ES2656149T3 - ADN recombinante para la supresión génica - Google Patents

Abstract

Una construcción de ADN recombinante para la supresión de al menos un gen diana en células vegetales que comprende en un orden de 5' a 3' un elemento promotor activo en células vegetales, unido de forma operativo a un elemento de ADN orientado en antisentido a partir de al menos un gen diana y un elemento de ADN orientado n sentido que comprende de 50 a 5.000 nucleótidos, en el que el elemento de ADN orientado en sentido es más corto que el elemento de ADN orientado en antisentido y el ARN orientado en sentido transcrito por el ADN orientado en sentido es complementario de la mayoría del extremo 5' del ARN orientado en antisentido transcrito por el elemento de ADN orientado en antisentido, en el que dicho ARN transcrito forma un bucle de ARN orientado en antisentido para suprimir dicho al menos un gen diana y en el que dicho elemento de ADN orientado en antisentido comprende, en serie, segmentos de dos o más genes orientados para la supresión.

Description

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paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 and aacC4) o resistencia a herbicidas tales como glulfosinato (bar o pat) y glifosato (aroA o EPSPS). Ejemplos de tales marcadores seleccionables se ilustran en las patentes de los EE.UU. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.

Los marcadores reconocibles que proporcionan una capacidad de identificación visual de los transformados también pueden emplearse, por ejemplo, un gen que expresa una proteína colorada o fluorescente tal como una luciferasa o proteína fluorescente verde (GFP) o un gen que expresa una beta-glucuronidasa o gen uidA (GUS) para el cual se conocen diversos sustratos cromogénicos.

Las células que sobreviven a la exposición del agente selectivo o las células que se han puntuado de forma positiva en una prueba de detección, pueden cultivarse en medios de regeneración y dejarse madurar en plantas. Las plántulas que se están desarrollando pueden transferirse a una mezcla de crecimiento de plantas y fortalecerse, por ejemplo, en una cámara ambientalmente controlada a un 85 % de humedad relativa, 600 de ppm CO2, y 25-250 microeinsteins m-2s-1 de luz, antes de transferirlas a un invernadero o cámara de crecimiento para su maduración. Las plantas se regeneran de aproximadamente 6 semanas a 10 meses y se identifica un transformado, dependiendo del tejido inicial. Las plantas pueden polinizarse usando procedimientos de alimentación de plantas convencionales conocidos por los expertos en la técnica y las semillas producidas, por ejemplo, la auto.polinizacion se usa comúnmente en maíz transgénico. La planta transformada y regenerada o su semilla descendiente o plantas pueden evaluarse para la expresión de ADN recombinante y analizarse para la presencia de un rasgo agronómico potenciado.

Plantas y semillas transgénicas

Las semillas de plantas transgénicas que se desvelan en el presente documento se cultivan para generar plantas transgénicas que tengan un rasgo potenciado en comparación con una planta de control. Tal semilla para plantas con rasgo agronómico potenciado se identifica mediante la identificación de plantas transformadas o semilla descendiente para un rasgo potenciado. Para la eficacia se ha diseñado un programa de identificación para evaluar múltiples plantas transgénicas (casos) que comprende el ADN recombinante, por ejemplo, múltiples plantas de 2 a 20 o más casos transgénicos. Las plantas transgénicas cultivadas a partir de una semilla transgénica proporcionada en el presente documento demuestran rasgos agronómicos mejorados que contribuyen a un rendimiento aumentado u otro rasgo que proporciona un valor de la planta aumentado, que incluye, por ejemplo, una calidad de las semillas mejorada. Son de particular interés las plantas que tienen un rendimiento potenciado que resultan a partir de un crecimiento y desarrollo de la planta aumentado, tolerancia al estrés, desarrollo de la semilla mejorado, respuesta lumínica superior, desarrollo de la flor mejorado o metabolismo de carbono y/o nitrógeno mejorado.

Muchos casos transgénicos que sobreviven a plantas transgénicas fértiles que producen semillas y plantas descendientes no mostrarán un rasgo agronómico potenciado. La identificación es necesaria para identificar la planta transgénica que tiene rasgos agronómicos potenciados de poblaciones de plantas transformadas tal como se describe en el presente documento mediante evaluación del rasgo en una variedad de pruebas para detectar un rasgo agronómico potenciado. Estas pruebas también pueden tomar muchas formas, incluyendo análisis para detectar cambios en la composición química, biomasa, propiedades fisiológicas, morfología de la planta.

Los siguientes ejemplos ilustran aspecto de la memoria descriptiva.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la preparación de un vector de transformación útil para insertar una construcción de ADN recombinante de la presente invención en una planta transgénica para practicar un procedimiento de la presente invención. El gen LKR/SDH codifica una pre-proteína para la lisina-cetoglutarato reductasa (LKR) y sacaropina deshidrogenasa (SDH) que son enzimas en una trayectoria catabólica de lisinas. La supresión de la LKR se manifiesta en la modificación, por ejemplo, aumento, del contenido de lisina. La supresión de la LKR se efectúa expresando en una planta una construcción de ADN recombinante que produce un ARN antisentido estabilizado transcrito a partir de un ADN de LKR orientado en antisentido transcrito y un ADN de LKR orientado en sentido que forma un bucle de ARN orientado en antisentido.

Se prepara un vector de transformación que comprende dos unidades de transcripción entre los bordes derecho e izquierdo a partir de Agrobacterium tumefaciens. Una unidad de transcripción para un marcador comprendido en:

(a)

ADN de promotor de la actina del arroz e intrón de la actina del arroz,

(b)

ADN de un péptido de tránsito de cloroplasto de Arabidopsis EPSPS

(c)

ADN de A. tumefaciens aroA (un marcador resistente al glifosato) y

(d)

ADN de terminado NOS de A. tumefaciens,

La otra unidad de transcripción para la supresión de gen de LKR comprendido en:

(a)

ADN de promotor de Zea mays GLB1,

(b)

ADN de intrón de Zea mays ADH1,

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(c)

Fragmento de ADN orientado en antisentido de Zea mays LKR,

(d)

Fragmento de ADN orientado en sentido de Zea mays LKR y

(e)

ADN de terminador de Zea mays GLB1.

SEQ ID NO: 1 es secuencia de ADN de un vector de transformación que comprende el marcador anteriormente descrito y elementos de supresión génica. Véase tabla 1 a continuación para una descripción de los elementos del vector de transformación contenido dentro de la SEQ ID NO:1.

Tabla 1.

Bases de la SEQ ID NO:1

Descripción del segmento de ADN

1-357

Borde derecho de A. tumefaciens

376-1774

ADN de promotor de la actina del arroz y intrón de la actina del arroz

1784-2011

ADN de péptido de tránsito de cloroplasto EPSPS de A. tumefaciens

2012-3379

ADN de A. tumefaciens aroA (marcador resistente al glifosato)

3395-3647

ADN de terminador de NOS de A. tumefaciens

3691-4686

ADN de terminador de Zea mays Glb1

4692-5145

Elemento de ADN orientado en sentido de Zea mays LKR

5152-6118

Elemento de ADN orientado en antisentido de Zea mays LKR

6123-6680

ADN de intrón de Zea mays ADH1

6687-8082

ADN de promotor de Zea mays GLB1

8149-8590

Borde izquierdo de A. tumefaciens

Se usó un vector preparado con los elementos que se indican en la Tabla 1 para transformar tejido de planta de maíz. Se obtuvieron plantas de maíz transgénicas mediante transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas transgénicas de dos casos de inserción transgénica separados se cultivaron para producir semilla F1. Seis semillas maduras de cada caso se analizaron para determinar el éxito de transformación y supresión de LKR. Las semillas transgénicas maduras se diseccionaron para extraer proteína la cual se analizó mediante análisis Western. Con referencia a la Figura 2, la semilla de uno de los casos no mostró ninguna reducción en LKR en comparación con el tipo salvaje; y la semilla del otro caso mostró estar segregando (1:1 hemicigoto:tipo salvaje) como tres de las seis semillas mostraron una reducción sustancial en LKR en comparación con el tipo salvaje.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra un amplio ámbito de vectores de transformación útiles para la inserción de una construcción de ADN recombinante de la presente invención en una planta transgénica para practicar un procedimiento de la presente invención. Se prepararon los vectores de transformación usando los siguientes elementos de ADN en los que:

(a)

"pGcx" se refiere ADN de un promotor derivado de un gen de coixina gamma de Coix lacryma-jobi;

(b)

"pZ27" se refiere a ADN de un promotor derivado de un gen de zeína gamma deZea mays;

(c)

"pZ27t" se refiere a ADN de un promotor truncado que tiene una secuencia líder de 59 nucleótidos delecionada de la región 3' de pZ27;

(d)

"Z19as" se refiere a ADN de un segmento orientado en antisentido de 351 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 19 kilo dáltons de Zea mays;

(e)

"Z19s" se refiere a ADN de un segmento orientado en sentido de 351 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 19 kilo dáltons de Zea mays, que es una repetición invertida de Z19as;

(f)

"Z22as" se refiere a ADN de un segmento orientado en antisentido de 789 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 22 kilo dáltons de Zea mays;

(g)

"Z22asL" se refiere a ADN de un segmento orientado en antisentido de 785 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 22 kilo dáltons de Zea mays;

(h)

"Z22asSI" se refiere a ADN de un segmento orientado en antisentido de 789 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 22 kilo dáltons de Zea mays que tiene un intrón divisible largo de 520 nucleótidos de un intrón 3 de gen GB1 de Zea mays insertado en la región sin emparejar;

(i)

"Z22s" se refiere a ADN de un segmento orientado en sentido de 289 nucleótidos de la secuencia de codificación de un gen de zeína alfa de 22 kilo dáltos de Zea mays, que es una repetición invertido de la mayoría del extremo 5' de Z22as; yy

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(j) "TE9" se refiere a ADN de una señal de poliadenilación orientada en sentido y elemento de sitio de un gen RbcS2 de Pisum sativum.

Con referencia a la Tabla 2 y la SEQ ID NO:2 se fabricó un vector de transformación que comprendía la "construcción 2a" del modo del Ejemplo 1 excepto que la unidad de transcripción de la supresión génica de LKR se reemplazó por una unidad de transcripción que comprendía los elementos ilustrados en el siguiente esquema:

"Construcción 2a" pZ27 -Z19as -Z22asL -Z22s -Z19s -TE9

Tabla 2

Bases de la SEQ ID NO:2

descripción del segmento de ADN

1-357

Borde derecho de A. tumefaciens

376-1774

ADN de promotor de la actina del arroz y intrón de la actina del arroz

1784-2011

ADN de péptido de tránsito de cloroplasto EPSPS de A. tumefaciens

2012-3379

ADN de A. tumefaciens aroA (marcador resistente al glifosato)

3395-3647

ADN de terminador de NOS de A. tumefaciens

3479-4391

ADN de terminador de Pisum sativum RbcS2

4398-4748

ADN de Z19s

4755-5043

ADN de Z22s

5050-5835

ADN de Z22asL

5842-6192

ADN de Z19as

6204-7305

ADN de promotor de Zea mays Z27

7353-7794

Borde izquierdo de A. tumefaciens

Se transformó callo de maíz y se seleccionaron los casos con una única copia del vector de transformación para cultivarlos en plantas. Las semillas de plantas cultivadas a partir de los casos de copia única de 26 y de 29 10 mostraron una reducción sustancial de las zeínas alfa de 19 kilo dáltons y las zeínas alfa de 22 kilo dáltons.

Se fabricaron otros vectores de transformación de un modo similar usando los elementos que se ilustran en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3

Construcción 2b1

pGcx -Z19as -Z22asSI -Z22s -Z19s -TE9

Construcción 2b2*

pGcx -Z19as -Z22asSI -Z22s -Z19s -TE9

Construcción 2c

pZ27 -Z19as -Z22asSI -Z22s -Z19s -TE9

Construcción 2d

PZ27t -Z19as -Z22asSI -Z22s -Z19s -TE9

Construcción 2e

PZ27 -Z19as -Z22asL -Z 19s -TE9

* la construcción 2b2 se insertó en una vector de transformación que también incluía una unidad de transcripción para expresar otro gen que tenía un promotor contiguo a pGcx.

La eficacia de supresión de las zeínas alfa en semillas por plantas cultivadas a partir de casos de copia única se

15 registra en la Tabla 4 la cual informa del número de casos transgénicos con reducción de zeínas en comparación con el número total de casos transgénicos generados en casa construcción analizada. El fenotipo de reducción de zeínas se observa mediante análisis MALDITOF MS (Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción /ionización láser asistida por matriz). La Figura 3 ilustra el espectro típico que evidencia la reducción de zeínas.

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Claims (1)

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