ES2624908T3 - Prevención y tratamiento de la enfermedad amiloide - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 1-10 de Aß, en el que el isotipo del anticuerpo es IgGI humana, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Description

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Prevencion y tratamiento de la enfermedad amiloide Descripcion

CAMPO TECNICO

La invencion reside en los campos de la tecnica de la inmunolog^a y la medicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva que resulta en demencia senil. Vease, en general, Selkoe, TINS 16, 403 409 (1993); Hardy et al, WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438 447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (l995); Games y col., Nature 373, 523 (1995). En terminos generales, la enfermedad se clasifica en dos categonas: inicio tardm, que se produce en la vejez (65 + anos) y de aparicion temprana, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre 35 y 60 anos. En ambos tipos de enfermedad, la patologfa es la misma, pero las anomalfas tienden a ser mas graves y generalizadas en los casos que comienzan a una edad temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, placas seniles y ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son areas de neuropilo desorganizado de hasta 150 |jM con depositos amiloides extracelular en el centro visibles por analisis microscopico de secciones de tejido cerebral. Los ovillos neurofibrilares son depositos intracelulares de protema tau asociada a microtubulos que consisten en dos filamentos retorcidos el uno del otro en pares.

El constituyente principal de las placas es un peptido denominado Ap o peptido p-amiloide. El peptido Ap es un fragmento interno de 39-43 aminoacidos de una protema precursora denominada protema precursora amiloide (APP). Varias mutaciones dentro de la protema de APP se han correlacionado con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Vease, por ejemplo, Goate et al., Nature 349, 704) (1991) (valina717 a isoleucina).; Chartier Harlan et al. Nature 353, 844 (1991)) (valine717 a glicina); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valina717 a fenilalanina); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (una doble mutacion cambia lisina595-metionina596 a asparagina595leucina596). Se cree que estas mutaciones causan la enfermedad de Alzheimer por procesamiento incrementado o alterado de APP para Ap, en particular procesamiento de APP para cantidades aumentadas de la forma larga de Ap (es decir, Ap1-42 y Ap1-43). Se cree que las mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente el procesamiento de APP para generar mayores cantidades de forma larga Ap (vease Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Estas observaciones indican que la Ap, y particularmente su forma larga, es un elemento causante de la enfermedad de Alzheimer.

McMichael, EP 526.511, propone la administracion de dosificaciones homeopaticas (menos de o igual a 10' 2 mg/dfa) de Ap a pacientes con Ap preestablecida. En un humano tfpico con aproximadamente 5 litros de plasma, sena de esperar que incluso el lfmite superior de esta dosificacion generana una concentracion de no mas de 2 jg/ml. La concentracion normal de Ap en plasma humano esta tfpicamente en el rango de 50-200 jg/ml (Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)). Debido a la dosis propuesta de EP 526,511 apenas alterana el nivel de Ap endogeno circulante y porque EP 526.511 no recomienda el uso de un adyuvante, como un inmunoestimulante, parece inverosfmil que cualquier beneficio terapeutico resultana.

FRENKEL D ET AL.; JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, 88, 85-90 (1998) describe anticuerpos murinos que se unen a Ap 1-7 o 1-5; WO 98/44955 da a conocer la administracion de ADN que codifica los anticuerpos murinos se unen a Ap 1-7 o 1-5 a las celulas del sistema nervioso central.

Por el contrario, la presente descripcion se dirige inter alia a tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogenicas mediante la administracion de fragmentos de Ap, o anticuerpo a determinados epttopos dentro de Ap a un paciente en condiciones que generen una respuesta inmunitaria beneficiosa en el paciente. La invencion cumple asf una necesidad desde hace mucho tiempo para los regfmenes terapeuticos para prevenir o mejorar la neuropatologfa y, en algunos pacientes, el deterioro cognitivo asociado con la enfermedad de Alzheimer.

RESUMEN DE LA INVENCION REIVINDICADA

La invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epitope dentro de los residuos 1-10 de Ap, donde el isotipo del anticuerpo es IgG1 humano, y un portador farmaceuticamente aceptable.

La invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica de este tipo para su uso en la prevencion o tratamiento de una enfermedad asociada con depositos amiloides de Ap en el cerebro de un paciente.

La invencion tambien proporciona un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo dentro de los residuos 1-10 de Ap, en el que el isotipo del anticuerpo es IgG1 humano, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad asociada con depositos amiloides de Ap en el cerebro de un paciente.

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En un aspecto, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas o anticuerpos tal como se definen en las reivindicaciones para uso en metodos de prevencion o tratamiento de una enfermedad asociada con depositos amiloides de Ap en el cerebro de un paciente. Tales enfermedades incluyen enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down y deterioro cognitivo de Down. Este ultimo puede ocurrir con o sin otras caractensticas de una enfermedad amiloidogenica. Algunos metodos implican la administracion de una dosificacion eficaz de un anticuerpo que se une espedficamente a un componente de un deposito amiloide al paciente. Tales metodos son particularmente utiles para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer en pacientes humanos. Algunos metodos implican la administracion de una dosificacion eficaz de un anticuerpo que se une a Ap. Algunos metodos implican la administracion de una dosificacion eficaz de un anticuerpo que se une espedficamente a un epitope dentro de los residuos 1-10 de Ap. En algunos procedimientos, el anticuerpo se une espedficamente a un epitope dentro de los

el anticuerpo se une espedficamente a un epitope dentro de los

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el anticuerpo se une a un epftopo que comprende un residuo N- En algunos procedimientos, el anticuerpo se une a un epftopo dentro de los residuos de 1-10 de Ap donde el residuo 1 y/o residuo 7 de Ap es acido aspartico. En algunos procedimientos, el anticuerpo se une espedficamente a un peptido sin unirse a la protema precursora de amiloide de longitud completa (APP). En algunos metodos, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humano.

residuos 1-6 de Ap. residuos 1-5 de Ap. residuos 1-7 de Ap. residuos 3-7 de Ap. residuos 1-3 de Ap. residuos 1-4 de Ap. terminal libre de Ap.

En algunos procedimientos, En algunos procedimientos, En algunos procedimientos, En algunos procedimientos, En algunos procedimientos, En algunos procedimientos,

En algunos procedimientos, el anticuerpo se une a un deposito amiloide en el paciente e induce una respuesta de eliminacion contra el deposito amiloide. Por ejemplo, tal respuesta de eliminacion puede realizarse por fagocitosis mediada por receptor de Fc.

Los metodos se pueden utilizar tanto en pacientes asintomaticos y aquellos que actualmente muestran smtomas de la enfermedad. El anticuerpo utilizado en tales metodos puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimerico o no humano y puede ser monoclonal o policlonal. En algunos metodos, el anticuerpo se prepara a partir de un humano inmunizado con peptido Ap, siendo este humano el paciente a tratar con anticuerpo. En algunos procedimientos, el anticuerpo se administra con un portador farmaceutico como una composicion farmaceutica. En algunos metodos, el anticuerpo se administra a una dosis de 0,0001 a 100 mg/kg, preferiblemente, al menos un anticuerpo de peso corporal de 1 mg/kg. En algunos procedimientos, el anticuerpo se administra en multiples dosis durante un penodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. En algunos procedimientos, el anticuerpo se administra como una composicion de liberacion sostenida. El anticuerpo se puede administrar, por ejemplo, por via intraperitoneal, oral, subcutanea, intracraneal, intramuscular, topica, intranasal o intravenosa.

En algunos procedimientos, el anticuerpo se administra por administracion de un polinucleotido que codifica al menos una cadena de anticuerpo al paciente. El polinucleotido se expresa para producir la cadena de anticuerpo en el paciente. Opcionalmente, el polinucleotido codifica cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. El polinucleotido se expresa para producir las cadenas pesadas y ligeras en el paciente. En algunos metodos, el paciente se controla para el nivel de anticuerpo administrado en la sangre del paciente.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con depositos amiloides de Ap en el cerebro del paciente. Por ejemplo, los metodos se pueden utilizar para tratar la enfermedad de Alzheimer o el smdrome de Down o deterioro cognitivo. Tales metodos implican la administracion de fragmentos de Ap o analogos de los mismos que provocan una respuesta inmunogenica contra ciertos epftopos dentro de Ap. Algunos metodos implicanan la administracion a un paciente de una dosificacion eficaz de un polipeptido que comprende un segmento N-terminal de al menos los residuos 1-5 de Ap, el primer residuo de Ap siendo el residuo N-terminal del polipeptido, donde el polipeptido esta libre de un segmento C-terminal 1-5 de Ap. Algunos metodos implican la administracion a un paciente de una dosificacion eficaz de un polipeptido que comprende un segmento N-terminal de Ap, el segmento comienza en el residuo 1-3 de Ap y terminando en los residuos 7-11 de Ap. Algunos metodos implican la administracion a un paciente de una dosificacion eficaz de un agente que induce una respuesta inmunogenica contra un segmento N-terminal de Ap, el segmento comienza en el residuo 1-3 de Ap y terminando en residuos 7-11 de Ap sin inducir una respuesta inmunogenica contra un epftopo dentro de los residuos 12-43 de Ap43.

En algunos de los metodos anteriores, el segmento N-terminal de Ap esta vinculado a su C-termino a un polipeptido heterologo. En algunos de los metodos anteriores, el segmento N-terminal de Ap esta vinculado en su N- termino a un polipeptido heterologo. En algunos de los metodos anteriores, el segmento N-terminal de Ap esta unido en sus terminales N y C a un primer y segundo polipeptido heterologo. En algunos de los metodos anteriores, el segmento N-terminal de Ap esta unido en su extremo N-terminal con un polipeptido heterologo, y en su C-termino al menos una copia adicional del segmento N-terminal. En algunos de los metodos anteriores, el polipeptido heterologo y de este modo una respuesta de celulas B contra el segmento N-terminal. En algunos de los metodos anteriores, el polipeptido comprende ademas al menos una copia adicional del segmento N-terminal. En algunos de los metodos anteriores, el polipeptido comprende N-termino a C-termino, el segmento N-terminal de Ap, una pluralidad de copias adicionales del segmento N-terminal, y el segmento de aminoacido heterologo. En algunos de los metodos

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anteriores, el segmento N-terminal consiste en Ap1-7. En algunos de los metodos anteriores, el segmento N-terminal consiste en Ap3-7.

En algunos procedimientos, el fragmento esta libre de al menos el 5 aminoacidos C-terminales en Ap43. En algunos procedimientos, el fragmento comprende hasta 10 aminoacidos contiguos de Ap. Los fragmentos se administran tipicamente en mas de 10 microgramos por dosis por paciente.

En algunos procedimientos, el fragmento se administra con un adyuvante que potencia la respuesta inmunitaria al peptido Ap. El adyuvante y el fragmento pueden ser administrados en cualquier orden o juntos como una composicion. El adyuvante puede ser, por ejemplo, hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, mPltm, QS-21 (StimulonTM) o adyuvante incompleto de Freund.

La descripcion proporciona ademas composiciones farmaceuticas que comprenden fragmentos de Ap u otros agentes que desencadenantes la respuesta inmunogenica a los mismos epftopos de Ap, tal como se describe anteriormente, y un adyuvante. La invencion proporciona tambien composiciones farmaceuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos como se definen en las reivindicaciones y un portador farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos de cribado de un anticuerpo para la actividad en el tratamiento de una enfermedad asociada con depositos de Ap en el cerebro de un paciente (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Tales metodos implican poner en contacto el anticuerpo con un polipeptido que comprende al menos cinco aminoacidos contiguos de un segmento N-terminal de Ap que comienza en el residuo entre 1 y 3 de la Ap, siendo el polipeptido libre de un segmento C-terminal de Ap. Uno determina entonces si el anticuerpo se une espedficamente al polipeptido, proporcionando la union espedfica una indicacion de que el anticuerpo tiene actividad en el tratamiento de la enfermedad.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos de cribado de un anticuerpo para la actividad en la limpieza de una entidad biologica asociada a antfgeno. Tales metodos implican la combinacion de la entidad biologica asociada a antfgeno y el anticuerpo y celulas fagodticas que llevan receptores de Fc en un medio. Se supervisa entonces la cantidad de la entidad biologica asociada a antfgeno que queda en el medio. Una reduccion en la cantidad de la entidad biologica asociada a antfgeno indica el anticuerpo tiene actividad de eliminacion contra la entidad biologica asociada a antfgeno. El antfgeno puede proporcionarse como una muestra de tejido o en forma aislada. Por ejemplo, el antfgeno se puede proporcionar como una muestra de tejido del cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer o un animal mairnfero que tiene la patologfa de Alzheimer. Otras muestras de tejido contra el que los anticuerpos pueden ensayarse para la actividad de eliminacion incluyen muestras cancerosas de tejidos, muestras de tejidos infectadas por virus, comprendiendo las muestras de tejido celulas inflamatorias, tumores anormales en las celulas no malignas, o muestras de tejidos que comprenden una matriz extracelular anormal.

En otro aspecto, la descripcion proporciona metodos para detectar un deposito amiloide en un paciente. Tales metodos implican la administracion al paciente de un anticuerpo que se une espedficamente a un epitope dentro de los aminoacidos 1-10 de Ap, y detectan la presencia del anticuerpo en el cerebro del paciente. En algunos procedimientos, el anticuerpo se une a un epttopo dentro de los residuos 4-10 de Ap. En algunos procedimientos, el anticuerpo esta marcado con una etiqueta paramagnetica y se detecta por tomograffa de resonancia magnetica nuclear.

La descripcion proporciona ademas kits de diagnostico adecuados para su uso en los metodos anteriores. Dicho kit comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epitope con los restos 1-10 de Ap. Algunos kits llevan una etiqueta que describe el uso del anticuerpo para el diagnostico in vivo o un control de la enfermedad de Alzheimer.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1: El tftulo de anticuerpos tras la inyeccion de ratones transgenicos con Ap-142.

FIG. 2: La carga de amiloide en el hipocampo. El porcentaje de la zona de la region del hipocampo ocupada por placas amiloides, definidas por reactividad con el anticuerpo monoclonal 3D6 de Ap espedfico, se determino por analisis de imagen cuantitativa asistida por ordenador de secciones de cerebro inmunoreaccionadas. Los valores para los ratones individuales se muestran clasificados por grupo de tratamiento. La lmea horizontal para cada agrupacion indica el valor mediano de la distribucion.

FIG. 3: Distrofia neuntica en el hipocampo. El porcentaje del area de la region del hipocampo ocupada por neuritas distroficas, definida por su reactividad con el 8E5 monoclonal APP-espedfico humano, se determino por analisis de imagen asistida por ordenador cuantitativa de secciones de cerebro inmunoreaccionadas. Los valores para los ratones individuales se muestran para el grupo tratado por AN1792 y el grupo de control tratado por PBS. La lmea horizontal para cada agrupacion indica el valor de la mediana de la distribucion.

FIG. 4: Astrocitosis en la corteza retroesplenial. El porcentaje del area de la region cortical ocupada por

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astrocitos (GFAP)-positivos de protema acida fibrilar glial se determino por analisis de imagen cuantitativa asistida por ordenador de secciones del cerebro inmunoreaccionadas. Los valores para los ratones individuals se muestran clasificados por el grupo de tratamiento y los valores de grupo mediano se indican mediante lmeas horizontales.

FIG. 5: Tftulos de anticuerpos de media geometrica a Ap1-42 despues de la inmunizacion con una gama de ocho dosis de AN1792 que contiene 0,14, 0,4, 1,2, 3,7, 11, 33, 100, o 300 |jg.

FIG. 6: Cinetica de la respuesta de anticuerpos a inmunizacion de AN1792. Los tftulos son expresados como medias geometricas de los valores para los 6 animales en cada grupo.

FIG. 7: Analisis cuantitativo de imagenes de la carga amiloide cortical en ratones tratados con PBS y

AN1792.

FIG. 8: Analisis cuantitativo de imagenes de la carga de placa neurftica en ratones tratados con PBS y

AN1792.

FIG. 9: Analisis cuantitativo de imagenes del porcentaje de la corteza retroesplenial ocupada por astrocitosis en ratones tratados por PBS y AN1792.

FIG. 10: Ensayo de proliferacion de linfocitos en celulas de bazo de (panel superior) tratado por AN1792 o (panel inferior) tratado por PBS.

FIG. 11: Niveles totales de Ap en la corteza. Un diagrama de dispersion de perfiles individuos de Ap en ratones inmunizados con derivados Ap o APP combinados con adyuvante de Freund.

FIG. 12: Carga de amiloide en la corteza se determino por analisis cuantitativo de imagenes de secciones de cerebro inmunoreaccionadas para los ratones inmunizados con los conjugados de peptido Ap Ap1-5, Ap1-12 EA, y AB13-28; los agregados de Ap de longitud completa AN1792 (Ap1-42) y AN1528 (Ap1-40) y el grupo de control tratado por PBS.

FIG. 13: Tftulos medios geometricos de anticuerpos Ap-espedficos para grupos de ratones inmunizados con derivados de Ap o APP combinadas con adyuvante de Freund.

FIG. 14: Tftulos medios geometricos de anticuerpos Ap-espedficos para grupos de cobayas inmunizadas con AN1792, o un derivado palmitoilado del mismo, combinado con diferentes adyuvantes.

FIG. 15 (AE): Los niveles de Ap en la corteza de ratones PDAPP de 12 meses de edad tratados con AN1792 o AN1528 con diferentes adyuvantes.

FIG. 16: Tftulo medio de los ratones tratados con el anticuerpo policlonal a Ap.

FIG. 17: Tftulo de ratones tratados con anticuerpo monoclonal 10D5 a Ap.

FIG. 18: Tftulo de ratones tratados con anticuerpo monoclonal 2F12 a Ap.

FIG. 19: Mapa de epftopos: Respuesta de N-terminal restringida. Suero de dfa 175 de monos cynomolgus se ensayo por ELISA contra una serie de peptidos de solapamiento 10-mer que cubren la secuencia completa de AN1792. Numero animal F10920M muestra una respuesta restringida N-terminal representativa al peptido DAEFRHDSGY que abarca los aminoacidos 1-10 del peptido AN1792 que se utilizo como antfgeno inmunizante.

FIG. 20: Mapa de epftopos: Respuesta N-terminal no restringida. Suero de dfa 175 de monos cynomolgus se ensayo mediante ELISA frente a una serie de peptidos superpuestos 10-mer que cubren la secuencia completa AN1792. El numero animal F1097SF muestra una respuesta N-terminal no restringida representativa. La reactividad se ve contra los dos peptidos N-terminales y un peptido C-terminal al peptido DAEFRHDSGY que cubre los aminoacidos 1-10 del peptido AN1792.

DEFINICIONES

El termino "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptfdicas, cuando se alinean de manera optima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 65 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos identidad de secuencia de 80 o 90 por ciento, mas preferiblemente al menos identidad de secuencia 95 por ciento o mas (por ejemplo, identidad de secuencia de 99 por ciento o mas). Preferiblemente, las posiciones de residuos que no son identicas difieren por sustituciones de aminoacidos conservativos.

Para la comparacion de secuencias, tfpicamente una secuencia actua como secuencia de referencia, a la

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que las secuencias de prueba se comparan. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordenadas de subsecuencia se designan, si es necesario, y se designan los parametros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula el porcentaje de secuencia de identidad de la secuencia de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basandose en los parametros del programa designados.

La alineacion optima de secuencias para la comparacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFTT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion visual (vease generalmente Ausubel et al., supra). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para la determinacion de por ciento de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tfpicamente, los parametros del programa por defecto se pueden utilizar para realizar la comparacion de secuencias, aunque tambien pueden usarse parametros personalizados. Para secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 10915 (1989)).

Para los propositos de clasificacion de sustituciones de aminoacidos como conservativas o no conservativas, aminoacidos se agrupan de la siguiente manera: Grupo I (cadenas laterales hidrofobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales neutras hidrofilas): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales basicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientacion de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromaticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoacidos en la misma clase. Sustituciones no conservativas constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Los agentes terapeuticos de la invencion son tfpicamente sustancialmente puros a partir de contaminante no deseado. Esto significa que un agente es tfpicamente al menos aproximadamente 50% de pureza p/p (peso/peso), asf como protemas interferentes sustancialmente libres y contaminantes. A veces los agentes tienen al menos aproximadamente 80% p/p y, mas preferiblemente al menos pureza de 90% o aproximadamente 95% p/p. Sin embargo, usando tecnicas de purificacion de protemas convencionales, los peptidos homogeneos de al menos el 99% p/p puede obtenerse.

La union espedfica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1. Se prefieren las afinidades mayores que 108 M-1.

El termino "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usa para incluir anticuerpos intactos y fragmentos de union de los mismos. Normalmente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivan para la union a un fragmento de antfgeno incluyendo cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras de Fab, Fab' F(ab')2, Fabc, y Fv. Los fragmentos se producen por tecnicas de ADN recombinante, o por separacion enzimatica o qrnmica de inmunoglobulinas intactas. El termino “anticuerpo” tambien incluye una o mas cadenas de inmunoglobulina que se conjugan qmmicamente a, o se expresan como protemas de fusion con otras protemas. El termino "anticuerpo" tambien incluye anticuerpo biespedfico. Un anticuerpo biespedfico o bifuncional es un anticuerpo hfbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de union diferentes. Los anticuerpos biespedficos se pueden producir por una variedad de metodos que incluyen fusion de hibridomas o union de fragmentos Fab'. Vease, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

APP695, APP751, y APP770 se refieren, respectivamente, a polipeptidos largos de residuo de aminoacidos 695, 751, y 770 codificados por el gen APP humano. Vease Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988).; y Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). A los aminoacidos dentro de la protema precursora de amiloide humano (APP) se les asignan numeros segun la secuencia de la isoforma APP77O. Terminos tales como Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 y Ap43 se refieren a un peptido Ap que contiene residuos de aminoacido 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 y 1-43.

Un "antigeno" es una entidad a la que un anticuerpo se une espedficamente.

El termino "epftopo" o "determinante antigenico" se refiere a un sitio en un antfgeno al que responden celulas B y/o T. Epftopos de celulas B se pueden formar tanto a partir de aminoacidos contiguos o aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una protema. Los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos tfpicamente se retienen en la exposicion a disolventes desnaturalizantes mientras que los epftopos formados por el plegamiento terciario tfpicamente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye normalmente al menos 3, y mas habitualmente, al menos 5 o 8-10 aminoacidos en una conformacion

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espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen, por ejemplo, cristalograffa de rayos X y la resonancia magnetica nuclear 2-dimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). los anticuerpos que reconocen el mismo epftopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la union de otro anticuerpo a un antigeno diana. Celulas T reconocen epftopos continuos de aproximadamente nueve aminoacidos para las celulas CD8 o aproximadamente 13-15 aminoacidos para las celulas CD4. Las celulas T que reconocen el epftopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferacion dependiente de antigenos, como se determina por incorporacion de 3H-timidina por las celulas T cebadas en respuesta a un epftopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), mediante matanza dependiente de antigeno (Cytotoxic T Lymphocyte Assay, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910), o por la secrecion de citoquinas.

El termino respuesta "inmunologica" o "inmunologica" es el desarrollo de una respuesta humoral beneficiosa (anticuerpo mediado) y/o una respuesta celular (mediada por celulas T de antigeno espedfico o sus productos de secrecion) dirigida contra un peptido amiloide en un paciente receptor. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administracion de inmunogeno o una respuesta pasiva inducida por la administracion de anticuerpo o celulas T cebadas. Una respuesta inmune celular se provoca por la presentacion de epftopos polipeptfdicos en asociacion con moleculas de MHC de clase I o clase II para activar las celulas T auxiliares CD4+ de antigeno espedfico y/o celulas T citotoxicas CD8+. La respuesta tambien puede implicar la activacion de monocitos, macrofagos, celulas NK, basofilos, celulas dendrfticas, astrocitos, celulas de microglia, eosinofilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunologica mediada por celulas puede determinarse mediante ensayos de proliferacion (celulas T CD4+) o ensayos CTL (linfocitos T citotoxicos) (vease Burke, supra; Tigges, supra). Las contribuciones relativas de las respuestas humoral y celular al efecto protector o terapeutico de un inmunogeno puede distinguirse aislando separadamente anticuerpos y celulas T de un animal singenico inmunizado y midiendo el efecto protector o terapeutico en un segundo sujeto.

Un "agente inmunogenico" o "inmunogeno" es capaz de inducir una respuesta inmunologica contra sf misma en la administracion a un mairftfero, opcionalmente en conjunto con un adyuvante.

El termino "polinucleotido desnudo" se refiere a un polinucleotido no complejado con materiales coloidales. Los polinucleotidos desnudos a veces se clonan en un vector plasmido.

El termino "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra conjuntamente con un antfgeno, aumenta la respuesta inmune al antfgeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmune al antfgeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de linfocitos, la estimulacion de celulas B y/o T, y la estimulacion de los macrofagos.

El termino "paciente" incluye sujetos humanos y otros mairftferos que reciben un tratamiento ya sea profilactico o terapeutico.

Ap desagregado o monomerico significa unidades peptfdicas monomericas solubles de Ap. Un metodo para preparar Ap monomerico consiste en disolver peptido liofilizado en DMSO puro con sonicacion. La solucion resultante se centrifuga para eliminar cualquier partfcula insoluble. Ap agregada es una mezcla de oligomeros en los que las unidades monomericas son mantenidas juntas mediante enlaces no covalentes.

La competencia entre anticuerpos se determina mediante un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo ensayo inhibe la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun, tal como Ap. Se conocen numerosos tipos de ensayos de union competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo en fase solida directo o indirecto (RTA), en fase solida de inmunoensayo enzimatico directo o indirecto (ETA), ensayo de competicion de sandwich (vease Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 253 (1983)); biotinavidina directa en fase solida EIA (vease Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)); ensayo de marcado directo en fase solida, ensayo sandwich marcado directo en fase solida (vease Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1988)); marcador directo RIA en fase solida usando etiqueta I-125 (vease Morel et al., Molec Immunol 25 (1): 7-15 (1988)); biotinavidin de fase solida directa EIA (Cheung et al., Virology 176: 546 552 (1990)); y RIA etiquetado directo (Moldenhauer et al., Scand J. Immunol 32: 77-82 (1990)). Tfpicamente, tal ensayo implica el uso de antfgeno purificado unido a una superficie solida o celulas que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibicion competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie solida o las celulas en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Por lo general, la inmunoglobulina de ensayo esta presente en exceso. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competicion (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epftopo como el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epftopo adyacente suficientemente proximo al epftopo unido por el anticuerpo de referencia para el impedimento esterico que se produzca. Por lo general, cuando un anticuerpo competitivo esta presente en exceso, inhibira la union espedfica de un anticuerpo de referencia a un antfgeno comun en al menos 50 o 75%.

Las composiciones o metodos "que comprenden" uno o mas elementos recitados pueden incluir otros

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elementos no enumerados espedficamente. Por ejemplo, una composicion que comprende peptido Ap que abarca tanto un peptido aislado Ap y peptido Ap como un componente de una secuencia polipeptfdica mas grande.

DESCRIPCION DETALLADA

I. General

Varias enfermedades y condiciones amiloidogenicas se caracterizan por la presencia de depositos de un peptido agregado a una masa insoluble en el cerebro de un paciente. Tales enfermedades incluyen la enfermedad de Alzheimer, smdrome de Down y deterioro cognitivo. Este ultimo es un smtoma de la enfermedad de Alzheimer y el smdrome de Down, pero tambien puede suceder sin otras caractensticas de cualquiera de estas enfermedades. Por ejemplo, deterioro cognitivo leve o perdida de memoria asociada a edad se produce en algunos pacientes que no han desarrollado todavfa, o puede que nunca desarrollen la enfermedad de Alzheimer completa. El deterioro cognitivo leve puede ser definido por puntuacion en el Examen de Estado Mini-Mental de conformidad con la convencion. Tales enfermedades se caracterizan por agregados de Ap que tienen una estructura de lamina p- plegado y tincion con el colorante Congo Rojo. El enfoque basico de la prevencion o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades amiloidogenicas mediante la generacion de una respuesta inmunogenica a un componente del deposito de amiloide en un paciente se describe en el documento WO 99/27944. La presente solicitud se reitera y confirma la eficacia del enfoque basico. La presente solicitud esta, sin embargo, dirigida principalmente a la mejora de reactivos y metodos. Estas mejoras se basan, en parte, en que los presentes inventores han localizado los epftopos preferidos dentro de Ap contra los cuales una respuesta inmunogenica debe dirigirse. La identificacion de epftopos preferidos dentro de Ap resulta en agentes y metodos que han aumentado la eficacia, potencial reducido de efectos secundarios, y/o una mayor facilidad de fabricacion, formulacion y administracion.

II. Agentes terapeuticos

Una respuesta inmunogenica puede ser activa, como cuando un inmunogeno es administrado para inducir anticuerpos reactivos con Ap en un paciente, o pasiva, como cuando se administra un anticuerpo que se une a Ap en un paciente.

1. Agentes inductores de respuesta inmune activa

Los agentes terapeuticos inducen una respuesta inmunogenica dirigida espedficamente a determinados epftopos dentro de peptidos Ap. Los agentes preferidos son el peptido Ap en sf y los segmentos de los mismos. Las variantes de tales segmentos, analogos y mimeticos de peptido Ap natural que inducen y/o reaccionan de forma cruzada con anticuerpos frente a los epftopos preferidos de Ap peptido tambien pueden utilizarse.

Ap, tambien conocido como peptido p-amiloide, o peptido A4 (vease el documento US 4.666.829; Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131-(l984)), es un peptido de 39-43 aminoacidos, que es el componente principal de placas caractensticas de la enfermedad de Alzheimer. Ap se genera por el procesamiento de una protema mas grande APP por dos enzimas, denominadas secretasas p y y (vease Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Mutaciones conocidas en APP asociadas con la enfermedad de Alzheimer se producen proxima al lugar de secretasa p o y, o dentro de Ap. Por ejemplo, la posicion 717 esta proxima al sitio de escision de Y-secretasa de APP en su procesamiento a Ap, y posiciones 670/671 estan proximas al sitio de escision de p-secretasa. Se cree que las mutaciones que causan Ea mediante la interaccion con las reacciones de escision por las cuales se forma Ap con el fin de aumentar la cantidad de la forma de aminoacido 42/43 de Ap generado.

Ap tiene la propiedad inusual de que se pueda fijar y activar tanto cascadas de complemento alternativo como clasico. En particular, se une a Clq y en ultima instancia a C3bi. Esta asociacion facilita la union a macrofagos que conduce a la activacion de las celulas B. Ademas, C3bi se deshace adicionalmente y entonces se une a CR2 en las celulas B de una manera dependiente de celulas T que conduce a un aumento de 10.000 en la activacion de estas celulas. Este mecanismo hace que Ap genere una respuesta inmunitaria en exceso de la de los otros antfgenos.

Ap tiene varias formas de origen natural. Las formas humanas de Ap se denomina Ap39, Ap40, Ap41, Ap42 y Ap43. Las secuencias de estos peptidos y su relacion con el precursor APP se ilustran mediante la FIG. 1 de Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Por ejemplo, Ap42 tiene la secuencia:

H2N-Asp-Ala-Glu-Phc-Arg-His-Asp-Scr-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-

Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH.

Ap41, Ap40 y Ap39 difieren de Ap42 por la omision de Ala, Ala-lle, y Ala-Ile-Val respectivamente desde el extremo C-terminal. Ap43 difiere de Ap42 por la presencia de un residuo de treonina en el C-termino. Los fragmentos inmunogenicos de Ap son ventajosos con respecto a la molecula intacta en los presentes metodos para varias razones. En primer lugar, debido a que solo ciertos epftopos dentro de Ap inducen una respuesta

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inmunogenica util para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, una dosificacion igual de masa de un fragmento que contiene tales epttopos proporciona una mayor concentracion molar de los epttopos inmunogenicos utiles que una dosis de Ap intacta. En segundo lugar, ciertos fragmentos inmunogenicos de Ap generan una respuesta inmunogenica contra los depositos amiloides sin generar una respuesta inmunogenica significativa contra la protema APP de la cual se deriva Ap. En tercer lugar, los fragmentos de Ap son mas faciles de fabricar que Ap intacta debido a su tamano mas corto. En cuarto lugar, los fragmentos de Ap no se agregan de la misma manera como Ap intacta, lo que simplifica la preparacion de composiciones farmaceuticas y administracion de los mismos. Algunos fragmentos inmunogenicos de Ap tienen una secuencia de al menos 2, 3, 5, 6, 10 o 20 aminoacidos contiguos de un peptido natural. Algunos fragmentos inmunogenicos no tienen mas de 10, 9, 8, 7, 5 o 3 residuos contiguos de Ap. Se prefieren fragmentos de la mitad N-terminal de Ap. Fragmentos inmunogenicos preferidos incluyen Ap1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, y 1-4. La designacion de Ap15 por ejemplo, indica un fragmento que incluye los residuos 1-5 de Ap y que carecen de otros residuos de Ap. Se prefieren particularmente los fragmentos que comienzan en los residuos 1-3 de Ap y que terminan en los residuos 7-11 de Ap. El fragmento Ap1-12 tambien se puede utilizar, pero es menos preferido. En algunos procedimientos, el fragmento es un fragmento N-terminal distinto de Ap1-10. Otros fragmentos menos preferidos incluyen Ap13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 y 35-42. Estos fragmentos requieren la deteccion de actividad en la limpieza o la prevencion de depositos amiloides como se describe en los Ejemplos antes del uso. Los fragmentos que carecen de al menos uno, y algunas veces al menos 5 o 10 aminoacidos C-terminales presentes en formas naturales de Ap se utilizan en algunos de los metodos. Por ejemplo, un fragmento que carece de 5 aminoacidos del extremo C-terminal de Ap43 incluye los primeros 38 aminoacidos del extremo N-terminal de Ap. Otros componentes de las placas de amiloide, por ejemplo, fragmentos de sinuclema, y epitopicas de los mismos tambien se pueden usar para inducir una respuesta inmunogenica.

A menos que se indique lo contrario, la referencia a Ap incluye las secuencias de aminoacidos humanas naturales indicadas anteriormente, asf como analogos incluyendo alelico, especies y variantes inducidas. Los analogos tipicamente difieren de los peptidos de origen natural en uno, dos o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservadoras. Los analogos presentan tfpicamente al menos 80 o 90% de identidad de secuencia con los peptidos naturales. Algunos analogos tambien incluyen aminoacidos no naturales o modificaciones de aminoacidos N o C-terminales de en una, dos o unas pocas posiciones. Por ejemplo, el residuo de acido aspartico en la posicion natural de 1 y/o 7 de Ap puede reemplazarse con acido isoaspartico. Ejemplos de aminoacidos no naturales son D-aminoacidos, a, a-aminoacidos disustituidos, aminoacidos N-alquilo, acido lactico, 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, u>-N-metilarginina, y acido isoaspartico. Los fragmentos y analogos se pueden cribar para la eficacia profilactica o terapeutica en modelos de animales transgenicos en comparacion con los controles no tratados o placebo como se describe a continuacion.

Ap, sus fragmentos, y analogos pueden ser sintetizados por smtesis de peptidos en fase solida o expresion recombinante, o pueden obtenerse de fuentes naturales. sintetizadores de peptidos automaticos estan disponibles comercialmente de numerosos proveedores, tales como Applied Biosystems, Foster City, California. La expresion recombinante puede ser en bacterias, tales como E. coli, levadura, celulas de insecto o celulas de mairnfero. Procedimientos para expresion recombinante son descritos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2a ed., 1989). Algunas formas de peptido Ap tambien estan disponibles comercialmente (por ejemplo, American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CAy California Peptide Research, Inc. Napa, CA).

Los agentes terapeuticos tambien incluyen polipeptidos mas largos que incluyen, por ejemplo, un fragmento activo de un peptido, junto con otros aminoacidos. Por ejemplo, los agentes preferidos incluyen protemas de fusion que comprenden un segmento de Ap fusionado a una secuencia heterologa de aminoacidos que induce una respuesta de celulas T auxiliares en contra de la secuencia de aminoacidos heterologos y de este modo una respuesta de celulas B contra el segmento Ap. Tales polipeptidos pueden ser examinados para la eficacia profilactica o terapeutica en modelos animales en comparacion con los controles no tratados o placebo como se describe a continuacion. El peptido Ap, analogo, fragmento activo u otro polipeptido que se pueden administrar en forma asociada o multimerica o en forma disociada. Agentes terapeuticos tambien incluyen multimeros de agentes inmunogenicos monomericos.

En una variacion adicional, un peptido inmunogenico, tal como un fragmento de Ap, se puede presentar por un virus o una bacteria como parte de una composicion inmunogenica. Un acido nucleico que codifica el peptido inmunogenico se incorpora en un genoma o episoma del virus o bacterias. Opcionalmente, el acido nucleico se incorpora de una manera tal que el peptido inmunogenico se expresa como una protema secretada o como una protema de fusion con una protema de la superficie externa de un virus o una protema transmembrana de una bacteria para que se muestre el peptido. Los virus o bacterias usadas en tales metodos deben ser no patogenos o atenuados. Virus adecuados incluyen adenovirus, HSV, virus de la encefalitis equina venezolana y otros virus alfa, virus de la estomatitis vesicular, y otros virus rabdo, vaccinia y viruela aviar. Las bacterias adecuadas incluyen salmonella y shigella. La fusion de un peptido inmunogenico a HBsAg de VHB es particularmente adecuada. Los agentes terapeuticos tambien incluyen peptidos y otros compuestos que no tienen necesariamente una similitud de secuencia de aminoacidos significativa con Ap pero no obstante sirven como mimeticos de Ap e inducen una respuesta inmune similar. Por ejemplo, cualesquiera peptidos y protemas que forman hojas p-plegadas pueden examinarse para determinar su idoneidad. Anticuerpos antiidiotipicos contra anticuerpos monoclonales para Ap u

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otros peptidos amiloidogenicos tambien se pueden utilizar. Tales anticuerpos anti-Id imitan el antigeno y generan una respuesta inmune (vease Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6a ed.), p. 181). Los agentes distintos de peptidos Ap deben inducir una respuesta inmunogenica contra uno o mas de los segmentos preferidos de Ap enumerados anteriormente (por ejemplo, 1-10, 1-7, 1-3, y 3-7). Preferiblemente, tales agentes inducen una respuesta inmunogenica que se dirige espedficamente a uno de estos segmentos sin ser dirigidos a otros segmentos de Ap.

Bibliotecas aleatorias de peptidos u otros compuestos tambien pueden examinarse para determinar su idoneidad. Las bibliotecas combinatorias se pueden producir para muchos tipos de compuestos que se pueden sintetizar de una manera paso por paso. Tales compuestos incluyen polipeptidos, mimeticos beta, polisacaridos, fosfoftpidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromaticos, compuestos heterodclicos, benzodiazepinas, glicinas oligomericas N-sustituidas y oligocarbamatos. Las grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos pueden ser construidas por el metodo de bibliotecas codificadas sinteticas (ESL) descrito en Affimax, WO 95/12608, Affymax, documento WO 93/06121, Universidad de Columbia, documento WO 94/08051, Pharmacopeia, documento WO 95/35503 y Scripps, WO 95/30642. Las bibliotecas de peptidos tambien pueden generarse mediante metodos de presentacion de fagos. Vease, por ejemplo, Devlin, documento WO 91/18980.

Las bibliotecas combinatorias y otros compuestos se examinan inicialmente para idoneidad mediante la determinacion de su capacidad para unirse a anticuerpos o linfocitos (B o T) conocidos por ser espedficos para Ap u otros peptidos amiloidogenicos. Por ejemplo, revisiones iniciales se pueden realizar con cualquier suero policlonal o anticuerpo monoclonal a Ap o un fragmento del mismo. Los compuestos pueden entonces ser examinados para la union a un epftopo espedfico dentro de Ap (por ejemplo, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 y 3-7). Los compuestos pueden ser probados por los mismos procedimientos descritos para las especificidades de epftopo de anticuerpo de mapeo. Los compuestos identificados por tales revisiones se analizan entonces adicionalmente por la capacidad para inducir anticuerpos o linfocitos reactivos a Ap o fragmentos de los mismos por ejemplo, multiples diluciones de los sueros se pueden ensayar en placas de microtitulacion que han sido recubiertas previamente con Ap o un fragmento del mismo y un ELISA estandar puede ser realizada para la prueba de anticuerpos reactivos a Ap o el fragmento. Los compuestos pueden ser examinados para la eficacia profilactica y terapeutica en animales transgenicos predispuestos a una enfermedad amiloidogenica, tal como se describe en los Ejemplos. Tales animales incluyen, por ejemplo, ratones que portan una mutacion 717 de APP descrita por Games et al., Supra, y los ratones que llevan una mutacion sueca 670/671 de APP tal como se describe por McConlogue et al., Us 5.612.486 y Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939 945 (1997)). El mismo enfoque de deteccion se puede utilizar en otros agentes potenciales analogos de Ap y peptidos mas largos que incluyen fragmentos de la Ap, descritos anteriormente.

2. Agentes inductores de respuesta inmune pasiva

Agentes terapeuticos de la invencion tambien incluyen anticuerpos que se unen espedficamente a Ap, como se define en las reivindicaciones. Los agentes terapeuticos de la divulgacion tambien incluyen anticuerpos que se unen espedficamente a otros componentes de placas amiloides. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Algunos de tales anticuerpos se unen espedficamente a la forma agregada de Ap sin unirse a la forma disociada. Algunos se unen espedficamente a la forma disociada sin unirse a la forma agregada. Algunos se unen a ambas formas agregadas y disociadas. Algunos de tales anticuerpos se unen a una forma corta natural de Ap (es decir, Ap39, 40 o 41) sin unirse a una forma larga natural de Ap (es decir, Ap42 y Ap43). Algunos anticuerpos se unen a una forma larga sin unirse a una forma corta. Algunos anticuerpos se unen a Ap sin unirse a la protema precursora amiloide de longitud completa. Los anticuerpos utilizados en los metodos terapeuticos por lo general tienen una region constante intacta o al menos suficiente de la region constante para interaccionar con un receptor de Fc. IgG1 de isotipo humano es preferido debido a que tiene mayor afinidad de los isotipos humanos por el receptor FcRI en celulas fagodticas. fragmentos biespedficos Fab tambien se pueden utilizar, en el que un brazo del anticuerpo tiene especificidad para Ap, y el otro para un receptor de Fc. Algunos anticuerpos se unen a Ap con una afinidad de union mayor que o igual a aproximadamente 106, 107, 108, 109, o 1010 M-1.

Los sueros policlonales tfpicamente contienen poblaciones mixtas de anticuerpos que se unen a varios epftopos a lo largo de la longitud de Ap. Sin embargo, los sueros policlonales pueden ser espedficos para un segmento particular de Ap, tal como Ap1-10. Los anticuerpos monoclonales se unen a un epftopo espedfico dentro de Ap que puede ser un epitope conformacional o no conformacional. La eficacia profilactica y terapeutica de anticuerpos puede ensayarse usando los procedimientos de modelo animal transgenico descritos en los Ejemplos. Anticuerpos monoclonales preferidos se unen a un epftopo dentro de los residuos 1-10 de Ap (con el primer residuo N-terminal de Ap ffsica designada 1). Algunos anticuerpos monoclonales preferidos se unen a un epftopo dentro de los aminoacidos 1-5, y algunos para un epftopo dentro de 5-10. Algunos anticuerpos preferidos se unen a epftopos dentro de los aminoacidos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 o 3-7. Algunos anticuerpos preferidos se unen a un epftopo a partir de los residuos 1-3 y terminando en los residuos 7-11 de Ap. Anticuerpos menos preferidos incluyen los que se unen a epftopos con los residuos 10-15, 15-20, 25-30, 10-20, 20, 30, o 10-25 de Ap. Se recomienda que tales anticuerpos sean examinados para la actividad en el modelo de raton descrito en los Ejemplos antes del uso. Por ejemplo, se ha encontrado que ciertos anticuerpos contra epftopos dentro de los residuos 10-18, 16-24, 18-21 y 33-42 carecen de

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actividad. En algunos metodos, se utilizan multiples anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de union a epftopos diferentes. Tales anticuerpos se pueden administrar secuencialmente o simultaneamente. Los anticuerpos para los componentes amiloides distintos de Ap tambien se pueden utilizar. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser dirigidos a la sinuclema de protema asociada a amiloide.

Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epftopo dentro de residuos especificados, tales como Ap 1-5 por ejemplo, lo que se entiende es que el anticuerpo se une espedficamente a un polipeptido que contiene los residuos especificados (es dear, Ap 1-5 en este ejemplo). Tal anticuerpo no contacta necesariamente con cada residuo dentro de Ap 1-5. Tampoco afecta necesariamente de modo significativo la afinidad de union de cada sustitucion o eliminacion de aminoacido dentre de Ap1-5. La especificidad de epftopo de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, formando una biblioteca de presentacion en fagos en la que diferentes miembros presentan diferentes subsecuencias de Ap. La biblioteca de presentacion de fagos se selecciona a continuacion para los miembros de union espedfica a un anticuerpo bajo ensayo. Se afsla una familia de secuencias. Tfpicamente, una tal familia contiene una secuencia central comun, y diversas longitudes de secuencias flanqueantes en los diferentes miembros. La secuencia central mas corta que muestra union espedfica al anticuerpo define el epftopo unido por el anticuerpo. Los anticuerpos tambien pueden ensayarse para determinar la especificidad de epftopo en un ensayo de competicion con un anticuerpo cuya especificidad de epftopo ya se ha determinado. Por ejemplo, anticuerpos que compiten con el anticuerpo 3D6 para la union a Ap se unen al mismo o similar epftopo que 3D6, es decir, dentro de los residuos Ap 1-5. Del mismo modo anticuerpos que compiten con el anticuerpo 10D5 se unen al mismo o similar epftopo, es decir, dentro de residuos de Ap 3-6. la deteccion de anticuerpos de la especificidad de epftopo es un predictor util de la eficacia terapeutica. Por ejemplo, un anticuerpo determinado que se une a un epftopo dentro de los residuos 1-7 de la Ap es probable que sea eficaz en la prevencion y tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen espedficamente a un segmento preferido de Ap sin unirse a otras regiones de Ap tienen un numero de ventajas con respecto a anticuerpos monoclonales que se unen a otras regiones o sueros policlonales a Ap intacta. En primer lugar, para dosificaciones de masa iguales, las dosificaciones de anticuerpos que se unen espedficamente a segmentos preferidos contienen una dosis mas alta molar de anticuerpos eficaces en la limpieza de placas de amiloide. En segundo lugar, los anticuerpos se unen espedficamente a segmentos preferidos pueden inducir una respuesta de eliminacion contra depositos amiloides sin inducir una respuesta de eliminacion contra polipeptido APP intacto, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios.

i. Caractensticas generales de las inmunoglobulinas

La unidad estructural basica del anticuerpo es conocida por comprender un tetramero de subunidades. Cada tetramero esta compuesto de dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porcion aminoterminal de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos responsables principalmente del reconocimiento del antfgeno. La porcion carboxiterminal de cada cadena define una region constante responsable principalmente de la funcion efectora. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen por una region "J" de aproximadamente 12 o mas aminoacidos, incluyendo la cadena pesada tambien una region "D" de aproximadamente 10 aminoacidos mas. (Vease en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a ed., Raven Press, Nueva York, 1989), cap. 7.

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de union de anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de union. Salvo en anticuerpos bifuncionales o biespedficos, los dos sitios de union son los mismos. Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, tambien llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par estan alineadas por las regiones marco, lo que permite la union a un epftopo espedfico. De N-terminal a C-terminal, tanto cadenas ligeras como pesadas comprenden los dominios fR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignacion de aminoacidos a cada dominio esta de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), o Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia y colaboradores, Nature 342: 878-883 (1989).

ii. La produccion de anticuerpos no humanos

La produccion de anticuerpos no humanos monoclonales, por ejemplo, murino, cobaya, primate, conejo o rata, se puede lograr mediante, por ejemplo, inmunizando del animal con Ap. Un polipeptido mas largo que comprende Ap o un fragmento inmunogenico de anticuerpos Ap o antiidiotfpicos a un anticuerpo a Ap tambien se pueden utilizar. Vease Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Tal inmunogeno puede ser obtenido a partir de una fuente natural, mediante smtesis peptfdica o mediante expresion recombinante. Opcionalmente, el inmunogeno puede administrarse fusionado o no complejado con una protema portadora, tal como se describe a continuacion. Opcionalmente, el inmunogeno puede administrarse con un adyuvante. Existen

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varios tipos de adyuvante que pueden usarse como se describe a continuacion. Adyuvante Completo de Freund seguido de adyuvante incomplete se prefiere para la inmunizacion de animales de laboratorio. Conejos o cobayas se utilizan tipicamente para preparar anticuerpos policlonales. Los ratones se usan tipicamente para preparar anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se seleccionaron para la union a Ap. Opcionalmente, los anticuerpos se criban adicionalmente para la union a una region espedfica de Ap. Este ultimo cribado puede llevarse a cabo mediante la determinacion de la union de un anticuerpo a una coleccion de mutantes de delecion de un peptido Ap y determinar que mutantes de delecion se unen al anticuerpo. La union puede evaluarse, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. El fragmento mas pequeno que muestra union espedfica al anticuerpo define el epftopo del anticuerpo. Alternativamente, la especificidad de epftopo se puede determinarse por un ensayo de competicion en el que un anticuerpo de ensayo y de referencia compiten para la union a AB. Si los anticuerpos de ensayo y de referencia compiten, a continuacion, se unen al mismo epftopo o epftopos suficientemente proximales que la union de un anticuerpo interfiere con la union del otro. El isotipo preferido para tales anticuerpos es IgG2a de isotipo de raton o isotipo equivalente en otras especies. IgG2a de isotipo de raton es el equivalente de IgG1 de isotipo humano.

iii. Los anticuerpos quimericos y humanizados

Los anticuerpos quimericos y humanizados tienen la misma o similar especificidad de union y afinidad como un raton u otro anticuerpo no humano que proporciona el material de partida para la construccion de un anticuerpo quimerico o humanizado. Anticuerpos quimericos son anticuerpos cuya luz y genes de cadena pesada se han construido, tipicamente por ingeniena genetica, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de raton pueden unirse a segmentos constantes humanos (C), tales como IgG1 e IgG4. Se prefiere IgG1 de isotipo humano. Un anticuerpo quimerico tfpico es por lo tanto una protema hterida que consiste en el dominio de union a V o al antfgeno de un anticuerpo de raton y el dominio C o efector de un anticuerpo humano.

Los anticuerpos humanizados tienen residuos de marco de region variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado un anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de una anticuerpo de raton, (denominado inmunoglobulina donante). Vease, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 10029-10033 (1989) y WO 90/07861, US 5.693.762, US 5.693.761, US 5.585.089, US 5.530.101 y Winter, US 5.225.539. La region constante, si esta presente, tambien es sustancial o completamente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos suelen ser elegidos a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias de marco presentan un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de region variable murina a partir de los cuales se derivaron las CDR. Los residuos de marco de region variable de cadena pesada y ligera pueden derivar de las mismas o diferentes secuencias de anticuerpo humano. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden ser secuencias de consenso de varios anticuerpos humanos. Vease Carter et al., WO 92/22653. Ciertos aminoacidos de los residuos de marco de region variable humana se seleccionan para la sustitucion basandose en su posible influencia sobre la conformacion de CDR y/o la union a antfgeno. La investigacion de tales influencias posibles se realiza por modelado, examen de las caractensticas de los aminoacidos en localizaciones particulares, o la observacion empftica de los efectos de la sustitucion o la mutagenesis de aminoacidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoacido difiere entre un residuo de marco de region variable murina y un residuo de marco de region variable humana seleccionada, el aminoacido del marco humano generalmente debena sustituirse por el aminoacido de marco equivalente del anticuerpo de raton cuando se espera razonablemente que el aminoacido:

(1) se une de forma no covalente directamente al antfgeno,

(2) es adyacente a una region CDR,

(3) interacciona de otra manera con una region CDR (por ejemplo, dentro de aproximadamente 6 A de una

region CDR), o

(4) participa en la interfaz VL-VH.

Otros candidatos para la sustitucion son aminoacidos de marco de estructura humana aceptor que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posicion. Estos aminoacidos pueden sustituirse con aminoacidos de la posicion equivalente del anticuerpo donante de raton o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas mas tfpicas. Otros candidatos para la sustitucion son aceptores de aminoacidos del marco humano que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posicion. Los marcos de region variable de inmunoglobulinas humanizadas normalmente muestran al menos 85% de identidad de secuencia a unz secuencia de marco de zona variable humana o consenso de dichas secuencias.

iv. Anticuerpos humanos

Los anticuerpos humanos contra Ap son proporcionados por una variedad de tecnicas descritas a continuacion. Algunos anticuerpos humanos son seleccionados por experimentos de union competitiva, o de otra manera, para tener la misma especificidad de epftopo que un anticuerpo de raton particular, tal como uno de los

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anticuerpos monoclonales de raton descritos en el Ejemplo XI. Los anticuerpos humanos tambien se pueden cribar para una especificidad de epftopo particular mediante el uso de solo un fragmento de Ap como el inmunogeno, y/o mediante el cribado de anticuerpos contra una coleccion de mutantes de delecion de Ap. Los anticuerpos humanos tienen preferiblemente IgG1 humana de especificidad de isotipo.

(I) Metodologfa del trioma

El enfoque basico y una pareja de fusion celular ejemplar, SPAZ-4, para su uso en este enfoque han sido descritos por Oestberg et al., Hybridoma 2: 361-367 (1983); Oestberg, Patente de EE.UU. N° 4.634.664; y Engleman et al., Patente de Estados Unidos 4.634.666. Las lmeas celulares productoras de anticuerpos obtenidas por este procedimiento se denominan triomas, debido a que descienden de tres celulas--dos humanas y una de raton. Inicialmente, una lmea de mieloma de raton se fusiona con un B-limfocito humano para obtener una celula tftbrida xenogeneica no productora de anticuerpo, tales como la lmea celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, supra. La celula xenogenica es fusionada con un B-limfocito humano inmunizado para obtener una lmea celular de trioma productor de anticuerpo. Triomas han demostrado producir anticuerpos de forma mas estable que los hibridomas ordinarios hechos de celulas humanas.

Los linfocitos B inmunizados se obtienen de la sangre, el bazo, los ganglios linfaticos o medula osea de un donante humano. Si se desean anticuerpos frente a un antfgeno o epftopo espedfico, es preferible usar ese antfgeno o epftopo para la inmunizacion. La inmunizacion puede ser o bien in vivo o in vitro. Para la inmunizacion in vivo, las celulas B se afslan tfpicamente a partir de un humano inmunizado con Ap, un fragmento del mismo, polipeptido mas grande que contiene Ap o fragmento, o un anticuerpo antiidiotfpico a un anticuerpo a Ap. En algunos procedimientos, las celulas B se afslan del mismo paciente que es la terapia de anticuerpos en ultima instancia, a ser administrado. Para la inmunizacion in vitro, los linfocitos B estan tfpicamente expuestos a antfgeno durante un periodo de 7-14 dfas en un medio tal como RPMI-1640 (vease Engleman, supra) suplementado con plasma humano al 10%.

Los linfocitos B inmunizados se fusionan a una celula tftbrida xenogenica tal como SPAZ-4 por metodos bien conocidos. Por ejemplo, las celulas se tratan con 40-50% polietilenglicol de MW 1000-4000, a aproximadamente 37 grados C, durante aproximadamente 5-10 min. Las celulas se separan de la mezcla de fusion y se propagan en medio selectivo para los hftbridos deseados (por ejemplo, HAT o Ah). Los clones que secretan anticuerpos que tienen la especificidad de union requerida son identificados ensayando el medio de cultivo del trioma para la capacidad de unirse a Ap o un fragmento del mismo. Los triomas que producen anticuerpos humanos que tienen la especificidad deseada se subclonan por la tecnica de dilucion limitante y se cultivan in vitro en medio de cultivo. Las lmeas de celulas de trioma obtenidas se ensayaron luego para determinar la capacidad de unir Ap o un fragmento del mismo.

Aunque triomas son geneticamente estables no producen anticuerpos en niveles muy altos. Los niveles de expresion pueden aumentarse clonando genes de anticuerpos del trioma en uno o mas vectores de expresion, y transformando el vector en lmeas celulares estandar de mamfero, bacterianas o de levadura.

(2) Mairftferos transgenicos no humanos

Anticuerpos humanos contra Ap tambien se pueden producir a partir de mamferos transgenicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana. Por lo general, el locus de inmunoglobulina endogena de dichos mairftferos transgenicos esta funcionalmente inactivado. Preferiblemente, el segmento del locus de inmunoglobulina humana incluye secuencias no reorganizadas de componentes de la cadena pesada y ligera. Tanto la inactivacion de genes de inmunoglobulina endogena y la introduccion de genes de inmunoglobulina exogena se puede lograr mediante recombinacion homologa diana, o por introduccion de cromosomas YAC. Los mamferos transgenicos resultantes de este proceso son capaces de reorganizar funcionalmente las secuencias componentes de inmunoglobulina, y expresar un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humana, sin expresar los genes de inmunoglobulina endogenos. La produccion y propiedades de los mamferos que tienen estas propiedades se describen en detalle por, por ejemplo, Lonberg et al., W093/12227 (1993).; US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741-(1991). Los ratones transgenicos son particularmente adecuados. Anticuerpos Anti-Ap se obtienen mediante la inmunizacion de un mairftfero no humano transgenico, tal como se describe por Lonberg o Kucherlapati, supra, con Ap o un fragmento del mismo. Anticuerpos monoclonales se preparan mediante, por ejemplo, la fusion de celulas B de dichos mairftferos a lmeas celulares de mieloma adecuadas utilizando tecnologfa Kohler-Milstein convencional. anticuerpos policlonales humanos tambien se pueden proporcionar en la forma de suero de seres humanos inmunizados con un agente inmunogeno. Opcionalmente, tales anticuerpos policlonales se pueden concentrar mediante purificacion por afinidad usando Ap u otro peptido amiloide como un reactivo de afinidad.

(3) Metodos de exposicion de fagos

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Un enfoque adicional para obtener anticuerpos anti-Ap humanos es para cribar una biblioteca de ADN de celulas B humanas segun el protocolo general esbozado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Como se ha descrito para la metodologfa de trioma, tales celulas B pueden obtenerse a partir de un humano inmunizado con Ap, fragmentos, polipeptidos mas largos que contienen Ap o fragmentos o anticuerpos antiidiotfpicos. Opcionalmente, dichas celulas B se obtienen a partir de un paciente quien en ultima instancia ha de recibir el tratamiento con anticuerpos. Se seleccionan anticuerpos que se unen a Ap o un fragmento del mismo. Las secuencias que codifican tales anticuerpos (o fragmentos de union) se clonan a continuacion y se amplifican. El protocolo descrito por Huse se hace mas eficiente en combinacion con tecnologfa de presentacion de fagos. Vease, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271 y MeCafferty et al., WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 y US 5.565.332. En estos metodos, bibliotecas de fago se producen en la que los miembros presentan diferentes anticuerpos en sus superficies exteriores. Los anticuerpos generalmente se muestran como fragmentos Fv o Fab. Fagos que presentan anticuerpos con una especificidad deseada se seleccionan mediante enriquecimiento por afinidad a un peptido Ap o fragmento del mismo.

En una variacion del metodo de presentacion de fagos, los anticuerpos humanos que tienen la especificidad de union de un anticuerpo murino seleccionado pueden ser producidos. Vease Winter, el documento WO 92/20791. En este metodo, ya sea la region variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado se usa como un material de partida. Si, por ejemplo, una region variable de cadena ligera se selecciona como el material de partida, una biblioteca de fagos se construye en la que elementos representan la misma region de cadena ligera variable (es dear, el material de partida murino) y una cadena pesada de la region variable diferente. Las regiones variables de cadena pesada se obtienen a partir de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humana reordenada. Un fago que muestra una fuerte union para Ap espedfico (por ejemplo, al menos 108 y preferiblemente al menos 109 M'1) se selecciona. La cadena pesada de la region variable humana de este fago sirve a continuacion como material de partida para la construccion de una biblioteca de fagos adicional. En esta biblioteca, cada fago muestra la misma region variable de cadena pesada (es dear, la region identificada a partir de la primera biblioteca de presentacion) y una region variable de cadena ligera diferente. Las regiones variables de cadena ligera se obtienen a partir de una biblioteca de regiones de cadena ligera variable humana reordenada. Una vez mas, el fago que muestra una fuerte union espedfica para Ap se seleccionan. Estos fagos muestran las regiones variables de los anticuerpos anti-Ap completamente humanos. Estos anticuerpos por lo general tienen la misma o similar especificidad de epftopo que el material de partida murino.

v. Seleccion de la region constante

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quimericos, humanizados, o humanos pueden ser vinculados a al menos una porcion de una region constante humana. La eleccion de la region constante depende, en parte, de si el complemento dependiente de anticuerpo y/o toxicidad mediada por celulas se desea. Por ejemplo, los isotopos IgG1 y IgG3 tienen actividad del complemento e isotipos IgG2 e IgG4 no la tienen. La eleccion de isotipo tambien puede afectar paso del anticuerpo en el cerebro. Se prefiere IgG1 de isotipo humano. Regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrameros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab'F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera estan unidos a traves de un espaciador.

VI. Expresion de anticuerpos recombinantes

Anticuerpos quimericos, humanizados y humanos se producen tfpicamente por expresion recombinante. Constructos de polinucleotido recombinante tfpicamente incluyen una secuencia de control de la expresion unida operativamente a las secuencias codificantes de cadenas de anticuerpo, incluyendo regiones promotoras naturalmente asociadas o heterologas. Preferiblemente, las secuencias de control de expresion son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar celulas huesped eucarioticas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huesped apropiado, el huesped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresion de alto nivel de las secuencias de nucleotidos, y la recoleccion y purificacion de los anticuerpos de reaccion cruzada.

Estos vectores de expresion son tfpicamente replicables en los organismos huesped ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomico del huesped. Comunmente, vectores de expresion contienen marcadores de seleccion, por ejemplo, resistencia de amicilina o resistencia de higromicina, para permitir la deteccion de aquellas celulas transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un huesped procariota particularmente util para clonar las secuencias de ADN de la presente descripcion. Los microbios, tales como levaduras tambien son utiles para la expresion. Saccharomyces es un huesped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresion, un origen de replicacion, secuencias de terminacion y similares, como se desee. Los promotores tfpicos incluyen 3-quinasa fosfoglicerato y otras enzimas glicolfticas. promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de deshidrogenasa de alcohol, isocitocromo C, y enzimas responsables de la utilizacion de maltosa y galactosa.

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Las celulas de mamfero son un huesped preferido para expresar segmentos de nucleotidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Vease Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Un numero de lmeas de celulas huesped adecuadas capaces de secretar protemas heterologas intactas se han desarrollado en la tecnica, e incluyen lmeas de celulas CHO, diversas lmeas celulares COS, celulas HeLa, celulas L y lmeas celulares de mieloma. Preferiblemente, las celulas son no humanas. Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir secuencias de control de la expresion, tales como un origen de replicacion, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de informacion necesarios de procesamiento, tales como sitios de union a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilacion, y secuencias terminadoras de la transcripcion. secuencias de control de la expresion preferidas son promotores derivados de genes endogenos, citomegalovirus, SV4O, adenovirus, virus del papiloma bovino, y similares. Vease Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992).

Alternativamente, las secuencias codificantes de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para la introduccion en el genoma de un animal transgenico y la expresion posterior en la leche del animal transgenico (vease, por ejemplo, US 5.741.957, US 5.304.489, Us 5.849.992). transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para las cadenas ligeras y/o pesadas en union operativa con un promotor y potenciador de un gen espedfico de la glandula mamaria, tal como casema o lactoglobulina beta.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interes se pueden transferir a la celula huesped por procedimientos bien conocidos, dependiendo del tipo de huesped celular. Por ejemplo, la transfeccion con cloruro de calcio se utiliza comunmente para las celulas procarioticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporacion, lipofeccion, bioftstica o transfeccion a base viral puede utilizarse para otros huespedes celulares. Otros metodos utilizados para transformar celulas de marnffero incluyen el uso de polibreno, fusion de protoplastos, liposomas, electroporacion, y microinyeccion (vease en general, Sambrook et al., Supra). Para la produccion de animales transgenicos, los transgenes pueden microinyectarse en oocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de celulas madre embrionarias, y los nucleos de dichas celulas transferidas a oocitos enucleados.

Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estandar de la tecnica, incluyendo la purificacion por HPLC, cromatograffa en columna, electroforesis de gel y similares (vease, en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

3. Las protemas transportadoras

Algunos agentes para inducir una respuesta inmune contienen el epftopo apropiado para inducir una respuesta inmune contra los depositos amiloides pero son demasiado pequenos para ser inmunogenicos. En esta situacion, un inmunogeno de peptido puede estar unido a un portador adecuado para ayudar a provocar una respuesta inmunitaria. Los portadores adecuados incluyen albuminas sericas, hemoeyanina de lapa californiana, moleculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbumina, toxoide tetanico, o un toxoide de otras bacterias patogenas, tales como difteria, E. coli, colera, o H. pylori, o un derivado de toxina atenuada. Otros portadores incluyen epftopos de celulas T que se unen a multiples alelos de MHC, por ejemplo, al menos el 75% de todos los alelos de MhC humanos. Tales portadores se conocen a veces en la tecnica como "epftopos universales de celulas T". Los ejemplos de epftopos de celulas T universales incluyen:

Influenza hemaglutinina: HA307-319 PKYVKQNTLKLAT

PADRE (residuos comunes en negrita) AKXVAAWTLKAAA

Malaria CS: T3 epftopo EKKIAKMEKASSVFNV

Anrtgeno de superficie hepatitis B: HBsAG-ig-28 FFLLTRILTI

Protema de choque termico 65: hsp65-i53--m DQSIGDLIAEAMDKVGNEG

bacilo Calmette-Guerin QVHFQPLPPAVVKL

Toxoide tetanico: TT330-844 QYIKANSKFIGITEL

Toxoide tetanico: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

HIV gp120 T1: KQI INMWQEVGKAMYA.

Otros portadores para estimular o potenciar una respuesta inmune incluyen citoquinas tales como peptidos IL-1, IL-1 a y p, IL-2, yInF, IL-10, GM-CSF, y quimiocinas, tal como MIP1a y p y RANTES. Los agentes inmunogenicos tambien se pueden vincular a peptidos que potencian el transporte a traves de tejidos, como se describe en O'Mahony, WO 97/17613 y WO 97/17614.

Los agentes inmunogenicos pueden estar vinculados a los portadores mediante reticulacion qmmica. Las tecnicas para la vinculacion de un inmunogeno a un portador incluyen la formacion de enlaces de disulfuro usando N-succinimidilo-3-(2-piridilo-tio) propionato (SPDP) y succinimidilo 4-(N-maleimidometilo)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (si el peptido carece de un grupo de sulfhidrilo, esto puede ser proporcionado mediante la adicion de un residuo de cistema). Estos reactivos crean un enlace de disulfuro entre ellos mismos y peptido de cistema reside en una protema y un enlace de amida a traves del un amino en una lisina, u otro grupo de amino libre en otros aminoacidos. Una variedad de tales agentes formadores de disulfuro/amida se describen por Immun. Rev. 62, 185 (1982). Otros agentes de acoplamiento bifuncionales forman un tioeter en lugar de un enlace de disulfuro. Muchos

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de estos agentes formadores de tioeter estan disponibles comercialmente e incluyen esteres reactivos de 6-acido maleimidocaproico, 2-acido bromoacetico, y 2-acido yodoacetico, 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1-acido carbox^lico. Los grupos de carboxilo se pueden activar combinandolos con succinimida o 1-hydroxilo-2-nitro-4-acido sulfonico, sal de sodio.

Los peptidos inmunogenicos tambien pueden expresarse como protemas de fusion con portadores (es dedr, peptidos heterologos). El peptido inmunogenico puede estar ligado en su extremo amino terminal, su extremo carboxilo terminal, o ambos a un portador. Opcionalmente, multiples repeticiones del peptido inmunogenico pueden estar presentes en la protema de fusion. Opcionalmente, un peptido inmunogenico puede estar ligado a multiples copias de un peptido heterologo, por ejemplo, tanto en los extremos N y C del peptido. Algunos peptidos portadores sirven para inducir una respuesta de celulas T auxiliares contra el peptido portador. Las celulas T auxiliares inducen a su vez una respuesta de celulas B contra el peptido inmunogenico ligado al peptido portador.

Algunos agentes de la divulgacion comprenden una protema de fusion en la que un fragmento N-terminal

de Ap esta vinculado en su C-termino a un peptido portador. En tales agentes, el residuo N-terminal del fragmento

de Ap constituye el residuo N-terminal de la protema de fusion. Por consiguiente, tales protemas de fusion son

eficaces en la induccion de anticuerpos que se unen a un epftopo que requiere el residuo N-terminal de Ap a estar

en forma libre. Algunos agentes de la descripcion comprenden una pluralidad de repeticiones de un segmento N- terminal de Ap vinculado en el C-termino a una o mas copias de un peptido portador. El fragmento N-terminal de Ap incorporado en tales protemas de fusion a veces comienza en Ap1-3 y termina en Ap7-11. Ap1-7, Ap1-3, 1-4, 1-5, y 3-7 es fragmento N-terminal preferido de Ap. Algunas protemas de fusion comprenden diferentes segmentos N- terminales de Ap en tandem. Por ejemplo, una protema de fusion puede comprender Ap1-7 seguido de un Ap1-3 seguido de un peptido heterologo.

En algunas protemas de fusion, un segmento N-terminal de Ap se fusiona en su extremo N-terminal a un peptido portador heterologo. La misma variedad de segmentos N-terminales de Ap puede utilizarse como con fusiones C-terminales. Algunas protemas de fusion comprenden un peptido heterologo ligado al N-termino de un segmento N-terminal de Ap, que es a su vez se vincula a uno o mas segmentos N-terminales de Ap en tandem.

Algunos ejemplos de protemas de fusion adecuadas para uso en la divulgacion se muestran a continuacion. Algunas de estas protemas de fusion comprenden segmentos de Ap vinculado al epttopos de toxoides tetanos tal como se describe en el documento US 5.196.512, EP 378.881 y EP 427.347. Algunas protemas de fusion comprenden segmentos de Ap vinculados a peptidos portadores descritos en la US 5.736.142. Algunos peptidos heterologos son epitopos de celulas T universales. En algunos procedimientos, el agente para la administracion es simplemente una unica protema de fusion con un segmento Ap ligado a un segmento heterologo en configuracion lineal. En algunos metodos, el agente es multimero de protemas de fusion representadas por la formula 2X, en la que x es un numero entero de 1-5. Preferiblemente x es 1, 2 o 3, siendo 2 el mas preferido. Cuando x es dos, tal multfmero tiene cuatro protemas de fusion con enlaces en una configuracion preferida denominada MAP4 (vease el documento US 5.229.490). Epftopos de Ap estan subrayados.

La configuracion MAP4 se muestra a continuacion, donde las estructuras ramificadas son producidas mediante el inicio de la smtesis de peptidos tanto en las aminas N terminales y de cadena lateral de la lisina. Dependiendo del numero de veces que la lisina se incorpora en la secuencia y se dejo en rama, la estructura resultante presentara multiples N-terminales. En este ejemplo, cuatro N-terminales identicos se han producido en el nucleo que contiene lisina ramificada. Tal multiplicidad mejora en gran medida la capacidad de respuesta de las celulas B afines.

imagen1

AN90549 (Ap 1-7/Toxoide tetanico 830-844 en una configuracion MAP4): DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL

AN90550 (Ap 1-7/Toxoide tetanico 947-967 en una configuracion MAP4):

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DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

AN90542 (Ap 1-7/Toxoide tetanico 830-844 + 947-967 en una configuracion lineal): DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFIVSFWLRVPKVSASHLE

AN90576: (Ap 3-9)/Toxoide tetanico 830-844 en una configuracion MAP4): EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL

Peptido descrito en el documento US 5.736.142 (todos en configuraciones lineales): AN90562 (Ap 1-7/peptido) AKXVAAWTLKAAADAEFRHD

AN90543 (Ap 1-7 x 3/peptido): DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA

Otros ejemplos de protemas de fusion (epttopo inmunogenico de Ap en negrita) incluyen AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD DAEFRHD- DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT

DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT

DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-

QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD

DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-

DAEFRHD

DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL en una resina de 2 ramas

imagen2

EQVTNVGGAISQAVHAAHAETNEAGR (protema de fusion sinuclema en configuracion MAP4)

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Las mismas o similares protemas de portador y metodos de vinculacion se pueden utilizar para la generacion de inmunogenos para utilizarse en la generacion de anticuerpos contra Ap para su uso en inmunizacion pasiva. Por ejemplo, Ap o un fragmento ligado a un portador puede administrarse a un animal de laboratorio en la produccion de anticuerpos monoclonales frente a Ap.

4. Acidos nucleicos que codifican agentes terapeuticos

Las respuestas inmunes contra depositos amiloides tambien pueden ser inducidos por la administracion de acidos nucleicos que codifican segmentos de peptido Ap, y fragmentos de los mismos, otros inmunogenos peptfdicos, o anticuerpos y sus cadenas de componentes usadas para inmunizacion pasiva. Tales acidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de acido nucleico que codifica un inmunogeno tfpicamente se vincula a elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresion del segmento de ADN en las celulas diana previstas de un paciente. Para la expresion en celulas sangumeas, como es deseable para la induccion de una respuesta inmune, elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o el promotor temprano intermedio de CMV y el potenciador son adecuados para la expresion directa. Los elementos reguladores unidos y las secuencias codificantes a menudo se clonan en un vector. Para la administracion de anticuerpos de cadena doble, las dos cadenas pueden clonarse en iguales o distintos vectores.

Un numero de sistemas de vectores virales estan disponibles, incluyendo sistemas retrovirales (vease, por ejemplo, Lawrie y Tumin, Cur Opin Genet Develop. 3, 102-109 (1993)); vectores adenovirales (vease, por ejemplo, Bett et al., J. Virol 67, 5911 (1993)); vectores de virus asociados a adeno (vease, por ejemplo, Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), vectores virales de la familia de la viruela, incluyendo virus vaccinia y los virus de la viruela aviar, vectores virales del genero de virus alfa tales como los derivados de Virus de Bosque Sindbis y Semliki (vease, por ejemplo, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (vease el documento US 5.643.576) y rabdovirus, tales como el virus de la estomatitis vesicular (vease el documento WO 96/34625) y virus del papiloma (Ohe et al., Human gene Therapy 6, 325-333 (1995)) y;. Woo et al., WO 94/12629 y Xiao y Brandsma, Nucleic Acids Res 24, 2630-2622 (1996)).

ADN que codifica un inmunogeno, o un vector que contiene el mismo, puede empaquetarse en liposomas. Los lfpidos adecuados y analogos relacionados se describen en US 10 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 y 5.283.185. Los vectores y el ADN que codifican un inmunogeno tambien pueden adsorberse a o asociarse con portadores particulados, ejemplos de los cuales incluyen polfmeros y polilactidas de metacrilato de metilo y poli(lactidacoglicolidas), vease, por ejemplo, McGee et al., J. Micro Encap. (1996).

Vectores de terapia genica o ADN desnudo se pueden administrar in vivo por administracion a un paciente individual, tipicamente por administracion sistemica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, nasal, gastrica, intradermica, intramuscular, subdermica, o infusion intracraneal) o aplicacion topica (vease, por ejemplo, US 5.399.346). Tales vectores pueden incluir ademas agentes auxiliares tales como bupivacama (US 5.593.970). El ADN tambien puede administrarse usando una pistola genica. Vease Xiao y Brandsma, supra. El ADN que codifica un inmunogeno se precipita sobre la superficie de perlas metalicas microscopicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o expandiendo gas de helio, y penetran los tejidos a una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, el AccelTM Gene Delivery Device fabricado por Agacetus, Inc. Middleton WI es adecuado. Alternativamente, el ADN desnudo puede pasar a traves de la piel en el torrente sangumeo simplemente mediante la deteccion de la ADN sobre la piel con irritacion qmmica o mecanica (vease el documento WO 95/05853).

En una variacion adicional, los vectores que codifican inmunogenos pueden suministrarse a celulas ex vivo, tales como celulas explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de medula osea, biopsia tisular) o celulas madre hematopoyeticas donantes universales, seguido por reimplantacion de las celulas en un paciente, usualmente despues de seleccion para celulas que han incorporado el vector.

III. Examen de los anticuerpos para la actividad de eliminacion

La descripcion proporciona procedimientos de cribado de un anticuerpo para la actividad en la limpieza de un deposito de amiloide o cualquier otro antfgeno, o entidad biologica asociada, para la que la actividad de compensacion se desea. Para explorar la actividad contra un deposito amiloide, una muestra de tejido de un cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer o un modelo animal que tiene la patologfa de Alzheimer caractenstica se pone en contacto con celulas fagocfticas que llevan un receptor Fc, tales como celulas microgliales, y el anticuerpo bajo ensayo en un medio in vitro. Las celulas pagocfticas pueden ser un cultivo primario o una lmea celular, tal como BV-2, C8-B4, o THP-1. En algunos procedimientos, los componentes se combinan en un portaobjetos de microscopio para facilitar el control microscopico. En algunos metodos, multiples reacciones se realizan en paralelo en los pocillos de una placa de microtitulacion. En un formato de este tipo, se puede emplear un portaobjetos de microscopio en miniatura separado se puede montar en los pocillos separados, o un formato de deteccion no microscopico, tal como deteccion de ELISA de Ap. Preferiblemente, se hace una serie de mediciones de la cantidad de deposito de amiloide en la mezcla de reaccion in vitro, partiendo de un valor basal antes de que la reaccion ha procedido, y uno o mas valores de ensayo durante la reaccion. El antfgeno puede detectarse por tincion, por ejemplo, con un anticuerpo marcado con fluorescencia a Ap u otro componente de placas amiloides. El

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anticuerpo usado para la tincion puede o no ser el mismo que el anticuerpo que se esta examinando para la limpieza de actividad. Una reduccion relativa a la lmea basal durante la reaccion de los depositos amiloides indica que el anticuerpo bajo ensayo tiene actividad de eliminacion. Tales anticuerpos son probablemente utiles en la prevencion o el tratamiento y la enfermedad de Alzheimer de otras enfermedades amiloidogenicas.

Metodos analogos se pueden utilizar para examinar anticuerpos para la actividad en limpieza de otros tipos de entidades biologicas. El ensayo se puede usar para detectar la actividad de eliminacion contra practicamente cualquier tipo de entidad biologica. Tfpicamente, la entidad biologica tiene alguna funcion en la enfermedad humana o animal. La entidad biologica puede proporcionarse como una muestra de tejido o en forma aislada. Si se proporciona como una muestra de tejido, la muestra de tejido es preferiblemente no fijada para permitir el facil acceso a los componentes de la muestra de tejido y para evitar la perturbacion de la conformacion de los componentes relacionados con la fijacion. Los ejemplos de muestras de tejido que pueden ser examinados en este ensayo incluyen tejido canceroso, tejido precanceroso, tejido que contiene tumores benignos tales como verrugas o lunares, tejido infectado con microorganismos patogenos, tejido infiltrado con celulas inflamatorias, tejido que lleva matrices patologicas entre celulas (por ejemplo, periearditis fibrinosa), tejido que lleva antfgenos aberrantes, y tejido cicatricial. Los ejemplos de entidades biologicas aisladas que pueden usarse incluyen Ap, antfgenos virales o virus, proteoglicanos, antfgenos de otros microorganismos patogenos, antfgenos tumorales, y moleculas de adhesion. Dichos antfgenos pueden obtenerse de fuentes naturales, expresion recombinante o smtesis qmmica, entre otros medios. La muestra de tejido o entidad biologica aislada se pone en contacto con celulas fagodticas que llevan receptores Fc, tales como monocitos o celulas microgliales, y un anticuerpo a ensayar en un medio. El anticuerpo puede estar dirigido a la entidad biologica bajo ensayo o a un antfgeno asociado con la entidad. En la ultima situacion, el objeto es examinar si la entidad biologica es fagocitada indirectamente con el antfgeno. Por lo general, aunque no necesariamente, el anticuerpo y la entidad biologica (a veces con un antfgeno asociado) se ponen en contacto entre sf antes de anadir las celulas fagodticas. La concentracion de la entidad biologica y/o el antfgeno asociado, si esta presente, que quedan en el medio se controlan a continuacion. Una reduccion en la cantidad o concentracion de antfgeno o la entidad biologica asociada en el medio indica que el anticuerpo tiene una respuesta de eliminacion contra el antfgeno y/o entidad biologica asociada junto con las celulas fagodticas (vease, por ejemplo, Ejemplo 14).

IV. PACIENTES SUSCEPTIBLES DE TRATAMIENTO

Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de enfermedad pero que no muestran smtomas, asf como pacientes que muestran smtomas actualmente. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, practicamente cualquier persona esta en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer si vive lo suficiente. Por lo tanto, los presentes metodos se pueden administrar profilacticamente a la poblacion general sin necesidad de ninguna evaluacion del riesgo del sujeto paciente. Los presentes metodos son especialmente utiles para las personas que tienen un riesgo genetico conocido de la enfermedad de Alzheimer. Tales individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado esta enfermedad, y aquellos cuyo riesgo se determina por analisis de marcadores geneticos o bioqmmicos. Los marcadores geneticos de riesgo hacia la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen APP, particularmente mutaciones en la posicion 717 y las posiciones 670 y 671 denominadas mutaciones Hardy y Suecas respectivamente (vease Hardy, TINS, supra). Otros marcadores de riesgo son mutaciones en los genes de la presenilina, PSI y PS2, y ApoE4, historial familiar de EA, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Las personas que actualmente sufren de la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse desde la demencia caractenstica, asf como la presencia de factores de riesgo descritos anteriormente. Ademas, una serie de pruebas de diagnostico estan disponibles para identificar individuos que tienen Ap. Estos incluyen la medicion de CSF tau y niveles Ap42. Niveles elevados de tau y niveles reducidos de Ap42 indican la presencia de Ap. Las personas que sufren de la enfermedad de Alzheimer tambien puede ser diagnosticadas por criterios ADRDA tal como se ha discutido en la seccion de ejemplos.

En los pacientes asintomaticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Por lo general, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente alcance 40, 50, 60 o 70. El tratamiento tfpicamente implica multiples dosificaciones durante un penodo de tiempo. El tratamiento puede monitorizarse mediante el ensayo de anticuerpo, o respuestas activadas de celulas T o de celulas B al agente terapeutico (por ejemplo, peptido Ap) a lo largo del tiempo. Si la respuesta se cae, se recomienda una dosis de refuerzo. En el caso de los pacientes con smdrome de Down potenciales, el tratamiento puede comenzar antes del nacimiento mediante la administracion del agente terapeutico a la madre o poco despues del nacimiento.

V. REGfMENES DE TRATAMIENTO

En aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible a, o de otra manera en riesgo de, enfermedad de Alzheimer en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad, o retardar el inicio de la enfermedad, incluyendo smtomas bioqmmicos, histologicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapeuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente que se sospecha de, o que ya sufre de una enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los smtomas de la enfermedad

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(bioqmmicos, histologicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. En algunos metodos, la administracion de agente reduce o elimina el deterioro miocognitivo en pacientes que aun no han desarrollado la patologfa caractenstica de Alzheimer. Una cantidad adecuada para conseguir el tratamiento terapeutico o profilactico se define como una dosis terapeutica o profilacticamente efectiva. En ambos regfmenes profilacticos y terapeuticos, los agentes normalmente se administran en varias dosificaciones hasta que se ha conseguido una respuesta inmune suficiente. Tfpicamente, la respuesta inmune se controla y dosis repetidas se dan si la respuesta inmune empieza a disminuir.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invencion, por el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente vanan dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Por lo general, el paciente es un humano, pero mairnfero no humanos tales como marnfferos transgenicos tambien pueden ser tratados. Las dosificaciones de tratamiento necesitan titularse para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunogeno depende de si el adyuvante tambien se administra, con dosis mas altas que se requieren en la ausencia de adyuvante. La cantidad de un inmunogeno para su administracion en ocasiones vana de 1-500 |jg por paciente y mas habitualmente de 5-500 |jg por inyeccion para la administracion humana. En ocasiones, se utiliza una dosis mayor de 12 mg por inyeccion. Tfpicamente aproximadamente 10, 20, 50 o 100 jg se utiliza para cada inyeccion humana. La masa de inmunogeno tambien depende de la relacion de masa del epftopo inmunogenico en el inmunogeno para la masa de inmunogeno como un todo. Tfpicamente, 10'3 a 10'5 micromoles de epftopo inmunogenico se utilizan para microgramo de inmunogeno. El momento de las inyecciones puede variar significativamente desde una vez al dfa, a una vez al ano, a una vez cada decada. En cualquier dfa dado que se administre una dosis de inmunogeno, la dosificacion es mayor que 1 jg/paciente y habitualmente mayor que 10 jg/paciente si el adyuvante tambien se administra, y mayor que 10 jg/paciente y habitualmente mayor que 100 jg/paciente en ausencia de adyuvante. Un regimen tfpico consiste en una inmunizacion seguida de inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas. Otro regimen consta de una inmunizacion seguida por inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses mas tarde. Otro regimen supone una inyeccion cada dos meses para el resto de la vida. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo pueden ser de forma irregular tal como se indica mediante la monitorizacion de la respuesta inmune.

Para la inmunizacion pasiva con un anticuerpo, la dosificacion vana de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del huesped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 110 mg/kg. Un regimen de tratamiento ejemplar implica la administracion una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos procedimientos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes speeifleities de union se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado esta dentro de los rangos indicados. El anticuerpo se administra habitualmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos tambien pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sangumeos de anticuerpo a Ap en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentracion de anticuerpo en plasma de 1-1.000 ug/ml y en algunos metodos 25 - 300 ug/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulacion de liberacion sostenida, en cuyo caso se requiere menos administracion frecuente. La dosificacion y frecuencia vanan dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media mas larga, seguida por anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, y anticuerpos no humanos. La dosificacion y frecuencia de administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, una dosificacion relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo penodo de tiempo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento para el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos a veces se requieren hasta que la progresion de la enfermedad se reduzca o termine, y preferiblemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los smtomas de la enfermedad. Despues, se puede administrar un regimen profilactico a la patente.

Dosis para inmunogenos de codificacion de acidos nucleicos vanan de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 jg a 10 mg, o 30-300 jg de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos vanan de 10-100, o mas, viriones por dosis.

Los agentes para inducir una respuesta inmunitaria pueden administrarse por via parenteral, topica, intravenosa, oral, subcutanea, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o medios intramusculares para el tratamiento profilactico y/o terapeutico. La ruta mas tfpica de administracion de un agente inmunogenico es subcutanea aunque otras vfas pueden ser igualmente eficaces. La siguiente via mas comun es la inyeccion intramuscular. Este tipo de inyeccion se realiza mas tfpicamente en los musculos de la pierna o el brazo. En algunos procedimientos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde se han acumulado depositos, por ejemplo inyeccion intracraneal. La inyeccion intramuscular en infusion intravenosa se prefieren para la administracion de anticuerpo. En algunos procedimientos, en particular anticuerpos terapeuticos se inyectan directamente en el craneo. En algunos procedimientos, los anticuerpos se administran como una composicion de liberacion sostenida o dispositivo, tal como un dispositivo Medipad™.

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Los agentes de la invencion opcionalmente pueden administrarse en combinacion con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad amiloidogenica. En el caso del smdrome de Alzheimer y de Down, en el que los depositos amiloides se producen en el cerebro, los agentes de la invencion tambien se pueden administrar en combinacion con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invencion a traves de la barrera hematoencefalica. Los agentes inmunogenicos de la descripcion, tales como peptidos, se administran a veces en combinacion con un adyuvante. Una variedad de adyuvantes se puede utilizar en combinacion con un peptido, tales como Ap, para provocar una respuesta inmune. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta intrmseca a un inmunogeno sin provocar cambios conformacionales en el inmunogeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes preferidos incluyen hidroxido de aluminio y fosfato de aluminio, 3 De-O-acilado lfpido de monofosforilo A (MpLtm) (vease el documento GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, ahora parte de Corixa). Stimulon™ QS-21 es un glucosido de triterpeno o saponina aislada de la corteza del arbol Quillaja Saponaria Molina que se encuentra en America del Sur (vease Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, Nueva York, 1995); Patente de Estados Unidos N° 5.057.540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinacion con estimulantes inmunes, tales como lfpido de monofosforilo A (vease Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (WO 98/40100). Alternativamente, Ap puede acoplarse a un adyuvante. Sin embargo, dicho acoplamiento no debena cambiar sustancialmente la conformacion de Ap de modo que pueda afectar a la naturaleza de la respuesta inmune. Los adyuvantes pueden administrarse como un componente de una composicion terapeutica con un agente activo o pueden administrarse por separado, antes de, simultaneamente con, o despues de la administracion del agente terapeutico.

Una clase preferida de adyuvantes son sales de aluminio (alumbre), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como MPL o 3-DMP, QS-21, aminoacidos polimericos o monomericos tales como acido poliglutamico o polilisina. Otra clase de adyuvantes son formulaciones de emulsion aceite-en-agua. Tales adyuvantes pueden usarse con o sin otros agentes inmunoestimulantes espedficos tales como peptidos de muramilo (por ejemplo, N acetilmuramilo-L-treonilo-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilo-normuramilo-L-alanilo-D- isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramilo-L-alanilo-D-isoglutaminilo-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoilo-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminilo-N-acetilmuramiloL-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) theramideTM), u otros componentes de la pared celular bacteriana. emulsiones aceite-en- agua incluyen (a) MF59 (documento WO 90/14837), que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0,5% de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formulado en partfculas submicrometricas usando un microfluidizador tal como el Modelo 110Y microfluidizador (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polfmero pluronico-bloqueado L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsion de submicron o vortex para generar una emulsion de tamano de partfcula mas grande, y (c) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (RIBI ImmunoChem, Hamilton, MT) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosfotillipido A (MPL), dimicolado de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (DetoxTM). Otra clase de adyuvantes preferidos es adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA) o partfculas generadas de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes) y ISCOMATRIX. Otros adyuvantes incluyen el Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA). Otros adyuvantes incluyen citocinas, tales como interleucinas (IL 1, IL2, IL1- 2 y), de colonias de macrofagos factor estimulante (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF).

Un adyuvante puede administrarse con un inmunogeno como una unica composicion, o se puede administrar antes de, simultaneamente con o despues de la administracion del inmunogeno. El inmunogeno y el adyuvante pueden envasarse y suministrarse en el mismo vial o pueden envasarse en viales separados y mezclarse antes de su uso. Inmunogeno y adyuvante se envasan tfpicamente con una etiqueta que indica la aplicacion terapeutica prevista. Si inmunogeno y adyuvante se envasan por separado, el embalaje incluye tfpicamente instrucciones para la mezcla antes de su uso. La eleccion de un adyuvante y/o portador depende de la estabilidad de la formulacion inmunogenica que contiene el adyuvante, la via de administracion, el programa de dosificacion, la eficacia del adyuvante para la especie a la que se vacuna y, en seres humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que se ha aprobado o puede aprobarse para la administracion humana por los organismos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el Adyuvante Completo de Freund no es adecuado para la administracion humana. Se prefieren Alum, MPL y QS-21. Opcionalmente, dos o mas adyuvantes diferentes se pueden utilizar simultaneamente. Las combinaciones preferidas incluyen alumbre con MPL, alumbre con QS-21, MPL con QS-21 y alumbre, QS-21 y MPL juntos. Ademas, el Adyuvante Incompleto de Freund se puede utilizar (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), opcionalmente en combinacion con cualquiera de alumbre, QS-21 y MPL y todas las combinaciones de los mismos.

Los agentes de la invencion se administran a menudo como composiciones farmaceuticas que comprenden un agente terapeutico activo, es decir, y una variedad de otros componentes farmaceuticamente aceptables. Vease Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). La forma preferida depende del modo pretendido de administracion y aplicacion terapeutica. Las composiciones tambien pueden incluir, dependiendo de la formulacion deseada, portadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables no

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toxicos, que se definen como portadores comunmente utilizados para formular composiciones farmaceuticas para la administracion animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biologica de la combinacion. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solucion salina con fosfato fisiologico, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank. Ademas, la composicion farmaceutica o formulacion tambien puede incluir otros portadors, adyuvantes, o estabilizadores no terapeuticos, no inmunogenicos, no toxicos y similares. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como protemas, polisacaridos tales como quitosano, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos y copoUmeros (tales como sefarosa funcionalizada por latex (TM), agarosa, celulosa, y similares), aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacido, y agregados de lfpidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (es dedr, adyuvantes).

Para la administracion parenteral, los agentes de la invencion se pueden administrar como dosificaciones inyectables de una solucion o suspension de la sustancia en un diluyente fisiologicamente aceptable con un portador farmaceutico que puede ser un lfquido esteril tal como aceites en agua, solucion salina, glicerol, o etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmaceuticas son los de origen en petroleo, animal, vegetal, o sintetico, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son portadores lfquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos se pueden administrar en la forma de una inyeccion de deposito o preparacion de implante que puede formularse de una manera tal que permita una liberacion sostenida del ingrediente activo. Una composicion ejemplar comprende anticuerpo monoclonal a 5 mg/mL, formulado en tampon acuoso que consiste en 50 mM L-histidina, 150 mM de NaCl, ajustado a pH 6,0 con HCl.

Tfpicamente, las composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones lfquidas; formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, portadores lfquidos antes de la inyeccion tambien se pueden preparar. La preparacion tambien se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartfculas tales como polilactida, poliglicolida, o copolfmero para un efecto adyuvante potenciado, como se discutio anteriormente (vease Langer, Science 249, 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97119 (1997). Los agentes de esta invencion se pueden administrar en forma de una inyeccion de deposito o preparacion de implante que pueden formularse de una manera tal que permita una liberacion sostenida o pulsatil del ingrediente activo.

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administracion incluyen la via oral, intranasal, y formulaciones pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdermicas.

Para supositorios, los aglutinantes y portadores incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25%-70%.

La aplicacion topica puede resultar en la liberacion transdermica o intradermica. La administracion topica puede facilitarse mediante la coadministracion del agente con toxina del colera o derivados o subunidades desintoxicadas de los mismos u otras toxinas bacterianas similares (vease Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). La coadministracion puede lograrse mediante el uso de los componentes como una mezcla o como moleculas unidas obtenidas por reticulacion qmmica o expresion como una protema de fusion.

Alternativamente, la administracion transdermica puede lograrse usando una ruta de la piel o usando transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

VI. Metodos de Diagnostico

La descripcion proporciona metodos para detectar una respuesta inmune contra un peptido en un paciente que sufre de o es susceptible a la enfermedad de Alzheimer. Los metodos son particularmente utiles para el seguimiento de un curso de tratamiento que se administra a un paciente. Los metodos se pueden utilizar para controlar tanto el tratamiento terapeutico en pacientes sintomaticos como el tratamiento profilactico en pacientes asintomaticos. Los metodos son utiles para controlar tanto la inmunizacion activa (por ejemplo, anticuerpo producido en respuesta a la administracion de inmunogeno,) como la inmunizacion pasiva (por ejemplo, el nivel de medicion de anticuerpo administrado).

1. Inmunizacion activa

Algunos metodos implican determinar un valor de lmea de base de una respuesta inmune en un paciente

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antes de administrar una dosificacion de agente, y comparer este con un valor para la respuesta immune despues del tratamiento. Un aumento significativo (es dedr, mayor que el margen tipico de error experimental en mediciones repetidas de la misma muestra, expresado como una desviacion estandar de la media de tales mediciones) en el valor de la respuesta inmunitaria senala un resultado de tratamiento positivo (es dedr, que la administracion del agente ha logrado o aumentado una respuesta inmune). Si el valor para la respuesta inmune no se cambia significativamente, o se disminuye, un resultado de tratamiento negativo se indica. En general, se espera que pacientes sometidos a un ciclo inicial de tratamiento con un agente inmunogenico para mostrar un aumento de la respuesta inmunitaria con las dosificaciones sucesivas, que finalmente alcanza un nivel. La administracion de agente se continua generalmente mientras que la respuesta inmune se aumenta. El logro del nivel es un indicador de que la administracion del tratamiento puede ser suspendido o reducido en la dosificacion o frecuencia.

En otros procedimientos, un valor de control (es dedr, una desviacion media y estandar) de respuesta inmune se determina para una poblacion control. Tfpicamente los individuos en la poblacion control no han recibido tratamiento previo. Los valores medidos de respuesta inmune en un paciente despues de la administracion de un agente terapeutico se comparan entonces con el valor control. Un aumento significativo con respecto al valor de control (por ejemplo, mayor que una desviacion estandar de la media) indica un resultado de tratamiento positivo. La falta de aumento significativo o una disminucion indica un resultado de tratamiento negativo. La administracion de agente se continua generalmente mientras que la respuesta inmunitaria se aumenta con respecto al valor control. Como anteriormente, el logro de un nivel relativo a los valores de control es un indicador de que la administracion de tratamiento puede interrumpirse o reducirse la frecuencia de la dosis.

En otros metodos, un valor de control de la respuesta inmune (por ejemplo, una desviacion media y estandar) se determina a partir de una poblacion de control de individuos que han experimentado tratamiento con un agente terapeutico y cuyas respuestas inmunes han alcanzado un nivel en respuesta al tratamiento. Los valores medidos de respuesta inmune en un paciente se comparan con el valor de control. Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, mas de una desviacion estandar) del valor de control, el tratamiento puede interrumpirse. Si el nivel en un paciente es significativamente inferior al valor de control, esta justificada la administracion continuada de agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor de control, entonces un cambio en el regimen de tratamiento, por ejemplo, puede estar indicado el uso de un adyuvante diferente.

En otros metodos, un paciente que no esta recibiendo actualmente tratamiento pero se ha sometido a un curso previo de tratamiento se controla para la respuesta inmune para determinar si se requiere una reanudacion del tratamiento. El valor medido de respuesta inmune en el paciente puede ser comparado con un valor de respuesta inmune previamente conseguido en el paciente despues de un curso previo de tratamiento. Una disminucion significativa relativa a la medicion anterior (es dedr, mayor que un margen tfpico de error en mediciones repetidas de la misma muestra) es una indicacion de que el tratamiento puede reanudarse. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control (desviacion media mas estandar) determinado en una poblacion de pacientes despues de someterse a un curso de tratamiento. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados profilacticamente que permanecen libres de smtomas de la enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapeuticamente que muestran mejora de caractensticas de la enfermedad. En todos estos casos, una disminucion significativa relativa al nivel de control (es dedr, mas de una desviacion estandar) es un indicador de que el tratamiento debe reanudarse en un paciente.

La muestra de tejido para el analisis es tfpicamente sangre, plasma, suero, fluido mucoso o cefalorraqrndeo del paciente. La muestra se analiza para la indicacion de una respuesta inmune a cualquier forma de peptido Ap, tfpicamente Ap42. La respuesta inmunitaria puede determinarse a partir de la presencia de, por ejemplo, anticuerpos o celulas T que se unen espedficamente al peptido Ap. Metodos ELISA de deteccion de anticuerpos espedficos para Ap se describen en la seccion de Ejemplos. Los metodos para detectar celulas T reactivas se han descrito anteriormente (vease Definiciones). En algunos procedimientos, la respuesta inmune se determina usando un ensayo de compensacion, tal como se describe en la Seccion III anterior. En tales metodos, una muestra de tejido de un paciente al que se examina se pone en contacto con depositos amiloides (por ejemplo, de un raton PDAPp) y celulas fagodticas que llevan receptores Fc. A continuacion, se monitorea la eliminacion posterior del deposito amiloide. La existencia y el grado de limpieza de respuesta proporciona una indicacion de la existencia y nivel de anticuerpos eficaces para eliminar Ap en la muestra de tejido del paciente al que se examina.

2. Inmunizacion pasiva

En general, los procedimientos para controlar la inmunizacion pasiva son similares a aquellos para controlar la inmunizacion activa descrita anteriormente. Sin embargo, el perfil de anticuerpos despues de la inmunizacion pasiva tfpicamente muestra un pico inmediato en concentracion de anticuerpos seguida por un decaimiento exponencial. Sin una dosificacion adicional, el deterioro se aproxima a los niveles de pretratamiento dentro de un penodo de dfas a meses dependiendo de la semivida del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la vida media de algunos anticuerpos humanos es del orden de 20 dfas.

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En algunos metodos, una medicion de lmea de base de anticuerpo a Ap en el paciente se realiza antes de la administracion, una segunda medicion se realiza poco despues para determinar el nivel pico de anticuerpos, y una o mas mediciones se realizan a intervalos para controlar la descomposicion de los niveles de anticuerpos. Cuando el nivel de anticuerpo se ha reducido al valor basal o un porcentaje predeterminado del pico menos la lmea de base (por ejemplo, 50%, 25% o 10%), se administra la administracion de una dosificacion adicional de anticuerpo. En algunos procedimientos, niveles medidos pico o posteriores menos el fondo se comparan con niveles de referencia determinados previamente para constituir un regimen de tratamiento profilactico o terapeutico beneficioso en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que una administracion de nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviacion estandar del valor de referencia en la poblacion de pacientes que se benefician del tratamiento) de una dosis adicional de anticuerpo se indica.

3. Kits de diagnostico

La descripcion proporciona ademas kits de diagnostico para realizar los metodos de diagnostico descritos anteriormente. Tfpicamente, dichos kits contienen un agente que se une espedficamente a los anticuerpos a Ap. El kit tambien puede incluir una etiqueta. Para la deteccion de anticuerpos frente a Ap, la etiqueta esta tfpicamente en forma de anticuerpos antiidiotfpicos marcados. Para la deteccion de anticuerpos, el agente puede suministrarse preunido a una fase solida, tal como a los pocillos de una placa de microtitulacion. Los kits tambien contienen tipicamente etiquetado que proporciona instrucciones de uso del kit. El etiquetado puede incluir tambien un grafico u otros niveles de correlacion de regimen de correspondencia de marcador medido con niveles de anticuerpos a Ap. El termino etiquetado se refiere a cualquier material escrito o registrado que esta unido a, o de otra manera acompana a un kit en cualquier momento durante su fabricacion, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el termino etiquetado abarca panfletos y folletos publicitarios, materiales de embalaje, instrucciones, cintas de audio o de video, discos informaticos, asf como letra impresa directamente en los kits.

La descripcion tambien proporciona kits de diagnostico para llevar a cabo visualizacion in vivo. Dichos kits tfpicamente contienen un anticuerpo de union a un epftopo de Ap, preferentemente dentro de los residuos 1-10. Preferiblemente, el anticuerpo esta marcado o un reactivo de marcaje secundario esta incluido en el kit. Preferiblemente, el kit esta etiquetado con instrucciones para realizar un ensayo de visualizacion in vivo.

VII. Visualizacion in vivo

La descripcion proporciona metodos de visualizacion de depositos amiloides in vivo en un paciente. Tales metodos son utiles para diagnosticar o confirmar el diagnostico de la enfermedad de Alzheimer, o la susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, los metodos se pueden utilizar en un paciente que presenta smtomas de demencia. Si el paciente tiene depositos amiloides anormales, entonces el paciente es probable que sufren de la enfermedad de Alzheimer. Los metodos tambien pueden ser utilizados en pacientes asintomaticos. La presencia de depositos anormales de amiloide indica susceptibilidad a la enfermedad sintomatica futura. Los metodos tambien son utiles para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y/o la respuesta al tratamiento en pacientes que han sido previamente diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer.

Los metodos funcionan mediante la administracion de un reactivo, tal como un anticuerpo, que se une a Ap para el paciente y, a continuacion, la deteccion del agente despues de que se ha unido. Los anticuerpos preferidos se unen a depositos de Ap en un paciente sin unirse a polipeptido APP de longitud completa. Se prefieren particularmente los anticuerpos que se unen a un epftopo de Ap dentro de aminoacidos 1-10. En algunos procedimientos, el anticuerpo se une a un epftopo dentro de los aminoacidos 7-10 de Ap Tales anticuerpos se unen tipicamente sin inducir una respuesta sustancial de compensacion. En otros metodos, el anticuerpo se une a un epftopo dentro de los aminoacidos 1-7 de Ap. Tales anticuerpos se unen tfpicamente e inducen una respuesta de eliminacion a Ap. Sin embargo, la respuesta de eliminacion puede evitarse usando fragmentos de anticuerpo que carecen de una region constante de longitud completa, tales como Fab. En algunos procedimientos, el mismo anticuerpo puede servir como un tratamiento y reactivo de diagnostico. En general, los anticuerpos se unen a epftopos C-terminales de residuo 10 de Apdo no muestran una senal tan fuerte como anticuerpos que se unen a epftopos dentro de los residuos 1-10, presumiblemente debido a que los epftopos C-terminales son inaccesibles en depositos amiloides. Por consiguiente, dichos anticuerpos son menos preferidos.

Reactivos de diagnostico pueden administrarse por inyeccion intravenosa en el cuerpo del paciente, o directamente en el cerebro por inyeccion intracraneal o taladro de un agujero a traves del craneo. La dosificacion de reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos que para los metodos de tratamiento. Tfpicamente, el reactivo esta marcado, aunque en algunos metodos, el reactivo primario con afinidad por Ap es no marcado y un agente de marcaje secundario se usa para unirse al reactivo primario. La eleccion del marcador depende de los medios de deteccion. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para la deteccion optica. El uso de marcadores paramagneticos es adecuado para la deteccion tomografica sin intervencion quirurgica. Los marcadores radiactivos tambien pueden detectarse usando PET o SPECT.

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El diagnostico se lleva a cabo comparando el numero, tamano y/o la intensidad de loci marcado a valores de la lmea base correspondiente. Los valores de la lmea base pueden representar los niveles medios en una poblacion de individuos no enfermos. Los valores de la lmea base tambien pueden representar niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de lmea de base pueden determinarse en un paciente antes de comenzar el tratamiento, y los valores medidos a partir de entonces en comparacion con los valores de la lmea de base. Una disminucion en los valores relativos a la lmea de base de las senales de una respuesta positiva al tratamiento.

EJEMPLOS

I. EFICACIA PROFILACTICA DE Ap CONTRA EA

Estos ejemplos describen la administracion de peptido Ap42 a ratones transgenicos que sobreexpresan APP con una mutacion en la posicion 717 (APP717v->f) que los predispone a desarrollar neuropatologfa de tipo Alzheimer. La produccion y las caractensticas de estos ratones (ratones PDAPP) se describen en Games et al., Nature, supra. Estos animales, en su forma heterocigota, comienzan a depositar Ap a los seis meses de edad hacia adelante. A los quince meses de edad presentan niveles de deposicion Ap equivalente a la observada en la enfermedad de Alzheimer. Ratones PDAPP se inyectaron con Ap42 agregada (Ap42 agregada) o solucion salina tamponada con fosfato. Ap42 agregada fue elegida debido a su capacidad para inducir anticuerpos frente a multiples epftopos de Ap.

A. METODOS

1. Fuente de ratones

Treinta ratones hembra heterogeneos PDAPP se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos: 10 ratones para ser inyectados con Ap42 agregada (uno murio en el transito), 5 ratones para ser inyectados con PBS/adyuvante o pBs y 10 controles no inyectados. Cinco ratones fueron inyectados con peptidos derivados de la secuencia de la protema amiloide serica (SAP).

2. Preparacion de los inmunogenos

Preparacion de Ap42 agregada: dos miligramos de Ap42 (US Peptides Inc, lote K-42-12) se disolvio en 0,9 ml de agua y se completo hasta 1 ml mediante la adicion de 0,1 ml de 10 x PBS. Esto se agito con vortex y se dejo incubar durante la noche 37°C, en cuyas condiciones el peptido se agrego. Cualquier Ap no usado se almaceno como un polvo liofilizado seco a 20°C hasta la siguiente inyeccion.

3. Preparacion de las inyecciones

Para cada inyeccion, 100 |jg de Ap42 agregada en PBS por raton se emulsiono 1: 1 con Adyuvante Completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 jl de emulsion para la primera inmunizacion, seguido de un refuerzo de la misma cantidad de inmunogeno en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) a las 2 semanas. Dos dosis adicionales en IFA se administraron a intervalos mensuales. Las inmunizaciones posteriores se realizaron a intervalos mensuales en 500 jl de PBS. Las inyecciones se administraron por via intraperitoneal (i.p.).

Las inyecciones de PBS siguieron el mismo horario y los ratones fueron inyectados con una mezcla 1: 1 de PBS/adyuvante a 400 jl por raton, o 500 jl de PBS por raton. Las inyecciones SAP igualmente siguieron el mismo programa usando una dosis de 100 jg por inyeccion.

4. Titulacion de sangrado de raton, preparacion del tejido e inmunohistoqmmica

Los metodos anteriores se describen infra en materiales y procedimientos generales.

B. RESULTADOS

Los ratones PDAPP se inyectaron bien con Ap42 agregada (Ap42 agregada), peptidos SAP o salina tamponada con fosfato. A un grupo de ratones PDAPP tambien se le dejo como control positivo no inyectado. Los tftulos de los ratones a Ap42 agregada se monitorearon cada dos meses a partir del cuarto impulso hasta que los ratones teman un ano de edad. Los ratones se sacrificaron a los 13 meses. En todos los puntos de tiempo examinados, ocho de los nueve ratones Ap42 agregados desarrollaron un tftulo alto de anticuerpos, que se mantuvo alto durante toda la serie de inyecciones (tftulos mayores que 1/10000). El noveno raton tema un tftulo bajo, pero medible de aproximadamente 1/1000 (figura 1, tabla 1). ratones inyectados por SAPP teman tftulos de 1: 1.000 a 1: 30.000 para este inmunogeno con solo un unico raton superior a 1: 10.0000.

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Los ratones tratados con PBS se titularon contra Ap42 agregada a los seis, diez y doce meses. En una dilucion 1/100 de los ratones PBS, cuando se titulan contra Ap42 agregada, solo superada 4 veces el fondo en un punto de datos, de lo contrario, eran menos de 4 veces el fondo en todos los puntos del tiempo (Tabla 1). La respuesta SAP espedfica era insignificante en estos puntos de tiempo con todos los tttulos de menos de 300.

Siete de los nueve ratones en el grupo tratado Ap1-42 agregada no teman amiloide detectable en sus cerebros. En contraste, el tejido cerebral de los ratones en grupos SAP y PBS contema numerosos depositos amiloides en el hipocampo, asf como en las cortezas frontal y cingulada. El patron de la deposicion era similar al de los controles no tratados, con implicacion caractenstica de subregiones vulnerables, tales como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo. Un raton del grupo inyectado Ap 1-42 tema una carga de amiloide enormemente reducida, confinada en el hipocampo. Una placa aislada se identifico en otro raton tratado por Ap 142.

El analisis de imagen cuantitativo de la carga amiloide en el hipocampo verifico la dramatica reduccion lograda en los animales tratados con Ap42(AN1792) (Fig. 2). Los valores de la mediana de la carga de amiloide para el grupo PBS (2,22%), y para el grupo de control no tratado (2,65%) fueron significativamente mayores que para los inmunizados con AN1792 (0,00%, p = 0,0005). En contraste, el valor mediano para el grupo inmunizado con peptidos SAP (SAPP) era del 5,74%. El tejido cerebral de los ratones de control no tratados contema numerosos depositos amiloides Ap visualizados con el anticuerpo monoclonal Ap espedfico (mAb) 3D6 en el hipocampo, asf como en la corteza retroesplenial. Un patron similar de deposicion de amiloide se observo tambien en ratones inmunizados con SAPP o pBs (Fig. 2). Ademas, en estos ultimos tres grupos hubo una implicacion caractenstica de subregiones vulnerables del cerebro visto clasicamente en EA, tales como la capa molecular externa del giro dentado del hipocampo, en los tres de estos grupos.

Los cerebros que no conteman depositos Ap tambien estaban desprovistos de placas neunticas que normalmente se visualizan en ratones PDAPp con el anticuerpo humano APP 8E5. Todos los cerebros de los grupos restantes (inyectados con SAP, PBS y ratones no inyectados) teman numerosas placas neunticas tfpicas de los ratones PDAPP no tratados. Un pequeno numero de placas neunticas estaba presente en un raton tratado con AN1792, y un unico grupo de neuritas distroficas se encontro en un segundo raton tratado con AN1792. Analisis de imagen del hipocampo, y se muestran en la FIG. 3, demostraron la practica eliminacion de las neuritas distroficas en los ratones tratados con AN1792 (mediana 0,00%) en comparacion con los receptores de PBS (mediana 0,28%, p = 0,0005). Astrocitosis caractenstica de la inflamacion asociada a placa tambien estaba ausente en los cerebros del grupo inyectado Ap1-42. Los cerebros de los ratones en los otros grupos conteman astrocitos GFAP positivos abundantes y agrupados tfpicos de gliosis Ap asociada a placas. Un subconjunto de las diapositivas reaccionadas por GFAP se contratineron con tioflavina S para localizar los depositos Ap. Los astrocitos GFAP positivos se asociaron con placas Ap en el SAP, PBS y controles no tratados. Ninguna asociacion de este tipo se encontro en los ratones tratados con Ap142 de placa negativa, mientras gliosis asociada a placas minima se identifico en un raton tratado con AN1792.

Los analisis de imagenes, mostrados en la FIG. 4 para la corteza retroesplenial, verificaron que la reduccion en la astrocitosis fue significativa con un valor medio de 1,56% para los tratados con AN1792 frente a valores medianos mayores del 6% para los grupos inmunizados con peptidos SAP, PBS o (p = 0,0017) no tratado.

Evidencia de un subconjunto de los ratones Ap42 y PBS indico que inmunorreactividad de MHC II asociada a placas estaba ausente en los ratones inyectados por Ap1-42, en consonancia con la falta de una respuesta inflamatoria relacionada con Ap.

Las secciones de los cerebros de raton tambien se hicieron reaccionar con un mAb espedfico con un anticuerpo monoclonal espedfico para MAC-1, una protema de superficie celular. MAC-1-(CD11b) es un miembro de la familia de integrinas y existe como un heterodfmero con CD18. El complejo CD11b/CD18 esta presente en monocitos, macrofagos, neutrofilos y celulas asesinas naturales (Mak y Simard). Es probable que el tipo de celulas MAC-1-reactivo residente en el cerebro es microglia basada en la morfologfa fenotfpica similar en secciones inmunoreaccionadas por MAG-1. El etiquetado de MAC-1 asociada a placas era inferior en los cerebros de los ratones tratados con AN1792 en comparacion con el grupo de control PBS, un hallazgo consistente con la falta de una respuesta inflamatoria inducida por Ap.

C. CONCLUSION

La falta de placas de Ap y cambios neuronales y glioticos reactivos en los cerebros de los ratones inyectados con Ap1-42 indican que ninguno o extremadamente poco amiloide se depositaron en sus cerebros, y consecuencias patologicas, tales como gliosis y patologfa neuntica, estaban ausentes. Los ratones PDAPP tratados con Ap1-42 muestran esencialmente la misma falta de patologfa que los ratones de control no transgenicos. Por lo tanto, las inyecciones Ap1-42 son altamente efectivas en la prevencion de la deposicion o el aclaramiento de Ap humana a partir de tejido cerebral, y la eliminacion de cambios degenerativos neuronales e inflamatorios posteriores. Asf, la administracion de peptido Ap puede tener beneficio tanto preventivo como terapeutico en la prevencion de la

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II. ESTUDIO DE LA RESPUESTA DE DOSIS

Grupos de ratones Swiss Webster de cinco semanas de edad, (N = 6 por grupo) se inmunizaron con 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 o 0,13 ug de Ap formulada en CFA/IFA administrado por v^a intraperitoneal. Tres dosis se administraron a intervalos bisemanales seguido por una cuarta dosis un mes mas tarde. La primera dosis se emulsiono con CFA y las dosis restantes se emulsionaron con IFA. Los animales se sangraron 47 dfas despues de cada inmunizacion de partida despues de la segunda dosis para la medicion de los tftulos de anticuerpos. Los animales en un subconjunto de tres grupos, los inmunizados con 11, 33, o 300 |jg de antigeno, se sangraron adicionalmente a intervalos aproximadamente mensuales durante cuatro meses tras la cuarta inmunizacion para controlar la descomposicion de la respuesta de anticuerpos a traves de una gama de dosis de formulaciones inmunogenicas. Estos animales recibieron una quinta inmunizacion final a los siete meses despues del inicio del estudio. Se sacrificaron una semana mas tarde para medir respuestas de anticuerpos a AN1792 y para realizar analisis toxicologicos.

Se observo una respuesta a la dosis decreciente 300 a 3,7 jg sin respuesta en las dos dosis mas bajas. La media de los tftulos de anticuerpos son de aproximadamente 1: 1000 despues de 3 dosis y de aproximadamente 1: 10,000 tras 4 dosis de 11-300 jg de antfgeno (vease FIG. 5).

Los tftulos de anticuerpos se aumentaron espectacularmente para todos excepto para el grupo de dosis mas bajo despues de la tercera inmunizacion con aumentos en GMT que van de 5 a 25 veces. Las respuestas de anticuerpos bajas fueron entonces detectables, incluso para los receptores de 0,4 jg. Los grupos de 1,2 y 3,7 jg teman tftulos comparables con GMT de aproximadamente 1000 y los cuatro dosis mas altos agrupados junto con GMT de aproximadamente 25.000, con la excepcion del grupo de dosis 33 jg con un GMT inferior de 3000. Tras la cuarta inmunizacion, el incremento de tftulo era mas modesto para la mayona de los grupos. Hubo una respuesta a la dosis clara en todos los grupos de dosis de antfgeno inferior desde 0,14 jg a 11 jg que van desde ningun anticuerpo detectable para los receptores de 0,14 jg a un GMT de 36.000 para los receptores de 11 jg. Una vez mas, los tftulos para los cuatro grupos de dosis mas altas de 11 a 300 jg se agruparon juntos. Por lo tanto, tras dos inmunizaciones, el tftulo de anticuerpos era dependiente de la dosis de antfgeno a traves del amplio intervalo desde 0,4 hasta 300 jg. Llegado a la tercera inmunizacion, los tftulos de las cuatro dosis mas altas eran comparables y se mantuvieron en un nivel tras una inmunizacion adicional. Un mes despues de la cuarta inmunizacion, los tftulos fueron de 2 a 3 posiciones mayores en el grupo 300 jg que los medidos a partir de la sangre extrafda cinco dfas despues de la inmunizacion (Fig. 6). Esta observacion sugiere que la respuesta de anticuerpos anamnesica pico se produjo mas tarde de 5 dfas despues de la inmunizacion. Un aumento mas modesto (50%) se observo en este momento en el grupo de 33 jg. En el grupo de dosis de 300 jg a los dos meses despues de la ultima dosis, los GMT declinaron abruptamente en un 70%. Despues de otro mes, la disminucion era menos pronunciada al 45% (100 jg) y aproximadamente 14% para las dosis 33 y 11 jg. Por lo tanto, la tasa de disminucion en los tftulos de anticuerpos circulantes tras el cese de la inmunizacion parece ser bifasica con una disminucion pronunciada el primer mes tras la respuesta de pico seguida por una tasa mas modesta de disminucion a partir de entonces.

Los tftulos de anticuerpos y la cinetica de la respuesta de estos ratones Swiss Webster son similares a los de ratones transgenicos PDAPP heterocigotos jovenes inmunizados de una manera paralela. Las dosificaciones eficaces para inducir una respuesta inmune en los seres humanos son tfpicamente similares a las dosificaciones eficaces en ratones.

III. EXAMEN PARA EFICACIA TERAPEUTICA CONTRA EA ESTABLECIDA

Este ensayo esta disenado para examinar agentes inmunogenicos para la actividad en la detencion o reversion caractensticas neuropatologicas de la EA en animales de edad avanzada. Las inmunizaciones con 42 aminoacidos de Ap larga (1792) se iniciaron en un punto de tiempo cuando las placas amiloides ya estan presentes en los cerebros de los ratones PDAPP.

En el transcurso de tiempo utilizado en este estudio, los ratones PDAPP no tratados desarrollan un numero de cambios neurodegenerativos que se asemejan a los encontrados en la EA (Games et al., supra y Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.Uu. 94, 1550-1555 (1997)). La deposicion de Ap en placas amiloides se asocia con una respuesta neuronal degenerativa que consiste en elementos axonales aberrantes y dendrfticos, denominados neuritas distroficas. Los depositos amiloides que estan rodeados de y contienen neuritas distroficas llamadas placas neurfticas. Tanto en raton EA como raton PDAPP, las neuritas distroficas tienen una estructura globular distintiva, son inmunorreactivas con un panel de anticuerpos que reconocen APP y componentes del citoesqueleto y muestran cambios degenerativos subcelulares complejos en el nivel ultraestructural. Estas caractensticas permiten mediciones relevantes a la enfermedad, selectivas y reproducibles de la formacion de placas neurfticas en el cerebro PDAPP. El componente neuronal distrofico de las placas neurfticas de PDAPP se visualiza facilmente con un anticuerpo espedfico para APP humana (anticuerpo monoclonal 8E5), y es facilmente medible por analisis de imagen asistida por ordenador. Por lo tanto, ademas de medir los efectos de AN1792 sobre la formacion de la placa amiloide, se monitorearon los efectos de este tratamiento en el desarrollo de la distrofia neurftica.

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Los astrocitos y la microglia son celulas no neuronales que responden y reflejan el grado de lesion neuronal. Los astrocitos de GFAP positivo y microglia de MHC II positivo se observan comunmente en la EA, y sus aumentos de la activacion con la gravedad de la enfermedad. Por lo tanto, tambien monitoreamos el desarrollo de astrocitosis reactiva y microgliosis en los ratones tratados con AN1792.

A. Materiales y Metodos

Cuarenta y ocho, ratones hembras heterocigotas PDAPP, de 11 a 11,5 meses de edad, obtenidos de Charles River, se dividieron al azar en dos grupos: 24 ratones a inmunizarse con 100 |jg de AN1792 y 24 ratones a inmunizarse con PBS, cada uno combinado con adyuvante de Freund. Los grupos con AN1792 y PBS se dividieron de nuevo cuando alcanzaron los 15 meses de edad. A los 15 meses de edad se sacrifico aproximadamente la mitad de cada grupo de los animales tratados con AN1792 y PBS (n = 10 y 9, respectivamente), el resto continuo recibiendo inmunizaciones hasta la finalizacion a los ~18 meses (n = 9 y 12, respectivamente). Un total de 8 animales (5 AN1792, 3 PBS) murio durante el estudio. Ademas de los animales inmunizados, ratones PDAPP no tratados de un ano de edad (n = 10), 15 meses de edad (n = 10) y 18 meses de edad (n = 10) se incluyeron para comparacion en ELISA para medir niveles Ap y APP en el cerebro; los animales de un ano de edad tambien se incluyeron en los analisis inmunohistoqmmicos.

La metodologfa era como en el Ejemplo 1 salvo que se indique lo contrario. Los peptidos de EE.UU. de lote 12 y peptidos de California lote ME0339 de AN1792 se utilizo para preparar el antfgeno para las seis inmunizaciones administradas antes del punto de tiempo de 15 meses. Los peptidos de California lotes ME0339 y ME0439 se utilizaron para las tres inmunizaciones adicionales administradas entre los 15 y 18 meses.

Para las inmunizaciones, 100 jg de AN1792 en 200 jl PBS o PBS solo se emulsiono 1: 1 (vol: vol) con Adyuvante Completo de Freund (CFA) o Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) o PBS en un volumen final de 400 jl. La primera inmunizacion se administro con CFA como adyuvante, las siguientes cuatro dosis se administraron con TFA y las ultimas cuatro dosis con PBS solo sin adyuvante anadido. Un total de nueve inmunizaciones se administraron durante el penodo de siete meses en un programa de dos semanas para las tres primeras dosis seguido por un intervalo de cuatro semanas para las inyecciones restantes. El grupo de tratamiento de cuatro meses, eutanasiado a los 15 meses de edad, recibio solo las 6 primeras inmunizaciones.

B. Resultados

1. Efectos de tratamiento AN1792 en carga de amiloide

Los resultados de un tratamiento AN1792 sobre la carga amiloide cortical determinada por analisis de imagen cuantitativo se muestran en la FIG. 7. El valor mediano de la carga de amiloide cortical era del 0,28% en un grupo de ratones PDAPP de 12 meses no tratado, un valor representativo de la carga de placa en ratones al inicio del estudio. A los 18 meses, la carga de amiloide se aumento mas de 17 veces a 4,87% en los ratones tratados por PBS, mientras que ratones tratados por AN1792 teman una gran reduccion de la carga de amiloide de solo el 0,01%, en particular menos de los grupos de 12 meses no tratados y grupos tratados con PBS tanto de 15 como de 18 meses. La carga amiloide se redujo significativamente en los receptores AN1792 tanto a 15 (reduccion del 96%; p = 0,003) como a 18 (> 99% de reduccion; p = 0,0002) meses.

Normalmente, la deposicion amiloide cortical en ratones PDAPP se inicia en las cortezas frontal y retroesplenial (RSC) y progresa en una direccion ventral-lateral para implicar las cortezas temporal y entorrinal (CE). Poco o ningun amiloide se encontro en la CE de ratones de 12 meses, la edad aproximada en la que se administro primero AN1792. Despues de 4 meses de un tratamiento de AN1792, la deposicion de amiloide se redujo en gran medida en la RSC, y la implicacion progresiva de la CE se elimino completamente mediante un tratamiento AN1792. Esta ultima observacion demostro que AN1792 detuvo completamente la progresion de amiloide que normalmente invadina las cortezas temporal y ventral, asf como deposicion detenida o posiblemente invertida en la RSC.

Los profundos efectos de tratamiento de AN1792 en el desarrollo de la carga de amiloide cortical en los ratones PDAPP se demuestran adicionalmente por el grupo de 18 meses, que se habfa tratado durante siete meses. Una ausencia casi completa de amiloide cortical se encontro en el raton tratado con AN1792, con una falta total de placas difusas, asf como una reduccion en los depositos compactados.

2. Cambios celulares y morfologicos asociados a tratamiento AN1792

Una poblacion de celulas Ap-positivas se encontro en regiones del cerebro que normalmente contienen depositos amiloides. Notablemente, en varios cerebros de receptores AN1792, se encontraron muy pocas placas o ninguna de amiloide cortical extracelular. La mayona de la inmunorreactividad Ap parecfa estar contenida dentro de

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las celulas con gran soma lobular o agrupada. Fenotfpicamente, estas celulas se paredan a microglia o monocitos activados. Eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen ligandos expresados por monocitos activados y microglia (MHC II y CD11b) y se asociaron ocasionalmente con la pared o lumen de los vasos sangumeos. La comparacion de secciones casi adyacentes marcadas con anticuerpos de Ap y MHC II espedficos revelo que patrones similares de estas celulas fueron reconocidos por ambas clases de anticuerpos. El examen detallado de los cerebros de la AN1792 revelo que las celulas MHC II positivas estaban restringidas a las proximidades del amiloide limitado que queda en estos animales. En las condiciones de fijacion empleadas, las celulas no eran inmunorreactivas con anticuerpos que reconocen los ligandos de celulas T (CD3, CD3e) o celulas B (CD45RA, CD45RB) o antfgeno comun de leucocitos (CD45), pero eran reactivas con un anticuerpo que reconoce leucosialina (CD43), que reacciona cruzadamente con monocitos. No se encontraron tales celulas en cualquiera de los ratones tratados por PBS.

Los ratones PDAPP invariablemente desarrollan la deposicion de amiloide pesado en la capa molecular exterior del giro dentado del hipocampo. La deposicion forma una racha distinta dentro de la via perforante, una subregion que contiene clasicamente placas amiloides en la EA. La aparicion caractenstica de estos depositos en los ratones tratado por PBS se pareda a la caracterizada anteriormente en los ratones no tratados por PDAPP. La deposicion de amiloide consistfa en ambas placas difusas y compactadas en una banda continua. En contraste, en un numero de cerebros de ratones tratados por AN1792 este patron estaba drasticamente alterado. El deposito de amiloide del hipocampo ya no contema amiloide difuso, y el patron de bandas se interrumpio completamente. En cambio, un numero de estructuras punteadas inusuales estaban presentes que son reactivas con anticuerpos anti- Ap, varias de las cuales paredan ser celulas que contienen amiloide.

Celulas MHC II-positivas se observaron frecuentemente en la proximidad de amiloide extracelular en animales tratados con AN1792. El patron de asociacion de celulas Ap positivas con amiloide era muy similar en varios cerebros de ratones AN1792. La distribucion de estas celulas monocfticas estaba restringida a la proximidad del amiloide depositado y estaba completamente ausente de otras regiones cerebrales desprovistas de placas Ap. La microscopfa confocal de secciones etiquetadas por MHCII y Ap revelo que el material de la placa estaba contenida dentro de muchas de las celulas monocfticas.

Analisis cuantitativo de imagenes de secciones etiquetadas por MHC II y MAC I puso de manifiesto una tendencia hacia una mayor inmunoreactividad en la RSC y en el hipocampo de ratones tratados con AN1792 en comparacion con el grupo PBS que alcanzo significacion con la medicion de reactividad MAC 1 en el hipocampo.

Estos resultados son indicativos del aclaramiento activo, mediado por celulas de amiloide en regiones del cerebro que soportan placa.

3. Efectos AN1792 sobre los niveles de Ap: Determinaciones ELISA

(a) Niveles corticales

En ratones PDAPP no tratados, el nivel mediano de Ap total en la corteza a los 12 meses era de 1.600 ng/g, el cual se incremento a 8.700 ng/g a los 15 meses (Tabla 2). A los 18 meses el valor era de 22.000 ng/g, un aumento de mas de 10 veces durante el curso del tiempo del experimento. Animales tratados con PBS tuvieron Ap total de 8.600 ng/g a los 15 meses, aumentandose a 19.000 ng/g a los 18 meses. En contraste, animales tratados con 1792 teman 81% menos Ap total a los 15 meses (1.600 ng/g) que el grupo inmunizado por PBS. Significativamente, menos (p = 0,0001) Ap total (5.200 ng/g) se encontro a los 18 meses cuando se compararon los grupos AN1792 y PBS (Tabla 2), lo que representa una reduccion del 72% del Ap que de otra manera estana presente. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon los niveles corticales de Ap42, es decir, que el grupo tratado con AN1792 contema mucho menos AB42, pero en este caso las diferencias entre los grupos AN1792 y PBS fueron significativas tanto a los 15 meses (p = 0,04) como a los 18 meses (p = 0,0001, Tabla 2).

Tabla 2: Niveles medianos de Ap (nglg) en la corteza

NO TRATADO PBS AN1792

Edad

Total Ap42 (n) Total Ap42 (n) Total Ap42 (n)

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1600 1300 (10)

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8700 8300 (10) 8600 7200 (9) 1600 1300 * (10)

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22.200 18.500 (10) 19.000 15.900 (12) 5,200** 4,000 ** (9)

* p = 0,0412 ** p = 0,0001

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(b) Niveles de hipocampo

En ratones PDAPP no tratados, los niveles de hipocampo medianos de Ap total a los doce meses de edad fueron de 15.000 ng/g, aumentandose a 51.000 nglg a los 15 meses y adicionalmente a 81.000 ng/g a los 18 meses (tabla 3). Del mismo modo, ratones inmunizados por PBS mostraron valores de 40.000 ng/g y 65.000 ng/g a los 15 meses y 18 meses, respectivamente. Animales inmunizados por AN1792 mostraron menos Ap total, espedficamente 25.000 ng/g y 51.000 ng/g en los respectivos puntos de tiempo de 15 meses y 18 meses. El valor de grupo tratado AN1792 a los 18 meses era significativamente inferior que el del grupo tratado con PBS (p = 0,0105; Tabla 3). La medicion de Ap42 dio el mismo patron de resultados, a saber, que los niveles en el grupo tratado con AN1792 fueron significativamente mas bajos que en el grupo PBS (39.000 ng/g vs. 57.000 ng/g, respectivamente; p = 0,002) en la evaluacion de 18 meses (Tabla 3).

Tabla 3: Niveles medianos de Ap (ng/g) en el hipocampo

NO TRATADO PBS AN1792

Edad

Total Ap42 (n) Total Ap42 (n) Total Ap42 (n)

12

15.500 11.100 (10)

15

51.500 44.400 (10) 40.100 35.70 (9) 24.50 22,100 (10)

18

80.800 64.200 (10) 65.400 57.10 (12) 50,90 38.900 ** (9)

* p = 0,0105

** p = 0,0022

(c) Niveles cerebelares

En ratones PDAPP no tratados a los 12 meses, el nivel cerebeloso mediano del Ap total era de 15 ng/g (Tabla 4). A los 15 meses, esta mediana se aumento hasta 28 ng/g y a los 18 meses hada aumentado a 35 ng/g. Animales tratado por PBS muestran valores medianos de Ap total de 21 ng/g a los 15 meses y 43 ng/g a los 18 meses. Se encontro que animales tratados con AN1792 teman 22 ng/g de Ap total a los 15 meses y significativamente menos (p = 0,002) Ap total a los 18 meses (25 ng/g) que el grupo de PBS correspondiente (Tabla 4).

Tabla 4: Niveles de Ap mediana (nglg) en el cerebelo

NO TRATADO PBS AN1792

Edad

Ap Total (n) Ap Total (n) Ap Total (n)

12

15,6 (10)

15

27,7 (10) 20,8 (9) 21,7 (10)

18

35,0 (10) 43,1 (12) 24,8 * (9)

* p = 0,0018

4. Efectos de tratamiento AN1792 sobre los niveles de APP

APP-a y la molecula de APP de longitud completa contienen toda o parte de la secuencia de Ap y por lo tanto podnan estar potencialmente afectados por la generacion de una respuesta inmune dirigida por AN1792. En los estudios realizados hasta la fecha, un ligero aumento en los niveles de APP ha sido notado a medida que aumente la neuropatologfa en el raton PDAPP. En la corteza, los niveles de cualquiera de APP-a/FL (longitud completa) o APP-a eran esencialmente sin cambios por el tratamiento con la excepcion de que APP-a se redujo en un 19% en el punto de tiempo de 18 meses en el AN1792 vs. el grupo tratado por PBS. Los valores APP de 18 meses tratados con AN1792 no fueron significativamente diferentes de los valores de los grupos PBS no tratados de 12 meses y 15 meses y de 15 meses. En todos los casos los valores APP permanecieron dentro de los intervalos

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que se encuentran normalmente en ratones PDAPP.

5. Efectos de tratamiento AN1792 en patologfa neurodegenerativa y gliotica

La carga de placa neuntica se redujo significativamente en la corteza frontal de ratones tratados por AN1792 en comparacion con el grupo PBS tanto a 15 (84%; p=0,03) como 18 (55%; p = 0,01) meses de edad (Fig. 8). El valor mediano de la carga de placa neuntica se aumento de 0,32% a 0,49% en el grupo de PBS entre los 15 y 18 meses de edad. Esto contrastaba con la gran reduccion de desarrollo de placas neunticas en el grupo AN1792, con valores medianos de carga de placas neunticas de 0,05% y 0,22%, en los grupos de 15 y 18 meses, respectivamente.

Inmunizaciones con AN1792 paredan estar bien toleradas y astrocitosis reactiva tambien se redujo significativamente en la RSC de ratones AN1792 cuando se compara con el grupo PBS tanto a 15 (56%; p = 0,011) como 18 (39%; p = 0,028) meses de edad (Fig. 9). Valores medianos de los valores del porcentaje de astrocitosis en el grupo de PBS aumentaron entre los 15 y 18 meses de 4,26% a 5,21%. El tratamient de AN1792 suprimio el desarrollo de astrocitosis en ambos puntos temporales de 1,89% y 3,2%, respectivamente. Esto sugiere que la neuropila no estaba siendo danado por el proceso de despacho.

6. Respuestas de anticuerpos

Tal omo se describio anteriormente, ratones PDAPP heterocigotos de 11 meses de edad (N = 24) recibio una serie de 5 inmunizaciones de 100 |jg de AN1792 emulsionado con adyuvante de Freund y se administro por via intraperitoneal en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12, y una sexta inmunizacion con PBS solo (adyuvante no de Freund) en la semana 16. Como control negativo, un conjunto paralelo de 24 ratones transgenicos ajustado por edad recibio inmunizaciones de PBS emulsionado con los mismos adyuvantes y la administracion de produjo en el mismo horario. Los animales se sangraron dentro del plazo de tres a siete dfas despues de cada inmunizacion comenzando tras la segunda dosis. Las respuestas de anticuerpos a AN1792 se midieron por ELISA. Los tttulos medios geometricos (GMT) para los animales que fueron inmunizados con AN1792 eran de aproximadamente 1.900, 7.600 y 45.000 tras la segunda, tercera y ultima (sexta) dosis, respectivamente. Ningun anticuerpo Ap espedfico se midio en los animales de control tras la sexta inmunizacion.

Aproximadamente una mitad de los animales fueron tratados durante un penodo adicional de tres meses, recibiendo inmunizaciones aproximadamente a 20, 24 y 27 semanas. Cada una de estas dosis se administro en portador de PBS solo sin adyuvante de Freund. Los tftulos medios de anticuerpos permanecieron sin cambios durante este penodo de tiempo. De hecho, los tftulos de anticuerpos parecieron permanecer estables desde el cuarto al octavo sangrado de purga correspondiente a un periodo que cubre la quinta a la novena inyeccion.

Para determinar si los anticuerpos de Ap espedficos provocados por la inmunizacion que se detectaron en el suero de un raton tratado por Ap1792 tambien se asociaron con amiloide cerebral depositado, un subconjunto de las secciones de los ratones tratados por AN1792 y PBS se hicieron reaccionar con un anticuerpo espedfico para IgG de raton. En contraste con el grupo PBS, placas Ap en los cerebros tratados con AN1792 se recubrieron con IgG endogena. Esta diferencia entre los dos grupos se observo en ambos grupos de 15 de 18 meses. Particularmente sorprendente era la falta de etiquetado en el grupo de PBS, a pesar de la presencia de una carga de amiloide pesada en estos ratones. Estos resultados muestran que la inmunizacion con una protema Ap sintetica genera anticuerpos que reconocen y se unen in vivo a la Ap en las placas amiloides.

7. Las respuestas inmunes mediadas por celulas

Se extrajeron los bazos de nueve ratones PDAPP de 18 meses de edad inmunizados por AN1792 e inmunizados por 12 PBS 7 dfas despues de la novena inmunizacion. Los esplenocitos se aislaron y se cultivaron durante 72 h en presencia de Ap40, Ap42, o Ap40-1 (protema de orden inverso). El mitogeno Con A sirvio como control positivo. Respuestas optimas se obtuvieron con > 1,7 jM de protema. Las celulas de los nueve animales tratados por AN1792 proliferaron en respuesta a cualquiera de Ap1-40 o Ap1-42 de protema, con niveles iguales de incorporacion de ambas protemas (Fig. 10, panel superior). No hubo respuesta a la protema inversa Ap40-1. Las celulas de los animales de control no respondieron a ninguna de las protemas Ap (Fig. 10, panel inferior).

C. Conclusion

Los resultados de este estudio muestran que inmunizacion AN1792 de ratones PDAPP que poseen depositos amiloides existentes ralentizan y evitan la deposicion amiloide progresiva y retardan los cambios neuropatologicos consecuentes en el cerebro envejecido de raton PDAPP. Inmunizaciones con AN1792 detuvieron esencialmente amiloide en desarrollo en estructuras que normalmente sucumbinan a la amiloidosis. Asf, la administracion de un peptido Ap tiene beneficio terapeutico en el tratamiento de la EA.

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IV. EXAMEN DE FRAGMENTOS Ap

Ratones 100 PDAPP de 9-11 meses de edad se inmunizaron con 9 regiones diferentes de APP y Ap para determinar que epttopos transmiten la respuesta eficaz. Los 9 inmunogenos diferentes y un control se inyectaron i.p. como se describe anteriormente. Los inmunogenos incluyen cuatro conjugados de peptido Ap humanos 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, acoplados a IgG anti-raton de oveja mediante un enlace de cistina; aminoacidos de polipeptidos APP 592695, Ap agregada humana 1-40, y Ap agregada humana 25-35, y Ap42 agregada de roedor. Ap42 y PBS agregadas se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Se usaron diez ratones por grupo de tratamiento. Los tftulos se controlaron como anteriormente y los ratones se sacrificaron al final de los 4 meses de inyecciones. Histoqmmica, niveles de Ap, y analisis de toxicologfa se determino post mortem.

A. Materiales y metodos

1. Preparacion de inmunogenos

Preparacion de peptidos Ap acoplados: cuatro conjugados de peptidos humanos Ap (residuos de aminoacidos 1-5, 1-12, 13-28, y 33-42, cada uno conjugado con IgG anti-raton de oveja) se prepararon por acoplamiento a traves de una cisterna artificial anadida al peptido Ap usando la sulfo-EMCS reactiva de reticulacion. Los derivados de peptidos Ap se sintetizaron con las siguientes secuencias de aminoacidos final. En cada caso, la ubicacion del residuo de cisterna insertado esta indicada mediante subrayado. El derivado de peptido Ap13-28 tambien tema dos residuos de glicina anadidos antes de la cisterna terminal de carboxilo como se indica.

Peptido Ap1-12 NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH

Peptido Ap1-5 NH2-DAEFRC-COOH

Peptido Ap33-42 NH2-C-amino-acido heptanoico GLMVGGVVIA-COOH

Peptido Ap13-28 Ac-NH-HHQICLVFFAEDVGSNKGGC-COOH

Para prepararse para la reaccion de acoplamiento, diez mg de anti-raton de oveja (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se dializo durante la noche frente a tampon de borato de sodio de 10 mM, pH 8,5. El anticuerpo dializado se concentro hasta un volumen de 2 ml utilizando un tubo Amicon Centriprep. Diez mg sulfo- EMCS

[N (£-maleimidocuproiloxi) succinimida] (Molecular Sciences Co.) se disolvio en un agua desionizada mL. Se anadio un exceso molar de 40 veces de sulfo-EMCS gota a gota con agitacion a IgG anti-raton de oveja y y despues la solucion se agito durante un penodo adicional de diez mm. La IgG anti-raton de oveja activada se purifico y se intercambio el tampon mediante el paso sobre una columna de filtracion de gel de 10 mL (Columna Pierce Presto, obtenida de Pierce Chemicals) equilibrada con 0,1 M NaPO4, 5 mM EDTA, pH 6,5. Fracciones que contienen anticuerpo, identificadas mediante absorbancia a 280 nm, se agruparon y se diluyeron a una concentracion de aproximadamente 1 mg/mL, usando 1,4 mg por DO como coeficiente de extincion. Un exceso molar de 40 veces de peptido Ap se disolvio en 20 mL de 10 mM NaPO4, pH 8,0, con la excepcion del peptido Ap33-42 para lo cual 10 mg primero se disolvio en 0,5 mL de DMSO y despues se diluyo a 20 mL con el tampon 10mM NaPO4. Las soluciones de peptidos se agregaron cada uno a 10 mL de IgG anti-raton de oveja activada y se sacudieron a temperatura ambiente durante 4 h. Los conjugados resultantes se concentraron hasta un volumen final de menos de 10 mL usando un tubo Amicon Centriprep y luego se dializaron frente a PBS para intercambiar el tampon y eliminar el peptido libre. Los conjugados se pasaron a traves de filtros de tamano de poro 0,22 pm para la esterilizacion y a continuacion en almuotas en fracciones de 1 mg y se almacenaron congelados a -20°C. Las concentraciones de los conjugados se determinaron utilizando el ensayo de protema BCA (Pierce Chemicals) con IgG de caballo para la curva estandar. La conjugacion se documento por el aumento del peso molecular de los peptidos conjugados con respecto al de la IgG anti-raton de oveja activada. El conjugado anti-raton de oveja Ap 1-5 era un deposito de dos conjugaciones, el resto eran de una sola preparacion.

2. Preparacion de peptidos Ap agregados

Peptidos 1-40 humanos (AN1528; California Peptides Inc., Lote ME0541), 1-42 humanos (AN1792; California Peptides Inc., Lotes ME0339 y ME0439), 25-35 humanos, y 1-42 roedores (California Peptides Inc., Lote ME0218) estaban recien solubilizaeow para la preparacion de cada conjunto de inyecciones de polvos liofilizados que se habfan almacenado desecados a 20°C. Para este fin, se anadieron dos mg de peptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agito con vortex para generar una solucion relativamente uniforme o suspension. De los cuatro, AN1528 era el unico peptido soluble en esta etapa. A almuota de 100 pl de 10X PBS (1X PbS: 0,15 M NaCl, 0,01 M fosfato de sodio, pH 7,5) se anadio entonces en cuyo momento AN1528 comenzo a precipitarse. La suspension se agito con vortex de nuevo y se incubo durante la noche a 37°C para su uso el dfa siguiente.

Preparacion de la protema pBx6: Se construyo un plasmido de expresion que codifica pBx6, una protema de fusion que consta de la secuencia lfder N-terminal de polimerasa MS-2 de bacteriofago 100-aminoacido seguido por los aminoacidos 592-695 de APP (pAPP) se construyo como se describe por Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497 (1990). El plasmido se transfecto en E. coli y se expreso la protema tras la induccion del promotor. Las

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bacterias se lisaron en 8M urea y pBx6 se purifico parcialmente mediante SDS PAGE preparativa. Las fracciones que conteman pBx6 se identificaron mediante transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal anti-pBx6de conejo, reunido, concentrado usando un tubo Amicon Centriprep y se dializaron contra PBS. La pureza de la preparacion, estimada por SDS PAGE manchado por azul de Coomassie, era de aproximadamente 5 a 10%.

B. Resultados y discusion

1. Diseno del estudio

Un centenar de ratones transgenicos PDAPP heterocigoticos de 9 a 11 meses de edad macho y hembra, se obtuvieron de Charles River Laboratory y Taconic Laboratory. Los ratones se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con diferentes regiones de Ap o APP combinadas con adyuvante de Freund. Los animales se distribuyeron para coincidirse con el sexo, edad, parentesco y el origen de los animales dentro de los grupos lo mas cerca posible. Los inmunogenos incluyeron cuatro peptidos Ap derivados de la secuencia humana, 1-5, 1-12, 13-28, y 33-42, cada uno conjugado con IgG anti-raton de oveja; cuatro peptidos Ap agregados, polipeptidos humanos 1-40 (AN1528), humanos 1-42 (AN1792), humanos 25-35, y roedores 1-42; y un polipeptido de fusion, designado como pBx6, conteniendo los residuos de aminoacidos de APP 592-695. Un decimo grupo se inmunizo con PBS combinado con adyuvante como control.

Para cada inmunizacion, 100 |jg de cada peptido Ap en 200 jl PBS o 200 |jg del derivado de APP pBx6 en el mismo volumen de PBS o PBS solo se emulsiono 1:1 (vol: vol) con Adyuvante Completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 jl para la primera inmunizacion, seguido de un refuerzo de la misma cantidad de inmunogeno en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) para las siguientes cuatro dosis y con PBS para la dosis final. Las inmunizaciones se administran por via intraperitoneal en un programa bisemanal para las primeras tres dosis, despues en un programa mensual a partir de entonces. Los animales se sangraron cuatro a siete dfas despues de cada inmunizacion comenzando tras la segunda dosis para la medicion de los tttulos de anticuerpos. Los animales se sacrificaron aproximadamente una semana despues de la ultima dosis.

2. Niveles Ap y APP en el cerebro

Despues de unos cuatro meses de inmunizacion con los diversos peptidos Ap o el derivado de APP, se extrajeron los cerebros de los animales perfundidos por salina. Un hemisferio se preparo para el analisis inmunohistoqmmico y el segundo se uso para la cuantificacion de los niveles de Ap y APP. Para medir las concentraciones de diversas formas de peptido beta amiloide y protema precursora de amiloide, el hemisferio se disecciono y se homogeneizo de las regiones de hipocampo, cortical, y del cerebelo se prepararon en 5 M de guanidina. Estos se diluyeron y el nivel de amiloide o APP se cuantifico por comparacion con una serie de diluciones de patrones de peptido Ap o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA.

La concentracion mediana de Ap total para el grupo de control inmunizado con PBS era 5,8 veces mayor en el hipocampo que en la corteza (mediana de 24.318 ng/g de tejido del hipocampo en comparacion con 4.221 ng/g para la corteza). La mediana del nivel en el cerebelo del grupo de control (23,4 ng/g de tejido) era de alrededor de 1,000 veces menor que en el hipocampo. Estos niveles son similares a los que hemos informado anteriormente para ratones PDAPP transgenicos heterocigotos de esta edad (Johnson-Woods et al., 1997, supra).

Para la corteza, un subconjunto de grupos de tratamiento tuvo Ap mediano total y Ap1-42 niveles que difenan significativamente del grupo de control (p <0,05), recibiendo aquellos animales el conjugado peptido AN1792, roedor Ap1-42 o Ap1-5 como se muestra en la FIG. 11. Los niveles medianos de Ap total se redujeron en un 75%, 79% y 61%, respectivamente, en comparacion con el control para estos grupos de tratamiento. No habfa correlaciones discernibles entre los tftulos de anticuerpos Ap espedficos y niveles de Ap en la region cortical del cerebro para cualquiera de los grupos.

En el hipocampo, la reduccion mediana de Ap total asociado con el tratamiento AN1792 (46%, p = 0,0543) no era tan grande como la observada en la corteza (75%, p = 0,0021). Sin embargo, la magnitud de la reduccion era mucho mayor en el hipocampo que en la corteza, una reduccion neta de 11.186 ng/g de tejido en el hipocampo frente a 3.171 ng/g de tejido en la corteza. Para los grupos de animales que recibieron roedor Ap1-42 o Ap1-5, los niveles medianos totales de Ap se redujeron en 36% y 26%, respectivamente. Sin embargo, dado el pequeno tamano de los grupos y la alta variabilidad de los niveles de amiloide peptido de animal a animal dentro de ambos grupos, estas reducciones no fueron significativas. Cuando los niveles de Ap1-42 se midieron en el hipocampo, ninguna de las reducciones inducidas por tratamiento alcanzo significacion. Por lo tanto, debido a la carga Ap menor en la corteza, los cambios en esta region son un indicador mas sensible de los efectos del tratamiento. Los cambios en niveles Ap medidos por ELISA en la corteza son similares, pero no identicos, a los resultados de los analisis de inmunohistoqmmica (vease abajo).

Ap total tambien se midio en el cerebelo, una region normalmente mmimamente afectada con patologfa de la EA. Ninguna de las concentraciones medianas Ap de cualquiera de los grupos inmunizados con los diversos peptidos Ap o el derivado de APP difirieron del del grupo de control en esta region del cerebro. Este resultado

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sugiere que los niveles no patologicos de Ap no se ven afectados por el tratamiento.

La concentracion APP tambien se determino mediante ELISA en la corteza y cerebelo de ratones tratados y de control. Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, designado APP-a/FL, reconocio tanto formas APP-alfa (a, la forma secretada de APP que se ha escindido dentro de la secuencia Ap), y de longitud completa (FL) de APP, mientras que el segundo reconoce solo APP-a. En contraste con la disminucion asociada al tratamiento de Ap en un subconjunto de grupos de tratamiento, los niveles de APP eran no cambiados en todos los animales tratados en comparacion con los de control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con peptidos Ap no agotan APP; mas bien el efecto del tratamiento es espedfico para Ap.

En resumen, niveles totales de Ap y de Ap1-42 se redujeron significativamente en la corteza mediante el tratamiento con conjugado AN1792, roedor Ap1-42 o Ap1-5. En el hipocampo, Ap total se redujo significativamente solo mediante un tratamiento AN1792. Ningun otro cambio asociado a tratamiento en los niveles Ap o APP en las regiones del hipocampo, cortical o cerebelar, era signifativo.

2. Analisis histoqmmico

Cerebros de un subconjunto de seis grupos se prepararon para el analisis inmunohistoqmmico, tres grupos inmunizados con los peptidos conjugados Ap1-5, Ap1-12, y Ap13-28; dos grupos inmunizados con los agregados Ap de longitud completa AN1792 y AN1528 y el grupo de control tratado por PBS. Los resultados de los analisis de imagen de la carga de amiloide en secciones de cerebro de estos grupos se muestran en la FIG. 12. Hubo reducciones significativas de la carga de amiloide en las regiones corticales de tres de los grupos de tratamiento en comparacion con los animales de control. Se observo la mayor reduccion de la carga amiloide en el grupo que recibio AN1792 donde el valor medio se redujo en un 97% (p = 0,001). Reducciones significativas tambien se observaron para los animales tratados con AN1528 (95%, p = 0,005) y el conjugado de peptido Ap1-5 (67%, p = 0,02).

Los resultados obtenidos por la cuantificacion del Ap total o Ap1-42 por ELISA y la carga de amiloide por analisis de imagenes difieren en cierta medida. El tratamiento con AN1528 tuvo un impacto significativo sobre el nivel de carga de amiloide cortical cuando se midio por analisis de imagenes cuantitativo pero no en la concentracion de Ap total en la misma region cuando se mide por ELISA. La diferencia entre estos dos resultados es probable que sea se deba a las especificidades de los ensayos. El analisis de imagen mide unicamente Ap insoluble agregada en placas. En contraste, el ELISA mide todas las formas de EA, tanto solubles como insolubles, monomericas y agregadas. Dado que se cree que la patologfa de la enfermedad esta asociada con la forma asociada a placas insolubles de Ap, la tecnica de analisis de imagenes puede tener mas sensibilidad para revelar los efectos del tratamiento. Sin embargo ya que el ELISA es un ensayo mas rapido y mas facil, es muy util para fines de seleccion. Por otra parte se puede revelar que la reduccion asociada a tratamiento de Ap es mayor para Ap asociada a placas que Ap total.

Para determinar si los anticuerpos de Ap espedficos provocados por la inmunizacion en los animales tratados reaccionaron con el amiloide del cerebro depositado, un subconjunto de las secciones de los animales tratados y los ratones de control se hicieron reaccionar con un anticuerpo espedfico para la IgG de raton. En contraste con el grupo PBS, las placas que contienen Ap se recubrieron con IgG endogena para los animales inmunizados con los conjugados de peptido Ap Ap1-5, Ap1-12, y Ap13-28; y los agregados Ap de longitud completa AN1792 y AN1528. Los cerebros de los animales inmunizados con los demas peptidos Ap o el peptido APP pBx6 no fueron analizados por este ensayo.

3. Medicion de tftulos de anticuerpo

Los ratones se sangraron cuatro a siete dfas despues de cada inmunizacion comenzando tras la segunda inmunizacion, para un total de cinco extracciones de sangre. Los tftulos de anticuerpos se midieron como anticuerpo de enlace de Ap1-42 usando un ELISA tipo sandwich con placas plasticas de multipocillo revestidas con A142. Como se muestra en la FIG. 13, los tftulos de anticuerpos de pico se indujeron despues de la cuarta dosis para las cuatro formulaciones inmunogenicas que provocaban los tftulos mas altos de anticuerpos AN1792 espedficos: AN1792 (GMT maximo: 94.647), AN1528 (GMT maximo: 88.231), Ap1-12 conjugado (GMT maximo: 47.216) y roedores Ap1-42 (GMT maximo: 10.766). Los tftulos de estos grupos se redujeron ligeramente despues de las dosis quinta y sexta. Para los cinco inmunogenos restantes, se alcanzaron tftulos maximos tras la quinta o la sexta dosis y estas eran de magnitud muy inferior a los de los cuatro grupos de tftulo mas altos: conjugado Ap1-5 (GMT maximo: 2.356), pBx6 (GMT maximo: 1.986), conjugado Ap13-28 (GMT maximo: 1.183), Ap33-42 conjugado (GMT maximo: 658), Ap25-35 (GMT maximo: 125). Los tftulos de anticuerpos se midieron tambien contra los peptidos homologos usando el mismo formato de ELISA de tipo sandwich para un subconjunto de los inmunogenos, los grupos inmunizados con Ap1-5, Ap13-28, Ap25-35, Ap33-42 o roedor Ap1-42. Estos tftulos fueron aproximadamente los mismos como los medidos contra Ap1-42 excepto por el inmunogeno de roedor Ap1-42 en el que los tftulos de anticuerpos de caso contra el inmunogeno homologo fueron aproximadamente dos veces mas altos. La magnitud de la concentracion de anticuerpo AN1792 espedfico de los animales individuales o los valores medios de los grupos

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de tratamiento no se correlacionaron con la eficacia medida como la reduccion de la Ap en la corteza.

4. Respuestas linfoproliferativas

La linfoproliferacion dependiente de Ap se midio usando celulas de bazo recogidas aproximadamente una semana despues de la inmunizacion final, sexta. Las celulas recien cosechadas, 105 por pocillo, se cultivaron durante 5 dfas en la presencia de Ap1-40 a una concentracion de 5 pM para la estimulacion. Las celulas procedentes de un subconjunto de siete de los diez grupos tambien fueron cultivadas en presencia del peptido inverso, Ap40-1. Como control positivo, se cultivaron celulas adicionales con el mitogeno de celulas T, PHA, y, como un control negativo, las celulas fueron cultivadas sin peptido anadido.

Los linfocitos de una mayona de los animales proliferaron en respuesta a PHA. No hubo respuestas significativas al peptido inverso Ap40-1. Las celulas de animales inmunizados con los peptidos grandes agregados Ap, AN1792, roedor Ap1-42 y AN1528 proliferaron robustamente cuando se estimularon con Ap1-40 con la cpm mas alta en los receptores de AN1792. Un animal en cada uno de los grupos inmunizados con conjugado Ap1-12, conjugado Ap1328 y A132535 proliferaron en respuesta a Ap1-40. Los grupos restantes que recibieron conjugado Ap1-5, conjugado Ap33-42 pBx6 o PBS no tuvieron animales con una respuesta estimulada por Ap. Estos resultados se resumen en la Tabla 5 a continuacion.

Tabla 5

Inmunogeno

Conjugado Aminoacidos Ap Respondedores

Ap1-5

Sf 5-mer 0/7

Ap1-12

Sf 12-mer 1/8

Ap13-28

Sf 16-mer 1/9

Ap25-35

1 1-mer 1/9

Ap33-42

Sf 10-mer 0/10

Ap1-40

40-mer 5/8

Ap1-42

42-mer 9/9

r Ap 1-42

42-mer 8/8

pBx6

0/8

PBS

0-mer 0/8

Estos resultados muestran que AN1792 y AN1528 estimulan fuertes respuestas de celulas T, muy probablemente del fenotipo CD4+. La ausencia de una respuesta de celula T Ap espedfica en los animales inmunizados con Ap1-5 no es sorprendente ya que epttopos peptfdicos reconocidos por las celulas T CD4+ son por lo general aproximadamente 15 aminoacidos de longitud, aunque peptidos mas cortos a veces pueden funcionar con menos eficiencia. Asf, es probable que la mayona de los epftopos de celulas T auxiliares para los cuatro peptidos del conjugado residen en la pareja de conjugado IgG, no en la region Ap. Esta hipotesis esta apoyada por la muy baja incidencia de respuestas proliferativas para los animales en cada uno de estos grupos de tratamiento. Dado que el conjugado Ap1-5 era eficaz para la reduccion significativa del nivel de Ap en el cerebro, en la aparente ausencia de celulas T Ap espedficas, la respuesta inmunitaria efectora clave inducida por la inmunizacion con este peptido parece ser anticuerpo.

La falta de celulas T y la respuesta de anticuerpos baja de peptido de fusion pBx6, que abarca los aminoacidos de APP 592-695 incluyendo todos los residuos de Ap pueden deberse a la escasa inmunogenicidad de esta preparacion particular. La escasa inmunogenicidad del agregado Ap25-35 es probablemente debido a que el peptido es demasiado pequeno para que probablemente contenga un buen epftopo de celulas T para ayudar a la induccion de una respuesta de anticuerpos. Si este peptido se conjugara con una protema portadora, probablemente sena mas inmunogenico.

V. Preparacion de anticuerpos policlonales para la proteccion pasiva

125 ratones no transgenicos fueron inmunizados con 100 pg de Ap1-42, ademas del adyuvante CFAIIFA, y se sacrificaron a los 4-5 meses. Se recogio sangre de ratones inmunizados. IgG se separo de otros componentes de

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la sangre. Anticuerpo espedfico para el inmunogeno puede purificarse parcialmente por cromatograffa de afinidad. Un promedio de alrededor de 0,5-1 mg de anticuerpo inmunogeno espedfico se obtiene por raton, dando un total de 60-120 mg.

VI. La inmunizacion pasiva con anticuerpos para Ap

Grupos de ratones PDAPP de 7-9 meses de edad se inyectaron con 0,5 mg en PBS de anti-Ap policlonal o anti-Ap espedfico monoclonal como se muestra a continuacion. Todas las preparaciones de anticuerpo se purificaron para tener bajos niveles de endotoxina. Los monoclonales pueden ser preparados contra un fragmento inyectando el fragmento o forma mas larga de Ap en un raton, preparando hibridomas y examinando los hibridomas para un anticuerpo que se une espedficamente a un fragmento deseado de Ap sin unirse a otros fragmentos no solapantes de Ap.

Tabla 6

Anticuerpo

Epftopo

2H3

Ap 1-12

10D5

Ap 1-12

266

Ap 13-28

21F12

Ap 33-42

Ap42 anti-humano policlonal de raton

Ap42 anti-agregada

Los ratones fueron inyectados ip segun sea necesario durante un penodo de 4 meses para mantener una concentracion circulante de anticuerpo medida por tftulo ELISA de mayor que 1/1000 definida por ELISA para Ap42 u otro inmunogeno. Los tttulos se controlaron como anteriormente y los ratones se sacrificaron al final de los 6 meses de inyecciones. Histoqmmica, niveles de Ap y toxicologfa se realizaron post mortem. Se usaron diez ratones por grupo. Estudios adicionales de inmunizacion pasiva se describen en los Ejemplos XI y XII abajo.

VII. Comparacion de diferentes adyuvantes

Este ejemplo compara CFA, alumbre, una emulsion de agua en aceite y MPL para la capacidad de estimular una respuesta inmune.

A. Materiales y Metodos

1. Diseno del estudio

Un centenar de cobayas de seis semanas de edad de cepa Hartley hembra, obtenidas de Elm Hill, se clasificaron en diez grupos para inmunizarse con AN1792 o un derivado palmitoilado del mismo combinado con diversos adyuvantes. Siete grupos recibieron inyecciones de AN1792 (33 |jg a menos que se especifique lo contrario) combinado con a) PBS, b) adyuvante de Freund, c) MPL, d) escualeno, e) MPL/escualeno f) alumbre de baja dosis, o g) alumbre de alta dosis (300 jg AN1792). Dos grupos recibieron inyecciones de un derivado palmitoilado de AN1792 (33 jg) combinado con a) PBS o b) escualeno. Un decimo grupo final recibio PBS solo sin antfgeno o adyuvante adicional. Para el grupo que recibe adyuvante de Freund, la primera dosis se emulsiono con CFA y las restantes cuatro dosis con IFA. El antfgeno se administro a una dosis de 33 jg para todos los grupos excepto el grupo de alumbre de dosis alta, que recibio 300 jg de AN1792. Las inyecciones se administraron por via intraperitoneal para CFA/IFA y por via intramuscular en el cuadriceps de las extremidades traseras alternativamente en el lado derecho e izquierdo de todos los otros grupos. Las tres primeras dosis se administraron en un programa bisemanal seguido por dos dosis en un intervalo mensual). Se extrajo sangre seis a siete dfas despues de cada inmunizacion, comenzando tras la segunda dosis, para la medicion de los tftulos de anticuerpos.

2. Preparacion de los inmunogenos

Se anadieron dos mg de Ap42 (California Peptide, Lote ME0339) a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agito con vortex para generar una suspension relativamente uniforme. Se anadio una alfcuota de 100 jl de 10X PBS (1X PBS, 0,15 M NaCl, fosfato de sodio 0,01 M, pH 7,5). La suspension se agito con vortex de nuevo y se incubo durante la noche a 37°C para su uso al dfa siguiente. Ap1-42 no usada se almaceno con desecante como un polvo liofilizado a -20°C.

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Un derivado palmitoilado de AN1792 se preparo por acoplamiento de anhftdrido palmftico, disuelto en dimetilformamida, al residuo amino terminal de AN1792 antes de la eliminacion del peptido naciente de la resina mediante tratamiento con acido fluorhftdrico.

Para preparar las dosis de formulacion con Adyuvante Completo de Freund (CFA) (grupo 2), 33 |jg de AN1792 en 2O0 jl PBS, se emulsiono 1:1 (vol: vol) con CFA en un volumen final de 400 jl para la primera inmunizacion. Para las inmunizaciones posteriores, el antigeno se emulsiono de manera similar con Adyuvante Incompleto de Freund (IFA).

Para preparar las dosis de formulacion con MPL para los grupos 5 y 8, polvo liofilizado se anadio (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) a trietilamina acuosa al 0,2% a una concentracion final de 1 mg/mL y se agito en vortex. La mezcla se calento a 65 a 70°C durante 30 s para crear una suspension uniforme ligeramente opaca de micelas. La solucion estaba recien preparada para cada conjunto de inyecciones. Para cada inyeccion en el grupo 5, 33 jg de AN1792 en 16,5 jL PbS, 50 jg de MPL (50 jl) y 162 jL de PBS se mezclaron en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

Para preparar la dosis de formulacion con la emulsion bajo aceite-en-agua, AN1792 en PBS se anadio a 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, 0,5% de Span 85 en PBS para alcanzar una concentracion de dosis unica final del AN1792 33 jg en 250 jL (grupo 6). La mezcla se emulsiono pasando a traves de un dispositivo de mano de dos camaras 15 a 20 veces hasta que las gotitas de la emulsion parecieron ser aproximadamente iguales en diametro a una perla de latex de diametro estandar de 1,0 jm cuando se observa bajo un microscopio. La suspension resultante era opalescente, de color blanco lechoso. Las emulsiones se preparan para cada serie de inyecciones. Para el grupo 8, se anadio MPL en 0,2% de trietilamina a una concentracion de 50 jg por dosis a la mezcla de escualeno y un detergente para la emulsion como se senalo anteriormente. Para el derivado de palmitofto (grupo 7), se anadio 33 jg por dosis de palmitoil-NH-Ap1-42 al escualeno y se agito. Tween 80 y Span 85 se anadieron a continuacion con agitacion en vortex. Esta mezcla se anadio a PBS para alcanzar concentraciones finales de 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, 0,5% de Span 85 y la mezcla se emulsiono como se senalo anteriormente.

Para preparar la dosis de formulacion con alumbre (grupos 9 y 10), AN1792 en PBS se anadio a Alhidrogel (gel de hidroxido de aluminio, Accurate, Westbury, NY) para alcanzar concentraciones de 33 jg (dosis baja, grupo 9) o 300 jg (dosis alta, grupo 10) AN1792 por 5 mg de alumbre en un volumen de dosis final de 250 jL. La suspension se mezclo suavemente durante 4 horas a TA.

3. Medicion de los tftulos de anticuerpos

Las cobayas se sangraron seis a siete dfas despues de la inmunizacion a partir de la segunda inmunizacion para un total de cuatro extracciones de sangre. Tftulos de anticuerpos contra Ap42 se midieron mediante ELISA como se describe en Materiales y Procedimientos Generales.

4. Preparacion del tejido

Tras aproximadamente 14 semanas, todos los cobayas se sacrificaron mediante la administracion CO2. Se recogio el ftquido cefalorraqrndeo y se extrajeron los cerebros y tres de cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) se diseccionaron y se utilizaron para medir la concentracion de protema total Ap usando ELISA.

B. Resultados

1. Respuestas de anticuerpos

Hubo una amplia gama en la potencia de los diversos adyuvantes cuando se midio como la respuesta de anticuerpos a AN1792 despues de la inmunizacion. Como se muestra en la FIG. 14, cuando AN1792 se administro en PBS, no se detectaron anticuerpos tras dos o tres inmunizaciones y las respuestas insignificantes se detectaron despues de la cuarta y quinta dosis con tftulos de media geometrica (GMTs) de solo aproximadamente 45. La emulsion o/w indujo tftulos modestos despues de la tercera dosis (GMT 255) que se mantuvieron tras la cuarta dosis (GMT 301) y cayo con la dosis final (GMT 54). Hubo una clara respuesta a la dosis de antfgeno para AN1792 unido a alumbre con 300 jg siendo mas inmunogenico en todos los puntos de tiempo que 33 jg. En el pico de la respuesta de anticuerpos, tras la cuarta inmunizacion, la diferencia entre las dos dosis era del 43% con GMT de aproximadamente 1940 (33 jg) y 3400 (300 jg). La respuesta de anticuerpos a 33 jg AN1792 mas MPL era muy similar a la generada con casi una dosis diez veces mayor de antfgeno (300 jg) unido a alumbre. La adicion de MPL a una emulsion o/w redujo la potencia de las formulaciones relativas a la con MPL como el unico adyuvante hasta un 75%. Un derivado palmitoilado de AN1792 era completamente no inmunogenico cuando se administra en PBS y dio tftulos modestos cuando se presento en una emulsion o/w con GMT de 340 y 105 para la tercera y la cuarta hemorragia. Los tftulos de anticuerpos mas altos se generaron con adyuvante de Freund con un GMT maximo de aproximadamente 87.000, un valor casi 30 veces mayores que la GMT de las siguientes dos formulaciones mas potentes, MPL y altas dosis de AN1792/alumbre.

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Los adyuvantes mas prometedores identificados en este estudio son MPL y alumbre. De estos dos, parece preferible MPL porque una dosis de antigeno inferior de 10 veces se requiere para generar la misma respuesta de anticuerpos como la obtenida con alumbre. La respuesta puede incrementarse aumentando la dosis de antfgeno y/o adyuvante y mediante la optimizacion del programa de inmunizacion. La emulsion o/w era un adyuvante muy debil para AN1792 y la adicion de una emulsion o/w para adyuvante MPL disminuyo la actividad adyuvante intrmseca de MPL solo.

2. Niveles Ap en el cerebro

A aproximadamente 14 semanas, los cobayas se anestesiaron profundamente, se extrajo el lfquido cefalorraqmdeo (CSF) y los cerebros fueron extirpados de los animales en un subconjunto de los grupos, los inmunizados con adyuvante de Freund (grupo 2), MPL (grupo 5), alumbre con una dosis alta, 300 |jg, de AN1792 (grupo 10) y el grupo de control de PBS inmunizado (grupo 3). Para medir el nivel de peptido AP, un hemisferio se disecciono y homogeneizados de las regiones de hipocampo, cortical, y del cerebelo se prepararon en 5 M de guanidina. Estos se diluyeron y se cuantificaron mediante comparacion con una serie de diluciones de protema estandar de Ap de concentraciones conocidas en un formato ELlSA. Los niveles de protema Ap en el hipocampo, la corteza y el cerebelo fueron muy similares para los cuatro grupos a pesar de la amplia gama de respuestas de anticuerpos a Ap provocados por estas formulaciones. Los niveles medios de Ap de aproximadamente 25 ng/g de tejido se midieron en el hipocampo, 21 ng/g en la corteza y 12 ng/g en el cerebelo. Por lo tanto, la presencia de un tftulo de anticuerpos de alta circulacion a Ap durante casi tres meses en algunos de estos animales no altero los niveles de Ap total en sus cerebros. Los niveles de Ap en el CSF tambien fueron bastante similares entre los grupos. La falta de efecto grande de inmunizacion AN1792 en la Ap endogena indica que la respuesta inmune se centra en las formaciones patologicas de Ap.

VIII. Respuesta inmune a diferentes adyuvantes en ratones

Ratones Swiss Webster hembra de seis semanas de edad se utilizaron para este estudio con 10-13 animales por grupo. Las inmunizaciones se dieron en los dfas 0, 14, 28, 60, 90 y 20 administradas por via subcutanea en un volumen de dosis de 200 jl. PBS se utilizo como el tampon para todas las formulaciones. Los animales se sangran siete dfas despues de cada inmunizacion a partir de la segunda dosis para el analisis de los tttulos de anticuerpos por ELISA. El regimen de tratamiento de cada grupo se resume en la Tabla 7.

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Diseno experimental

Grupo

Na Adjuvanteb Dosis Antfgeno Dosis (jg)

1

10 MPL 12,5 |jg AN1792 33

2

10 MPL 25 jg AN1792 33

3

10 MPL 50 jg AN1792 33

4

13 MPL 125 jg AN1792 33

5

13 MPL 50 jg AN1792 150

6

13 MPL 50 jg AN1528 33

7

10 PBS AN1792 33

8

10 PBS Ninguno

9

10 Escualeno emulsionado 5% AN1792 33

10

10

Escualeno mezclado 5% AN1792 33

11

10 Alumbre 2 mg AN1792 33

12

13 MPL + Alumbre 50 jg/2 mg AN1792 33

13

10 QS-21 5 jg AN1792 33

14

10 QS-21 10 jg AN1792 33

15

10 QS-21 25AN1792 AN1792 33

16

13 QS-21 25AN1792 AN1792 150

17

13 QS-21 25AN1792 AN1528 33

18

13 QS-21 + MPL 25 jg/50 jg AN1792 33

19

13 QS-21 + Alumbre 25 jg/2 mg AN1792 33

Notas al pie:

a numero de ratones en cada grupo al inicio del experimento.

b Se anotan los adyuvantes. El tampon para todas estas formulaciones era PBS. Para el grupo 8, no hubo adyuvante y no hubo antigeno.

Los tttulos de ELISA de anticuerpos contra Ap42 en cada grupo se muestran en la Tabla 8 a continuacion.

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Tftulos de anticuerpos de media geometrica

Semana de sangrado

Grupo de tratamiento

2,9 5,0 8,7 12,9 16,7

1

248 1797 2577 6180 4177

2

598 3114 3984 5287 6878

3

1372 5000 7159 12333 12781

4

1278 20791 14368 20097 25631

5

3288 26242 13229 9315 23742

6

61 2536 2301 1442 4504

7

37 395 484 972 2149

8

25 25 25 25 25

9

25 183 744 952 1823

10

25 89 311 513 817

11

29 708 2618 2165 3666

12

198 1458 1079 612 797

13

38 433 566 1080 626

14

104 541 3247 1609 838

15

212 2630 2472 1224 1496

16

183 2616 6680 2085 1631

17

28 201 375 222 1540

18

31699 15544 23095 6412 9059

19

63 243 554 299 441

La tabla muestra que se obtuvieron los tftulos mas altos para los grupos 4, 5 y 18, en los que los adyuvantes fueron 125 |jg MPL, 50 |jg MPL y QS-21 mas MPL.

IX. La eficacia terapeutica de diferentes adyuvantes

Un estudio de la eficacia terapeutica se llevo a cabo en ratones transgenicos PDAPP con un conjunto de adyuvantes adecuados para el uso en seres humanos para determinar su capacidad para potenciar la respuesta inmune a Ap y para inducir el aclaramiento inmunomediado de depositos amiloides en el cerebro.

Ciento ochenta ratones transgenicos PDAPP heterocigoticos macho y hembra, de 7,5 a 8,5 meses de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories. Los ratones se ordenaron en nueve grupos que contienen 15 a 23 animales por grupo a inmunizarse con AN1792 o AN1528 combinados con diversos adyuvantes. Los animales se distribuyeron para coincidir con el genero, la edad y el parentesco de los animales dentro de los grupos lo mas cerca posible. Los adyuvantes incluyen alumbre, MPL y QS-21, cada uno en combinacion tanto con antigenos como adyuvantes de Freund (AF) combinados solo con AN1792. Un grupo adicional se inmunizo con AN1792 formulado en tampon PBS mas el timerosal conservante sin adyuvante. Un noveno grupo se inmunizo con PBS solo como control negativo.

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Preparacion de peptidos Ap agregados: peptidos Ap1-40 humanos (AN1528; California Peptides Inc., Napa, CA; Lote ME0541) y Ap1-42 humanos (AN1792; California Peptides Inc., Lote ME0439) se solubilizaron recientemente para la preparacion de cada conjunto de inyecciones de polvos liofilizados que se habfan almacenado de modo desecado a -20°C. Para este fin, se anadieron dos mg de peptido a 0,9 ml de agua desionizada y la mezcla se agito con vortex para generar una solucion relativamente uniforme o suspension. AN1528 era soluble en esta etapa, en contraste con AN1792. A continuacion, se anadio una parte aftcuota de 100 pl de 10X PBS (1X PBS: 0,15 M NaCl, 0,01 M de fosfato de sodio, pH 7,5) en cuyo punto AN1528 comenzo a precipitar. Las suspensiones se agitaron en vortex de nuevo y se incubaron durante la noche a 37°C para su uso al dfa siguiente.

Para preparar la dosis de formulacion con alumbre (grupos 1 y 5), se anadio peptido Ap en PBS a alhidrogel (dos por ciento de gel de hidroxido de aluminio acuoso, Sargeant, Inc., Clifton, NJ) hasta alcanzar concentraciones de 100 pg de peptido Ap por 1 mg de alumbre. 10X PBS se anadio a un volumen de dosis final de 200 pl en 1X PBS. La suspension se mezclo suavemente durante aproximadamente 4 h a TA antes de la inyeccion.

Para preparar la dosis de formulacion con MPL (Grupos 2 y 6), polvo liofilizado (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lote 67039-E0896B) se anadio a trietilamina acuosa al 0,2% a una concentracion final de 1 mg/mL y se agito en vortex. La mezcla se calento a 65 a 70°C durante 30 s para crear una suspension uniforme ligeramente opaca de micelas. La solucion se almaceno a 4°C. Para cada conjunto de inyecciones, 100 pg de peptido por dosis en 50 pl PBS, 50 pg de MPL por dosis (50 pl) y 100 pl de PBS por dosis se mezclaron en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

Para preparar la dosis de formulacion con QS-21 (Grupos 3 y 7), polvo liofilizado (Aquila, Framingham, MA; Lote A7018R) a PBS, pH 6,6-6,7 a una concentracion final de 1 mg/ml y se agito en vortex. La solucion se almaceno a -20°C. Para cada conjunto de inyecciones, 100 pg de peptido por dosis en 50 pl de PBS, 25 pg de QS-21 por dosis en 25 pl de PBS y 125 pl de PBS por dosis se mezclaron en un tubo de borosilicato inmediatamente antes de su uso.

Para preparar la dosis de formulacion con adyuvante de Freund (Grupo 4), 100 pg de AN1792 en 200 pl PBS se emulsiono 1:1 (vol: vol) con Adyuvante Completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 pl para la primera inmunizacion. Para las inmunizaciones posteriores, el antfgeno se emulsiono de manera similar con Adyuvante Incompleto de Freund (IFA). Para las formulaciones que contienen los adyuvantes alumbre, MPL o QS- 21, 100 pg por dosis de AN1792 o AN1528 se combino con alumbre (1 mg por dosis) o MPL (50 pg por dosis) o QS- 21-(25 pg por dosis) en un volumen final de 200 pl PBS y se administro por inoculacion subcutanea en la espalda entre los omoplatos. Para el grupo que recibe AF, 100 pg de AN1792 se emulsiono 1:1 (vol: vol) con Adyuvante Completo de Freund (CFA) en un volumen final de 400 pl y se administro por via intraperitoneal para la primera inmunizacion, seguido de un refuerzo de la misma cantidad de inmunogeno en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) para las cinco dosis posteriores. Para el grupo que recibio AN1792 sin adyuvante, 10 pg de AN1792 se combino con 5 pg de timerosal en un volumen final de 50 pl de PBS y se administro por via subcutanea. El noveno grupo de control recibio solo 200 pl de PBS administrado por via subcutanea. Las inmunizaciones se realizaron segun una programa bisemanal para las primeras tres dosis, despues en un programa mensual a partir de entonces en los dfas 0, 16, 28, 56, 85 y 112. Los animales se sangraron de seis a siete dfas despues de cada inmunizacion comenzando tras la segunda dosis para la medicion de los tftulos de anticuerpos. Los animales fueron sacrificados aproximadamente una semana despues de la ultima dosis. Los resultados se midieron mediante ensayo de ELISA de niveles Ap y APP en el cerebro y mediante la evaluacion inmunohistoqmmica de la presencia de placas amiloides en secciones de cerebro. Ademas, se determinaron los tftulos de anticuerpos Ap espedfico, y respuestas proliferativas y de citoquinas dependientes de Ap.

La Tabla 9 muestra que los tftulos de anticuerpos mas altos a Ap1-42 se indujeron con AF y AN1792, los tftulos que alcanzaron un maximo tras la cuarta inmunizacion (GMT maximo: 75.386) y despues se disminuyeron en un 59% despues de la sexta inmunizacion final. El tftulo medio maximo provocado por mPl con AN1792 era 62% menor que el generado con AF (GMT maximo: 28.867) y tambien se alcanzo pronto en el esquema de inmunizacion, tras 3 dosis, seguido de una disminucion a 28% del valor pico despues de la sexta inmunizacion. El tftulo medio maximo generado con QS-21 combinado con AN1792 (GMT: 1.511) era de aproximadamente 5 veces inferior que el obtenido con MPL. Ademas, la cinetica de la respuesta era mas lenta, ya que se requirio una inmunizacion adicional para alcanzar la respuesta del pico. Los tftulos generados por AN1792 enlazado a alumbre eran marginalmente mayores que los obtenidos con QS-21 y la cinetica de respuesta fueron mas rapidos. Para AN1792 administrado en PBS con timerosal la frecuencia y el tamano de los tftulos fueron apenas mayores que la de PBS solo. Los tftulos maximos generados con MPL y AN1528 (GMT 3099 maximo) fueron aproximadamente 9 veces menores que aquellos con AN1792. AN1528 enlazado a alumbre era muy escasamente inmunogenico con tftulos bajos generados solo en algunos de los animales. Ninguna respuesta de anticuerpos se observo en los animales de control inmunizados con PBS solo.

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Tttulos de anticuerpos de media geometrica

Semana de sangrado

Tratamiento

3,3 5,0 9,0 13,0 17,0

Alumbre/

102 1081 2366 1083 572

AN1792

(12/21) b (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)

MPL/

6241 28867 1,1242 5665 8204

AN1792

(21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20)

QS-21/

30 227 327 1511 1188

AN1792

(1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18)

CFA/

10076 61279 75386 41628 30,574

AN1792

(15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)

Alumbre/

25 33 39 37 31

AN1528

(0/21) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20)

MPL/

184 2591 1653 1156 3099

AN1528

(15/21) (20/21) (21/21) (20/20) (20/20)

QS-21/

29 221 51 820 2994

AN1528

(1/22) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22)

PBS mas

25 33 39 37 47

timerosal

(0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16)

PBS

25 25 25 25 25

(0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16)

Notas al pie:

a Tftulos de anticuerpos de media geometrica medidos contra Ap1-42 b Numero de respondedores por grupo

Los resultados de tratamiento AN1792 o AN1528 con diversos adyuvantes, o timerosal en la carga de amiloide cortical en ratones de 12 meses de edad determinados por ELISA se muestran en la FIG. 15. En los ratones de PDAPP de control PBS, el nivel mediano de Ap total en la corteza a los 12 meses era 1.817 ng/g. Se observaron niveles notablemente reducidos de Ap en ratones tratados con AN1792 mas CFA/TFA, AN1792 mas alumbre, AN1792 mas MPL y QS-21 mas AN1792. La reduccion alcanzo significacion estadfstica (p <0,05) solamente para AN1792 mas CFA/IFA. Sin embargo, como se muestra en los Ejemplos I y III, los efectos de la inmunizacion en reduccion de los niveles Ap se convierten sustancialmente mayores en ratones de 15 meses y 18 meses de edad. Por lo tanto, se espera que al menos las composiciones AN1792 mas alumbre, AN1792 mas MPL y AN1792 mas QS-21 lograran significacion estadfstica en el tratamiento de ratones de mas edad. Por el contrario, la AN1792 mas el conservante timerosal mostro un nivel mediano de Ap aproximadamente igual que en los ratones tratados con PBS. Se obtuvieron resultados similares cuando se compararon niveles corticales de Ap42. El nivel mediano del de Ap42 en los controles de PBS era 1.624 ng/g. Se observaron Notablemente reducidos niveles medios de 403, 1.149, 620 y 714 se observaron en los ratones tratados con AN1792 mas CFA/IFA, AN1792 mas alumbre, AN1792 mas MPL y AN1792 mas QS-21, respectivamente, con la reduccion que logra la significacion estadfstica (p = 0,05) para el grupo de tratamiento con AN1792 CFA/IFA. El nivel mediano en los ratones tratados con AN1792 timerosal era 1.619 ng/g Ap42.

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Se realizo un estudio de eficacia adyuvante/inmunogeno terapeutico adicional en ratones transgenicos PDAPP heterocigotos machos y hembras de 9 - 10,5 meses de edad. La duracion del estudio era de 25 semanas con 29-40 animales por grupo de tratamiento; por lo tanto, los animales eran 15 - 16,5 meses de edad en la terminacion. Los grupos de tratamiento se identifican en la Tabla 10 a continuacion.

Adyuvante Inmunogeno Tampon de dilucion Administracion

Grupo 1:

MPL-SE AN1792-GCS (75 jg) PBS SC (250 jL)

Grupo 2:

ISA 51 AN1792-GCS (75 jg) PBS IP (400 jL)

Grupo 3:

QS21 AN1792-GCS (75 jg) PBS SC (250 jL)

Grupo 4:

QS21 abrev. AN1792-GCS (75 jg) PBS SC (250 jL)

Grupo 5:

PBS SC (250 jL)

Abreviaturas de Tabla 10: MAP - peptido multiantigenico; TT - epftopo de celulas T de toxoide tetanico (830,844); SQ - subcutanea; IP - via intraperitoneal; PBS - fosfato, solucion salina tamponada; ISA-51 es un adyuvante comercialmente disponible similar a IFA; GCS es una formulacion de glicina/citrato/sacarosa, MPL-SE es MPL en una emulsion estabilizada de agua y aceite.

El calendario de inmunizacion era identico para todos los grupos de tratamiento excepto para el Grupo 3, el grupo horario abreviado QS-21/AN1792. Los ratones se inyectaron en las semanas 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, con sangrados en las semanas 3, 5, 9, 13, 17, 21 y 25. Los grupos 1, 2, recibieron ocho inyecciones y el Grupo 3 recibio cuatro inyecciones durante el penodo de 25 semanas del estudio. El Grupo 4, el horario abreviado QS-21/AN1792, recibio inyecciones en las semanas 0, 2, 4, y 8 solo. Este grupo no se inyecto para el resto del estudio, a pesar de que se extrajo sangre en el mismo horario de purga como el resto del estudio para seguir deterioro del tftulo. Los grupos 3 y 5, QS-21/AN1792 y PBS, respectivamente, sirvio como controles positivos y negativos para este estudio.

Los tftulos se determinaron mediante el ensayo de tftulo de anticuerpos anti-Ap.

Grupo 1, el grupo MPL-SE /AN1792, levanto un tftulo de media geometrica maxima (GMT) de 17.100 a las 9 semanas cayendo a un GMT de 10.000 a las 25 semanas. Inicialmente, los tftulos MPL-SE subieron a una velocidad algo mayor que el grupo de control QS21/AN1792 (Grupo 4).

Grupo 2, el grupo ISA 51/AN1792, produjo tftulos altos en todo el estudio alcanzando un GMT de mas de 100.000 durante las ultimas 9 semanas del estudio.

Grupo 3, el grupo de control QS21/AN1792, alcanzo su tftulo maximo en 17 semanas con un GMT de 16.000. El tftulo luego cayo en las proximas 8 semanas para terminar con GMT de 8.700. Un animal en este grupo no planteo un tftulo largo de todo el curso del experimento.

Grupo 4, el grupo de horario de inyecciones abreviado QS21/AN1792, alcanzo un tftulo maximo de 7.300 a las 13 semanas, cinco semanas despues de su inyeccion final. El tftulo luego cayo a un GMT de 2.100 en el sangrado final (25 semanas). Al igual que en el grupo de control, un animal no logro levantar un tftulo detectable, mientras que otro animal perdio todo el tftulo al final del penodo de deterioro.

Grupo 5, el grupo de PBS solo, no tema tftulos.

Para evaluar los niveles Ap corticales, Ap total y Ap1-42 se midieron por ELISA. Brevemente, un hemisferio cerebral se diseco para tejido cortical, hipocampo y cerebelo seguido de homogeneizacion en tampon de guanidina 5M y se ensayo para Ap cerebral. Los resultados corticales totales de Ap y Ap42 son similares. Un analisis estadfstico de Mann-Whitney se realizo para determinar la significacion entre los grupos con un valor p de <0,05 indicando un cambio significativo en Ap.

Todos los grupos de tratamiento redujeron significativamente niveles de Ap total en comparacion con el grupo de control PBS (vease la Tabla 11). El grupo MPL-SE/AN1792, mostro el cambio mayor en Ap, y es significativamente mejor que los otros grupos de tratamiento. El grupo abreviado QS21/AN1792 era similar en su cambio global de Ap al grupo de control QS21 que recibio las ocho inyecciones. Los niveles de Ap en el grupo ISA 51/AN1792, se redujeron de manera similar en comparacion con el grupo CFA/TFA:MAP (Ap1-7).

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PBS MPL-SE ES UN QS-21 QS-21-(4)

MEDIANA

7.335 1.236 3.026 2.389 2.996

(tejido ng/g)

RANGO

550-18.358 70-3.977 23-9.777 210- 24-16.834

(tejido ng/g)

11.167

valor p

— <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001

N

38 29 36 34 40

En conclusion, adyuvantes MPL-SE, ISA-51 y QS21 combinados con AN1792 son eficaces en la induccion de una respuesta inmune suficiente para retardar significativamente deposicion Ap en la corteza.

X. Analisis de Toxicidad

Los tejidos se recogieron para su examen histopatologico a la terminacion de los estudios descritos en los Ejemplos 2, 3 y 7. Ademas, hematolog^a y qmmica clmica se realizaron en muestras de sangre terminales de los ejemplos 3 y 7. Se evaluo la mayona de los organos principales, incluyendo el cerebro, pulmonar, linfoide, gastrointestinal, Idgado, rinon, adrenal y gonadas. Aunque se observaron lesiones esporadicas en los animales del estudio, no hubo diferencias obvias, ya sea en los tejidos afectados o la gravedad de la lesion, entre animales AN1792 tratados y no tratados. No hubo lesiones histopatologicas unicas observadas en animales inmunizados por AN1528 en comparacion con animales tratados por PBS o no tratados. Tampoco hubo diferencias en el perfil de bioqmmica clmica entre grupos adyuvantes y animales tratados con PBS en el ejemplo 7. Aunque hubo aumentos significativos en varios de los parametros de hematologfa entre los animales tratados con AN1792 y adyuvante de Freund en el Ejemplo 7 con respecto a animales tratados por PBS, este tipo de efectos se espera de un tratamiento de adyuvante de Freund y la peritonitis que acompana y no indican ningun efecto adverso a partir de un tratamiento AN1792. Aunque no forma parte de la evaluacion toxicologica, la patologfa del cerebro de raton PDAPP fue examinado extensamente como parte de los criterios de valoracion de eficacia. Ningun indicio de tratamiento relacionado con efectos adversos sobre la morfologfa del cerebro se observo en los estudios. Estos resultados indican que un tratamiento AN1792 se tolera y es al menos sustancialmente libre de efectos secundarios.

XI. El tratamiento terapeutico con anticuerpos anti-Ap

Este ejemplo examina la capacidad de diversos anticuerpos monoclonales y policlonales a Ap para inhibir la acumulacion de Ap en el cerebro de ratones transgenicos heterocigotos.

1. Diseno del estudio

Sesenta ratones transgenicos PDAPP heterocigotos macho y hembra, de 8,5 a 10,5 meses de edad se obtuvieron de Charles River Laboratory. Los ratones se clasificaron en seis grupos a tratar con diversos anticuerpos dirigidos a Ap. Los animales se distribuyeron para coincidir con el sexo, edad, parentesco y el origen de los animales dentro de los grupos lo mas cerca posible. Como se muestra en la Tabla 10, los anticuerpos inclrnan cuatro anticuerpos monoclonales murinos Ap espedficos, 2H3 (dirigido a residuos Ap 1-12), 10D5 (dirigido a residuos Ap 116), 266 (dirigido a residuos Ap 13-28 y se une a monomerico pero no a AN1792 agregada), 21F12 (dirigida a residuos Ap 33-42). Un quinto grupo se trato con una fraccion de anticuerpo policlonal Ap espedfico (levantada por inmunizacion con AN1792 agregada). El grupo de control negativo recibio el diluyente, PBS, solo sin anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales se inyectaron a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg (suponiendo que los ratones pesaron 50 g). Las inyecciones se administraron por via intraperitoneal cada siete dfas en promedio para mantener los tftulos de anti-Ap por encima de 1000. Aunque tttulos mas bajos se midieron para mAb 266 ya que no se une bien a la AN1792 agregada usada como antfgeno de captura en el ensayo, se mantuvo el mismo programa de dosificacion para este grupo. El grupo que recibe anticuerpo monoclonal 2H3 se interrumpio en las primeras tres semanas desde el anticuerpo se despejo demasiado rapidamente in vivo. Los animales se sangraron antes de cada dosificacion para la medicion de los tftulos de anticuerpos. El tratamiento se continuo durante un penodo de seis meses para un total de 196 dfas. Los animales se sacrificaron una semana despues de la ultima dosis.

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DISENO EXPERIMENTAL

Grupo de tratamiento

Na Anticuerpo de tratamiento Especificidad de anticuerpo Isotipo de anticuerpo

1

9 ninguno (PBS solo) N/Ab N/A

2

10 Policlonal Ap1-42 mezclado

3

0 mAbc2H3 Ap1-12 IgG1

4

8 mAb10D5 Ap1-16 IgG1

5

6 mAb 266 Ap13-28 IgG1

6

8 mAb 21F12 Ap33-42 IgG2a

Notas al pie de pagina

a. Numero de ratones en el grupo a la terminacion del experimento. Todos los grupos empezaron con 10 animales por grupo.

b. NA: no aplicable

c. mAb: anticuerpo monoclonal

2. Materiales y Metodos

a. Preparacion del anticuerpo

Anticuerpos policlonales de anti-Ap se prepararon a partir de sangre recogida de dos grupos de animales. El primer grupo consistfa en 100 ratones Swiss Webster hembra, de 6 a 8 semanas de edad. Se inmunizaron en los dfas 0, 15, y 29 con 100 |jg de AN1792 combinado con CFA/IFA. Una cuarta inyeccion se administro en el dfa 36 con una mitad de la dosis de AN1792. Los animales se desangraron despues del sacrificio el dfa 42, se preparo suero y los sueros se reunieron para crear un total de 64 ml. El segundo grupo constaba de 24 ratones hembra isogenicos con los ratones PDAPP pero no transgenicos para el gen APP humano, de 6 a 9 semanas de edad. Se inmunizaron en los dfas 0, 14,28 y 56 con 100 jg de AN1792 combinado con CFA/IFA. Estos animales tambien se desangraron despues del sacrificio el dfa 63, se preparo el suero y se combinaron para un total de 14 ml. Se combinaron los dos lotes de suero. La fraccion de anticuerpo se purifico usando dos rondas secuenciales de precipitacion con sulfato de amonio saturado al 50%. El precipitado final se dializo frente a PBS y se ensayo para endotoxinas. El nivel de endotoxina era menor de 1 EU/mg.

Los anticuerpos monoclonales anti-Ap se prepararon a partir de fluido de ascitis. El fluido se deslipido primero mediante la adicion de sulfato de dextrano sodico concentrado a fluido helado de ascitis por agitacion en hielo para alcanzar una concentracion final de 0,238%. Despues CaC12 concentrada se anadio con agitacion para alcanzar una concentracion final de 64mM. Esta solucion se centrifugo a 10.000 x g y se descarto el granulo. El sobrenadante se agito en hielo anadiendose gota a gota un volumen igual de sulfato de amonio saturado. La solucion se centrifugo de nuevo a 10.000 x g y se descarto el sobrenadante. El granulo se resuspendio y se dializo contra 20 mM Tris-HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,5. Esta fraccion se aplico a una columna Q de Sefarosa Pharmacia FPLC y se eluyo con un gradiente inverso de 0,4 M a 0,275 M NaCl en 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.

El pico de anticuerpos se identifico por absorbancia a 280 nm y se agruparon las fracciones apropiadas. La preparacion de anticuerpo purificado se caracterizo midiendo la concentracion de protema usando el metodo BCA y la pureza usando SDS-PaGe. El deposito tambien se examino para endotoxina. El nivel de endotoxina era menor de 1 UE/mg. Los tftulos, se les asigno a los tftulos de menos de 100 arbitrariamente un valor de tftulo de 25.

3. Niveles de Ap y APP en el cerebro:

Despues de aproximadamente seis meses de tratamiento con las diversas preparaciones de anticuerpos anti-Ap, los cerebros se retiraron de los animales despues de perfusion salina. Un hemisferio se preparo para el analisis inmunohistoqmmico y el segundo se uso para la cuantificacion de niveles Ap y APP. Para medir las concentraciones de diversas formas de peptido de amiloide beta y la protema precursora de amiloide (APP), el

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hemisferio se disecciono y homogeneizados del hipocampo, cortical, y las regiones del cerebelo se prepararon de 5M guanidina. Estos se diluyeron en serie y el nivel de peptido amiloide o APP se cuantificaron por comparacion con una serie de diluciones de patrones de peptido Ap o APP de concentraciones conocidas en un formato ELISA.

Los niveles de Ap total y de Ap1-42 medidos por ELISA en homogeneizados de la corteza, y el hipocampo y el nivel de Ap total en el cerebelo se muestran en las Tablas 11, 12 y 13, respectivamente. La concentracion mediana del Ap total para el grupo de control, inoculado con PBS, era 3,6 veces mayor en el hipocampo que en la corteza (mediana de tejido del hipocampo de 63.389 ng/g en comparacion con 17.818 ng/g para la corteza). La mediana del nivel en el cerebelo del grupo de control (30,6 ng/g de tejido) era mas de 2,000 veces menor que en el hipocampo. Estos niveles son similares a los que hemos informado anteriormente para ratones transgenicos PDAPP heterocigotos de esta edad (Johnson-Wood et al., 1997).

Para la corteza, un grupo de tratamiento tema un nivel de Ap mediano, medido como Ap1-42, el cual difena significativamente del del grupo de control (p <0,05), aquellos animales que recibieron el anticuerpo policlonal anti- Ap como se muestra en la Tabla 13. El nivel mediano de Ap1-42 se redujo en un 65%, en comparacion con el control para este grupo de tratamiento. Los niveles medios de Ap1-42 tambien se redujeron significativamente en un 55% en comparacion con el control en un grupo de tratamiento adicional, los animales dosificados con el mAb 10D5 (p = 0,0433).

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Notas a pie de pagina:

a. Numero de animales por grupo al final del experimento

b. Tejido ng/g

c. Analisis Mann Whitney

d. NA: no aplicable

e. Desviacion estandar

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En el hipocampo, el porcentaje de reduccion media de Ap total asociado con el tratamiento con anticuerpo anti-Ap policlonal (50%, p = 0,0055) no era tan grande como el observado en la corteza (65%) (Tabla 14). Sin embargo, la magnitud absoluta de la reduccion era casi 3 veces mayor en el hipocampo que en la corteza, una reduccion neta de 31.683 ng/g de tejido en el hipocampo frente a 11.658 ng/g de tejido en la corteza. Cuando se midio como el nivel de la forma mas amiloidogenica de Ap1-42 EA, mas que como Ap total, la reduccion conseguida con el anticuerpo policlonal era significativa (p = 0,0025). Los niveles medianos en los grupos tratados con mAb 10D5 y 266 se redujeron en 33% y 21%, respectivamente.

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Notas de pie de pagina:

a. Numero de animales por grupo al final del experimento

b. Tejido ng/g

c. Analisis Mann Whitney

d. NA: no aplicable

e. Desviacion estandar

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Ap total tambien se midio en el cerebelo (Tabla 15). Esos grupos dosificados con anti-Ap policlonal y el anticuerpo 266 mostraron reducciones significativas de los niveles de Ap total (43% y 46%, p = 0,0033 y p = 0,0184, respectivamente) y de ese grupo tratado con 10D5 tuvo una reduccion casi significativa (29%, p = 0,0675).

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CEREBELO

Grupo de tratamiento

Na Medianas Medias

Ap total Ap total

Valor ELISAb Valor Pc % de cambio Valor ELISA

PBS

9 30,64 NAd N/A 40,001+/-31,89e

Anti-Ap42 policlonal

10 17,61 0,0033 -43 18,15+/-4,36

mAb10D5

8 21,68 0,0675 -29 27,29+/-19,43

mAb 266

6 16,59 0,0184 -46 19,59+/-6,59

mAb 21F12

8 29,80 > 0,9999 -3 32,88+/-9,90

Notas al pie de pagina:

a. Numero de animales por grupo al final del experimento

b. Tejido ng/g

c. Analisis Mann Whitney

d. NA: no aplicable

e. Desviacion estandar

La concentracion de APP tambien se determino mediante ELISA en la corteza y cerebelo de ratones tratados por PBS tratados por anticuerpo y de control,. Dos ensayos de APP diferentes se utilizaron. El primero, denominado APP-a/FL, reconoce tanto APP-alfa (a, la forma secretada de APP que se ha escindido dentro de la secuencia Ap), y formas de longitud completa (FL) de APP, mientras que el segundo reconoce solo APP-a. En contraste con la disminucion asociada a tratamiento de Ap en un subconjunto de grupos de tratamiento, los niveles de APP estaban practicamente sin cambios en todos los animales tratados en comparacion con los de control. Estos resultados indican que las inmunizaciones con anticuerpos Ap agotan Ap sin agotar APP.

En resumen, los niveles de Ap se redujeron significativamente en la corteza, el hipocampo y el cerebelo en animales tratados con el anticuerpo policlonal producido contra AN1792. En menor medida, los anticuerpos monoclonales para la region amino terminal de Ap1-42, espedficamente aminoacidos 1-16 y 13-28 tambien mostraron efectos significativos del tratamiento.

4. Analisis histoqmmicos:

La morfologfa de las placas Ap-inmunoreactivas en subconjuntos de cerebros de ratones en los grupos de tratamiento PBS, AB42 policlonal, 21F12, 266 y 10D5 se comparo cualitativamente con los estudios previos en los que los procedimientos de inmunizacion estandar con AB42 fueron seguidos.

La alteracion mas grande tanto en la extension como la aparicion de placas amiloides ocurrieron en los animales inmunizados con el anticuerpo policlonal Ap42. La reduccion de la carga amiloide, morfologfa erosionada de placa e inmunorreactividad Ap asociada a celulas se pareda estrechamente a los efectos producidos por el procedimiento de inmunizacion estandar. Estas observaciones apoyan los resultados de ELlSA en loz que reducciones significativas tanto en Ap total como Ap42 se lograron por la administracion del anticuerpo policlonal Ap42.

En evaluaciones cualitativas similares, placas de amiloide en el grupo de 10D5 tambien se redujeron en numero y aspecto, con alguna evidencia de inmunorreactividad Ap asociada a celulas. En relacion con los animales tratados por control, la fraccion Ig policlonal contra Ap y uno de los anticuerpos monoclonales (10D5) redujo la carga de placas en un 93% y 81%, respectivamente (p<0,005). 21F12 pareda tener un efecto relativamente modesto sobre la carga de la placa. Las micrograffas de cerebro despues del tratamiento con pabAp1-42 muestran depositos

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difusos y ausencia de muchas de las placas compactadas mas grandes en el grupo tratado pabAp-M2 en relacion con los animales tratados por control.

5. Medicion de tttulos de anticuerpos:

Un subconjunto de tres ratones elegidos aleatoriamente de cada grupo se sangraron justo antes de cada inoculacion intraperitoneal, para un total de 30 extracciones de sangre. Los tttulos de anticuerpos se midieron como anticuerpo de union a Ap1-42 usando un ELISA de tipo sandwich con placas de multipocillo de plastico revestidas con Ap1-42 como se describe en detalle en los Materiales y Procedimientos Generales. Los tftulos medios para cada extraccion de sangre se muestran en las Figuras 16-18 para el anticuerpo policlonal y los 10D5 y 21F12 monoclonales, respectivamente. Los tftulos teman un promedio de aproximadamente 1000 durante este penodo de tiempo para la preparacion de anticuerpos policlonal y eran ligeramente por encima de este nivel para animales tratados con 10D5 y 21F12.

6. Respuestas linfoproliferativas:

Linfoproliferacion dependiente de Ap se midio usando celulas de bazo recogidas ocho dfas despues de la infusion final de anticuerpo. Las celulas recien cosechadas, 105 por pocillo, se cultivaron durante 5 dfas en presencia de Ap1-40 a una concentracion de 5 pM para la estimulacion. Como control positivo, se cultivaron celulas adicionales con el mitogeno de celulas T, PHA, y, como control negativo, celulas se cultivaron sin peptido anadido.

Los esplenocitos de ratones PDAPP inmunizados pasivamente con diversos anticuerpos anti-Ap se estimularon in vitro con AN1792 y se midieron las respuestas proliferativas y de citoquinas. El proposito de estos ensayos era el de determinar si la inmunizacion pasiva facilitaba la presentacion del antigeno, y por lo tanto el cebado de respuestas de celulas T espedficas para AN1792. No se observo respuestas proliferativas o citoquinas AN1792 espedficas en ratones pasivamente inmunizados con los anticuerpos anti-Ap.

XII: ESTUDIO ADICIONAL DE LA INMUNIZACION PASIVA

En un segundo estudio, el tratamiento con 10D5 se repitio y se ensayaron dos anticuerpos anti-Ap adicionales, los monoclonales 3D6 (Api-5) y 16C11 -( Ap33-42). Los grupos de control recibieron PBS o un anticuerpo irrelevante ajustado a isotipo (TM2a). Los ratones eran mas viejos (heterocigotos de 11,5-12 meses de edad) que en el estudio anterior, de lo contrario el diseno experimental era el mismo. Una vez mas, despues de seis meses de tratamiento, 10D5 redujo la carga de placas en mas de un 80% con respecto a PBS o controles de anticuerpos aujstado a isotipo (p = 0,003). Uno de los otros anticuerpos contra Ap, 3D6, era igualmente eficaz, produciendo una reduccion del 86% (p = 0,003). En contraste, el tercer anticuerpo contra el peptido, 16C11, no tuvo ningun efecto sobre la carga de placas. Se obtuvieron resultados similares con las mediciones Ap42 ELISA. Estos resultados demuestran que una respuesta de anticuerpos contra el peptido Ap, en ausencia de inmunidad de celulas T, es suficiente para disminuir la deposicion amiloide en ratones PDAPP, pero que no todos los anticuerpos anti-Ap son eficaces. Los anticuerpos dirigidos a epftopos que comprenden 30 aminoacidos 15 o 37 de Ap son particularmente eficaces.

En resumen, hemos demostrado que los anticuerpos administrados pasivamente contra Ap redujeron la extension de la deposicion de la placa en un modelo de raton de la enfermedad de Alzheimer. Cuando se mantiene en concentraciones sericas modestas (25-70 pg/ml), los anticuerpos tuvieron acceso al SNC a niveles suficientes para decorar las placas p-amiloide. La entrada de anticuerpos en el SNC no se debfa a una fuga anormal de la barrera hematoencefalica ya que no habfa aumento en la permeabilidad vascular medida por Azul de Evans en ratones PDAPP. Ademas, la concentracion de anticuerpo en el parenquima cerebral de ratones PDAPP era igual que en ratones no transgenicos, representando el 0,1% de la concentracion de anticuerpos en suero (independientemente del isotipo).

XIII: CONTROL DE LA UNION DE ANTICUERPOS

Para determinar si los anticuerpos contra Ap podnan estar actuando directamente dentro del SNC, los cerebros tomados de ratones perfusionados con salina al final del Ejemplo XII, se examinaron para la presencia de los anticuerpos administrados perifericamente. Secciones de cerebro de criostato no fijadas fueron expuestas a un reactivo fluorescente contra inmunoglobulina de raton (IgG-Cy3 anti-raton de cabra). Las placas dentro de cerebros de los grupos de 10D5 y 3D6 fueron fuertemente decoradas con el anticuerpo, mientras que no hubo tincion en el grupo de 16C11. Para revelar el grado completo de deposicion de la placa, las secciones seriadas de cada cerebro se inmunorreaccionaron primero con un anticuerpo anti-Ap, y despues con el reactivo secundario. 10D5 y 3D6, despues de la administracion periferica, tuvieron acceso a la mayona de las placas dentro del SNC. La carga de placas se redujo enormemente en estos grupos de tratamiento en comparacion con el grupo 16C11. Estos datos indican que anticuerpos administrados perifericamente pueden entrar en el SNC donde pueden desencadenar directamente aclaramiento de amiloide. Es probable que 16C11 tambien tema acceso a las placas pero era incapaz

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de unirse.

XIV: ENSAYO DE EXAMEN EX VIVO PARA ACTIVIDAD DE UN ANTICUERPO CONTRA DEPOSITOS AMILOIDES

Para examinar el efecto de los anticuerpos sobre la eliminacion de placas, establecimos un ensayo ex vivo en el que las celulas microgliales primarios se cultivaron con secciones de criostato no fijadas de cualquiera de raton PDAPP o cerebros Ap humanos. Las celulas microgliales se obtuvieron de las cortezas cerebrales de ratones DBAI2N neonatos (13 dfas). Las cortezas se disociaron mecanicamente en HBSS (Solucion salina equilibrada de Hanks, Sigma) con 50 pg/ml de DNasa I (Sigma). Las celulas disociadas se filtraron con un filtro de celulas gm 100 (Falcon), y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sedimento se resuspendio en medio de crecimiento (DMEM de alta glucosa, 10% de fBs, 25 ng/ml rmGM-CSF), y las celulas se sembraron a una densidad de 2 cerebros por matraz de cultivo de plastico T75. Despues de 79 dfas, los matraces se rotaron en un agitador orbital a 200 rpm durante 2 horas a 37°C. La suspension celular se centrifugo a 1000 rpm y se resuspendio en el medio de ensayo.

Las secciones de criostato 10-pm de cerebros EA humanos o de raton PDAPP (intervalo postmortem de <3 h) fueron montados en deshielo en cubreobjetos de vidrio redondos recubiertos de polilisina y se colocaron en pocillos de placas de 24 pocillos de cultivo tisular. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con el medio de ensayo consistente en HSFM (medio libre de suero hibridoma, Gibco BRL) con 1% de FBS, glutamina, penicilina/estreptomicina, y Sng/ml rmGM-CSF (R&D). Control o anticuerpos anti-Ap se anadieron a una concentracion 2x (5 pg/ml final) durante 1 hora. Las celulas microgliales fueron entonces sembradas a una densidad de 0,8 x 106 celulas/ml de medio de ensayo. Los cultivos se mantuvieron en un incubador humidificado (37°C, 5%CO2) para las 24 horas o mas. Al final de la incubacion, los cultivos se fijaron con paraformaldehndo al 4% y se permeabilizaron con 0,1% Triton-X100. Las secciones se tineron con 3D6 biotinilado seguido de un conjugado estreptavidina/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Se visualizaron las celulas microgliales exogenas por una tincion nuclear (DAPI). Los cultivos se observaron con un microscopio fluorescente invertida (Nikon, TE300) y microfotograffas fueron tomadas con una camara digital SPOT usando el software SPOT (instrumentos de diagnostico). Para el analisis Western blot, se extrajeron los cultivos en urea 8 M, se diluyeron 1: 1 en tampon de muestra reductor de tricina y se cargaron en un gel de tricina 16% (Novex). Despues de la transferencia sobre immobilon, las transferencias se expusieron a 5 pg/ml de pabAp42 seguidos por un anticuerpo anti-raton conjugado por HRP, y se desarollaron con ECL (Amersham).

Cuando el ensayo se realizo con secciones de cerebro PDAPP en presencia de 16C11 (uno de los anticuerpos contra Ap que no era eficaz in vivo), las placas p-amiloide permanecieron intactas y no se observo fagocitosis. En contraste, cuando las secciones adyacentes se cultivaron en presencia de 10D5, los depositos amiloides desaparecieron en gran medida y las celulas microgliales mostraban numerosas vesfculas fagocfticas que contienen Ap. Se obtuvieron resultados identicos con secciones cerebrales EA; fagocitosis inducida por 10D5 de placas EA, mientras que 16C11 era ineficaz. Ademas, el ensayo proporciono resultados comparables cuando se realizo con el raton o las celulas microgliales humanas, y con el raton, conejo, o anticuerpos de primates contra Ap.

La Tabla 16 muestra si la union y/o fagocitosis se obtuvo para varias especificidades de union diferentes de anticuerpos. Se puede observar que los anticuerpos que se unen a epttopos dentro de aa 1-7 tanto unen como aclaran depositos amiloides, mientras que los anticuerpos que se unen a epttopos dentro de los aminoacidos 4-10 se unen sin eliminar los depositos amiloides. Los anticuerpos que se unen a epftopos C-terminales al residuo 10 ni unen ni aclaran depositos amiloides.

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Anticuerpo Tincion Fagocitosis

epttopo isotipo

N-Term

MAB

3D6

1-5 IgG2b + +

10D5

3-6 igG1 + +

22C8

3-7 IgG2a + +

6E10

5-10 IgG1 + -

14A8

4-10 igG1 de rata + -

13-28

18G11

10-18 igG1 de rata - -

266

16-24 IgG1 - -

22D12

18-21 IgG2b - -

C-Termino

2G3

-40 IgG1 - -

16C11

-40/-42 IgG1 - -

21F12

-42 IgG2a - -

Suero inmune

conejo (CFA)

1-6 + +

raton (CFA)

3-7 + +

raton (QS-21)

3-7 + +

mono (QS-21)

1-5 + +

raton (MAPI-7)

+ +

La Tabla 17 muestra los resultados obtenidos con varios anticuerpos contra Ap, comparando sus capacidades para inducir la fagocitosis en el ensayo ex vivo y para reducir carga de placa in vivo en estudios de transferencia pasiva. Aunque 16C11 y 21F12 unidos a peptido Ap sintetico agregado con alta avidez, estos anticuerpos eran incapaces de reaccionar con placas p-amiloides en secciones del cerebro no fijadas, no podfan desencadenar fagocitosis en el ensayo ex vivo, y no eran eficaces in vivo. 10D5, 3D6, y el anticuerpo policlonal contra Ap fueron activos por las tres medidas. El anticuerpo 22C8 se une mas fuertemente a una forma analogica de origen natural Ap en la que el acido aspartico en las posiciones 1 y 7 se sustituye con acido isoaspartico. Estos resultados muestran que la eficacia in vivo se debe a la liquidacion del anticuerpo directa mediada de las placas dentro del SNC, y que el ensayo ex es predictivo de la eficacia in vivo.

El mismo ensayo se ha utilizado para examinar la liquidacion de un anticuerpo contra un fragmento de sinuclema denominado como NAC. Sinuclema ha demostrado ser una protema asociada a placas amiloides. Un anticuerpo a NAC se puso en contacto con una muestra de tejido cerebral que contema placas amiloides, celulas microgliales, como antes. Suero de conejo se uso como un control. control posterior mostro una marcada reduccion en el numero y tamano de placas indicativas de la actividad de eliminacion del anticuerpo.

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Tabla 17 El ensayo ex vivo como predictor de la eficacia in vivo.

Anticuerpo

Isotipo Avidez para Ap agregada (PM) Union a placas p- amiloides Eficacia ex vivo Eficacia in vivo

monoclonal

3D6

IgG2b 470 + + +

10D5

Iggi 43 + + +

16C11

Iggi 90 - - - -

211712

IgG2a 500 - - -

TM2A

Iggi - - - -

policlonal

1-42

mezcla 600 + + +

La microscopfa confocal se uso para confirmar que Ap se internaliza durante el transcurso del ensayo ex vivo. En presencia de anticuerpos de control, las celulas microgliales exogenas permanedan en un plano confocal encima del tejido, no hada vesfculas fagodticas que conteman Ap, y las placas permanecieron intactas dentro de la seccion. En presencia de 10D5, casi todo el material de placa estaba contenido en vesfculas dentro de las celulas microgliales exogenas. Para determinar el destino del peptido internalizado, cultivos tratados con 10D5 se extrajeron con urea 8M en varios puntos de tiempo, y se examinaron por analisis de transferencia Western. Al punto de tiempo de una hora, cuando aun no se hada producido fagocitosis, la reaccion con un anticuerpo policlonal contra Ap revelo una fuerte banda 4 kD (correspondiente al peptido Ap). La inmunorreactividad Ap se disminuyo en el dfa 1 y estaba ausente el dfa 3. De esta manera, la fagocitosis mediada por anticuerpos de Ap conduce a su degradacion.

Para determinar si la fagocitosis en el ensayo ex vivo era Fc-mediado, fragmentos F(ab')2 del anticuerpo anti-Ap 3D6 se prepararon. Aunque los fragmentos F(ab')2 reteman su capacidad completa de reaccionar con las placas, eran incapaces de desencadenar la fagocitosis por celulas microgliales. Ademas, la fagocitosis con el anticuerpo completo podfa bloquearse por un reactivo contra receptores Fc murinos (anti-CD16/32). Estos datos indican que la liquidacion in vivo de Ap ocurre a traves de la fagocitosis mediada por Fc-receptor.

XV: PASO DE ANTICUERPOS A TRAVES DE LA BARRERA SANGWNEA DEL CEREBRO

Este ejemplo determina la concentracion de anticuerpo suministrado al cerebro despues de la inyeccion intravenosa en un tejido periferico de cualquiera de ratones normales o PDAPP. Ratones normales PDAPP o de control fueron perfundidos con 0,9% de NaCl. Las regiones cerebrales (hipocampo o corteza) se diseccionaron y se congelaron rapidamente. Cerebro se homogeneizo en inhibidores 0,1% triton + proteasa. La inmunoglobulina se detecto en los extractos por ELISA. IgG anti-raton de cabra Fab'2 se revistieron sobre una placa de RIA como reactivo de captura. Extractos de suero o de cerebro se incubaron durante 1 h. Los isotipos se detectaron con anti- raton de IgG1-HRP o IgG2a-HRP o IgG2b-HRP (Caltag). Los anticuerpos, independientemente del isotipo, estaban presentes en el SNC a una concentracion que es 1: 1000 la encontrada en la sangre. Por ejemplo, cuando la concentracion de IgG1 era tres veces la de IgG2a en la sangre, era tres veces IgG2a en el cerebro, estando ambos presentes en 0,1% de sus niveles respectivos en la sangre. Este resultado se observo tanto en ratones transgenicos como no transgenicos por lo que el PDAPP no tiene una barrera hematoencefalica de fuga unica.

XVI: EFICACIA TERAPEUTICA DE UN PEPTIDO AB EN LA CONFIGURACION MAP

Un estudio de eficacia terapeutico adyuvante/inmunogeno se realizo en ratones transgenicos PDAPP heterocigotos machos y hembras de 9 a 10,5 meses de edad para examinar la eficacia de una protema de fusion que comprende Ap1-7 en la configuracion de MAP tetramerica como se describe anteriormente. La duracion del estudio era de 25 semanas con 29-40 animales por grupo de tratamiento; por lo tanto, los animales era de 15 a 16,5 meses de edad en la terminacion. La metodologfa utilizada en este estudio es la misma que en el estudio terapeutico de diferentes adyuvantes en el Ejemplo VIII anteriormente. Los grupos de tratamiento se identifican en la Tabla 18 a continuacion.

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Adyuvante Inmunogeno Tampon de dilucion Administracion

Grupo 1:

CFA/IFA MAP (Ap 1-7: TT) (100 pg) PBS IP (400 pl)

Grupo 2:

QS21 AN1792-GCS (75 pg) PBS SC (250 pl)

Grupo 3:

PBS SC (250 pl)

Abreviaturas de la tabla: MAP - peptido multiantigenica; TT - epftopo de celulas T toxoide tetanico (830,844); subcutanea SC; IP v^a intraperitoneal; fosfato PBS solucion salina tamponada; GCS es una formulacion de glicina/citrato/sacarosa.

El calendario de inmunizacion era identico para todos los grupos de tratamiento. Los ratones se inyectaron en las semanas 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, con extracciones de sangre en la semana 3, 5, 9, 13, 17, 21 y 25. Los grupos 1, 2, 3, 4, y 6 recibieron ocho inyecciones de Grupos 2 y 3, QS21/AN1792 y PBS, respectivamente, que se sirvieron como controles positivos y negativos para este estudio.

Los tftulos se determinaron mediante el ensayo de tftulo de anticuerpos anti-Ap.

Grupo 1, grupo CFA/IFA: MAP (Ap1-7: TT), teman niveles bajos de tftulo. GMT maximo alcanzado solo era de 1.200 a las 13 semanas, cayendo a un GMT de 600 a la semana 25. Hubo 3 de los 30 ratones que no alzaron ningun tftulo y otros 7 ratones que no superaron un tftulo de 400 al final del estudio.

Grupo 2, el grupo de control QS21/AN1792, alcanzo su tftulo maximo a las 17 semanas con un GMT de 16.000. El tftulo despues cayo en las proximos 8 semanas para terminar con un GMT de 8700. Un animal en este grupo no alzo un tftulo a lo largo del experimento.

Grupo 3, el grupo de PBS solo, no tema tftulos.

Ambos grupos de tratamiento mostraron un descenso significativo en los niveles corticales Ap en comparacion con el grupo de control PBS (vease la Tabla 19). El grupo CFA/IFA:MAP (Ap1-7), rebajo significativamente la Ap en comparacion con el grupo de control PBS a pesar de los relativamente bajos tftulos de anticuerpos anti-Ap.

Tabla 19 Niveles corticales Ap

PBS MAPA QS-21

MEDIANA (tejido ng/g)

7.335 3.692 2.389

RANGO (tejido ng/g)

550-18.358 240-10.782 210-11.167

Valor de p

— 0,0003 <0,0001

N

38 30 34

En conclusion, el inmunogeno Ap 1-7MAP es eficaz en la induccion de una respuesta inmune suficiente para retardar significativamente la deposicion de Ap en la corteza.

XVII. MAPEO DE EPTOPOS DE RESPUESTA INMUNOGENICA A Ap EN MONOS

Este ejemplo analiza la respuesta de un primate a la inmunizacion con AN1792 (es dedr, Ap1-42). Once grupos de monos (4/sexo/grupo) se inmunizaron con AN1792 (75 o 300 pg/dosis) en combinacion con el adyuvante QS-21-(50 o 100 pg/dosis) o 5% dextrosa esteril en agua (D5W, grupo de control). Todos los animales recibieron inyecciones IM en uno de tres horarios de inyeccion como se muestra en la Tabla 20 para un total de 4, 5 o 8 dosis. Las muestras de suero (de 4 monos/sexo/grupo) recogidas en el Dfa 175 de las muestras de estudio y CSF (de 3 monos/sexo/grupo) recogidas en el Dfa 176 del estudio (en la necropsia a 6 meses) se evaluaron por su capacidad de unirse al peptido Ap1-40 y APP.

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Tabla 20: Asignaciones de grupo y los niveles de dosis

N° de Grupo

Horario3 # Monos (M/F) AN1792 Dosis (pg/dose) QS-21 Dosis (pg/dosis) Ruta de dosis

1 4/4 0 0 IM

2

1 4/4 Vehftculo0 50 IM

3

1 4/4 Vehfculo 100 IM

4

1 4/4 75 50 IM

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1 4/4 300 50 IM

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1 4/4 75 100 IM

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1 4/4 300 100 IM

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2 4/4 75 100 IM

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2 4/4 300 100 IM

10

3 4/4 75 100 IM

11

3 4/4 300 100 IM

a. Horario 1, dfas de dosis 1, 15, 29, 57, 85, 113, 141, 169; Horario 2, dfas de dosis 1,29, 57, 113, 169; Horario 3, dfas de dosis 1, 43, 85, 169

b. Grupo de control de inyeccion D5W

c. Portador consiste en el tampon de glicina/citrato/sacarosa que es el excipiente para AN1792.

La matriz exacta de peptidos lineales reconocidos por los anticuerpos en las muestras de suero de animales inmunizados con AN1792 se determino mediante un ELISA que midio la union de estos anticuerpos a peptidos solapantes que cubnan toda la secuencia Ap1-42. Peptidos biotinilados con secuencias parciales de AN1792 se obtuvieron de Chiron Technologies como 10 peptidos de aminoacidos con un solapamiento de 9 residuos y una etapa de un residuo por peptido (smtesis N° 5366, N° 5331 y N° 5814). Los primeros 32 peptidos (desde la posicion de ocho aminoacidos aguas arriba de N-terminal de AN1792 al vigesimocuarta aminoacido de AN1792) estan biotinilados en el C-terminal con un enlazador de GGK. Los ultimos 10 peptidos (repitiendo el peptido de treinta segundos a partir de la serie anterior) se biotinilan en el N-terminal con un enlazador que consiste en EGEG). Los peptidos biotinilados liofilizados se disolvieron a una concentracion de 5 mM en DMSO. Estas reservas de peptidos se diluyeron a 5 pM en TTBS (0,05% de Tween 20, 25 mM Tris HCl, 137 mM NaCl, 5,1 mM KCI, pH = 7,5). Se anadieron aftcuotas de 100 pl de esta solucion 5 pM por duplicado a placas de 96 pocillos con estreptavidina recubierta previamente (Pierce). Las placas se incubaron durante una hora a la temperatura ambiente, despues se lavo cuatro veces con TTBS. Las muestras de suero se diluyeron en muestra de diluyente sin azida para normalizar tftulos, y se anadio 100 pl por pocillo. Estas placas se incubaron una hora a temperatura ambiente y despues se lavo cuatro veces con TTBS. Anticuerpo antihumano de cabra de HRP conjugado (Jackson ImrnunoResearch) se diluyo 1:10.000 en diluyente de muestra sin azida y se anadio 100 pl por pocillo. Las placas se incubaron de nuevo y se lavaron. Para desarrollar la reaccion de color, TMB (Pierce), se anadio a 100 pl por pocillo y se incubo durante 15 min antes de la adicion de 30 pl de 2 N H2SO4 para detener la reaccion. La densidad optica se midio a 450 nm en un lector de placas colorimetrico Vmax o Spectramax. La inmunizacion con AN1792 dio como resultado la produccion de anticuerpos en el 100% de los animales en todos los grupos de dosis por Dfa 175. Los tftulos medios en los grupos oscilaron entre 14596 - 56084. Hubo una tendencia para los tftulos a ser mas altos dentro de un programa de inmunizacion en la presencia de antfgeno mas alto y/o mayor concentracion de adyuvante, pero no se pudo demostrar diferencias estadfsticamente significativas debido a la alta variabilidad en las respuestas individuales de los animales a las inmunizaciones.

Sueros que fueron positivos para anticuerpos a AN1792 tambien fueron positivos para anticuerpos para Ap1-40. Los tftulos medios en los grupos oscilaron entre 36867-165991, y en cuanto a tftulos anti-AN1792, no mostraron diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos en el Dfa 175. La union a AN1792 mostraron una correlacion altamente positiva (Spearman r = 0,8671) con la union a Ap1-40.

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De los 48 monos inmunizados en diferentes horarios con AN1792, 33 muestras de CSF producidas de volumen adecuado y la calidad para el analisis. Treinta y dos (97%) de estos monos teman tftulos positivos a AN1792. Los tftulos variaron de 2-246, con una media de 49,44 ± 21,34. Niveles CSF anti-AN1792 fueron 0,18 ± 0,11% de lo que se midio en el suero y demostraron una correlacion altamente positiva (Spearman r = 0,7840) con tftulos sericos. Ninguna diferencia observo entre los grupos o entre sexos en el porcentaje de anticuerpo en el CSF. El nivel de anticuerpo en el CSF es consistente con la transferencia pasiva de anticuerpo generado perifericamente a traves de la barrera hematoencefalica en el sistema nervioso central.

El examen de un subconjunto de muestras de CSF positivas anti-AN1792 demostro que, como el anticuerpo en muestras de suero, el anticuerpo en el CSF reacciona cruzadamente con Ap1-40. Los tftulos a Ap1-40 mostro una alta correlacion (Spearman r = 0,9634) a sus respectivos tftulos de AN1792. El examen de un subconjunto de muestras de CSF con los tftulos mas altos a AN1792 no mostraron ninguna union a APP, como para los anticuerpos sericos.

Cuando los sueros del Dfa 175 se ensayaron frente a una serie de peptidos solapantes 10-mer, anticuerpos de todos los monos unidos al peptido cuya secuencia cubrio aminoacidos 1-10 del peptido AN1792 (aminoacidos 653-672 de APP). En algunos animales, este fue el unico peptido al que la union podna ser medida (vease FIG. 19).

En otros animales, otras reactividades podnan medirse, pero en todos los casos la reactividad a la secuencia peptfdica N-terminal era la predominante. Las reactividades adicionales se dividfan en dos grupos. Primero y mas comun, era la union a peptidos de centrado alrededor de un peptido AN1792 de N-terminal 1-10 (Figura 20). La union de este tipo fue dirigida a los peptidos que abarcan los aminoacidos 1-8, 1-9, y 2-11 del peptido AN1792. Estas reactividades, combinadas con el peptido 1-10, representan la inmensa mayona de la reactividad en todos los animales. El mapeo de epftopos de los animales individuales en el tiempo indica que la reactividad de los anticuerpos para el peptido 1-10 procede la propagacion a los peptidos adyacentes. Esto demuestra una fuerte desviacion de la respuesta inmune al peptido AN1792 N-terminal con su residuo de acido aspartico de terminal libre. La segunda actividad detectable menor en algunos animales era vinculante a los peptidos localizados en C-terminal a la zona mayor y centrados alrededor de peptidos que cubren los aminoacidos 7-16, 11-20 y 16-25 del peptido AN1792. Estas reactividades se observaron solo en 10-30% de los monos.

La variabilidad en la respuesta entre diferentes animales (por ejemplo, si los aminoacidos 1-10 fueron el epftopo reactivo exclusivo o predominante) no se correlaciono con la dosis de antfgeno/adyuvante, horario de dosificacion, o el tftulo de anticuerpos, y es probablemente un reflejo de la composicion genetica de cada animal individual.

XVIII. PREVENCION Y TRATAMIENTO DE SUJETOS HUMANOS

Un ensayo de fase I de dosis unica se realiza para determinar la seguridad en los seres humanos. Un agente terapeutico se administra en dosificaciones crecientes a diferentes pacientes a partir de aproximadamente 0,01 el nivel de eficacia supuesta, y aumentando en un factor de tres hasta un nivel de aproximadamente 10 veces se alcanza la dosificacion eficaz del raton.

Un ensayo de fase II se lleva a cabo para determinar la eficacia terapeutica. Los pacientes con enfermedad de Alzheimer de etapa temprana a mediana definida utilizando los criterios de Alzheimer's disease and Related Disorders Association (ADRDA) para EA probable. La puntuacion de pacientes adecuados en el rango de 12-26 en el Mini-Mental State Exam (MMSE). Otros criterios de seleccion son que los pacientes son propensos a sobrevivir a la duracion del estudio y carecen de problemas que complican tales como el uso de medicaciones concomitantes que puedan interferir. Las evaluaciones iniciales de la funcion del paciente se realizan usando medidas psicometricas clasicas, como el MMSE y la ADAS, que es una escala exhaustiva para evaluar pacientes con estado y funcion de la enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicometricas proporcionan una medida de la progresion de la enfermedad de Alzheimer. Escalas de vida cualitativas adecuadas tambien se pueden utilizar para controlar el tratamiento. La progresion de la enfermedad tambien se puede controlar mediante resonancia magnetica. los perfiles sangumeos de los pacientes tambien se pueden monitorizar incluyendo ensayos de anticuerpos y las respuestas de celulas T inmunogeno espedficas.

Tras medidas basales, los pacientes empiezan a recibir tratamiento. Se aleatorizaron y se trataron con agente terapeutico o placebo de forma ciega. Los pacientes se controlan al menos cada seis meses. La eficacia se determina por una reduccion significativa en la progresion de un grupo de tratamiento con respecto a un grupo placebo.

Un segundo ensayo de fase II se realiza para evaluar la conversion de pacientes de perdida de memoria temprana de la enfermedad de tipo no Alzheimer, a veces denominada deterioro de memoria asociado a la edad (AAMI) o deterioro cognitivo leve (DCL), a la enfermedad de Alzheimer probable como se define por criterios ADRDA. Los pacientes con alto riesgo de conversion a la enfermedad de Alzheimer se seleccionan de una poblacion no clrnica mediante el cribado de poblaciones de referencia para signos tempranos de perdida de memoria u otras

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dificultades asociadas con la sintomatologfa de pre-Alzheimer, un historial familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo geneticos, edad, sexo y otras caractensticas encontradas para predecir alto riesgo para la enfermedad de Alzheimer. Se recogen puntuaciones basales en las metricas adecuadas incluyendo MMSE y ADAS junto con otras metricas disenadas para evaluar una poblacion mas normal. Estas poblaciones de pacientes se dividen en grupos adecuados con comparacion de placebo frente a alternativas de dosificacion con el agente. Estas poblaciones de pacientes se siguieron a intervalos de aproximadamente seis meses, y el criterio de valoracion para cada paciente es si o no se convierte en la enfermedad de Alzheimer probable segun los criterios ADRDA al final de la observacion.

XIX. Materiales y metodos generales

1. La medicion de tftulos de anticuerpos

Se sangraron los ratones haciendo un pequeno corte en la vena de la cola y recogiendo aproximadamente 200 |jl de sangre en un tubo de microcentnfuga. Los cobayas se sangraron primero mediante el afeitado de la zona de la espalda del corvejon y despues usando una aguja de calibre 18 para cortar la vena metatarsiana y recogiendo la sangre en tubos de microcentnfuga. La sangre se dejo coagular durante una hora a temperatura ambiente (TA), se sometio a vortex, despues se centrifugo a 14.000 x g durante 10 min para separar el coagulo del suero. Entonces el suero se transfirio a un tubo de microcentnfuga limpio y se almaceno a 4°C hasta que se titularon.

Los tftulos de anticuerpos se midieron por ELISA. Placas de microtitulacion de 96 pocillos (placas Costar EIA) se recubrieron con 100 jl de una solucion que contiene o bien 10 jg/ml ya sea Ap42 o SAPP u otros antfgenos como se indica en cada uno de los informes individuales en Tampon de Recubrimiento de Pocillo (fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,5, 0,1% de azida de sodio) y se mantiene durante la noche a TA. Los pocillos se aspiraron y los sueros se anadieron a los pocillos comenzando a una dilucion 1/100 en Diluyente de Muestra (fosfato sodico 0,014 M, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,6% de albumina de suero bovino, 0,05% de timerosal). Siete diluciones seriadas de las muestras se hicieron directamente en las placas en etapas de tres clases para alcanzar una dilucion final de 1/218.700. Las diluciones se incubaron en los pocillos de placas recubiertos durante una hora a TA. A continuacion, las placas se lavaron cuatro veces con PBS que contema 0,05% de Tween 20. El segundo anticuerpo, una Ig anti-raton de cabra conjugado con peroxidasa de rabano picante (obtenida de Boehringer Mannheim), se anadio a los pocillos como 100 jl de una dilucion 1/3000 de Diluyente de Muestra y se incubo durante una hora a TA. Las placas se lavaron nuevamente cuatro veces en PBS, Tween 20. Para desarrollar el cromogeno, 100 jl de TMB lenta (3,3',5,5'- bencidina de tetrametilo se obtuvo de Pierce Chemicals) se anadio a cada pocillo y se incubo durante 15 min a TA. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 25 jl de 2 M H2SO4. A continuacion, la intensidad del color se leyo en un Vmax de Dispositivos Moleculares a (450 nm - 650 nm).

Los tftulos se definieron como el redproco de la dilucion de suero que da una media de la DO maxima. La DO maxima se toma generalmente a partir de una dilucion inicial 1/100, excepto en casos con tftulos muy altos, en cuyo caso era necesaria una dilucion inicial superior para establecer la DO maxima. Si el punto de 50% cayo entre dos diluciones, una extrapolacion lineal se hizo para calcular el tftulo final. Para calcular los tftulos de media geometrica de anticuerpos, los tftulos de menos de 100 se asignaron arbitrariamente un valor de tftulo de 25.

2. Ensayo de proliferacion de linfocitos

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano. Se retiraron los bazos y se enjuagaron dos veces con 5 ml de PBS que contema suero bovino fetal inactivado termicamente al 10% (PBS-FBS) y a continuacion se homogeneizo en una unidad Centricon de 50° (Dako A/S, Dinamarca) en 1,5 ml PBS-FBS durante 10 segundos a 100 rpm en un Medimachine (Dako) seguido por filtracion a traves de una malla de nylon de tamano de poro de 100 micrometres. Los esplenocitos se lavaron una vez con 15 ml de PBS-FBS, y a continuacion granulizados por centrifugacion a 200 x g durante 5 min. Los globulos rojos se lisaron mediante resuspension de los granulos en 5 mL de tampon que contema 0,15 M NH4CL, 1 M KHCO3, 0,1 M NaEDTA, pH 7,4 durante cinco min a TA. Entonces los leucocitos se lavaron como anteriormente. Celulas recien aisladas de bazo (105 celulas por pocillo) se cultivaron en conjuntos por triplicado en placas de microtitulacion tratadas por cultivo de tejido de fondo U de 96 pocillos (Corning, Cambridge, MA) en medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 2,05 mM de L glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, y 10% de EBS activada termicamente, durante 96 ha 37°C. Tambien se anadieron varios peptidos Ap, Ap1-16, Ap1-40, Ap1-42 o Ap40-1 protema de secuencia inversa a dosis que oscilan desde 5 hasta 0,18 micromolares en cuatro pasos. Las celulas en los pocillos de control se cultivaron con Concanavalina A (Con A) (Sigma, cat. n° C5275, a 1 microgramo/ml) sin protema anadida. Las celulas se pulsaron durante las ultimas 24 h con 3H-timidina (1 jCi/pocillo obtenido de Amersham Corp., Arlington Heights IL). Las celulas se recogieron a continuacion en placas UniFilter y se contaron en un contador de centelleo de microplacas de conteo superior (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Los resultados se expresan como computo por minuto (cpm) de radiactividad incorporada en las macromoleculas insolubles.

4. Preparacion de tejidos de cerebro

Despues de la eutanasia, los cerebros se retiraron y un hemisferio se prepare para el analisis

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inmunohistoqmmico, mientras que tres regiones del cerebro (hipocampo, corteza y cerebelo) se diseccionaron a partir del otro hemisferio y se usaron para medir la concentracion de diversas protemas Ap y formas de APP usando ELISA espedficos (JohnsonWood et al., Supra).

Los tejidos destinados para los ELISA se homogeneizaron en 10 volumenes de tampon enfriado con tampon de guanidina helado (5,0 M guanidina-HCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Los homogeneizados se mezclaron por agitacion suave usando un Nutator Adams (Fisher) durante tres a cuatro h a TA, despues se almacenaron a -20°C antes de la cuantificacion de Ap y APP. Experimentos previos hadan demostrado que los analitos eran estables en estas condiciones de almacenamiento, y que la protema Ap sintetica (Bachem) se podnan recuperar cuantitativamente cuando se alzaron en homogeneizados de tejido cerebral de control de los companeros de camada de raton (JohnsonWood et al., Supra).

5. Medicion de los niveles de Ap

Los homogeneizados cerebrales se diluyeron 1:10 con Diluyente de Casema helado (0,25% de casema, PBS, 0,05% de azida de sodio, 20 pg/ml de aprotinina, 5 mM EDTA pH 8,0, 10 pg/ml de leupeptina) y despues se centrifugaron a 16.000 x g durante 20 mm a 4°C. Las Ap estandares sinteticas de protema (142 aminoacidos) y los patrones de APP se prepararon para incluir 0,5 M de guanidina y 0,1% de albumina de suero bovino (BSA) en la composicion final. La ELISA sandwich Ap "total" utiliza anticuerpo monoclonal 266, espedfico para los aminoacidos 13-28 de Ap (Seubert, et al.), como anticuerpo de captura, y anticuerpo monoclonal biotinilado 3D6, espedfico para los aminoacidos 1-5 de Ap (JohnsonWood, et al), como el anticuerpo reportero. El anticuerpo monoclonal 3D6 no reconoce APP secretada o APP de longitud completa, pero solo detecta especies de Ap con un acido aspartico amino terminal. Este ensayo tiene un lfmite inferior de sensibilidad de 50 ng/ml (11 nM) y no muestra reactividad cruzada con la protema Ap-murina endogena a concentraciones de hasta 1 ng/ml (JohnsonWood et al., Supra).

El ELISA de sandwich Ap1-42 espedfico emplea mAp 21F12, espedfico para aminoacidos 33-42 de Ap (Johnson-Wood, et al.), como el anticuerpo de captura. mAp Biotinilado 3D6 es tambien el anticuerpo indicador en este ensayo que tiene un lfmite inferior de sensibilidad de aproximadamente 125 pg/ml (28 pM, Johnson-Wood et al). Para los EliSas Ap, 100 pl de cualquiera de mAp 266 (al 10 pg/ml) o mAp 21F12 a (5 pg/ml) se recubrio en los pocillos de 96 pocillos de placas de inmunoensayo (Costar) por incubacion durante la noche a TA. La solucion se retiro por aspiracion y los pocillos se bloquearon por la adicion de 200 pl de albumina de suero humano al 0,25% en tampon PBS durante al menos 1 hora a TA. La solucion de bloqueo se retiro y las placas se almacenaron desecadas a 4°C hasta su uso. Las placas se rehidrataron con tampon de lavado [solucion salina tamponada por Tris (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,5), mas 0,05% de Tween 20] antes de su uso. Se anadieron las muestras y los patrones en almuotas por triplicado de 100 pl por pocillo y despues se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron al menos tres veces con tampon de lavado entre cada etapa del ensayo. El mAp 3D6 biotinilado, diluido a 0,5 pg/ml en Tampon de Ensayo de Casema (0,25% de casema, PBS, 0,05% Tween 20, pH 7,4), se anadio y se incubo en los pocillos durante 1 h a TA. Un conjugado de peroxidasa de avidina-rabano picante, (Avidina-HRP obtenida de Vector, Burlingame, CA), diluido 1: 4000 en Tampon de Ensayo de Casema, se anadio a los pocillos durante 1 h a TA. El sustrato colorimetrico, Slow TMB-ELISA (Pierce), se anadio y se dejo reaccionar durante 15 minutos a TA, despues de lo cual la reaccion enzimatica se detuvo por la adicion de 25 pl 2 N H2SO4. El producto de reaccion se cuantifico usando un Vmax de Dispositivos Moleculares que mide la diferencia en la absorbancia a 450 nm y 650 nm.

6. Medicion de los niveles de APP

Se utilizaron dos ensayos de APP diferentes. El primero, designado APP-a/FL, reconoce formas tanto de APP-alfa (a) y de longitud completa (FL) de APP. El segundo ensayo es espedfico para APP-a. El ensayo APPA/FL reconoce APP secretada incluyendo los primeros 12 aminoacidos de Ap. Dado que el anticuerpo reportero (2H3) no es espedfico para el sitio de clip a, que se produce entre los aminoacidos 612-613 de APP695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990).); este ensayo tambien reconoce APP de longitud completa (APP-FL). Los experimentos preliminares utilizando anticuerpos inmovilizados de APP a la cola citoplasmica de APP-FL para agotar homogeneizados de cerebro de APP-FL sugieren que aproximadamente el 30-40% de la APP-a/FL APP es FL (datos no mostrados). El anticuerpo de captura tanto para los ensayos de APP-a/FL y APP-a es mAb 8E5, inducido contra los aminoacidos 444 a 592 de la forma APP695 (Games et al., supra). El mAb reportero para el ensayo APP- a/FL es mAb 2H3, espedfico para los aminoacidos 597-608 de APP695 (JohnsonWood et al., Supra) y el anticuerpo reportero para el ensayo de APPA es un derivado biotinilado de mAb 16H9, planteado a los aminoacidos 605 a 611 de APP. El lfmite inferior de sensibilidad del ensayo APP-aFL es de aproximadamente 11 ng/ml (150 pM) (JohnsonWood et al.) y la del ensayo espedfico de APP-a es de 22 ng/ml (0,3 nM). Para ambos ensayos de APP, mAb 8E5 se recubrio en los pocillos de placas de 96 pocillos de EIA, como se describe anteriormente para mAb 266. APP-a purificada, secretada por recombinante se utilizo como patron de referencia para el ensayo de APP-a y el ensayo APP-a/FL (Esch et al., supra). Las muestras de homogeneizado cerebral en guanidina 5 M se diluyeron 1:10 en ELlSA diluyente de muestras (tampon de fosfato 0,014 M, pH 7,4, 0,6% de albumina de suero bovino, 0,05% de timerosal, 0,5 MNaCI, 0,1% NP40). A continuacion, se diluyeron 1: 4 en Diluyente de muestra que contiene 0,5 M de guanidina. Homogeneizados diluidos se centrifugaron a 16.000 x g durante 15 segundos a Ta. Se anadieron los patrones de APP y las muestras a la placa en almuotas duplicadas y se incubaron durante 1,5 horas a TA. El

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anticuerpo reportero biotinilado 2H3 o 16H9 se incubo con las muestras durante 1 hora a TA. La fosfatasa estreptavidina-alcalina (Boehringer Mannheim), diluido 1: 1000 en diluyente de muestra, se incubo en los pocillos durante 1 h a TA. Se anadio el 4-metilo-umbeliferilo-fosfato de sustrato fluorescente para la incubacion a TA durante 30 min y se leyeron las placas en un fluonmetro Cytofluor tm 2350 (Millipore) a 365 nm de excitacion y 450 nm de emision.

7. Qmmica inmunohistoqmmica

Cerebros se fijaron durante tres dfas a 40°C en 4% de paraformaldel'ndo en PBS y despues se almacenaron de uno a siete dfas a 4°C en 1% de paraformaldel'ndo, pBs hasta seccionarse. Secciones coronales de espesor de cuarenta micras se redujeron en un vibratoma a TA y se almacenaron en crioprotector (30% de glicerol, 30% de etilenglicol en tampon de fosfato) a -20°C antes del procesamiento inmunohistoqmmico. Para cada cerebro, seis secciones al nivel del hipocampo de dorsal, cada una separada por intervalos consecutivos de 240 pm, se incubaron durante la noche con uno de los siguientes anticuerpos: (1) un anti-Ap biotinilado (mAb, 3D6, espedfico para Ap humana) diluido a una concentracion de 2 pg/ml en PBS y 1% de suero de caballo; o (2) un mAb biotinilado espedfico para APP humana, 8E5, diluido a una concentracion de 3 pg/ml en PBS y 1,0% de suero de caballo; o (3) un mAb espedfico para protema acida fibrilar glial (GFAP; Sigma Chemical Co.) diluido 1: 500 con 0,25% de Triton X-100 y 1% de suero de caballo, en solucion salina tamponada de Tris, pH 7,4 (TBS); o (4) un mAb espedfico para CD11b, antfgeno MAC-1, (Chemicon International) diluido 1: 100 con 0,25% de Triton X-100 y 1% de suero de conejo en TBS; o (5) un mAb espedfico para el antfgeno MHC II, (Pharmingen) diluido 1: 100 con 0,25% de Triton X-100 y 1% de suero de conejo en TBS; o (6) un mAb de rata espedfico para CD 43 (Pharmingen) diluido 1: 100 con suero de conejo al 1% en PBS o (7) un mAb de rata espedfico para CD 45RA (Pharmingen) diluido 1: 100 con suero de conejo al 1% en PBS ; o (8) un monoclonal de rata Ap espedfico para CD 45RB (Pharmingen) diluido 1: 100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (9) un monoclonal de rata Ap 10 espedfico para CD 45 (Pharmingen) diluido 1: 100 con suero de conejo al 1% en PBS; o (10) un biotinilado hamster policlonal Ap espedfico para CD3e (Pharmingen) diluido 1: 100 con suero de conejo al 1% en PBS o (11) un mAb de rata espedfico para CD3 (Serotec) diluido 1: 200 con suero de conejo al 1% en PBS ; o con (12) una solucion de PBS que carece de un anticuerpo primario que contiene 1% de suero de caballo normal.

Las secciones que reaccionaron con soluciones de anticuerpo enumeradas en los 1,2 y 6-12 anteriormente se trataron previamente con 1,0% de Triton X-100, peroxido de hidrogeno 0,4% en PBS durante 20 min a TA para bloquear la peroxidasa endogena. Se incubaron durante la noche a 4°C con el anticuerpo primario. Las secciones que reaccionaron con 3D6 o 8E5 o mAbs CD3e a continuacion se hicieron reaccionar durante una h a TA con un peroxidasa-avidina-biotina-complejo de rabano picante con componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.). Las secciones que reaccionaron con anticuerpos espedficos para CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 y la solucion de PBS desprovista de anticuerpo primario se incubaron durante 1 hora a TA con IgG anti-rata biotinilada (Vector) diluida 1:75 en PBS o IgG de anti-raton biotinilada de (Vector) diluido 1:75 en PBS, respectivamente. Las secciones despues se hicieron reaccionar durante una hora a TA con un peroxidasa-avidina-biotina-complejo de rabano picante con componentes del kit "A" y "B" diluidos 1:75 en PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA.).

Las secciones se desarrollaron en 0,01%, de peroxido de hidrogeno, 0,05% de 3,3'-diaminobencidina (DAB) a TA. Secciones destinadas a la incubacion con anticuerpos espedficos de GFAP, MAC-1 y MHC II se pretrataron con peroxido de hidrogeno al 0,6% a TA para bloquear peroxidasa endogena incubada durante la noche con el anticuerpo primario a 4°C. Las secciones que reaccionaron con el anticuerpo GFAP se incubaron durante 1 hora a TA con IgG de anti-raton biotinilada hecha en caballo (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) diluido 1: 200 con TBS. Las secciones se hicieron reaccionar a continuacion durante una h con peroxidasa-avidina-biotina- complejo (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit) diluido 1: 1000 con TBS. Secciones incubadas con el anticuerpo monoclonal espedfico MAC-1 o MHC II como anticuerpo primario se hicieron reaccionar posteriormente durante 1 hora a TA con IgG de anti-rata biotinilada hecha en conejo diluido 1: 200 con TBS, seguido de incubacion durante una h con complejo de avidina-biotina-peroxidasa diluido 1: 1000 con TBS. Secciones incubadas con anticuerpos espedficos GFAp, MAC-I y MHC II a continuacion se visualizaron por tratamiento a TA con 0,05% DAB, 0,01% de peroxido de hidrogeno, 0,04% de cloruro de mquel, TBS durante 4 y 11 min, respectivamente.

Secciones inmunoetiquetadas se montaron en portaobjetos de vidrio (VWR, portaobjetos Superfrost), se secaron al aire durante la noche, sumergido en Propar (Anatech) y se recubrieron con cubreobjetos usando Permount (Fisher) como medio de montaje.

Para contratenir placas de Ap, un subconjunto de las secciones de GFAP positiva se montaron en portaobjetos Superfrost y se incubaron en tioflavina S acuosa al 1% (Sigma) durante 7 min despues del procesamiento inmunohistoqmmico. Las secciones despues se deshidrataron y se liquido en Propar, despues recubierto con cubreobjetos montados con Permount.

8. Analisis de imagen

Un Sistema de Analisis de Imagen 150 Videometrico (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) unido a un

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microscopio Nikon Microphot-FX a traves de una camara de v^deo CCD y un monitor Sony Trinitron se utilizo para la cuantificacion de los portaobjetos inmunorreactivos. La imagen de la seccion se almaceno en una memoria intermedia de video y un umbral a base de color y saturacion se determino para seleccionar y calcular el area total de pfxeles ocupada por las estructuras inmunoetiquetadas. Para cada seccion, el hipocampo se perfilo manualmente y se calculo el area total de pfxeles ocupada por el hipocampo. El porcentaje de carga de amiloide de por ciento se midio como: (la fraccion del area del hipocampo que contiene depositos inmunorreactivos de Ap con mAb 3D6) x 100. De manera similar, el porcentaje de carga neuntica se midio como: (la fraccion del area del hipocampo que contiene neuritas distroficas reactivas con anticuerpo monoclonal 8E5) x100. El Sistema de C-Imagen (Compix, Inc., Cranberry Township, PA) que opera el programa aplicacion de software 32 simple se relaciono con un microscopio Nikon Microphot-FX a traves de una camara Optronics y se utilizaron para cuantificar el porcentaje de la corteza retrospenial ocupada por astrocitos GFAP positivos y microglias MAC-1 y MHC-II positivas. La imagen de la seccion inmunoreaccionada se almaceno en una memoria intermedia de video y se determino un umbral a base de monocromo para seleccionar y calcular el area total de pfxeles ocupada por celulas inmunoetiquetadas. Para cada seccion, la corteza retroesplenial (RSC) se esbozo manualmente y el area total de pfxeles ocupada por la RSC se calculo. El porcentaje de astrocitosis se definio como: (la fraccion de RSC ocupada por astrocitos GFAP-reactivos) X 100. De manera similar, el porcentaje de microgliosis se definio como: (la fraccion de la RSC ocupada por microglia reactive MAC-I o MHC II) X 100. Para todos los analisis de imagenes, seis secciones a nivel del hipocampo dorsal, cada una separada por intervalos consecutivos de 240 pm, se cuantificaron para cada animal. En todos los casos, el estado de tratamiento de los animales era desconocido para el observador.

Aunque la invencion anterior ha sido descrita en detalle para fines de claridad de comprension, sera obvio que ciertas modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. De lo anterior sera evidente que la invencion permite un numero de usos. Por ejemplo, la invencion proporciona cualquiera de los anticuerpos a Ap definido en las reivindicaciones para uso en el tratamiento, profilaxis o diagnostico de enfermedad amiloidogenica. La descripcion preve el uso de cualquiera de los anticuerpos a Ap se ha descrito anteriormente en la fabricacion de un medicamento o composicion de diagnostico para su uso en el mismo. Del mismo modo, la descripcion preve el uso de cualquiera de los fragmentos epitopicos de Ap descritos anteriormente para el tratamiento o la profilaxis de enfermedad amiloidogenica, o en la fabricacion de un medicamento para uso en la misma.

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   1. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo dentro de los residuos 1-10 de Ap, en el que el isotipo del anticuerpo es IgGI humana, y un portador farmaceuticamente aceptable.
2. 2. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo se une espedficamente a un epftopo dentro de:

   los residuos 1-6 de Ap;

   los residuos 1-7 de Ap;

   los residuos 1-4 de Ap;

   los residuos 1-3 de Ap;

   los residuos 3-6 de Ap;

   o los residuos 3-7 de Ap.
3. 3. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que el anticuerpo se une espedficamente a un epftopo que comprende un residuo N-terminal libre de Ap.
4. 4. Una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
5. 5. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo comprende dos copias del mismo par de cadenas ligera y pesada.
6. 6. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo es un anticuerpo biespedfico que comprende una primera luz y un par de cadena pesada que se une espedficamente al epftopo de A y una segunda luz y un par de cadena pesada que se une espedficamente a un receptor de Fc en las celulas microgliales.
7. 7. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde una cadena del anticuerpo se fusiona a un polipeptido heterologo.
8. 8. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo se une espedficamente al peptido Ap sin unirse a protema precursora de amiloide (APP) de longitud completa.
9. 9. Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la composicion farmaceutica comprende adicionalmente al menos un otro anticuerpo que se une a un epftopo diferente de Ap.
10. 10. La composicion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un diluyente fisiologicamente aceptable para la administracion parenteral.
11. 11. Una composicion farmaceutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde

    la composicion farmaceutica es para uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad asociada con los depositos amiloides de A en el cerebro de un paciente.
12. 12. La composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion II, en la que la composicion farmaceutica se administra por via subcutanea o por via intravenosa.
13. 13. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 11 o la reivindicacion 12, en donde la composicion farmaceutica se administra en multiples dosis durante un penodo de al menos seis meses.
14. 14. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la composicion farmaceutica se administra como una composicion de liberacion sostenida.
15. 15. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde la dosis de anticuerpo es de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal del paciente.
16. 16. Un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo dentro de los residuos 1-10 de Ap donde el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana, para su uso en la prevencion o el tratamiento de una enfermedad asociada con depositos amiloides de la Ap en el cerebro de un paciente.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65
17. 17. Un anticuerpo para el uso segun la reivindicacion 16, donde el anticuerpo es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
18. 18. Un anticuerpo para el uso segun la reivindicacion 16 o la reivindicacion 17, donde el anticuerpo se administra al paciente:

    por via subcutanea o intravenosa;

    en multiples dosificaciones durante un penodo de al menos seis meses; como una composicion de liberacion sostenida; y/o a una dosis de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal del paciente.

    ’Iru.OA i>2 WAX. o.o. DE liioooe OILUCiOn

    TlTULO DE RAfOlSES PDAPPINVECTADOS PQH A&, AGRE&ADA A LO LARGO DEL TIEMPO

    imagen1

    FIG. 1

    £ STUDIO 001

    CAKGA DE AMILDtDE HlPOCAMPAL

    101 AM 102Ap 3 103 A01 1CM AJJ-3 105 AJJ’5 10SAM

    imagen2

    DBTROf IA NBUftlTlCA (fc}

    ESTLDIO DQl

    CARCA D= PLACA NEJRlTlCA HIPQCAMPAL

    imagen3

    ^studo OGT

    lASrROCl rosis CORTICAL RETROESPElEmica

    imagen4

    Tl TULO DEMEDMGEOMf fRlCA

    SfESPL c£ I A 3E T1TULO Dt ANDCUERPO A VARIAS DOSI“ ICACIQNcS DE U^ 1792 TRA£ 2. 3, V A tNWUNtZAClONEB

    imagen5

    pg AN 1792.1 NMUNIZAClON

    FIG. 5

    CNETICA DE RESPUESTA BE ANTCL/ERPC A AN 1T52

    imagen6

    300 33 \nj 11 M

    FIG. 6

    D 1ST ROFlA N EU RlTICA (%) AWl LOlOE (<ft |

    E STUDIO 002

    CARfiA DE AMLQIDE CORTICAL

    imagen7

    12 WESES 15 WESES is MESES

    FIG. 7

    ESTUDIO 002

    CARGA DE PLACA NEURlTlCA CORTICAL

    imagen8

    FIG. 8

    A$TROCirOSlS(V

    ESTUDIO 002

    A£TROClTOSl£ CORTICAL RETROES^ELENfC A

    imagen9

    15 WESES IS WESES

    FIG 9

    INCORPCRAaON 31+TIMKNNA <£PU> i IN CO R^OR AClON 3H-TI MDMA fCPM)

    ESfUDlO DOS

    ASTROCITOSIS CORTICAL RETROE5PEL&NICA

    CftUPO'l-iAlAJO POR*«l792

    imagen10

    GRUTO TRATADO POR

    imagen11

    FIG. 10

    imagen12

    ATULO DC AHTICUERPQ GM TlTt-0 DE ANTICU ERPO GM

    ESTUDlO GOG

    UlULOSUb AMTtCJEftPO 3b JMON A AH '-02

    imagen13

    imagen14

    FIG. 13

    ^ESPk, = £ Ta£ Ub AN IIC U ERfA\r CSN JlFEKbN r b £ ADV UV AN TES

    imagen15
19. -.Mug AM1732 ^^ENPBS

    _33u£AN1792 ° ENCFMfiA

    33 tn PALWITOYL

    AB EN E&CAULtNO

    33 ug AN1792 “' EN 50 \xg MPUFBS

    «, 33uoANt?fl2 EN ESCaulEnO - 33 ms AN 1792/50 pig

    MFL£n ESCAUlENO 33 f]gAN1792 EN 5 Jig ALUVaHiE

    3W ^9 AN 1792

    en SugALiiwaBE

    FIG. 14

    comrgl de pes

    CONTROL NO TRATADO

    624-165

    272 764-101 3470

    625’ 166

    1602 . 765-162 171

    626-167

    62 766-163 91

    633-165

    4696 767-104 GE92

    ■ 634-169

    3090 763-105 1353

    671-170

    2417 771-106 1153

    672-171

    2640 772 107 3900

    623-172

    3320 760-1 aa 3740

    630-173

    1633 043- 109 163

    631-174

    416 044 190 122

    702-175

    126 045-191 427

    793-17&

    2559 B4&-1G2 2674

    794-177

    269 057-193 453

    732- 17B

    179 630-194 2990

    733 179

    1329 039-195 1075

    734-130

    5665

    VALOR p

    1617 VALOR p 1153

    MEDLANO{M-W)

    MEDIAN© (M-tt)

    rJEV. EST.

    1931 DEV. EET. 1625

    MEDIO

    1713 MEDIO 1709

    KCV

    39 k,cv 97

    VALOR p <PRUEBA 1)

    n=16 VALOR p<PRUEBA 1) n*15

    FIG 15A

    2 mg aluiv3RE

    50 tig MPL

    100 |jgANt520

    100 ng AN1520

    660-003

    290 643-105 305

    661 '004

    0100 Q44-106 2640

    662-005

    2400 645-107 2403

    663-006

    3014 654-100 1741

    6G4-O07

    5670 655-109 3053

    6G5-O0&

    5970 656-110 599D

    G93-O09

    1620 070-111 3360

    694-090

    36 679-11 £ 1230

    695-091

    3400 764-114 2660

    697-092

    £630 705-115 76

    59R093

    903 706-116 129D

    699-094

    5327 729-117 3100

    701*095

    1062 730-116 1033

    702-096

    1049 731-119 4590

    703-097

    2239 736-120 1112

    739-ODH

    006 737-121 1653

    740-099

    5303 757-122 992

    741-100

    459 750-123 4602

    600-103

    154 SOS*t24 70S

    B01-104

    05£ 009-125 244

    010-126 32

    VALOR p

    2051 VALOR p 1741

    MEDIANO (M-W)

    MEDIANO (M-Wl

    DEV. EST.

    2407 DEV. EST. £140

    MEMO

    1913 MEDIO 1659

    %CV

    79 itcv 70

    VALOR p (PRUE6A 1j

    n=20 VALOR p [PRUEBA 1) tl=2l

    FIG. 15B

    25 jig QS21 100 iigAN-ISae

    CEA/1FA ICO piy AN 1792

    615-12S

    1257 $39-066 693

    616-129

    361 - 640060 500

    $17-130

    1006 641-070 440

    536-131

    3290 G42-071 467

    - 637-132

    2520 090 072 42

    630-133

    3660 G91 073 2491

    744-134

    627 692-074 121

    745-135

    56 795-07E 137

    746-136

    2610 795-076 622

    747-137

    1500 797-077 475

    769-136

    1760 740-067 600

    770-139

    060 749-079 76

    773-140

    1199 750-080 1267

    774-141

    339 751-081 1351

    775 142

    402 701-082 69

    776-143

    537

    640-144

    1119

    641-145

    104

    621-146

    1259

    622-147

    5413

    623-140

    2233

    VALOR p

    1109 VALOR & 475

    l,1EC>IAI\Q [1U-W)

    MEDIAN© (V-iV.i 0.0401

    DEV. EST.

    1552 DEV. EST. 637

    MEDIO

    1304 MEDIO 655

    it tv

    06 it tv 103

    VALOR p (PRUEBA 1)

    VALOR p [PRUEBA 11 0.0106

    n=21 n=15

    FIG. 15C

    5 Lid TWtROflALJPBS 10|ig AN1792

    2 Mg ALUlVBRE 100 AN 1792

    E35-149

    1337 010001 432

    669-150

    4644 . 611-002 1012

    670-151

    6335 6-12-003 3607

    673-152

    3700 613.004 506

    674-153

    2750 620.005 465

    676-154

    1607 621-006 16

    601-156

    105 622-007 28

    602-157

    0031 623 009 217

    683-158

    3400 7Q0-OO9 2739

    754-159

    157 709-01 0 927

    755-160

    6857 710.011 1609

    756-161

    462 716-012 1608

    005-162

    524 784 014 3390

    006-163

    397 765-015 1614

    007-164

    234 766-010 265

    707-017 3102

    760-01B 1617

    709-019 1474

    815-020 424

    816 021 1375

    817-022 2323

    VALORp

    1667 VALOR 3 1375

    MEDlANO (M-wj

    MEDlANO (W-W) 0.5000

    DEV. EST.

    2710 DEV. EST. 1394

    MEMO

    2005 MEMO 1166

    *CV

    99 *CV 04

    VALOR p (PR.UEBA 1|

    VALOR p (PRuEBA T| 0.2650

    n^5 n-21

    FIG. 15D

    CQRit^

    50 tig MPL tOO ng AN1792

    25 tig QS21 100 tig AMI 792

    646-023

    2002 627-045 91

    647-024

    147 628 046 3397

    648-025

    1304 G31 -040 3702

    645-026

    34 632-05D 1776

    .. G6O-027

    960 667-052 1832

    724-026

    1202 660-053 3023

    726-010

    1906 686-054 139

    727-031

    733 G07-Q55 091

    720-032

    2563 Geg.056 240

    721-033

    5563 609.057 110

    802-034

    113 712-059 3311

    803-035

    671 525-081 1009

    804-036

    51 826-082 1R165

    611-037

    613 827-063 73

    812-038

    332 823-064 70

    813-039

    1454 037-065 1001

    814-040

    2441 038-066 270

    B33-014

    742 030-067 371

    634-042

    40

    036-044

    807

    VA..OR 0

    774 VALOR 0 950

    MEDIANti (V-W.i

    0. 1710 VEDIANO (V-W) 0.4076

    DEV. EST.

    1192 DEV. ESI. 2199

    MEMO

    1299 MEMO 4157

    %CV

    109 %CV 190

    VALOR p (PRuEBA11

    0.1506 VALOR p(PRUEaAt) 0,8131

    n=21 ______________________________ n-18

    FIG, 15E

    I '1uto "ledio £= ratofies uaLa^aa 'ion a"lJC_,erpo Ant AB po dpnal

    imagen16

    wpeui ii'±i&rr:i;uE- ^po|nqn

    Figura 16

    Semanss cto tralamlento

    imagen17

    a

    oipdLLi sodjBranuF ap-o|ni!j

    Figura 17

    3amonai 3e (ratamtinLa

    imagen18

    cipeiu TOliBmuuE- ap-o|nn!i

    Figura 18

    £«msriias So tr«ftnri«nla

    Ll0

    imagen19

    T

    cp

    O

    imagen20

    R
20. 0.7-t

    imagen21

    imagen22

    imagen23

    a

    at

    £