ES2617921T3 - Excipientes para estabilizar partículas virales - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la preparación de una solución acuosa, estable durante el almacenamiento, lista para su uso, que se proporciona en un envase sellado y que contiene partículas virales vivas, procedimiento que comprende: (a) proporcionar una solución que comprende: - agua o solución salina fisiológica, que está opcionalmente tamponada con un tampón fisiológicamente aceptable; - partículas virales vivas de Adenoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Flaviviridae o Herpesviridae; - un excipiente que es una N,N-di(alquil C1-6)-glicina o N,N,N-tri(alquil C1-6)-glicina, o una sal o un éster fisiológicamente aceptable de las mismas; - opcionalmente uno o más azúcares; y - opcionalmente un compuesto de sulfona de fórmula (IIC): **Fórmula** en la que Ra y Rb representan independientemente alquilo C1-6; y (b) sellar la solución en un recipiente.

Description

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DESCRIPCION
Excipientes para estabilizar partfculas virales Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a formulaciones de virus estables durante el almacenamiento.
Antecedentes de la invencion
Algunas moleculas biologicas son tan suficientemente estables que pueden aislarse, purificarse y despues almacenarse en solucion a temperatura ambiente. Sin embargo, esto no es posible para muchos materiales y se han probado tecnicas que implican el almacenamiento a baja temperatura, adicion de estabilizadores, liofilizacion, formacion de vacfo y secado al aire para garantizar la auto-preservacion. A pesar de la disponibilidad de estas tecnicas, algunos materiales biologicos todavfa muestran niveles insatisfactorios de estabilidad durante el almacenamiento y algunas tecnicas conducen a coste e inconvenientes anadidos. Por ejemplo, el transporte y almacenamiento refrigerados es caro. Ademas, el transporte refrigerado no esta frecuentemente disponible para el transporte de medicinas tales como vacunas en pafses en vfas de desarrollo.
En particular, los estreses del secado por congelacion o liofilizacion pueden ser muy daninos para algunos materiales biologicos. La liofilizacion de productos biofarmaceuticos implica congelar soluciones o suspensiones de biomateriales termosensibles, seguido de secado primario y secundario. La tecnica se basa en la sublimacion del agua a temperatura bajo cero a vacfo sin la fusion de la solucion. La liofilizacion representa una etapa clave para la fabricacion de protefna solida y productos farmaceuticos para vacunas. La velocidad de difusion del vapor de agua del biomaterial congelado es muy baja y, por tanto, el procedimiento requiere tiempo. Adicionalmente, tanto las etapas de congelacion como de secado introducen estreses que son capaces de desplegar o desnaturalizar protefnas.
Las protefnas son moleculas con estructuras primaria, secundaria, terciaria y, en algunos casos, cuaternaria, definidas. La estructura desempena una funcion importante en dar a una protefna su funcion biologica especffica. Desafortunadamente, la complejidad estructural de los productos farmaceuticos biologicos tales como las protefnas los hace susceptibles a diversos procedimientos que producen inestabilidad estructural y funcional. Deben protegerse la integridad conformacional y los grupos funcionales de la degradacion.
La inestabilidad puede ser una consecuencia de una variedad de reacciones covalentes y no covalentes o modificaciones en solucion. La degradacion se clasifica generalmente en dos categorfas principales: en primer lugar degradacion ffsica o degradacion de via no covalente y en segundo lugar la via de degradacion covalente.
Las protefnas pueden degradarse mediante procedimientos ffsicos tales como adsorcion interfacial y agregacion que puede reducir significativamente una potencia y estabilidad del farmaco de protefna. Una segunda consecuencia es que el despliegue mediado por la adsorcion en una interfase puede ser frecuentemente una etapa de inicio para la agregacion irreversible de la protefna en solucion. La exposicion del nucleo de protefna en una superficie hidrofoba puede producir la adsorcion como consecuencia de estreses inducidos por agitacion, temperatura o pH; todos los cuales pueden conducir a agregacion.
Las protefnas pueden someterse a modificacion qufmica tal como oxidacion, isomerizacion, hidrolisis, reordenamiento de disulfuros, eliminacion beta, desamidacion y formacion de aductos. Los principales mecanismos hidrolfticos de degradacion incluyen hidrolisis de enlaces peptfdicos, desamidacion de asparagina y glutamina, y la isomerizacion de acido aspartico. Una caracterfstica comun de la via de degradacion hidrolftica es que una variable de formulacion significativa, con respecto a las velocidades de las reacciones, es el pH.
Como la estabilidad de la protefna puede afectar significativamente la seguridad y eficacia de un agente terapeutico, la composicion de componentes en una formulacion biofarmaceutica puede afectar el grado de degradacion de las protefnas. El metodo de formulacion de un producto biofarmaceutico tambien puede afectar la facilidad y frecuencia de administracion.
Debido a problemas relacionados con la inestabilidad y la agregacion, la mayorfa de las actuales formulaciones estables de protefnas no son formulaciones lfquidas. Normalmente, las protefnas se secan por congelacion (liofilizan) para proporcionar formulaciones estables de protefnas. En las formulaciones frecuentemente hay un agente de carga. Las formulaciones secadas por congelacion se distribuyen y se conservan en forma seca, normalmente como un polvo, en un vial sellado, ampolla o jeringa. Por ejemplo, el documento WO 97/04801 describe formulaciones liofilizadas estables de anticuerpos anti-IgE que tienen que reconstituirse inmediatamente antes de uso.
El documento WO-A-2006/0850082 informa de un producto desecado o preservado que comprende un azucar, un material cargado tal como una protefna de histona y un componente biologico de desecacion o termosensible. El
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azucar forma una matriz amorfa solida. Sin embargo, la histona puede tener consecuencias inmunologicas si el componente biologico preservado se administra a un ser humano o animal.
El documento WO 2008/114021 describe un metodo de preservacion de partfculas virales. El metodo comprende secar una solucion acuosa de uno o mas azucares, una polietilenimina y las partfculas virales para formar una matriz amorfa solida que comprende las partfculas virales. La solucion acuosa contiene la polietilenimina a una concentracion de 15 pM o menos basada en la masa molar promedio en numero (Mn) de la polietilenimina y la concentracion de azucar o, si esta presente mas de un azucar, la concentracion de azucar total es mayor de 0,1 M.
El documento WO 2010/035001 describe un metodo de preservacion de un polipeptido en el que se seca una solucion acuosa del polipeptido, por ejemplo se seca por congelacion, en presencia de uno o mas azucares y una polietilenimina (PEI). La composicion secada resultante normalmente se proporciona como un polvo seco estable en un vial sellado, ampolla o jeringa. Una solucion se reconstituye del polvo con el fin de administrar el polipeptido a un paciente, por ejemplo, mediante inyeccion.
El secado, y especialmente la liofilizacion, son, sin embargo, procedimientos costosos y que requieren tiempo. Serfa ventajoso si su uso pudiera evitarse. Los materiales biologicamente activos frecuentemente sufren una perdida de actividad tras el calentamiento y secado. Adicionalmente, la necesidad de reconstituir un polvo secado por congelacion en un disolvente antes del uso del polipeptido es un inconveniente. De hecho, puede conllevar riesgos para el paciente o profesional medico que realiza la etapa de reconstitucion si el procedimiento no se lleva a cabo correctamente.
Asf, es ventajoso para proporcionar formulaciones lfquidas de virus y protefna que no requieren reconstitucion con el fin de ser usado. Por consiguiente, hay una demanda de formulaciones de virus y protefna inyectables lfquidas estables. Hay una demanda de formulaciones de anticuerpo inyectables lfquidas estables altamente concentradas.
Sumario de la invencion
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que las soluciones acuosas listas para uso estables durante el almacenamiento de partfculas virales pueden proporcionarse por el uso de ciertos excipientes y opcionalmente uno, dos o mas azucares. Estas formulaciones retienen la estabilidad a largo plazo. Pueden prepararse sin una etapa de secado o de liofilizacion. Evitan la necesidad de reconstituir una solucion de un polvo secado por congelacion antes de uso. Tambien se ha encontrado que estos excipientes y opcionalmente uno, dos o mas azucares pueden preservar partfculas virales durante la fabricacion. Ademas, se ha encontrado que estos excipientes y opcionalmente uno, dos o mas azucares pueden preservar muestras tomadas de un ser humano o animal.
La presente invencion proporciona un procedimiento para la preparacion de una solucion acuosa estable durante el almacenamiento lista para uso que se proporciona en un envase sellado y que contiene partfculas virales vivas, procedimiento que comprende:
(a) proporcionar una solucion que comprende:
- agua o solucion salina fisiologica, que esta opcionalmente tamponada con un tampon fisiologicamente aceptable;
- partfculas virales vivas de Adenoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Flaviviridae o Herpesviridae;
- un excipiente que es una N,N-di(alquil C1-6)-glicina o N,N,N-tri(alquil C1-6)-glicina, o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas;
- opcionalmente uno o mas azucares; y
- opcionalmente un compuesto de sulfona de formula (IIC):
imagen1
(IIC)
en la que Ra y Rb representan independientemente alquilo C1-6; y
(b) sellar la solucion en un recipiente.
En un aspecto del procedimiento de la invencion, las partfculas virales son de un adenovirus, virus de la variolovacuna, virus de la gripe o virus del sarampion.
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En otro aspecto del procedimiento de la invencion, el excipiente es N,N-dimetilglicina o N,N,N-trimetilglicina, o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, el excipiente es N,N-dimetilglicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de la misma.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, el uno o mas azucares comprenden sacarosa o manitol.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion el uno o mas azucares comprenden sacarosa y rafinosa.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, el compuesto de sulfona de formula (IIC) es metilsulfonilmetano.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, la solucion comprende ademas:
(a) un adyuvante;
(b) un agente de ajuste de la tonicidad; y/o
(c) un conservante.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, la solucion es isotonica.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, la solucion se proporciona en un envase sellado bajo nitrogeno.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, el recipiente sellado es un vial sellado, ampolla, jeringa, cartucho, bolsa flexible o botella de vidrio.
En un aspecto adicional del procedimiento de la invencion, la solucion se pasa a traves de un filtro de esterilizacion en la etapa (a).
La presente invencion tambien proporciona una solucion acuosa estable durante el almacenamiento lista para uso que contiene partfculas virales vivas que se proporciona en un envase sellado, siendo dicho solucion acuosa obtenible por un procedimiento de la invencion.
Breve descripcion de las fiauras
La Figura 1a muestra el efecto de las formulaciones de prueba sobre la actividad recuperada de formulaciones de adenovirus mantenidas a 4 °C durante una semana. Barras grises y blancas representan formulaciones de prueba. Las figuras en el eje x se refieren a la concentracion en M. Las barras negras representan muestras de control. "Inicial" = tftulo de virus de entrada para el almacenamiento, "PBS" = formulacion que no contiene excipiente adicional, "Azucares" = formulacion que comprende sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM. Barras de error = estandar de la media, n = 3.
La Figura 1b muestra el efecto de las formulaciones de prueba sobre la actividad recuperada de formulaciones de adenovirus que contienen azucares (sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM) mantenidas a 4 °C durante una semana. Barras grises y blancas representan formulaciones de prueba. Las figuras en el eje x se refieren a concentraciones en M. Las barras negras representan muestras de control, "Inicial" = tftulo de virus de entrada antes del almacenamiento, "PBS" - formulacion que no contiene excipientes adicionales, "Azucares" = formulacion que comprende sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM. Barras de error = error estandar de la media, n =
3.
La Figura 1c muestra el efecto de las formulaciones de prueba sobre la actividad recuperada de formulaciones de adenovirus que no contienen azucares mantenidas a 37 °C durante una semana. Barras grises y blancas representan formulaciones de prueba. Las figuras en el eje x se refieren a concentracion en M. Las barras negras representan muestras de control, "Inicial" = tftulo de virus de entrada antes del almacenamiento, "PBS" = formulacion que no contiene excipientes adicionales, "Azucares" = formulacion que comprende sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM, Barras de error = error estandar de la media, n = 3.
La Figura 1d muestra el efecto de las formulaciones de prueba sobre la actividad recuperada de formulaciones de adenovirus que contienen azucares (sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM), mantenidas a 37 °C durante una semana. Barras grises y blancas representan formulaciones de prueba. Las figuras en el eje x se refieren a la concentracion en M. Las barras negras representan muestras de control, "Inicial" = tftulo de virus de entrada antes del almacenamiento, "PBS" = formulacion que no contiene excipientes adicionales, "Azucares" = formulacion que comprende sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM, Barras de error = error estandar de la media, n = 3.
La Figura 2 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 2 en el que se evaluo que la capacidad de once formulaciones para estabilizar adenovirus contra la exposicion termica tras 7 dfas a 37 °C.
La Figura 3 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 3 en el que se evaluo la capacidad de once formulaciones para estabilizar MVA contra la exposicion termica a 37 °C durante 7 dfas.
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La Figura 4 muestra una representacion del espacio de diseno en el Ejemplo 4. Los cfrculos numerados representan formulaciones dentro del espacio de diseno que se prueba. Este diseno es un diseno de RSM de CCF. Los numeros en cfrculos se refieren a I.D. de muestra en la Tabla 3.
La Figura 5 resume la estadfstica del modelo usado para representar los datos en el Ejemplo 4.
La Figura 6 muestra terminos retenidos en el modelo despues del ajuste en el Ejemplo 4. Las barras de error que no cruzan el origen indican un factor significativo al 95 % de IC.
La Figura 7 es una representacion de respuesta de superficie del tftulo viral recuperado predicho en las formulaciones de TMG y manitol en el Ejemplo 4.
La Figura 8 es una captura de pantalla de los parametros y salidas de las predicciones optimas basadas en el modelo de los datos en el Ejemplo 4, generadas usando simulaciones de Monte-Carlo. La formulacion marcada (lfnea 4) es el optimo identificado.
La Figura 9 muestra una representacion 3D del espacio de diseno en el Ejemplo 5. Esferas representan formulaciones dentro del espacio de diseno que se prueba. Este diseno es un diseno de RSM de Doehlert.
La Figura 10 resume la estadfstica del modelo usado para representar los datos en el Ejemplo 5.
La Figura 11 muestra terminos retenidos en el modelo en el Ejemplo 5 despues del ajuste. Barras de error que no cruzan el origen indican un factor significativo al 95 % de IC.
La Figura 12 es un grafico de respuesta de superficie del tftulo viral predicho usando el modelo del Ejemplo 5 en formulaciones de DMG y sacarosa a tres niveles diferentes de rafinosa, concretamente: "Baja" = rafinosa a 0 mM, "Media" = rafinosa a 150 mM, "Alta" = rafinosa a 300 mM.
La Figura 13 muestra una captura de pantalla de los parametros y salidas de las predicciones optimas basadas en el modelo de los datos en el Ejemplo 5, generadas usando simulaciones de Monte-Carlo. La optima predicha marcada es la concentracion de sacarosa de 0,5 M, concentracion de DMG 0,4 M y concentracion de rafinosa de 272,5 mM.
La Figura 14 muestra un grafico de region optima usando el modelo derivado del Ejemplo 5. La Figura 14A es una grafica de contornos donde una cruz marca el optimo predicho. La coloracion indica el nivel de variable. La Figura 14B es un grafico que marca la region de modelo donde la actividad viral recuperada predicha es mayor o igual a la salida.
La Figura 15 muestra la actividad viral recuperada de diversas formulaciones despues de 6 meses de almacenamiento a +4 °C en el Ejemplo 6.
La Figura 16 muestra la actividad viral recuperada para la 'mejor' formulacion en el Ejemplo 6 que comprende sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM y DMG 0,7 M en cada momento de tiempo y exposicion termica.
La Figura 17 muestra la reduccion en la actividad viral recuperada con el tiempo a exposicion termica de +37 °C en diversas formulaciones en el Ejemplo 6.
La Figura 18 muestra una representacion del espacio de diseno en el Ejemplo 7. Los cfrculos numerados representan formulaciones dentro del espacio de diseno que se probaron. Este diseno es un diseno de RSM de CCF.
La Figura 19 resume la estadfstica del modelo usado para representar los datos en el Ejemplo 7.
La Figura 20 muestra terminos retenidos en el modelo en el Ejemplo 7 despues del ajuste. Las barras de error que no cruzan el origen indican un factor significativo al 95 % de iC.
La Figura 21 muestra un grafico de contornos del tftulo viral recuperado predicho en formulaciones de DMG y manitol en el Ejemplo 7.
Descripcion detallada de la invencion
Sumario
Se proporcionan soluciones acuosas estables de partfculas virales segun la invencion. Las soluciones son lfquidos farmaceuticamente aceptables esteriles que pueden administrarse a un paciente sin tener que reconstituirse de, por ejemplo, un polvo seco inmediatamente antes de uso.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a la preservacion de partfculas virales por un derivado de glicina N-alquilado o una sal o un ester del mismo, y un compuesto de sulfona de formula (IIC). El derivado de glicina N- alquilado y el compuesto de sulfona pueden interaccionar sinergicamente para estabilizar las partfculas virales en un entorno lfquido.
Las soluciones pueden tomar la forma de volumenes parenterales pequenos de 100 ml o menos o volumenes parenterales grandes de 100 ml o mas. Las soluciones son lfquidos farmaceuticamente aceptables esteriles que pueden administrarse a un paciente sin tener que reconstituirse de, por ejemplo, un polvo seco inmediatamente antes de uso.
Las soluciones son capaces de presentar estabilidad durante el almacenamiento a largo plazo. Pueden, por tanto, almacenarse durante 6 a 18 meses o mas en un frigorffico, es decir, a temperaturas de 2 a 8 °C. En algunos casos, las soluciones pueden almacenarse a temperatura ambiente durante tales periodos de tiempo. Las soluciones asf poseen suficiente estabilidad para permitir que sean fabricadas en una fabrica, distribuidas, por ejemplo, a mayoristas farmaceuticos y farmacias, y guardadas antes de uso sin que se produzca un nivel de degradacion inaceptable.
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Normalmente, las soluciones se proporcionan como liquidos claros. Las soluciones son normalmente incoloras. Adicionalmente, pueden comprender un tampon fisiologicamente aceptable y/o un agente de ajuste de la tonicidad y/o un conservante. Las soluciones pueden asf ser isotonicas. Las soluciones se tapan en un recipiente apropiado en un vial, ampolla, jeringa, cartucho, bolsa flexible o botella de vidrio. Asf se fabrican en forma lista para uso en una fabrica. Por tanto, no han sido reconstituidas de una composicion solida tal como un liofilizado inmediatamente antes de uso.
Los excipientes de la invencion pueden preservar ademas partfculas de virus durante la fabricacion de soluciones de dichas partfculas de virus.
Partfculas virales
Las partfculas virales usadas en la presente invencion estan vivas y pueden ser virus completos. Un virus vivo es capaz de infectar y replicarse dentro de la celula huesped. Las partfculas pueden ser partfculas similares a virus (VLP) o nucleocapsides. El virus puede ser infeccioso para celulas procariotas o eucariotas. El virus puede ser un virus humano o de animal.
La partfcula viral puede ser, o puede derivarse de, un virus de ADNbc, un virus de ADNmc, un virus de ARNbc, un virus de ARNmc(+),un virus de ARNmc(-), un virus de ARNmc-RT o un virus de ADNbc-RT. La partfcula viral es, o puede derivarse de, un virus de las siguientes familias:
1. Adenoviridae tales como los adenovirus A, B, C, D, E o F humanos que incluyen los serotipos Ad5, Ad2, Ad4, Ad6, Ad24, Ad35, Ad36 humanos;
2. Flaviviridae tales como el virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la hepatitis C;
3. Orthomyxoviridae tales como los virus de la gripe A, B, C que incluyen, pero no se limitan a, serotipos del virus de la gripe A H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9H2, H7N2, H7N3 y N10N7;
4. Paramyxoviridae tales como el virus paragripal 1 humano, virus del sarampion y virus de las paperas;
5. Parvoviridae tales como virus adeno-asociado;
6. Picornaviridae tales como virus de la poliomielitis humana, virus de la enfermedad de pies y boca (incluyendo los serotipos O, A, C, SAT-1, SAT-2, SaT-3 y Asia-1);
7. Poxviridae tales como el virus de la variolovacuna, virus de la viruela y poxvirus aviar (viruela aviar); y
8. Herpesviridae tales como el virus del herpes simple, por ejemplo, VHS1 o VHS2, virus del herpes humano 1, 3, 4, 5 o 6;
En una realizacion preferida, la partfcula viral puede ser o puede derivarse de un virus Adenoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae o Poxviridae. En una realizacion particularmente preferida, la partfcula viral puede ser o puede derivarse de un adenovirus, virus de la variolovacuna, virus de la gripe, o virus del sarampion.
Las partfculas similares a virus (VLP) incluyen protefnas virales derivadas de las protefnas estructurales de un virus, pero carecen de acido nucleico viral. Cuando se expresan en exceso, estas protefnas estructurales virales se auto- ensamblan espontaneamente en partfculas. Las VLP son incompetentes en la replicacion. En algunas realizaciones, las VLP son protefnas virales incorporadas dentro de una bicapa lipfdica. Ejemplos de VLP incluyen VLP derivadas de fago, VLP de la protefna de la capside mayor L1 del virus del papiloma humano (VPH), VLP de la protefna de la capside del virus de Norwalk y VLP ensambladas de protefnas estructurales del virus de la gripe tales como protefna M1, protefna de hemaglutinina HA y protefna de neuraminidasa N1.
Las partfculas virales pueden prepararse usando tecnicas convencionales muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, puede prepararse un virus infectando celulas huesped cultivadas con la cepa de virus que va a usarse, permitiendo que la infeccion progrese de forma que el virus se replique en las celulas cultivadas y pueda ser liberado por metodos convencionales conocidos en la tecnica para recoger y purificar virus.
Derivados de glicina
El excipiente es una N,N-di(alquil C1-C6)- o N,N,N-tri(alquil C1-C6)-glicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas. El grupo alquilo normalmente es un grupo alquilo C1-4. Grupos alquilo preferidos estan seleccionados de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo. Metilo y etilo son particularmente preferidos.
Derivados de glicina preferidos para su uso en la invencion son N,N-dimetilglicina, N,N,N-trimetilglicina y sales fisiologicamente aceptables y esteres de las mismas. La N,N-dimetilglicina tambien se llama dimetilglicina (DMG) o acido 2-(dimetilamino)-acetico. La N,N,N-trimetilglicina se llama trimetilglicina (TMG) por brevedad y se ha mencionado anteriormente como un compuesto de betafna.
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La sal normalmente es una sal con un acido fisiologicamente aceptable y asf incluye aquellas formadas con un acido inorganico tal como acido clorhfdrico o sulfurico o un acido organico tal como acido cftrico, tartarico, malico, maleico, mandelico, fumarico o metanosulfonico. Se prefiere la sal de clorhidrato.
El ester normalmente es un ester de alquilo Ci-6, preferentemente un ester de alquilo C1-4. El ester puede, por tanto, ser el ester de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o terc-butilo. Se prefiere ester de etilo.
Soluciones que contienen derivados de glicina N-alquilados y compuestos de sulfona
1. Derivados de glicina N-alquilados
El derivado de glicina N-alquilado es una N,N-di(alquil C1-6)- o N,N,N-tri(alquil C1-6)-glicina. El grupo alquilo normalmente es un grupo alquilo C1-4. Grupos alquilo preferidos estan seleccionados de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo. Metilo y etilo son particularmente preferidos.
Derivados de glicina preferidos para su uso en la invencion son N,N-dimetilglicina, N,N,N-trimetilglicina. La N,N- dimetilglicina tambien se llama dimetilglicina (DMG) o acido 2-(dimetilamino)-acetico. La N,N,N-trimetilglicina se llama trimetilglicina (TMG).
Puede emplearse una sal fisiologicamente aceptable o ester de un derivado de glicina N-alquilado. Asf:
- La sal normalmente es una sal con un acido fisiologicamente aceptable y asf incluye aquellas formadas con un acido inorganico tal como acido clorhfdrico o sulfurico o un acido organico tal como acido cftrico, tartarico, malico, maleico, mandelico, fumarico o metanosulfonico. Se prefiere la sal de clorhidrato.
- El ester normalmente es un ester de alquilo C1-6, preferentemente un ester de alquilo C1-4. El ester puede, por tanto, ser el ester de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o terc-butilo. Se prefiere ester de etilo.
2. Compuestos de sulfona
El compuesto de sulfona es un compuesto de formula (IIC):
imagen2
(IIC)
en la que Ra y Rb representan independientemente alquilo C1-6, por ejemplo alquilo C1-4. Grupos alquilo preferidos estan seleccionados de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo y terc-butilo. Metilo y etilo son particularmente preferidos. Un compuesto de sulfona preferido es metilsulfonilmetano (MSM), que tambien se conoce como dimetilsulfona (DMSO2).
Azucares
Azucares adecuados para su uso en la presente invencion incluyen azucares reductores tales como glucosa, fructosa, gliceraldehfdos, lactosa, arabinosa y maltosa; y preferentemente azucares no reductores tales como sacarosa y rafinosa. El azucar puede ser un monosacarido, disacarido, trisacarido, u otros oligosacaridos. El termino "azucar" incluye alcoholes de azucar.
Se preven monosacaridos tales como galactosa y manosa; disacaridos tales como sacarosa, lactosa y maltosa; trisacaridos tales como rafinosa; y tetrasacaridos tales como estaquiosa. Tambien son adecuadas trehalosa, umbeliferosa, verbascosa, isomaltosa, celobiosa, maltulosa, turanosa, melecitosa y melibiosa para su uso en la presente invencion. Un alcohol de azucar adecuado es manitol.
La preservacion de la actividad viral es particularmente eficaz cuando se usan dos o mas azucares. Pueden usarse dos, tres o cuatro azucares. Preferentemente, se usan los dos azucares sacarosa y rafinosa. La sacarosa es un disacarido de glucosa y fructosa. La rafinosa es un trisacarido compuesto de galactosa, fructosa y glucosa.
Disolvente acuoso
El disolvente acuoso es generalmente agua. Se usa generalmente agua pura tal como agua para inyecciones. Alternativamente, puede usarse solucion salina fisiologica.
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Otros componentes
La solucion acuosa puede tamponarse. Puede usarse cualquier tampon fisiologicamente aceptable adecuado tal como un tampon fosfato. Normalmente, el pH se ajustara a de 4 a 9, preferentemente entre 5 y 8, y especialmente de aproximadamente pH 6,5 a 7,5. El pH exacto dependera, por ejemplo, de la estabilidad en solucion acuosa de las partfculas virales.
Para fines de estabilidad, las soluciones de la presente invencion deben protegerse de la contaminacion y el crecimiento microbianos. Un conservante puede, por tanto, estar presente, por ejemplo en una cantidad del 0,001 al 1 % en peso. Ejemplos de agentes antimicrobianos farmaceuticamente aceptables que pueden usarse en la formulacion incluyen:
- compuestos de amonio cuaternario (por ejemplo cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, cetrimida y cloruro de cetilpiridinio);
- agentes mercuriales (por ejemplo, nitrato fenilmercurico, acetato fenilmercurico y timerosal);
- agentes alcoholicos (por ejemplo, clorobutanol, alcohol feniletflico y alcohol bencflico);
- esteres antibacterianos (por ejemplo, esteres de acido para-hidroxibenzoico);
- agentes quelantes tales como edetato de disodio (EDTA); y
- otros agentes antimicrobianos tales como clorhexidina, clorocresol, acido sorbico y sus sales y polimixina.
La presencia de un agente de ajuste de la tonicidad es algunas veces deseable para lograr la isotonicidad con lfquidos corporales que producen niveles reducidos de irritacion tras la administracion a un paciente. Ejemplos de agentes de ajuste de la tonicidad adecuados son cloruro sodico, dextrosa y cloruro de calcio. El agente de ajuste de la isotonicidad se anadira deseablemente en una cantidad suficiente para lograr esta funcion. Preferentemente, el agente de ajuste de la tonicidad esta presente en una cantidad de entre el 0,1 y el 10 % en peso.
Otros aditivos pueden estar presentes tambien tales como agentes co-solubilizantes y adyuvantes. Un adyuvante esta generalmente presente cuando una solucion de la invencion se usa como una vacuna. El adyuvante se usa con el fin de aumentar la potencia de la vacuna y/o modular las respuestas inmunitarias humorales y celulares.
Adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales minerales (por ejemplo, hidroxido de aluminio ("alumbre"), fosfato de aluminio, fosfato de calcio), adyuvantes en partfculas (por ejemplo, virosomas, ISCOM (complejo estructurado de saponinas y lfpidos)), derivados microbianos (por ejemplo, MPL (monofosforil lfpido A), motivos CpG, toxinas modificadas que incluyen adyuvantes de TLR tales como flagelina), derivados de planta (por ejemplo, saponinas (QS-21)) y adyuvantes inmunoestimulantes endogenos (por ejemplo, citocinas y cualquier otra sustancia que actue de agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la vacuna).
Produccion de soluciones de la invencion
Pueden prepararse soluciones de la invencion mezclando las partfculas virales y otros componentes en cualquier orden conveniente en el disolvente acuoso seleccionado. Las partfculas virales se proporcionan en la cantidad requerida, por ejemplo en una cantidad de dosificacion unitaria. Una cantidad farmaceuticamente eficaz de las partfculas virales puede asf proporcionarse en la solucion.
Generalmente, una preparacion de las partfculas virales se mezcla con una solucion acuosa del (de los) excipiente(s) y opcionalmente uno o mas azucares. Los componentes de la solucion pueden mezclarse bajo condiciones esteriles. Alternativamente, los componentes de la solucion pueden mezclarse primero y esterilizarse la solucion resultante. Por ejemplo, el (los) excipiente(s) y/o azucares opcionales pueden anadirse durante la fabricacion de partfculas virales, de manera que las partfculas virales se estabilicen durante la fabricacion, ademas de en el producto final. En algunos casos, sin embargo, puede desearse eliminar el (los) excipiente(s) y/o azucares opcionales en una etapa de purificacion antes de la formulacion del producto final.
La solucion con la que las partfculas virales se mezclan puede tamponarse o la solucion puede tamponarse despues de la mezcla con las partfculas virales. Puede ser una solucion acuosa de HEPES, tamponada con fosfato, tamponada con Tris o pura. El pH puede ajustarse segun se desee. Normalmente, una solucion tendra un pH de 4 a 9, preferentemente de 5 a 8, y especialmente aproximadamente pH 6,5 a 7,5.
El excipiente y, opcionalmente uno o mas azucares, estan presentes a concentraciones que proporcionan soluciones de estabilidad durante el almacenamiento requerida. El excipiente puede ser un excipiente de la invencion como se define en el presente documento. Concentraciones adecuadas pueden determinarse y optimizarse por experimentacion rutinaria. Las concentraciones usadas en un caso particular dependeran de varios factores que incluyen:
- las partfculas virales particulares;
- el excipiente que esta siendo usado;
- si estan presentes uno o mas azucares y, si es asf, la identidad del o de cada azucar.
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El excipiente y azucar(es) pueden estar presentes en cantidades que producen interacciones sinergicas entre el excipiente y el (los) azucar(es). Por ejemplo, pueden surgir interacciones sinergicas entre (a) sulfonas tales como MSM y rafinosa, y (b) N,N-dialquilglicinas tales como DMG y sacarosa. Pueden determinarse concentraciones adecuadas y optimizarse por experimentacion rutinaria.
La concentracion del compuesto de derivado de glicina o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo o compuesto de formula (IIC) o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo en la solucion acuosa esta generalmente en el intervalo de 0,001 M a 2,5M y mas especialmente de 0,01 M a 2,5 M. Por ejemplo, el intervalo de concentracion puede ser de 0,1 M a 2,5 M. La concentracion particular del compuesto de derivado de glicina o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo o compuesto de formula (IIC) o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo que se emplea dependera de varios factores que incluyen las partfculas virales; el compuesto de derivado de glicina particular o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo o compuesto de formula (IIC) o sal fisiologicamente aceptable o ester del mismo que se usa; si estan presentes uno, dos o mas azucares y la identidad del (de los) azucar(es).
La concentracion de una N,N-dialquil- o N,N,N-trialquil-glicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas en la solucion acuosa esta generalmente en el intervalo de 0,1 mM a 3 M o de 1 mM a 2M. La concentracion puede ser de 1 mM a 1,5 M o de 5 mM a 1 M. Concentraciones preferidas son de 7 mM a 1,5 M o de 0,07 M a 0,7 M. La concentracion particular de una N,N-dialquil- o N,N,N-trialquil-glicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas que se emplea dependera de varios factores que incluyen las partfculas virales; si se usa uno o mas azucares y, si es asf, el tipo de azucar(es) particular(es) usado(s). Asf:
- Concentraciones preferidas de la N,N-dialquil- o N,N,N-trialquil-glicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas cuando no esta presente azucar son de 5 mM a 1,5 M o de 7 mM a 1 M o a 0,7 M. Concentraciones mas preferidas son de 0,023 M a 0,7 M, o de 0,07 M a 0,7 M, tal como aproximadamente 0,07 M.
- Concentraciones preferidas de una N,N-dialquil- o N,N,N-trialquil-glicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas cuando estan presentes uno o mas azucares son generalmente mas bajas y en el intervalo de 1 mM a 1 M o de 5 mM a 1 M. Concentraciones mas preferidas son de 0,007 M a 0,7 M tal como aproximadamente 0,007 M.
Los componentes estan presentes a concentraciones que proporcionan soluciones de la estabilidad durante el almacenamiento requerida. Pueden determinarse concentraciones adecuadas y optimizarse por experimentacion rutinaria. El derivado de glicina N-alquilado o sal o un ester del mismo y el compuesto de sulfona de formula (IIC) pueden asf estar presentes en cantidades que producen sinergia. Las concentraciones usadas en un caso particular dependeran de varios factores que incluyen:
- las partfculas virales particulares que van a estabilizarse;
- el excipiente que esta siendo usado;
- si estan presentes uno o mas azucares y, si es asf, la identidad del o de cada azucar.
En particular:
- la concentracion del derivado de glicina N-alquilado o sal o un ester del mismo en la solucion acuosa para el secado esta generalmente en el intervalo de 0,1 mM a 3 M o de 1 mM a 2 M. La concentracion puede ser de 1 mM a 1,5 M o de 5 mM a 1 M. Concentraciones preferidas son de 7 mM a 1,5 M, de 0,07 M a 0,7 M, 0,1 M a 1,5 M o de 0,5 M a 1,25 M, y/o
- la concentracion del compuesto de sulfona de formula (IIC) en la solucion acuosa para el secado esta generalmente en el intervalo de 0,1 mM a 3 M, de 1 mM a 2 M o de 0,2 mM a 1 M tal como de 0,35 mM a 1 M, de 3,5 mM a 0,5 M, de 0,035 M a 0,5 M o de 0,035 M a 0,25 M. La concentracion puede ser de 0,1 M a 1,5 M o de 0,5 M a 1,25 M.
Cuando esta presente en las soluciones de la invencion, la concentracion de azucar o la concentracion total de azucares es al menos 0,01 M, normalmente hasta saturacion. Generalmente, la concentracion de azucar es al menos 0,1 M, al menos 0,2 M o al menos 0,5 M hasta saturacion, por ejemplo, saturacion a temperatura ambiente o hasta 3 M, 2,5 M o 2 M. La concentracion de azucar puede, por tanto, oscilar de, por ejemplo, 0,1 M a 3 M o 0,2 M a 2 M. Alternativamente, la concentracion de azucar o la concentracion total de azucar si esta presente mas de un azucar puede, por tanto, oscilar de 0,08 M a 3 M, de 0,15 M a 2 M o de 0,2 M a 1 M. Un intervalo adecuado es de 0,05 a 1 M.
Cuando esta presente mas de un azucar en las soluciones de la invencion, preferentemente uno de aquellos azucares es sacarosa. La sacarosa puede estar presente a una concentracion de 0,05 M, 0,1 M, 0,25 M o 0,5 M hasta saturacion, por ejemplo, saturacion a temperatura ambiente o hasta 3 M, 2,5 M o 2 M.
La relacion de la concentracion molar de sacarosa con respecto a la concentracion molar del (de los) otro(s) azucar(es) normalmente es de 1:1 a 20:1, tal como de 5:1 a 15:1. En el caso cuando estan presentes dos azucares,
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y en particular cuando estan presentes sacarosa y rafinosa, por tanto, la relacion de concentraciones molares de sacarosa normalmente es de 1:1 a 20:1 tal como de 5:1 a 15:1 y p refe rente me nte aproximadamente 10:1. Soluciones particularmente preferidas contienen los siguientes componentes:
- Sacarosa a una concentracion de 0,8 M a 1,2 M, por ejemplo aproximadamente 1 M; TMG a una concentracion de 0,8 a 1,2 M, por ejemplo aproximadamente 1 M; y/o rafinosa a una concentracion de 200 a 400 mM, por ejemplo aproximadamente 300 mM. Normalmente, una solucion tal comprende MVA.
- Sacarosa a una concentracion de 0,8 M a 1,2 M, por ejemplo aproximadamente 1 M; y/o MSM a una concentracion de 0,75 a 1,15 M, por ejemplo aproximadamente 0,95 M. A estas concentraciones puede surgir una interaccion sinergica entre mSm y sacarosa. Normalmente, una solucion tal comprende adenovirus.
- Sacarosa a una concentracion de 0,3 M a 0,7 M, por ejemplo aproximadamente 0,5 M; DMG a una concentracion de 0,2 a 0,6 M, por ejemplo aproximadamente 0,4 M;
y/o rafinosa a una concentracion de 200 a 400 mM, por ejemplo aproximadamente 275 mM. A estas concentraciones puede surgir una interaccion sinergica entre dMg y rafinosa. Normalmente, una solucion tal comprende adenovirus.
El pH de una solucion de la invencion puede ajustarse segun se desee. Normalmente, una solucion tendra un pH de 4 a 9, preferentemente de 5 a 8 y especialmente aproximadamente pH 6,5 a 7,5.
Una solucion de la invencion esta libre de pirogenos. La solucion esta asf esterilizada. Una solucion puede ser esterilizada pasandola a traves de un filtro esterilizante. La solucion esterilizada puede entonces introducirse en recipientes, tales como viales, que entonces se cierran hermeticamente. Alternativamente, puede tener lugar la esterilizacion, por ejemplo, por esterilizacion en autoclave despues de que la solucion haya sido sellada en un recipiente.
La solucion puede asf proporcionarse en un vial sellado, ampolla, jeringa, cartucho, bolsa flexible o botella de vidrio. Como parenteral de volumen pequeno (SVP), puede proporcionarse en un cartucho desechable, jeringa desechable, vial, ampolla o bolsa flexible. Como parenteral de volumen grande (LVP) puede proporcionarse en un vial, bolsa flexible, botella de vidrio o, en algunos casos, como una jeringa desechable.
Preferentemente, los recipientes son viales con tapones no reactivos. El tapon puede estar recubierto u orientado a Teflon™. Se contemplan tapones de caucho de silicona u otros tapones no reactivos.
Los cartuchos, jeringas, viales y ampollas estan normalmente compuestos de vidrio de tipo I o II, o polipropileno. Las bolsas flexibles normalmente se construyen con plastico multicapa. Los tapones y tabiques en cartuchos, jeringas y viales normalmente estan compuestos de materiales elastomericos. Los puertos de entrada (medicacion) y salida (administracion) para bolsas flexibles pueden ser materiales plasticos y/o elastomericos. Puede usarse una envoltura completa con bolsas flexibles para retardar la perdida de disolvente y para proteger el sistema de embalaje flexible de la manipulacion brusca.
Las soluciones de la invencion pueden usarse segun se desee, dependiendo de las partfculas virales en solucion. La solucion puede ser extrafda de un envase sellado, por ejemplo, por una jeringa e inyectarse en un paciente por una via adecuada. La solucion puede asf administrarse por inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal. Una solucion puede administrarse alternativamente por infusion. La solucion puede diluirse antes de la administracion.
Preservacion de partfculas virales durante la fabricacion
En algunas circunstancias, puede desearse el uso del excipiente de la invencion durante la fabricacion de una solucion de partfculas virales, con el fin de que las partfculas virales se preserven o estabilicen durante el procedimiento de fabricacion. Esto puede aumentar el rendimiento del procedimiento.
Normalmente, el excipiente de la invencion sera retenido en la solucion de partfculas virales y asf en el producto final. Esto puede ser ventajoso, ya que el excipiente de la invencion continuara estabilizando las partfculas virales en el producto final.
Alternativamente, puede haber algunas situaciones en las que sea preferible eliminar el excipiente de la invencion en una etapa de purificacion. Tal eliminacion puede llevarse a cabo por cualquier tecnica de purificacion adecuada conocida para aquellos expertos en la materia, tal como cromatograffa. El metodo de purificacion exacto dependera del excipiente que se use y las tecnicas adecuadas pueden ser facilmente seleccionadas por aquellos expertos en la materia.
Una vez se ha eliminado el excipiente, la solucion de partfculas virales normalmente se sella en un recipiente, tal como vial, ampolla, jeringa, cartucho, bolsa flexible o botella de vidrio.
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Preferentemente, la solucion se esteriliza, por ejemplo pasando la solucion a traves de un filtro esterilizante, antes de introducir la solucion en el recipiente. Alternativamente, puede ser preferible realizar el procedimiento de fabricacion y purificacion en condiciones esteriles, tal que el producto final sea esteril.
La concentracion del excipiente de la invencion es preferentemente como se explica anteriormente en "Produccion de soluciones de la invencion" anteriormente. La concentracion del (de los) azucar(es), donde esten presentes, tambien es preferentemente como se explica en "Produccion de soluciones de la invencion" anteriormente.
Medicion de la preservacion de partfculas virales
La preservacion en relacion con las partfculas virales se refiere a la resistencia de la partfcula viral a degradacion ffsica o qufmica y/o perdida de actividad biologica.
Metodos de ensayo de la actividad viral, tales como infectividad y/o inmunogenicidad, son muy conocidos para aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, crecimiento de un virus en un cultivo celular, deteccion de anticuerpo especffico de virus en sangre, capacidad para provocar respuestas de linfocitos T y/o B, deteccion de antfgenos virales, deteccion de ADN o ARN codificado por virus, u observacion de partfculas de virus usando un microscopio.
Ademas, la presencia de un virus da lugar a cambios morfologicos en la celula huesped, que pueden medirse para dar una indicacion de la actividad viral. Cambios detectables tales como estos en la celula huesped debido a infeccion viral se conocen como efecto citopatico. Los efectos citopaticos pueden consistir en redondeo de celulas, desorientacion, hinchamiento o encogimiento, muerte y desprendimiento de la superficie. Muchos virus inducen la apoptosis (muerte celular programada) en celulas infectadas, medible por tecnicas tales como el ensayo TUNEL (marcado de extremos cortados por dUTP mediado por uridin desoxinucleotidil transferasa terminal) y otras tecnicas muy conocidas para aquellos expertos en la materia.
Los virus tambien pueden afectar la regulacion de la expresion de los genes de la celula huesped y estos genes pueden analizarse para dar una indicacion de si esta presente actividad viral o no. Tales tecnicas pueden implicar la adicion de reactivos al cultivo celular para completar una reaccion enzimatica o qufmica con un producto de expresion viral. Ademas, puede modificarse el genoma viral con el fin de potenciar la deteccion de la infectividad viral. Por ejemplo, el genoma viral puede ser geneticamente modificado para expresar un marcador que puede ser facilmente detectado por microscopfa de contraste de fases, microscopfa de fluorescencia o por obtencion de imagenes por rayos X. El marcador puede ser una protefna fluorescente expresada tal como GFP (protefna verde fluorescente) o una enzima expresada que puede participar en una reaccion colorimetrica o de radiomarcado. El marcador tambien podrfa ser un producto genico que interrumpe o inhibe una funcion particular de las celulas que se prueban.
Puede usarse un ensayo para las unidades formadoras de placa para medir la infectividad viral y para indicar el tftulo viral. En este ensayo, se cultivan celulas huesped adecuadas sobre una superficie plana hasta que forman una monocapa de celulas que cubre una botella de plastico o placa. La seleccion de una celula huesped particular dependera del tipo de virus. Ejemplos de celulas huesped adecuadas incluyen, pero no se limitan a, CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, celulas WEHI, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HEK293 y celulas HeLa. La monocapa de celulas huesped se infecta entonces con las partfculas virales. El medio lfquido se sustituye por un semi-solido de manera que produzca partfculas de virus, como resultado de que una infeccion no puede alejarse del sitio de su produccion. Se produce una placa cuando una partfcula de virus infecta una celula, se replica, y entonces aniquila esa celula. Una placa se refiere a un area de celulas en la monocapa que muestra un efecto citopatico, por ejemplo que aparecen redondas y mas oscuras que otras celulas bajo el microscopio, o como puntos blancos cuando se visualizan a ojo; el centro de la placa puede carecer de celulas debido a la lisis inducida por virus. El virus recientemente replicado infecta las celulas de alrededor y tambien son aniquiladas. Este procedimiento puede repetirse varias veces. Las celulas se tinen entonces con un colorante tal como azul de metileno, que tine solo las celulas vivas. Las celulas muertas en la placa no se tinen y aparecen como areas sin tenir sobre un fondo coloreado.
Cada placa es el resultado de infeccion de una celula por un virus, seguido de replicacion y extension de ese virus. Sin embargo, los virus que no aniquilan celulas pueden no producir placas. Una placa se refiere a un area de celulas en una monocapa que muestra un efecto citopatico, por ejemplo que aparecen redondas y mas oscuras que otras celulas bajo el microscopio, o como manchas blancas cuando se visualizan a ojo; el centro de la placa puede carecer de celulas debido a la lisis inducida por virus. Una indicacion de tftulo viral se da midiendo las "unidades formadoras de placa" (UFP). Los niveles de infectividad viral pueden medirse en una muestra de material biologico preservada segun la presente invencion y en comparacion con muestras de control tales como virus recien recogidos o muestras sometidas a desecacion y/o variacion termica sin adicion de la mezcla de preservacion de la presente invencion.
Algunos tipos de partfculas virales de la invencion, tales como protefnas virales, VLP, o algunos virus inactivados, no tienen la capacidad de formar placas en el ensayo de placas. En este caso, la preservacion puede medirse por otros
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metodos tales como metodos para determinar la inmunogenicidad, que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, se conocen en la tecnica ensayos in vivo e in vitro para medir respuestas inmunitarias de anticuerpos o de huespedes mediadas por celulas y adecuadas para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, puede medirse una respuesta inmunitaria basada en anticuerpo comparando la cantidad, avidez y distribucion del isotipo de los anticuerpos del suero en un modelo animal, antes y despues de la inmunizacion usando la partfcula viral preservada de la invencion.
Usos de las partfculas virales preservadas de la invencion
Las soluciones de la invencion pueden usarse segun se desee. La solucion puede sacarse de un envase sellado, por ejemplo, por una jeringa e inyectarse en un paciente por una via adecuada. La solucion puede asf administrarse por inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal. Una solucion puede alternativamente administrarse por infusion. La solucion puede diluirse antes de la administracion.
Vacunas
Las soluciones de la presente invencion pueden encontrar uso como vacunas. Por ejemplo, las soluciones que contienen virus muertos completos, virus atenuados vivos, virus qufmicamente inactivados, VLP o vectores virales vivos son adecuadas para su uso como vacunas. Como vacuna pueden usarse las partfculas virales como antfgenos o para codificar antfgenos tales como protefnas virales para el tratamiento o la prevencion de varias afecciones que incluyen, pero no se limitan a, infeccion viral, secuelas de infeccion viral que incluyen, pero no se limitan a, toxicidad inducida por virus, cancer y alergias. Tales antfgenos contienen uno o mas epitopes que estimularan el sistema inmunitario de un huesped para generar una respuesta especffica de antfgeno humoral y/o celular.
Una vacuna de la invencion puede usarse para prevenir o tratar infeccion por virus tales como virus del papiloma humano (VPH), VIH, VHS2/VHS1, virus de la gripe (tipos A, B y C), virus paragripal, virus de la polio, virus VRS, rinovirus, rotavirus, virus de la hepatitis A, virus de Norwalk, enterovirus, astrovirus, virus del sarampion, virus de las paperas, virus de la varicela-zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus de la rubeola, virus linfotropico T humano de tipo I (HTLV-I), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis D, poxvirus y virus de la variolovacuna. La vacuna puede usarse ademas para proporcionar una respuesta inmunitaria adecuada contra numerosas enfermedades veterinarias, tales como enfermedad de pies y boca (incluyendo serotipos O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 y Asia-1), coronavirus, lengua azul, virus de la leucemia felina, gripe aviar, virus de Hendra y de Nipah, pestivirus, parvovirus canino y virus de la diarrea viral bovina. En una realizacion, la vacuna es una vacuna de subunidad, conjugada o multivalente. Por ejemplo, la vacuna de la invencion puede usarse para tratar infeccion por dos o mas tipos diferentes de virus tales como sarampion, paperas y rubeola (por ejemplo, vacuna de MMR).
Para medir la preservacion de la estabilidad de una vacuna preparada segun la presente invencion, la potencia de la vacuna puede medirse usando tecnicas muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la generacion de una respuesta inmunitaria celular o humoral puede probarse en un modelo animal apropiado monitorizando la generacion de anticuerpos o respuestas de celulas inmunitarias a la vacuna. La capacidad de las muestras de vacuna para desencadenar una respuesta inmunitaria puede compararse con vacunas no sometidas a la misma tecnica de preservacion.
Vectores virales
Puede usarse un virus o vector viral segun la presente invencion para transferir un gen heterologo u otra secuencia de acidos nucleicos a celulas diana. Adecuadamente, la secuencia heterologa (es decir, el transgen) codifica una protefna o producto genico que es capaz de ser expresado en la celula diana. Transgenes adecuados incluyen genes indicadores deseables, genes terapeuticos y genes que codifican polipeptidos inmunogenicos (para su uso como vacunas). La terapia genica, un enfoque para el tratamiento o la prevencion de enfermedades asociadas a expresion genica defectuosa, implica la insercion de un gen terapeutico en celulas, seguido de la expresion y produccion de las protefnas requeridas. Este enfoque permite la sustitucion de genes danados o la inhibicion de la expresion de genes no deseados. En particular, el virus o vector viral puede usarse en terapia genica para transferir un transgen terapeutico o gen que codifica polipeptidos inmunogenicos a un paciente.
En una realizacion preferida, la partfcula viral es un vector viral vivo. Por "vector viral vivo" se indica un vector viral vivo que es no patogeno o de baja patogenicidad por las especies diana y en el que se han insertado uno o mas genes que codifican antfgenos que estimulan una respuesta inmunitaria protectora contra otros virus o microorganismos, un gen indicador o una protefna terapeutica. En particular, el acido nucleico se introduce en el vector viral de tal forma que sea todavfa capaz de replicarse, expresando asf un polipeptido codificado por la secuencia de acidos nucleicos insertada y, en el caso de una vacuna, provocando una respuesta inmunitaria en el animal huesped infectado. En una realizacion, el vector viral vivo es un vector viral vivo atenuado, es decir, se modifica para ser menos virulento (causante de enfermedad) que el virus no mutante.
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La base de uso de virus recombinantes como posibles vacunas implica la incorporacion de genes especfficos de un organismo patogeno en el genoma de un virus no patogeno o atenuado. El virus recombinante puede entonces infectar celulas eucariotas especfficas tanto in vivo como in vitro, y hacerlas que expresen la protefna recombinante.
Pueden preferirse vacunas de vector viral vivo derivadas por la insercion de secuencias codificantes de genes de organismos enfermos con respecto a vacunas atenuadas vivas, vacunas inactivadas, enfoques de subunidad o de ADN. Una de las caracterfsticas de seguridad mas importantes de los vectores virales vivos es que los receptores pueden inmunizarse contra antfgenos especfficos de organismos patogenos sin exposicion al propio agente de enfermedad. La seguridad se regula ademas por la seleccion de un vector viral que esta tanto atenuado para el huesped como es incapaz de replicarse en el huesped, aunque todavfa es capaz de expresar el antfgeno heterologo de interes. Una cepa de vacuna que tiene una historia de seguridad en la especie diana ofrece una caracterfstica de seguridad adicional. Se han desarrollado varios sistemas en los que el vector tiene delecionado genes esenciales y la preparacion de la vacuna se lleva a cabo en sistemas de celulas que proporcionan la funcion que falta.
Puede usarse una variedad de vectores tales como vectores virales retrovirales, lentivirales, del virus del herpes, de poxvirus, adenovirales y adeno-asociados para la administracion de genes heterologos a celulas diana. El gen heterologo de interes puede insertarse en el vector viral. Los vectores virales de la invencion pueden comprender, por ejemplo, un vector de virus provisto de un origen de replicacion, opcionalmente un promotor para la expresion del gen heterologo y opcionalmente un regulador del promotor. Por ejemplo, adenovirus utiles en la practica de la presente invencion pueden tener deleciones en la region E1 y/o E3 y/o E4, o pueden de otro modo ser maximizados para recibir ADN heterologo.
El vector viral puede comprender un promotor constitutivo tal como un promotor del citomegalovirus (CMV), promotor del antfgeno T grande del SV40, promotor LTR del virus de tumor mamario de raton, promotor tardfo principal del adenovirus (MLP), el promotor LTR del virus de tumor mamario de raton, el promotor temprano del SV40, promotores de adenovirus tales como el promotor tardfo principal del adenovirus (Ad MLP), promotores del VHS (tales como los promotores IE del VHS), promotores del vPh tales como la region reguladora aguas arriba del VPH (URR) o promotor del virus del sarcoma de Rous, junto con otras secuencias de acidos nucleicos virales operativamente unidas al gen heterologo de interes. Tambien pueden usarse promotores especfficos de tejido o inducibles para controlar la expresion del gen heterologo de interes. Tambien pueden seleccionarse promotores para ser compatibles con la celula huesped para la que se disena la expresion.
El vector viral tambien puede comprender otros elementos moduladores de la transcripcion tales como potenciadores. Los potenciadores se definen ampliamente como un agente que actua en cis, que cuando esta operativamente unido a un promotor/secuencia de genes, aumentara la transcripcion de esa secuencia de genes. Los potenciadores pueden funcionar desde posiciones que estan mucho mas lejos de una secuencia de interes que otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, promotores) y pueden operar cuando se posicionan en cualquier orientacion con respecto a la secuencia de interes. Se han identificado potenciadores de varias fuentes virales, que incluyen virus del polioma, virus BK, citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus simio 40 (SV40), virus del sarcoma de Moloney, virus del papiloma bovino y virus del sarcoma de Rous. Ejemplos de potenciadores adecuados incluyen el potenciador del gen temprano del SV40, el potenciador/promotor derivado de la repeticion terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous, y elementos derivados de CMV humano o murino, por ejemplo, elementos incluidos en la secuencia A del intron del CMV.
El vector viral que contiene un gen heterologo de interes puede entonces preservarse segun el metodo de la invencion antes del almacenamiento, someterse a tecnicas de preservacion adicionales tales como liofilizacion, o administracion a un paciente o celula huesped.
Acidos nucleicos que codifican polipeptidos conocidos por mostrar actividad antiviral, moleculas inmunomoduladoras tales como citocinas (por ejemplo TNF-alfa, interleucinas tales como IL-6, y IL-2, interferones, factores estimulantes de colonias tales como GM-CSF), adyuvantes y moleculas co-estimulantes y accesorias pueden incluirse en el vector viral de la invencion. Alternativamente, tales polipeptidos pueden proporcionarse por separado, por ejemplo en la mezcla de preservacion de la invencion, o pueden administrarse simultaneamente, secuencialmente o por separado con vectores virales de la invencion.
Preferentemente, el vector viral preservado de la invencion puede introducirse en celulas huesped adecuadas usando una variedad de tecnicas virales que se conocen en la tecnica, tales como, por ejemplo, infeccion con vectores virales recombinantes tales como retrovirus, virus del herpes simple y adenovirus. Preferentemente, la administracion del vector viral preservado de la invencion que contiene un gen de interes esta mediada por infeccion viral de una celula diana.
Se han desarrollado varios sistemas basados en virus para transfectar celulas de mamffero.
Por ejemplo, una molecula de acido nucleico recombinante seleccionada puede insertarse en un vector y encapsidarse como partfculas retrovirales usando tecnicas conocidas en la tecnica. El virus recombinante puede entonces aislarse y administrarse a las celulas del sujeto tanto in vivo como ex vivo. Los vectores retrovirales
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pueden basarse en el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV). En un vector retroviral, uno o mas de los genes virales (gag, pol y env) estan generalmente sustituidos con el gen de interes.
Se conocen varios vectores de adenovirus. Comunmente se usan los serotipos 2 y 5 del subgrupo C de adenovirus como vectores. Los adenovirus pueden ser un adenovirus humano o no humano. El genoma del adenovirus no mutante tiene aproximadamente 35 kb de los que hasta 30 kb pueden sustituirse con ADN extrano.
Hay cuatro unidades transcripcionales tempranas (E1, E2, E3 y E4) que tienen funciones reguladoras, y un transcrito tardfo, que codifica protefnas estructurales. Los vectores de adenovirus pueden tener el gen E1 y/o E3 inactivado. El (Los) gen(es) ausente(s) pueden entonces suministrarse en trans tanto por un virus colaborador, plasmido, como integrarse en un genoma de celula colaboradora. Los vectores de adenovirus pueden usar un mutante sensible a la temperatura E2A o una delecion de E4. Vectores de adenovirus mfnimos pueden contener solo las repeticiones terminales invertidas (ITR) y una secuencia de encapsidacion alrededor del transgen, siendo todos los genes virales necesarios proporcionados en trans por un virus colaborador. Asf, vectores adenovirales adecuados incluyen vectores Ad4, Ad5, Ad7, Ad11, Ad14, Ad26, Ad35 y Ad36 y vectores de adenovirus de simio, preferentemente vectores Ad4, Ad5, Ad7, Ad35 y Ad36. Ad5 es el mas comunmente usado.
Tambien pueden derivarse vectores virales de la familia de virus pox, que incluye virus de la variolovacuna y poxvirus aviares tales como vacunas de la viruela aviar. Por ejemplo, el virus de la variolovacuna modificado Ankara (MVA) es una cepa de virus de la variolovacuna que no se replica en la mayorfa de los tipos de celulas, que incluyen tejidos humanos normales. Un vector de MVA recombinante puede, por tanto, usarse para administrar un polipeptido.
Tambien pueden usarse tipos de virus adicionales tales como virus adeno-asociado (AAV) y virus del herpes simple (HSV) para desarrollar sistemas de vector adecuados.
Administracidn
Las soluciones segun la presente invencion pueden administrarse a un sujeto in vivo usando una variedad de vfas y tecnicas conocidas. Las soluciones son adecuadas para administracion parenteral. Por ejemplo, las vacunas pueden proporcionarse como una solucion inyectable, suspension o emulsion y administrarse por via parenteral, subcutanea, oral, epidermica, intradermica, intramuscular, interarterial, intraperitoneal, inyeccion intravenosa usando una aguja y jeringa convencionales, o usando un sistema de inyeccion de chorro lfquido. Las vacunas pueden administrarse apicalmente a la piel o tejido mucoso, tal como por via nasal, intratraqueal, intestinal, sublingual, rectal o vaginal, o proporcionarse como un espray finamente dividido adecuado para administracion respiratoria o pulmonar.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.
Estadistica
En algunos de los ejemplos se calcularon los siguientes valores estadfsticos:
R2= coeficiente de determinacion. Una medida de la bondad del ajuste. R2<0,5 = baja significancia del modelo.
Q2 = estimacion de la precision de la prediccion. Una medida de la bondad de la prediccion. Q2 debe ser >0,1 para un modelo significativo. Q2 debe ser >0,5 para un buen modelo. R2-Q2 < 0,2 a 0,3
Validez del modelo (MV)= "una prueba de diversos problemas del modelo". Validez del modelo < 0,25 = indicador de problemas del modelo estadfsticamente significativos, por ejemplo, valores atfpicos, modelo incorrecto / transformacion.
Reproducibilidad (Rep) = medida de la variacion entre repeticiones en comparacion con la variabilidad global. Reproducibilidad > 0,5 implica significancia.
Se emplearon los siguientes materiales, equipo y tecnicas, a menos que se establezca de otro modo en los Ejemplos 1 a 4:
Materiales
Celulas HEK-293 (ECACC 85120602)
DMSO (Sigma D1435, Lote 118K1455)
Sacarosa (Sigma 16104, Lote 70040)
Rafinosa (Sigma R0250, Lote 039K0016)
PBS (Sigma D8662, Lote 118K2339)
Agua (Sigma W3500, Lote 8M0411)
Viales de vidrio de 5 ml (Adelphi Tubes VCD005)
Viales de vidrio de 2 ml (Adelphi Tubes VCDIN2R)
Tapones de liofilizacion de 14 mm (Adelphi Tubes FDIA14WGB)
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Tapas de 14 mm (Adelphi Tubes CWPP14)
GFP de adenovirus (cat. de Vector Bio labs 1060) Glicina (Sigma, G7126, 118K00181)
N,N-DMG (Sigma D1156; Lote 077K1856)
SMM (Sigma, 64382, 1339210)
TMG (Sigma, B2629, 1089K1201)
Equipo
Liofilizador Modulyo D (Thermofisher)
Vitrina de clase de seguridad II HERA (Thermofisher)
Estufa de incubacion de CO2 Binder (Binder)
Camara de prueba de ciclado termico APT line TM MK Binder (Binder) Estufa de incubacion Thermo Scientific MaxQ 4450 (Thermofisher) Balanza KERN EW220-3NM (VWR)
Congelador a -45 °C Elcold (VWR)
Congelador a -80 °C serie Forma 900 (Thermofisher)
Lector de microplacas Sinergia HT (Biotek)
Ejemplo 1
Formulacion de virus
Se uso adenovirus recombinante (Vector Biolabs) que expresa GFP (protefna verde fluorescente) potenciada bajo un promotor del CMV para facilitar la deteccion durante el ensayo.
En este estudio se probaron cuatro compuestos glicinergicos y una tetina para la eficacia como conservante (de adenovirus) a una concentracion final de 0,07-0,70 M, tanto en co-formulaciones con azucares (sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM) como en su ausencia. Los compuestos glicinergicos probados fueron glicina, sarcosina (mono- metilglicina), DMG (Di-metilglicina), TMG (tri-metilglicina). La tetina probada fue SMM (S-metil-metionina). El virus se formulo con mezclas de excipiente con el fin de probar su eficacia en preservar la actividad viral durante un periodo de exposicion termica. Cada mezcla de excipientes mas virus (vease la Tabla 1, a continuacion) se preparo como una solucion madre en PBS y se anadieron 300 pl a viales de vidrio de 5 ml apropiadamente marcados.
Tabla 1 - Sumario de tratamientos, cada sistema por triplicado. S = Si, N= No. Donde la concentracion de azucares __________________________presentes = sacarosa ^ 1 M, rafinosa 100 mM._________________________
Excipiente
Conc. (M) ^Azucares? Exposicion termica (°C) Excipiente Conc. (M) ^Azucares? Exposicion termica (°C)
DMG
0,70 S 4 DMG 0,7 S 37
DMG
0,23 S 4 DMG 0,23 S 37
DMG
0,07 S 4 DMG 0,07 S 37
DMG
0,70 N 4 DMG 0,70 N 37
DMG
0,23 N 4 DMG 0,23 N 37
DMG
0,07 N 4 DMG 0,07 N 37
Glicina
0,70 S 4 Glicina 0,70 S 37
Glicina
0,23 S 4 Glicina 0,23 S 37
Glicina
0,07 S 4 Glicina 0,07 S 37
Glicina
0,70 N 4 Glicina 0,70 N 37
Glicina
0,23 N 4 Glicina 0,23 N 37
Glicina
0,07 N 4 Glicina 0,07 N 37
Sarcosina
0,70 S 4 Sarcosina 0,70 S 37
Sarcosina
0,23 S 4 Sarcosina 0,23 S 37
Sarcosina
0,07 S 4 Sarcosina 0,07 S 37
Sarcosina
0,70 N 4 Sarcosina 0,70 N 37
Sarcosina
0,23 N 4 Sarcosina 0,23 N 37
Sarcosina
0,07 N 4 Sarcosina 0,07 N 37
TMG
0,70 S 4 TMG 0,70 N 37
TMG
0,23 S 4 TMG 0,23 S 37
5
10
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20
25
30
35
40
45
Excipiente
Conc. (M) ^Azucares? Exposicion termica (°C) Excipiente Conc. (M) ^Azucares? Exposicion termica (°C)
TMG
0,07 S 4 TMG 0,07 S 37
TMG
0,70 N 4 TMG 0,70 N 37
TMG
0,23 N 4 TMG 0,23 N 37
TMG
0,07 N 4 TMG 0,07 N 37
SMM
0,70 S 4 SMM 0,70 S 37
SMM
0,23 S 4 SMM 0,23 S 37
SMM
0,07 S 4 SMM 0,07 S 37
SMM
0,70 N 4 SMM 0,70 N 37
SMM
0,23 N 4 SMM 0,23 N 37
SMM
0,07 N 4 SMM 0,07 N 37
Ninguno
0,00 S 4 Ninguno 0,00 S 37
Ninguno
0,00 N 4 Ninguno 0,00 N 37
Exposicion termica
Se dispusieron tres duplicados de cada tratamiento a 4 °C, y otros 3 a 37 °C, durante un periodo de 7 dfas. En este momento todas las muestras se dispusieron a 4 °C hasta que fue practico ensayarlos.
Ensayo de adenovirus
Se sembraron celulas permisivas al adenovirus (HEK 293, ECACC 85120602) en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos (VWR, RU) a 105 celulas por ml (100 pl por pocillo) y se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de alcanzar el 90 % de confluencia, los viales que contenfan el adenovirus mas excipiente se sacaron del frigorffico y se produjeron diluciones 1 en 10, y 1 en 100, por dilucion sucesiva en DMEM. Entonces se anadieron 100 pl de cada una de las diluciones resultantes (1 en 10 y 1 en 100) a los pocillos de la placa que contenfan celulas HEK 293. Adicionalmente, se uso otra muestra de adenovirus, de la misma fuente y con el mismo tftulo (en almacenamiento a -80 °C) en los tratamientos de excipiente, se descongelo y se uso para producir una serie de diluciones 1 en 10 (en DMEM). Las diluciones que oscilaban de 1 en 10 a 1 en 106 tambien se anadieron a pocillos individuales que contenfan HEK 293. A las 48 horas, despues de la inoculacion, se conto el numero de celulas GFP (protefna verde fluorescente) por pocillo usando microscopfa fluorescente, y esto se convirtio posteriormente en ufp/ml de las muestras tratadas, teniendo en cuenta el volumen aplicado y la dilucion del inoculo.
Resultados y discusion
Actividad viral recuperada despues de 1 semana a 4 °C (Figura 1a y b) (glicinergicos y SMM SIN azucar anadido o CON azucar anadido, respectivamente)
Despues de una semana a 4 °C de las muestras adenovirales formuladas en PBS solo, la actividad viral recuperada fue un 46 % del tftulo original. Sin embargo, la formulacion junto con azucares (sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM) produjo una mejora de la recuperacion al 69 %. Todas las formulaciones de adenovirus junto con glicinergicos o SMM y en ausencia de azucares produjeron una recuperacion del 52-71 %. Aunque esto represento una mejora significativa con respecto a PBS, incluso las mejores formulaciones glicinergicas o de SMM dieron una recuperacion que es solo equivalente a la de los azucares (vease la Figura 1a). Cuando los glicinergicos o SMM se formularon junto con azucares, la actividad viral recuperada no se potencio adicionalmente (50-72 %). En ambos casos (es decir, glicinergicos o SMM en presencia o ausencia de azucares) no hubo dependencia clara de la dosis, es decir, no hubo una clara correlacion entre la actividad viral recuperada y la concentracion de glicinergico o SMM (vease la Figura 1b).
La actividad viral recuperada despues de 1 semana a 37 °C (Figura 1c y d) (glicinergicos y SMM SIN azucar anadido o CON azucar anadido, respectivamente)
Despues de una semana a 37 °C de las muestras adenovirales formuladas en PBS solo, la actividad viral recuperada fue del 25 % del tftulo original. La formulacion junto con azucares (sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM) potencio la recuperacion al 38 %.
El uso de glicinergicos en el extremo mas alto del intervalo de concentracion probado y como el unico excipiente produjeron eficacia mejorada con respecto a PBS solo, y en cada caso se observo una fuerte correlacion positiva entre la concentracion de glicinergico y la actividad viral recuperada. Con respecto al intervalo de concentracion probado (0,07 a 0,70 M), la actividad se potencio del 29 % al 45 % en el caso de glicina, del 29 % al 49 % con
5
10
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20
25
30
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45
sarcosina, del 27 % al 41 % con DMG, y del 21 a 45 % con TMG. Con cada glicinergico en el intervalo de concentracion probado, los mejores resultados se lograron con la concentracion mas alta probada y fue posible recuperar la actividad viral como alta o mayor que cuando se usan azucares como el unico formulante (vease la Figura 1c).
El uso de los siguientes glicinergicos, glicina, sarcosina y DMG, a traves del intervalo de concentracion probado completo junto con azucares produjo eficacia mejorada con respecto a PBS solo. Con la excepcion de las concentraciones de sarcosina y DMG mas bajas, la recuperacion tambien fue superior a la de los azucares solos. En cada caso se observo una fuerte correlacion positiva entre la concentracion de glicinergico y la actividad viral recuperada. Por encima del intervalo de concentracion probada (0,07 a 0,70 M) la actividad se potencio del 41 % al 54 % en el caso de glicina, del 37 % al 56 % con sarcosina y del 37 % al 52 % con DMG (vease la Figura 1d).
Una excepcion fue que cuando TMG se co-formulo con azucares se observo algun tipo de efecto antagonista. Esto produjo una correlacion negativa entre la concentracion de TMG y la actividad recuperada. La actividad vario con la concentracion de TMG del 45 % a 0,07 M al 38,7 % a 0,70M. Estos datos sugieren que los azucares alteran la concentracion optima de TMG, ya que se observa una interaccion positiva entre TMG y azucares a 0,07 M y una negativa a 0,70M, pero la actividad recuperada nunca supera la que se ha observado como posible con TMG solo (vease la Figura 1d). Finalmente, SMM preserva la actividad adenoviral cuando se usa como el unico formulante en el intervalo 0,07 M a 0,23 M (la actividad recuperada es del 33 % y 43 %, respectivamente).
Ejemplo 2 - Estabilizacion de adenovirus
Se emplearon los siguientes materiales, equipos y tecnicas, a menos que se establezca de otro modo en el ejemplo 2 y Ejemplo 3:
Materiales
Productos quimicos
Dimetilglicina (DMG) (Sigma D1156, Lote 077K1856)
Dimetilsulfona (MSM) (Sigma M81705, Lote 0001452516)
Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma D5796, Lote RNBB1139)
Suero bovino fetal (FBS) (Sigma F7524, Lote 109K3395)
Penicilina-estreptomicina (PS) (Sigma P4458, Lote 0409M00393)
Solucion salina de citrato de sodio (SSC) (Sigma S6639, Lote 020M8404)
Sacarosa (Sigma 16104, Lote SZB90120)
Agua (Sigma W3500, Lote RNBB1139)
Adenovirus Lfnea celular BHK-21 HEK 293
Productos biologicos
(cat. de Vector Biolabs 1060) (ECCAC CB2857)
(ECACC 85120602)
Otros
Viales de vidrio de 5 ml (Adelphi Tubes VCD005)
Tapones de liofilizacion de 14 mm (Adelphi Tubes FDIA14WGB) Tapas de 14 mm (Adelphi Tubes CWPP14)
Equipo
Vitrina de clase de seguridad II HERA Microscopio invertido LED DMIL Estufa de incubacion de CO2 Binder Congelador a -80 °C serie Forma 900 Balanza ATL-84-1 Atlion Estufa de incubacion a 37 °C IP250
(Thermo Fisher, EQP# 011 y 012) (Leica, EQP#062)
(Binder, EQP#014)
(Thermofisher, EQP#015) (Acculab, EQP#088)
(LTE, EQP#016)
Preparacion de preparaciones de virus liquidas
Se saco adenovirus humano recombinante Ad5 (Vector Biolabs) que expresa GFP (protefna verde fluorescente) potenciada bajo un promotor del CMV, y con un tftulo (pre-congelacion) de 6,7x105 ufp/ml en SSC, de almacenamiento a -80 °C y se dejo que se descongelara. Se anadieron alfcuotas de 50 pl a viales de vidrio de 5 ml. A estas muestras de virus de 50 pl se anadieron 250 pl de una mezcla de formulacion compuesta de DMG, MSM y opcionalmente sacarosa. Cada mezcla de formulacion se enraso en SSC. La concentracion de DMG, MSM y sacarosa en cada formulacion despues de la adicion a la muestra de virus se muestra en la Tabla 2:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tabla 2 - Formulaciones probadas
Formulacion
Sacarosa (M) MSM (M) DMG (M)
1
0,00 0,10 0,10
2
0,15 0,10 0,10
3
0,00 1,00 0,10
4
0,15 1,00 0,10
5
0,08 0,55 0,55
6
0,08 0,55 0,55
7
0,08 0,55 0,55
8
0,00 0,10 1,00
9
0,15 0,10 1,00
10
0,00 1,00 1,00
11
0,15 1,00 1,00
Los viales se taparon con tapon y con tapa (tapa roscada) antes de colocarse a 37 °C para exposicion termica. La exposicion termica fue durante 7 dfas, despues de lo cual todos los viales se devolvieron a 4 °C hasta que fue practico ensayarlos.
Ensayo para adenovirus infecciosos
Se sembraron placas de cultivo celular de fondo plano de 96 (VWR, RU) con celulas HEK 293 (ECACC 85120602) a 105 celulas por ml (100 pl por pocillo) y se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de alcanzar el 90 % de confluencia, las celulas se inocularon.
Se reconstituyeron viales que contenfan adenovirus mas excipiente en 300 pl de SSC. Entonces se hizo una etapa de dilucion 1 en 10 tomando 20 pl del vial reconstituido y anadiendo a 180 pl de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Se realizo otra dilucion 1 en 100 (de la muestra original) tomando 20 pl de la dilucion 1 en 10 y anadiendola a 180 pl de DMEM. Entonces se anadieron 100 pl de cada una de la dilucion resultante (1 en 10 y 1 en 100) a los pocillos de la placa que contenfa celulas HEK 293.
Adicionalmente, otra muestra de adenovirus, de la misma fuente y con el mismo tftulo (en almacenamiento a -80 °C) usada en los tratamientos de excipiente, se descongelo y se uso para producir una serie de dilucion 1 en 10 (en DMEM + 10 % de FBS). Tambien se anadieron diluciones que oscilaban de 1 en 10 a 1 en 106 a pocillos individuales que contenfan HEK 293. 48 horas despues de la inoculacion, se conto el numero de celulas de GFP (protefna verde fluorescente) por pocillo usando microscopfa fluorescente, y esto se convirtio posteriormente en ufp/ml de las muestras tratadas teniendo en cuenta el volumen aplicado y la dilucion del inoculo.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 2. Cuando los datos se analizaron por analisis de regresion lineal multiple (MLR) usando el programa MODDE 9.0 (Umetrics, Suecia), se observo un efecto sinergico cuando MSM y DMG se usaron en combinacion
Ejemplo 3: Estabilizacion de MVA
Preparacion de preparaciones de virus liquidas
Se recupero MVA de almacenamiento a -80 °C y se descongelo. Se anadieron alfcuotas de 50 pl a viales de vidrio de 5 ml. A estos viales se anadieron 250 pl de una mezcla de formulacion enumerada en la Tabla 1 anterior. Los viales se taparon con tapon y se ajustaron tapas roscadas para el sellado. Los viales se colocaron inmediatamente a 37 °C para exposicion termica. La exposicion termica fue durante 7 dfas, despues de lo cual todos los viales se devolvieron a 4 °C hasta que fue practico ensayarlos.
Ensayo para MVA infeccioso
Se sembraron placas de ensayo (96 pocillos) con celulas BHK-21 (100 pl por pocillo, 105 celulas/ml). Las celulas se diluyeron en DMEM complementado con 10 % de FBS y 1 % de PS. Las placas se colocaron a +37 °C, + 5 % de CO2 durante 1 a 2 horas.
Mientras tanto, se preparo una serie de dilucion de muestras de MVA formuladas (en el mismo medio de crecimiento) que oscilaba de 10"1 a 10"4. Cada serie de dilucion se preparo 4 veces. Se aplicaron 35 pl de cada dilucion a pocillos individuales que contenfan celulas BHK-21 y los pocillos se rellenaron con otros 65 pl de medio.
5
10
15
20
25
30
35
En el dfa 6 despues de la inoculacion, los pocillos se puntuaron para la presencia o ausencia de efecto citopatico (CPE) y se calculo TCID50. Entonces se usaron estas para estimar la concentracion de MVA infeccioso por ml en los viales termo-expuestos.
Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 4 Materiales
Productos quimicos
Proveedor Codigo de producto Lote N.°
20x SSC
Sigma S6639 020M8404
Medio Eagle modificado por Dulbecco Sigma
D5796 RNBB1139
Suero bovino fetal
Sigma F7524 109K3395
Penicilina-estreptomicina
Sigma P4458 0409M0093
Trimetilglicina
Sigma B2629 069K1514
Agua
Sigma W3500 8M0411
Productos biologicos
Proveedor Codigo de producto
Lfnea celular BHK-21
ECACC CB2857
MVA
ATCC VR-1508
Viales de vidrio de 5 ml Tapones de liofilizacion de 14 mm Tapas de 14 mm
Otros
Fabricante
Adelphi Tubes Adelphi Tubes Adelphi Tubes
Codigo de producto
VCD005
FDIA14WG/B
CWPP14
Vitrina de clase de seguridad II HERA Microscopio invertido LED DMIL Estufa de incubacion de CO2 Binder Congelador a -80 °C serie Forma 900 Balanza ATL-84-1 Atlion Estufa de incubacion a 37 °C IP250
Equipo
Fabricante Thermo Fisher Leica Binder
Thermo Fisher
Acculab
LTE
Equipo N.°
EQP# 011 y 012
EQP#062
EQP#014
EQP#015
EQP#088
EQP#016
Metodos
Diseno del experimento
Se uso MODDE 9.0 para generar un diseno central compuesto centrado en las caras (CCF) (vease la Figura 4). Los disenos de CCF son una forma de diseno del modelado de superficie de respuesta (RSM) que prueba solo tres niveles de cada factor, pero todavfa soporta un modelo cuadratico. A diferencia de los disenos de formulacion regulares, pueden eliminarse factores no significativos del analisis y asf no llegan a ser un factor de confusion.
Preparacion de y exposicion termica de MVA formulado en un entorno liquido
Se recupero MVA del almacenamiento a -80 °C y se descongelo. Se anadieron alfcuotas de 50 pl de MVA a 15 viales de vidrio de 5 ml. Posteriormente, se anadieron alfcuotas de 50 pl de virus a 15 viales de vidrio de 5 ml. A cada vial se mezclaron 250 pl de una mezcla de excipiente. Las formulaciones de mezcla de excipiente una vez mezcladas con virus se describen en la Tabla 3 y se enrasaron en SSC.
Tabla 3
Formulacion N.°
Sacarosa Rafinosa TMG Tftulo (ufp/ml)
(M)
(mM)
(M)
1
0,25 150,0 0,13 7,6E+04
2
0,75 150,0 0,13 3,0E+05
3
0,5 272,5 0,42 3,0E+05
4
0,25 27,5 0,71 3,0E+05
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Formulacion N.°
Sacarosa Rafinosa TMG Tftulo (ufp/ml)
(M)
(mM)
(M)
5
0,75 27,5 0,71 4,8E+05
6
0 150,0 1,00 1,9E+05
7
0,5 150,0 1,00 4,8E+05
8
0,5 150,0 1,00 4,8E+05
9
0,5 150,0 1,00 3,0E+05
10
1 150,0 1,00 3,0E+05
11
0,25 272,5 1,29 4,8E+05
12
0,75 272,5 1,29 7,6E+05
13
0,5 27,5 1,58 3,0E+05
14
0,25 150,0 1,87 4,8E+05
15
0,75 150,0 1,87 4,8E+05
Los viales se taparon con tapon y con tapa (tapa roscada) antes de colocarse a +37 °C durante 1 semana de termo- exposicion y despues se colocaron a +4 °C hasta que fue practico ensayarlos.
Ensayo de MVA
Se sembraron placas de ensayo (96 pocillos) con celulas BHK-21 (100 pl por pocillo, 105 celulas/ml). Las celulas se diluyeron en DMEM complementado con 10 % de FBS, y 1 % de PS. Las placas se colocaron a +37 °C, + 5 % de CO2 durante 1-2 horas.
Se preparo una serie de dilucion de 10 veces de muestras de MVA formuladas (en el mismo medio de crecimiento) que oscilaban de 1 en 10 a 1 en 10.000. Cada serie de dilucion se preparo 5 veces. Se aplicaron 100 pl de cada dilucion a pocillos individuales que contenfan celulas BHK-21 (descrito anteriormente).
6 d p.i., los pocillos se puntuaron para la presencia o ausencia de CPE y se calculo TCID50. Entonces se usaron estas para estimar la concentracion de MVA infeccioso por ml en los viales termo-expuestos.
Posteriormente, se preparo una serie de dilucion doble de muestras de MVA formuladas que oscilaba de 1 en 2.000 a 1 en 32.000. Estas diluciones se ensayaron por separado pero como antes.
Resultados
Los datos sin procesar recogidos en esta investigacion se muestran en la Tabla 3 anterior. Las respuestas oscilaron de 7,6x104 a 7,6x105 TCID50/ml, o 7,4-74,0 % de tftulo inicial (vease la Tabla 3). El modelo generado a partir de estos datos se puntuo razonablemente en los cuatro parametros de evaluacion del modelo (R2 = 0,79, Q2=0,49, Modelo validez =0,90, Reproducibilidad=0,59) (vease la Figura 5).
Se predijo que todos de sacarosa, TMG y rafinosa tenfan efectos positivos de 1° orden sobre la recuperacion viral sobre el intervalo de concentracion probado. Aunque el efecto de la rafinosa fue solo significativo al 90 % de IC, se retuvo en el modelo, ya que mejoro la solidez del modelo y se requirio para preservar la jerarqufa del modelo. Esto se requirio debido a que tambien se predijo una interaccion de TMG y rafinosa. Finalmente, se observo un efecto no lineal de 2° orden de la sacarosa. Vease la Figura 6 para un resumen de coeficientes retenidos en el modelo.
La Figura 7 es de un grafico de contornos 4D que ilustra las interacciones claramente. La concentracion optima de sacarosa puede observarse que esta consistentemente entre 0,6 y 0,8 M, ningun otro excipiente altera significativamente esto. En general, cuanto mayor sea la concentracion de TMG, mayor sera la recuperacion de actividad viral.
Simulaciones de Monte-Carlo (mostradas en la Figura 8) indican al extremo del intervalo probado para un optimo (sacarosa 1 M, TMG 1 M, rafinosa 300 mM). Esto sugiere que la formulacion optima no esta cubierta por el intervalo probado. Sin embargo, las simulaciones predicen que las formulaciones proximas a este optimo deben dar la actividad viral recuperada del 94 % de tftulo inicial.
Ejemplo 5
Materiales
5
10
15
20
25
30
35
Productos quimicos
Proveedor Codigo de producto Lote N.°
24x SSC
Sigma S6639 020M8404
Dimetilglicina
Sigma D1156 077K1856
Medio Eagle modificado por Dulbecco
Sigma D5796 RNBB1139
Suero bovino fetal
Sigma F7524 109K3395
Penicilina-estreptomicina
Sigma P4458 0409M0093
Rafinosa
Sigma R0250 050M0053
Sacarosa
Sigma 16104 SZB90120
Agua
Sigma W3500 8M0411
Productos biologicos
Proveedor Codigo de producto
Adenovirus Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
HEK 293 ECACC 85120602
Otros
Fabricante
Viales de vidrio de 5 ml Adelphi Tubes
Tapones de liofilizacion de 14 mm Adelphi Tubes Tapas de 14 mm Adelphi Tubes
Codigo de producto
VCD005
FDIA14WG/B
CWPP14
Metodos
Vitrina de clase de seguridad II HERA Microscopio invertido LED DMIL Estufa de incubacion de CO2 Binder Congelador a -80 °C serie Forma 900 Balanza ATL-84-1 Atlion Estufa de incubacion a 37 °C IP250
Equipo
Fabricante
Thermo Fisher
Leica
Binder
Thermo Fisher
Acculab
LTE
Equipo N.°
EQP# 011 y 012
EQP#062
EQP#014
EQP#015
EQP#088
EQP#016
Diseno del experimento
Se uso MODDE 9.0 (Umetrics) para generar un diseno experimental de Doehlert (vease la Figura 9). Los disenos de Doehlert son disenos de modelado de superficie de respuesta construidos a partir de simplex regulares. Son facilmente extensibles en diferentes direcciones y pueden anadirse factores nuevos a un diseno existente. A diferencia de los disenos de formulacion regulares, pueden eliminarse factores no significativos del analisis y asi no llegan a ser un factor de confusion.
Ademas, se prueban diferentes factores dentro del diseno a un numero de niveles diferente, asi es posible asignar mas niveles de prueba a factores que los presentes inventores sospechan que son de mayor importancia. Asi, se probo DMG a siete niveles, mientras se probo sacarosa a cinco y rafinosa a tres. Este modelo retiene la capacidad para modelar efectos de segundo orden e interacciones. El diseno incluyo tres factores y tres puntos centrales duplicados que produjeron quince muestras de prueba.
La sacarosa se probo entre 0 y 1 M. la rafinosa se probo sobre un intervalo de 0 a 300 mM, aunque la naturaleza del diseno de Doehlert significo que los niveles probados no incluyeron 0 mM. En su lugar, se probaron los siguientes intervalos: 27,5, 150,0 y 272,5 mM. DMG se probo sobre un intervalo lineal de 0 a 2 M.
Estabilidad de adenovirus en un entorno liquido
Se saco adenovirus recombinante que expresa GFP potenciada bajo un promotor del CMV, con un tftulo (pre- congelacion) de 6,7x105 ufp/ml en SSC, de almacenamiento a -80 °C y se dejo que se descongelara. Posteriormente, se anadieron alfcuotas de 50 pl de virus a 15 viales de vidrio de 5 ml. A cada vial se mezclaron 250 pl de una mezcla de excipiente. Las formulaciones de mezcla de excipiente una vez mezcladas con virus se describen en la Tabla 4 y se enrasaron en SSC.
Tabla 4
Formulacion N.°
Sacarosa (M) Rafinosa (mM) DMG (M) Tftulo (ufp/ml)
1
0,25 150,0 0,13 1,1E+05
2
0,75 150,0 0,13 2,2E+05
3
0,5 272,5 0,42 3,8E+05
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Formulacion N.°
Sacarosa (M) Rafinosa (mM) DMG (M) Tftulo (ufp/ml)
4
0,25 27,5 0,71 2,0E+05
5
0,75 27,5 0,71 2,6E+05
6
0 150,0 1,00 2,2E+05
7
0,5 150,0 1,00 2,2E+05*
8
0,5 150,0 1,00 3,1E+05
9
0,5 150,0 1,00 3,4E+05
10
1 150,0 1,00 4,1E+05
11
0,25 272,5 1,29 2,5E+05
12
0,75 272,5 1,29 3,7E+05
13
0,5 27,5 1,58 3,7E+05
14
0,25 150,0 1,87 2,5E+05
15
0,75 150,0 1,87 3,3E+05
* indica un valor atfpico eliminado del modelo
Los viales se taparon con tapon y con tapa (tapa roscada) antes de colocarse a +37 °C durante 1 semana de termo- exposicion y despues se colocaron a +4 °C hasta que fue practico ensayarlos. El ensayo de adenovirus fue como se describe a continuacion.
Ensayo de adenovirus
Se prepararon celulas HEK 293 en placas de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos para inoculacion por siembra a 105 celulas por ml (100 pl por pocillo) y se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2. Despues de 2 horas se inocularon las celulas del siguiente modo.
Se diluyeron muestras de virus termo-expuestas 1 en 10 y 1 en 100 en DMEM +10 % de FBS +1 % de PS. Entonces se anadieron 100 pl de cada una de las muestras de virus diluidas resultantes a pocillos individuales de la placa de ensayo. Adicionalmente, se descongelo una segunda alfcuota del adenovirus original en SSC de -80 °C y tambien se preparo una serie de dilucion de 10 veces (de 1 en 10 a 1 en 100.000) en DMEM +10 % de FBS +1 % de PS. La serie de dilucion de control positivo se inoculo por duplicado a cada placa de 96 pocillos usada. Despues de otras 48 horas, se conto el numero de celulas de GFP por pocillo usando microscopfa fluorescente.
Resultados
Se genero un modelo muy fuerte a partir de estos datos (vease la Tabla 4). El modelo se puntuo altamente con los cuatro indicadores (R2=0,97, Q2=0,90, Validez del modelo=0,89, Reproducibilidad=0,96) (vease la Figura 10). El modelo se potencio durante el ajuste por la eliminacion de un duplicado. Esta formulacion fue marcada por el software como un valor atfpico obvio.
Se mostro que los tres excipientes en la formulacion eran factores significativos en el modelo (vease la Figura 11). La sacarosa y la rafinosa solo tuvieron efectos de 1° orden, mientras que DMG tuvo tanto efectos de 1° como de 2° orden. Ademas, hubo una interaccion entre rafinosa y DMG.
La Figura 12 muestra que la concentracion optima de sacarosa esta mas alla de la probada. Sin embargo, es poco probable que la concentracion de sacarosa aumente significativamente debido a las limitaciones en la osmolaridad del producto. A algunos niveles, DMG potencia el efecto protector de la formulacion, y la rafinosa altera la concentracion optima de DMG para este fin.
Se usaron simulaciones de Monte-Carlo para predecir una formulacion optima (vease la Figura 13). El programa se establecio para maximizar la actividad viral recuperada a un lfmite de 4,3x105 ufp/ml (el tftulo de un control positivo). La formulacion optima predicha fue sacarosa 0,5 M, DMG 0,4 M, rafinosa 272 nM y se predijo que esto daba un tftulo de 3,6x105 ufp/ml o 84 % del tftulo inicial (basado en el control positivo).
La Figura 14a muestra una forma alternativa de mirar los datos. Un grafico de contornos muestra la concentracion de DMG representada contra la concentracion de sacarosa a varias concentraciones de rafinosa diferentes. El grafico muestra que la region mas oscura (mayor recuperacion de la actividad de virus) mueve el eje y (concentracion de DMG) a medida que aumenta la rafinosa. Una cruz negra marca la formulacion optima predicha. La Figura 14b muestra la region donde se predice que la recuperacion es del 100 % o mayor.
5
10
15
20
25
Ejemplo 6
Materiales
Productos quimicos
Proveedor Codigo de producto Lote N.°
Dimetilglicina
Sigma D1156 077K1856
Medio Eagle modificado por Dulbecco
Sigma D5796 RNBB1139
Suero bovino fetal
Sigma F7524 109K3395
Rafinosa
Sigma R0250 050M0053
Sacarosa
Sigma 16104 SZB90120
Agua
Sigma W3500 8M0411
Productos biologicos
Proveedor Codigo de producto
Adenovirus Vector Biolabs Ad-CMV-GFP
HEK 293 ECACC 85120602
Otros
Proveedor
Viales de vidrio de 5 ml Adelphi Tubes
tapones de liofilizacion de 14 mm Adelphi Tubes Tapas de 14 mm Adelphi Tubes
Codigo de producto
VCD005
FDIA14WG/B
CWPP14
Secadora
Vitrina de clase de seguridad II HERA Microscopio invertido LED DMIL Estufa de incubacion de CO2 Binder Congelador a -80 °C serie Forma 900 Balanza ATL-84-1 Atlion Estufa de incubacion a 37 °C IP250
Equipo
Fabricante
Thermo Fisher
Leica
Binder
Thermofisher
Acculab
LTE
Equipo N.°
EQP# 011 y 012
EQP#062
EQP#014
EQP#015
EQP#088
EQP#016
Metodos
Se saco adenovirus recombinante que expresa GFP potenciada bajo un promotor del CMV, con un tftulo (despues de la descongelacion) de 10,2x105 ufp/ml en PBS, de almacenamiento a -80 °C y se dejo que se descongelara. Posteriormente, se anadieron alfcuotas de 50 pl de virus a 15 viales de vidrio de 5 ml. A cada vial se mezclaron 250 pl de una mezcla de excipiente. Las formulaciones de mezcla de excipiente una vez mezcladas con virus se describen en la Tabla 5 y se enrasaron en PBS.
Tabla 5
Nombre de la formulacion
Tampon Rafinosa (mM) Sacarosa (M) DMG (M)
Tampon
PBS 0 0 0
Rafinosa
PBS 100 0 0
Sacarosa
PBS 0 1 0
Azucares
PBS 100 1 0
NE
PBS 0 0 0,7
Mejor
PBS 100 1 0,7
Desde este punto en adelante se usan los siguientes nombres de tratamiento:
- "Tampon" = tampon PBS solo sin excipientes
- "Sacarosa" = sacarosa 1 M en PBS
- "Rafinosa" = rafinosa 100 mM en PBS
- "Azucares" = sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM en PBS,
- "NE" = DMG 0,7 M en PBS,
- "Mejor" = sacarosa 1 M, rafinosa 100 mM, DMG 0,7 M en PBS._____________________
Los viales se taparon con tapon y con tapa (tapa roscada) antes de ser termicamente expuestos en las condiciones expuestas en la Tabla 6. En momentos de tiempo apropiados, se llevo a cabo un ensayo de adenovirus como se describe en el Ejemplo 5.
Resultados
Muchos puntos de datos reunidos estuvieron por debajo del umbral de deteccion del ensayo (vease la Tabla 6).
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 6
Exposicion termica
Formulacion
Temperatura
Duracion Mejor Sacarosa Rafinosa Azucares NE Tampon
+4 °C
6 meses 2,0E+06 1,8E+06 1,1E+06 1,7E+06 1,3E+06 1,0E+06
+254 °C
1 mes 5,2E+05 1,9E+05 1,6E+05 2,0E+05 2,3E+05 7,2E+04
6 meses
1,9E+05 6,0E+02* 6,0E+02* 1,0E+05 3,0E+04 6,0E+02*
1 2,3E+04 3,0E+03 6,0E+02* 4,2E+03 6,0E+02* 6,0E+02*
+37 °C
8 1,7E+04 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02*
12 3,6E+03 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02* 6,0E+02*
*punto de datos por debajo del umbral de deteccion
Por comodidad, a estos puntos de datos se les ha asignado el valor umbral ya que este es el maximo valor posible que podrfan tener. Es probable que esto tenga poco efecto sobre la interpretacion de los resultados, ya que cualquier formulacion que de tal baja recuperacion de viral actividad es de poco uso practico como algo distinto de un comparador. El umbral de deteccion para este ensayo es 600 ufp/ml, que es igual al 0,03 % de la actividad recuperada.
Solo se probo un momento de tiempo para las muestras mantenidas a +4 °C. El rendimiento de la actividad de virus despues de 6 meses a esta temperatura puede observarse en la Figura 15. El tratamiento de solo tampon dio recuperacion del 50,1 % del tftulo inicial y una clara indicacion de que el adenovirus usado es inherentemente razonablemente estable en este entorno lfquido. Este hallazgo tambien muestra la necesidad de estudios de estabilidad acelerada.
El tratamiento con "sacarosa" recupero el 92,1 % de la actividad, que despues de 6 meses es una mejora importante en el tampon solo. "Rafinosa", a diferencia, solo dio el 55,5 %, una ligera mejora en "Tampon solo" pero peor que "Sacarosa". El tratamiento con "Azucares" combinados dio una actividad de virus recuperado de solo el 86,4 %.
El tratamiento de solo DMG ("NE") preservo solo el 65,1 % de la actividad de virus, pero cuando se uso junto con los azucares se observo una actividad recuperada del 99,3 %. Este hallazgo es perdida proxima a cero de adenovirus a +4 °C despues de 6 meses.
La actividad viral recuperada en esta formulacion "Mejor" en cada momento de tiempo y la exposicion a temperatura se muestra en la Figura 16. Como se trato previamente despues de 6 meses a +4 °C, hay una perdida proxima a cero.
Los resultados (veanse la Tabla 6 y la Figura 17) a termo-exposiciones a +25 °C y +37 °C demuestran que la formulacion "Mejor" es mas eficaz en estabilizar el adenovirus que sus componentes constituyentes.
Ejemplo 7
Materiales
Productos quimicos
Proveedor
20x SSC Sigma
Dimetilglicina Sigma
Medio Eagle modificado por Dulbecco Sigma
Suero bovino fetal Sigma
Penicilina-estreptomicina Sigma
Agua Sigma
Codigo de producto
S6639
D1156
D5796
F7524
P4458
W3500
Lote N.°
020M8404
077K1856
RNBB1139
109K3395
0409M0093
8M0411
BHK-21 lfnea celular MVA
Productos biologicos
Proveedor Codigo de
ECACC CB2857
ATCC VR-1508
producto
Viales de vidrio de 2 ml Tapones de liofilizacion de 13 mm Plegados
Otros
Fabricante
Adelphi Tubes Adelphi Tubes Adelphi Tubes
Codigo de producto
VCDIN2R
FDW13
COTW13
5
10
15
20
25
30
35
40
Equipo
Vitrina de clase de seguridad II HERA Microscopio invertido LED DMIL Estufa de incubacion de CO2 Binder Congelador a -80 °C serie Forma 900 Balanza ATL-84-1 Atlion Estufa de incubacion a 37 °C IP250
Fabricante
Thermo Fisher
Leica
Binder
Thermofisher
Acculab
LTE
Equipo N.°
EQP# 011 y 012
EQP#062
EQP#014
EQP#015
EQP#088
EQP#016
Metodos
Diseno del experimento
Se uso MODDE 9.0 para generar un diseno compuesto central centrado en las caras (CCF). Los disenos de CCF son una forma de diseno del modelado de superficie de respuesta (RSM) que prueba solo 3 niveles de cada factor, pero todavfa soporta un modelo cuadratico (vease la Figura 18). A diferencia de los disenos de formulacion regulares, pueden eliminarse factores no significativos del analisis y asf no llegan a ser un factor de confusion.
Preparacion de y exposicion termica de MVA formulado en un entorno liquido
Se recupero MVA del almacenamiento a -80 °C y se descongelo. Posteriormente, se anadieron alfcuotas de 50 pl de virus a 15 viales de vidrio de 5 ml. A cada vial se mezclaron 250 pl de una mezcla de excipiente. Las formulaciones de mezcla de excipiente una vez mezcladas con virus se describen en la Tabla 7 mas adelante y se enrasaron en SSC. Los viales se taparon con tapon a vacfo, y se taparon (tapa roscada) antes de colocarse a +37 °C durante 1 semana de termo-exposicion y despues se colocaron a +4 °C hasta que fue practico ensayarlos.
Ensayo de MVA
Se sembraron placas de ensayo (96 pocillos) con celulas BHK-21 (100 pl por pocillo, 105 celulas/ml). Las celulas se diluyeron en DMEM complementado con 10 % de FBS, y 1 % de PS. Las placas se colocaron a +37 °C, + 5 % de CO2 durante 1-2 horas.
Mientras tanto, se preparo una serie de dilucion de 10 veces de muestras de MVA formuladas (en el mismo medio de crecimiento) que oscilaba de 1 en 10 a 1 en 10.000. Cada serie de dilucion se preparo como 5 duplicados. Se aplicaron 100 pl de cada dilucion a pocillos individuales que contenfan celulas BHK-21 (descrito anteriormente).
6 d p.i., los pocillos se puntuaron para la presencia o ausencia de CPE y se calculo TCID50. Entonces se usaron estas para estimar la concentracion de MVA infeccioso por ml en los viales termo-expuestos.
Resultados
Los datos de TCID50 sin procesar de este estudio se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7
I.D. de muestra
DMG (M) Manitol (mM) Tftulo (TCIDso/ml)
1
0 6 1,90E+5
2
2
6 4,80E+3
3
0 600 3,00E+4
4
2 600 4,80E+5
5
0 303 3,00E+5*
6
2 303 3,00E+5
7
1 6 3,00E+4
8
1 600 3,00E+5
9
1 303 7,60E+5*
10
1 303 1,90E+5
11
i 303 1,90E+5
* Punto de datos excluido del modelo durante el ajuste como un valor atipico obvio
Las respuestas variaron del 0,5 al 74,1 % del tftulo inicial. El modelo predice los efectos de 1° orden de ambos excipientes (vease la Figura 19 y 20). En el caso de tanto DMG como manitol, la preservacion viral aumenta a medida que aumenta la concentracion. Esto se ilustra claramente por el grafico de contornos mostrado en la Figura
21. Adicionalmente, se identified una interaccion entre DMG y manitol.
Simulaciones de Monte-Carlo sugieren que con la alta concentracion de cada excipiente probada puede esperarse lograr mas del 66 % del tftulo inicial despues de la exposicion termica a +37 °C durante 1 semana, esto representa 5 menos de una perdida de 0,2 LOG.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la preparacion de una solucion acuosa, estable durante el almacenamiento, lista para su uso, que se proporciona en un envase sellado y que contiene partfculas virales vivas, procedimiento que comprende:
    (a) proporcionar una solucion que comprende:
    - agua o solucion salina fisiologica, que esta opcionalmente tamponada con un tampon fisiologicamente aceptable;
    - partfculas virales vivas de Adenoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Flaviviridae o Herpesviridae;
    - un excipiente que es una N,N-di(alquil Ci-6)-glicina o N,N,N-tri(alquil Ci-6 )-glicina, o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas;
    - opcionalmente uno o mas azucares; y
    - opcionalmente un compuesto de sulfona de formula (IIC):
    imagen1
    (IIC)
    en la que Ra y Rb representan independientemente alquilo Ci-6; y
    (b) sellar la solucion en un recipiente.
  2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que las partfculas virales son de un adenovirus, virus de la variolovacuna, virus de la gripe o virus del sarampion.
  3. 3. El procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el excipiente es N,N-dimetilglicina o N,N,N-trimetilglicina, o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de las mismas.
  4. 4. El procedimiento segun la reivindicacion 3, en el que el excipiente es N,N-dimetilglicina o una sal o un ester fisiologicamente aceptable de la misma.
  5. 5. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el uno o mas azucares comprenden sacarosa o manitol.
  6. 6. El procedimiento segun la reivindicacion 5, en que el uno o mas azucares comprenden sacarosa y rafinosa.
  7. 7. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto de sulfona de formula (IIC) es metilsulfonilmetano.
  8. 8. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solucion comprende ademas:
    (a) un adyuvante;
    (b) un agente de ajuste de la tonicidad; y/o
    (c) un conservante.
  9. 9. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solucion es isotonica.
  10. 10. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solucion se proporciona en un envase sellado bajo nitrogeno.
  11. 11. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el recipiente sellado es un vial, una ampolla, una jeringa, un cartucho, una bolsa flexible o una botella de vidrio, sellado.
  12. 12. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la solucion se pasa a traves de un filtro esterilizante en la etapa (a).
  13. 13. Una solucion acuosa estable durante el almacenamiento, lista para su uso, que contiene partfculas virales vivas de Adenoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Flaviviridae o Herpesviridae que se proporciona en un envase sellado, conteniendo dicha partfcula viral viva solucion acuosa que
    es obtenible por un procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
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