ES2590077T3 - Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos - Google Patents

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Abstract

Ácido nucleico aislado con una secuencia que codifica un polipéptido con actividad de Δ5-elongasa, con a) un ácido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 67, b) un ácido nucleico que, como resultado del código genético degenerado, puede derivarse de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 68 o c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 67, que codifica polipéptidos con al menos el 40 % de identidad al nivel de aminoácidos con la SEQ ID NO: 68 y que presenta una actividad de Δ5-elongasa, y en el que el ácido nucleico no posee la secuencia representada en la SEQ ID NO: 113.

Description

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DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en un organismo introduciendo ácidos nucleicos en el organismo que codifican polipéptidos con actividad de Δ5-elongasa. Ventajosamente, estas secuencias de ácidos nucleicos, dado el caso junto con secuencias de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos de la biosíntesis del metabolismo de los ácidos grasos o de los lípidos, pueden expresarse en el organismo. Son especialmente ventajosas secuencias de ácidos nucleicos que codifican una actividad de Δ6-desaturasa, Δ5-desaturasa, Δ4-desaturasa, Δ12-desaturasa y/o Δ6-elongasa. Estas desaturasas y elongasas proceden ventajosamente de Thalassiosira, Euglena u Ostreococcus. Además, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de aceites y/o triacilglicéridos con un elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
La presente invención se refiere además en una forma de realización preferida a un procedimiento para la producción de ácidos grasos ω3 insaturados, así como a un procedimiento para la producción de triglicéridos con un elevado contenido de ácidos grasos insaturados, especialmente de ácidos grasos ω3 con más de tres dobles enlaces. La invención se refiere a la producción de un organismo no humano transgénico, preferiblemente de una planta transgénica o de un microorganismo transgénico con elevado contenido de ácidos grasos ω3 insaturados, aceites o lípidos con dobles enlaces en ω3 debido a la expresión de las elongasas y desaturasas usadas en el procedimiento según la invención, ventajosamente junto con ω3-desaturasas, por ejemplo, una ω3-desaturasa de hongos de la familia Pythiaceae como el género Phytophtora, por ejemplo, el género y la especie Phytophtora infestans o una ω3-desaturasa de algas como de la familia de Prasinophyceae, por ejemplo, el género Ostreococcus, especialmente el género y la especie Ostreococcus tauri o diatomeas como el género Thalassiosira, especialmente el género y la especie Thalassiosira pseudonana.
La invención se refiere además a las secuencias de ácidos nucleicos, construcciones de ácido nucleico, vectores y organismos que contienen las secuencias de ácidos nucleicos según la invención, vectores que contienen las secuencias de ácidos nucleicos y/o las construcciones de ácido nucleico, así como organismos transgénicos que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, construcciones de ácido nucleico y/o vectores previamente mencionados.
Una parte adicional de la invención se refiere a aceites, lípidos y/o ácidos grasos producidos según el procedimiento según la invención y a su uso. Además, la invención se refiere a ácidos grasos insaturados, así como a triglicéridos con un elevado contenido de ácidos grasos insaturados, y a su uso.
Los ácidos grasos y los triacilglicéridos tienen múltiples aplicaciones en la industria alimentaria, la nutrición animal, la cosmética y en el sector farmacéutico. Dependiendo de si se trata de ácidos grasos saturados e insaturados libres o de triacilglicéridos con un elevado contenido de ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para aplicaciones muy distintas. Los ácidos grasos poliinsaturados como el ácido linoleico y linolénico son esenciales para los mamíferos, ya que no pueden ser producidos por ellos mismos. Por este motivo, los ácidos grasos ω3 poliinsaturados y los ácidos grasos ω6 representan un constituyente importante de la nutrición animal y humana.
Δ5,8,11,14,17) o el
Los ácidos grasos ω3 poliinsaturados de cadena larga como el ácido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5ácido docosahexaenoico (=DHA, C22:6Δ4,10,13,16,19) son componentes importantes de la nutrición humana debido a sus distintas funciones en la salud, que comprenden aspectos como el desarrollo del cerebro infantil, la funcionalidad del ojo, la síntesis de hormonas y otras sustancias señal, así como la prevención de trastornos cardiovasculares, y diabetes (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Por este motivo existe una necesidad de la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
Debido a la composición actualmente habitual de la nutrición humana, una adición de ácidos grasos ω3 poliinsaturados, que se encuentran preferiblemente en aceites de pescado, es especialmente importante para la nutrición. Así, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados como el ácido docosahexaenoico (=DHA, C22:6Δ4,7,10,13,16,19) o el ácido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17) se añaden a los alimentos infantiles para elevar el valor nutricional. A este respecto, al ácido graso insaturado DHA se le atribuye un afecto positivo sobre el desarrollo y el mantenimiento de las funciones cerebrales.
A continuación, los ácidos grasos poliinsaturados se designan PUFA o LCPUFA (poly unsaturated fatty acids, PUFA, ácidos grasos poliinsaturados; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga).
Los distintos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos como Mortierella o Schizochytrium o a partir de plantas productoras de aceite como soja, colza, algas como Crypthecodinium o Phaeodactylum y otras, obteniéndose generalmente en forma de sus triacilglicéridos (=triglicéridos =trigliceroles). Pero también pueden obtenerse de animales como, por ejemplo, peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante saponificación. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena muy larga como DHA, EPA, ácido araquidónico (=ARA, C20:4Δ5,8,11,14), ácido dihomo-γ-linolénico (C20:3Δ8,11,14) o ácido docosapentaenoico (DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19) no se sintetizan en plantas oleaginosas como colza, soja, girasol, cártamo. Fuentes naturales
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ácidos grasos correspondientes.
R3 significa en la fórmula general II hidrógeno, alquil C2-C24-carbonilo saturado o insaturado.
Como restos alquilo son de mencionar cadenas de alquil C2-C24-carbonilo sustituidas o sin sustituir, saturadas o insaturadas, como etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, n-butilcarbonilo, n-pentilcarbonilo, n-hexilcarbonilo, nheptilcarbonilo, n-octilcarbonilo, n-nonilcarbonilo, n-decilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, ntridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, noctadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, n-docosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren restos alquil C10-C22-carbonilo saturados o insaturados como ndecilcarbonilo, n-undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, n-tridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, n-octadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo, n-eicosilcarbonilo, ndocosanilcarbonilo o n-tetracosanilcarbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren especialmente restos alquil C10-C22-carbonilo saturados y/o insaturados como restos alquil C10-carbonilo, alquil C11-carbonilo, alquil C12-carbonilo, alquil C13-carbonilo, alquil C14-carbonilo, alquil C16-carbonilo, alquil C18-carbonilo, alquil C20-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Se prefieren muy especialmente restos alquil C16C22-carbonilo saturados o insaturados como restos alquil C16-carbonilo, alquil C18-carbonilo, alquil C20-carbonilo o alquil C22-carbonilo, que contienen uno o varios dobles enlaces. Estos restos ventajosos pueden contener dos, tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los restos especialmente ventajosos con 20 o 22 átomos de carbono en la cadena de ácido graso contienen hasta seis dobles enlaces, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces, con especial preferencia cinco o seis dobles enlaces. Todos los restos mencionados se derivan de los ácidos grasos correspondientes.
Los restos anteriormente mencionados de R1, R2 y R3 pueden estar sustituidos con grupos hidroxilo y/o epoxi y/o pueden contener triples enlaces.
Los ácidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento según la invención contienen ventajosamente al menos dos, ventajosamente tres, cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los ácidos grasos contienen especialmente ventajosamente cuatro, cinco o seis dobles enlaces. Los ácidos grasos producidos en el procedimiento tienen ventajosamente 18, 20 o 22 átomos de C en la cadena de ácido graso, los ácidos grasos contienen preferiblemente 20 o 22 átomos de carbono en la cadena de ácido graso. Ventajosamente, los ácidos grasos saturados reaccionan poco o casi no reaccionan con los ácidos nucleicos usados en el procedimiento. Por poco debe entenderse que, en comparación con los ácidos grasos poliinsaturados, los ácidos grasos saturados reaccionan con menos del 5 % de actividad, ventajosamente menos del 3 %, especialmente ventajosamente con menos del 2 %, de manera muy especialmente preferida con menos del 1; 0,5; 0,25 o 0,125 %. Estos ácidos grasos producidos pueden producirse como producto único en el procedimiento o estar presentes en una mezcla de ácidos grasos.
En el caso de las secuencias de ácidos nucleicos usadas en el procedimiento según la invención se trata de ácidos nucleicos aislados con secuencias que codifican polipéptidos con actividad de Δ5-elongasa, que se seleccionan del grupo constituido por:
a) un ácido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 67, o
b) ácidos nucleicos que, como resultado de la degeneración del código genético, pueden derivarse de la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 68, o
c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 67, que codifican polipéptidos con al menos el 40 % de identidad al nivel de aminoácidos con la SEQ ID NO: 68 y presentan una actividad de Δ5elongasa.
y en el que el ácido nucleico no posee la secuencia representada en la SEQ ID NO: 113.
Alternativamente, en el procedimiento pueden usarse ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con actividad de Δ9-elongasa, Δ6-desaturasa, Δ8-desaturasa, Δ6-elongasa, Δ5-desaturasa, Δ5-elongasa o Δ4-desaturasa, que se seleccionan del grupo constituido por:
a) un ácido nucleico con la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 183, o
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La Tabla 1 describe las secuencias de ácidos nucleicos, el organismo de procedencia y el número de ID de la secuencia.
N.º
Organismo Actividad Número de secuencia
1.
Euglena gracilis Δ8-Desaturasa SEQ ID NO: 1
2.
Isochrysis galbana Δ9-Elongasa SEQ ID NO: 3
3.
Phaeodactylum tricornutum Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 5
4.
Ceratodon purpureus Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 7
5.
Physcomitrella patens Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 9
6.
Thraustrochytrium sp. Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 11
7.
Mortierella alpina Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 13
8.
Caenorhabditis elegans Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 15
9.
Borago officinalis Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 17
10.
Ceratodon purpureus Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 19
11.
Phaeodactylum tricornutum Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 21
12.
Physcomitrella patens Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 23
13.
Caenorhabditis elegans Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 25
14.
Physcomitrella patens Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 27
15.
Thraustrochytrium sp. Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 29
16.
Phytophtora infestans Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 31
17.
Mortierella alpina Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 33
18.
Mortierella alpina Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 35
19.
Caenorhabditis elegans Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 37
20.
Euglena gracilis Δ4-Desaturasa SEQ ID NO: 39
21.
Thraustrochytrium sp. Δ4-Desaturasa SEQ ID NO: 41
22.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 43
23.
Thalassiosira pseudonana Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 45
24.
Crypthecodinium cohnii Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 47
25.
Crypthecodinium cohnii Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 49
26.
Oncorhynchus mykiss Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 51
27.
Oncorhynchus mykiss Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 53
28.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 59
29.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 61
30.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 63
31.
Thraustrochytrium aureum Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 65
32.
Ostreococcus tauri Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 67
33.
Ostreococcus tauri Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 69
9
(continuación)
N.º
Organismo Actividad Número de secuencia
34.
Prímula farinosa Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 71
35.
Primula vialii Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 73
36.
Ostreococcus tauri Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 75
37.
Ostreococcus tauri Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 77
38.
Ostreococcus tauri Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 79
39.
Ostreococcus tauri Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 81
40.
Thraustrochytrium sp. Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 83
41.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 85
42.
Phytophtora infestans ω3-Desaturasa SEQ ID NO: 87
43.
Ostreococcus tauri Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 89
44.
Ostreococcus tauri Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 91
45.
Ostreococcus tauri Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 93
46.
Ostreococcus tauri Δ4-Desaturasa SEQ ID NO: 95
47.
Thalassiosira pseudonana Δ6-Desaturasa SEQ ID NO: 97
48.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 99
49.
Thalassiosira pseudonana Δ5-Desaturasa SEQ ID NO: 101
50.
Thalassiosira pseudonana Δ4-Desaturasa SEQ ID NO: 103
51.
Thalassiosira pseudonana ω3-Desaturasa SEQ ID NO: 105
52.
Ostreococcus tauri Δ12-Desaturasa SEQ ID NO: 107
53.
Thalassiosira pseudonana Δ12-Desaturasa SEQ ID NO: 109
54.
Ostreococcus tauri Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 111
55.
Ostreococcus tauri Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 113
56.
Xenopus laevis (BC044967) Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 117
57.
Ciona intestinalis (AK112719) Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 119
58.
Euglena gracilis Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 131
59.
Euglena gracilis Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 133
60.
Arabidopsis thaliana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 135
61.
Arabidopsis thaliana Δ5-Elongasa SEQ ID NO: 137
62.
Phaeodactylum tricornutum Δ6-Elongasa SEQ ID NO: 183
Los ácidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento están ventajosamente unidos en lípidos de membrana y/o triacilglicéridos, pero también pueden producirse en los organismos como ácidos grasos libres o bien 5 unidos en forma de otros ésteres de ácidos grasos. A este respecto pueden estar presentes como “productos puros”
o bien ventajosamente en forma de mezclas de distintos ácidos grasos o mezclas de diferentes glicéridos. Los distintos ácidos grasos unidos en los triacilglicéridos pueden derivarse a este respecto de ácidos grasos de cadena corta con 4 a 6 átomos de C, ácidos grasos de cadena media con 8 a 12 átomos de C o ácidos grasos de cadena larga con 14 a 24 átomos de C, se prefieren los ácidos grasos de cadena larga, se prefieren especialmente los 10 ácidos grasos de cadena larga LCPUFA de ácidos grasos C18, C20 y/o C22.
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octadecatrienoico), ácido eleoesteárico (ácido 9c11t13t-octadecatrienoico), ácido jacárico (ácido 8c10t12coctadecatrienoico), ácido punícico (ácido 9c11t13c-octadecatrienoico), ácido parinárico (ácido 9c11t13t15coctadecatetraenoico), ácido pinolénico (ácido all-cis-5,9,12-octadecatrienoico), ácido labalénico (ácido 5,6octadecadienalénico), ácido ricinoleico (ácido 12-hidroxioleico) y/o ácido coriólico (ácido 13-hidroxi-9c,11toctadecadienoico). Los ácidos grasos previamente mencionados están presentes en los ésteres de ácidos grasos o las mezclas de ácidos grasos producidos según el procedimiento según la invención generalmente ventajosamente solo en trazas, es decir, están presentes, referido a los ácidos grasos totales, a menos del 30 %, preferiblemente a menos del 25 %, 24 %, 23 %, 22 % o 21 %, con especial preferencia a menos del 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 %, de manera muy especialmente preferida a menos del 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. En otra forma preferida de la invención, estos ácidos grasos previamente mencionados están presentes, referido a los ácidos grasos totales, a menos del 0,9 %; 0,8 %; 0,7 %; 0,6 %; o 0,5 %, con especial preferencia a menos del 0,4 %; 0,3 %; 0,2 %; 0,1 %. Ventajosamente, los ésteres de ácidos grasos o las mezclas de ácidos grasos producidos según el procedimiento según la invención contienen menos del 0,1 % referido a los ácidos grasos totales y/o ningún ácido butírico, ningún colesterol, ningún ácido clupanodónico (=ácido docosapentaenoico, C22:5Δ4,8,12,15,21), así como ningún ácido nísico
Δ3,8,12,15,18,21).
(ácido tetracosahexaenoico, C23:6
Debido a las secuencias de ácidos nucleicos según la invención o a las secuencias de ácidos nucleicos usadas en el procedimiento según la invención, puede alcanzarse un aumento del rendimiento de ácidos grasos poliinsaturados de al menos el 50 %, ventajosamente de al menos el 80 %, especialmente ventajosamente de al menos el 100 %, muy especialmente ventajosamente de al menos el 150 % en comparación con el organismo de partida no transgénico, por ejemplo, una levadura, un alga, un hongo o una planta como Arabidopsis o lino en la comparación en el análisis de CG, véanse los ejemplos.
También pueden sintetizarse ácidos grasos poliinsaturados químicamente puros o composiciones de ácidos grasos según los procedimientos previamente descritos. Para esto, los ácidos grasos o las composiciones de ácidos grasos se aíslan del organismo no humano, como los microorganismos o las plantas o el medio de cultivo en el que o sobre el que se cultivaron los organismos, o del organismo y del medio de cultivo, de manera conocida, por ejemplo, mediante extracción, destilación, cristalización, cromatografía o combinaciones de estos procedimientos. Estos ácidos grasos químicamente puros o composiciones de ácidos grasos son adecuados para aplicaciones en el sector de la industria alimentaria, de la industria cosmética y especialmente de la industria farmacéutica.
Como organismo para la producción en el procedimiento según la invención se consideran fundamentalmente todos los organismos no humanos como microorganismos, animales no humanos o plantas.
Como plantas se consideran fundamentalmente todas las plantas que están en condiciones de sintetizar ácidos grasos, como todas las plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, algas o musgos. Ventajosamente, las plantas se seleccionan del grupo de las familias de plantas Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Euglenaceae, Prasinophyceae o plantas de hortaliza o plantas ornamentales como clavelón.
A modo de ejemplo son de mencionar las siguientes plantas seleccionadas del grupo: Adelotheciaceae como los géneros Physcomitrella, por ejemplo, el género y las especies Physcomitrella patens, Anacardiaceae como los géneros Pistacia, Mangifera, Anacardium, por ejemplo, el género y las especies Pistacia vera [pistacho], Mangifer indica [mango] o Anacardium occidentale [anacardo], Asteraceae como los géneros Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, por ejemplo, el género y las especies Calendula officinalis [caléndulas de jardín], Carthamus tinctorius [cártamo, safflower], Centaurea cyanus [aciano], Cichorium intybus [husillo], Cynara scolymus [alcachofa], Helianthus annus [girasol], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola
L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [lechuga], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [damasquina], Apiaceae como el género Daucus, por ejemplo, el género y la especie Daucus carota [zanahoria], Betulaceae como el género Corylus, por ejemplo, los géneros y las especies Corylus avellana o Corylus colurna [avellano], Boraginaceae como el género Borago, por ejemplo, el género y la especie Borago officinalis [borraja], Brassicaceae como los géneros Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabidopsis, por ejemplo, los géneros y las especies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [colza], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mostaza], Brassica oleracea [remolacha forrajera] o Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae como los géneros Anana, Bromelia (piña), por ejemplo, los géneros y las especies Anana comosus, Ananas ananas o Bromelia comosa [piña], Caricaceae como el género Carica como el género y especie Carica papaya [papaya], Cannabaceae como el género Cannabis como el género y especie Cannabis sativa[cáñamo], Convolvulaceae como los géneros Ipomea, Convolvulus, por ejemplo, los géneros y las especies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fasfigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba o Convolvulus panduratus [patata dulce, batata], Chenopodiaceae como el género Beta como los géneros y especies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva o Beta vulgaris var. esculenta [remolacha azucarera], Crypthecodiniaceae como el género Crypthecodinium, por ejemplo, el género y la especie
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Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [amapola], Pedaliaceae como el género Sesamum, por ejemplo, el género y la especie Sesamum indicum [sésamo], Piperaceae como los géneros Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, por ejemplo, los géneros y las especies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [pimienta de Cayena], Poaceae como los géneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maíz), Triticum, por ejemplo, los géneros y las especies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [sorgo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae como los géneros Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, por ejemplo, el género y la especie Porphyridium cruentum, Proteaceae como el género Macadamia, por ejemplo, el género y la especie Macadamia intergrifolia [macadamia], Prasinophyceae como los géneros Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, por ejemplo, los géneros y las especies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae como el género Coffea, por ejemplo, los géneros y las especies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora o Coffea liberica [café], Scrophulariaceae como el género Verbascum, por ejemplo, los géneros y las especies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus [candelaria], Solanaceae como los géneros Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, por ejemplo, los géneros y las especies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimienta], Capsicum annuum [pimiento], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [patata], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae como el género Theobroma, por ejemplo, el género y la especie Theobroma cacao [cacao] o Theaceae como el género Camellia, por ejemplo, el género y la especie Camellia sinensis [té].
Microorganismos ventajosos son, por ejemplo, hongos seleccionados del grupo de las familias Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae o Tuberculariaceae.
A modo de ejemplo son de mencionar los siguientes microorganismos seleccionados del grupo: Choanephoraceae como los géneros Blakeslea, Choanephora, por ejemplo, los géneros y las especies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae como el género Mortierella, por ejemplo, los géneros y las especies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae como los géneros Phytium, Phytophthora, por ejemplo, los géneros y las especies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae,
Saccharomycetaceae como los géneros Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, por ejemplo, los géneros y las especies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus,
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Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum o Colpidium sp.
En el procedimiento según la invención se usan ventajosamente organismos no humanos transgénicos como hongos como Mortierella o Thraustochytrium, levaduras como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, musgos como Physcomitrella o Ceratodon, animales no humanos como Caenorhabditis, algas como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium o Phaeodactylum o plantas como plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas. Se usan de manera especialmente ventajosa en el procedimiento según la invención los organismos que pertenecen a los organismos productores de aceite, es decir, los que se usan para la producción de aceites, como hongos como Mortierella o Thraustochytrium, algas como Nephroselmis, Pseudoscourfielda, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, Crypthecodinium, Phaeodactylum o plantas, especialmente plantas, preferiblemente plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lipídicos, como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo (Carthamus tinctoria), amapola, mostaza, cáñamo, ricino, olivo, sésamo, Calendula, Punica, onagra, candelaria, cárdamo, rosas silvestres, avellano, almendro, macadamia, aguacate, laurel, calabaza, lino, soja, pistacho, borraja, árboles (palma aceitera, coco o nogal) o cultivos como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, clavelón, plantas solanáceas como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisantes, alfalfa o plantas arbusto (café, cacao, té), especies de Salix así como pastos perennes y plantas para forraje. Plantas preferidas según la invención son plantas oleaginosas como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo, amapola, mostaza, cáñamo, ricino, olivo, Calendula, Punica, onagra, calabaza, lino, soja, borraja, árboles (palma aceitera, coco). Particularmente se prefieren plantas ricas en ácidos grasos C18:2 y/o C18:3 como girasol, cárdamo, tabaco, candelaria, sésamo, algodón, calabaza, amapola, onagra, nogal, lino, cáñamo, cardo o cárdamo. Muy particularmente se prefieren plantas como cárdamo, girasol, amapola, onagra, nogal, lino o cáñamo.
Para el procedimiento descrito según la invención es ventajoso introducir en el organismo adicionalmente otros ácidos nucleicos que codifican enzimas del metabolismo de los ácidos grasos o de los lípidos, adicionalmente a los ácidos nucleicos introducidos en la etapa de procedimiento (a) a (d), así como las secuencias de ácidos nucleicos dado el caso introducidas, que codifican las ω3-desaturasas.
En principio, todos los genes del metabolismo de los ácidos grasos o de los lípidos pueden usarse ventajosamente en el procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en combinación con la(s) Δ5-elongasa(s), Δ6-elongasa(s) y/o ω3-desaturasa(s) inventivas [en el sentido de esta solicitud el plural deberá contener el singular y al revés]. Ventajosamente se usan genes del metabolismo de los ácidos grasos o de los lípidos seleccionados del grupo acil-CoA-deshidrogenasa(s), acil-ACP [= proteína transportadora de acilo]-desaturasa(s), acil-ACPtioesterasa(s), ácido graso-acil-transferasa(s), acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferasas, ácido graso-sintasa(s), ácido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acil-coenzima A-oxidasa(s), ácido graso-desaturasa(s), ácido graso-acetilenasa(s), lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, óxido de aleno-sintasas, hidroperóxido-liasas o ácido graso-elongasa(s) en combinación con la Δ5-elongasa, Δ6-elongasa y/o ω3-desaturasa. Especialmente se usan preferiblemente genes seleccionados del grupo de Δ4-desaturasas, Δ5-desaturasas, Δ6-desaturasas, Δ8desaturasas, Δ9-desaturasas, Δ12-desaturasas, Δ6-elongasas o Δ9-elongasas en combinación con los genes previamente mencionados para la Δ5-elongasa, Δ6-elongasa y/o ω3-desaturasa, pudiendo usarse los genes individuales o varios genes en combinación.
Las Δ5-elongasas según la invención tienen, en comparación con las elongasas humanas o elongasas de animales no humanos como las de Oncorhynchus, Xenopus o Ciona, la propiedad ventajosa de que no alargan los ácidos grasos C22 a los ácidos grasos C24 correspondientes. Además, no convierten ventajosamente los ácidos grasos con un doble enlace en la posición Δ6, como se convierten por las elongasas humanas o las elongasas de animales no humanos. Las Δ5-elongasas especialmente ventajosas convierten solo preferiblemente ácidos grasos C20 insaturados. Estas Δ5-elongasas ventajosas presentan algunas supuestas hélices transmembrana (5-7). Ventajosamente solo convierten ácidos grasos C20 con un doble enlace en la posición Δ5, prefiriéndose ácidos grasos ω3 C20 (EPA). Además, en una forma de realización preferida de la invención, tienen la propiedad de que, además de la actividad de Δ5-elongasa, ventajosamente no presentan actividad de Δ6-elongasa o solo una actividad relativamente baja. A diferencia de esto, las elongasas humanas o elongasas de animales no humanos presentan una actividad aproximadamente igual en comparación con ácidos grasos con un doble enlace en Δ6 o Δ5. Estas elongasas ventajosas se denominan las llamadas elongasas monofuncionales. Las elongasas humanas o las elongasas de animales no humanos se designan, por el contrario, elongasas multifuncionales que, además de los sustratos previamente mencionados, también convierten ácidos grasos C16 y C18 monoinsaturados, por ejemplo, con doble enlace en Δ9 o Δ11. En una prueba de alimentación de levadura, en la que se añadió EPA como sustrato a las levaduras, las elongasas monofuncionales convierten ventajosamente al menos el 15 % en peso del EPA añadido al ácido docosapentaenoico (=DPA, C22:5Δ7,10,13,16,19), ventajosamente al menos el 20 % en peso, especialmente
Δ6,9,12),
ventajosamente al menos el 25 % en peso. Si como sustrato se añade ácido γ-linolénico (=GLA, C18:3entonces éste no se alarga ventajosamente en absoluto. Igualmente, C18:3Δ5,9,12 tampoco se alarga. En otra forma de realización ventajosa se convierte menos del 60 % en peso del GLA añadido en ácido dihomo-γ-linolénico (C20:3Δ8,11,14), ventajosamente menos del 55 % en peso, preferiblemente menos del 50 % en peso, especialmente ventajosamente menos del 45 % en peso, muy especialmente ventajosamente menos del 40 % en peso. En otra forma de realización muy preferida de la actividad de Δ5-elongasa según la invención, no se convierte GLA.
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ejemplo, una desaturación tal en la posición Δ5 y Δ4. Como productos del procedimiento según la invención se prefieren especialmente ácido dihomo-γ-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico y/o ácido docosahexaenoico. Los ácidos grasos C20 con al menos dos dobles enlaces en el ácido graso pueden alargarse mediante la actividad enzimática según la invención en forma del ácido graso libre o en forma de los ésteres, como fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, monoacilglicerina, diacilglicerina o triacilglicerina.
El sitio de biosíntesis preferido de los ácidos grasos, aceites, lípidos o grasas en las plantas ventajosamente usadas es, por ejemplo, en general las semillas o las capas celulares de la semilla, de manera que sea útil una expresión específica de semilla de los ácidos nucleicos usados en el procedimiento. Sin embargo, es lógico que la biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos no deba limitarse al tejido de semilla, sino que también puede realizarse de forma específica de tejido en todas las otras partes de la planta, por ejemplo, en las células de la epidermis o en los tubérculos.
Si microorganismos como levaduras como Saccharomyces o Schizosaccharomyces, hongos como Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor o Thraustochytrium, algas como Isochrysis, Mantoniella, Euglena, Ostreococcus, Phaeodactylum o Crypthecodinium se usan como organismos en el procedimiento según la invención, entonces estos organismos se cultivan ventajosamente de forma fermentativa.
Mediante el uso de los ácidos nucleicos según la invención que codifican una Δ5-elongasa, los ácidos grasos poliinsaturados producidos en el procedimiento pueden elevarse al menos el 5 %, preferiblemente al menos el 10 %, con especial preferencia al menos el 20 %, de manera muy especialmente preferida al menos el 50 %, en comparación con los no mutantes de los organismos que no contienen los ácidos nucleicos recombinantemente.
En principio, los ácidos grasos poliinsaturados producidos mediante el procedimiento según la invención en los organismos usados en el procedimiento pueden aumentarse de dos formas. Puede aumentarse ventajosamente el conjunto de ácidos grasos libres poliinsaturados y/o la proporción de ácidos grasos poliinsaturados esterificados producidos mediante el procedimiento. El conjunto de ácidos grasos poliinsaturados esterificados en los organismos transgénicos aumenta ventajosamente mediante el procedimiento según la invención.
Si se usan microorganismos como organismos en el procedimiento según la invención, entonces se hacen crecer o se cultivan de forma conocida para el experto, dependiendo del organismo huésped. Los microorganismos se hacen crecer generalmente en un medio líquido que contiene una fuente de carbono principalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno principalmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso, magnesio y dado el caso vitaminas, a temperaturas entre 0 ºC y 100 ºC, preferiblemente entre 10 ºC y 60 ºC, con gasificación con oxígeno. A este respecto, el pH del líquido nutritivo puede mantenerse a un valor fijo, es decir, regularse durante el cultivo o no. El cultivo puede realizarse de forma discontinua, semicontinua o continua. Los nutrientes pueden disponerse al principio de la fermentación o alimentarse posteriormente semicontinuamente o continuamente. Los ácidos grasos poliinsaturados producidos pueden aislarse a partir de los organismos según el procedimiento conocido para el experto como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, mediante extracción, destilación, cristalización, dado el caso precipitación con sales y/o cromatografía. Para esto, los organismos pueden descomponerse ventajosamente de antemano.
El procedimiento según la invención se realiza ventajosamente, cuando en el caso de los organismos huésped se trata de microorganismos, a una temperatura entre 0 ºC y 95 ºC, preferiblemente entre 10 ºC y 85 ºC, con especial preferencia entre 15 ºC y 75 ºC, de manera muy especialmente preferida entre 15 ºC y 45 ºC.
El valor de pH se mantiene a este respecto ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 6 y 9, con especial preferencia entre pH 7 y 8.
El procedimiento según la invención puede operarse de forma discontinua, semicontinua o continua. Un resumen de procedimientos de cultivo conocidos puede encontrarse en el libro de texto de Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo que va a usarse cumple de forma adecuada los requisitos de las cepas respectivas. Descripciones de medios de cultivo de distintos microorganismos están contenidas en el manual “Manual of Methods für General Bacteriology” de la American Society für Bacteriology (Washington D. C., EE.UU., 1981).
Estos medios que pueden utilizarse según la invención comprenden habitualmente, como se ha descrito anteriormente, una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/u oligoelementos.
Fuentes de carbono preferidas son azúcares, como mono-, di-o polisacáridos. Fuentes de carbono muy buenas son, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. También pueden añadirse a los medios azúcares mediante compuestos complejos, como molasas, u otros productos secundarios del refino del azúcar. También puede ser ventajoso añadir mezclas de
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Los ácidos grasos obtenidos en el procedimiento también son adecuados como material de partida para la síntesis química de otros productos de valor. Pueden usarse, por ejemplo, en combinación entre sí o solos, para la producción de fármacos, alimentos, piensos o cosméticos.
Otro objeto según la invención son ácidos nucleicos aislados con secuencias que codifican polipéptidos con
5 actividad de Δ5-elongasa, convirtiendo las Δ5-elongasas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos ácidos grasos C20 con al menos cuatro dobles enlaces en la molécula de ácido graso; que se incorporan finalmente ventajosamente en diacilglicéridos y/o triacilglicéridos.
Se dan a conocer ácidos nucleicos aislados con secuencias que codifican polipéptidos con actividad de Δ5-elongasa y que contienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID
10 NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 o SEQ ID NO: 142.
Otros ácidos nucleicos aislados dados a conocer están representados por secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con actividad de Δ5-elongasa y que contienen una combinación de aminoácidos con las secuencias seleccionadas del grupo:
a) SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 15 140; o
b) SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142; o
c) SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142.
Las secuencias descritas en las secuencias SEQ ID NO: 115 (NXXXHXXMYXYYX), SEQ ID NO: 116
20 (HHXXXXWAWW), SEQ ID NO: 139 (LHXXHH), SEQ ID NO: 140 (TXXQXXQF), SEQ ID NO: 141 (DTXFMV) y SEQ ID NO: 142 (TQAQXXQF) describen regiones conservadas de las distintas elongasas. La Tabla 2 describe el significado de los aminoácidos marcados con X contenidos en las secuencias de ácidos nucleicos mencionadas (Columna 3). También pueden extraerse de la tabla los aminoácidos preferidos en las distintas posiciones (Columna 3). La columna 1 describe la SEQ ID NO, la columna 2 la posición en la secuencia.
25 Tabla 2: Significado de los aminoácidos marcados con X en las secuencias consenso.
SEQ ID NO:
Posición de X en la secuencia Aminoácido Aminoácido preferido
115 (NXXXHXXMYXYYX)
2 Ser, Cys, Leu, Gly Cys, Leu
115
3 Thr, Phe, Ile, Ser, Val, Trp, Gly Phe, Trp
115
4 Val, Ile Val, Ile
115
6 Val, Ile, Thr Val, Ile
115
7 lle, Phe, Val, Leu, Cys Cys, Val
115
10 Ser, Gly, Tyr, Thr, Ala Thr, Ser
115
13 Phe, Met, Thr, Leu, Ala, Gly Leu
116 (HHXXXXWAWW)
3 Ala, Ser, Thr Ala, Ser, con especial preferencia Ala
116
4 Thr, Met, Val, Leu, Ile, Ser Leu, Thr, con especial preferencia Leu
116
5 Val, Thr, Met, Leu, Ile Ile, Ser, con especial preferencia Ile
116
6 Val, Met, Leu, Ile, Ala, Pro, Ser, Phe Ile, Ser, con especial preferencia Ile
139 LHXXHH
3 Val, Tyr, Ile Val, Thr
139
4 Tyr, Phe Tyr
140 TXXQXXQF
2 Asn, Asp, Thr, Gln, Met, Ser, Ala Gln
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Tabla 16:
Sustrato de ácido graso
Conversión (en %) de OtElo2 Conversión (en %) de OtELO2.2
16:0
- -
16:1Δ9
- -
16:3Δ7,10,13
- -
18:0
- -
18:1Δ6
- -
18:1Δ9
- -
18:1Δ11
- -
18:2Δ9,12
- -
18:3Δ6,9,12
15,3 55,7
18:3Δ5,9,12
- -
18:4Δ6,9,12,15
21,1 70,4
2O-2Δ11,14
- -
20:3Δ8,11,14
- -
20:4Δ5,8,11,14
- -
20:5Δ5,8,11,14,17
- -
22:4Δ7,10,13,16
- -
22:5Δ7,10,13,16,19
- -
22:6Δ4,7,10,13,16,19
- -
La Figura 24 A -D muestra el alargamiento de ácido eicosapentaenoico mediante OtElo1 (B) u OtElo1.2 (D). Los controles (A, C) no muestran el producto de alargamiento (C22:5 ω3).
5 La Figura 25 A -D muestra el alargamiento de ácido araquidónico mediante OtElo1 (B) u OtElo1.2 (D). Los controles (A, C) no muestran el producto de alargamiento (C22:4 ω6).
Ejemplo 48: Clonación de genes de elongasa de Euglena gracilis y Arabidopsis thaliana
Mediante búsqueda de regiones conservadas en las secuencias de proteínas con ayuda de los genes elongasa citados en la solicitud con actividad de Δ5-elongasa o actividad de Δ6-elongasa pudieron identificarse secuencias de 10 Arabidopsis thaliana o Euglena gracilis con motivos correspondientes en bandos de datos de secuencias (Genbank, Euglena EST Bank). A este respecto se trata de las siguientes secuencias:
Nombre del gen
SEQ ID Aminoácidos
EGY1019 (E. gracilis)
SEQ ID NO: 131 262
EGY2019 (E. gracilis)
SEQ ID NO: 133 262
At3g06460 (A. thaliana)
SEQ ID NO: 135 298
At3g06470 (A. thaliana)
SEQ ID NO: 137 278
La clonación de elongasas de Euglena gracilis se realizó del siguiente modo:
Se obtuvo la cepa 1224-5/25 de Euglena gracilis de la Sammlung für Algenkulturen Göttingen (SAG). Para el 15 aislamiento, la cepa se cultivó en medio II (Calvayrac R y Douce R, FEBS Letters 7:259-262, 1970) durante 4 días a 23 ºC con un intervalo de luz/oscuridad de 8 h/16 h (35 mol s-1 m-2 de intensidad de la luz).
Se aisló ARN total de un cultivo de Euglena de cuatro días con ayuda del kit RNAeasy de la empresa Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.). A partir del ARN total se aisló poli-A+ ARN (ARNm) con ayuda de oligo-dT-celulosa (Sambrook y col., 1989). El ARN se transcribió de forma inversa con el kit Reverse Transcription System de 20 Promega y el ADNc sintetizado se clonó en el vector lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). Correspondientemente a las instrucciones del fabricante, el ADNc se desempaquetó dando el ADN de plásmido y los clones se secuenciaron para secuenciación aleatoria. A partir del ARN total se aisló ARNm con ayuda del sistema de aislamiento PolyATract (Promega). El ARNm se transcribió de forma inversa con el kit Marathon cDNA Amplification (BD Biosciences) y se ligó con los adaptadores correspondientemente a las instrucciones del fabricante. Entonces
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Claims (1)

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