Fig. 2 (Paneles A-C) representa los resultados de transferencias Western que ilustran el grado al que las moléculas de unión a la Ang-2 inhiben, o dejan de inhibir, la fosforilación de Tie-2 inducida por la Ang-1. La Fig. 3 es un resumen del experimento de unión del mutante puntual Ang-2FD-mFc del Ejemplo 13, que muestra los cambios de aminoácidos que produjeron una reducción superior a cinco veces en T½ de disociación (representada por círculos sólidos ●) en relación con el no mutante, para los diferentes anticuerpos y pepticuerpos probados.
Descripción detallada
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término “angiopoyetina-2” o “Ang-2”, a menos que se especifique como que es de una especie no humana (por ejemplo, “Ang-2 de ratón”, “Ang-2 de mono”, etc.), se refiere a la Ang-2
humana o a un fragmento biológicamente activo de la misma (por ejemplo, un fragmento de la proteína Ang-2 que es capaz de inducir la angiogénesis in vitro o in vivo). La Ang-2 humana se codifica por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO: 517 y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 518. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas Ang-2 de ratón y de mono están disponibles de la base de datos de secuencias de proteínas NCBI con los N.º de acceso NP_031452 y BAE89705.1, respectivamente.
El término “angiopoyetina-1” o “Ang-1”, a menos que se especifique como que es una especie no humana (por ejemplo, “Ang-1 de ratón”, “Ang-1 de mono”, etc.), se refiere a la Ang-1 humana o a un fragmento biológicamente activo de la misma. La Ang-1 humana tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la base de datos de secuencias de proteínas NCBI con el N.º de acceso AAB50557. El término “Tie-2” (también denominado en la técnica “TEK”), a menos que se especifique como que es de una especie no humana (por ejemplo, “ Tie-2 de ratón”, “ Tie-2 de mono”, etc.), se refiere a Tie-2 humano o a un fragmento biológicamente activo del mismo. Tie-2 humano tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en la base de datos de secuencias de proteínas NCBI con el N.º de acceso AAA61130.
El término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL pueden dividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (las CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-Ang-2 (o porción de unión al antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificadas natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
El término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión al antígeno de las moléculas de anticuerpo completo. Los términos “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo, “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo, y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína que existe de forma natural, obtenible enzimáticamente, sintético o de ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completo usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión del ADN que codifica los dominios variables y opcionalmente constantes del anticuerpo. Tal ADN es conocido y/o es fácilmente obtenible, por ejemplo, de fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de fago-anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede ser secuenciado y manipulado químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para ordenar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.
Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada). Otras moléculas de ingeniería, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos también están englobadas dentro de la expresión “fragmento de unión al antígeno” como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que es adyacente a o en marco con una o más secuencias de la región estructural. En los fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio VH asociado a un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados el uno con relación al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones a modo de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones a modo de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar o bien enlazados
directamente uno a otro o bien pueden estar enlazados mediante una región bisagra o de conector completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen un enlace flexible o semi-flexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de los dominios variables y constantes enumerados antes en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, por enlace(s) disulfuro).
Al igual que con las moléculas de anticuerpo completo, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión al antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente sobre el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento, pueden adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de las células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si es deseable o no que el anticuerpo medie en la citotoxicidad.
El término “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, no pretende incluir los anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias de la región estructural humana.
El término “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante (descrito más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de la inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que implica el corte y empalme de secuencias del gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercadenas de cadenas pesadas. En una segunda forma, los dímeros no están enlazados mediante enlaces disulfuro intercadenas y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semi-anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diferentes isotipos de IgG intacta se debe a, pero no se limita, a diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una simple sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de lgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta niveles normalmente observados usando una bisagra de lgG1 humana. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, CH2 o CH3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Un “anticuerpo aislado”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la Ang-2 humana o a un fragmento de la Ang-2 humana está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de la Ang-2 humana). El término “que se une específicamente” o similares significa que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo forma un
complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. Las uniones específicas pueden caracterizarse por una KD de aproximadamente 1x10-8 M o menos. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente o no son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmones superficiales, y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la Ang-2 humana, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas de Ang-2 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o de productos químicos.
Un anticuerpo “neutralizante” o “bloqueante”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a la Ang-2 bloquea la interacción entre la Ang-2 y su receptor (Tie-2) y/o produce la inhibición de al menos una función biológica de la Ang-2. No es necesario que la inhibición causada por un anticuerpo neutralizante o bloqueante de la Ang-2 sea completa, siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. Ensayos a modo de ejemplo para detectar la inhibición de la Ang-2 se describen en otro lugar en el presente documento.
Los anticuerpos anti-Ang-2 humana completos desvelados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones estructurales y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes. Tales mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con las secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, de las bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. En el presente documento se describen anticuerpos, y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones estructurales y/o CDR se retro-mutan hasta el (los) residuo(s) de la línea germinal correspondiente(s) o hasta una sustitución de aminoácidos conservativa (natural o no natural) del (de los) residuo(s) de la línea germinal correspondiente(s) (tales cambios de secuencia se denominan en el presente documento “retro-mutaciones de la línea germinal”). Un experto habitual en la técnica, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que comprendan una o más retro-mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. Todos los residuos de las regiones estructurales y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL pueden retro-mutarse a la secuencia de la línea germinal. Alternativamente, solamente ciertos residuos se retro-mutan a la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, solamente los residuos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o solamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. Además, los anticuerpos pueden contener cualquier combinación de dos o más retro-mutaciones a la línea germinal dentro de las regiones estructurales y/o CDR, es decir, en los que ciertos residuos individuales se retro-mutan a la secuencia de la línea germinal mientras que ciertos otros residuos que difieren de la secuencia de la línea germinal se mantienen. Una vez obtenidos, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno que contienen una o más retro-mutaciones a la línea germinal pueden probarse fácilmente para una o más propiedades deseadas tales como especificidad de unión mejorada, aumento de la afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según el caso), reducción de la inmunogenicidad, etc.
También se describen en el presente documento anticuerpos anti-Ang-2 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, se contemplan anticuerpos anti-Ang-2 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR, por ejemplo, con 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos con relación a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 con 8 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 con 6 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 con 4 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 con 2 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 con 8 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 con 6 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 con 4 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 con 2 o menos sustituciones conservativas de aminoácidos.
El término “resonancia de plasmones superficiales”, como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences división de GE Healthcare, Piscataway, NJ).
El término “KD”, como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término “epítopo” se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión al antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como un parátope. Un antígeno individual puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas de un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser tanto conformacionales como lineales. Un epítopo conformacional se produce por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos a partir de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es aquel producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir residuos de sacáridos, grupos fosforilo
o grupos sulfonilo del antígeno.
El término “identidad sustancial” o “sustancialmente idéntico”, cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de manera óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay identidad de la secuencia nucleotídica en al menos aproximadamente el 95 º%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 96 º%, 97 º%, 98 º% o el 99 º% de las bases nucleotídicas, como se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de la secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se trata más adelante. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia, en ciertos casos, puede codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Como se aplica a polipéptidos, el término “similitud sustancial” o “sustancialmente similar” significa que dos secuencias peptídicas, cuando están alineadas de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 95 º% de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos el 98 º% o el 99 º% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Una “sustitución conservativa de aminoácido” es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácido no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren una de la otra por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad o grado de similitud de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina;
(3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz PAM250 de verosimilitud logarítmica desvelada en Gonnet et al. (1992) Science
256: 1443-1445. Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz PAM250 de verosimilitud logarítmica.
La similitud de secuencia para los polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente usando un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de similitud asignada a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre los polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína no mutante y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También pueden compararse secuencias polipeptídicas usando FASTA usando los parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda e investigación (Pearson (2000) arriba). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Preparación de anticuerpos humanos
Se conocen en la técnica métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales humanos completos. Puede usarse cualquiera de tales métodos conocidos en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unen específicamente a la Ang-2 humana y que poseen una o más de las características de unión al antígeno y/o funcionales de cualquiera de los anticuerpos anti-Ang-2 a modo de ejemplo desvelados en el presente documento.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad para la Ang-2 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental más adelante, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo humano completo de la invención, por ejemplo, lgG1 o lgG4 no mutante o modificado. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, la unión al antígeno con alta afinidad y las características de especificidad por diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-Ang-2 y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden englobar proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que retienen la capacidad de unirse a la Ang-2 humana. Tales anticuerpos de variante y fragmentos de anticuerpo comprenden una
o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia parental, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifica el anticuerpo anti-Ang-2 pueden englobar secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-Ang-2 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-Ang-2 o fragmento de anticuerpo de la invención. Ejemplos de tales secuencias de aminoácidos de variante y de ADN se han se tratado anteriormente.
Dos proteínas de unión al antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran en la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en dosis única o bien en dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y también pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en la etiqueta, no son esenciales para conseguir concentraciones eficaces de fármaco en el cuerpo, por ejemplo, en el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el medicamento particular estudiado.
Dos proteínas de unión al antígeno pueden ser bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
Dos proteínas de unión al antígeno pueden ser bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin que se espere un aumento del riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o una disminución de la eficacia, en comparación con la terapia continuada sin tal cambio.
Dos proteínas de unión al antígeno pueden ser bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, hasta el punto que tales mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en los que la concentración de anticuerpo o sus metabolitos se mide en la sangre, plasma, suero, u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad humana in vivo; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en los que el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) se mide en función del tiempo; y (d) un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Pueden construirse variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención, por ejemplo, haciendo diferentes sustituciones de residuos o secuencias o delecionando residuos terminales o internos o secuencias que no son necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse o reemplazarse residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización.
Características biológicas y terapéuticas de los anticuerpos
Los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a la Ang-2 humana con una KD inferior a 50 pM, y en ciertas realizaciones con una KD inferior a 40 pM, cuando se mide por unión al antígeno tanto inmovilizado en fase sólida como en fase en solución.
Además, los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención presentan una o más de las siguientes características: (1) capacidad para unirse a la Ang-2 humana pero no a la Ang-2 de ratón; (2) capacidad para unirse a la Ang-2 humana y a la Ang-2 de ratón; (3) capacidad para unirse a la Ang-2 humana pero no a las Ang-1, -3 o -4 humanas; (4) capacidad para unirse a la Ang-2 humana pero no a las Ang-1, -3 o -4 de ratón; (5) capacidad para unirse a la Ang-2
humana y a las Ang-1, -3 o -4; humanas; (6) capacidad para unirse a la Ang-2 humana y a las Ang-1, -3 o -4 de ratón; (7) capacidad para bloquear la unión de la Ang-2 humana a Tie-2 humano; (8) capacidad para bloquear la unión de la Ang-2 humana a Tie-2 de ratón; (9) capacidad para bloquear la unión de la Ang-2 de ratón a Tie-2 humano; (10) capacidad para bloquear la unión de la Ang-2 de ratón a Tie-2 de ratón; (11) capacidad para bloquear la unión de la Ang-1 humana a Tie-2 humano; (12) capacidad para bloquear la unión de la Ang-1 humana a Tie-2 de ratón; (13) capacidad para bloquear la unión de la Ang-1 de ratón a Tie-2 humano; (14) capacidad para bloquear la unión de la Ang-1 de ratón a Tie-2 de ratón; (15) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 humano inducida por la Ang-2 humana; (16) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 de ratón inducida por la Ang-2 humana; (17) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 humano inducida por la Ang-2 de ratón; (18) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 de ratón inducida por la Ang-2 de ratón; (19) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 humano inducida por la Ang-1 humana; (20) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 de ratón inducida por la Ang-1 humana; (21) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 humano inducida por la Ang-1 de ratón; (22) capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2 de ratón inducida por la Ang-1 de ratón; (23) capacidad para inhibir in vivo la angiogénesis en un modelo experimental (por ejemplo, angiogénesis inducida por un tampón Matrigel que contiene células MCF-7 implantadas subcutáneamente en ratones desnudos); y/o (24) capacidad para inhibir o disminuir el volumen de un tumor en un modelo de xenoinjerto de ratón.
La presente invención incluye también anticuerpos que se unen con alta afinidad a una construcción que comprende el dominio tipo fibronectina de la Ang-2, pero carece del dominio de bobina en espiral del extremo N de la Ang-2 (tales construcciones se denominan en el presente documento “Ang-2FD”). Construcciones Ang-2FD a modo de ejemplo incluyen Ang-2-FD humana (SEQ ID NO: 519), Ang-2FD de ratón (SEQ ID NO: 520) y Ang-2FD de mono (SEQ ID NO: 521). Las construcciones Ang-2FD humanas, de ratón y de mono pueden ser monoméricas o diméricas. Las construcciones Ang-2FD también pueden incluir otras secuencias de aminoácidos no Ang-2 tales como un dominio Fc humano o de ratón unido a las moléculas de Ang-2FD. Otra construcción Ang-2FD a modo de ejemplo se denomina en el presente documento “hBA2” (o “Ang2 de lazo” humana) que es un tetrámero de los dominios tipo fibrinógeno de la Ang-2 humana asociados entre sí mediante un dominio Fc humano o de ratón para formar una configuración tipo corbata de lazo. Normalmente, hBA2 consiste en dos dímeros de Ang-2, en el que cada dímero de Ang-2 contiene dos dominios tipo fibronectina de Ang-2 conectados entre sí mediante un dominio Fc. Componentes de hBA2 a modo de ejemplo incluyen los polipéptidos designados hBA2-hlgG1 (SEQ ID NO: 522) y hBA2-mlgG2a (SEQ ID NO: 523). Inesperadamente, se encontró que ciertos anticuerpos anti-Ang-2 de la presente invención se unían a las construcciones Ang-2FD con afinidades mucho más altas que un anticuerpo de control de Ang-2 conocido (véanse los ejemplos expuestos en el presente documento).
La unión de alta afinidad, en el contexto de la unión de un anticuerpo anti-Ang-2 a una construcción Ang-2FD dimérica humana o de ratón, significa que el anticuerpo anti-Ang-2 se une a la Ang-2FD dimérica humana o de ratón con una KD inferior a 300 pM. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 que se unen con alta afinidad a la Ang-2FD dimérica humana o de ratón incluyen anticuerpos que se unen a la Ang-2-FD dimérica humana o de ratón con una KD inferior a 300 pM, inferior a 250 pM, inferior a 200 pM, inferior a 190 pM, inferior a 180 pM, inferior a 170 pM, inferior a 160 pM, inferior a 150 pM, inferior a 140 pM, inferior a 130 pM, inferior a 120 pM, inferior a 110 pM, inferior a 100 pM, inferior a 90 pM, inferior a 80 pM, inferior a 70 pM, inferior a 60 pM o inferior a 50 pM, como se mide a 25 ºC en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales.
La unión de alta afinidad, en el contexto de la unión de un anticuerpo anti-Ang-2 a una construcción Ang-2FD dimérica de mono, significa que el anticuerpo anti-Ang-2 se une a la Ang-2FD dimérica de mono con una KD inferior a 500 pM. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 que se unen con alta afinidad a la Ang-2FD dimérica de mono incluyen anticuerpos que se unen a la Ang-2-FD de mono con una KD inferior a 500 pM, inferior a 450 pM, inferior a 400 pM, inferior a 350 pM, inferior a 300 pM, inferior a 250 pM, inferior a 200 pM, inferior a 190 pM, inferior a 180 pM, inferior a 170 pM, inferior a 160 pM, inferior a 150 pM, inferior a 140 pM, inferior a 130 pM, inferior a 120 pM, inferior a 110 pM, inferior a 100 pM, inferior a 90 pM, o inferior a 80 pM, como se mide a 25 ºC en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales.
La unión de alta afinidad, en el contexto de la unión de un anticuerpo anti-Ang-2 a una construcción Ang-2FD monomérica humana, significa que el anticuerpo anti-Ang2 se une a la Ang-2FD monomérica humana con una KD inferior a 40 nM. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 que se unen con alta afinidad a la Ang-2FD monomérica humana incluyen anticuerpos que se unen a la Ang-2-FD monomérica humana con una KD inferior a 40 nM, inferior a 30 nM, inferior a 25 nM, inferior a 20 nM, inferior a 15 nM, inferior a 10 nM, inferior a 9 nM, inferior a 8 nM, inferior a 7 nM, inferior a 6 nM, inferior a 5 nM, inferior a 4 nM, inferior a 3 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,9 nM, inferior a 0,8 nM, inferior a 0,7 nM, o inferior a 0,6 nM, como se mide a 25 ºC en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales.
La unión de alta afinidad, en el contexto de la unión de un anticuerpo anti-Ang-2 a una construcción hBA2, significa que el anticuerpo anti-Ang-2 se une a la hBA2 con una KD inferior a 80 pM. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 que se unen con alta afinidad a hBA2 incluyen anticuerpos que se unen a hBA2 con una KD inferior a 80 pM, inferior a 75 pM, inferior a 70 pM, inferior a 65 pM, inferior a 60 pM, inferior a 55 pM, inferior a 50 pM, inferior a 45 pM, inferior a 40 pM, inferior a 35 pM, inferior a 30 pM, inferior a 25 pM, inferior a 20 pM, inferior a 18 pM, inferior a 16 pM, inferior a 14 pM, o inferior a 12 pM, como se mide a 25 ºC en un ensayo de resonancia de plasmones
superficiales.
Los anticuerpos de la presente invención se unen a la Ang-2, pero que no se unen sustancialmente a la Ang-1. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo “no se une sustancialmente a la Ang-1” si el anticuerpo, cuando se prueba para la unión a la Ang-1 en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales en el que el anticuerpo es capturado sobre una superficie y se inyecta una Ang-1 humana no mutante de longitud completa a una concentración de aproximadamente 25 nM sobre la superficie del anticuerpo capturado a un caudal de aproximadamente 60 µl/min durante aproximadamente 3 minutos a 25 ºC, presenta una KD superior a aproximadamente 1 nM, por ejemplo, una KD superior a aproximadamente 5 nM, superior a aproximadamente 10 nM, superior a aproximadamente 50 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 150 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 250 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 350 nM, superior a aproximadamente 400 nM, superior a aproximadamente 450 nM, superior a aproximadamente 500 nM, o más. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). En la presente invención, un anticuerpo “no se une sustancialmente a la Ang-1” si el anticuerpo deja de presentar unión a la Ang-1 cuando se prueba en un ensayo tal o equivalente del mismo.
La presente invención incluye también anticuerpos que bloquean la unión de la Ang-2 a Tie-2, pero que no bloquean sustancialmente la unión de la Ang-1 a Tie-2. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo “no bloquea sustancialmente la unión de la Ang-1 a Tie-2” si, cuando el anticuerpo se premezcla con el antígeno de Ang-1 a una relación de aproximadamente 100:1 (anticuerpo:antígeno) y se deja incubar a 25 ºC durante aproximadamente 60 minutos y después se prueba la mezcla equilibrada para la unión a Tie-2 por resonancia de plasmones superficiales sobre una superficie recubierta de Tie-2 (5 µl/min durante 5 min a 25 ºC), la cantidad de Ang-1 unida a Tie-2 es al menos el 50 º% de la cantidad de Ang-1 unida a Tie-2 en presencia de una molécula de control irrelevante. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 6). Por ejemplo, si la cantidad de Ang-1 unida a Tie-2 tras la preincubación con un anticuerpo es al menos aproximadamente el 50 º%, al menos el aproximadamente el 55 º%, al menos el aproximadamente el 60 º%, al menos el aproximadamente el 65 º%, al menos el aproximadamente el 70 º%, al menos el aproximadamente el 75 º%, al menos el aproximadamente el 80 º%, al menos el aproximadamente el 85 º%, al menos el aproximadamente el 90 º%, al menos el aproximadamente el 95 º%, o aproximadamente el 100 º% de la cantidad de Ang-1 que se une a Tie-2 tras la preincubación con una molécula de control irrelevante en las condiciones experimentales indicadas antes, entonces se considera que el anticuerpo “no bloquea sustancialmente la unión de la Ang-1 a Tie-2”.
Además, la presente invención incluye anticuerpos que bloquean o atenúan sustancialmente una actividad biológica de la Ang-2 (por ejemplo, la fosforilación de Tie-2 mediada por la Ang-2; la angiogénesis inducida por la Ang-2; etc.), pero no bloquean ni atenúan sustancialmente la actividad biológica correspondiente de la Ang-1 (por ejemplo, la fosforilación de Tie-2 mediada por la Ang-1; la angiogénesis inducida por la Ang1; etc.). Ensayos y pruebas útiles para determinar si un anticuerpo satisface o no una o más de las características enumeradas antes serán fácilmente conocidos y fácilmente puestos en práctica por los expertos habituales en la materia y/o pueden ser completamente establecidos a partir de la presente divulgación. Por ejemplo, los procedimientos experimentales detallados a continuación pueden usarse para determinar si un anticuerpo dado se une o no se une a la Ang-2 y/o a la Ang-1; bloquea o no bloquea la unión de la Ang-2 y/o de la Ang-1 a Tie-2; inhibe o no inhibe la fosforilación de Tie-2 mediada por la Ang-2y/o la Ang-1; etc.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
Para seleccionar anticuerpos que se unen a un epítopo particular (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de IgE a su receptor de alta afinidad), puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en “Antibodies,” Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen mutantes de barrido con alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o análisis por escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
El término “epítopo” se refiere a un sitio sobre un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T. Pueden formarse epítopos de linfocitos B tanto a partir tanto de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son normalmente retenidos por exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.
El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpo basado en la estructura del antígeno (ASAP), es un método que clasifica grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos frente al mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a las superficies del antígeno modificadas química o enzimáticamente (documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único bien claramente diferente de o bien parcialmente solapante con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, tal que la caracterización pueda
basarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado del hibridoma, el MAP puede facilitar la identificación de clones raros de hibridoma que producen mAb que tienen las características deseadas. El MAP puede usarse para clasificar los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
Los anticuerpos anti-Ang-2 pueden unirse a un epítopo dentro del dominio de bobina en espiral del extremo amino o dentro del dominio tipo fibrinógeno del extremo carboxi (“FD”). Los anticuerpos anti-Ang-2 y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la invención se unen a un epítopo dentro del FD.
Se han determinado los aminoácidos dentro del FD de Ang-2 que interaccionan con Tie-2 a partir del análisis de la estructura cristalina. Véase Barton et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (Mayo de 2006). Con respecto a los anticuerpos que bloquean la unión de Ang-2 a Tie-2, pero que no bloquean sustancialmente la unión de Ang-1 a Tie2 (por ejemplo, H1H685P, véanse los Ejemplos 5 y 6 más adelante), el epítopo al que se unen tales anticuerpos puede incluir uno o más aminoácidos de Ang-2 que (a) interaccionan con Tie-2 y (b) no son idénticos al aminoácido correspondiente en Ang-1. (Véase la Figura 1). Así, el epítopo al que se unen los anticuerpos preferenciales de Ang2 puede incluir uno o más de los siguientes aminoácidos de hAng-2 (SEQ ID NO: 518): S-417; K-432; I-434; N-467; F-469; Y-475; o S-480. Por ejemplo, los presentes inventores han descubierto que los anticuerpos que interaccionan con los aminoácidos F-469, Y-475 y S-480 de Ang-2 (SEQ ID NO: 518) interaccionan preferencialmente con Ang-2 con respecto a Ang-1, y esta unión preferencial puede tener beneficios terapéuticos. Así, los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención, que se unen específicamente a la angiopoyetina-2 humana (hAng-2), pero que no se unen sustancialmente a la hAng-1, se unen a un epítopo sobre hAng-2 (SEQ ID NO: 518) que comprende los aminoácidos F-469, Y-475 y S-480. Similarmente, la presente invención incluye anticuerpos anti-Ang-2 que bloquean la unión de hAng-2 a hTie-2, pero que no bloquean sustancialmente la unión de hAng-1 a hTie-2, en el que los anticuerpos se unen a un epítopo sobre hAng-2 (SEQ ID NO: 518) que comprende los aminoácidos F-469, Y-475 y S-480.
Delecionados
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo o no, o compite por la unión con un anticuerpo anti-Ang-2 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Ang-2 de referencia de la invención, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido Ang-2 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de Ang-2. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a Ang-2 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-Ang-2 de referencia, se puede sacar la conclusión de que el anticuerpo de prueba se une con un epítopo diferente que el anticuerpo anti-Ang-2 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la molécula de Ang-2 tras la unión de saturación con el anticuerpo anti-Ang-2 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo anti-Ang-2 de referencia de la invención. Se puede llevar a cabo entonces experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación peptídica y análisis de la unión) para confirmar si la falta de unión observada del anticuerpo de prueba es de hecho debida a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Pueden realizarse experimentos de esta clase usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo
o cualquier otro ensayo de unión al anticuerpo cuantitativa o cualitativa disponible en la técnica. Dos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo (o solapante), si, por ejemplo, un exceso de 1-, 5-, 10-, 20-o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos el 50 º%, pero preferiblemente el 75 º%, 90 º% o incluso el 99 º% como se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen “epítopos solapantes” si solamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-Ang-2 de referencia, la metodología de unión anteriormente descrita se realiza en dos orientaciones: En una primera orientación, se deja que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de Ang-2 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula de Ang-2. En una segunda orientación, se deja que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de Ang-2 en condiciones de saturación, seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de Ang-2. Si, en ambas orientaciones, solamente el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unión a la molécula de Ang-2, entonces se llega a la conclusión de que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a la Ang-2. Como se apreciará por un experto habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión con un epítopo solapante o adyacente.
Selectividad de las especies y reactividad cruzada de las especies
Los anticuerpos anti-Ang-2 descritos en el presente documento pueden unirse a la Ang-2 humana, pero no a la Ang2 de otras especies. Alternativamente, los anticuerpos anti-Ang-2 descritos en el presente documento pueden unirse
a la Ang-2 humana y a la Ang-2 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos para Ang-2 pueden unirse a la Ang-2 humana y pueden unirse o no unirse, según el caso, a una o más Ang-2 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, cinomolgo, tití, rhesus o chimpancé.
Inmunoconjugados
La invención engloba anticuerpos monoclonales anti-Ang-2 conjugados con un resto terapéutico (“inmunoconjugado”) tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo el documento WO 05/103081).
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los mAb multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión al antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Los anticuerpos anti-Ang-2 de la presente invención, o porciones de los mismos, pueden enlazarse o co-expresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína, para formar una molécula multiespecífica. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) a una o más de otras entidades moleculares; tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.
Un formato de anticuerpo biespecífico a modo de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en el que el primer y segundo dominios CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que la diferencia de al menos un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la proteína A tal como una modificación de H95R (por numeración de exones de IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen; D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG4.
Formulación y administración terapéutica
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Ang-2 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones terapéuticas de la presente invención comprenden además uno o más vehículos, excipientes y otros agentes farmacéuticamente aceptables que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares (denominados en el presente documento colectivamente “vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables”). Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los técnicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones aceite en agua y agua en aceite, emulsiones con Carbowax (polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares), geles semi-sólidos y mezclas semi-sólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y del tamaño de un sujeto que va a administrarse, enfermedad objetivo, condiciones, vía de administración, y similares. La dosis preferida se calcula normalmente según el peso corporal o el área de superficie corporal. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad de la Ang-2 en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar intravenosamente el anticuerpo de la presente invención normalmente en una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Dosis eficaces y programas para la administración de anticuerpos para Ang2 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, el progreso del paciente puede monitorizarse por evaluación periódica, y la dosis puede ajustarse en consecuencia. Además, puede realizarse el escalado de dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por perfusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse, por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma fácilmente tiene aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Un dispositivo de administración de pluma tal puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica de dentro del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse con un cartucho nuevo que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Por el contrario, el dispositivo de administración de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que se vacía el depósito de la composición farmacéutica, se desecha el dispositivo completo.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero por supuesto no están limitados a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-aventis, Fráncfort, Alemania), sólo por nombrar algunos. Ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero por supuesto no están limitados a, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Para el tratamiento de trastornos oculares, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de la invención pueden administrarse, por ejemplo, mediante colirios, inyección subconjuntiva, implante subconjuntivo, inyección intravítrea, implante intravítreo, inyección sub-tenon o implante sub-tenon.
La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer 1990 Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, véase arriba, pp. 317-327; véase generalmente arriba).
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización puede usarse una bomba (véase Langer, arriba; Sefton 1987 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización pueden usarse materiales poliméricos. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede situarse en la proximidad de la diana de la composición, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, arriba, vol. 2, pp. 115-138).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones para goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, mediante disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleoso convencionalmente usado para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones están, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medios oleosos se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferiblemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustarse una dosis de los principios activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones
(ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo anteriormente mencionado contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado a la actividad de la Ang-2, incluyendo las enfermedades o trastornos asociados a la angiogénesis. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de la presente invención pueden usarse para tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, orofaringe, pulmón y árbol bronquial, tubo gastrointestinal, tracto reproductor masculino y femenino, músculo, hueso, piel y extremidades, tejido conjuntivo, bazo, sistema inmunitario, células formadoras de sangre y médula ósea, hígado y vías urinarias, y órganos sensoriales especiales tales como el ojo. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno también pueden usarse para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma.
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento de uno o más trastornos oculares. Trastornos oculares a modo de ejemplo que pueden tratarse con los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de la invención incluyen, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética y otros trastornos oculares asociados con la neovascularización coroidea, extravasación vascular, edema retiniano e inflamación. Adicionalmente, los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención pueden administrarse como un adyuvante para la cirugía del glaucoma para prevenir la hemangiogénesis y linfangiogénesis tempranas y el reclutamiento de macrófagos en la ampolla filtrante después de cirugía del glaucoma, y mejorar el resultado clínico.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en el presente documento también pueden usarse para tratar hipertensión, diabetes (incluyendo diabetes mellitus no insulino-dependiente), psoriasis, artritis (incluyendo artritis reumatoide), asma, septicemia, enfermedad renal y edema asociado a lesiones, accidente cerebrovascular o tumor.
Se ha mostrado que la expresión de Ang-2 se correlaciona con la gravedad de diversas enfermedades inflamatorias y/o infecciosas (véase, por ejemplo, Siner et al., 2009, Shock 31:348-353; Yeo et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):105:17097-17102). Por consiguiente, los anticuerpos anti-Ang-2 descritos en el presente documento pueden usarse para tratar, prevenir o mejorar una o más enfermedades inflamatorias o infecciosas. Enfermedades infecciosas a modo de ejemplo que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse mediante la administración de los anticuerpos anti-Ang-2 incluyen, pero no se limitan a: malaria (infección por Plasmodium falciparum), fiebres hemorrágicas virales (por ejemplo, fiebre del dengue), infección por rickettsias, síndrome de choque tóxico, septicemia, hepatitis C, infección por Bartonella bacilliformis, leishmaniosis, infección micobacteriana e infección por virus de Epstein-Barr.
Terapias de combinación
Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-Ang-2 de la invención y, por ejemplo, otro antagonista de Ang-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2, pepticuerpo, o CovX-cuerpo tal como CVX-060 (véase el documento US 7.521.425)). Los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención también pueden administrarse junto con otro agente anti-angiogénico tal como, por ejemplo, un antagonista de VEGF (por ejemplo, un VEGF-Trap, véase, por ejemplo, el documento US 7.087.411 (denominado también en el presente documento una “proteína de fusión inhibidora de VEGF”), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasas de molécula pequeña del receptor VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib), un anticuerpo anti-DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), etc.), o con un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, anticuerpo anti-EGFR o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de EGFR). Otros agentes que pueden administrarse beneficiosamente en combinación con los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención incluyen los inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocinas de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, o a sus receptores respectivos. La presente invención también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención y un inhibidor de uno o más de VEGF, DLL4, EGFR, o cualquiera de las citocinas anteriormente mencionadas, en las que el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas manipuladas por ingeniería, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades mínimas de reconocimiento). Los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención también pueden administrarse en combinación con antivirales, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE. Los anticuerpos anti-Ang-2 de la
invención también pueden administrarse como parte de una pauta de tratamiento que incluye además tratamiento de radiación y/o quimioterapia convencional. Cuando se combinan con uno o más agentes adicionales, los anticuerpos anti-Ang-2 de la invención pueden administrarse antes, simultáneamente (por ejemplo, en la misma formulación o en formulaciones separadas), o posteriormente a la administración del (de los) otro(s) agente(s).
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-Ang-2 descritos en el presente documento también podrían usarse para detectar y/o medir Ang2 en una muestra, por ejemplo, para fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang-2, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión aberrante (por ejemplo, expresión en exceso, expresión por defecto, falta de expresión, etc.) de la Ang-2. Ensayos de diagnóstico a modo de ejemplo para la Ang-2 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-Ang-2 descrito en el presente documento, en los que el anticuerpo anti-Ang-2 está marcado con una marca detectable o molécula indicadora. Alternativamente, un anticuerpo anti-Ang-2 no marcado puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está él mismo marcado detectablemente. La etiqueta detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C,32P, 35S o 125l; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína, o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, -galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Ensayos a modo de ejemplos específicos que pueden usarse para detectar o medir la Ang-2 en una muestra incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos expertos habituales en la materia de una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben suponerse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados Centígrados y la presión es la presión atmosférica o próxima a ella.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos para Ang-2 humana
Se administró directamente el antígeno de Ang-2 humana, con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de las cadena pesada y ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria al anticuerpo se monitorizó por un inmunoensayo específico de Ang-2. Cuando se alcanzó una respuesta inmunitaria deseada se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producen anticuerpos específicos de la Ang-2. Usando esta técnica se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-Ang-2 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos a modo de ejemplo generados de esta manera se denominaron como sigue: H1M724, H1M727, H1M728, H2M730, H1M732, H1M737, H2M742, H2M743, H2M744, H1M749, H2M750 y H1M810.
Los anticuerpos anti-Ang-2 también se aislaron directamente de linfocitos B positivos para antígeno sin fusión a las células de mieloma, como se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-Ang-2 humanos completos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos a modo de ejemplo generados de esta manera se denominaron como sigue: H1H685, H1H690, H1H691, H1H693, H1H694, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706 y H1H707.
Las propiedades biológicas de los anticuerpos anti-Ang-2 a modo de ejemplo generados según los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Análisis de la utilización de genes variables
Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, se clonaron y se secuenciaron los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo. A partir de la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso del gen para cada región variable de la cadena pesada (HCVR) y la región variable de cadena ligera (LCVR) (Tabla 1).
Tabla 1
Anticuerpo
HCVR LCVR Identificador de anticuerpo
VH
DH JH VK JK SEQ ID NO de HCVR/LCVR
H1H685
3-13 3-16 4 3-20 1 2/10
H1H690
3-23 4-4 3 3-11 4 26/34
H1H691
3-9 4-17 6 3-20 4 50/58
H1H693
3-23 4-4 3 1-12 1 74/82
H1H694
3-15 6-6 4 1-5 1 98/106
H1H695
3-33 5-12 6 3-15 5 122/130
H1H696
3-11 4-17 4 1-16 4 146/154
H1H704
3-33 6-6 4 1-16 5 170/178
H1H706
3-33 3-3 3 1-16 1 194/202
H1H707
3-33 3-3 3 3-20 4 218/226
H1M724
3-33 3-3 5 1-17 4 266/274
H1M727
1-18 3-3 6 2-28 2 338/346
H1M728
3-7 6-19 4 1-5 1 290/298
H2M730
3-7 6-13 4 1-5 1 362/370
H1M732
3-15 1-7 4 1-17 3 242/250
H2M742
3-23 5-5 5 2-28 4 386/394
H2M743
3-23 2-8 4 1-12 4 410/418
H2M744
1-18 4-4 5 1-12 4 434/442
H1M749
3-33 5-5 4 3-15 1 314/322
H2M750
3-33 6-6 4 1-16 4 458/466
H1M810
3-23 3-3 3 1-12 1 482/490
La Tabla 2 expone los pares de secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Las denominaciones N,
5 P y G se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas, pero con variaciones de la secuencia en regiones que están fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones estructurales). Por tanto, las variantes N, P y G de un anticuerpo particular tienen secuencias de CDR idénticas dentro de sus regiones variables de la cadena pesada y ligera, pero contienen modificaciones dentro de las regiones estructurales.
Tabla 2
Nombre
SEQ ID NO de HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NO de HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NO de HCVR/LCVR
H1H685N
2/10 H1H685P 18/20 H1H685G 22/24
H1H690N
26/34 H1H690P 42/44 H1H690G 46/48
H1H691N
50/58 H1H691P 66/68 H1H691G 70/72
H1H693N
74/82 H1H693P 90/92 H1H693G 94/96
H1H694N
98/106 H1H694P 114/116 H1H694G 118/120
H1H695N
122/130 H1H695P 138/140 H1H695G 142/144
H1H696N
146/154 H1H696P 162/164 H1H696G 166/168
H1H704N
170/178 H1H704P 186/188 H1H704G 190/192
H1H706N
194/202 H1H706P 210/212 H1H706G 214/216
H1H707N
218/226 H1H707P 234/236 H1H707G 238/240
H1M724N
266/274 H1M724P 282/284 H1M724G 286/288
H1M727N
338/346 H1M727P 354/356 H1M727G 358/360
H1M728N
290/298 H1M728P 306/308 H1M728G 310/312
H2M730N
362/370 H2M730P 378/380 H2M730G 382/384
H1M732N
242/250 H1M732P 258/260 H1M732G 262/264
H1M737N
506/X* H1M737P 514/X* H1M737G 516/X*
Nombre
SEQ ID NO de HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NO de HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NO de HCVR/LCVR
H2M742N
386/394 H2M742P 402/404 H2M742G 406/408
H2M743N
410/418 H2M743P 426/428 H2M743G 430/432
H2M744N
434/442 H2M744P 450/452 H2M744G 454/456
H1M749N
314/322 H1M749P 330/332 H1M749G 334/336
H2M750N
458/466 H2M750P 474/476 H2M750G 478/480
H1M810N
482/490 H1M810P 498/500 H1M810G 502/504
*No se muestra la secuencia de aminoácidos de la LCVR de H1M737.
Construcciones de control usadas en los siguientes ejemplos
Se incluyeron diversas construcciones de control (anticuerpos anti-Ang-2 y pepticuerpos anti-Ang-2) en los siguientes experimentos con fines comparativos. Las construcciones de control se designan del siguiente modo: Control I: un anticuerpo anti-Ang-2 humana con dominios variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de los correspondientes dominios de “Ab536(THW)” como se expone en el documento US 2006/0018909 (véase también Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516); Control II: un pepticuerpo que se une a la Ang-2 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de “2XCon4(C)” como se expone en el documento US 7.205.275, (véase también Oliner et al., 2004, Cancer Cell 6:507-516); Control III: un pepticuerpo que se une a la Ang-2 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de “L1-7”, como se expone en el documento US 7.138.370; Control IV: un anticuerpo anti-Ang-2 humano con regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de los dominios correspondientes de “3.19.3” como se expone en el documento US 2006/0246071; y Control V: un anticuerpo anti-Ang-2 humano con regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen las secuencias de aminoácidos de los dominios correspondientes de “MEDI1/5” como se expone en el documento WO 2009/097325. (No todas las construcciones de control fueron usadas en cada ejemplo). En las tablas que siguen, las notaciones “Ab” y “Pb” se incluyen para identificar los controles de anticuerpo y pepticuerpo, respectivamente (es decir, Control 1 = Ab; Control II = Pb; Control III = Pb; Control IV = Ab; y Control V = Ab).
Ejemplo 3. Determinación de la afinidad de unión al antígeno.
Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (valores de KD) para la unión de los anticuerpos para Ang-2 purificados seleccionados al dominio dimérico tipo fibrinógeno de Ang-2 (Ang-2FD) humana (SEQ ID NO: 519), de ratón (Mus musculus; SEQ ID NO: 520) y de mono (Macca fascicularis; SEQ ID NO: 521) conjugado con la lgG1 humana (SEQ ID NO: 528) por cinética de superficie usando un ensayo de resonancia de plasmones superficiales con un biosensor en tiempo real. Se capturó el anticuerpo sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón, una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti- humana (Southern Biotech, Birmingham, AL) o una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA) creada mediante el acoplamiento directo de amina a un chip sensor BIACORE™ CM5 para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectaron concentraciones variables (que varían de 50 nM a 6,25 nM) de proteína a 100 µl/min en la superficie del anticuerpo capturado durante 90 segundos. Se monitorizaron la unión y la disociación de antígeno-anticuerpo en tiempo real a temperatura ambiente. Se realizó el análisis cinético para calcular la KD y la semivida de disociación del complejo antígeno/anticuerpo. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Anticuerpo
Ang-2FD dimérico humano Ang-2FD dimérico de ratón Ang-2FD dimérico de mono
KD (pM)
T1/2 (min) KD (pM) T1/2 (min) KD (pM) T1/2 (min)
H1M724N
179 42,7 694 16 730 25,7
H1M728N
137 58,4 5650 9,9 1580 69,5
H2M730N
210 47 - - 842 36,6
H1M732N
484 35,5 1700 21,4 7330 24,1
H1M737N
251 34,5 1740 6,3 3810 16
H2M742N
295 38 610 30,8 6170 28,5
H2M743N
154 167 882 195,2 234 169,2
H2M744N
98,9 109,1 143 223,1 500 281,7
H2M749N
165 42,9 529 25,5 1500 40,9
H2M750N
362 32,2 - - 1470 23
Se repitió el experimento anterior usando anticuerpos anti-Ang-2 purificados seleccionados clonados sobre lgG1 humana. Los resultados se resumen en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Anticuerpo
Ang-2FD dimérico humano Ang-2FD dimérico de ratón Ang-2FD dimérico de mono
KD (pM)
T1/2 (min) KD (pM) KD (pM) T1/2 (min)
KD (pM)
H1H685P
71,4 229,4 148 128,7 99,4 177,1
H1H690P
79 126,1 91,3 105,2 55,6 195,2
H1H691P
220 38,5 220 43,8 290 41
H1H693P
500 37,1 446 63,7 1170 17,6
H1H694P
126 265,6 237 166,5 356 85,6
H1H695P
245 147 347 124,2 440 84,1
H1H696P
289 38,8 402 37,6 354 36,6
H1H704P
331 86,1 484 61,9 818 33,5
H1H706P
201 50,4 357 47 164 53,3
H1H707P
262 26,6 328 34,4 283 22,3
H1H724N
115 107 185 84 239 173
H1H728N
162 81 5760 20 2000 77
H1H730N
234 62 97,1 90 3400 87
H1H732N
386 57 529 51 439 118
H1H742N
186 65 276 58 683 93
H1H743N
88,2 254 124 233 96,5 780
H1H744N
114 127 158 115 346 164
H1H749N
118 109 177 96 407 143
H1H750N
164 127 218 121 199 244
Control I (Ab)
339 34,8 339 47,1 537 27,1
5 Se realizaron experimentos de unión adicionales usando anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados a dos temperaturas diferentes para evaluar adicionalmente la afinidad cruzada de las especies. Cada anticuerpo seleccionado o construcción de control se capturó a un caudal de 40 µl/min durante 1 minuto sobre la superficie de un anticuerpo policlonal de cabra anti-kappa humana creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para
10 formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectó Ang-2FD-Fc humano, de mono y de ratón a una concentración de 25 nM o 0,78 nM sobre la superficie de anticuerpo capturado a un caudal de 60 µl/min durante 3 minutos, y se monitorizó la disociación de antígeno-anticuerpo en tiempo real durante 20 minutos a tanto 25 ºC como a 37 ºC.
15 Los resultados se resumen en las Tablas 5 (unión a 25 ºC) y 6 (unión a 37 ºC) a continuación.
Tabla 5
Unión a 25 ºC
Anticuerpo
Ang-2FD-mFc dimérico humano Ang-2FD-hFc dimérico de ratón Ang-2FD-hFc dimérico de mono
KD (Molar)
T1/2 (min) KD (Molar) T1/2 (min) KD (Molar) T1/2 (min)
H1H685P
1,17E-11 227 6,51E-11 208 2,20E-11 275
H1H744N
1,16E-10 23 3,85E-10 33 2,44E-10 24
Control I (Ab)
1,07E-09 15 1,07E-09 15 1,03E-09 4
Control IV (Ab)
1,27E-11 269 4,02E-11 289 1,55E-11 342
Tabla 6
Unión a 37 ºC
Anticuerpo
Ang-2FD-mFc dimérico humano Ang-2FD-hFc dimérico de ratón Ang-2FD-hFc dimérico de mono
KD (Molar)
T1/2 (min) KD (Molar) T1/2 (min) KD (Molar) T1/2 (min)
H1H685P
2,70E-11 60 9,39E-11 64 7,21E-11 65
H1H744N
1,05E-10 18 2,15E-10 26 3,20E-10 11
Control I (Ab)
-- -- 3,90E-10 12 -- ---
Control IV (Ab)
9,91E-12 184 5,40E-11 119 4,74E-11 107
En otro experimento se determinaron los valores de KD para los anticuerpos purificados seleccionados que se unen a una construcción tetramérica “Ang2 de lazo” humana (“hBA2”) (usando los métodos descritos anteriormente). La hBA2 consiste en dos dímeros, conteniendo cada dímero dos dominios tipo fibronectina de Ang-2 conectados entre sí por un dominio Fc humano. La secuencia de aminoácidos de los constituyentes del dímero de hBA2 se representa por SEQ ID NO: 522. Los resultados se resumen en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7
Anticuerpo
hBA2
KD (PM)
T1/2 (min)
H1H685P
11,9 587,2
H1H690P
17,9 299,3
H1H691P
106 50,6
H1H693P
299 28,7
H1H694P
68,4 111,3
H1H695P
40,1 254,3
H1H696P
111 51,5
H1H704P
93,9 117,7
H1H706P
79,1 63,9
H1H707P
75,2 51,4
H1H724N
23,3 323
H1H728N
41,8 185
H1H730N
55,9 152
H1H732N
132 73
H1H742N
72,1 87
H1H743N
9,71 1118
H1H744N
17,2 442
H1H749N
32,5 235
H1H750N
36,9 284
Control I (Ab)
83 57,5
10 En otro experimento más se determinaron los valores de KD para los anticuerpos purificados seleccionados que se unen a la Ang-2 humana no mutante (hAng-2-WT; SEQ ID NO: 518) y el dominio tipo fibrinógeno de la Ang2 humana (hAng-2FD) (como se ha descrito anteriormente). Los resultados se resumen en la Tabla 8 a continuación.
15 Tabla 8
Anticuerpo
hAng-2FD monomérico hAng-2-WT
KD (nM)
T1/2 (min) KD (pM) T1/2 (min)
H1M724N
1,75 17,4 33,1 568
H1M728N
1,17 33,9 33,8 725
H2M730N
2,06 24,4 49,2 519
H1M732N
6,13 18,7 131 333
H1 M737N
2,82 13,1 59,3 282
Anticuerpo
hAng-2FD monomérico hAng-2-WT
KD (nM)
T1/2 (min) KD (pM) T1/2 (min)
H2M742N
4,81 18,0 67,9 437
H2M743N
0,399 156,7 14,3 2366
H2M744N
0,475 89,3 28,9 846
H2M749N
1,38 27,9 49 479
H2M750N
4,42 21,5 40,8 991
H1H685P
0,578 55 47,6 1000
H1H691P
11 0,57 19,1 684,6
H1H690P
0,594 25,16 12,4 1568
H1H693P
44,8 0,61 425 100
H1H694P
7,89 9,85 158 209,7
H1H695P
1,12 50,59 31,1 1770,7
H1H696P
38,4 0,20 40,3 642,7
H1H704P
0,39 3,31 36,2 747,6
H1H706P
11 1,02 27,4 661,9
H1H707P
145 - 77,1 217,4
H1H724N
2,4 13,34 22,6 895
H1H728N
1,18 5,86 43 566
H1H730N
2,84 3,44 47,5 534
H1H732N
264 0,22 202 264
H1H742N
486 2,29 44,9 666
H1H743N
2,35 33,03 9,48 3927
H1H744N
1,02 42,14 30,8 837
H1H749N
1,13 33,48 12,5 1833
H1H750N
0,787 30,20 9,5 4442
Control I (Ab)
44,5 0,03 47,6 512
Control II (Pb)
90 - 44,7 334,8
Se realizaron experimentos adicionales para medir las propiedades de unión de anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados a hAng-2FD monomérico a 25 ºC y 37 ºC. Cada anticuerpo seleccionado o construcción de control se capturó a un caudal de 40 µl/min durante 1 minuto sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG
5 humana creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectó Ang-2FD humano a una concentración de 500 nM o 7,8 nM sobre la superficie del anticuerpo capturado a un caudal de 60 µl/min durante 3 minutos, y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo en tiempo real durante 20 minutos a tanto 25 ºC como a 37 ºC.
10 Los resultados se resumen en las Tablas 9 (25 ºC) y 10 (37 ºC) a continuación. N/D = No determinado.
Tabla 9
Unión a hAng-2FD monomérico a 25 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½
H1H685P
2,44E+05 7,96E-05 3,36E-10 145 minutos
H1H744N
2,92E+05 1,24E-04 4,24E-10 93 minutos
Control I (Ab)
4,00E+05 5,10E-02 1,28E-07 14 segundos
Control II (Pb)
estado estacionario estado estacionario 9,00E-08 estado estacionario
Control III (Pb)
5,40E+05 6,30E-02 1,17E-07 11 segundos
Control IV (Ab)
2,84E+05 3,56E-02 1,25E-07 19 segundos
Tabla 10
Unión a hAng-2FD monomérico a 37 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½
H1H685P
4,06E+05 1,39E-04 3,42E-10 83 minutos
H1H744N
3,86E+05 5,48E-04 1,42E-09 21 minutos
Control I (Ab)
estado estacionario estado estacionario 1,51E-07 estado estacionario
Control II (Pb)
N/D N/D N/D N/D
Control III (Pb)
estado estacionario estado estacionario 2,94E-07 estado estacionario
Control IV (Ab)
estado estacionario estado estacionario 9,40E-08 estado estacionario
Como se muestra en este ejemplo, varios de los anticuerpos anti-Ang-2 generados según los métodos del Ejemplo 1 se unieron a las construcciones de Ang-2 con afinidades equivalentes o más altas que los controles. Por ejemplo, los 5 anticuerpos H1H685, H1H690, H1H724 y H1H744 se unieron a Ang-2-FD humano dimérico con KD de 71,4, 79, 115 y 114 pM, respectivamente, mientras que el anticuerpo de control I se unió a Ang-2-FD humano dimérico con una KD de 339 pM (véase la Tabla 4). Similarmente, los anticuerpos H1H685, H1H690, H1H724 y H1H744 se unieron a BA2 humana (una construcción tetramérica con dominio tipo fibrinógeno de Ang-2) con KD de 11,9, 17,9, 23,3 y 17,2 pM, respectivamente, mientras que el anticuerpo de control I se unió a hBA2 con una KD de 83 pM (véase la Tabla 7).
10 Así, cuando se comparan con las construcciones de control, muchos de los anticuerpos de la invención presentan unión potenciada a la Ang-2. El anticuerpo H1H685P mostró propiedades de unión especialmente fuertes a la Ang-2 en comparación con las construcciones de control.
Ejemplo 4. Unión preferencial a la Ang-2 con respecto a la Ang-1
15 Se realizaron experimentos de unión (ensayos de resonancia de plasmones) para determinar si los anticuerpos seleccionados se unieron tanto a la Ang-2 como a la Ang-1 o si se unieron preferencialmente a la Ang-2 solamente. Cada anticuerpo seleccionado o construcción de control se capturó a un caudal de 40 µl/min durante 1 minuto sobre una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana creada mediante acoplamiento químico directo a
20 un chip de BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectaron Ang-1 o Ang-2 humanas no mutantes de longitud completa a una concentración de 25 nM o 0,78 nM sobre la superficie del anticuerpo capturado a un caudal de 60 µl/min durante 3 minutos, y se monitorizó la disociación antígeno-anticuerpo en tiempo real durante 20 minutos a tanto 25 ºC como a 37 ºC.
25 Los resultados de estos experimentos se resumen en las Tablas 11-14 a continuación. N/D = no determinado. “Sin unión” significa que no se observó unión detectable en las condiciones experimentales particulares usadas en estos experimentos.
Tabla 11a
Unión a hAng-2-WT a 25 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
6,59E+05 1,60E-05 2,42E-11 722
H1H744N
7,65E+05 2,57E-05 3,35E-11 450
Control I (Ab)
4,74E+05 2,26E-05 4,76E-11 512
Control II (Pb)
7,73E+05 3,45E-05 4,47E-11 335
Control III (Pb)
3,29E+05 1,98E-05 6,01E-11 584
Control IV (Ab)
3,80E+06 2,74E-04 7,22E-11 42

Tabla 11 b
Unión a hAng-2-WT a 25 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
1,15E+05 8,50E-06 7,39E-11 1359
Control II (Pb)
8,30E+04 5,41 E-05 6,52E-10 213
Control V (Ab)
1,12E+05 2,66E-05 2,73E-10 434
Tabla 12a
Unión a hAng-1-WT a 25 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
H1H744N
4,10E+05 3,81 E-05 9,30E-11 303
Control I (Ab)
4,55E+05 2,49E-05 5,47E-11 464
Control II (Pb)
4,53E+05 3,54E-05 7,82E-11 326
Control III (Pb)
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
Control IV (Ab)
6,60E+05 1,11E-04 1,68E-10 105
Tabla 12b
Unión a hAng-1-WT a 25 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1 H685P
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
Control II (Pb)
3,04E+05 2,51E-05 8,26E-11 460
Control V (Ab)
2,75E+05 6,68E-05 2,43E-10 173
Tabla 13a
Unión a hAng-2-WT a 37 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
8,54E+05 3,76E-05 4,40E-11 707
H1H744N
7,01E+05 2,43E-04 3,47E-10 48
Tabla 13b
Unión a hAng-2-WT a 37 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
1,36E+05 2,16E-05 1,59E-10 535
Control II (Pb)
3,79E+04 1,17E-04 3,09E-09 99
Control V (Ab)
9,42E+04 7,92E-05 8,41E-10 146
Tabla 14a
Unión a hAng-1-WT a 37 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
H1H744N
1,47E+06 5,20E-05 3,12E-11 222
Control III (Pb)
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
Tabla 14b
Unión a hAng-1-WT a 37 ºC
ka (Ms-1)
kd (s-1) KD (Molar) T½ (minutos)
H1H685P
Sin unión Sin unión Sin unión Sin unión
Control II (Pb)
2,81E+05 4,35E-05 1,55E-10 266
Control V (Ab)
4,42E+05 5,47E-05 1,24E-10 211
Estos resultados demuestran que el H1H685P es único entre los anticuerpos probados en este experimento porque se une con alta afinidad a la Ang-2, pero no se une a la Ang-1. La única construcción distinta que presenta unión a la
15 Ang-2, pero no a la Ang-1, es el Control III. Debe enfatizarse, sin embargo, que el Control III es un pepticuerpo y que todos los otros anticuerpos probados en este experimento se unen tanto a la Ang-2 como a la Ang-1. La selectividad para la unión a la Ang-2 puede conferir beneficios terapéuticos a H1H685P que no tienen los anticuerpos que se unen a tanto Ang-2 como a Ang-1.
20 Ejemplo 5. Inhibición de la unión de Ang-2 a Tie-2 humano
El Tie-2 es un receptor natural para la Ang-2. Se probaron anticuerpos anti-Ang-2 para su capacidad de bloquear la unión de la Ang-2 a Tie-2 humano (hTie-2). Se recubrió hTie-2-mFc (una construcción quimérica que consiste en
Tie-2 humano conjugado con IgG de ratón; SEQ ID NO: 525) sobre placas de 96 pocillos a una concentración de 2 µg/ml y se incubó durante la noche, seguido por un lavado de cuatro veces en tampón de lavado (PBS con Tween20 al 0,05 º%). Se bloqueó entonces la placa con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía BSA al 0,5 º% (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa separada, los 5 anticuerpos anti-Ang-2 purificados, a una concentración de partida de 50 nM, se diluyeron sucesivamente por un factor de tres por toda la placa. Se añadieron proteínas Ang-2FD humanas, de ratón o de mono conjugadas con la IgG humana (Ang-2FD-hFc) a concentraciones finales 2 nM, 8 nM o 2 nM respectivamente y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Entonces se añadió la mezcla de anticuerpo/Ang-2FD-Fc a la placa que contenía hTie-2-mFc y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se determinó la detección de Ang-2FD-hFc unido 10 a la proteína hTie-2-mFc con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo IgG humana (Jackson Immuno Research Lab, West Grave, PA) y se reveló mediante respuesta colorimétrica estándar usando sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA). Se leyó la absorbancia a DO450 durante 0,1
s. El porcentaje de bloqueo de la unión de Ang-2FD-hFc a hTie-2-mFc por 16,67 nM de los anticuerpos anti-Ang-2
seleccionados se muestra en la Tabla 15. 15
Tabla 15
Anticuerpo
Porcentaje de bloqueo de la unión de Ang-2FD a Tie-2
Ang-2FD-hFc humano
Ang-2FD-hFc de ratón Ang-2FD-hFc de mono
H1M724N
99,5 96,6 95,2
H1M728N
98,5 83,9 97,1
H2M730N
98,9 55,0 97,3
H1M732N
97,7 90,9 95,8
H1M737N
99,1 95,4 90,5
H2M742N
99,6 98,6 94,1
H2M743N
99,6 98,4 95,1
H2M744N
99,5 98,4 95,5
H2M749N
99,5 97,3 97,4
H2M750N
99,4 53,7 97,4
Control I (Ab)
94,5 90,2 96,9
En un experimento similar se probaron anticuerpos anti-Ang-2 purificados seleccionados clonados sobre lgG1 humana para su capacidad para bloquear la unión de Ang-2FD a hTie-2 (como se ha descrito anteriormente). El 20 porcentaje de bloqueo de la unión de Ang-2FD-hFc a hTie-2-mFc por 16,67 nM de los anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados se muestra en la Tabla 16. NT: No probado.
Tabla 16
Anticuerpo
Porcentaje de bloqueo de la unión de Ang-2FD a Tie-2
Ang-2FD-hFc humano
Ang-2FD-hFc de ratón Ang-2FD-hFc de mono
H1H685P
93,8 97,1 62,2
H1H690P
97,2 98,0 99,6
H1H691P
97,4 96,7 99,8
H1H693P
73,9 63,6 NT
H1H694P
79,8 36,0 NT
H1H695P
98,4 97,6 NT
H1H696P
98,2 94,9 99,2
H1H704P
97,0 41,8 NT
H1H706P
97,1 95,9 99,8
H1H707P
95,1 93,8 NT
H1H724N
96,6 97,1 96,6
H1H744N
97,9 97,6 96,2
Control I (Ab)
97,3 82,2 98,5
25 En otro experimento se probaron anticuerpos anti-Ang-2 purificados seleccionados para su capacidad para bloquear la unión de hBA2 20 pM biotinilada a hTie-2 (como se ha descrito anteriormente). Para este experimento se usó Tie2 humano conjugado con una marca de histidina (hTie-2-His; SEQ ID NO: 526) de una manera similar al hTie-2-mFc
descrito anteriormente. Las concentraciones de anticuerpo de 5 nM se diluyeron sucesivamente tres veces. Se generó un valor de CI50 (concentración inhibidora) calculando la cantidad de anticuerpo requerida para bloquear el 50 º% de la señal de la unión de hBA2-biotina a Tie-2. Se calculó un valor promedio de CI50 para cada anticuerpo basándose en dos experimentos separados. Los resultados se resumen en la Tabla 17. NB: No se observó bloqueo a la concentración 5 nM.
Tabla 17
Anticuerpo
Biotina -hBA2
CI50 promedio (pM)
H1M724N
9,72
H1M728N
14,05
H2M730N
14,60
H1M732N
82,17
H1M737N
13,01
H2M742N
9,65
H2M743N
11,01
H2M744N
11,43
H2M749N
6,43
H2M750N
8,83
Control I (Ab)
30,23
Control II (Pb)
7,75
Control III (Pb)
16,49
En un experimento similar se ensayaron anticuerpos anti-Ang-2 purificados seleccionados clonados sobre lgG1 10 humana para su capacidad para bloquear la unión de hBA2 biotinilada a hTie-2 (como se ha descrito anteriormente). Los resultados se muestran en la Tabla 18. NB: No se observó bloqueo a la concentración 5 nM.
Tabla 18
Anticuerpo
Biotina -hBA2
CI50 (pM)
H1H685P
20
H1H690P
17
H1H691P
13
H1H693P
NB
H1H694P
NB
H1H695P
59
H1H696P
22
H1H704P
56
H1H706P
8
H1H707P
22
H1H724N
4
H1H744N
25
15 Este ejemplo ilustra que varios de los anticuerpos anti-Ang-2 generados según los métodos del Ejemplo 1 bloquearon la interacción entre el dominio tipo fibrinógeno de Ang-2 y su receptor (TIE-2) a un grado equivalente o mayor que el anticuerpo de control. Por ejemplo, los anticuerpos H1H690, H1H691, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706, H1H707, H1H724 y H1H744 causaron cada uno un bloqueo superior al 95 º% de las construcciones Ang2FD humanas, de ratón y de mono para el receptor TIE-2, similar a los resultados observados con las
20 construcciones de control (véase la Tabla 16).
Ejemplo 6: Inhibición de la unión de Ang-2 y Ang-1 de longitud total a Tie-2 humano
Tie-2 es un receptor para la Ang-1, además de la Ang-2. Por tanto, en el presente ejemplo, se midió y se comparó la 25 capacidad de ciertos anticuerpos anti-Ang-2 para bloquear la unión de la Ang-2 o de la Ang-1 a Tie-2 humano.
Los experimentos ELISA mostrados en este ejemplo se realizaron de manera similar a los experimentos del Ejemplo
5. Brevemente, hTie-2-mFc (una construcción quimérica que consiste en Tie-2 humano conjugado con IgG de ratón; SEQ ID NO: 525) se recubrió sobre placas de 96 pocillos a una concentración de 2 µg/ml y se incubó durante la noche, seguido por un lavado de cuatro veces en tampón de lavado (PBS con Tween-20 al 0,05 º%). Entonces la placa se bloqueó con PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía BSA al 0,5 º% (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) durante una hora a temperatura ambiente. En una placa separada, los anticuerpos anti-Ang-2 purificados y las construcciones de control, a una concentración de partida de 300 nM, se diluyeron sucesivamente por un factor de tres por toda la placa. Se añadieron proteínas humanas Ang-2 o Ang-1 de longitud completa, conjugadas con 6X marcas de histidina (R&D Systems, Mineápolis, MN) a una concentración final 0,6 nM y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Entonces se añadió la mezcla de anticuerpo/antígeno a la placa que contiene hTie-2mFc y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Se determinó la detección de Ang-2-His o Ang-1-His unidos a la proteína hTie-2-mFc con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo a-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) y se reveló mediante respuesta colorimétrica estándar usando sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA). Se leyó la absorbancia a DO450 durante 0,1 s. Se generó un valor de CI50 (concentración inhibidora) calculando la cantidad de anticuerpo requerida para bloquear el 50 º% de la señal de la unión de la Ang-2 o de la Ang-1 humana a Tie-2. Los resultados, expresados en términos de CI50, se muestran en la Tabla 19, columnas (1) y (2). El grado al que los anticuerpos o construcciones de control bloquean la interacción hAng-2/Tie-2 con respecto a la interacción hAng-1/Tie-2 se refleja en la diferencia en veces en la CI50 mostrada en la columna (3); es decir, un número más alto en la columna (3) indica una mayor capacidad para bloquear la interacción hAng-2/Tie-2 que la interacción hAng-1/Tie-2.
Tabla 19
Anticuerpo
(1) CI50 de bloqueo dehAng-2 WT a Tie-2 (M) (2) CI50 de bloqueo dehAng-1 WT a Tie-2 (M) (3) Diferencia en veces en la CI50 de bloqueo de hAng-1 en comparación con la CI50 de bloqueo de h-Ang-2*
H1H685P
1,294E-10 > 3,000E-07 > 2318
H1H744N
7,871E-11 1,872E-07 2378
Control I (Ab)
9,372E-11 6,171E-08 658
Control II (Pb)
3,096E-11 5,509E-11 1,8
Control III (Pb)
1,626E-10 > 1,000E-06 > 6150
Control IV (Ab)
1,476E-10 4,252E-09 28,8
* Calculada dividiendo la CI50 de bloqueo de hAng-1 (columna 2) entre la CI50 de bloqueo de hAng-2 (columna 1).
En un esfuerzo para evaluar adicionalmente la capacidad de los anticuerpos anti-hAng-2 seleccionados para bloquear la unión de Ang-1 a Tie-2, se realizó un experimento de resonancia de plasmones superficiales con biosensor. En este experimento, una construcción de dominio extracelular de longitud completa de Tie-2 humano (hTie-2mFc-ecto) se acopló con una amina en un chip BIACORE™ para crear una superficie recubierta con receptor. Los anticuerpos anti-hAng-2 seleccionados y las construcciones de control, a 1 µM (100 veces de exceso con respecto al antígeno), se premezclaron con 10 nM de hAng-1-WT, seguido de 60 minutos de incubación a 25 ºC para permitir que la unión anticuerpo-antígeno alcanzara el equilibrio para formar soluciones equilibradas. Las soluciones equilibradas se inyectaron sobre las superficies del receptor a 5 µl/min durante 5 minutos a 25 ºC. Se determinaron los cambios en las unidades de resonancia (UR) debidos a la unión de hAng-1-WT a hTie-2-mFc. Una construcción irrelevante de pepticuerpo sin ninguna unión a hAng-1 se incluyó en este experimento para establecer el nivel inicial de bloqueo del 0 º%, y se usó una construcción Tie-2-mFc humana como control positivo del bloqueo. La cantidad de Ang-1 unida a Tie-2 tras la preincubación del anticuerpo, expresada como un porcentaje de la cantidad de Ang-1 unida a Tie-2 tras la preincubación del control negativo, se muestra en la Tabla 20. (Una cantidad mayor de unión de Ang-1 a Tie-2 significa un menor grado de bloqueo del anticuerpo).
Tabla 20
Anticuerpo
UR (promedio) Porcentaje de unión del control negativo
Control negativo (pepticuerpo irrelevante)
169 100
hTie-2-mFc
71 42
H1H685P
137 81
H1H744N
57 34
H1H691P
117 69
H1H706P
140 83
H1H724N
57 34
Anticuerpo
UR (promedio) Porcentaje de unión del control negativo
Control I (Ab)
48 28
Control II (Pb)
48 28
Control III (Pb)
160 95
El experimento anterior se repitió usando diferentes cantidades de bloqueantes de Ang-2 y controles. En particular, una construcción de dominio extracelular de longitud completa de Tie-2 humano (hTie-2-mFc-ecto) se acopló con una amina en un chip BIACORE™ para crear una superficie recubierta con receptor. Se mezclaron anticuerpos anti5 hAng-2 seleccionados y las construcciones de control (50 o 150 nM) con hAng-2-WT (25 nM), seguido de 60 minutos de incubación a 25 ºC para permitir que la unión anticuerpo-antígeno alcanzara el equilibrio. Las soluciones equilibradas se inyectaron sobre las superficies del receptor a 10 µl/min durante 5 minutos a 25 ºC. Para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-hAng-2 seleccionados para bloquear la unión de Ang-1 -WT a hTie-2, se siguió un procedimiento similar, excepto que los anticuerpos se probaron a tres concentraciones (50, 100 o 1000 nM) y se
10 incubaron con hAng-1-WT 10 nM. Se determinaron los cambios en las unidades de resonancia (UR) debidos a la unión de Ang-2-WT o hAng-1-WT a hTie-2-mFc. Un anticuerpo irrelevante sin unión a cualquiera de las angiopoyetinas se incluyó en estos experimentos para establecer el nivel inicial de bloqueo del 0 º%, y se usó una construcción Tie-2-mFc humana como control positivo del bloqueo. Los resultados se resumen en las Tablas 21 (hAng-1 aplicada a una superficie de hTie-2) y 22 (hAng-2 aplicada a una superficie de hTie-2).

Tabla 21 (hAng-1 WT)
Cantidad de anticuerpo o control
50 nM
100 nM 1000 nM
Anticuerpo
UR específicas unidas Porcentaje de unión del control negativo UR específicas unidas Porcentaje de unión del control negativo UR específicas unidas Porcentaje de unión del control negativo
Control negativo (anticuerpo irrelevante)
316 100 307 100 276 100
hTie-2-mFc
70 22 39 13 -47 0
H1H685P
299 95 291 95 289 105
Control II (Pb)
8 2,5 4 1,3 -1 0
Control V (Ab)
150 48 114 37 29 11
Tabla 22 (hAng-2 WT)
Cantidad de anticuerpo o control
50 nM
150 nM
Anticuerpo
UR específicas unidas Porcentaje de unión del control negativo UR específicas unidas Porcentaje de unión del control negativo
Control negativo (anticuerpo irrelevante)
281 100 278 100
hTie-2-mFc
97 35 82 30
H1H685P
12 4,3 12 4,3
Control II (Pb)
10 3,6 10 3,6
Control V (Ab)
12 4,3 12 4,3
20 Los resultados obtenidos de estos experimentos están de acuerdo con resultados previos que demostraron que el H1H685P se une preferencialmente a la Ang-2 con respecto a la Ang-1 (véase el Ejemplo 4). En particular, los resultados de este ejemplo demuestran que varios anticuerpos anti-Ang-2 (por ejemplo, H1H685P y H1H706P) no bloquean significativamente la unión de la Ang-1 humana a Tie-2 humano, aún cuando, en otras experimentos, se demostró que estos anticuerpos bloqueaban potentemente la interacción entre Ang-2 y Tie-2 (véase el Ejemplo 5,
25 Tabla 16). Además, en estos experimentos, ninguna de las construcciones de control, excepto el pepticuerpo de Control III, presentó el mismo grado de unión/bloqueo preferencial de la Ang-2 con respecto a la Ang-1 como los anticuerpos anti-Ang-2 a modo de ejemplo de la presente invención, tal como H1H685P.
Ejemplo 7. Inhibición de la fosforilación de Tie-2 mediada por Ang-2 por los anticuerpos anti-Ang-2
30 Los inventores de la presente invención han demostrado que la expresión de Ang-2 puede ser inducida en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) por el factor de transcripción FOXO1 (Daly et al. 2006 PNAS 103:15491). Además, los inventores han mostrado que la infección de las HUVEC con un adenovirus que codifica FOXO1 produce la expresión y secreción de Ang-2, seguido de la activación de la fosforilación de Tie-2 (Daly et al.
2006 PNAS 103:15491).
Se probaron anticuerpos anti-Ang-2 para su capacidad para inhibir la fosforilación de Tie-2. Brevemente, se sembraron 7x105 HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY) en placas de cultivo celular de 6 cm en 3,5 ml de medio completo MCDB131 (Vec Technologies, Rensselaer, NY). Al día siguiente, las células se lavaron con Opti-MEM (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y se alimentaron con 2 ml de Opti-MEM. Se añadieron a las células adenovirus recombinantes que codifican o bien la proteína verde fluorescente (GFP; control) o bien FOXO1 humano (Daly et al. 2004 Genes Dev. 18:1060) a una concentración de 10 ufp/célula y se incubaron durante cuatro horas. Entonces, las células se lavaron con MCDB131 y se alimentaron con 2 ml de MCDB131 que contenía anticuerpos anti-Ang-2 a una concentración de 0,5 µg/ml. A las veinte horas después de la infección, las células se lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación de Tie-2 como se describe por Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 703:1549115496 (2006). Se recogió la inmunoglobulina sobre perlas de proteína A/G (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante una hora. Se lavaron las perlas con tampón de lisis frío y se resuspendieron en tampón de muestra SDS para el análisis por transferencia Western con anticuerpos específicos para la fosfotirosina (Millipore, Billerica, MA) o Tie-2. Se detectaron señales usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y reactivos ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se escanearon las películas de rayos X y se cuantificaron las señales de fosfo-Tie-2 y Tie-2 usando el software ImageJ. Las relaciones fosfo-Tie-2/Tie-2 se usaron para determinar el º% de inhibición para cada anticuerpo anti-Ang-2 (es decir, Porcentaje de inhibición = Reducción en fosfo-Tie-2/Tie-2 en comparación con el control). Por ejemplo, una reducción en la fosforilación de Tie-2 hasta el nivel observado en la muestra control se considera que es el 100 º% de inhibición. La inhibición relativa (+, ++, +++) para cada anticuerpo anti-Ang-2 probado según el porcentaje de inhibición observado (25-50 º%, 50-75 º%, 75-100 º%, respectivamente) se muestra en la Tabla 23.
Tabla 23
Anticuerpo
Inhibición de la fosforilación de Tie-2
H1H685P
+++
H1H690P
+++
H1H691P
+++
H1H693P
+++
H1H694P
++
H1H695P
+++
H1H696P
+++
H1H704P
+++
H1H706P
+++
H1H707P
+++
H1M724N
+++
H1M728N
++
H1M732N
++
H1M742N
++
H1M743N
+++
H1M744N
+++
H1M749N
++
H1M750N
+++
Control I (Ab)
+
Control II (Pb)
+++
Como se demuestra en este ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 generados según los métodos del Ejemplo 1 inhibieron la fosforilación de Tie-2 a un mayor grado que el anticuerpo de Control I. Se observó una inhibición especialmente fuerte con los anticuerpos H1H685, H1H690, H1H691, H1H693, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706, H1H707, H1M724, H1M744 y H1M750.
Ejemplo 8. Inhibición de la fosforilación de Tie-2 mediada por Ang-1
Como se muestra en el ejemplo previo, la Ang-2 puede mediar la fosforilación de Tie-2. La Ang-1 también es capaz de promover la fosforilación de Tie-2. En el presente ejemplo se evaluó la capacidad de anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados para bloquear la fosforilación de Tie-2 mediada por Ang-1.
Se sembraron células EA.hy926 (Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3734-3737 (1983)) a 5x106 células por placa de 10 cm en 10 ml de DMEM con 10 º% de FBS, HAT, L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Después de 24 horas, las células se privaron de suero durante 1 hora en 10 ml de DMEM + 1 mg/ml de BSA. Entonces las células
se estimularon durante 10 minutos con 500 ng/ml de Ang-1 humana recombinante (R&D Systems) en presencia de tanto un anticuerpo de control de isotipo irrelevante (“9E10”) a 400 nM o del anticuerpo anti-Ang-2 H1H685P, como de agentes de control (Control I, Control II, Control IV, o Control V) a concentraciones que oscilan de 10 a 400 nM.
Tras la incubación, las células se lisaron y se inmunoprecipitó Tie-2 como se ha descrito por Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 703:15491-15496 (2006). Se recogieron los complejos inmunes por incubación con perlas de proteína A/G (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 60 min. Se lavaron las perlas con tampón de lisis frío y las proteínas unidas se eluyeron calentando en tampón de muestra SDS. Entonces las muestras se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos monoclonales contra Tie-2 o fosfotirosina (clon 4G10, Millipore, Billerica, MA). Los resultados se muestran en la Figura 2.
Se detectaron señales usando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y reactivos ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se escanearon las películas de rayos X y se cuantificaron las señales de fosfo-Tie-2 y Tie-2 usando el software ImageJ. Las relaciones fosfo-Tie-2/Tie-2 se usaron para determinar el º% de inhibición para cada anticuerpo o pepticuerpo. Porcentaje de inhibición = reducción en fosfo-Tie2/Tie-2 en comparación con la muestra control (anticuerpo de control de isotipo 400 nM).
En presencia del anticuerpo de control 9E10, la Ang-1 activó fuertemente la fosforilación de Tie-2 (Figura 2, panel A
– compárense los carriles 2 y 3 frente al carril 1). Todos los agentes control que se probaron inhibieron significativamente la fosforilación de Tie-2, produciéndose la inhibición completa a 50 nM para el Control II (Figura 2, panel B carril 17), 100 nM para el Control IV (Figura 2, panel A carril 11) y 200 nM para el Control I (Figura 2, panel B carril 24) y Control V (Figura 2, panel C carril 9). Por el contrario, H1H685P no tuvo efecto inhibidor significativo incluso a 400 nM (Figura 2, panel A carriles 4-8). Estos resultados proporcionan confirmación adicional de la especificidad de H1H685P por Ang-2 con respecto a Ang-1.
Ejemplo 9. Inhibición del crecimiento tumoral por los anticuerpos anti-Ang-2
Se determinó el efecto de los anticuerpos anti-Ang-2 purificados seleccionados sobre el crecimiento tumoral usando dos líneas de células tumorales.
PC3 (línea celular de cáncer de próstata humano) Brevemente, se inyectaron por vía subcutánea 5x106 células PC3 en 100 µl de Matrigel reducido por factor de crecimiento (BD Biosciences) en los flancos de ratones sin pelo macho NCr de 6-8 semanas de edad (Taconic, Hudson, NY). Después de que los volúmenes de tumor alcanzaron un promedio de aproximadamente 200 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos para el tratamiento. Se administró a los ratones en cada grupo de tratamiento un anticuerpo anti-Ang-2, proteína Fc, o construcción de control, a una concentración de 10 mg/kg mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante aproximadamente tres semanas (Tabla 24) o a concentraciones de 2,5, 12,5 o 25 mg/kg mediante inyección subcutánea dos veces por semana durante aproximadamente tres semanas (Tabla 25). Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento y se midieron los pesos del tumor después de la extirpación de los tumores a la conclusión del experimento. Para cada grupo de tratamiento se calcularon los promedios (media +/desviación estándar) del peso y crecimiento tumoral. Los porcentajes de disminución del peso y del crecimiento tumoral se calcularon a partir de la comparación con las mediciones de la proteína Fc. Los resultados se resumen en las Tablas 24 y 25.
Tabla 24
Anticuerpo
Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
0,66 ± 0,26 - 509 ± 213 -
Control I (Ab)
0,47 ± 0,23 29 300 ± 242 41
H1H724N
0,55 ± 0,07 17 392 ± 169 23
H1H744N
0,43 ± 0,20 35 259 ± 212 49
H1H685P
0,44 ± 0,12 33 305 ± 143 40
H1H691P
0,59 ± 0,07 11 485 ± 141 5
H1H706P
0,52 ± 0,14 21 329 ± 125 35
Tabla 25
Anticuerpo
Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
1031 ± 485 -
Control II (Pb) (2,5 mg/kg)
356 ± 196 65
Control II (Pb) (12,5 mg/kg)
360 ± 162 65
Anticuerpo
Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Control II (Pb) (25 mg/kq)
527 ± 218 49
H1H685P (2,5 mg/kg)
308 ± 274 70
H1H685P (12,5 mg/kg)
550 ± 150 47
H1H685P (25 mg/kg)
413 ± 208 60
Como se muestra anteriormente,, los anticuerpos H1H744N y H1H685P demostraron actividad antitumoral especialmente marcada en el modelo de tumor de ratón PC3 en comparación con las construcciones de control.
Los resultados de experimentos similares usando el modelo de tumor de ratón PC3 y diferentes anticuerpos experimentales (dosificados a 2 mg/kg, dos veces por semana) se muestran en las Tablas 26 y 27.
Tabla 26
Anticuerpo
Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
0,626 ± 0,156 - 356 ± 93 -
Control I (Ab)
0,347 ± 0,093 45 250 ± 145 30
H2M742N
0,407 ± 0,076 35 220 ± 102 38
H2M743N
0,372 ± 0,122 41 179 ± 169 50
10 Tabla 27
Anticuerpo
Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
0,552 ± 0,211 - 473 ± 202 -
H1M749N
0,383 ± 0,275 31 220 ± 261 54
H1M750N
0,348 ± 0,128 37 227 ± 195 52
COLO 205 (línea de células de adenocarcinoma colorrectal humano) Brevemente, se inyectaron por vía subcutánea 2x106 células COLO 205 en 100 µl de medio libre de suero en el flanco de ratones sin pelo macho NCr de 6-8 semanas de edad (Taconic, Hudson, NY). Después de que los volúmenes del tumor alcanzaron un promedio de 15 aproximadamente 150 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos para el tratamiento con anticuerpo o con proteína Fc. Se administró a los ratones en cada grupo de tratamiento un anticuerpo anti-Ang-2 o proteína Fc a una concentración de 4 mg/kg mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante aproximadamente dos semanas. Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento y se midieron los pesos del tumor después de la extirpación de los tumores a la conclusión del experimento. Se
20 calcularon los promedios (media +/-desviación estándar) del peso y del crecimiento tumoral para cada grupo de tratamiento. “Crecimiento tumoral promedio” representa el crecimiento promedio desde el inicio del tiempo de tratamiento (cuando los tumores eran de aproximadamente 150 mm5). Los porcentajes de disminución del peso y del crecimiento tumoral se calculan a partir de la comparación con las mediciones de la proteína Fc. Los resultados se resumen en la Tabla 28.
Tabla 28
Anticuerpo
Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
0,847 ± 0,180 - 731 ± 249 -
Control I (Ab)
0,503 ± 0,090 41 367 ± 121 50
Control II (Pb)
0,608 ± 0,085 28 492 ± 82 33
H1 M724N
0,531 ± 0,103 37 336 ± 125 54
H2M742N
0,576 ± 0,057 32 427 ± 92 42
H2M744N
0,491 ± 0,051 42 409 ± 162 44
H1M749N
0,603 ± 0,142 29 449 ± 169 39
Se llevó a cabo un experimento similar para evaluar el efecto de H1H685P, en particular, sobre el crecimiento tumoral de COLO 205. Brevemente, se implantaron por vía subcutánea 2x106 células COLO 205 en 100 µl de medio
31 5
libre de suero en el flanco trasero derecho derecha de ratones SCID CB17 macho de 9-11 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron ~125 mm3, los ratones se aleatorizaron en 5 grupos (n = 7-8 ratones/grupo) y se trataron dos veces por semana con proteína Fc (15 mg/kg), H1H685P (5 o 25 mg/kg) o Control II (5 o 25 mg/kg) durante un periodo de 19 días. Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento y se midieron los pesos del tumor después de la extirpación de los tumores al final del experimento. Se calcularon para cada grupo los promedios del peso y crecimiento tumoral desde el comienzo del tratamiento. Los porcentajes de disminución del peso y del crecimiento tumoral se calculan a partir de la comparación con el grupo control de Fc. Los resultados se muestran en la Tabla 29.
Tabla 29
Anticuerpo
Concentración de anticuerpo Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
25 mg/kg 0,800 ± 0,108 - 675 ± 93 -
Control II (Pb)
5 mg/kg 0,481 ± 0,091 40 288 ± 85 57
Control II (Pb)
25 mg/kg 0,393 ± 0,136 51 267 ± 155 60
H1H685P
5 mg/kg 0,458 ± 0,125 43 370 ± 114 45
H1H685P
25 mg/kg 0,430 ± 0,139 46 295 ± 160 56
Al igual que con el modelo de tumor de ratón PC3, varios de los anticuerpos de la invención, incluyendo H1H685P, presentaron actividades antitumorales sustanciales en el modelo de ratón de COLO 205 que fueron al menos equivalentes a las actividades antitumorales presentadas por las moléculas control.
Ejemplo 10. Inhibición del crecimiento tumoral y perfusión mediante una combinación de un anticuerpo antiAng-2 y un inhibidor de VEGF
Para determinar el efecto de combinar un anticuerpo anti-Ang-2 con un inhibidor de VEGF sobre el crecimiento de xenoinjertos de COLO 205, se implantaron 2 x 106 células por vía subcutánea en el flanco trasero derecho de ratones SCID hembra de 6-8 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de ~350 mm3, los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (n = 6 ratones/grupo) y se trataron con: Proteína Fc humana (7,5 mg/kg), H1H685P (5 mg/kg), VEGF Trap (véase el documento US 7.087.411) (2,5 mg/kg) o la combinación de H1H685P + VEGF Trap. Se administró a los ratones un total de 3 dosis a lo largo de 10 días de tratamiento. Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento. Se calcularon para cada grupo de tratamiento los promedios del crecimiento tumoral desde el comienzo del tratamiento (media +/desviación estándar). El porcentaje de disminución del crecimiento tumoral se calculó a partir de la comparación con el grupo de control de Fc. Los resultados se muestran en la Tabla 30. Obsérvese que en los grupos de VEGF Trap y en los de H1H685P + VEGF Trap el promedio de tamaño del tumor fue más pequeño al final del tratamiento que al principio, es decir, se observó regresión del tumor.
Tabla 30
Anticuerpo
Crecimiento tumoral promedio (mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
366 ± 65 -
H1H685P
74 ± 77 80
VEGF Trap
62 ± 44 117
H1H685P + VEGF Trap
221 ± 131 160
Los resultados de este experimento demuestran que la combinación de H1H685P + VEGF Trap produce una disminución en el crecimiento tumoral que es superior al porcentaje de disminución en el crecimiento tumoral producido por cualquiera componente solo.
Para proporcionar pruebas adicionales de la eficacia de la combinación, se evaluó el efecto de la combinación de H1H685P + VEGF Trap sobre el crecimiento de tumores MMT. Se implantaron 0,5 x 106 células MMT por vía subcutánea en el flanco trasero derecho de ratones SCID hembra de 6-8 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de ~400 mm3, los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (n = 11 ratones/grupo) y se trataron con: proteína Fc humana (17,5 mg/kg), H1H685P (12,5 mg/kg), VEGF Trap (5 mg/kg) o la combinación de H1H685P + VEGF Trap. Se administraron a los grupos de Fc y de H1H685P 3 dosis a lo largo de 9 días. A los grupos de VEGF Trap y de combinación se les administraron 4 dosis a lo largo de 12 días. Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento y se midieron los pesos del tumor después de la extirpación de los tumores al final del experimento (debido a su gran tamaño, los tumores de los
grupos de Fc y de H1H685P se recogieron 3 días antes que los tumores de los grupos de VEGF Trap y de combinación). Se calcularon para cada grupo los promedios (media +/-desviación estándar) del crecimiento tumoral desde el comienzo del tratamiento y del peso del tumor. Los porcentajes de disminución del peso y del crecimiento tumoral se calcularon a partir de la comparación con el grupo de control de Fc. Los resultados se muestran en la Tabla 31.
Tabla 31
Anticuerpo
Peso del tumor promedio (g) % de disminución en el peso del tumor Crecimiento tumoral promedio(mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc
1,591 ± 0,265 - 1337 ± 273 -
H1H685P
1,409 ± 0,314 11 1135 ± 306 15
VEGF Trap
0,889 ± 0,141 44 536 ± 179 60
H1 H685P + VEGF Trap
0,599 ± 0,066 62 215 ± 92 84
Estos resultados confirman el potenciado efecto de inhibición del tumor de H1H685P + VEGF Trap con respecto a 10 los tratamientos con un único agente.
Para determinar si la combinación de H1H685P + VEGF Trap tiene un efecto mayor sobre la función de los vasos
del tumor que los agentes individuales, se usó un micro-ultrasonidos (sistema de imagen VisualSonics’ Vevo 770)
para evaluar los cambios en la perfusión del tumor. Se cultivaron tumores COLO 205 hasta ~125 mm3 y entonces los 15 ratones se trataron durante 24 h con H1H685P, VEGF Trap o la combinación de ambos agentes. Tras el tratamiento
se determinó la perfusión de los vasos del tumor basándose en la adquisición de la imagen 2D por micro
ultrasonidos mejorada por contraste y análisis de una curva de “lavado interno”, que representa la cantidad de
agente de contraste que entra en el tumor. Se calculó para cada grupo el promedio (media +/-desviación estándar)
de la perfusión del tumor. El porcentaje de disminución se calculó a partir de la comparación con el grupo de control 20 de Fc. Los resultados se muestran en la Tabla 32.
Tabla 32
Anticuerpo
Perfusión relativa del tumor % de disminución en la perfusión del tumor
Proteína Fc
8,09 ± 2,16 -
H1H685P
6,32 ± 2,81 22
VEGF Trap
6,99 ± 1,36 14
H1H685P + VEGF Trap
2,46 ± 0,34 70
De forma consistente con el efecto potenciado del tratamiento de combinación sobre la perfusión, la tinción con anti
25 CD31 de secciones del tumor demostró un efecto más potente de la combinación sobre la densidad de los vasos sanguíneos del tumor (datos no mostrados). El aumento del efecto de la combinación de H1H685P + VEGF Trap sobre la función de la vasculatura del tumor proporciona una posible explicación de los efectos potenciados de la terapia de combinación sobre el crecimiento tumoral.
30 Ejemplo 11. Inhibición del crecimiento tumoral por una combinación de un anticuerpo anti-Ang-2 y un agente quimioterapéutico
Para probar el efecto de H1H685P en combinación con un agente quimioterapéutico sobre el crecimiento tumoral, se implantaron por vía subcutánea 2,5 x 106 células tumorales COLO 205 en el flanco trasero derecho de ratones SCID 35 macho de 8-9 semanas de edad. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de ~150 mm3 (día 17 después de la implantación), los ratones se aleatorizaron en 4 grupos (n = 5 ratones/grupo) y se trataron del siguiente modo: el primer grupo se trató sc con 15 mg/kg de hFc y por vía intraperitoneal (ip) con vehículo 5-FU; el segundo grupo se trató sc con 15 mg/kg de H1H685P; el tercer grupo se trató ip con 75mg/kg de 5-FU; el cuarto grupo se trató con la combinación de 15 mg/kg H1H685P sc más 75 mg/kg de 5-FU ip. Los ratones recibieron un
40 total de tres tratamientos, administrados cada 3-4 días. Se midieron los volúmenes del tumor dos veces por semana durante el transcurso del experimento. Se calculó para cada grupo el promedio (media +/-desviación estándar) del crecimiento tumoral desde el comienzo del tratamiento hasta el día 38. Se calculó el porcentaje de disminución del crecimiento tumoral a partir de la comparación con el grupo control. Los resultados se muestran en la Tabla 33.
Tabla 33
Tratamiento
Crecimiento tumoral promedio(mm3) % de disminución en el crecimiento tumoral
Proteína Fc + vehículo 5-FU
574 ± 110 -
H1H685P
405 ± 80 29
5-FU
313 ± 60 45
H1H685P + 5-FU
175 ± 78 70
Los resultados de este experimento muestran que la combinación de H1H685P y 5-FU causó una mayor disminución en el crecimiento tumoral que cualquier agente administrado por separado. 5
Ejemplo 12. Los anticuerpos anti-Ang-2 atenúan la angiogénesis ocular in vivo
En este ejemplo se evaluaron los efectos de anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados sobre la vascularización retiniana en un modelo de ratón.
10 En un conjunto de experimentos se usaron ratones no mutantes. En otro conjunto se usaron ratones que expresan una Ang-2 humana en lugar de la Ang-2 de ratón no mutante (denominados “ratones con hu-Ang-2”). Se inyectaron por vía subcutánea ratones de dos días de edad (P2) con o bien control de Fc o bien con anticuerpos antiAng-2 seleccionados a una dosis de 12,5 mg/kg. Tres días después (en P5), las crías se sacrificaron y se extirparon los
15 globos oculares y se fijaron en PFA al 4 º% durante 30 minutos. Se diseccionaron las retinas, se tiñeron con lectina-1 Griffonia simplicifolia durante 3 horas o durante toda la noche a 4 ºC para visualizar la vasculatura, y se montaron en plano sobre portaobjetos de microscopio. Se tomaron imágenes usando una cámara de microscopio Nikon Eclipse 80i y se analizaron usando el software Adobe Photoshop CS3, Fovea 4.0, y Scion 1.63.
20 Se midieron las áreas de la retina cubiertas con vasculatura superficial y se usaron como una lectura de la actividad del anticuerpo. La reducción del tamaño de las áreas vasculares en los ratones tratados con anticuerpo en comparación con los controles tratados con Fc se presenta en la Tabla 34. El porcentaje de reducción en el área vascular refleja la potencia antiangiogénica del anticuerpo. (N/D = No determinado)
25 Tabla 34
% de reducción en el área vascular con respecto a control de Fc
Anticuerpo
Ratones no mutantes Ratones con hAng-2
H1H685P
39,7 N/D
H1H690P
30,7 41,5
H1H691P
30,4 N/D
H1H696P
31,1 N/D
H1 H724N
32,2 33,2
H1H744N
35,8 50,5
Control I (Ab)
26,9 35,6
Como se muestra en este ejemplo, los anticuerpos anti-Ang-2 seleccionados de la presente invención inhibieron sustancialmente la angiogénesis ocular in vivo, reflejando así el probable potencial antiangiogénico de estos anticuerpos en otros contextos terapéuticos.
Ejemplo 13. Aminoácidos de la Ang-2 importantes para la unión del anticuerpo
Para caracterizar adicionalmente la unión entre la hAng2 y los mAb anti-hAng2 de la invención, se generaron siete proteínas hAng2-FD-mFc de variante, conteniendo cada una una única mutación puntual. Los aminoácidos 35 seleccionados para la mutación se basaron en la diferencia en la secuencia entre hAng-2 y hAng-1 en la región que interacciona con hTie-2 (Figura 1). En particular, los aminoácidos dentro del dominio tipo fibrinógeno (FD) de la Ang2 que se cree que interaccionan con Tie-2 basándose en el análisis de la estructura cristalina, pero que difieren del aminoácido correspondiente en la Ang-1, se mutaron individualmente al residuo de hAng-1 correspondiente. Los resultados de este ejemplo indican los residuos aminoácidos de hAng-2 con los que interaccionan los anticuerpos de
40 unión preferencial a la Ang-2. Es decir, si un residuo particular (o residuos) de hAng-2 se cambia al residuo correspondiente de hAng-1, y la unión de un anticuerpo de unión preferencial a Ang-2 está sustancialmente reducida, entonces puede llegarse a la conclusión de que el anticuerpo interacciona con ese (esos) residuo(s) o particular(es) de hAng-2.
En este experimento, cada una de las siete proteínas mutantes hAng-2FD-mFc se capturaron (~147-283 UR) sobre una superficie anti-Fc de ratón creada mediante el acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™. Entonces se inyectó cada anticuerpo para Ang-2 (o pepticuerpo, según el caso) a 100 nM sobre la superficie de la proteína capturada hAng-2FD marcada con mFc a un caudal de 50 µl/min durante 180 s, y la disociación de la hAng2-FDmFc de variante y el anticuerpo se monitorizó en tiempo real durante 20 min a 25 ºC. Los resultados se resumen en las Tablas 35a 35d y la Figura 3.
Tabla 35a
Aminoácido(s) de hAng-2 mutados [1]
H1H685P H1H744N
UR
KD (M) T½ (min) UR KD (M) T½ (min)
WT[2]
210,70 2,23E-11 1988 213 3,98E-11 904
S-417-I
127,65 3,05E-11 1809 127 5,12E-11 1590
K-432-N
152,68 1,40E-11 4468 137 4,87E-11 1690
I-434-M
235,95 1,79E-11 3600 213 3,18E-11 2589
N-467-G
152,25 9,38E-12 6762 139 7,72E-11 1011
F-469-L
101,16 1,38E-08 4 180 1,95E-10 237
Y-475-H
181,53 1,96E-10 289 247 3,06E-10 136
S-480-P
161,13 2,05E-10 289 228 2,25E-11 2129
Tabla 35b
Aminoácido(s) de hAng-2 mutados [1]
Control I (Ab) Control II (Pb)
UR
KD (M) T½ (min) UR KD (M) T½ (min)
WT[2]
195,25 4,69E-10 54,33 67,44 4,29E-10 39,86
S-417-I
142,96 5,79E-10 32,81 49,99 1,88E-10 36,38
K-432-N
189,69 3,49E-10 51,75 63,21 1,39E-10 42,34
I-434-M
282,10 4,64E-10 48,80 89,15 1,36E-10 57,09
N-467-G
180,90 4,61 E-10 44,66 60,94 1,54E-10 46,97
F-469-L
173,01 1,05E-09 25,13 46,73 2,40E-10 36,20
Y-475-H
170,05 1,15E-08 1,85 74,79 1,40E-10 54,12
S-480-P
181,32 2,98E-09 13,36 71,90 1,79E-10 45,45
Tabla 35c
Aminoácido(s) de hAng-2 mutados [1]
Control III (Pb) Control V (Ab)
UR
KD (M) T½ (min) UR KD (M) T½ (min)
WT[2]
80,33 2,07E-11 170,03 214,48 7,97E-10 48,43
S-417-I
57,13 5,31E-11 114,81 126,45 2,40E-09 29,17
K-432-N
79,22 2,88E-11 200,94 149,14 8,48E-10 75,59
I-434-M
116,22 2,15E-10 62,77 214,75 2,23E-09 31,76
N-467-G
74,64 8,90E-11 109,07 146,77 1,11E-09 55,66
F-469-L
72,66 2,74E-10 66,11 131,96 1,37E-08 1,46
Y-475-H
76,21 6,87E-09 4,11 260,93 2,66E-10 93,22
S-480-P
77,93 2,78E-09 11,69 177,10 3,47E-09 10,33
Tabla 35d
Aminoácido(s) de hAng-2 mutados [1]
Control negativo (anticuerpo irrelevante)
UR
KD (M) T½ (min)
WT[2]
0,81 N/B N/B
S-417-1
-1,21 N/B N/B
K-432-N
-0,38 N/B N/B
I-434-M
-1,31 N/B N/B
N-467-G
-1,09 N/B N/B
F-469-L
0,32 N/B N/B
Aminoácido(s) de hAng-2 mutados [1]
Control negativo (anticuerpo irrelevante)
UR
KD (M) T½ (min)
Y-475-H
-0,20 N/B N/B
S-480-P
-0,52 N/B N/B
[1] [1] La numeración de aminoácidos se basa en la numeración de aminoácidos de SEQ ID NO: 518. [2] WT = construcción Ang-2FD-mFc no mutante. N/B = no se observa unión.
Para los fines de la presente invención, se considera que un anticuerpo anti-Ang-2 interacciona con un residuo de aminoácido de Ang-2 particular si, cuando el residuo es mutado al residuo correspondiente de Ang-1, el T½ de disociación es al menos 5 veces inferior al T½ de disociación observado para la construcción no mutante en las 5 condiciones experimentales usadas en este ejemplo. En vista de esta definición, el anticuerpo H1H685P parece ser el único de entre los anticuerpos probados que interacciona con F469, Y475 y S480. Ya que H1H685P también es el único debido a su fuerte unión preferencial a la Ang-2 con respecto a la Ang-1, puede llegarse a la conclusión de que F469, Y475 y S480 comprenden un epítopo que permite la distinción inmunológica de Ang-2 de Ang-1. Los otros anticuerpos/pepticuerpos probados en este experimento parece que interaccionan como máximo con uno o dos de
10 estos residuos; es decir, H1H744N y Control I interaccionan con Y475; Control III interacciona con Y475 y S480; y Control V interacciona con F469. De manera interesante, Control II, que se mostró que bloqueaba la unión tanto de la Ang-1 como de la Ang-2 a Tie-2 con igual potencia, no interacciona con ninguno de los aminoácidos específicos de la Ang-2 identificados en este experimento.
15 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Anticuerpos humanos de alta afinidad para la angiopoyetina-2 humana 20
<130> 6200A WO
<140> A asignar
<141> Presentado con la presente 25
<150> 61/229.418
<151> 29-7-2009
<150> 61/295.194 30 <151>
<160> 531
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 35
<210> 1
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 40
<220>
<223> sintética
<400> 1 45
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 2
10
15
<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética <400> 3 ggattcacct tcagtagcta cgac 24
25
<210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
30
<220> <223> sintética
<400> 4
35
<210> 5
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> sintética
<400> 5
45
attggtcctg ctggtgacac a 21
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 6
15
<210> 7 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
<400> 7 gcaagaggtt tgattacgtt tggggggctt atcgccccgt ttgactac
48
25
<210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
<400> 8
35
<210> 9 <211> 324 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
45
<400> 9
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 10
5
<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética
15 20
<400> 11 cagagtgtta gcagcaccta c <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética 21
25
<400> 12
<210> 13
<211> 9 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 35
<400> 13 ggtgcatcc 9
<210> 14 40 <211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> sintética
<400> 14
5
<210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética <400> 15 cagcattatg ataactcaca aacg 24
15
<210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 16
25
<210> 17
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> sintética
<400> 17
35
<210> 18
<211> 122 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 45
<400> 18
<210> 19
<211> 321 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 10
<400> 19
15 <210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 20
<210> 21
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 21
10
<210> 22
<211> 122 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 22
25 <210> 23
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 23
<210> 24
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 10
<400> 24
15 <210> 25
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 25
<210> 26
<211> 122
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
35 <400> 26
5
<210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética <400> 27 ggattcacct ttagcagcta tgcc 24
15
<210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 28
25 30
<210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética
35
<400> 29 attactggga gtggtgatac caca 24
40
<210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
45
<400> 30
5
<210> 31 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética <400> 31 gcgaaagatt ttcttgacta cagtacctac cttgcttttg atctc 45
15
<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 32
25
<210> 33
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> sintética
<400> 33
35
<210> 34
<211> 108 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 45
<400> 34
5
<210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética <400> 35 cagagtgtta gcagctac 18
15
<210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 36
25 30
<210> 37 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética
35
<400> 37 gatgcatct 9
40
<210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
45
<400> 38
5
<210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética
10
<400> 39 cagcagcgta gcaactggcc gctcact 27
15
<210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
20
<400> 40
<210> 41 25 <211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> sintética
<400> 41
35
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> sintética
<400> 42
45
<210> 43
<211> 321 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 10
<400> 43
15 <210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 44
<210> 45
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 45
10
<210> 46
<211> 122 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 46
25 <210> 47
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 47
<210> 48
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 10
<400> 48
15 <210> 49
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 49
<210> 50
<211> 122
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
35 <400> 50
5
<210> 51 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética
<400> 51 ggattcacct ttgatgatta tgcc
24
15
<210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 52
<210> 53
<211> 24
<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
35 <400> 53 attagttgga atagtggtga cata 24
<210> 54
<211> 8 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 45
<400> 54
5
<210> 55 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> sintética
15 20
<400> 55 gcaaaagctt acggtgacta ctactacttt tacggtatgg acgtc <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética 45
25
<400> 56
<210> 57
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<223> sintética
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20
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<223> sintética
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<223> sintética 10
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20
<220> <223> sintética
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<223> sintética 45
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética 45
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<220>
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<223> sintética
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<211> 122
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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20
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<400> 128
25
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<223> sintética 45
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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20
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<210>
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35
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40
<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética 10
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<223> sintética
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5
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10
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<220>
<223> sintética 20
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30 <220>
<223> sintética
<400> 143
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<211> 106
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 144
10
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 145
25 <210> 146
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 146
<210> 147
<211> 24
<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
<400> 148
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 150 <210> 154
5
<210> 151 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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<210> 152 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> sintética
<400> 152
25
<210> 153
<211> 324
<212> ADN
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30
<220>
<223> sintética
<400> 153
35
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 45
<400> 154
<210> 155
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 155 cagggcatta gcaattat 18
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 156
<210> 157
<211> 9
<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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20
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25
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30
<220>
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35
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<220>
<223> sintética 45
<400> 162
<210> 163
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<220>
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20 <220>
<223> sintética
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<211> 357
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5
<220>
<223> sintética
<400> 165
10
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 166
25 <210> 167
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 167
<210> 168
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 168
10
15 <210> 169
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 169
<210> 170
<211> 120
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> sintética
<400> 172
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética 45
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética 20
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<223> sintética 20
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30 <220>
<223> sintética
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<220> <223> sintética
<400> 200
<211> 324
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30 <220>
<223> sintética
<400> 201
<210> 202
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<211> 18
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
<400> 204
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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20
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética 20
<400> 214
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética 10
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<211> 372
<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética 35
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<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<211> 8
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<223> sintética
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<223> sintética 45
<400> 226
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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231
<210>
233
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5
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10 15
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20
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<220>
<223> sintética 30
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35 <210> 234
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<212> PRT
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<223> sintética
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<211> 321 5 <212> ADN
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<220>
<223> sintética 10
<400> 235
15 <210> 236
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 236
<210> 237
<211> 372
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 237
10 <210> 238
<211> 124
<212> PRT
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15 <220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<210> 240
<211> 107
<212> PRT
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5
<220>
<223> sintética
<400> 240
10
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<220>
<223> sintética 20
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25 <210> 242
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 242
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<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<210> 244
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<212> PRT
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<220>
<223> sintética
<400> 244
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<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<212> PRT
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<220>
<223> sintética
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20
<220> <223> sintética
<400> 248
25
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<212> ADN
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30
<220>
<223> sintética
<400> 249
35
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<220>
<223> sintética 45
<400> 250
<210> 251
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<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 252
<210> 253
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<220>
<223> sintética
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<212> PRT
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<220>
<223> sintética
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5
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15
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20
<400> 256
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257 25 <211> 360
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> sintética
<400> 257
35
<210> 258
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> sintética
<400> 258
45
<210> 259
<211> 321 5 <212> ADN
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<220>
<223> sintética 10
<400> 259
15 <210> 260
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 260
<210> 261
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 261
10
<210> 262
<211> 120 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 262
25 <210> 263
<211> 322
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 263
<210> 264
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> sintética
<400> 264
10
<210> 265
<211> 375 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 20
<400> 265
25 <210> 266
<211> 125
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> sintética
<400> 266
<210> 267
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 267 ggattcaccc tcagtaacta tggc 24
<210> 268
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 268
<210> 269
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 269 atatggcatg atggaagtaa taca 24
<210> 270
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 270
<210> 271
<211> 54 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética 10
<400> 271
15 <210> 272
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> sintética
<400> 272
<210> 273
<211> 321
<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
35 <400> 273
<210> 274 40 <211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> sintética
<400> 274
<210> 275
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 275 cagggcatta gaaatgat 18
<210> 276
<211> 6
<212> PRT
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<220>
<223> sintética
<400> 276
<210> 277
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 277 gctgcatcc 9
<210> 278
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
<400> 278
5
<210> 279 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> sintética
10
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15
<210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial
<220> <223> sintética
20
<400> 280
<210> 281 25 <211> 375
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> sintética
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35
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<212> PRT
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40
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética 45
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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45
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> sintética
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<212> ADN
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30
<220>
<223> sintética
<400> 377
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<220>
<223> sintética 45
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<211> 318 5 <212> ADN
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<220>
<223> sintética 10
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<223> sintética
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<211> 363
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5
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<223> sintética
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10
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<220>
<223> sintética 20
<400> 382
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<223> sintética
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<223> sintética 10
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20
<220>
<223> sintética
<400> 385
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<220>
<223> sintética 35
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<212> ADN
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<220>
<223> sintética
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<212> PRT
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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<220>
<223> sintética
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5
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15
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20
<220> <223> sintética
<400> 392
25
<210> 393
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> sintética
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<223> sintética
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<223> sintética
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<211> 88
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 531

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo humano aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (hAng2) con una KD de inferior a 80 pM, pero que no presenta ninguna unión a hAng-1 cuando se prueba en un ensayo de resonancia de plasmones superficiales y que comprende una CDR-1 de la cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una HCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una cadena ligera CDR-1 (LCDR-1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, una LCDR-2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y una LCDR-3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
  2. 2.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se une a un epítopo en hAng-2 (SEQ ID NO: 518) que comprende:
    (a)
    al menos un aminoácido seleccionado de F-469, Y-475 y S-480; o
    (b)
    aminoácidos F-469, Y-475 y S-480.
  3. 3.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
  4. 4.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno bloquea la unión de hAng-2 a hTie-2, pero no bloquea sustancialmente la unión de hAng-1 a hTie-2.
  5. 5.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  6. 6.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 5, que comprende además un antagonista de VEGF; en la que el antagonista de VEGF está opcionalmente seleccionado de un anticuerpo anti-VEGF, un inhibidor de cinasas de molécula pequeña del receptor de VEGF y una proteína de fusión inhibidora de VEGF.
  7. 7.
    El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene:
    (a)
    un tumor; o
    (b)
    una enfermedad ocular asociada a la angiogénesis.
  8. 8.
    Uso del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene:
    (a)
    un tumor; o
    (b)
    una enfermedad ocular asociada a la angiogénesis.
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