RS55184B1 - Derivat purinona kao inhibitor btk kinaze - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

(0001] Predmetni pronalazak se odnosi na 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoil)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purm-8-on i njegove soli (skraćeno ispod kao "jedinjenja predmetnog pronalaska").

STANJE TEHNIKE

[0002] Bruton tirozin kinaza (skraćeno ispod kao "Btk") pripada Tec familiji kinaza, koje su nereceptorne tirozin kinaze, i selektivno je eksprimirana u B ćelijama i mijelocitnim linijama. Btk ima značajnu ulogu u signalnoj transdukciji u B ćelijama i faktor je koji doprinosi preživljavanju, diferencijaciji, proliferaciji, i aktivaciji B ćelija. Signalizacija u B ćelijama putem receptora antigena B-ćelija (BCR) indukuje širok opseg bioloških odgovora, i abnormalna signalna transdukcija ovde uzrokuje abnormalnu aktivaciju B ćelija i formiranje patogenih autoantitela. Veruje se da Btk formira vezu u putevima BCR-posredovane signalne transdukcije u B ćelijama. Prema tome, zna se da X-vezanu agamaglobulinemiju uzrokuje defekt u humanom Btk genu što rezultuje indukcijom abnormalne B ćelijske diferencijacije i drastičan pad u proizvodnji imunoglobulina (pogledati Ne-patentni Dokument 1). Simptomi ove bolesti obuhvataju znatno smanjenje u B ćelijama u perifernoj krvi i povećanu osteljivost na bakterijske infekcije. Poznato je takođe da Btk učestvuje u aktivaciji mastocita i u fiziološkim funkcijama trombocita. Zbog toga, jedinjenja koja imaju Btk inhibitornu aktivnost su efikasna u lečenju bolesti u kojima B ćelije ili mastociti učestvuju, na primer. alergijske bolesti, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti, tromboembolijske bolesti, i kanceri (videti Ne-patentni Dokument 2).

[0003] Sledeća jedinjenja su poznata kao stanje tehnike za jedinjenja predmetnog pronalaska.

[0004] Jedinjenja predstavljena opštom formulom (A) su poznata kao jedinjenja koja imaju Btk inhibitornu aktivnost. (u formuli, La<A>predstavlja CH2, O, NH, ili S; Ar<A>predstavlja supstituisani ili nesupstituisani aril ili supstituisani ili nesupstituisani heteroaril; Y<A>predstavlja bilo koji supstituent odabran od alkil, heteroalkil, cikloalkil. heterocikloalkil, aril, i heteroaril; Z<A>predstavlja CO, OCO, NHCO, ili CS;R7'Ai R<8>"<A>svaki nezavisno predstavlja II, nesupstituisani C1-C4alkil, supstituisani C1-C4alkil. nesupstituisani C1-C4heteroalkil, supstituisani C1-C4heteroalkil, nesupstituisani CVC& cikloalkil, supstituisani C3-C6cikloalkil, nesupstituisani C2-C6heterocikloalkil. i supstituisani C2-C6 heterocikloalkil; ili R<7>"<A>i R<8>"<A>zajedno formiraju vezu; i R<6>"<A>predstavlja H, supstituisani ili nesupstituisani C1-C4alkil, supstituisani ili nesupstituisani C1-C4heteroalkil, O-G, alkoksialkil, Ci-Ckalkilaminoalkil, supstituisani ili nesupstituisani Ci-Cr, cikloalkil. ili supstituisani ili nesupstituisani aril (definicije ovih grupa su navedene)) (videti Patentne Dokumente 1, 2, i 3).

[0005] S druge strane, na primer, jedinjenja predstavljena pomoću opšte formule (B)

(u formuli,Q1<B>i Q<2B>su nezavisno odabrani od CX<IB>, CX<2B>. i azot; Q<3B>predstavlja N ili CH;X1Bi X<2B>su nezavisno odabrani iz grupe koja obuhvata vodonik, (Ci-Cf,) alkil. cijano, halogen, i tako dalje; R<IB>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonik i (Ci-Cg) alkil; yB predstavlja 0 ili ceo broj od 1 to 3; R<2B>i R<JB>su nezavisno odabrani od vodonik i (Ci-C&) alkil; R4B je odabran iz grupe koja se sastoji od alkil, heterociklil. aril, heteroaril, i tako dalje; i R<5B>je odabran iz grupe koja se sastoji od alkil, heterociklil, i supstituisani heterociklil

(definicije ovih grupa su navedene)) (videti Patentni Dokument 4) su poznata kao jedinjenja koja imaju purinon skelet.

[0006] Jedinjenja koja su predstavljena pomoću opšte formule (C) su takođe poznata

(u formuli, X<c>je odabran iz grupe koja se sastoji od azot i CR<8t>; R<8C>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonik, halogen, supstituisani ili nesupstituisani alkil, i tako dalje; Q<1C>je odabran iz grupe koja se sastoji od O, S, i tako dalje; Z<c>je odabran iz grupe koja se sastoji od kiseonik, sumpor, and NY<5C>;Y* cje odabran iz grupe koja se sastoji od vodonik, supstituisani ili nesupstituisani alkil, i tako dalje;Q<2C>, Q<3C>, i Q<4t>su nezavisno odabrani od od grupe koja se sastoji od vodonik, supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, i tako dalje; R<2C>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonik i supstituisani ili nesupstituisani alkil; i nC predstavlja 0, 1.2, 3, ili 4 (definicije ovih grupa su navedene)) (videti Patentni Dokument 5).

[0007] Jedinjenja koja imaju purinon skelet su takode stavljena na uvid javnosti kao formula 20 (videti paragraf broj 0028) u Patentnom Dokumentu 6.

[0008] Jedinjenja predstavljena pomoću opšte formule (D) su takode poznata

(u formuli, R<1D>predstavlja grupu koja jc odabrana od vodonik, supstituisani ili nesupstituisani alkil, i tako dalje; R<2D>predstavlja supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani alkenil, ili supstituisani ili nesupstituisani alkinil; Y<D>predstavlja grupu odabranu od 0, C-NO2, i S; Z<D>predstavlja grupu odabranu od

i tako dalje; ovde,A<Đ>,DD, E<D>, i M<D>svaki nezavisno predstav<l>jaCR12<D>, N, i N-oksid; R,<2D>predstavlja grupu odabranu od vodonik, halogen, amino, hidroksi, i cijano; X<D>predstavlja grupu odabranu od O, C-NO2, i S; R<6D>predstavlja grupu odabranu od supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, i supstituisani ili nesupstituisani aril; oznaka aD predstavljena pomoću isprekidane linije predstavlja jednostruku ili dvostruku vezu; i nD predstavlja ceo broj odabran od 0, 1, i 2)

(videti Patentni Dokument 7).

[0009]Jedinjenja predmetnog pronalaska su jedinjenja koja, kao dodatak Btk-selektivnoj inhibitornoj aktivnosti, pokazuju odličnu metaboličku aktivnost i mogu izbeći CYP inhibitornu aktivnost i štetne reakcije kao što je, na primer, hepatotoksičnost; međutim, nema iskaza ili sugestija koje se odnose na one karakteristične osobine u bilo kom od dokumenata stanja tehnike.

[0010]

Patentni Dokument 1: Japanski prevod PCT prijave br. 2010-504324

Patentni Dokument 2: WO 2008/121742

Patentni Dokument 3: WO 2010/009342

Patentni Dokument 4: WO 2008/060301

Patentni Dokument 5: WO 2007/142755

Patentni Dokument 6: Japanski prevod PCT prijave br. 2003-509427

Patentni Dokument 7: WO 2003/037890

[0011]

Ne-patentni Dokument 1: Nature, Volume 361, pp. 226-233. 1993

Ne-patentni Dokument 2: Anticancer Agents in Medicinal Chemistrv, Volume 7, Number 6, pp. 624-632, 2007

STAVLJANJE PRONALASKA NA UVID JAVNOSTI

[0012]Da bi se obezbedio veoma siguran terapijski agens za bolesti u kojima učestvuju B ćelije i/ili mastociti, cilj predmetnog pronalaska je da se razvije jedinjenje koje, kao dodatak Btk-selektivnoj inhibitornoj aktivnosti, pokazuje i odličnu metaboličku aktivnost i može da izbegne hepatotoksičnost.

[0013]Da bi se postigao gornji cilj, predmetni pronalazači su izveli intenzivna istraživanja koja su usmerena ka otkrivanju jedinjenja koja imaju Btk-selektivnu inhibitornu aktivnost i otkrili su jedinjenja predmetnog pronalaska kao rezultat. Pored toga. takode je otkriveno da ova jedinjenja su jedinjenja koja pokazuju odličnu metaboličku aktivnost i mogu izbeći hepatotoksičnost, i predmetni pronalazak je ostvaren kao rezultat.

[0014]Ovde, predmetni pronalazak se odnosi na

[1] 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoil)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7.9-dihidro-8H-purin-8-on, ili njegovu so; i

[2] 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoil)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on.

[0015]Jedinjenja predmetnog pronalaska, kao dodatak tome što imaju Btk-selektivnu inhibitornu aktivnost, pokazuju odličnu metaboličku stabilnost i mogu izbeći hepatotoksičnost, i kao posledica su korisni kao veoma sigurni terapijski agensi za bolesti u kojima B ćelije i/ili mastociti učestvuju, kao Što je ne-Hočkin limfom.

NAJBOLJI NAČIN ZA OSTVARENJE PRONALASKA

[0016]Predmetni pronalazak je opisan detaljno ispod.

[0017]U predmetnom pronalasku, "posedovanje Btk-selektivne inhibitorne aktivnosti" označava posedovanje Btk-selektivne inhibitorne aktivnosti u odnosu na ne-Btk tirozin kinaze i naročito limfocit-specifične protein tirozin kinaze (Lck), protein-tirozin kinazu fyn (Fyn), i izoformu A homologa v-yes-l Yamaguchi sarkom virus-vezanog onkogena (LynA). Ova osobina omogućava da se izbegnu nepredvidljive neželjene reakcije uzrokovane inhibicijom drugih tirozin kinaza. Na primer, pojava retinalnih abnormalnosti je poznata kao Lck-deficijentni miševi (Oncogene, Volume 16, pp. 2351-2356. 1998), povećava mogućnost da će neželjene reakcije biti uzrokovane u oku u slučaju inhibicije Lck.

[0018]U predmetnom pronalasku, atom halogena označava fluor, hlor, hrom, i jod.

[0019]U predmetnom pronalasku, ukoliko nije specifično navedeno drugačije, i kao što je jasno prosečnom poznavacu oblasti,

simbol predstavlja vezivanje prema zadnjoj strani ravni papira (ovde, a-položaj); simbol predstavlja vezivanje prema prednjoj strani ravni papira (ovde. (3-položaj); i

predstavlja a-položaj, p-položaj, ili njihovu smešu u bilo kojoj proporciji.

[0020]Jedinjenja predmetnog pronalaska su konvertovana u odgovarajuće soli pomoću poznatih metoda. So je poželjno so koja je rastvorila u vodi. Pogodne soli mogu biti prikazane kao soli alkalnih metala (kalijum i natrijum), soli zemnoalkalnih metala (kalcijum i magnezijum), amonijumove soli, soli sa farmaceutski prihvatljivim organskim aminima (tetrametilamonijum, trietilamin, metilamin, dimetilamin, cikiopentilamin. benzilamin, fenetilamin, piperidin, monoetanolamin, dietanolamin, tris(hidroksimetil)aminometan, lizin, arginin i N-metil-D-glukamin), i kisele adicione soli (neorganske kisele soli (hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, sulfat, fosfat i nitrat) i organske kisele soli (acetat, trifluoroacetat, laktat, tartarat, oksalat, fumarat, maleat, benzoat, citrat. metansulfonat. etansulfonat, benzensulfonat, toluensulfonat, izetionat, glukuronat i glukonat)).

[0021]Jedinjenja predmetnog pronalaska i njihove soli mogu takođe biti konvertovane u sol vate. Ovaj solvat je poželjno rastvoran u vodi i ima nisku toksičnost. Pogodni solvati mogu biti prikazani kao solvati sa, na primer, vodenim ili alkoholnim rastvaračima (na primer, etanol).

[0022]Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti korišćena kao prolekovi. Prolek jedinjenja predmetnog pronalaska označava jedinjenje koje je konvertovano reakcijominvivo,npr., pomoću enzima ili želudačne kiseline, u jedinjenje predmetnog pronalaska. Prolekovi jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti prikazani pomoću jedinjenja u kojima - kada jedinjenje predmetnog pronalaska ima hidroksilnu grupu - ova hidroksilna grupa je acilovana, alkilovana, fosfatirana, ili borovana (na primer, jedinjenja obezbeđena acetilacijom, palmitoilacijom, propanoilacijom, pivaloilacijom, sukcinilacijom. fumarilacijom, alanilacijom, ili dimetilaminometilkarbonilacijorn hidroksilne grupe u jedinjenjima pronalaska); drugi primeri su jedinjenja obezbeđena esterifikacijom ili amidacijom karboksilne grupe jedinjenja predmetnog pronalaska (na primer, jedinjenja obezbeđena etil esterifikacijom, izopropil esterifikacijom, fenil esterifikacijom, karboksimetil esterifikacijom, dimetilaminometil esterifikacijom, pivaloiloksimetil esterifikacijom, etoksi karboni loksietil esterifikacijom, ftalidil esterifikacijom, (5-metil-2-okso-t,3-dioksolen-4-iI)metil esterifikacijom, cikloheksiloksikarboniletil esterifikacijom. ili metilamidacijom karboksilne grupe u jedinjenju predmetnog pronalaska). Ova jedinjenja mogu biti pripremljena poznatim metodama. Dodatno, prolek jedinjenja predmetnog pronalaska može biti hidrat ili anhidrovan. Prolek jedinjenja predmetnog pronalaska je konvertovan pod fiziološkim uslovima ujedinjenje predmetnog pronalaska, kao što je opisano na stranama 163 do 198 u „Molecular Design in Volume 7 of Development of Medicines" (Hirokawa Shoten Co., 1990). Dodatno, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti obeležena pomoću izotopa (na primer,<2>H,<3>H, "C,<l3>C,14C,l<3>N,<l5>N,<l5>0,<l7>0,<l8>0,<35>S,<l8>F,<36>CI,<123>I, i l2T).

[Metode za proizvodnju jedinjenja predmetnog pronalaska]

[0023] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena pomoću pogodno modifikujućih i kombinujućih poznatih metoda, na primer, metode opisane u „Comprehensive Organic Transfonnations: A Guide to Functional Group Preparations, 2nd Edition (Richard C. Larock, John Wiley & Sons Inc., 1999)'\ili metode date u primerima.

[0024| Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena korišćenjem stedeće sheme reakcija 1.

(U formulama, T<1>i T<2>svaki nezavisno predstavlja zaštitnu grupu za amino grupu (na primer, benzil (Bn) grupa, 4-metoksibenzil grupa, i 3.4-dimetoksibenzii grupa); X<1>i X<2>svaki nezavisno predstavlja atom halogena; prsten2-I predstavlja prsten2<a>koji je bio zaštićen pomoću zaštitne grupe koja je predstavljena sa T<3>(na primer, terc-butoksikarbonil (Boe) grupa i benziloksikarbonil (Cbz) grupa; prsten2a je pirolidin prsten. L je -O-, prsteni je benzenov prsten, m je 0 i n je 0.)

[0025] Reakcija 1 u shemi reakcija 1 je poznata i izvedena je korišćenjem jedinjenja sa opštom formulom (a) i zaštićenim aminskim derivatom, tj.. jedinjenje predstavljeno pomoću T'T<2->NH (T<1>i T<2>u formuli imaju iste definicije kao iznad) i izvođenjem reakcije u organskom rastvaraču (na primer, dihlorometan, tetrahidrofuran, dioksan, dimetilformamid, dimetilacetamid, i l-metil-2-pirolidon) u prisustvu baze (na primer, trietilamin, N,N-điizopropiletilamin, piridin, 4-dimetilaminopiridin, i N-metilmorfolin) na temperaturi od - 20°C do sobne temperature.

[0026]Reakcija 2 u shemi reakcija 1 je poznata i izvedena je korišćenjem jedinjenja sa opštom formulom (b) i jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (II) i izvođenjem reakcije u organskom rastvaraču (na primer, dioksan, acetonitril, tetrahidrofuran, dimetilformamid, dimetilacetamid, i l-metil-2-pirolidon) u prisustvu baze (na primer, trietilamin, N,N-diizopropiletilamin, piridin, 4-dimetilaminopiridin. i N-metilmorfolin) na temperaturi od -20°C do 70°C.

[0027]Reakcija 3 u shemi reakcija 1 je poznata i izvedena je korišćenjem jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (c) i korišćenjem metalnog reagensa (na primer, cink, gvožđe, kalaj, kalaj hlorid, gvožđe hlorid, samarijum, indijum, i natrijum borohidrid-nikl hlorid) u rastvaraču koji može da se meša sa vodom (na primer, etanol, metanol, tetrahidrofuran. i etil acetat) u prisustvu ili odusustvu kiseline {na primer, hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, amonijum hlorid, sirćetna kiselina, i amonijum format) na temperaturi od 0°C do 150°C.

[0028]Reakcija 4 u shemi reakcija 1 je poznata i izvedena je korišćenjem jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (d) i korišćenjem reagensa (na primer, 1.1'-karbonildiimidazot (CDI) i trifosgena) u organskom rastvaraču (na primer, tetrahidrofuran, dimetilformamid, i dimetilacetamid) u prisustvu ili odusustvu baze (na primer, trietilamin. N,N-diizopropiletilamin, piridin, 4-dimetilaminopiridin, i N-metilmorfolin) od temperature koja je generisana hlađenjem leda do temperature refluksa.

[0029]Reakcije uklanjanja zaštite za zaštitne grupe u shemi reakcija 1 su poznate i mogu biti izvedene pomoću metoda koje su opisane ispod. Primeri ovde su (1) reakcije uklanjanja zaštite na osnovu alkalne hidrolize, (2) reakcije uklanjanja zaštite u kiselim uslovima, (3) reakcije uklanjanja zaštite na osnovu hidrolize, (4) reakcije uklanjanja zaštite za silil grupu, (5) reakcije uklanjanja zaštite korišćenjem metala, i (6) reakcije uklanjanja zaštite korišćenjem kompleksa metala.

[0030]Ove metode su specifično opisane ispod. (1) Reakcija uklanjanja zaštite na osnovu alkalne hidrolize može biti izvedena, na primer, u organskom rastvaraču (na primer, metanol, tetrahidrofuran, i dioksan) na od 0°C do 40°C korišćenjem hidroksida alkalnog metala (na primer. natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, i litijum hidroksid), hidroksid zemnoalkalnog metala (na primer, barijum hidroksid i kalcijum hidroksid), ili karbonata (na primer, natrijum karbonata i kalijum karbonata), ili vodenog rastvora prethodnog, ili njihove smeše. (2) Reakcija uklanjanja zaštite u kiselim uslovima može biti izvedena, na primer, na 0°C do 100°C u prisustvu ili odsustvu 2.2,2-trifluoroetanola, u organskom rastvaraču (na primer, dihlorometan, hloroform, dioksan, etil acetat, metanol, izopropil alkohol, tetrahidrofuran, i anizol) u organskoj kiselini (na primer, sirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, metansulfonska kiselina, i p-tozilat) ili neorganska kiselina (na primer, hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina) ili njihova smeša (na primer, vodonik bromid/sirćetna kiselina). (3) Reakcija uklanjanja zaštite na osnovu hidrolize može biti izvedena, na primer, na 0°C do 200°C u rastvaraču (na primer. etar (na primer, tetrahidrofuran, dioksan, dimetoksietan, i dietil etar), alkohol (na primer, metanol i etanol), benzenski rastvaraČ (na primer, benzen i toluen), keton (na primer, aceton i metil etil keton), nitril (na primer, acetonitril), amid (na primer, N,N-dimetilformamid), voda, etil acetat, sirćetna kiselina, ili smeša rastvarača od dva ili više prethodna) u prisustvu katalizatora (na primer, paladijum-ugljenik, paladijum crno, paladijum hidroksid-ugljenik, platina oksid, i Raney nikl) u atmosferi vodonika pri normalnom pritisku ili povišenom pritisku ili u prisustvu amonijum foramata. (4) Reakcija uklanjanja zaštite za silil grupu može biti izvedena, na primer, na 0°C do 40°C u organskom rastvaraču koji može da se mesa sa vodom (na primer, tetrahidrofuran i acetonitril) korišćenjem tetrabutilamonijum fluorida. Može takode biti izvedena, na primer, na -10°C do 100°C u organskoj kiselini (na primer, sirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, metansulfonska kiselina, i p-tozilat) ili neorganskoj kiselini (na primer. hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina) ili njihova smeša (na primer. bromo vodonik/sirćetna kiselina). (5) Reakcija uklanjanja zaštite korišćenjem metala može biti izvedena, na primer, na 0°C do 40°C u kiselom rastvaraču (na primer, sirćetna kiselina, pufer sa pH od 4.2 to 7.2, ili smeša rastvora prethodnih rastvora sa organskim rastvaraćem kao što je tetrahidrofuran) u prisustvu praha cinka i ako je potrebno dok se primenjuje ultrazvuk. (6) Reakcija uklanjanja zaštite korišćenjem kompleksa metala može biti izvedena, na primer, na 0°C do 40°C u organskom rastvaraču (na primer, đihlorometan, N,N-dimetilformamid, tetrahidrofuran, etil acetat, acetonitril. dioksan, i etanol), vodi, ili smeši njihovih rastvora. korišćenjem kompleksa metala (na primer, tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0), bis(trifeni!fosfin)paladijum(II) dihlorid, palađijum(II) acetat, i tris(trifeniIfosfin)rodijum(I) hlorid) u prisustvu reagensa za hvatanje (na primer, tributilkalaj hidrid, trietilsilan, dimedon, morfolin. dietilamin, i piroiidon), organska kiselina (na primer, sirćetna kiselina, mravlja kiselina, i 2-etilheksanska kiselina), i/ili so organske kiseline (na primer, natrijum 2-etilheksanoat i kalijum 2-etilheksanoat) i u prisustvu ili odusutvu reagensa fosfin-tipa (na primer, trifenilfosfin).

[0031]Kao dodatak prethodnom, reakcija uklanjanja zaštite može takode biti izvedena korišćenjem metoda opisanih u, na primer, T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999.

[0032]Zaštitna grupa za amino grupu može biti prikazana kao benziloksikarbonilna grupa, t-butoksikarbonilna grupa, aliloksikarbonil (Alloc) grupa, 1-metil-l-(4-bifenil)etoksikarbonil (Bpoc) grupa, trifluoroacetil grupa, 9-fluorenilmetoksikarbonil grupa, benzil (Bn) grupa, p-metoksibenzil grupa, benziloksimetil (BOM) grupa, i 2-(trimetilsiliI)etoksimetil (SBM) group. (0033] Kao dodatak prethodnom, zaštitna grupa za amino grupu može biti grupa sposobna za laku i selektivnu eliminaciju i nije drugačije posebno ograničeno. Na primer, grupe opisane u T. W. Greene, Protective Groups in Organic Svnthesis, Wiley. New York, 1999, mogu biti korišćene.

[0034] Reakcija 5 u shemi reakcija 1 je poznata i izvedena korišćenjem jedinjenja sa opštom formulom (f) i jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (III-l) ili opšte formule(UI-2) i izvođenjem reakcije na od sobne temperature do 120°C u organskom rastvaraču (na primer, dihlorometan i acetonitril) u prisustvu baze (na primer. piridin, trietilamin, i N.N-diizopropiletilamin). so bakra (na primer, bakar(II) acetat), i agens za sušenje (na primer, molekularno sito).

[0035] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena korišćenjem jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (I-A) i jedinjenja koje je predstavljeno pomoću opšte formule (I-D-1)

(R<2d>u formuli je C3alkinilen grupa) i izvođenjem reakcije na 0°C do sobne temperature korišćenjem agensa za kondenzovanje (na primer, 1,3-dicikloheksilkarbodiimid (DCC), l-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]karbodiimid (EDC). I J'-karbonildiimidazol (CD1), 2-hloro-l-metilpiridinijum jodid, i ciklični anhidrid 1-propanfosfonske kiseline (PPA)) u organskom rastvaraču (na primer, hloroform, dihlorometan, dimetilformamid, dimetilacetamid, dietil etar, i tetrahidrofuran). ili bez rastvaraca, u prisustvu ili odsustvu baze (na primer, trietilamin, piridin, N.N-diizopropiletilamin, 4-dimetilaminopiridin. i N-metilmorfolin) i sa ili bez primene 1-hidroksibenztriazola (HOBt).

[0037] Jedinjenja korišćena kao početni materijal u svakoj od reakcija u ovom Opisu, na primer, opšte formule (a), (II), (III-l), (III-2) i (I-D-1), su ili poznata ili mogu biti odmah proizvedena pomoću poznatih metoda.

[0038] Za svaku od reakcija u ovom Opisu, reakcije koje su praćene primenom toplote mogu biti izvedene korišćenjem vodenog kupatila, uljanog kupatila, peščanog kupatila, ili mikrotalasni, što će biti jasno prosečnom poznavaocu oblasti.

[0039]Reagens u Čvrstoj fazi, koji sadržu reagens nošen na polimeru visoke molekulske težine (na primer, polistiren, poliakrilamid. polipropilen. i polietilen glikol). može biti korišćen odgovarajuće u reakcijama u ovom opisu.

[0040]Proizvod reakcije u svakoj od reakcija ovog opisa može biti prečišćen korišćenjem uobičajenih sredstava za prečišćavanje, na primer, korišćenjem metoda kao što je destilacija pri normanom pritisku ili pod smanjenim pritiskom, tečna hromatografija visokih performansi korišćenjem silika gela ili magnezijum silikata, tankoslojna hromatografija, jonoizmenjivačka smola, apsorptivna smola, hromatografija na koloni, ispiranje i rekristalizacija. Prečišćavanje može biti izvedeno u svakoj reakciji ili može biti izvedeno nakon kompletiranja nekoliko reakcija.

[Toksičnost]

[0041]Jedinjenja predmetnog pronalaska imaju prihvatljivo nisku toksičnost, na primer. skoro da nemaju CYP inhibitornu aktivnost i skoro da nemaju hepatotoksičnost, i tako mogu biti sigurno korišćena kao aktivni farmaceutski sastojak.

[Primena u farmaciji]

[0042] Jedinjenja predmetnog pronalaska imaju selektivnu Btk inhibitornu aktivnost i kao rezultat su korisna kao agensi za prevenciju i/ili lečenje Btk-povezanih bolesti, tj. bolesti u kojima učestvuju B ćelije i/ili mastociti, na primer, alergijske bolesti, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti, tromboembolijske bolesti, kanceri. i bolesti kalema-prema-domaćinu. Jedinjenja predmetnog pronalaska takode vrše selektivno inhibitorno delovanje na B ćelijsku aktivaciju i kao rezultat su takode efikasna kao inhibitori B ćelijske aktivacije.

[0044]Autoimune bolesti u predmetnom pronalasku mogu biti prikazane pomoću - inflamatorna bolest creva, artritis, lupus, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, osteoartritis, Stilova bolest, juvenilni artritis, dijabetes tipa 1, mijastenia gravis, Hašimotov tiroiditis, Ord-ov tiroiditis, Bazedovljeva bolest, Sjogren-ov sindrom, multipla skleroza, Guillain-Barre sindrom, akutni diseminirani encefalomijelitis, Adisonova bolest, opsoklonus-mioklonus sindrom, ankilozirajući spondilitis, sindrom anti-fosfoiipidnih antitela, aplastična anemija, autoimuni hepatitis, celijačna bolest, Goodpasture-ov sindrom, idiopatska trombocitopenična purpura, optički neuritis, skleroderma, primarna bilijarna ciroza, Reiter-ova bolest, Takavasu arteritis, temporalni arteritis, autoimuna hemolitička anemija sa toplim antitelima, Wegener-ov granulom, psorijaza, univerzalna alopecija, Behcet-ova bolest, sindrom hroničnog umora, disautonomija, endometrioza, intersticijalni cistitis. miotonija, vulvodinija, i sistemski eritemski lupus.

[0045] Inflamatorne bolesti u predmetnom pronalasku mogu biti prikazane kao astma, upala slepog creva, blefaritis, bronhiolitis, bronhitis, bursitis, cervicitis, holangitis, holecistitis, kolitis, konjunktivitis, cistitis, dakrioadenitis, dermatitis. dermatomiozitis, encefalitis, endokarditis, endometritis, enteritis, epikondilitis, epididimitis, fasciitis, fibrositis, gastritis, gastroenteritis, hepatitis, hidradenitis suppurativa, laringitis, mastitis, meningitis, mijelitis. miokarditis, miozitis, nefritis, ooforitis, orhitis, osteitis, pankreatitis, parotitis, perikarditis, peritonitis, faringitis, pleuritis, flebitis, pneumonija, proktitis, prostatitis, pijelonefritis, rinitis, salpingitis, sinusitis, stomatitis, sinovitis, tendinitis. tonzilitis. uveitis, vaginitis, vaskulitis, i vulvitis.

[0046]Tromboembolijske bolesti u predmetnom pronalasku mogu biti opisane pomoću infarkta miokarda. angine pektoris, reokluzije nakon angioplastike, restenoze nakon angioplastike, reokluzije nakon aortokoronarnog bajpasa, restenoze nakon nakon aortokoronarnog bajpasa, infarkta, prolazne ishemije, perifernih aretrijalnih poremećaja, plućne embolije, i tromboze dubokih vena.

[0047] U predmetnom pronalasku, kanceri uključuju ne-Hočkin limfome, među kojima su ne-Hočkin limfomi B-ćelija posebno pogodni, na primer, Burkitov limfom, limfom povezan sa AIDS-om. B-ćelijski limfom marginalne zone (nodularni B-ćelijski limfom marginalne zone, ekstranodularni B-ćelijski limfom marginalne zone, i splenični B-ćelijski limfom marginalne zone), difuzni B krupnoćelijski limfom. primarni efuzioni limfom, limfomatoidna granulomatoza, folikularni limfom, B-ćelijska hronična iimfocitna leukemija, B-ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmocitna leukemija</>Waldenstromova makroglobulinemija, plazmocitom, limfom plaštene zove (limfom „mantie" ćelija), medijastinalni krupnoćelijski B-limfom, intravaskularni krupnoćelijski B-limfom, i leukemija vlasastih ćelija (,,hairy eell" leukemija). Kao dodatak ne-Hočkin limfomu, kanceri u predmetnom pronalasku uključuju pankreasne endokrine tumore, na primer, insuiinom, gastrinom, glukagonoma, somatostatinoma, VlPom, PPom i GRFom.

[0048]Jedinjenje predmetnog pronalaska može biti administriram) samo ili može biti administrirano kao kombinovan preparat spojen sa drugim lekom u svrhu

1) dopune i povećanja profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjen ja.

2) poboljšanja farmakokinetike i apsorpcije i smanjenja doze jedinjenja. i/ili

3) smanjenja neželjenih reakcija jedinjenja.

[0049] Kombinovani preparat jedinjenja predmetnog pronalaska sa drugim lekom može biti administrirali u obliku izmešanog agensa u kome su obe komponente izmešane u pojedinačnoj formulaciji ili mogu biti administrirane kao odvojene formulacije. Administracija u vidu odvojenih formulacija uključuje istovremenu administraciju i administraciju u različita vremena. U slučaju administracije u različita vremena, jedinjenje predmetnog pronalaska može biti administrirano prvo praćeno sa administracijom drugog leka, ili drugi lek može biti administriran prvo praćeno sa administracijom jedinjenja predmetnog pronalaska. Ista metoda administracije može biti korišćena za svaki ili različite metode administracije mogu biti korišćene.

[0050] Nema posebnog ograničenja na bolesti koje mogu biti podvrgnute prevenciji i/ili lečenju pomoću gorepomenutog kombinovanog preparata, i ovaj kombinovani preparat može biti korišćen kod bilo koje bolesti kod koje je efekat prevencije i/ili lečenja jedinjenja predmetnog pronalaska dopunjen ili pojačan.

[0051] Drugi lek za dopunu i/ili pojačanje profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjenja predmetnog pronalaska protiv alergijskih bolesti može biti prikazan antihistaminicima, antagonistima leukotriena, antagonistima tromboksan A2 receptora, inhibitorima tromboksan sintaze, i steroidima.

[0052] Drugi lek za dopunu i/ili pojačanje profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjenja predmetnog pronalaska protiv autoimunih bolesti može biti prikazan imunosupresantima; steroidima; bolest-modifikujućim antireumatskim tekovima; inhibitorima elastaze; agonistima kanabinoid-2 receptora; prostaglandinima; inhibitorima prostaglandin sintaze; inhibitorima fosfodiesteraze; inhibitorima metaloproteaza; inhibitorima adhezivnih molekula; anticitokinskim proteinskim agensima kao što su anti-TNF-a agensi, anti-IL-1 agensi, i anti-IL-6 agensi; citokinskim inhibitorima; nesteroidnim antiinflamatoricima; i anti-CD20 antitelima.

[0053] Drugi lek za dopunu i/ili pojačanje profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjenja predmetnog pronalaska protiv inflamatornih bolesti mogu biti prikazani pomoću steroida, inhibitorima elastaza, agonistima kanabinoid-2 receptora, prostaglandinima, inhibitorima prostaglandin sintaze, inhibitorima fosfodiesteraze, inhibitorima metaloproteaza, inhibitorima adhezivnih molekula, antileukotrienima, antiholinergički agensi, antagonistima tromboksan A2 receptora, inhibitorima tromboksan sintaze. derivatima ksantina. ekspektoransima. antibaktericidima, antihistaminicima, anticitokinskim proteinskim agensima, inhibitorima citokina, forskolinskim agensima, inhibitorima posrednika oslobađanja, i nesteroidnim antiinflamatoricima.

[0054] Drugi lek za dopunu i/ili pojačanje profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjenja predmetnog pronalaska protiv tromboembolijskih bolesti može biti prikazan pomoću trombolitičkih agenasa, heparina, heparinoidima. heparinima male mokulske mase, varfarinom, inhibitorima trombina, faktor Xa inhibitorima, antagonistima ADP receptora, i inhibitorima ciklooksigenaze. {0055] Drugi lek za dopunu i/ili pojačanje profilaktičkog i/ili terapijskog efekta jedinjenja predmetnog pronalaska protiv ne-Hočkin limfoma može biti prikazan pomoću alkilirajućih agenasa, antimetabolita, antikancerskih antibiotika, biljnih alkaloida, hormona, platinskih jedinjenja, anti-CD20 antitela, i drugih antikancerskih agenasa.

[0056] Antihistaminici mogu biti prikazani pomoću azelastin hidrohlorida, ebastina, epinastin hidrohlorida, emedastin fumarata, auranofina, oksatomida, olopatadin hidrohlorida. dl-hlorfeniramin maleata, klemastin fumarata, ketotifen fumarata, cimetidina, dimenhidrinata, difenhidramin hidrohlorida, ciproheptadin hidrohlorida, cetirizin hidrohlorida, desloratadina. terfenadina, famotidina, feksofenadin hidrohlorida. bepotastina, bepotastin besilata, mizolastina, mekvitazina, mometazon furoata, ranitidina, ranitidin hidrohlorida, loratadina, prometazin hidrohlorida, i homohlorciklizin hidrohlorida.

[0057] Antagonisti leukotriena mogu biti prikazani pomoću praniukast hidrata. montelukast natrijuma, zafirlukasta, ablukasta, pobilukasta, sulukasta. iralukast natrijuma, verlukasta, ritolukasta, cinalukasta, pirodomasta, tomelukasta, i dokalasta. [0058| Antialergijski lekovi mogu biti prikazani pomoću amleksanoksa. azelastin hidrohlorida, israpafanta, ibudilasta, imitrođast natrijuma, ebastina. epinastin hidrohlorida, emedastin fumarata, oksatomida. ozagrel hidrohlorida, olopatadin hidrohlorida, kromoglicinske kiseline, natrijum kromoglikata, ketotifen fumarata, seratrodasta, cetirizin hidrohlorida, suplatast tosilata, tazanolasta, terfenadina, domitroban kalcij um hidrata, tranilasta, nedokromila, feksofenadina, feksofenadin hidrohlorida. pemirolast kalijuma, mekvitazina, ramatrobana, repirinasta. i loratadina.

[0059] Antagonisti tromboksan A2 receptora mogu biti prikazani pomoću seratrodasta, domitroban kalcijum hidrata, i ramatrobana.

[0060]Inhibitori tromboksan sintaze mogu biti prikazani pomoću imitrodast natrijuma i ozagrel hidrohlorida.

[0061]Steroidi mogu biti prikazani pomoću amcinonida, hidrokortizon natrijum sukcinata, prednizolon natrijum sukcinata, metilprednizolon natrijum sukcinata. ciklesonida, difluprednata, betametazon propionata, deksametazona, deflazakorta, triamcinolona, triamcinolon acetonida, halcinonida, deksametazon palmitata, hidrokortizona, flumetazon pivalata, prednizolon butilacetata, budesonida, prasteron sulfata, mometazon furoata, fluocinonida, fluocinolon acetonida, fludroksikortida, flunisolida, prednizolona, alklometazon propionata, klobetazol propionata. deksametazon propionata, deprodon propionata. flutikazon propionata, beklometazon propionata, betametazona. metilprednizolona, metilprednizolon suleptanata, metilprednizolon natrijum sukcinata, deksametazon natrijum fosfata, hidrokortizon natrijum fosfata, prednizolon natrijum fosfata, diflukortolon valerata, deksametzon valerata, betametazon valerata, prednizolon valerat acetata, kortizon acetata. diflorason acetata, deksametazon acetata. triamcinolon acetata, parametazon acetata. halopredon acetata, fludrokortizon acetata, prednizolon acetata, metilprednizolon acetata, klobetazon butirata, hidrokortizon butirata, hidrokortizon butirat propionata. i betametazon butirat propionata.

[0062]Imunosupresanti mogu biti prikazani pomoću - azatioprin, askomicin, everolimus. salazosulfapiridin, ciklosporin, ciklofosfamid, sirolimus, takrolimus, bucilamin, metotreksat, i leflunomid.

[0063]Bolest-modifikujući antireumatski lekovi mogu biti prikazani sa - D-penicilamin, aktarit, auranofin, salazosulfapiridin, hidroksihlorokvin, bucilamin, metotreksat, leflunomid. lobenzarit natrijum, aurotioglukoza, i natrijum aurotiomalat.

[0064]Inhibitori elastaze mog biti prikazani pomoću - ONO-5046, ONO-6818, MR-889, PBI-1101, EPI-HNE-4. R-665, ZD-0892. ZD-8321. C.W-311616, DMP-777, L-659286. L-680833, L-683845, i AE-3763.

[0065]Prostaglandini (skraćeni ispod kao "PG") mogu biti prikazani pomoću PGE1 lekova (primeri: alprostadil alfadeks, alprostadil), PGI2 lekova (primer: beraprost natrijum), PG receptor agonisti, i PG receptor antagonisti. PG receptor može biti predstavljen pomoću PGE receptora (EP1, EP2, EP3, i EP4), PGD receptora (DP, CRTH2), PGF receptora (FP), PGI2 receptora (IP), i TX receptora (TP).

[0066]Inhibitori prostaglandin sintaze mogu biti prikazani pomoću - salazosulfapiridin, mesalazin, olsalazin, 4-aminosalicilna kiselina, JTE-522, auranofin, karprofen, difenpiramid, flunoksaprofen, flurbiprofen. indometacin, ketoprofen, lornoksikam. loksoprofen, meloksikam, oksaprozin, parsalmid, piproksen, piroksikam. piroksikam cinamat, zaltoprofen, i pranoprofen.

[0067][Inhibitori fosfodiesteraze mogu biti prikazani sa - rolipram, cilomilast, Bayl9-8004, NIK-616, roflumilast (BY-217), cipamfilin (BRL-61063), atizoram (CP-80633), ONO-6126, SCH-351591, YM-976, V-l 1294A, PD-168787, D-4396, i IC-485.

[0068]Inhibitori adhezivnih molekula mogu biti prikazani pomoću a4 integrin antagonista.

[0069]Anti-TNF-ct agensi mogu biti prikazani pomoću anti-TNF-a antitelima, solubilnog TNF-a receptora, receptora anti-TNF-a antitela, i solubilnog TNF-a vezujućeg proteina i posebno pomoću infliksimaba i etanercepta.

[0070]Anti-IL-1 agensi mogu biti prikazani pomoću anti-IL-1 antitela, solubilnog IL-1 receptora, anti-IL-IRa antitela i/ili receptora anti-IL-1 antitela i naročito pomoću anakinra.

[0071]Anti-IL-6 agensi mogu biti prikazani pomoću anti-IL-6 antitela, solubilnog IL-6 receptora, i receptora anti-IL-6 antitela i naročito pomoću tocilizumaba.

[0072]Citokinski inhibitori mogu biti predstavljeni pomoću suplatast tozilata, T-614, SR-31747, i sonatimoda.

[0073]Antiholinergički agensi mogu biti prikazani pomoću triheksifenidil, triheksifenidil hidrohlorida, biperidena, i biperiden hidrohlorida.

[0074]Derivati ksantina mogu biti prikazani pomoću aminofilina, teofilina, doksofilina, sipamfilina, i diprofilina.

[0075]Ekspektoransi mogu biti prikazani pomoću ratsvora na bazi amonijaka - „foeniculated ammonia špirit", natrijum bikarbonata, bromheksin hidrohlorida. karbocisteina, ambroksol hidrohlorida, metilcistein hidrohlorida, acetilcisteina. etil L-cistein hidrohlorida, i tiloksapola.

[0076]Antibaktericidi mogu biti prikazani pomoću natrijum cefuroksima, meropenem trihidrata, netilmicin sulfata, sisomicin sulfata, ceftibutena. PA-1806, IB-367, tobramicina, PA-1420, doksorubicina, astromicin sulfata, i cefetamet pivoksil hidrohlorida.

[0077]Inhibitori posrednika oslobađanja mogu biti prikazani pomoću tranilasta, natrijum kromoglikata, amleksanoksa, repirinasta, ibudilasta, dazanolasta, i pemirolast kalijuma.

[0078] Trombolitički agensi mogu biti prikazani pomoću alteplaze. urokinaze, tisokinaze, nasaruplaze, nateplaze, t-PA, pamiteplaze. monteplaze, prourokinaze, i streptokinaze.

[0079]Heparinoidi mogu biti prikazani pomoću fondaparinuksa.

[0080] Heparini male molekulske mase mogu biti prikazani pomoću danaparoid natrijum, enoksaparin (natrijum), nadroparin kalcijum, bemiparin (natrijum). reviparin (natrijum), and tinzaparin (natrijum).

[0081] Inhibitori thrombina mogu biti prikazani pomoću argatroban. ksimelagatran, melagatran, dabigatran, bivalirudin, lepirudin. hirudin, i desirudin.

[0082] ADP receptor antagonisti mogu biti prikazani pomoću tiklopidin hidrohlorida i klopidogrel sulfata.

[0083] Ciklooksigenzani inhibitori mogu biti prikazani pomoću aspirina.

[0084] Alkilirajući agensi mogu biti prikazani pomoću azot iperit N-oksid hidrohlorid, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan, thiotepa. karbokvon. busulfan. nimustin hidrohlorid, dakarbazin, i ranimustin.

[0085] Antimetaboliti mogu biti prikazani pomoću metotreksat, merkaptopurin, 6-merkaptopurin ribozid, fluorouracil, tegafur, tegafur uracil, karmofur, doksifluridin. citarabin. enocitabin, tegafur gimestat otastat kalijum, gemcitabin hidrohlorid, citarabin okfosfat. prokarbazin hidrohlorid, i hidroksikarbamid.

[0086] Antikancerski antibiotici mogu biti prikazani pomoću aktinomicin D. mitomicin C. daunorubicin hidrohlorid, doksorubicin hidrohlorid, aklarubicin hidrohlorid, neokarzinostatin, pirarubicin hidrohlorid, epirubicin (hidrohlorid), idarubicin hidrohlorid, hromomicin A3. bleomicin (hidrohlorid), peplomicin sulfat, terarubicin, i zinostatin stimalamer.

[0087] Biljni alkaloiđi mogu biti prikazani pomoću vinblastin sulfat, vinkristin sulfat, vindezin sulfat, irinotekan hidrohlorid, etopozid, flutamid, vinorelbin tartarat, docetaksel hidrat, i paklitaksel.

[0088] Hormoni mogu biti prikazani pomoću estramustin fosfat natrijum. mepitiostan, epitiostanol, goserelin acetat, fosfestrol (dietilstilbestrol fosfat), tamoksifen citrat, toremifen citrat, fadrozol hidrohlorid hidrat, medroksiprogesteron acetat, bikalutamid, leuprorelin acetat, anastrozol, i eksemestan.

[0089] Platinska jedinjenja mogu biti prikazana pomoću karboplatine, cisplatine, i nedaplatine.

[0090] Anti-CD-20 antitela mogu biti prikazana pomoću rituksimaba, ibritumomaba, i okrelizumaba.

[0091]Drugi anti-kancerski agensi mogu biti prikazani pomoću L-asparaginaze. oktreotid acetata, porfimer natrijuma, i mitoksantron acetata.

[0092] Kombinovani preparat koji sadrži kombinaciju sa jedinjenjem predmetnog pronalaska ne samo da uključuje kombinovane preparate otkrivene do sada, već isto uključuje kombinovane preparate koji mogu otkriveni u budućnosti.

[0093] Jedinjenja predmetnog pronalaska su generalno administrirana sistemski ili lokalno kao farmaceutski efikasna komponenta u oralnoj ili parenteralnoj formi. Oralna formulacija može biti prikazana putem tečnosti za oralnu administraciju (na primer. eliksiri, sirupi, farmaceutski prihvatljive formulacije na bazi vode. suspenzije, i emulzije) i čvrstih supstanci za oralnu administraciju (na primer, tablete (uključujući sublingvalne tablete i oralne dezintegrišuće tablete), pilule, kapsule (uključujući tvrde kapsule, meke kapsule, želatinske kapsule, i mikrokapsule), prahovi, granule, i lozenge). Parenteralne formulacije mogu biti prikazane kao rastvori (na primer, za injektiranje (na primer, subkutano injektiranje, intravensko injektiranje, intramuskularno injektiranje, intraperitonealno injektiranje, i formulacije za kapanje), kapi za oči (na primer, vodene (na primer. vodeni rastvor kapi za oči, vodena suspenzija kapi za oči, viskozne kapi za oči, i solubilizovane kapi za oči) i nevodene kapi za oči (na primer, nevodene kapi za oči i nevodene suspenzije kapi za oči)), topikalni preparati (na primer, masti (na primer. masti za oči)), i kapi za uši). Ove formulacije mogu biti formulacije sa kontroiisanim oslobađanjem kao što su formulacije sa brzim oslobađanjem i formulacije sa produženim oslobađanjem. Ove formulacije mogu biti proizvedene pomoću poznatih metoda, na primer. pomoću metoda koje su opisane u Japanskoj Farmakopeji.

[0094] Tečnosti za oralnu administraciju u okviru domena oralnih formulacija mogu biti proizvedene, na primer, rastvaranjem, suspendovanjem, ili emulzifikacijom efikasne komponente u diluentu koji se obično koristi (na primer. prečišćena voda, etanol, ili njihova smeša). Ove tečne formulacije mogu takode da sadrže, na primer, agens za vlaženje, agens za suspendovanje, emulzifikujući agens, zaslađivač. flavorant (aromatična supstanca), miris, konzervans i pufer.

[0095] Čvrste supstance za oralnu administraciju u domenu oralnih formulacija mogu biti pripremljene mešanjem efikasne komponente sa, na primer, nosačem (na primer, laktoza, manitol. glukoza, mikrokristalna celuloza, i škrob), vezivom (na primer, hidroksipropil celuloza, polivinilpirolidon, i magnezijum metasilikat aluminat), disintegrantom (na primer, celuloza kalcijum glikolat), lubrikantom (na primer. magnezijum stearat), stabilizatorom, pomoćnim sredstvom za rastvaranje (na primer, glutaminska kiselina i aspartinska kiselina), i formulisanje prema standardnim metodama. Ako je neophodno, oblaganje može biti izvedeno pomoću agensa za oblaganje (na primer. šećer, želatin, hidroksipropil celuloza, i hidroksipropil metil celuloza ftalat) i dva ili više slojeva mogu biti aplicirani.

[0096] U sferi parenteralnih formulacija, topikalna supstanca može biti proizvedena korišćenjem poznate metode ili formulacije koja se obično koristi. Na primer, mast može biti pripremljena inkorporisanjem ili topljenjem efikasne komponente u bazi. Podloga masti je odabrana od poznatih podloga masti ili od podloge masti koja se obično upotrebljava. Na primer, pojedinačna selekcija od sledećih ili smeše dve ili više selekcija od sledećih može biti korišćena: više masne kiseline i estri viših masnih kiselina (na primer, adipinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, stearinska kiselina, oleinska kiselina, estri adipinske kiseline, estri miristinske kiseline, estri palmitinske kisline. estri stearinske kiseline, i estri oleinske kiseline), voskovi (na primer, pčelinji vosak, spermaceti, i cerezin). surfaktanti (na primer, polioksietilen alkil etar fosfatni estri), viši alkoholi (na primer, cetanol, stearil alkohol, i cetostearil alkohol), silikonska ulja (na primer. dimetilpolisiloksan), ugljovodonici (na primer, hidrofilni vazelin, beli vazelin, prečišćeni lanolin, i tečni parafin), glikoli (na primer, etilen glikol, dietilen glikol, propilen glikol, polietilen glikol, i makrogol), biljna ulja (na primer. ricinusovo ulje. maslinovo ulje, susamovo ulje, i terpentin ulje), životinjska ulja (na primer, ulje kanadske kune, ulje žumanceta. skvalan, i skvalen), voda, promoteri apsorpcije, anliiritanti. Humektant, konzervans, stabilizator, antioksidans i miris takode mogu biti uključeni. [0097J Injektabilne supstance u domenu parenteralnih formulacija obuhvataju rastvore, suspenzije, i emulzije kao i čvrste injektabilne supstance korišćene u rastvoru ili suspenziji u rastvaraču u vreme primene. Na primer, injektabilna supstanca može biti korišćena sa aktivnom komponentom koja je rastvorena, suspendovana. ili emulzifikovana u rastvaraču. Na primer, destilovana voda za injekciju, fiziološki slani rastvor, biljno ulje, propilen glikol, alkohol kao što je etanol, ili kombinacija prethodnih može biti korišćena kao rastvarač. Injektabilna supstanca može takode da sadrži stabilizator, pomoćno sredstvo za rastvaranje (na primer, glutaminska kiselina, aspartinska kiselina, i Polysorbate 80 (registrovani naziv)), agens za suspendovanje, agens za emulzifikaciju. agens za umirivanje, pufer i konzervans. Injektabilna supstanca može biti sterilisana u finalnom koraku ili može biti proizvedena korišćenjem aseptične obrade. Injektabilna supstanca može takode biti korišćena nakon rastvaranja u destilovanoj vodi za injekciju ili drugom rastvaraču, koji je ili sterilan ili sterilisan pre upotrebe. (0098JDoza kada je jedinjenje predmetnog pronalaska korišćeno kao efikasna komponenta u leku može biti odabrana kao odgovarajuća u zavisnosti od, na primer, simptoma, starosti i tipa formulacije. U slučaju oralne formulacije, poželjno od 1 mg do 100 mg i poželjnije od 5 mg do 30 mg može biti administrirano od jednom do nekoliko puta na dan (na primer, jedan do tri puta). U slučaju kapi za oči, od jedne do nekoliko kapi po administraciji očnog rastvora koji ima koncentraciju od poželjno 0.000001% do 5% (w/v) i poželjnije 0.00001% do 0.05%

(w/v) može biti stavljen od jednog do nekoliko puta na dan (na primer, od jedan do osam puta). U slučaju očne masti, očna mast sa koncentracijom od poželjno 0.000001% do 5%

(w/w) i poželjnije 0.00001%o do 0.05% ( w/w) može biti aplicirana od jednog do nekoliko puta na dan (na primer, jedan do četiri puta).

[0099]Naravno, kako je iznad zabeleženo, doza će zavisiti od raznih uslova i kao rezultat desiće se slučajevi u kojima će količina manja od gorepomenutih doznih nivoa biti dovoljna ili u kojima ovi opsezi moraju biti prekoraćeni.

PRIMERI

[0100JPredmetni pronalazak je opisan ispod korišćenjem primera, ali predmetni pronalazak nije ograničen ovim primerima.

[0101 [Rastvarači navedeni u zagradama za TLC i u delovima u vezi sa hromatografskom separacijom ukazuju na elucione rastvarače ili raslvarače za razvijanje koji su korišćeni, i proporcije i odnose zapremina.

[0102]Ukoliko specifično nije drugačije naznačeno, NMR podaci su podaci za 'H-NMR.

[0103]RastvaraČ korišćen u merenju je dat u zagradama u NMR delu.

[0104]Nazivi jedinjenja korišćeni u Opisu su generalno imena bazirana na IUPAC pravilima nomenklature ili generisana korišćenjem ACD/Name (registrovan žig), kompjuterskog programa od Advanced Chemistrv Development, Inc., koji vrši imenovanje na osnovu IUPAC pravila.

Primer 1 ( preporuka)

[0105]N,N-dibenzil-6-hloro-5-nitropirimidin-4-amin Dibenzilamin (10.2 g) u rastvoru dihlorometana (30 mL) je dodat u kapima u ledenom kupatilu u đihlormetan (70 mL) rastvor 4,6-dihIoro-5-nitropirimidina (10 g). Ovo je praćeno dodatkom trietilamina (14.4 mL) i mešano je tokom 1 sata. Voda je zatim dodata u reakcionu smešu i organski sloj je zatim ispran sa zasićenim rastvorom natrijum hlorida i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je koncentrovan pod smanjenim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova (19.2

g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod. TLC: Rf 0.50 (heksan : etil acetat = 7 : 1)-

Primer 2 ( preporuka)

terc-butil 3-{[6-(dibenzilamino)-5-nitropirimiđin-4-il]amino}azetidin-l-karboksilat

[0106]Jedinjenje (10.3 g) pripremljeno u Primeru 1 i terc-butil 3-aminoazetidin-l-karboksilat (5.0 g) su rastvoreni u dioksanu (58 mL); trietilamin (8.1 mL) je dodat; i mešanje je vršeno tokom 5 sati na 50°C. Reakciona smeša je vraćena na sobnu temperaturu; rastvarač je zatim predestilovan; voda je dodata; i ekstrakcija je izvedena sa etil acetatom. Organski sloj je ispran sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i zatim osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i rastvarač je zatim predestilovan. Ostatak je prečišćen uz pomoć hromatografije na koloni na silika gelu da se dobije jedinjenje iz naslova (10.8 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod. TLC: Rf 0.40 (heksan : etil acetat = 4 : 1).

Primer 3 ( preporuka)

terc-butil 3-{[5-amino-6-(dibenzilamino)pirimidin-4-il]amino}azetidin-l-karboksilat

[0107] Rastvor etil acetata (360 mL) jedinjenja (17.5 g) pripremljenog u Primeru 2 je dodat u kapima smeši cinka (23.3 g) i 3.0 M vodenom rastvoru amonijum hlorida (11.4 g) u ledenom kupatilu i temperatura je odmah povećana do sobne temperature. Nakon mešanja tokom 2 sata, reakciona smeša je filtrirana kroz Celit (registrovan naziv) i rastvarač je zatim predestilovan. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni na silika gelu da se dobije jedinjenje iz naslova (12.4 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod.

TLC: Rf 0.69 (heksan : etil acetat =1:1).

Primer 4 ( preporuka)

terc-butil 3-[6-(dibenzilamino)-8-okso-7,8-dihidro-9H-purin-9-il]azetidin-1 - karboksilat

[0108]Jedinjenje (8.4 g) pripremljeno u Primeru 3 i 1,1'-karbonildiimidazol (5.9 g) su rastvoreni u tetrahidrofuranu (120 mL) praćeno mešanjem tokom 15 sati na 60°C. Nakon što je rastvarač predestilovan iz reakcione smeše. voda je dodata i ekstrakcija sa etil acetatom je izvršena. Organski sloj je ispran sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i rastvarač je zatim predestilovan. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni na silika gelu da se dobije jedinjenje iz naslova (7.8 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod.

TLC: Rf 0.28 (heksan : etil acetat = 2:1).

Primer 5 ( preporuka)

terc-butil 3-(6-amino-8-okso-7,8-dihidro-9H-purin-9-il)azetidin-l-karboksilat

[0109]Jedinjenje (7.8 g) pripremljeno u Primeru 4 je rastvoreno u metanol u (240 mL) i etil acetatu (50 mL); 20% Pearlman-ov katalizator (Pd(OH)2/C) (8.0 g, 100 wt%) je dodat; izvršena je zamena sa vodonikom; i izvršeno je mešanje tokom 7.5 sati na 60°C. Reakciona smeša je filtrirana kroz Celit (regtstrovan naziv) i rastvarač je predestilovan da se dobije jedinjenje iz naslova (5.0 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod.

TLC: Rf 0.50 (etil acetat).

Primer 6 ( preporuka)

terc-butil 3-[6-amino-8-okso-7-(4-fenoksifenil)-7,8-dihidro-9H-purin-9-il]azetidin-1 - karboksilat

[0110]p-fenoksifenilborna kiselina(2.1 g), bakar(ll) acetat (1.48 g), molekularno sito 4A (2.5

g), i piridin (0.82 mL) su dodati na sobnoj temperaturiudihlorometan (200 mL) suspenziju jedinjenja (2.5 g) pripremljenog u Primeru 5, praćeno sa mešanjem tokom 21 sata. Reakciona

smeša je filtrirana kroz Celit (registrovan naziv) i ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na koloni na silika gelu da se dobije jedinjenje iz naslova (1.3 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod. TLC: Rf 0.18 (heksan : etil acetat =1:1).

Primer 7 ( preporuka)

6-amino-9-azetidin-3-il-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on dihidrohlorid

[0111]4 N hlorovodonična kiselina/dioksan (13 mL) je dodato na sobnoj temperaturi suspenziji u metanolu (13 mL) jedinjenja (1.3 g. 2.76 mmol, 1.0 ekvivalent) pripremljenog u Primeru 6 i mešanje je izvedeno tokom 1 sata. Rastvarač je zatim predestilovan da se dobije jedinjenje iz naslova (1.5 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod.

TLC: Rf 0.50 (dihlorometan : metanol: 28% vodeni amonijak = 9 : 1 : 0.1).

Primer 9 ( preporuka)

terc-butil (3R)-3-{[6-(dibenzilamino)-5-nitropirimidin-4-il]amino}piperidin-l-karboksilat

[0112]Jedinjenje iz naslova (1.44 g) koje ima vrednost fizičke osobine datu ispod je dobijeno praćenjem istog Šablona za postupak kao u Primeru 2 korišćenjem jedinjenja (1.5 g) koje je proizvedeno u Primeru 1 i korišćenjem terc-butil (3R)-3-aminopiperidin-l-karboksilat (0.85

g) umesto terc-butil 3-aminoazetidin-l-karboksilata.

TLC: Rf 0.23 (heksan : etil acetat = 9:1).

Primer 10 ( preporuka)

6-amino-7-(4-fenoksifenil)-9-[(3R)-piperidin-3-il]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on dihidrohlorid

[0113]Jedinjenje iz naslova (155 mg) koje ima vrednost fizičke osobine datu ispod je dobijeno praćenjem istog šablona za postupak kao u Primeru 3 —► Primeru 4 —+ Primeru 5 —► Primeru 6 —> Primeru 7, korišćenjem jedinjenja koje je proizvedeno u Primeru 9 i korišćenjem p-fenoksifenilborne kiseline (154 mg).

TLC: Rf 0.68 (metanol: dihlorometan : vodeni amonijak = 80 : 20 : 4).

Primer 17 ( preporuka)

terc-butil 4-({[6-(dibenzilamino)-5-nitropirimidin-4-il]amino}metil)piperidin-l-karboksilat

[0114]Jedinjenje iz naslova (68.3 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod je dobijeno praćenjem istog šablona za postupak kao u Primeru 2, korišćenjem jedinjenja (45.5 g) koje je proizvedeno u Primeru 1 i korišćenjem terc-butil 4-(aminometil)piperidin-1 - karboksilata (27.5 g) umesto terc-butil 3-aminoazetidin-l-karboksilat. TLC: Rf 0.56 (heksan :

etil acetat = 2:1).

Primer 18 ( preporuka')

6-amiiio-7-(4-feiioksifenil)-9-(piperidin-4-ilmeti])-7,9-dihiciro-8H-purin-8-on dihidrohlorid

[0115]Jedinjenje iz naslova (1.66 g) koje ima vrednost fizičke osobine prikazanu ispod je dobijeno praćenjem istog Šablona za postupak kao u Primeru 10, korišćenjem jedinjenja koje je proizvedeno u Primeru 17 i korišćenjem p-fenoksifenilborne kiseline (19 g).

TLC: Rf 0.10 (etil acetat: metanol : trietilamin =18:2: 1).

Primer 19 ( preporuka)

6-amino-9-{[l-(2-butinoil)-4-piperidinil]metil}-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0116]

[0117]2-butinska kiselina (34 mg), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (EDC) (78 mg), 1-hiđroksibenzotriazol (HOBt) (62 mg), i trietilamin (114 uL) su dodati u dimetilformamid (3 mL) rastvor jedinjenja (100 mg) pripremljenog u Primeru 18, praćeno mešanjem tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Voda je dodata reakcionoj smeši i ekstrakcija sa etil acetatom je izvršena. Organski sloj je ispran sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida i zatim je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i rastvarač je predestilovan. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na tankom sloju (dihlorometan : metanol : 28% vodeni amonijak = 90 : 10 : 1) da se dobije jedinjenje iz naslova (75 mg) koje ima vrednosti fizičkih osobina prikazane ispod.

TLC: Rf 0.43 (etil acetat : metanol = 19 : 1); 'H-NMR (CDCh) : 8 1.21-1.45, 1.71-1.83, 1.99, 2.18-2.36,2.59-2.72, 2.99-3.94,4.34-4.61. 7.05-7.24, 7.36-7.43, 8.24.

Primer 19( 2)

[0118]Jedinjenje iz primera dato ispod je dobijeno praćenjem istog šablona postupka kao u Primeru 9 —» Primeru 10 —» Primeru 19, korišćenjem jedinjenja pripremljenog u Primeru 1. korišćenjem odgovarajućeg aminskog derivata terc-butil (3R)-3-aminopiperidin-l-karboksilata, i korišćenjem p-fenoksifenilborne kiseline.

Primer 19( 2)

6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoii)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0119]

TLC: Rf 0.68 (etil acetat: metanol = 9:1);

'H-NMR (CDCb): 5 1.94-2.03. 2.23-2.39, 2.80-3.01, 3.50-3.63, 3.67-3.80, 3.86-4.02, 4.03-4.18, 4.23-4.33, 4.42-4.51, 5.11-5.25, 7.04-7.23, 7.34-7.45, 8.20-8.23.

[Farmakološki eksperimentalni primeri] Biološki Primer 1

Merenje (in vitro testovi) Btk inhibitorne aktivnosti i selektivnosti za Btk

[0120]Inhibitorna aktivnost Btk enzima je izmerena, na osnovu protokola koji je obezbedio proizvođač, korišćenjem Btk (Invitrogen Corporation) i seta Z'-LYTE™ Kinase Assay Kit-Tyrl peptide (Invitrogen Corporation), koji su obuhvatali sledeće reagense: Tyr-1 peptid. Thy-1 fosfopeptid, 5x kinazni pufer, ATP, reagens za razvijanje B, pufer za razvijanje, i reagens za zaustavljanje.

[0121]5 u.L/bunariću rastvora test jedinjenja razblaženog sa dimetil sulfoksidom (DMSO), ili DMSO, i 10 u.L/bunariću rastvora supstrata/enzimske smeše je raspodeljeno u test ploču sa 96 bunarića i reakcija je izvedena tokom 20 minuta na 30°C. Rastvor supstrata/enzimske smeše je pripremljen razređivanjem sa kinaznim puferom (DL-ditiotreitoI (DTT, 2.7 mM), 1.33x kinazni pufer) da se dobije finalna koncentracija za Tyr-1 peptid od 4 pM i finalna Btk koncentracija od 5 nM. 5 uL/bunariću adenozin trifosfata (ATP, finalna koncentracija = 36 uM) je zatim dodata i reakcija je izvedena tokom 1 sata na 30°C. Nakon kompletiranja reakcije, 10 pL rastvora za razvijanje, koji je obezbeđen razređivanjem pomoću reagensa za razvijanje B do 128x korišćenjem pufera za razvijanje, je dodato i reakcija je izvedena tokom dodatnog sata na 30°C. Enzimska reakcija je zatim zaustavljena dodavanjem 10 pL rastvora za zaustavljanje. Intenzitet fluorescencije na 445 nm i 520 nm u svakom bunariću je izmerena korišćenjem čitača ploča Fusion Universal Microplate Analyzer (PerkinElmer Inc.) fluorescence plate reader. Procenat fosforilacije je određen korišćenjem odnosa emisije na 445 mu (emisija kumarina) i emisije na 520 nm (emisija fluoresceina) u skladu sa protokolom koji je obezbeđen u setu.

[0122]Procenat inhibicije (%) test jedinjenja je izračunat korišćenjem sledećejednačine.

[El]

procenat inhibicije (%) fosforilacije =

Ax: % fosforilacija kada je dodato test jedinjenje

Ab: % fosforilacija u odsustvu ATP dodavanja (blank)

Ac : % fosforilacija kada je dodat samo DMSO (kontrola)

[0123] Vrednost 50% inhibicije (IC50 vrednost) za test jedinjenje je određenena sa krive inhibicije na osnovu % inhibicije za svaku koncentraciju test jedinjenja.

[0124] Inhibitoma aktivnost za druge kinaze (na primer, Lek, Fyn, i LynA (sve od Invitrogen Corporation) je izmerena na isti način kako je opisano iznad korišćenjem posebne kinaze umesto Btk.

[0125] Prema rezultatima, IC50 vrednosti za jedinjenja predmetnog pronalaska su bile, na primer, 0.007 pM za jedinjenje iz Primera 19(2).

[0126] Dodatno, Btk-selektivna inhibitoma aktivnost jedinjenja predmetnog pronalaska za druge kinaze, i posebno za Lek, Fyn, i LynA, je izračunata kao odnos IC50 vrednosti pojedinačnih kinaza i data je u Tabeli 1 ispod.

[0127]Ovi rezultati pokazuju da jedinjenja predmetnog pronalaska ne samo da imaju Btk inhibitorv aktivnost, nego takode imaju Btk-selektivnu inhibitornu aktivnost uzimajući u obzir druge kinaze.

Biološki Primer 2

Merenje aktivacije B ćelija ili aktivacije T ćelija korišćenjem humanih PBMC

[0128]10 mmol/L rastvor test jedinjenja u DMSO je raspodeljen u ploču sa 96 bunarića (Nunc) i 5x serija razblaženja je pripremljena korišćenjem DMSO. Razblaženje rastvora 100x koncentracije test jedinjenja je pripremljeno sa dodatnih 10* razblaženja sa RPMI1640 medijumom (sadrži 10% HI-FBS, 1% penicilin). Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su razblažene sa medijumom da se obezbedi gustina od 2 x 10f'ćelija/mL. 396 pL ćelijske suspenzije je dodato u ploču sa 96 bunarića u koju je već uneto 4 pL razblaženja rastvora 100* koncentracije test jedinjenja ili je već unet rastvarač (10% DMSO) i inkubacija je izvedena tokom 10 minuta na 37°C i 5% CO2. 10 pL rastvora anti-IgM antitela (Southern Biotech)/IL-4 (R & D Svstems) ili zrnasta suspenzija anti-CD3/CD28 antitela (Invitrogen Corporation) je dodata u ploču sa 96-bunarića i 90 pL ćelijske suspenzije koja je pripremljena kako je opisano iznad je takode dodata (finalne koncentracije: anti-IgM antitelo = 1 pg/mL, IL-4 = 3 ng/mL, i perlice anti-CD3/CD28 antitela = 2 x IO<6>perlica/mL). 10 pL medijuma je dodato u bunariće nestimulisanog uzorak umesto ovih nestimulisanih supstanci, i držanje na 37°C i 5% CO2je ponovo izvršeno. Inkubacija je izvedena tokom 16 sati u slučaju evaluacije aktivacije T ćelija i tokom 22 sata u slučaju evaluacije aktivacije B ćelija. 100 pL Cytofix pufera (BD Biosciences) je dodato; izvršeno je držanje tokom 15 minuta na 37°C; centrifugiranje 10 minuta na 1500 rpm je izvedeno; i uklonjen je supernatant. 200 pL Perm pufera II (BD Biosciences) na -20°C je dodata; ostvareno je držanje 30 minuta na ledu; centrifugiranje 10 minuta na 1500 rpm je izvršeno; i uklonjen je supernatant. 0.5 mL Stain pufera (BD Biosciences) je dodato i centrifugiranje je izvršeno tokom 10 minuta na 1500 rpm. 100 pL izmešanog rastvora antitela je dodato i inkubacija je izvedena tokom 30 minuta na ledu u mraku. Antitelo je bilo IO* razblaženje sa Stain puferom 1:1:1 smeše PerCP-obeleženog anti-CD3 antitela (BD Biosciences), AF488-obeleženog anti-CD20 antitelo (BD Biosciences), i PE-obeleženog anti-CD69 antitela (BD Biosciences). 0.4 mL Stain pufera je dodato i uklonjen je supernatant. 0.3 mL Stain pufera je dodato i ćelijski talog je suspendovan da se pripremi uzorak za FACS merenje. FACS analiza je koristila BD FACSCalibur (BD Biosciences) i CELLQuest Version 3.3 (BD Biosciences) softver za analizu podataka. CD69-pozitivni signal (srednji intenzitet fluorescencije) CD20-pozitivnih CD3-negativnih ćelija (B cells) ili CD3-pozitivnih CD20-negativnih ćelija (T ćelije) je izmeren. Nakon oduzimanja vrednosti za nestimulisani uzorak, % inhibicije sa upućivanjem na vrednost za stimulisani kontrolni uzorak je određen. % inhibicije je grafički ucrtan korišćenjem Prism (ver. 5.0U, GraphPad Soflvvare) i IC50 vrednost je određena.

[0129]Prema rezultatima, IC50 vrednosti jedinjenja predmetnog pronalaska za CD69-pozitivni signal za B ćelije su bile, na primer, 0.061 pM za jedinjenje iz Primera 19(2). S druge strane, IC50 vrednosti jedinjenja predmetnog pronalaska za CD69-pozitivni signal za T ćelije je bio > 10 pM za prethodno jedinjenje. Prema tome. pokazano je da jedinjenja imaju selektivno inhibitorno delovanje na aktivaciju B ćelija.

Biološki primer 3

Procena stabilnosti mikrozoma jetre kod čoveka i pacova

(1) Priprema rastvora test jedinjenja

[0130]0.25 mmol/L rastvor je pripremljen razređivanjem test jedinjenja (10 mmol/L DMSO rastvor, 5 pL) sa vodenim 50% acetonitrilnim rastvorom (195 pL).

(2) Priprema 0-minutnog uzorka reakcije

[0131]245 pL 0.1 mol/L fosfatnog pufera (pH 7.4) koji sadrži 0.5 mg/mL pacovskih i humanim mikrozoma jetre (XenoTech) i NADPH-Co-faktora (BD Biosciences) je dodato u reaktor koji je prethodno bio zagrejan na 37°C; pre-inkubacija je izvšena tokom 5 minuta; i prethodno naveden rastvor test jedinjenja (5 pL) je dodat i reakcija je započeta. 20 pL je sakupljeno odmah nakon početka i reakcija je prekinuta dodavanjem 180 pL acetonitrila koji je sadržao interni standard (varfarin). 20 pL ovog rastvora je mešano sa 180 pL vodenog 50% acetonitrilnog rastvora na filter ploči za depleciju proteina koja je praćena filtracijom uz pomoć sukcije, i filtrat je korišćen kao standardni uzorak.

3) Priprema 15-minutnog uzorka reakcije

(0132JPrethodno navedeni reakcioni rastvor je inkubiran tokom 15 minuta na 37°C, i 20 pL je zatim dodato u 180 pL hladnog acetonitrila (sadržao je interni standard varfarin) da zaustavi reakciju. 20 pL ovoga je izmešano sa 180 pL vodenog 50% acetonitrilnog rastvora na filter ploči za depleciju proteina koja je praćena filtrađjom uz pomoć sukcije, i filtrat je korišćen kao standardni uzorak.

(4) Procena metode i rezultata

[0133]Rezidualni odnos (%) je izračunat injektiranjem 1 pL rastvora uzorka u LC-MS/MS; deljenjem količnika oblasti pika za uzorak reakcije (oblast pika za test jedinjenje/oblast pika za interni standard) sa količnikom oblasti pika za standadni uzorak; i množenjem rezultujuće vrednosti sa 100.

[0134]Sledeća su korišćena kao test jedinjenja: jedinjenja predmetnog pronalaska i 1-{(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoksifenil)-lH-pirazolo[3,4-d]pirimidin-l-il]-l-piperidinil}-2-propen-l-on (komparativno jedinjenje A) i l-{3-[4-amino-3-(4-fenoksifenil)-l H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1 -il]-1 -pirolidinil}-2-propin-1 -on (komparativno jedinjenje B). koja su tipična jedinjenja opisana u Patentnom Dokumentu 1 koja imaju pirazolopirimidin kostur. Rezidualni odnos (%) test jedinjenja kod mikrozoma jetre pacova i čoveka je bio kao Što je prikazano u Tabeli 2 ispod.

[0135]Rezultati pokazuju da su jedinjenja predmetnog pronalaska mnogo stabilnija u humanim mikrozomima jetre nego komparativna jedinjenja.

Biološki primer 4

Merenje inhibitorne aktivnosti enzima koji metabolišu lekove (inhibitorno dclovanje na humani CYP2C8 i humani CYP2C19)

[Eksperimentalna metoda]

[0136]Reakcija je izvršena na ploči sa 96 bunarića. Pozitivne kontrolne supstance (CYP2C8: ketokonazol, CYP2CI9: tranilcipromin) su podešeni (CYP2C8: 0.6 i 6 mmol/L, CYP2C19: 0.9 i 9 mmol/L) sa DMSO do koncentracija koje su bile 300 puta finalna koncentracija, i rastvori su pripremljeni (CTP2C8: 8 i 80 pmol/L. CYP2C19: 12 i 120 pmol/L) pomoću 75* razblaženja sa prečišćenom vodom koja je sadržala 2.7% acetonitril. Test jedinjenja su podešena do 0.3 i 3 mol/L sa DMSO i podešena su do 4 i 40 pmol/L pomoću 75* razblaženja sa prečišćenom vodom koja je sadržala 2.7% acetonitrila. Reakciona smeša je zatim pripremljena (numeričke vrednosti su finalne koncentracije) dodavanjem pufera kalijum fosfata (pH 7.4), magnezijum hlorida (5 mol/L), supstrata (CYP2C8: dibenzilfluorescein 1 pmol/L, CYP2C19: 3-cijano-7-etoksikumarin 25 pmol/L), iE. coli-eksprimirani mikrozom jetre CYP2C8 (Cypex, 10 pmol/L) i CYP2CT9 (Cypex, 3 pmol/L). 100 pL ove reakcione smeše i 50 pL test jedinjenja koji su pripremljeni kao što je iznad opisano i pozitivni kontrolni rastvor pripremljen kako je iznad opisano su raspodeljeni u svaki bunarić i preinkubacija je izvršena tokom 10 minuta na 37°C. Reakcija je započeta dodavanjem 50 pL NADPH rastvora (finalna koncentracija = 1 mmol/L) i inkubacija je izvršena tokom 30 minuta na 37°C. Intenzitet fluorescencije je izmeren (CYP2C8: talasna dužina ekscitacije - 485 nm, talasna dužina fluorescencije = 538 nm; CYP2C19: talasna dužina ekscitacije = 409 nm, talasna dužina fluorescencije = 460 nm) odmah nakom dodavanja NADPH i nakon inkubacije od 30 minuta. % inhibicije je uzet da bude % smanjenja (% inhibicije) intenziteta fluorescencije u poređenju sa kontrolom u koju je dodat DMSO umesto rastvora test jedinjenja i reakcija je izvršena i izračunat je korišćenjem sledeće formule.

Inhibicija (%) = 100 - {(intenzitet fluorescencije nakon reakcije test jedinjenja - intenzitet fluorescencije pre reakcije test jedinjenja) / (intenzitet fluorescencije nakon kontrolne reakcije

- intenzitet fluorescencije pre kontrolne reakcije) x 100}

[0137]IC50 vrednost je uzeta da bude < 1 pM kada je % inhibicije pri 1 pmol/L bio najmanje 50%; je uzet da bude > 10 pmol/L kada % inhibicije pri 10 pmol/L niej bio više od 50%; i između prethodnih (ne više od 50% pri 1 pmol/L i najmanje 50% pri 10 pmol/L) je izračunat korišćenjem sledeće formule

Gde su a i b su nagib i prekid linearne regresione linije y = ax + b koja prolazi kroz sledeće dve tačke: koncentracija od 1 pmol/L, % inhibicije i koncentracija od 10 pmol/L, % inhibicije.

[0138]IC50 vrednosti komparativnih jedinjenja i jedinjenja predmetnog pronalaska su izmerena korišćenjem metode koja je opisana iznad.

[0139]Rezultati su bili kao što sledi: za komparativno jedinjenje A i komparativno jedinjenje B, IC50 vrednosti za CYP2C8 su 4.7 pM i 6.9 pM. redom, i IC50 vrednosti za CYP2C19 su 5.6 pM i 8.1 pM, redom. S druge strane, za jedinjenja predmetnog pronalaska, na primer, jedinjenje iz Primera 19(2), ima IC50 vrednosti za CYP2C8 i CYP2C19 od > 10 pM. Prema tome, jedinjenja predmetnog pronalaska su pokazana da imaju slabije CYP inhibitorno dejstvo od komparativnih jedinjenja.

Biološki primer 5

Merenje citotoksičnosti i sposobnosti smanjenja mitohondrijalnog membranskog potencijala u kulturi ćelija humanog hepatoma

[0140]Tkivo koje sadrži aerobni ekviiibrijum, npr., bubrezi i srce, i tkivo koje je izloženo visokim koncentracijama leka i obavlja metabolizam lekova, npr., jetra, su poznati kao osetljivi na mitohondrijalnu disfunkciju (Drug Discovery Today, 12 (17-18), 777-785. 2007). Smanjenje ili gašenje mitohondrijalnog membranskog potencijala pomoću leka je izazvano direktnom inhibicijom sistema transporta elektrona, odvajanjem transporta elektrona od ATP sintaze, ili otvaranjem mitohondrijalnog membranskog permeabilnog tranzicionog otvora. Kao posledica, merenje mitohondrijalnog membranskog potencijala ćelija jetre može da obezbedi parametar za hepatotoksičnost. [0141 [Humane ćelije jetre su zasađene u ploču sa 96 bunarića koji su obloženi kolagenom u gustini ćelija od 30,000 ćelija/bunariću i inkubacija je sprovedena preko noći u inkubatoru na 37°C u 5% CCb-95% vazduhu. Kultivisane ćelije su bojene tokom 1 sata sa 5,5',6,6'-tetrahidro-],l\3,3Metrametil-benzamidazolokarbocijanin jodidom (JC-1) što je praćeno sa tretmanom test jedinjenjem. Test jedinjenje je rastvoreno u DMSO i zatim razblaženo sa tečnim medijumom za kulture Medijum za kulture hepatocita (Hepatocvte Culture Medium. HCM) i dodato ćeli jama. Koncentracije test jedinjenje za tretman su bile 0, 6.25. 12.5, 25. 50, 100, 200, i 400 pmol/L. Nakon izlaganja test jedinjenju tokom 24 sata, merenje je izvršeno na čitaču ploča SpectraMax (Molecular Devices, LLC) na talasnoj dužini ekscitacije od 485 nm i talasnoj dužini fluorescencije 538 nm i talasnoj dužini ekscitacije od 544 nm i i talasnoj dužini fluorescencije 590 nm. Membranski potencijal je određen količnikom između vrednosti merenja na 544 nm/590 nm i vrednosti merenja na 485 nm/538 nm Nakon ovoga, ATP koncentracija u ćelijama je izmerena korišćenjem seta Celltiter Glo luminescent assay kit (Promega Corporation) da bi se procenila ćelijska toksičnost test jedinjenja. Ćelije su lizirane pomoću test pufera koji je obezbeđen setom za merenje i koncentracija ATP-a koji je oslobođen iz ćelija je izmerena korišćenjem luciferin-luciferaza enzimske aktivnosti kao indikatora. Emisija je izmerena korišćenjem čitača ploča SpectraMax. Sposobnost test jedinjenja da snizi mitohondrijalni membranski potencijal i citotoksičnost test jedinjenja su predtavljeni koncentracijom (IC50 vrednost) koja uzrokuje smanjenje od 50% u mitohondrijalnom membranskom potencijalu i ATP koncentracije redom. Sposobnost smanjenja mitohondijalnog membranskog potencijala test jedinjenja i citotoksičnosti test jedinjenja su date u Tabeli 3 ispod.

[0142]Rezultati su pokazali da su obe IC50 vrednosti bile niže za jedinjenje predmetnog pronalaska nego za komparativna jedinjenja.

[Primeri formulacija]

Primer formulacije 1

[0143]Komponente navedene ispod su izmešane pomoću standardne metode i tabletirane da se dobije 10 000 tableta koje su sadržale 10 mg aktivne komponente u svakoj tableti

■ 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoil)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on 100 g

kalcij um karboksimeti l celuloza (disintegrant) 20 g magnezijum stearat (lubrikant) 10 g

mikrokristalna celuloza 870 g

INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST

[0144]Jedinjenja predmetnog pronalaska su jedinjenja koja. dodatno tome što imaju Btk-selektivnu inhibitornu aktivnost, ispoljavaju odličnu metaboličku sposobnost i mogu izbeći hepatotoksičnost, i kao posledica su korisni kao veoma sigurni terapijski agensi za bolesti u kojima učestvuju B ćelije ili mastociti.

Claims (2)

1. 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoiO^ 8-on, ili njegova so.

2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 koje je 6-amino-9-[(3R)-l-(2-butinoil)-3-pirolidinil]-7-(4-fenoksifenil)-7.9-dihidro-8H-purin-8-on.