ES2592152T3 - Derivado de purinona como inhibidor de Btk quinasa - Google Patents

Abstract

6-Amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, o una sal de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Derivado de purinona como inhibidor de Btk quinasa Campo tecnico

La presente invencion se refiere a 6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8- ona y sales de la misma (abreviado en lo sucesivo como "compuestos de la presente invencion").

Antecedentes en la tecnica

La tirosina quinasa de Bruton (abreviada en lo sucesivo como "Btk") pertenece a la familia Tec de quinasas, que son tirosina quinasas no receptoras, y se expresan selectivamente en llneas de linfocitos B y mielocitos. Btk desempena un importante papel en la transduccion de senal en linfocitos B y es un factor que contribuye a la supervivencia, diferenciacion, proliferacion, y activacion de linfocitos B. La senalizacion en linfocitos B a traves del receptor antigenico de linfocitos B (BCR) induce una amplia diversidad de respuestas biologicas, y aqul una transduccion de senal anomala causa activacion anomala de linfocitos B y la formation de autoanticuerpos patogenos. Se cree que Btk forma una eslabon en las rutas de transduccion de senal mediadas por BCR en linfocitos B. De ese modo, se conoce que la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA) esta causada por un defecto en el gen Btk humano que da como resultado la induction de diferenciacion anomala de linfocitos B y una reduction drastica en la production de inmunoglobulina (vease el Documento de No Patente 1). Los slntomas de esta enfermedad incluyen una reduccion considerable de los linfocitos B en la sangre periferica y un aumento de la susceptibilidad a infecciones bacterianas. Btk tambien se conoce por participar en la activacion de mastocitos y en funciones fisiologicas de las plaquetas. Debido a esto, los compuestos que tienen una actividad inhibidora de Btk son eficaces para el tratamiento de enfermedades en las que participan linfocitos B o mastocitos, por ejemplo, enfermedades alergicas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades tromboembolicas y canceres (vease el Documento de No Patente 2).

Los siguientes compuestos se conocen como tecnica anterior para los compuestos de la presente invencion.

Los compuestos representados por la formula general (A) se conocen como compuestos que tienen actividad inhibidora de Btk

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(en la formula LaA representa CH2, O, NH, o S; ArA representa arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir; YA representa cualquier sustituyente seleccionado entre alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, y heteroarilo; ZA representa CO, OCO, NHCO, o CS; R7'A y R8'A representan cada uno independientemente H, alquilo C1-C4 sin sustituir, alquilo C1-C4 sustituido, heteroalquilo C1-C4 sin sustituir, heteroalquilo C1-C4 sustituido, cicloalquilo C3-C6 sin sustituir, cicloalquilo C3-C6 sustituido, heterocicloalquilo C2-C6 sin sustituir, y heterocicloalquilo C2-C6 sustituido; o R7'A y R8'A forman juntos un enlace; y R6'A representa H, alquilo C1- C4 sustituido o sin sustituir, heteroalquilo C1-C4 sustituido o sin sustituir, alcoxialquilo C1-C6, alquilaminoalquilo C1-C8, cicloalquilo C3-C6 sustituido o sin sustituir, o arilo sustituido o sin sustituir (las definiciones de estos grupos se han extraldo)) (veanse los Documentos de Patente 1,2, y 3).

Por otro lado, por ejemplo, los compuestos representados por la formula general (B)

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(en la formula, Q1B y Q2B se seleccionan independientemente entre CX1B, CX2B, y nitrogeno; Q3B representa N o CH; X1B y X2B se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo (C1-C6), ciano, halogeno, etc.; R1B se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo (C1-C6); y B representa 0 o un numero entero de 1 a 3; R2B y R3B se seleccionan independientemente entre hidrogeno y alquilo (C1-C6); R4B se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, etc.; y R5B se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo, heterociclilo, y heterociclilo sustituido (las definiciones de estos grupos se han extraldo)) (vease el Documento de Patente 4) se conocen como compuestos que tienen un esqueleto de purinona.

Tambien se conocen los compuestos representados por la formula general (C)

imagen3

(en la formula, XC se selecciona entre el grupo que consiste en nitrogeno y CR8C; R8C se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, alquilo sustituido o sin sustituir, etc.; Q1C se selecciona entre el grupo que consiste en O, S, etc.; ZC se selecciona entre el grupo que consiste en oxlgeno, azufre, y NY5C; Y5C se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo sustituido o sin sustituir, etc.; Q2C, Q3C, y Q4C se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, etc.; R2C se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo sustituido o sin sustituir; y nC representa 0, 1, 2, 3 o 4 (las definiciones de estos grupos se han extraldo)) (vease el Documento de Patente 5).

Tambien se desvelan compuestos que tienen un esqueleto de purinona como la formula 20 (vease el numero de parrafo 0028) en el Documento de Patente 6.

Tambien se conocen los compuestos representados por la formula general (D)

[C 5]

z°

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R1D

(en la formula, R1D representa un grupo seleccionado entre hidrogeno, alquilo sustituido o sin sustituir,

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etc.; R2D representa alquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, o alquinilo sustituido o sin sustituir; YD representa un grupo seleccionado entre O, C-NO2, y S; ZD representa un grupo seleccionado entre

[C 7]

r*d

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etc.; aqul, AD, DD, ED, y MD representan cada uno independientemente CR12D, N, y N-oxido; R12D representa un grupo seleccionado entre hidrogeno, halogeno, amino, hidroxi, y ciano; XD representa un grupo seleccionado entre O, C-NO2, y S; R6D representa un grupo seleccionado entre cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, y arilo sustituido o sin sustituir; la indicacion aD representada por la llnea punteada representa un enlace sencillo o un doble enlace; y nD representa un numero entero seleccionado entre 0, 1, y 2) (vease el Documento de Patente 7).

Los compuestos de la presente invencion son compuestos que, ademas de tener actividad inhibidora selectiva de Btk, exhiben una excelente actividad metabolica y pueden evitar la actividad inhibidora de CYP y reacciones adversas tales como, por ejemplo, hepatotoxicidad; sin embargo, no existe ninguna declaracion o sugerencia con respecto a estos rasgos caracterlsticos en ninguno de los documentos de la tecnica anterior.

Documento de Patente 1: Traduccion Japonesa de Solicitud PCT n.° 2010-504324

Documento de Patente 2: WO 2008/121742

Documento de Patente 3: WO 2010/009342

Documento de Patente 4: WO 2008/060301

Documento de Patente 5: WO 2007/142755

Documento de Patente 6: Traduccion Japonesa de Solicitud PCT n.° 2003-509427 Documento de Patente 7: WO 2003/037890

Documento de No Patente 1: Nature, Volumen 361, pp. 226-233, 1993

Documento de No Patente 2: Anticancer Agents in Medicinal Chemistry, Volumen 7, numero 6, pp. 624-632, 2007

Divulgacion de la invencion

Con el fin de proporcionar un agente terapeutico muy seguro para enfermedades en las que participan linfocitos B y/o mastocitos, un objetivo de la presente invencion es desarrollar un compuesto que, ademas de tener una actividad inhibidora selectiva de Btk, exhiba una excelente estabilidad metabolica y pueda evitar hepatotoxicidad.

Con el fin de conseguir el objetivo anterior, los presentes inventores llevaron a cabo investigaciones exhaustivas dirigidas a descubrir compuestos que tienen actividad inhibidora selectiva de Btk y descubrieron los compuestos de la presente invencion como resultado. Ademas, tambien se descubrio que estos compuestos son compuestos que exhiben una excelente actividad metabolica y pueden evitar hepatotoxicidad, y se logro la presente invencion como resultado.

Es decir, la presente invencion se refiere a

[1] 6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, o una sal de la misma;

y

[2] 6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona.

Los compuestos de la presente invencion, ademas de tener actividad inhibidora selectiva de Btk, exhiben una excelente actividad metabolica y pueden evitar hepatotoxicidad, y como consecuencia son utiles como agentes terapeuticos muy seguros para enfermedades en las que participan linfocitos B y/o mastocitos, tales como linfoma no Hodgkin.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

La presente invencion se describe con detalle a continuacion.

En la presente invencion, "que tiene actividad inhibidora selectiva de Btk" representa que tiene actividad inhibidora selectiva de Btk con respecto a tirosina quinasas no Btk y particularmente protelna tirosina quinasa especlfica de

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linfocitos (Lck), protelna tirosina quinasas fyn (Fyn), e isoforma A homologa del oncogen relacionado con sarcoma viral de Yamaguchi v-yes-1 (LynA). Esta propiedad hace posible evitar reacciones adversas impredecibles causadas por la inhibicion de otras tirosina quinasas. Por ejemplo, se conoce la aparicion de anomallas retinianas en ratones deficientes de Lck (Oncogene, Volumen 16, pp. 2351-2356, 1998), que aumenta la posibilidad de que se produzcan reacciones adversas en el ojo en el caso de inhibicion de Lck.

En la presente invencion, el atomo de halogeno representa fluor, cloro, bromo, y yodo.

En la presente invencion, a menos que se indique especlficamente otra cosa, y como es evidente para el experto en la materia,

el simbolo [C 11] representa que enlaza hacia el lado posterior del piano del papel (es decir, la posicion a); el simbolo [C 12] ^ representa que enlaza hacia la parte anterior del piano del papel (es decir, la posicion (3); y [C 13] representa la posicion a, la posicion (3, o su mezcla en cualquier proporcion.

Los compuestos de la presente invencion se convierten en las sales correspondientes mediante metodos conocidos. La sal es preferentemente una sal soluble en agua. Algunas sales adecuadas se pueden mostrar a modo de ejemplo mediante las sales con metales alcalinos (potasio y sodio), sales con metales alcalinoterreos (calcio y magnesio), la sal de amonio, sales con aminas organicas farmaceuticamente aceptables (tetrametilamonio, trietilamina, metilamina, dimetilamina, ciclopentilamina, bencilamina, fenetilamina, piperidina, monoetanolamina, dietanolamina, tris(hidroximetil)aminometano, lisina, arginina y N-metil-D-glucamina), y sales de adicion de acido (sales de acidos inorganicos (clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, fosfato y nitrato) y sales de acidos organicos (acetato, trifluoroacetato, lactato, tartrato, oxalato, fumarato, maleato, benzoato, citrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, toluenosulfonato, isetionato, glucuronato y gluconato)).

Los compuestos de la presente invencion y sus sales se pueden convertir en solvatos. Este solvato es preferentemente soluble en agua y tiene baja toxicidad. Algunos solvatos adecuados se pueden mostrar a modo de ejemplo mediante solvatos con, por ejemplo, agua o un disolvente de alcohol (por ejemplo, etanol).

Los compuestos de la presente invencion se pueden usar como profarmacos. Un profarmaco de un compuesto de la presente invencion representa un compuesto que se convierte mediante una reaccion in vivo, por ejemplo, mediante una enzima o acido gastrico, en el compuesto de la presente invencion. Algunos profarmacos de los compuestos de la presente invencion se pueden mostrar mediante compuestos en los que - cuando el compuesto de la presente invencion tiene un grupo hidroxilo - este grupo hidroxilo esta acilado, alquilado, fosfatado, o borado (por ejemplo, compuestos proporcionados por acetilacion, palmitoilacion, propanoilacion, pivaloilacion, succinilacion, fumarilacion, alanilacion o dimetilaminometilcarbonilacion del grupo hidroxilo en los compuestos de la invencion); otros ejemplos son compuestos proporcionados por la esterificacion o amidacion de un grupo carboxilo en un compuesto de la presente invencion (por ejemplo, compuestos proporcionados por esterificacion de etilo, esterificacion de isopropilo, esterificacion de fenilo, esterificacion de carboximetilo, esterificacion de dimetilaminometilo, esterificacion de pivaloiloximetilo, esterificacion de etoxicarboniloxietilo, esterificacion de ftalidilo, esterificacion de (5-metil-2-oxo-1,3- dioxolen-4-il)metilo, esterificacion de ciclohexiloxicarboniletilo, o metilamidacion de un grupo carboxilo en un compuesto de la presente invencion). Estos compuestos se pueden preparar mediante metodos conocidos. Ademas, el profarmaco de un compuesto de la presente invencion puede ser un hidrato o anhidro. El profarmaco de un compuesto de la presente invencion se convierte en condiciones fisiologicas en el compuesto de la presente invencion, como se describe en las paginas 163 a 198 de Molecular Design en el volumen 7 de Development of Medicines (Hirokawa Shoten Co., 1990). Ademas, los compuestos de la presente invencion se pueden marcar con un isotopo (por ejemplo, 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O,35S, 18F, 36Cl, 123I, y 125I).

[Metodos para producir los compuestos de la presente invencion]

Los compuestos de la presente invencion se pueden producir modificando y combinando adecuadamente metodos conocidos, por ejemplo, los metodos descritos en Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations, 2a edicion (Richard C. Larock, John Wiley & Sons Inc., 1999), o los metodos que se dan en los ejemplos.

Los compuestos de la presente invencion se pueden producir usando el siguiente esquema de reaccion 1.

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(En la formulas, T1 y T2 representan cada uno independientemente un grupo protector para el grupo amino (por ejemplo, el grupo bencilo (Bn), el grupo 4-metoxibencilo, y el grupo 3,4-dimetoxibencilo); X1 y X2 representan cada uno independientemente un atomo de halogeno; anillo2-1 representa un anillo2a que se ha protegido mediante un grupo protector representado por T3 (por ejemplo, el grupo terc-butoxicarbonilo (Boc) y el grupo benciloxicarbonilo (Cbz)); anillo2a es un anillo de pirrolidina, L es -O-, anillo1 es un anillo de benceno, m es 0 y n es 0.)

La reaccion 1 en el esquema de reaccion 1 se conoce y se lleva a cabo usando un compuesto con formula general

(a) y un derivado de amina protegido, es decir, un compuesto representado por T1T2-NH (T1 y T2 en la formula tienen las mismas definiciones que se han indicado anteriormente) y realizando la reaccion en un disolvente organico (por ejemplo, diclorometano, tetrahidrofurano, dioxano, dimetilformamida, dimetilacetamida, y 1-metil-2-pirrolidona) en presencia de una base (por ejemplo, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, piridina, 4-dimetilaminopiridina, y N- metilmorfolina) a una temperatura de -20 °C a la temperatura ambiente.

La reaccion 2 en el esquema de reaccion 1 se conoce y se lleva a cabo usando un compuesto con formula general

(b) y un compuesto representado por la formula general (II) y realizando la reaccion en un disolvente organico (por ejemplo, dioxano, acetonitrilo, tetrahidrofurano, dimetilformamida, dimetilacetamida y 1-metil-2-pirrolidona) en presencia de una base (por ejemplo, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, piridina, 4-dimetilaminopiridina, y N- metilmorfolina) a una temperatura de -20 °C a 70 °C.

La reaccion 3 en el esquema de reaccion 1 se conoce y se lleva a cabo usando un compuesto representado por la formula general (c) y usando un reactivo metalico (por ejemplo, cinc, hierro, estano, cloruro de estano, cloruro de hierro, samario, indio, y borohidruro sodico-cloruro de nlquel) en un disolvente miscible en agua (por ejemplo, etanol, metanol, tetrahidrofurano, y acetato de etilo) en presencia o ausencia de un acido (por ejemplo, acido clorhldrico, acido bromhldrico, cloruro de amonio, acido acetico, y formiato amonico) a una temperatura de 0 °C a 150 °C.

La reaccion 4 en el esquema de reaccion 1 se conoce y se lleva a cabo usando un compuesto representado por la formula general (d) y usando un reactivo (por ejemplo, 1,1'-carbonildiimidazol (CDI) y trifosgeno) en un disolvente organico (por ejemplo, tetrahidrofurano, dimetilformamida, y dimetilacetamida) en presencia o ausencia de una base (por ejemplo, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, piridina, 4-dimetilaminopiridina, y N-metilmorfolina) de una temperatura generada por enfriamiento en hielo a la temperatura de reflujo.

Las reacciones de desproteccion para los grupos protectores en el esquema de reaccion 1 se conocen y se pueden realizar mediante los metodos descritos a continuacion. Algunos ejemplos aqul son (1) reacciones de desproteccion basadas en hidrolisis alcalina, (2) reacciones de desproteccion en condiciones acidas, (3) reacciones de desproteccion basadas en hidrogenolisis, (4) reacciones de desproteccion para el grupo sililo, (5) reacciones de desproteccion usando un metal, y (6) reacciones de desproteccion usando un complejo metalico.

Estos metodos se describen especlficamente continuacion.

(1) La reaccion de desproteccion basada en hidrolisis alcalina se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un disolvente organico (por ejemplo, metanol, tetrahidrofurano, y dioxano) de 0 °C a 40 °C usando un hidroxido de metal alcalino (por ejemplo, hidroxido sodico, hidroxido potasico, e hidroxido de litio), un hidroxido de metal alcalinoterreo (por ejemplo, hidroxido de bario e hidroxido de calcio), o un carbonato (por ejemplo, carbonato sodico y carbonato potasico), o una solucion acuosa de los precedentes, o su mezcla.

(2) La reaccion de desproteccion en reacciones acidas se puede llevar a cabo, por ejemplo, de 0 °C a 100 °C en presencia o ausencia de 2,2,2-trifluoroetanol, en un disolvente organico (por ejemplo, diclorometano, cloroformo, dioxano, acetato de etilo, metanol, alcohol isopropllico, tetrahidrofurano, y anisol) y en un acido organico (por

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ejemplo, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido metanosulfonico, y p-tosilato) o un acido inorganico (por ejemplo, acido clorWdrico y acido sulfurico) o su mezcla (por ejemplo, bromuro de hidrogeno/acido acetico).

(3) La reaccion de desproteccion basada en hidrogenolisis se puede llevar a cabo, por ejemplo, de 0 °C a 200 °C en un disolvente (por ejemplo, un eter (por ejemplo, tetrahidrofurano, dioxano, dimetoxietano, y dietil eter), un alcohol (por ejemplo, metanol y etanol), un disolvente de benceno (por ejemplo, benceno y tolueno), una cetona (por ejemplo, acetona y metil etil cetona), un nitrilo (por ejemplo, acetonitrilo), una amida (por ejemplo, N,N- dimetilformamida), agua, acetato de etilo, acido acetico, o un disolvente mixto de dos o mas de los precedentes) en presencia de un catalizador (por ejemplo, paladio-carbono, negro de paladio, hidroxido de paladio-carbono, oxido de platino, y niquel Raney) en una atmosfera de hidrogeno a presion normal o presion elevada o en presencia de formiato de amonio.

(4) La reaccion de desproteccion para el grupo sililo se puede llevar a cabo, por ejemplo, de 0 °C a 40 °C en un disolvente organico miscible en agua (por ejemplo, tetrahidrofurano y acetonitrilo) usando fluoruro de tetrabutilamonio. Tambien se puede llevar a cabo, por ejemplo, de -10 °C a 100 °C en un acido organico (por ejemplo, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido metanosulfonico, y p-tosilato) o un acido inorganico (por ejemplo, acido clorhidrico y acido sulfurico) o su mezcla (por ejemplo, bromuro de hidrogeno/acido acetico).

(5) La reaccion de desproteccion usando un metal se puede llevar a cabo, por ejemplo, de 0 °C a 40 °C en un disolvente acido (por ejemplo, acido acetico, un tampon con un pH de 4,2 a 7,2, o una solucion mixta de las soluciones precedentes con un disolvente organico tal como tetrahidrofurano) en presencia de polvo de cinc y segun sea necesario mientras se aplican ultrasonidos.

(6) La reaccion de desproteccion usando un complejo metalico se puede llevar a cabo, por ejemplo, de 0 °C a 40 °C en un disolvente organico (por ejemplo, diclorometano, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetato de etilo, acetonitrilo, dioxano, y etanol), agua, o sus soluciones mixtas, usando un complejo metalico (por ejemplo, tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0), dicloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II), acetato de paladio(II), y cloruro de tris(trifenilfosfina)rodio(I)) en presencia de un agente de captura (por ejemplo, hidruro de tributilestano, trietilsilano, dimedona, morfolina, dietilamina, y pirrolidona), un acido organico (por ejemplo, acido acetico, acido formico, y acido 2-etilhexanoico) y/o una sal de acido organico (por ejemplo, 2-etilhexanoato sodico y 2- etilhexanoato potasico) y en presencia o ausencia de un reactivo de tipo fosfina (por ejemplo, trifenilfosfina).

Ademas de lo expuesto anteriormente, la reaccion de desproteccion tambien se puede llevar a cabo usando los metodos que se describen, por ejemplo, en T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, 1999.

El grupo protector para un grupo amino se puede mostrar a modo de ejemplo mediante el grupo benciloxicarbonilo, el grupo t-butoxicarbonilo, el grupo aliloxicarbonilo (Alloc), el grupo 1-metil-1-(4-bifenil)etoxicarbonilo (Bpoc), el grupo trifluoroacetilo, el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo, el grupo bencilo (Bn), el grupo p-metoxibencilo, el grupo benciloximetilo (BOM), y el grupo 2-(trimetilsilil)etoximetilo (SEM).

Ademas de lo expuesto anteriormente, el grupo protector para un grupo amino puede ser cualquier grupo capaz de una eliminacion facil y selectiva y no se limita particularmente de otro modo. Por ejemplo, se pueden usar los grupos descritos en T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, 1999.

La reaccion 5 en el esquema de reaccion 1 se conoce y se lleva a cabo usando un compuesto con formula general (f) y un compuesto representado por la formula general (III-1) o la formula general (III-2) y realizando la reaccion de la temperatura ambiente a 120 °C en un disolvente organico (por ejemplo, diclorometano y acetonitrilo) en presencia de una base (por ejemplo, piridina, trietilamina, y N,N-diisopropiletilamina), una sal de cobre (por ejemplo, acetato de cobre(II)), y un agente de secado (por ejemplo, tamices moleculares).

Los compuestos de la presente invencion se pueden producir usando el compuesto representado por la formula general (I-A) y un compuesto representado por la formula general (I-D-1)

[C 22]

R2d-CO2H (I-D-1)

(R2d en la formula es un grupo alquinileno C3) y llevando a cabo la reaccion de 0 °C a la temperatura ambiente usando un agente de condensacion (por ejemplo, 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-[3- (dimetilamino)propil]carbodiimida (EDC), 1,1'-carbonildiimidazol (CDI), yoduro de 2-cloro-1 -metilpiridinio, y anhidrido ciclico de acido 1-propanofosfonico (PPA)) en un disolvente organico (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, dimetilformamida, dimetilacetamida, dietil eter, y tetrahidrofurano), o sin disolvente, en presencia o ausencia de una base (por ejemplo, trietilamina, piridina, N,N-diisopropiletilamina, 4-dimetilaminopiridina, y N-metilmorfolina) y con o sin el uso de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt).

Los compuestos que se usan como materiales de partida en cada una de las reacciones de la presente Descripcion, por ejemplo, de formula general (a), (II), (III-1), (III-2) y (I-D-1), se conocen o se pueden producir facilmente mediante metodos conocidos.

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Para cada una de las reacciones de la presente Descripcion, las reacciones acompanadas por aplicacion de calor se pueden llevar a cabo usando un bano de agua, un bano de aceite, un bano de arena, o microondas, como sera evidente para el experto en la materia.

Se puede usar un reactivo de fase solida, que comprende el reactivo soportado sobre un pollmero de alto peso molecular (por ejemplo, poliestireno, poliacrilamida, polipropileno, y polietilenglicol), segun sea apropiado en las reacciones de la presente Descripcion.

El producto de reaccion en cada una de las reacciones de la presente Descripcion se puede purificar mediante los medios de purificacion habituales, por ejemplo, usando metodos tales como destilacion a presion normal o a presion reducida, cromatografla llquida de alta resolution usando gel de sllice o silicato de magnesio, cromatografla en capa fina, resinas de intercambio ionico, resinas secuestradoras, cromatografla en columna, lavado y recristalizacion. La purificacion se puede llevar a cabo en cada reaccion o se puede llevar a cabo despues de la finalization de varias reacciones.

[Toxicidad]

Los compuestos de la presente invention tienen una toxicidad aceptablemente baja, por ejemplo, casi no tienen actividad inhibitoria de CYP y casi no tienen hepatotoxicidad, y de ese modo se pueden usar de forma segura como ingrediente farmaceutico activo.

[Aplicaciones para compuestos farmaceuticos]

Los compuestos de la presente invencion tienen una actividad inhibidora selectiva de Btk y como resultado son utiles como agentes para prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con Btk, es decir, enfermedades en las que participan linfocitos B y/o mastocitos, por ejemplo, enfermedades alergicas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades tromboembolicas, canceres, y enfermedades de injerto frente al hospedador. Los compuestos de la presente invencion tambien ejercen una action inhibidora selectiva en la activation de linfocitos B y como resultado tambien son eficaces como inhibidores de la activation de linfocitos B.

Las enfermedades alergicas en la presente invencion se puede mostrar a modo de ejemplo mediante alergias, anafilaxis, conjuntivitis alergica, rinitis alergica, y dermatitis alergica.

Las enfermedades autoinmunes en la presente invencion se pueden ejemplificar con enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, lupus, artritis reumatoide, artritis psoriatica, osteoartritis, enfermedad de Still, artritis juvenil, diabetes de tipo I, miastenia gravis, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis de Ord, enfermedad de Basedow, slndrome de Sjogren, esclerosis multiple, slndrome de Guillain-Barre, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, slndrome de opsoclono-mioclono, espondilitis anquilosante, slndrome de anticuerpos antifosfollpidos, anemia aplasica, hepatitis autoinmune, enfermedad cellaca, slndrome de Goodpasture, purpura trombocitopenica idiopatica, neuritis optica, esclerodermia, cirrosis biliar primaria, enfermedad de Reiter, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolltica autoinmune calida, granuloma de Wegener, psoriasis, alopecia universal, enfermedad de Behpet, slndrome de fatiga cronica, disautonomla, endometriosis, cistitis intersticial, miotonla, vulvodinia, y lupus sistemico eritematoso.

Las enfermedades inflamatorias en la presente invencion se pueden ejemplificar con asma, apendicitis, blefaritis, bronquiolitis, bronquitis, bursitis, cervicitis, colangitis, colecistitis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dacrioadenitis, dermatitis, dermatomiositis, encefalitis, endocarditis, endometritis, enteritis, epicondilitis, epididimitis, fascitis, fibrositis, gastritis, gastroenteritis, hepatitis, hidradenitis supurativa, laringitis, mastitis, meningitis, mielitis, miocarditis, miositis,nefritis, ooforitis, orquitis, osteitis, pancreatitis, parotiditis, pericarditis, peritonitis, faringitis, pleuritis, flebitis, neumonia, proctitis, prostatitis, pielonefritis, rinitis, salpingitis, sinusitis, estomatitis, sinovitis, tendinitis, amigdalitis, uveitis, vaginitis, vasculitis y vulvitis.

Las enfermedades tromboembolicas en la presente invencion se pueden ejemplificar con infarto de miocardio, angina de pecho, reoclusion despues de angioplastia, reestenosis despues de angioplastia, reoclusion despues de revascularization aortocoronaria, reestenosis despues de revascularization aortocoronaria, apoplejia, isquemia transitoria, trastornos oclusivos de arterias perifericas, embolia pulmonar y trombosis venosa profunda.

En la presente invencion, los canceres incluyen linfomas no Hodgkin, entre los que son particularmente adecuados los linfomas no Hodgkin de linfocitos B, por ejemplo, linfoma de Burkitt, linfoma relacionado con SIDA, linfoma de linfocitos B de zona marginal (linfoma de linfocitos B de zona marginal nodal, linfoma de linfocitos B de zona marginal extranodal y linfoma de linfocitos B de zona marginal esplenica), linfoma de linfocitos B grandes y difusos, linfoma de efusion primaria, granulomatosis linfomatoide, linfoma folicular, leucemia linfocitica cronica de linfocitos B, leucemia prolinfocitica de linfocitos B, leucemia linfoplasmocitica/macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmocitoma, linfoma de celulas del manto, linfoma de linfocitos B grandes mediastinico, linfoma de linfocitos B grandes intravascular, y leucemia de celulas peludas. Ademas del linfoma no Hodgkin, los canceres en la presente invencion incluyen tumores endocrinos pancreaticos, por ejemplo, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, somatostatinoma,

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VIPoma, PPoma, y GRFoma.

Un compuesto de la presente invencion se puede administrar por si mismo o se puede administrar como una preparacion combinada en combination con otro farmaco con el fin de

1) suplementar y/o aumentar el efecto profilactico y/o terapeutico del compuesto,

2) mejorar la farmacocinetica y la absorcion y reducir la dosis del compuesto, y/o

3) reducir las reacciones adversas del compuesto.

La preparacion combinada de un compuesto de la presente invencion con otro farmaco se pueden administrar en forma de un agente combinado en el que ambos componentes se combinan en una unica formulation o se pueden administrar como formulaciones separadas. La administration como formulaciones separadas incluye administration simultanea y administracion en momentos diferentes. En el caso de administracion en momentos diferentes, el compuesto de la presente invencion se puede administrar primero seguido por la administracion del otro farmaco, o el otro farmaco se puede administrar en primer lugar seguido por la administracion del compuesto de la presente invencion. El mismo metodo de administracion se puede usar para cada metodo o se pueden usar diferentes metodos de administracion.

No hay limitation en particular sobre las enfermedades que se pueden someter a la prevention y/o el tratamiento con la preparacion combinada mencionada anteriormente, y esta preparacion combinada se puede usar con cualquier enfermedad con la que el efecto de prevencion y/o tratamiento del compuesto de la presente invencion se suplemente y/o mejore.

Este otro farmaco para suplementar y/o potenciar el efecto profilactico y/o terapeutico de los compuestos de la presente invencion frente a enfermedades alergicas se puede ejemplificar con antihistamlnicos, antagonistas de leucotrienos, farmacos antialergicos, antagonistas del receptor de tromboxano A2, inhibidores de la tromboxano sintasa y esteroides.

El otro farmaco para suplementar y/o potenciar el efecto profilactico y/o terapeutico de los compuestos de la presente invencion frente a enfermedades autoinmunes se puede ejemplificar con inmunosupresores; esteroides; farmacos antirreumaticos modificado desde la enfermedad; inhibidores de elastasa; agonistas de receptores de cannabinoide-2; prostaglandinas; inhibidores de la prostaglandina sintasa; inhibidores de fosfodiesterasa; inhibidores de metaloproteasas; inhibidores de moleculas de adhesion; agentes de protelnas anti-citoquina, tales como agentes anti-TNF-a, agentes anti-IL-1, y agentes anti-IL-6; inhibidores de citoquinas; antiinflamatorios no esteroideos; y anticuerpos anti-CD20.

El otro farmaco para suplementar y/o potenciar el efecto profilactico y/o terapeutico de los compuestos de la presente invencion frente a enfermedades inflamatorias se puede ejemplificar con esteroides, inhibidores de elastasa, agonistas receptores de cannabinoide-2, prostaglandinas, inhibidores de la prostaglandina sintasa, inhibidores de fosfodiesterasa, inhibidores de metaloproteasas, inhibidores de moleculas de adhesion, antileucotrienos, agentes anticolinergicos, antagonistas del receptor de tromboxano A2, inhibidores de la tromboxano sintasa, derivados de xantina, agentes expectorantes, antibacterianos, antihistamlnicos, agentes de protelna anti- citoquina, inhibidores de citoquina, agentes de forskolina, inhibidores de liberation de mediadores, y antiinflamatorios no esteroideos.

El otro farmaco para suplementar y/o potenciar el efecto profilactico y/o terapeutico de los compuestos de la presente invencion frente a enfermedades tromboembolicas se puede ejemplificar con agentes trombollticos, heparina, heparinoides, heparinas de bajo peso molecular, warfarina, inhibidores de trombina, inhibidores del factor Xa, antagonistas del receptor de ADP, e inhibidores de ciclooxigenasa.

El otro farmaco para suplementar y/o potenciar el efecto profilactico y/o terapeutico de los compuestos de la presente invencion frente a linfomas no Hodgkin se puede ejemplificar con agentes de alquilacion, antimetabolitos, antibioticos anticancer, alcaloides vegetales, hormonas, compuestos de platino, anticuerpos anti-CD20, y otros agentes anticancer.

Los antihistamlnicos se pueden ejemplificar con clorhidrato de azelastina, ebastina, clorhidrato de epinastina, fumarato de emedastina, auranofina, oxatomida, clorhidrato de olopatadina, maleato de dl-clorfeniramina, fumarato de clemastina, fumarato de ketotifeno, cimetidina, dimenhidrinato, clorhidrato de difenhidramina, clorhidrato de ciproheptadina, clorhidrato de cetirizina, desloratadina, terfenadina, famotidina, clorhidrato de fexofenadina, bepotastina, besilato de bepotastina, mizolastina, mequitazina, furoato de mometasona, ranitidina, clorhidrato de ranitidina, loratadina, clorhidrato de prometazina y clorhidrato de homoclorciclicina.

Los antagonistas de leucotrieno se pueden ejemplificar con hidrato de pranlukast, montelukast sodico, zafirlukast, ablukast, pobilukast, sulukast, iralukast sodico, verlukast, ritolukast, cinalukast, pirodomast, tomelukast, y doqualast.

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Los farmacos antialergicos se pueden ejemplificar con amlexanox, clorhidrato de azelastina, israpafant, ibudilast, imitrodast sodico, ebastina, clorhidrato de epinastina, fumarato de emedastina, oxatomida, clorhidrato de ozagrel, clorhidrato de olopatadina, acido cromogllcico, cromoglicato sodico, fumarato de ketotifeno, seratrodast, clorhidrato de cetirizina, tosilato de suplatast, tazanolast, terfenadina, hidrato de domitroban y calcio, tranilast, nedocromilo, fexofenadina, clorhidrato de fexofenadina, pemirolast potasico, mequitazina, ramatroban, repirinast, y loratadina.

Los antagonistas de receptor de tromboxano A2 se pueden ejemplificar con seratrodast, hidrato de domitroban y calcio, y ramatroban.

Los inhibidores de la tromboxano sintasa se pueden ejemplificar con imitrodast sodico y clorhidrato de ozagrel.

Los esteroides se pueden ejemplificar con amcinonida, succinato de hidrocortisona y sodio, succinato de

prednisolona y sodio, succinato de metilprednisolona y sodio, ciclesonida, difluprednato, propionato de

betametasona, dexametasona, deflazacort, triamcinolona, acetonido de triamcinolona, halcinonida, palmitato de dexametasona, hidrocortisona, pivalato de flumetasona, butilacetato prednisolona, budesonida, sulfato de prasterona, furoato de mometasona, fluocinonida, acetonido de fluocinolona, fludroxicortida, flunisolida, prednisolona, propionato de alclometasona, propionato de clobetasol, propionato de dexametasona, propionato de deprodona, propionato de fluticasona, propionato de beclometasona, betametasona, metilprednisolona, suleptanato de metilprednisolona, succinato de metilprednisolona y sodio, fosfato de dexametasona y sodio, fosfato de hidrocortisona y sodio, fosfato de prednisolona y sodio, valerato de diflucortolona, valerato de dexametasona, valerato de betametasona, valerato acetato de prednisolona, acetato de cortisona, acetato de diflorasona, acetato de dexametasona, acetato de triamcinolona, acetato de parametasona, acetato de halopredona, acetato de

fludrocortisona, acetato de prednisolona, acetato de metilprednisolona, butirato de clobetasona, butirato de

hidrocortisona, butirato propionato de hidrocortisona, butirato propionato de betametasona.

Los agentes inmunosupresores se pueden ejemplificar con azatioprina, ascomicina, everolimus, salazosulfapiridina, ciclosporina, ciclofosfamida, sirolimus, tacrolimus, bucillamina, metotrexato, y leflunomida.

Los farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad se pueden ejemplificar con D-penicilamina, actarit, auranofina, salazosulfapiridina, hidroxicloroquina, bucillamina, metotrexato, leflunomida, lobenzarit sodico, aurotioglucosa, y aurotiomalato sodico.

Los inhibidores de elastasa se pueden ejemplificar con ONO-5046, ONO-6818, MR-889, PBI-1101, EPI-HNE-4, R- 665, ZD-0892, ZD-8321, GW-311616, DMP-777, L-659286, L-680833, L-683845, y AE-3763.

Los prostaglandinas (abreviadas en lo sucesivo como "PG") se pueden ejemplificar con farmacos de PGE1 (ejemplos: alprostadilo alfadex, alprostadilo), farmacos de PGI2 (ejemplo: beraprost sodico), agonistas de receptor de PG, y antagonistas de receptor de PG. El receptor de PG receptor se puede ejemplificar con receptores de PGE (EP1, EP2, EP3, y EP4), receptores de PGD (DP, CRTH2), receptores de PGF (fP), receptores de PGI2 (IP), y receptores de TX (TP).

Los inhibidores de la prostaglandina sintasa se pueden ejemplificar con salazosulfapiridina, mesalazina, olsalazina, acido 4-aminosalicllico, JTE-522, auranofina, carprofeno, difenpiramida, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, lornoxicam, loxoprofeno, meloxicam, oxaprozina, parsalmida, piproxeno, piroxicam, cinamato de piroxicam, zaltoprofeno, y pranoprofeno.

Los inhibidores de la fosfodiesterasa se pueden ejemplificar con rolipram, cilomilast, Bayl9-8004, NIK-616, roflumilast (A-217), cipamfilina (BRL-61063), atizoram (CP-80633), ONO-6126, SCH-351591, YM-976, V-11294A, PD-168787, D-4396, e IC-485.

Los inhibidores de molecula de adhesion se pueden ejemplificar con antagonista de a4 integrina.

Los agentes anti-TNF- a se pueden ejemplificar con anticuerpos anti-TNF-a, receptor de TNF-a soluble, anticuerpos de receptor anti-TNF-a, y protelna de union a TNF-a soluble y en particular por infliximab y etanercept.

Los agentes anti-IL-1 se pueden ejemplificar con anticuerpos anti-IL-1, receptor soluble de IL-1, anticuerpos anti-IL- 1Ra y/o anticuerpos anti-receptor de IL-1 y en particular con anakinra.

Los agentes anti-IL-6 se pueden ejemplificar con anticuerpos anti-IL-6, receptor soluble de IL-6, anticuerpos antireceptor de IL-6 y en particular con tocilizumab.

Los inhibidores de citoquina se pueden ejemplificar con tosilato de suplatast, T-614, RS-31747, y sonatimod.

Los agentes anticolinergicos se pueden ejemplificar con trihexifenidilo, clorhidrato de trihexifenidilo, clorhidrato de biperideno, y clorhidrato de biperideno.

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Los derivados de xantina se pueden ejemplificar con aminofilina, teofilina, doxofilina, sipamfilina, y diprofilina.

Los expectorantes se pueden ejemplificar con disolventes de amoniaco foeniculado, bicarbonato sodico, clorhidrato de bromhexina, carbocistelna, clorhidrato de ambroxol, clorhidrato de metilcistelna, acetilcistelna, clorhidrato de etil L-cistelna, y tiloxapol.

Los antibacterianos se pueden ejemplificar con cefuroxima sodica, trihidrato de meropenem, sulfato de netilmicina, sulfato de sisomicina, ceftibuteno, PA-1806, IB-367, tobramicina, PA-1420, doxorrubicina, sulfato de astromicina, y clorhidrato de cefetamet pivoxilo.

Los inhibidores de liberacion de mediador se pueden ejemplificar con tranilast, cromoglicato sodico, amlexanox, repirinast, ibudilast, dazanolast, y pemirolast potasico.

Los agentes trombollticos se pueden ejemplificar con alteplasa, uroquinasa, tisoquinasa, nasaruplasa, nateplasa, t- PA, pamiteplasa, monteplasa, prouroquinasa, y estreptoquinasa.

Los heparinoides se pueden ejemplificar con fondaparinux.

Las heparinas de bajo peso molecular se pueden ejemplificar con danaparoid sodico, enoxaparina (sodica), nadroparina calcica, bemiparina (sodica), reviparina (sodica), y tinzaparina (sodica).

El inhibidor de trombina se puede ejemplificar con argatroban, ximelagatran, melagatran, dabigatran, bivalirudina, lepirudina, hirudina, y desirudina.

Los antagonistas del receptor de ADP se pueden ejemplificar con clorhidrato de ticlopidina y sulfato de clopidogrel. Los inhibidores de ciclooxigenasa se pueden ejemplificar con aspirina.

Los agentes de alquilacion se pueden ejemplificar con clorhidrato de N-oxido de mostaza de nitrogeno, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, tiotepa, carbocuona, busulfan, clorhidrato de nimustina, dacarbazina, y ranimustina.

Los antimetabolitos se pueden ejemplificar con metotrexato, mercaptopurina, ribosido de 6-mercaptopurina, fluorouracilo, tegafur, tegafur uracilo, carmofur, doxifluridina, citarabina, enocitabina, tegafur gimestat otastat potasico, clorhidrato de gemcitabina, ocfosfato de citarabina, clorhidrato de procarbazina, e hidroxicarbamida.

Los antibioticos anticancer se pueden ejemplificar con actinomicina D, mitomicina C, clorhidrato de daunorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, clorhidrato de aclarrubicina, neocarzinostatina, clorhidrato de pirarrubicina, epirubicina (clorhidrato), clorhidrato de idarrubicina, cromomicina A3, bleomicina (clorhidrato), sulfato de peplomicina, terarrubicina, y estimalamero de zinostatina.

Los alcaloides vegetales se pueden ejemplificar con sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, sulfato de vindesina, clorhidrato de irinotecan, etoposido, flutamida, tartrato de vinorelbina, hidrato de docetaxel, y paclitaxel.

Los hormonas se pueden ejemplificar con estramustina fosfato sodico, mepitiostano, epitiostanol, acetato de goserelina, fosfestrol (fosfato de dietilestilbestrol), citrato de tamoxifeno, citrato de toremifeno, hidrato de clorhidrato de fadrozol, acetato de medroxiprogesterona, bicalutamida, acetato de leuprorelina, anastrozol, y exemestano.

Los compuestos de platino se pueden ejemplificar con carboplatino, cisplatino, y nedaplatino.

Los anticuerpos anti-CD-20 se pueden ejemplificar con rituximab, ibritumomab, y ocrelizumab.

Los otros agentes anticancer se pueden ejemplificar con L-asparaginasa, acetato de octreotido, porflmero sodico, y acetato de mitoxantrona.

Los preparacion combinada que comprende una combinacion con un compuesto de la presente invention no solamente incluye las preparaciones combinadas descubiertas hasta la fecha, sino que tambien incluye preparaciones combinadas que se puedan descubrir en el futuro.

Los compuestos de la presente invencion se administran por lo general por via sistemica o por via local como un componente farmaceuticamente eficaz es una forma oral o parenteral. Las formulaciones orales se pueden ejemplificar con llquidos para administration oral (por ejemplo, elixires, jarabes, formulaciones con base de agua farmaceuticamente aceptables, suspensiones, y emulsiones) y solidos para administracion oral (por ejemplo, comprimidos (incluyendo comprimidos sublinguales y comprimidos de desintegracion por via oral), plldoras, capsulas (incluyendo capsulas duras, capsulas blandas, capsulas de gelatina, y microcapsulas), polvos, granulos, y pastillas para chupar). Las formulaciones parenterales se pueden ejemplificar con soluciones (por ejemplo, inyectables (por

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ejemplo, inyectables subcutaneos, inyectables intravenosos, inyectables intramusculares, inyectables por via intraperitoneal, y formulaciones de goteo), gotas oftalmicas (por ejemplo, gotas oftalmicas acuosas (por ejemplo, gotas oftalmicas acuosas, suspensiones de gotas oftalmicas acuosas, gotas oftalmicas viscosas, y gotas oftalmicas solubilizadas) y gotas oculares no acuosas (por ejemplo, gotas oculares no acuosas y suspensiones de gotas oftalmicas no acuosas)), agentes topicos (por ejemplo, pomadas (por ejemplo, unguentos oftalmicos)), y gotas para los oldos). Estas formulaciones pueden ser formulaciones de liberation controlada tales como formulaciones de liberation rapida y formulaciones de liberacion sostenida. Estas formulaciones se pueden producir con metodos conocidos, por ejemplo, con los metodos que se describen en la farmacopea japonesa.

Los llquidos para administration oral dentro del ambito de formulaciones orales se pueden producir, por ejemplo, por disolucion, suspension, o emulsion del componente eficaz en un diluyente de uso comun (por ejemplo, agua purificada, etanol, o una mezcla de los mismos). Estas formulaciones llquidas tambien pueden contener, por ejemplo, un agente humectante, agente de suspension, agente emulgente, edulcorante, aromatizante, fragancia, conservante y tampon.

Los solidos para administracion oral dentro del ambito de formulaciones orales se pueden preparar mezclando el componente eficaz, por ejemplo, con un vehlculo (por ejemplo, lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, y almidon), un aglutinante (por ejemplo, hidroxipropil celulosa, polivinilpirrolidona, y metasilicato aluminato de magnesio), un agente disgregante (por ejemplo, glicolato de celulosa y calcio), un lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio), un estabilizante, un adyuvante de disolucion (por ejemplo, acido glutamico y acido aspartico), y se pueden formular de acuerdo con metodos convencionales. Si fuera necesario, se puede realizar un revestimiento con un agente de revestimiento (por ejemplo, azucar, gelatina, hidroxipropil celulosa, y ftalato de hidroxipropil metil celulosa) y se pueden aplicar dos o mas capas.

Dentro del ambito de las formulaciones parenterales, un agente topico se puede producir usando un metodo conocido o una formulation de uso comun. Por ejemplo, una pomada se puede preparar mediante la incorporation o fusion del componente eficaz en una base. La base de pomada se selecciona entre bases de pomada conocidas o una base de pomada de uso comun. Por ejemplo, se puede usar una selection individual a partir de lo que sigue a continuation o una mezcla de dos o mas selecciones a partir de lo que sigue a continuation: acidos grasos superiores y esteres de acidos grasos superiores (por ejemplo, acido adlpico, acido mirlstico, acido palmltico, acido estearico, acido oleico, esteres de adipato, esteres de miristato, esteres de palmitato, esteres de estearato, y esteres de oleato), ceras (por ejemplo, cera de abejas, esperma de ballena, y ceresina), tensioactivos (por ejemplo, esteres de fosfato de polioxietilen alquil eter), alcoholes superiores (por ejemplo, cetanol, alcohol estearllico, y alcohol cetoestearllico), aceites de silicona (por ejemplo, dimetilpolisiloxano), hidrocarburos (por ejemplo, vaselina hidrofila, vaselina blanca, lanolina purificada, y parafina llquida), glicoles (por ejemplo, etilenglicol, dietilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, y macrogol), aceites vegetales (por ejemplo, aceites de ricino, aceite de oliva, aceite de sesamo, y aceite trementina), aceites animales (por ejemplo, aceite de vison, aceite de yema de huevo, escualeno, y escualeno), agua, promotores de absorcion, y agentes antiirritantes. Tambien se puede incorporar un agente humectante, conservante, estabilizante, antioxidante y fragancia.

Los agentes inyectables dentro del ambito de las formulaciones parenterales incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones as! como agentes inyectables solidos usados por disolucion o suspension en un disolvente en el momento de su uso. Por ejemplo, se puede usar un agente inyectable en el que el componente eficaz se disuelve, suspende, o emulsiona en un disolvente. Por ejemplo, para el disolvente se puede usar agua destilada para inyeccion, solution salina fisiologica, un aceite vegetal, propilenglicol, polietilenglicol, un alcohol tal como etanol, o una combination de los agentes mencionados anteriormente. El agente inyectable tambien puede contener un estabilizante, un adyuvante de disolucion (por ejemplo, acido glutamico, acido aspartico, y Polisorbato 80 (marca registrada)), un agente de suspension, un agente emulgente, un agente calmante, un tampon y un conservante. El agente inyectable se puede esterilizar en la etapa final o se puede fabricar usando procesamiento aseptico. El agente inyectable tambien se puede fabricar como una forma solida esteril, por ejemplo, un producto liofilizado, y se puede usar despues de la disolucion en agua destilada para inyeccion o en otro disolvente, que es esteril o se esteriliza antes de su uso.

La dosis cuando se usa un compuesto de la presente invention como un componente eficaz en un farmaco se puede seleccionar segun sea apropiado dependiendo, por ejemplo, de los slntomas, edad y tipo de formulacion. En el caso de una formulacion oral, preferentemente de 1 mg a 100 mg y mas preferentemente de 5 mg a 30 mg se pueden administrar de una a varias veces al dla (por ejemplo, de una a tres veces). En el caso de las gotas oftalmicas, se pueden infundir de una a varias gotas por administracion de una solucion oftalmica con una concentration preferentemente de un 0,000001 % a un 5 % (p/v) y mas preferentemente de un 0,00001 % a un 0,05 % (p/v) de una a varias veces al dla (por ejemplo, de una a ocho veces). En el caso de una pomada oftalmica, una pomada oftalmica con una concentracion preferentemente de un 0,000001 % a un 5 % (p/p) y mas preferentemente de un 0,00001 % a un 0,05 % (p/p) se puede aplicar de una a varias veces al dla (por ejemplo, de una a cuatro veces).

Por supuesto, como se ha indicado anteriormente, la dosis dependera de diversas condiciones y como resultado se produciran casos en los que sera suficiente una cantidad inferior a la de los niveles de dosificacion mencionados

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anteriormente o en los que estos intervalos se deben superar.

Ejemplos

La presente invencion se describe a continuation usando ejemplos, pero la presente invention no se limita mediante estos ejemplos.

Los disolventes que se dan entre parentesis para TLC y en las secciones de separation cromatografica indican los disolventes de elucion o los disolventes de revelado usados, y las proporciones son relaciones en volumen.

A menos que se indique especlficamente otra cosa, los datos de RMN son datos para RMN 1H.

El disolvente que se usa en la medicion se da entre parentesis en la section de RMN.

Los nombres de los compuestos que se usan en la presente Description son generalmente nombres generados basandose en las reglas de nomenclatura de la IUPAC o generados usando ACD/Name (marca registrada), un programa de ordenador de Advanced Chemistry Development, Inc., que lleva a cabo la nomenclatura basandose en las reglas de la IUPAC.

Ejemplo 1 (referencia)

N,N-dibencil-6-cloro-5-nitropirimidina-4-amina

Se anadio gota a gota dibencilamina (10,2 g) en una solution de diclorometano (30 ml) en un bano de hielo a una solution en diclorometano (70 ml) de 4,6-dicloro-5-nitropirimidina (10 g). Esto fue seguido de la adicion de trietilamina (14,4 ml) y agitation durante 1 hora. A continuacion, se anadio agua a la mezcla de reaction y la fase organica se lavo posteriormente con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico y se seco sobre sulfato sodico anhidro. El disolvente se concentro a presion reducida para obtener el compuesto del tltulo (19,2 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,50 (hexano : acetato de etilo = 7 : 1).

Ejemplo 2 (referencia)

3-{[6-(dibencilamino)-5-nitropirimidin-4-il]amino}azetidina-1-carboxilato de terc-butilo

El compuesto (10,3 g) preparado en el Ejemplo 1 y 3-aminoazetidina-1-carboxilato de terc-butilo (5,0 g) se disolvieron en dioxano (58 ml); se anadio trietilamina (8,1 ml); y a continuacion se llevo cabo una agitacion durante 5 horas a 50 °C. La mezcla de reaccion se devolvio a temperatura ambiente; a continuacion se retiro el disolvente por destilacion; se anadio agua; y se llevo a cabo una extraction con acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico y se seco posteriormente sobre sulfato sodico anhidro y a continuacion se retiro el disolvente por destilacion. El residuo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice para obtener el compuesto del tltulo (10,8 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,40 (hexano : acetato de etilo = 4 : 1).

Ejemplo 3 (referencia)

3-{[5-amino-6-(dibencilamino)pirimidin-4-il]amino}azetidina-1-carboxilato de terc-butilo

Una solucion de acetato de etilo (360 ml) del compuesto (17,5 g) preparado en el Ejemplo 2 se anadio gota a gota a una mezcla de cinc (23,3 g) y una solucion acuosa 3,0 M de cloruro de amonio (11,4 g) en un bano de hielo y la temperatura se aumento inmediatamente a la temperatura ambiente. Despues de agitar durante 2 horas, la mezcla de reaccion se filtro sobre Celite (nombre comercial) y a continuacion se retiro el disolvente por destilacion. El residuo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice para obtener el compuesto del tltulo (12,4 g) que tenia los valores de propiedades fisicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,69 (hexano : acetato de etilo = 1 : 1).

Ejemplo 4 (referencia)

3-[6-(dibencilamino)-8-oxo-7,8-dihidro-9H-purin-9-il]azetidina-1-carboxilato de terc-butilo

El compuesto (8,4 g) preparado en el Ejemplo 3 y 1,1'-carbonildiimidazol (5,9 g) se disolvieron en tetrahidrofurano (120 ml) seguido de agitacion durante 15 horas a 60 °C. Despues de que el disolvente se hubiera destilado de la mezcla de reaccion, se anadio agua y se llevo a cabo una extraccion con acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de cloruro sodico y se seco sobre sulfato sodico anhidro y a continuacion se retiro el disolvente por destilacion. El residuo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice para obtener el compuesto del tltulo (7,8 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,28 (hexano : acetato de etilo = 2 : 1).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo 5 (referencia)

3-(6-amino-8-oxo-7,8-dihidro-9H-purin-9-il)azetidina-1-carboxilato de terc-butilo

El compuesto (7,8 g) preparado en el Ejemplo 4 se disolvio en metanol (240 ml) y acetato de etilo (50 ml); se anadio catalizador de Pearlman al 20 % (Pd(oH)2/C) (8,0 g, 100 % en peso); se llevo a cabo un reemplazo con hidrogeno; y se llevo a cabo una agitacion durante 7,5 horas a 60 °C. La mezcla de reaccion se filtro sobre Celite (nombre comercial) y el disolvente se retiro por destilacion para obtener el compuesto del tltulo (5,0 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,50 (acetato de etilo).

Ejemplo 6 (referencia)

3- [6-amino-8-oxo-7-(4-fenoxifenil)-7,8-dihidro-9H-purin-9-il]azetidina-1-carboxilato de terc-butilo

Se anadieron acido p-fenoxifenilborico (2,1 g), acetato de cobre(II) (1,48 g), tamiz molecular de 4A (2,5 g), y piridina (0,82 ml) a temperatura ambiente a una suspension en diclorometano (200 ml) del compuesto (2,5 g) preparado en el Ejemplo 5, seguido de agitacion durante 21 horas. La solucion de reaccion se filtro sobre Celite (nombre comercial) y el residuo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice para obtener el compuesto del tltulo (1,3 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,18 (hexano : acetato de etilo = 1 : 1).

Ejemplo 7 (referencia)

Diclorhidrato de 6-amino-9-azetidin-3-il-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona

Se anadio acido clorhldrico/dioxano 4 N (13 ml) a temperatura ambiente a una suspension en metanol (13 ml) del compuesto (1,3 g, 2,76 mmol, 1,0 equivalente) preparado en el Ejemplo 6 y se llevo a cabo una agitacion durante 1 hora. A continuacion se retiro el disolvente por destilacion para obtener el compuesto del tltulo (1,5 g) que tenia los valores de propiedades fisicas indicados a continuacion. TLC: Rf 0,50 (diclorometano : metanol : amoniaco acuoso al 28 % = 9 : 1 : 0,1).

Ejemplo 9 (referencia)

(3R)-3-{[6-(dibencilamino)-5-nitropirimidin-4-il]amino}piperidina-1-carboxilato de terc-butilo

El compuesto del tltulo (1,44 g) que tenia los valores de propiedades flsicas que se dan a continuacion se obtuvo siguiendo la misma plantilla de proceso que en el Ejemplo 2 usando el compuesto (1,5 g) producido en el Ejemplo 1 y usando (3R)-3-aminopiperidina-1-carboxilato de terc-butilo (0,85 g) en lugar de 3-aminoazetidina-1-carboxilato de terc-butilo. TLC: Rf 0,23 (hexano : acetato de etilo = 9 : 1).

Ejemplo 10 (referencia)

Diclorhidrato de 6-amino-7-(4-fenoxifenil)-9-[(3R)-piperidin-3-il]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona

El compuesto del tltulo (155 mg) que tenia los valores de propiedades fisicas que se dan a continuacion se obtuvo siguiendo la misma plantilla de proceso que en el Ejemplo 3 ^ Ejemplo 4 ^ Ejemplo 5 ^ Ejemplo 6 ^ Ejemplo 7, usando el compuesto producido en el Ejemplo 9 y usando acido p-fenoxifenilborico (154 mg). TLC: Rf 0,68 (metanol : diclorometano : amoniaco acuoso = 80 : 20 : 4).

Ejemplo 17 (referencia)

4- ({[6-(dibencilamino)-5-nitropirimidin-4-il]amino}metil)piperidina-1-carboxilato de terc-butilo

El compuesto del tltulo (68,3 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion se obtuvo siguiendo la misma plantilla de proceso que en el Ejemplo 2, usando el compuesto (45,5 g) producido en el Ejemplo 1 y usando 4-(aminometil)piperidina-1-carboxilato de terc-butilo (27,5 g) en lugar de 3-aminoazetidina-1-carboxilato de terc-butilo. TlC: Rf 0,56 (hexano : acetato de etilo = 2 : 1).

Ejemplo 18 (referencia)

Diclorhidrato de 6-amino-7-(4-fenoxifenil)-9-(piperidin-4-ilmetil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona

El compuesto del tltulo (1,66 g) que tenia los valores de propiedades flsicas indicados a continuacion se obtuvo siguiendo la misma plantilla de proceso que en el Ejemplo 10, usando el compuesto producido en el Ejemplo 17 y usando acido p-fenoxifenilborico (19 g). tLC: Rf 0,10 (acetato de etilo : metanol : trietilamina = 18 : 2 : 1).

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 19 (referencia)

6-amino-9-{[1-(2-butinoil)-4-piperidinil]metil}-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona

imagen8

Se anadieron acido 2-butinoico (34 mg), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (78 mg), 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) (62 mg), y trietilamina (114 pl) a una solucion en dimetilformamida (3 ml) del compuesto (100 mg) preparado en el Ejemplo 18, seguido de agitacion durante 3 horas a temperatura ambiente. Se anadio agua a la mezcla de reaccion y se llevo a cabo una extraccion con acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato sodico y con a una solucion acuosa saturada de cloruro sodico y a continuacion se seco sobre sulfato sodico anhidro y el disolvente se retiro por destilacion. El residuo se purifico por cromatografla en capa fina (diclorometano : metanol : amonlaco acuoso al 28 % = 90 : 10 : 1) para obtener el compuesto del tltulo (75 mg) que tenia los valores de propiedades flsicas que se indican a continuacion.

TLC: Rf 0,43 (acetato de etilo : metanol = 19 : 1); RMN 1H (CDCla) : 5 1,21-1,45, 1,71-1,83, 1,99, 2,18-2,36, 2,592,72, 2,99-3,94, 4,34-4,61, 7,05-7,24, 7,36-7,43, 8,24.

Ejemplo 19(2)

El compuesto a modo de ejemplo que se da a continuacion se obtuvo siguiendo la misma plantilla de proceso que en el Ejemplo 9 ^ Ejemplo 10 ^ Ejemplo 19, usando el compuesto preparado en el Ejemplo 1, usando el correspondiente derivado de amina de (3R)-3-aminopiperidina-1-carboxilato de terc-butilo, y usando acido p- fenoxifenilborico.

Ejemplo 19(2)

6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona

imagen9

TLC: Rf 0,68 (acetato de etilo : metanol = 9: 1);

RMN 1H (CDCla): 5 1,94-2,03, 2,23-2,39, 2,80-3,01, 3,50-3,63, 3,67-3,80, 3,86-4,02, 4,03-4,18, 4,23-4,33, 4,42-4,51, 5,11-5,25, 7,04-7,23, 7,34-7,45, 8,20-8,23.

[Ejemplos experimentales farmacologicos] Ejemplo Biologico 1

Medicion (ensayos in vitro) de la actividad inhibidora de Btk y la selectividad para Btk

La actividad inhibidora de la enzima Btk se midio, basandose en el protocolo proporcionado por el fabricante, usando Btk (Invitrogen Corporation) y el Ensayo de Quinasa Z'-LYTE™ de peptido Kit-Tyr1 (Invitrogen Corporation), que contenla los siguientes reactivos: peptido Tyr-1, fosfopeptido Thy-1, tampon de quinasa 5x, ATP, reactivo revelado B, tampon revelado, y reactivo de parada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se dispensaron 5 pl/pocillo de una solucion del compuesto de ensayo diluida con dimetilsulfoxido (DMSO), o DMSO, y 10 pl/pocillo de la solucion de mezcla de sustrato/enzima a una placa de ensayo de 96 pocillos y se llevo a cabo una reaccion durante 20 minutos a 30 °C. La solucion de mezcla de sustrato/enzima se preparo por dilucion con el tampon de quinasa (DL-ditiotreitol (DTT, 2,7 mM), tampon de quinasa 1,33x) para proporcionar una concentracion final para el peptido Tyr-1 de 4 pM y una concentracion final de Btk de 5 nM. A continuacion se anadieron 5 pl/pocillo del trifosfato de adenosina (ATP, concentracion final = 36 pM) y se llevo a cabo la reaccion durante 1 hora a 30 °C. Despues de la finalizacion de la reaccion, se anadieron 10 pl de una solucion de revelado, proporcionada por dilucion del reactivo de revelado B hasta 128x usando tampon de revelado, y se llevo a cabo una reaccion durante un perlodo adicional de 1 hora a 30 °C. La reaccion enzimatica se detuvo a continuacion por adicion de 10 pl de la solucion de parada. Se midio la intensidad de fluorescencia a 445 nm y 520 nm en cada pocillo usando un lector de fluorescencia en placa Fusion Universal Microplate Analyzer (PerkinElmer Inc.). Se determino el porcentaje de fosforilacion usando la proporcion de la emision a 445 nm (emision de cumarina) con respecto a la emision a 520 nm (emision de fluorescelna) de acuerdo con el protocolo proporcionado con el kit.

Se calculo el porcentaje de inhibicion (%) por parte del compuesto de ensayo usando la siguiente ecuacion.

[E1]

porcentaje de inhibicion (%) de fosforilacion = 1 - { (Ac - Ax)/(Ac - Ab) } x 100

Ax : % de fosforilacion cuando se anadio el compuesto de ensayo Ab : % de fosforilacion en ausencia de adicion de ATP (blanco)

Ac : % de fosforilacion cuando se anadio solo DMSO (control)

El valor del 50 % de inhibicion (valor de CI50) para el compuesto de ensayo se determino a partir de la curva de inhibicion basada en el % de inhibicion para cada concentracion del compuesto de ensayo.

Se midio la actividad inhibidora para otras quinasas (por ejemplo, Lck, Fyn, y LynA (todas de Invitrogen Corporation) de la misma forma que se ha descrito anteriormente usando la quinasa particular en lugar de la Btk.

De acuerdo con los resultados, los valores de CI50 para los compuestos de la presente invention fueron, por ejemplo, 0,007 pM para el compuesto del Ejemplo 19(2).

Ademas, se calculo la actividad inhibidora selectiva de Btk de los compuestos de la presente invencion para otras quinasas, y particularmente para Lck, Fyn, y LynA, como la proporcion de los valores de CI50 de las quinasas individuales y se da en la siguiente Tabla 1.

[Tabla 1]

Numero de ejemplo

Lck[CI50]/ Btk[CI50] Fyn[CI50]/ Btk[CI50] LynA[CI50]/ Btk[CI50]

19 (2)

114 762 471

Estos resultados muestran que los compuestos de la presente invencion no solo tienen actividad inhibidora de Btk, sino que tambien tienen una actividad inhibidora selectiva de Btk con respecto a otras quinasas.

Ejemplo Biologico 2

Medida de la activation de linfocitos B o la activation de linfocitos T usando PBMC humanas

Se dispenso una solucion 10 mmol/l del compuesto de ensayo en DMSO en una placa de 96 pocillos (Nunc) y se preparo una dilucion en serie 5x usando DMSO. Se preparo una solucion de dilucion del compuesto de ensayo a concentracion 100x por dilucion adicional 10x con medio RPMI1640 (que contenla HI-FBS al 10 %, penicilina al 1 %). Se diluyeron celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) con el medio para proporcionar una densidad de 2 x 106 celulas/ml. Se anadieron 396 pl de la suspension de celulas a una placa de 96 pocillos en la que ya se hablan introducido 4 pl de la solucion de dilucion del compuesto de ensayo a concentracion 100x o el disolvente (DMSO al 10 %) y se llevo a cabo una incubation durante 10 minutos a 37 °C y 5 % de CO2. Se anadieron 10 pl de una solucion de anticuerpo anti-IgM (Southern Biotech)/IL-4 (R & D Systems) o una suspension de perlas de anticuerpo anti-CD3/CD28 (Invitrogen Corporation) a una placa de 96 pocillos y tambien se anadieron 90 pl de la suspension de celulas preparada como se ha descrito anteriormente (concentraciones finales: anticuerpo anti-IgM = 1 pg/ml, IL-4 = 3 ng/ml, y perlas de anticuerpo anti-CD3/CD28 = 2 x 106 perlas/ml). Se anadieron 10 pl del medio a pocillos de muestra sin estimular en lugar de estas sustancias estimulantes, y se llevo a cabo una incubacion a 37 °C y 5 % de CO2 de nuevo. La incubacion se llevo a cabo durante 16 horas en el caso de la evaluation de la activacion de linfocitos T y durante 22 horas en el caso de la evaluation de la activacion de linfocitos B. Se anadieron 100 pl de Tampon Cytofix (BD Biosciences); se llevo a cabo una incubacion durante 15 minutos a 37 °C; se llevo a cabo una centrifugation durante 10 minutos a 1500 rpm; y se retiro el sobrenadante. Se anadieron 200 pl de tampon Perm II (BD Biosciences) a -20 °C; se llevo a cabo una incubacion durante 30 minutos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

en hielo; se llevo a cabo una centrifugacion durante 10 minutos a 1500 rpm; y se retiro el sobrenadante. Se anadieron 0,5 ml de tampon de Tincion (BD Biosciences) y se llevo a cabo una centrifugacion durante 10 minutos a 1500 rpm. Se anadieron 100 gl de una solucion mixta de anticuerpo y se llevo a cabo una incubacion durante 30 minutos en hielo en oscuridad. El anticuerpo fue la dilucion 10x con Tampon de Tincion de la mezcla 1 : 1 : 1 de anticuerpo anti-CD3 marcado con PerCP (BD Biosciences), anticuerpo anti-CD20 marcado con AF488 (BD Biosciences), y anticuerpo anti-CD69 marcado con PE (BD Biosciences). Se anadieron 0,4 ml de Tampon de Tincion y se retiro el sobrenadante. Se anadieron 0,3 ml de Tampon de Tincion y el sedimento de celulas se suspendio para preparar una muestra para medicion de FACS. El analisis de FACs uso un equipo BD FACS-Calibur (BD Biosciences) y un software de analisis de datos CELLQuest version 3.3 (BD Biosciences). Se midio la senal CD69- positivo (intensidad de fluorescencia promedio) de las celulas CD20-positivo CD3-negativo (linfocitos B) o las celulas CD3-positivo CD20-negativo (linfocitos T). Despues de restar el valor para la muestra sin estimular, se determino el % de inhibicion por referencia al valor para la muestra de control estimulada. El % de inhibicion se represento graficamente usando Prism (ver. 5.01J, GraphPad Software) y se determino el valor de CI50.

De acuerdo con los resultados, los valores de CI50 de compuestos de la presente invencion para la senal CD69- positivo para linfocitos B fueron, por ejemplo, 0,061 gM para el compuesto del Ejemplo 19(2). Por otro lado, los valores de CI50 de compuestos de la presente invencion para la senal CD69-positivo para linfocitos T fueron > 10 gM para el compuesto precedente. Por lo tanto, los compuestos de la presente invencion mostraron tener una accion inhibidora selectiva sobre la activacion de linfocitos B.

Ejemplo Biologico 3

Evaluacion de la estabilidad en microsomas hepaticos de rata y humanos

(1) Preparacion de la solucion de compuesto de ensayo

Se preparo una solucion 0,25 mmol/l por dilucion del compuesto de ensayo (solucion 10 mmol/l en DMSO, 5 gl) con una solucion acuosa al 50 % de acetonitrilo (195 gl).

(2) Preparacion de la muestra la reaccion del minuto 0

Se anadieron 245 gl de un tampon fosfato 0,1 mol/l (pH 7,4) que contenla 0,5 mg/ml de microsomas de rata y humanos (XenoTe-ch) y cofactor de NADPH (BD Biosciences) a un reactor que se habla calentado previamente a 37 °C; se llevo a cabo una incubacion previa durante 5 minutos; y se anadio la solucion del compuesto de ensayo indicada anteriormente (5 gl) y se inicio la reaccion. Se recogieron 20 gl inmediatamente despues del comienzo y la reaccion se detuvo mediante la adicion de 180 gl de acetonitrilo que contenla un estandar interno (warfarina). Se agitaron 20 gl de esta solucion con 180 gl de una solucion acuosa al 50 % de acetonitrilo sobre una placa de filtro para la deplecion de protelnas seguido de filtracion por succion, y el filtrado se uso como la muestra estandar.

(3) Preparacion de la muestra de reaccion del minuto 15

La solucion de reaccion indicada anteriormente se incubo durante 15 minutos a 37 °C, y a continuacion se anadieron 20 gl a 180 gl de acetonitrilo frlo (que contenla el estandar interno de warfarina) para detener la reaccion. Se agitaron 20 gl de esto con 180 gl de una solucion acusa al 50 % de acetonitrilo sobre una placa de filtro para la deplecion de protelnas seguido de filtracion por succion, y el filtrado se uso como la muestra estandar.

(4) Metodo de evaluacion y resultados

Se calculo la proporcion residual (%) por inyeccion de 1 gl de la solucion demuestra en un equipo de LC-MS/MS; division de la proporcion de area de pico para la muestra de reaccion (area de pico para el compuesto de ensayo/area de pico para el estandar interno) por la proporcion de area de pico para la muestra estandar; y multiplicacion del valor resultante por 100.

Se usaron los siguientes compuestos como compuestos de ensayo: compuestos de la presente invencion y 1-{(3R)- 3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-piperidinil}-2-propen-1-ona (compuesto comparativo A) y 1-{3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-pirrolidinil}-2-propin-1-ona (compuesto comparativo B), que son compuestos a modo de ejemplo descritos en el Documento de Patente 1 que tienen un esqueleto de pirazolopirimidina. La proporcion residual (%) de los compuestos de ensayo en los microsomas hepaticos de rata y humanos fue la que se muestra en la siguiente Tabla 2.

[Tabla 2]

Compuesto

Proporcion residual (%) en el microsoma hepatico de rata Proporcion residual (%) en el microsoma hepatico humano

Compuesto comparativo

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

A

Compuesto comparativo B

50,6 55,9

Ejemplo 19(2)

86,4 100

Los resultados muestran que los compuestos de la presente invention son mucho mas estables en microsomas hepaticos de rata y humanos que los compuestos comparativos.

Ejemplo Biologico 4

Medicion de la actividad inhibidora en enzimas metabolizadoras de farmacos (action inhibidora en CYP2C8 humana y CYP2C19 humana)

[Metodo experimental]

La reaction se llevo a cabo en una placa de 96 pocillos. Las sustancias de control positivo (CYP2C8: ketoconazol, CYP2C19: tranilcipromina) se ajustaron (CYP2C8: 0,6 y 6 mmol/l, CYP2C19: 0,9 y 9 mmol/l) con DMSO a concentraciones que fueron 300 veces la concentration final, y se prepararon soluciones (CYP2C8: 8 y 80 pmol/l, CYP2C19: 12 y 120 pmol/l) por dilution 75x con agua purificada que contenla un 2,7 % de acetonitrilo. Los compuestos de ensayo se ajustaron a 0,3 y 3 mol/l con DMSO y se ajustaron a 4 y 40 pmol/l por dilucion 75x con agua purificada que contenla un 2,7 % de acetonitrilo. A continuation se preparo una mezcla de reaccion (los valores numericos son las concentraciones finales) mediante la adicion de tampon fosfato potasico (pH 7,4), cloruro de magnesio (5 mol/l), sustrato (CYP2C8: dibencilfluorescelna 1 pmol/l, CYP2C19: 3-ciano-7-etoxicumarina 25 pmol/l), y CYP2C8 (Cypex, 10 pmol/l) y CYP2C19 (Cypex, 3 pmol/l) de microsoma hepatico expresadas en E. coli. Se dispensaron en cada pocillo 100 pl de esta mezcla de reaccion y 50 pl del compuesto de ensayo preparados como se ha descrito anteriormente y la solution de control positivo preparada como se ha descrito anteriormente y se llevo a cabo una incubation previa durante 10 minutos a 37 °C. La reaccion se inicio mediante la adicion de 50 pl de solucion de NADPH (concentracion final = 1 mmol/l) y se llevo a cabo una incubacion durante 30 minutos a 37 °C. Se midio la intensidad de fluorescencia (CYP2C8: longitud de onda de excitation = 485 nm, longitud de onda de fluorescencia = 538 nm; CYP2C19: longitud de onda de excitacion = 409 nm, longitud de onda de fluorescencia = 460 nm) inmediatamente despues de la adicion de NADPH y despues de incubacion durante 30 minutos. Se tomo el % como el % de declination (% de inhibicion) en la intensidad de fluorescencia en comparacion con un control en el que se anadio DMSO en lugar de la solucion de compuesto de ensayo y se llevo a cabo la reaccion y se calculo usando la siguiente formula.

Inhibi cion (%) = 100 - { (intensidad de fluorescencia despues de la reaccion del compuesto de ensayo - intensidad de fluorescencia antes de la reaccion del compuesto de ensayo)/(intensidad de fluorescencia despues de la reaccion del control - intensidad de fluorescencia antes de la reaccion de control) x 100}

Se tomo el valor de CI50 para que fuera < 1 pM cuando el % de inhibition a 1 pmol/l fue al menos un 50 %; se tomo para que fuera > 10 pmol/l cuando el % de inhibicion a 10 pmol/l fue no mas de un 50 %; y los valores intermedios a los precedentes (no mas de un 50 % a 1 pmol/l y al menos un 50 % a 10 pmol/l) se calcularon usando la siguiente formula

CI50 = (50 - b)/a

en la que a y b son la pendiente y la ordenada en el origen de la recta de regresion lineal y = ax + b que pasa a traves de los dos puntos siguientes: la concentracion de 1 pmol/l, % de inhibicion y la concentracion de 10 pmol/l, % de inhibicion.

Los valores de CI50 de los compuestos comparativos y los compuestos de la presente invencion se midieron usando el metodo de medicion descrita anteriormente.

Los resultados son los que siguen a continuacion: para el compuesto comparativo A y el compuesto comparativo B, los valores de CI50 para CYP2C8 fueron 4,7 pM y 6,9 pM, respectivamente, y los valores de CI50 para CYP2C19 fueron 5,6 pM y 8,1 pM, respectivamente. Por otro lado, los compuestos de la presente invencion, por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 19(2), tuvieron valores de CI50 para CYP2C8 y CYP2C19 de > 10 pM. Por lo tanto, los compuestos de la presente invencion mostraron tener una menor actividad inhibidora de CYP que los compuestos comparativos.

Ejemplo Biologico 5

Medicion de la citotoxicidad y la capacidad de reducir el potencial de membrana mitocondrial en celulas cultivadas de hepatoma humano

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se conoce que el tejido que mantiene un equilibrio aerobico, por ejemplo, de rinones y corazon, y el tejido que se expone a altas concentraciones del farmaco y lleva a cabo el metabolismo del farmaco, por ejemplo, el hepatico, es sensible a disfuncion mitocondrial (Drug Discovery Today, 12 (17-18), 777-785, 2007). La reduccion o extincion del potencial de membrana mitocondrial mediante un farmaco esta causada por la inhibition directa del sistema de transporte de electrones, desacoplamiento del transporte de electrones de la ATP sintasa, o la apertura de un poro de transition de permeabilidad de membrana mitocondrial. Como consecuencia, la medicion del potencial de membrana mitocondrial de celulas hepaticas puede proporcionar un parametro para la hepatotoxicidad.

Se sembraron celulas hepaticas humanas en una placa de 96 pocillos revestida con colageno con una densidad celular de 30.000 celulas/pocillo y se llevo a cabo una incubation durante una noche en una incubadora a 37 °C en 5 % de CO2-95 % de aire. Las celulas cultivadas se tineron durante 1 hora con yoduro de 5,5',6,6'-tetrahidro- 1,1',3,3'-tetrametil-benzamidazolocarbocianina (JC-1) seguido de tratamiento con el compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo se disolvio en DMSO y a continuation se diluyo con el medio de cultivo llquido Hepatocyte Culture Medium (HCM) y se anadio a las celulas. Las concentraciones de tratamiento del compuesto de ensayo fueron 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, y 400 pmol/l. Despues de la exposition al compuesto de ensayo durante 24 horas, se llevo a cabo una medicion con un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices, LLC) a una longitud de onda de excitation de 485 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 538 nm y una longitud de onda de excitation de 544 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 590 nm. El potencial de membrana se determino mediante la proportion entre el valor de medicion de 544 nm/590 nm y el valor de medicion de 485 nm/538 nm. Despues de esto, se midio la concentration de ATP en las celulas usando un kit de ensayo luminescente Celltiter Glo (Promega Corporation) con el fin de evaluar la toxicidad celular en el compuesto de ensayo. Las celulas se lisaron mediante el tampon de ensayo proporcionado con el kit de medicion y se midio la concentracion del ATP liberado por las celulas usando como Indice la actividad enzimatica de luciferina-luciferasa. La emision se midio usando un lector de placas SpectraMax. La capacidad del compuesto de ensayo para disminuir el potencial de membrana mitocondrial y la citotoxicidad del compuesto de ensayo se representaron mediante la concentracion (valor de CI50) que causo un 50 % de disminucion en el potencial de membrana mitocondrial y la concentracion de ATP, respectivamente. La capacidad para disminuir el potencial de membrana mitocondrial de los compuestos de ensayo y la citotoxicidad de los compuestos de ensayos se dan en la siguiente Tabla 3.

[Tabla 31

Compuesto

Capacidad para disminuir el potencial de membrana mitocondrial (CI50 (mM)) Toxicidad para celulas hepaticas humanas (CI50 (mM))

Compuesto comparativo A

39 78

Compuesto comparativo B

< 6,25 < 6,25

Ejemplo 19(2)

200 135

Los resultados mostraron que ambos valores de CI50 fueron inferiores para el compuesto de la presente invention que para los compuestos comparativos.

[Ejemplos de formulation]

Ejemplo de Formulation 1

Los componentes indicados a continuacion se mezclaron mediante un metodo convencional y a continuacion se conformaron en comprimidos para obtener 10.000 comprimidos que contenlan 10 mg de cada componente activo en cada comprimido.

■ 6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona 100 g

■ carboximetilcelulosa de calcio (disgregante) 20 g

■ estearato de magnesio (lubricante) 10 g

■ celulosa microcristalina 870 g

Aplicabilidad industrial

Los compuestos de la presente invencion son compuestos que, ademas de tener actividad inhibidora selectiva de Btk, exhiben una excelente estabilidad metabolica y pueden evitar hepatotoxicidad, y en consecuencia son utiles como agentes terapeuticos muy seguros para enfermedades en las que participan linfocitos B o mastocitos.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. 6-Amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, o una sal de la misma.

   5 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 que es 6-amino-9-[(3R)-1-(2-butinoil)-3-pirrolidinil]-7-(4-

   fenoxifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona.