ES2585482T3 - Péptido terapéutico de la proteína básica de la mielina PBM83-99 unido a manano - Google Patents

Péptido terapéutico de la proteína básica de la mielina PBM83-99 unido a manano Download PDF

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Abstract

Un conjugado que comprende: (i) manano; y (ii) al menos un epítopo que comprende un péptido que es la PBM83-99, en forma lineal; en el que dicho epítopo se une a manano a través de un puente [(Lys-Gly)n], en el que n es un número entero de 1 a 10.

Description

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Más preferentemente, el epítopo es un péptido seleccionado entre GMO38-55 y GMO97-108, y variantes de los mismos, en forma lineal o cíclica.
En un aspecto, el epítopo comprende el péptido GMO35-55, o una variante del mismo. Más preferentemente, el epítopo es GMO35-55, o una variante del mismo, en forma lineal o cíclica.
En un aspecto, el epítopo corresponde a la secuencia peptídica SEQ ID NO. 2, o una variante de la misma:
H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-V al-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH [SEQ ID NO. 2]
en forma lineal o cíclica. Preferentemente, el péptido está en forma lineal.
En otro aspecto, el epítopo comprende un fragmento peptídico de la proteína proteolipídica (PPL) en forma lineal o cíclica.
Preferentemente, el epítopo comprende un péptido seleccionado entre PPL97-117, PPL185-206, PPL40-60, PPL139-151, PPL190-209, PPL184-199, PPL80-88, PPL30-49, PPL180-199, y sus variantes, en forma lineal o cíclica.
Más preferentemente, el epítopo es un péptido seleccionado entre PPL97-117, PPL185-206, PPL40-60, PPL139-151, PPL190209, PPL184-199, PPL80-88, PPL30-49, PPL180-199, y sus variantes, en forma lineal o cíclica.
En un aspecto, el epítopo comprende el péptido PPL139-151, o una variante del mismo. Incluso más preferentemente, el epítopo es PPL139-151, o una variante del mismo, en forma lineal o cíclica.
En un aspecto, el epítopo corresponde a la secuencia peptídica SEQ ID NO. 3, o una variante de la misma:
H-His-Ser-Leu-Gly-Lys-Trp-Leu-Gly-His-Pro-Asp-Lys-Phe-OH [SEQ ID NO. 3]
en forma lineal o cíclica. Preferentemente, el péptido está en forma lineal.
Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" incluye cualquier variación en la que; (a) uno o más residuos aminoácidos se sustituyen con un residuo aminoácido presente de forma natural o no natural, (b) se invierte el orden de dos o más residuos aminoácidos, (c) ambos (a) y (b) se presentan juntos, (d) un grupo espaciador está presente entre dos residuos aminoácidos, (e) uno o más residuos aminoácidos se encuentran en forma peptoide, (f) se ha modificado la estructura principal (N-C-C) de uno o más residuos aminoácidos del péptido, o cualquiera de (a)
(f) en combinación. Preferentemente, las variantes surgen de uno de (a), (b) o (c).
Más preferentemente, uno o dos residuos de aminoácidos se sustituyen con uno o varios residuos aminoácidos. Incluso más preferentemente, un residuo aminoácido se sustituye con otro residuo aminoácido. Preferentemente, la sustitución es homóloga.
Se puede producir la sustitución homóloga (tanto sustitución como reemplazo se utilizan en el presente documento con significado de intercambio de un residuo aminoácido existente, con un residuo alternativo) es decir, sustitución de semejante por semejante, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga puede producirse también, es decir, a partir de una clase de residuo a otro, o implica alternativamente la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como ornitina (en lo sucesivo denominada Z), ácido diaminobutírico ornitina (en lo sucesivo denominado B), norleucina ornitina (en lo sucesivo denominada O), piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina, un listado más detallado de lo cual aparece a continuación. En cada resto del transportador peptídico puede modificarse a la vez más de un residuo aminoácido.
Como se utiliza en el presente documento, los aminoácidos se clasifican según las siguientes clases;
básica; H, K, R ácida; D, E
no polar; A, F, G, I, L, M, P, V, W
polar; C, N, Q, S, T, Y,
(empleando la notación de una única letra de aminoácidos aceptada internacionalmente) y la sustitución homóloga y no homóloga se define utilizando estas clases. Por consiguiente, la sustitución homóloga se utiliza para referirse a la sustitución en la misma clase, mientras que la sustitución no homóloga se refiere a la sustitución de una clase diferente o por un aminoácido no natural.
Los grupos espaciadores apropiados que pueden insertarse entre cualesquiera de dos residuos aminoácidos del resto transportador incluyen grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores aminoácidos, tales como residuos de glicina o β-alanina. Una forma adicional de variante, tipo (e), implica la presencia de uno o más residuos aminoácidos en forma peptoide, se entenderá adecuadamente por los expertos en la materia. Para que no quede lugar a dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a una variante de residuos
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aminoácidos en la que el grupo sustituyente α-carbono es un átomo de nitrógeno del residuo en lugar de α-carbono. Los procesos para preparar péptidos en forma peptoide se conocen en la materia, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. La modificación tipo (f) puede producirse por métodos, tales como los descritos en la solicitud internacional PCT/GB99/01855.
En la definición de fórmula (I) se ha demostrado que resulta preferente que la variación de aminoácidos, preferentemente de tipo (a) o (b), se produzca de forma independiente en cualquier posición. Como se ha mencionado previamente puede ocurrir simultáneamente más de una sustitución homóloga o no homóloga. Además la variante puede ocurrir en virtud de la inversión de la secuencia de un número de residuos aminoácidos en una secuencia.
En un aspecto, el reemplazo de un residuo aminoácido se selecciona entre los residuos de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
El péptido de la presente invención puede comprender aminoácidos en forma L o D, es decir, uno o más residuos, preferentemente todos los residuos pueden estar en forma L o D.
El conjugado de la invención se une a manano a través de un puente [(Lys-Gly)n], en el que n es un número entero de 1 a 10. Preferentemente, n es un número entero de 1 a 5, y aún más preferentemente, n es 5. En una realización preferente, n es de 6 a 10, más preferentemente de 7 a 10. En otra realización preferente, n es de 1 a 4, más preferentemente 1 a 3.
La conjugación se produce a través de la formación de base de Schiff entre los grupos amino libres de la lisina y manano oxidado. Los conjugados a manano reducido pueden prepararse mediante la adición de un agente reductor
(p. ej., borohidruro de sodio) a los conjugados a manano oxidado.
El manano (poli-manosa) conjugado a MUC1 FP o péptidos (MUC1, un antígeno encontrado en las células de adenocarcinoma) en la forma oxidada (que comprende aldehídos) o reducida (aldehídos reducidos a alcoholes) genera respuestas inmunitarias diferenciales. El manano se ha utilizado como un transportador capaz de orientar selectivamente péptidos al receptor de manosa, que se encuentra predominantemente en macrófagos y en las células dendríticas (CDs). Tras la unión, se genera la presentación del CMH clase I o CMH clase II de péptidos, ya sea estimulando respuestas inmunitarias LTC/Ac o Th1/Th2. Las citoquinas Th1 liberadas tras la administración terapéutica se asocian con la exacerbación de la EM. No obstante, las citoquinas Th2 (tales como IL-4 e IL-10) poseen propiedades antiinflamatorias y reducen las respuestas Th1. El antígeno de manosa da lugar a una potencia 100-10.000 veces mejorada para estimular la presentación del CMH clase II a los linfocitos T [Apostolopoulos, et al., 2000a; Apostolopoulos, et al., 2000b]. El manano se ha investigado ampliamente por su capacidad para generar respuestas en varios sistemas modelo. Se ha demostrado que su función adyuvante surge de su capacidad para orientar selectivamente el receptor de manosa en las células presentadoras de antígenos. Los ratones (consanguíneos o MUC1 transgénicos) inmunizados con la proteína MUC1 a manano se protegen contra una estimulación tumoral que expresa MUC1, así como la inversión de tumores establecidos en ratones [Apostolopoulos, et al., 1996; Acres, et al., 2000]. Se observaron resultados similares en ratones transgénicos MUC1. Cualquiera de una respuesta Th1 (IL-2, IFN-γ, IL-12, FNT-α y anticuerpos IgG2a) o respuesta Th2 (sin IFN-γ o IL-12, aunque cantidades significativas de IL-4, IL-10 y FCT-β y anticuerpos IgG1) se genera en función del modo de conjugación, y si el manano se encuentra en un estado oxidado o reducido [Lees, et al., 1999; Lees, et al., 2000a; Lees, et al., 2000b]. Otras citoquinas, IL-5, IL-6, IL-13, IL-15 e IL-18 también se han medido con inmunógenos con manano oxidado o reducido. Además de las respuestas tipo Th1/Th2 a MUC1 en ratones, se han demostrado respuestas similares en seres humanos y monos [Vaughan, et al., 1999; Vaughan, et al., 2000] con la proteína MUC1 y en un péptido MSP-1 Anaplasma marginale en vacas [Davis, et al., 2002]. El empleo de manano oxidado o reducido conjugado con epítopos PBM83-99, PPL139-151 o GMO35-55 y en particular, el empleo de manano reducido para desviar aún más las respuestas inmunitarias a Th2 cuando se conjuga con péptidos PBM, constituye una prometedora estrategia para la inmunoterapia de EM.
En una realización preferente de la invención, el manano es manano reducido.
En otra realización preferente de la invención, el manano es manano oxidado.
En una realización especialmente preferente, más de un epítopo se une a manano, es decir, múltiples epítopos se unen a un único residuo de manano. Para la presente realización, los epítopos pueden ser iguales o diferentes.
Por consiguiente, en una realización particularmente preferente, el conjugado comprende una mezcla (o "cóctel") de más de uno de dichos epítopos conjugados a un único residuo de manano a través de un puente [(Lys-Gly)n], en el que n es un número entero de 1 a 10, es decir, el manano puede conjugarse a una pluralidad de epítopos. Como se ha indicado previamente, el manano puede estar oxidado o reducido.
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mezclados con un transportador, excipiente o diluyente, en particular para la terapia humana. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria.
Ejemplos de dichos excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden hallarse en "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2ª edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.
Transportadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico se conocen adecuadamente en la materia farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985).
Ejemplos de transportadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.
La selección del transportador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía pretendida de administración y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, o además, el transportador, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) solubilizante(s).
Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales, tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.
Ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares.
Conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes aromatizantes pueden proporcionarse en la composición farmacéutica. Ejemplos de conservantes incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres del ácido phidroxibenzoico. Pueden utilizarse asimismo antioxidantes y agentes de suspensión.
VACUNAS
Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna o composición inmunogénica que comprende un conjugado como se ha definido previamente.
Las composiciones inmunogénicas de la invención están preferentemente adyuvantadas. Los adyuvantes empleados en la presente invención son aquellos fisiológicamente aceptables para seres humanos, estos incluyen, entre otros, una sal de aluminio, tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también pueden ser una sal de calcio, hierro o cinc, adyuvantes de emulsión en base a aceite/tensioactivo, tales como Montanide (TM) en el que diferentes tensioactivos (especialmente oleato de manitol) se combinan con un aceite mineral, emulsiones que contienen escualeno, tales como MF59(TM), monofosforil lípido A, o lipopolisacárido mutante Neisseriae, una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente, o polifosfacenos.
Preferentemente, el adyuvante se administra al mismo tiempo que el de la invención y en realizaciones preferentes se formulan juntos.
La composición de vacuna de la presente invención es preferentemente estéril. Además, la composición puede contener componentes que preservan contra la infestación y el crecimiento de microorganismos.
Resulta preferente que la composición de vacuna se fabrique en forma de un líquido acuoso estéril que se prepara para la administración inmediata.
En una realización preferente de la invención, la composición de vacuna de la invención puede formularse en forma de dosificación unitaria como se ha descrito hasta la fecha para facilitar la administración y garantizar la uniformidad de la dosificación. La formulación puede efectuarse empleando técnicas disponibles, tales como las aplicables a las preparaciones de emulsiones.
SALES/ÉSTERES
Los péptidos/conjugados de la invención pueden estar presentes como sales o ésteres, en particular, sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos/conjugados de la invención incluyen sales de adición de ácido o de base adecuadas de las mismas. Una revisión de las sales farmacéuticas adecuadas puede hallarse en Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Las sales se forman, por ejemplo, con ácidos inorgánicos fuertes, tales
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como ácidos minerales, p. ej., ácido sulfúrico, ácido fosfórico o ácidos hidroálicos; con ácidos carboxílicos orgánicos fuertes, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 4 átomos de carbono que son insustituidos o sustituidos (p. ej., por halógeno), tales como ácido acético; con ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, por ejemplo ácido oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales como ácidos alquil (C1-C4) o aril sulfónico que son insustituidos o sustituidos (por ejemplo, por un halógeno), tales como ácido metano o p-toluensulfónico.
Los ésteres se forman utilizando ácidos orgánicos o alcoholes/hidróxidos, dependiendo del grupo funcional que se esterifica. Los ácidos orgánicos incluyen ácidos carboxílicos, tales como ácidos alcanocarboxílicos de 1 a 12 átomos de carbono que son insustituidos o sustituidos (p. ej., por halógeno), tales como ácido acético; con ácido dicarboxílico saturado o insaturado, por ejemplo ácido oxálico, malónico, succínico, maleico, fumárico, ftálico o tetraftálico; con ácidos hidroxicarboxílicos, por ejemplo ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico o cítrico; con aminoácidos, por ejemplo ácido aspártico o glutámico; con ácido benzoico; o con ácidos sulfónicos orgánicos, tales, como ácidos alquil (C1-C4) o aril sulfónico, que son insustituidos o sustituidos (por ejemplo, por un halógeno), tales como ácido metano o p-toluensulfónico. Hidróxidos adecuados incluyen hidróxidos inorgánicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio. Alcoholes incluyen alcanoalcoholes de 1-12 átomos de carbono que pueden ser insustituidos o sustituidos, (p. ej., por un halógeno).
ENANTIÓMEROS/TAUTÓMEROS
En todos los aspectos de la presente invención discutidos previamente, la invención incluye, cuando sea apropiado, todos los enantiómeros y tautómeros de los péptidos/conjugados. El experto en la materia reconocerá compuestos que poseen propiedades ópticas (uno o más átomos de carbono quirales) o características tautoméricas. Los enantiómeros y/o tautómeros correspondientes pueden aislarse/prepararse por métodos conocidos en la materia.
ESTEREOISÓMEROS E ISÓMEROS GEOMÉTRICOS
Algunos de los péptidos/conjugados de la invención pueden existir como estereoisómeros y/o isómeros geométricos,
p. ej., pueden poseer uno o más centros asimétricos y/o geométricos y así pueden existir en dos o más formas estereoisoméricas y/o geométricas. La presente invención contempla el uso de todos los estereoisómeros individuales e isómeros geométricos, y mezclas de los mismos. Los términos empleados en las reivindicaciones abarcan estas formas, siempre que dichas formas retengan la actividad funcional apropiada (aunque no necesariamente en el mismo grado).
La presente invención también incluye todas las variantes isotópicas adecuadas de los péptidos/conjugados o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Una variante isotópica se define como aquella en la que al menos un átomo se sustituye con un átomo que posee el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica normalmente hallada en naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los péptidos/conjugados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Ciertas variantes isotópicas de los péptidos/conjugados y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, por ejemplo, aquellas en las que se incorpora un isótopo radiactivo, tal como 3H o 14C, son útiles en estudios de distribución tisular en fármacos y/o sustrato. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y carbono 14, es decir, 14C, resultan particularmente preferentes por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos, tales como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, aumento de la semivida in vivo o reducción de requerimientos de dosificación y por tanto pueden preferirse en algunas circunstancias. Las variantes isotópicas de los péptidos/conjugados de la presente invención y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos de la presente invención pueden prepararse generalmente por medio de procedimientos convencionales empleando variantes isotópicas apropiadas de reactivos aptos.
SOLVATOS
La presente invención también incluye el uso de formas de solvato de los péptidos/conjugados de la presente invención. Los términos empleados en las reivindicaciones abarcan estas formas.
POLIMORFOS
La invención se refiere además a los péptidos/conjugados de la presente invención en sus diversas formas cristalinas, formas polimórficas y formas (an)hidras. Se establece de forma adecuada en la industria farmacéutica que los compuestos químicos pueden aislarse en cualquiera de dichas formas variando ligeramente el método de purificación y o forma de aislamiento de los disolventes utilizados en la preparación sintética de dichos compuestos.
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PROFÁRMACOS
La divulgación incluye además los péptidos/conjugados de la presente invención en forma de profármaco. Dichos profármacos son generalmente péptidos/conjugados en los que uno o más grupos apropiados se han modificado de manera tal que la modificación puede invertirse tras la administración a un sujeto humano o mamífero. Dicha inversión se realiza generalmente por una enzima natural presente en dicho sujeto, aunque es posible administrar un segundo agente junto con dicho profármaco para llevar a cabo la inversión in vivo. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen éster (por ejemplo, cualquiera de las descritas previamente), en las que la inversión que puede llevarse a cabo es una esterasa etc. Los expertos en la materia conocerán adecuadamente otros sistemas.
ADMINISTRACIÓN
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden adaptarse para vías oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal o sublingual de administración.
Para administración oral, se hace uso particular de pastillas comprimidas, píldoras, comprimidos, grageas, gotas, y cápsulas.
Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que pueden inyectarse por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular, y que se preparan a partir de soluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones, ungüentos, cremas, geles, pulverizaciones, soluciones o polvos para espolvorear.
Un medio alternativo de administración transdérmica es por medio del uso de un parche cutáneo. Por ejemplo, el principio activo puede incorporarse en una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. El principio activo también puede incorporarse a una concentración comprendida entre 1 y 10 % en peso, en un ungüento que consiste en una cera blanca o base de parafina blanda blanca junto con dichos estabilizadores y conservantes que pueden requerirse.
Las composiciones pueden formularse en forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una dosis unitaria.
DOSIFICACIÓN
Una persona experta en la materia puede determinar fácilmente una dosis apropiada de una de las composiciones instantáneas para administrar a un sujeto sin experimentación excesiva. Generalmente, un médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un paciente individual y dependerá de una variedad de factores incluyendo actividad del compuesto específico empleado, estabilidad metabólica y duración de acción de ese compuesto, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, gravedad de la afección particular, y terapia individual a la que se somete. Las dosificaciones divulgadas en el presente documento son ejemplos de caso ordinario. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se requieran intervalos de dosificación mayor o menor, y estos están dentro del alcance de la presente invención.
COMBINACIONES
En una realización particularmente preferente, uno o más péptidos/conjugados de la invención se administran en combinación con uno o varios agentes terapéuticamente activos, por ejemplo, fármacos existentes disponibles en el mercado En tales casos, los compuestos de la invención pueden administrarse de forma consecutiva, simultánea o secuencialmente con uno o varios agentes.
La terapia de combinación es deseable con el fin de evitar un solapamiento de toxicidades mayores, mecanismo de acción y mecanismo(s) de resistencia. Además, también es deseable administrar la mayoría de los fármacos en sus dosis máximas toleradas con intervalos de tiempo mínimos entre dichas dosis. Las principales ventajas de combinar fármacos quimioterapéuticos son aquellas que pueden favorecer efectos sinérgicos aditivos o posibles mediante interacciones bioquímicas y también pueden disminuir la aparición de resistencia en las células tumorales precoces que habrían sido de otra manera sensibles a la quimioterapia inicial con un único agente. La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos, y con referencia a las figuras siguientes (figuras y ejemplos marcados con un asterisco (*) se incluyen como referencia), en los que:
*La Figura 1 muestra la puntuación media clínica de los grupos de ratones que recibieron la vacunación profiláctica con conjugados peptídicos GMO35-55 a manano oxidado/reducido antes de la inducción de EAE por GMO35-55 (n=6 para todos los grupos).
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finales en resina se secaron al vacío y se trataron a continuación con la mezcla de división DCM/HFIP (8/2) durante 7 h a temperatura ambiente para liberar el péptido de la resina y desproteger Lys de MTT del ciclo(91-99)[Ala96] PBM83-99. Cada péptido protegido lineal se disolvió en DMF y se añadió colidina/HOAt. Esta mezcla se añadió gota a gota en una solución de TBTU en DMF durante 8 horas. La ciclación se determinó mediante CCF y HPLC en fase inversa analítica (RP-HPLC). El disolvente se eliminó a presión reducida, produciendo un residuo oleoso de color amarillo claro. El péptido protegido cíclico (pureza ≥90 %) se precipitó en H2O y se secó al vacío durante 16 h. El péptido protegido cíclico se trató con TFA al 65 % en DCM y etanoditiol al 3 % como depurador durante 4 horas a temperatura ambiente. La solución resultante se concentró en un pequeño volumen y el péptido libre final se precipitó como un sólido éter amorfo de color amarillo claro añadido a dietiléter (pureza ≥80 %). La pureza del péptido se evaluó mediante repeticiones de análisis por HPLC, cromatografía en capa fina (CCF) y espectrometría de masas (ESIMS).
Síntesis peptídica en fase sólida de análogos lineales
Los péptidos PBM87-99 (VHFFKNIVTPRTP), [R91, A96] PBM87-99 (VHFFRNIVTARTP) y [A91, A96]PBM87-99 (VHFFANIVTARTP) se prepararon en resina de cloruro de 2-clorotritil (CLTR-Cl) empleando la metodología Fmoc/tBu22, 48-51. La HPLC preparativa para los análogos peptídicos PBM87-99, [R91, A96]PBM87-99 y [A91, A96]PBM87-99 se realizó utilizando una columna en fase inversa semipreparativa Lichrosorb RP-18 con material de embalaje de 7 µm. Los péptidos eran > 95 % puros según el análisis por RP-HPLC analítica y ESI-MS.
Referencias para la síntesis peptídica en fase sólida de análogos lineales
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83.
49.
Tselios, T.; Daliani, I.; Deraos, S.; Thymianou, S.; Matsoukas, E.; Troganis, A.; Gerothanassis, I.; Mouzaki, A.; Mavromoustakos, T.; Probert, L.; Matsoukas, J. Treatment of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) by a rationally designed cyclic analogue of myelin basic protein (PBM) epitope 72-85. Bioorg Med Chem Lett 2000, 10, 2713-7.
50.
Tselios, T.; Daliani, I.; Probert, L.; Deraos, S.; Matsoukas, E.; Roy, S.; Pires, J.; Moore, G.; Matsoukas, J.
Treatment of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) induced by guinea pig myelin basic protein epitope 72-85 with a human PBM(87-99) analogue and effects of cyclic peptides. Bioorg Med Chem 2000, 8, 1903-9.
51. Tselios, T.; Probert, L.; Daliani, I.; Matsoukas, E.; Troganis, A.; Gerothanassis, I. P.; Mavromoustakos, T.; Moore,
G. J.; Matsoukas, J. M. Design and synthesis of a potent cyclic analogue of the myelin basic protein epitope PBM72
85: importance of the Ala81 carboxyl group and of a cyclic conformation for induction of experimental allergic encephalomyelitis. J Med Chem 1999, 42, 1170-7.
Síntesis peptídica en fase sólida de análogos cíclicos
Los péptidos PBM87-99 (VHFFKNIVTPRTP) y el péptido mutante doble cíclico con mutaciones Ala en las posiciones 91 y 96, ciclo(87-99) [A91, A96]PBM87-99 (ciclo, cabeza-cola, VHFFANIVTARTP) se prepararon en resina de cloruro de 2-clorotritilo (CLTR-Cl) empleando la metodología Fmoc/tBu. La ciclación cabeza-cola del péptido PBM87-99[A91, A96] se consiguió empleando O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU) y 1-hidroxi-7azabenzotriazol, 2,4,6 colidina en solución DMF, permitiendo reacciones rápidas y productos de ciclación de alto rendimiento. Los resultados indican que HOAt, una variante que contiene 4-nitrógeno, es un aditivo de acoplamiento muy eficaz, más eficiente que HOBt para la síntesis en solución o en fase sólida14-17. La HPLC preparativa para análogos peptídicos se realizó empleando una columna en fase inversa semipreparativa Lichrosorb RP-18 con material de embalaje de 7 µm. Los péptidos eran > 95 % puros según el análisis por espectrometría de masas (ESI-MS).
Referencias para la síntesis peptídica en fase sólida de análogos cíclicos
14. Tselios, T.; Apostolopoulos, V.; Daliani, I.; Deraos, S.; Grdadolnik, S.; Mavromoustakos, T.; Melachrinou, M.; Thymianou, S.; Probert, L.; Mouzaki, A.; Matsoukas, J. Antagonistic effects of human cyclic PBM(87-99) altered peptide ligands in experimental allergic encephalomyelitis and human T-cell proliferation. J Med Chem 2002, 45, 275
83.
15.
Tselios, T.; Daliani, I.; Deraos, S.; Thymianou, S.; Matsoukas, E.; Troganis, A.; Gerothanassis, I.; Mouzaki, A.; Mavromoustakos, T.; Probert, L.; Matsoukas, J. Treatment of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) by a rationally designed cyclic analogue of myelin basic protein (PBM) epitope 72-85. Bioorg Med Chem Lett 2000, 10, 2713-7.
16.
Tselios, T.; Daliani, I.; Probert, L.; Deraos, S.; Matsoukas, E.; Roy, S.; Pires, J.; Moore, G.; Matsoukas, J.
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Cebado de linfocitos T y ensayos de proliferación
Los esplenocitos aislados se cultivaron durante 72 h en placas de 96 pocillos en medio RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD) que contiene STF inactivado por calor al 10 %, 50 µM de 2-ME, y concentraciones crecientes del péptido GMO35-55. Las células se estimularon por triplicado a 2x106 células/ml en placas de fondo redondo de 96 pocillos, (Costar). Las células se pulsaron con 1 μCi/5x105 células de [3H]-timidina por triplicado (Amersham Radiochemicals) en las últimas 16 h de cultivo. La incorporación de [3H]-timidina se midió por recuento por centelleo líquido (Wallac, Turku, Finlandia). Los resultados se expresan como el índice de estimulación (relación entre los recuentos de radiactividad de las células cultivadas en presencia del péptido y células cultivadas con sólo medio).
Medición de citoquinas
El kit de determinación de citoquinas de ratón tipo Th1/Th2 con matriz citométrica de microesferas (BD Biosciences) se utilizó para medir los niveles de citoquinas en sobrenadantes de cultivo según las instrucciones del fabricante. Las citoquinas medidas con este kit eran: IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ y FNT-α. Además, se utilizó un conjunto ELISA de IL17 para ratón (R&D Systems, Alemania) para medir la secreción de citoquinas a partir de sobrenadantes de cultivo de células de esplenocitos según las instrucciones del fabricante. La sensibilidad del ensayo para diferentes citoquinas era de la siguiente manera: IL-2, IL-4 y IL-5 = 5,0 pg/ml; IFN-γ = 2,5 pg/ml; FNT-α = 6,3 pg/ml.
Análisis histopatológico
Los ratones se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído al 4 % helado en TFS con anestesia profunda. Los tejidos del SNC se postfijaron en el mismo fijador durante 3 horas a 4 ºC y se procesaron para análisis histopatológico convencional. La inflamación se visualizó mediante tinción con H y E, mientras que la desmielinización se demostró por una tinción azul luxol rápido/ácido periódico de Schiff. La cuantificación de la inflamación y desmielinización se hizo de forma ciega. La inflamación en la médula espinal se determinó por cuantificación absoluta verdadera; los números significan infiltrados inflamatorios/mm2 de tejido. En el cerebro se utilizó una puntuación semicuantitativa según la cual 0,5 significa infiltrados perivasculares únicos; 1 significa múltiples infiltrados inflamatorios. La desmielinización se puntuó de la siguiente manera: 0,5: manguitos únicos perivasculares de desmielinización, 1: desmielinización perivascular ubicua o subpial, 2: placas desmielinizadas confluentes, 3: desmielinización focal profunda, que implica aproximadamente 1/2 de la sustancia blanca de la médula espinal, al menos en un segmento de la médula espinal, 4: desmielinización extensa, por ejemplo desmielinización completa de la sustancia blanca de la médula espinal, al menos en un segmento de la médula espinal.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
* La vacunación con conjugados peptídicos GMO 35-55 a manano oxidado/reducido protege a ratones C57BL/6 de EAE por GMO35-55
La vacunación por triplicado de ratones C57BL/6 con conjugados peptídicos GMO35-55 a manano oxidado/reducido permitió su protección significativa del desarrollo de EAE por GMO35-55 que se indujo 15 días después de la última vacunación (Figura 1). El péptido GMO35-55 conjugado a manano oxidado mostró el mayor grado de protección a juzgar por el descenso de la puntuación clínica (Figura 1) y la ausencia de síntomas de emaciación que acompañan generalmente el inicio de la enfermedad y la progresión según la medición de peso diaria de los animales experimentales mostrados (Figura 2). El péptido GMO35-55 conjugado a manano reducido también mostró una inhibición significativa de la manifestación de la enfermedad. Con el fin de excluir la posibilidad de que hubiera una inducción de tolerancia con respecto al péptido debido a la estimulación repetida con ello, se realizó un experimento equivalente en el que los ratones recibieron vacunaciones por triplicado con péptido GMO35-55 no conjugado espaciado en un intervalo de 15 días antes de la inducción de EAE por GMO35-55. Los resultados mostraron que los ratones que recibieron tres exposiciones anteriores con sólo péptido aún eran susceptibles a EAE por GMO y mostraron signos clínicos de la enfermedad pero característicamente: 1) el inicio de EAE se retrasó en animales vacunados con GMO35-55 durante 3 días, 2) EAE era significativamente menor en animales vacunados con GMO35-55 en comparación con los controles no vacunados en las etapas iniciales de la enfermedad experimental y 3) la enfermedad se exacerbó en animales vacunados con GMO35-55 después del día 20 de progresión de la enfermedad (Figuras 3 y 4).
*Ausencia de infiltrados inflamatorios y lesiones desmielinizantes en ratones inmunizados con conjugados GMO35-55 a manano oxidado/reducido antes de la inducción de EAE
Los animales se sacrificaron 24 días después de la inducción de EAE. Las médulas espinales y los cerebros se examinaron para detectar la presencia de inflamación y desmielinización. La evaluación del grado de infiltración de linfocitos y la desmielinización (Figura 5) muestra ratones que no habían recibido ninguna vacunación con cantidad sustancial de infiltración de células mononucleares en la médula espinal acompañada por extensa desmielinización. Por el contrario, ratones vacunados con GMO35-55 a manano oxidado mostraron poca infiltración inflamatoria y sin
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Claims (1)

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ES09703874.9T 2008-01-25 2009-01-22 Péptido terapéutico de la proteína básica de la mielina PBM83-99 unido a manano Active ES2585482T3 (es)

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