ES2807448T3 - Método para la producción de L-serina usando microorganismos modificados por ingeniería genética deficientes para las vías de degradación de la serina - Google Patents

Método para la producción de L-serina usando microorganismos modificados por ingeniería genética deficientes para las vías de degradación de la serina Download PDF

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Abstract

Una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae que se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la producción de L-serina usando microorganismos modificados por ingeniería genética deficientes para las vías de degradación de la serina
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere, en general, a la industria microbiológica y específicamente, a la producción de L-serina usando bacterias modificadas genéticamente. La presente invención proporciona una bacteria genéticamente modificada que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, en donde los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA se han inactivado, lo que hace que sea particularmente adecuada para la producción de L-serina con mayor rendimiento. La presente invención también proporciona medios mediante los que puede hacerse tolerante a la bacteria a mayores concentraciones de serina. La presente invención también proporciona métodos para la producción de L-serina o derivados de L-serina usando dicha bacteria genéticamente modificada.
Antecedentes de la invención
La L-serina es un aminoácido que en la actualidad se usa en la industria cosmética, farmacéutica y médica. La producción anual estimada de L-serina es de entre 300-1000 toneladas (Leuchtenberger et al., 2005). El compuesto también se ha identificado como uno de los 30 agentes bioquímicos más importantes debido a su uso potencial como agente bioquímico de bloque de construcción. En la actualidad, la producción se basa en la conversión de glicina y metanol usando células en reposo (Hagishita et al., 1996), donde los metiltrofos convierten el metanol en formaldehído y transfieren la unidad de CH2-OH de la molécula a la glicina usando seria hidroximetiltransferasa (glyA). Este proceso de fermentación lento y la glicina es un material de partida costoso. Por tanto, es atractivo el desarrollo de un método para producir serina con un bajo coste a partir de glucosa.
La serina tiene el potencial de producirse a partir de glucosa mediante fermentación con un rendimiento teórico muy elevado (Burgard y Maranas, 2001). Sin embargo, hay que abordar varias complicaciones para aumentar el rendimiento, siendo la más importante la degradación de la serina en el organismo de producción. La serina tiene dos vías de degradación principales en E. coli. El catabolismo de serina a piruvato en E. coli está catalizado por tres desaminasas denominadas sdaA, sdaB y tdcG, mientras que C. glutamicum solo tiene una desaminasa (sdaA) con actividad frente a serina. En ambos organismos, la conversión de serina a glicina está codificada por glyA. Se ha probado la producción de serina mediante la supresión génica de las desaminasas en E. coli (Li et al., 2012) y C. glutamicum (Peters-Wendisch et al., 2005). En E. coli se observó la acumulación transitoria de 3,8 mg/l a partir de 1 g/l de glucosa cuando se sobreexpresó solo uno del gen de la vía (serA). La eliminación de la desaminasa en C. glutamicum da lugar a un aumento marginal y transitorio en el título de serina. En estudios recientes, se modificó E. coli por ingeniería genética para potenciar el flujo de 3-fosfoglicerato alterando el ciclo de TCA y el ciclo del glioxilato (Gu et al., 2014). Se informó de que la cepa resultante, donde solo se retiró una desaminasa (sdaA), produce 8,45 g/l de serina a partir de 75 g/l de glucosa (rendimiento del 11,2 %).
La regulación negativa de glyA (Peters-Wendisch et al., 2005) en C. glutamicum dio como resultado la producción de 9 g/l de serina a partir de 40 g/l de glucosa, pero da lugar a una cepa inestable. glyA es una importante enzima que convierte la serina en glicina y esta etapa transfiere una unidad de carbono al tetrahidrofolato (THF), que se usa como cofactor. La eliminación de la vía del ácido fólico y la suplementación de ácido fólico da lugar a una C. glutamicum estable y una producción de 36 g/l de serina, aunque con un rendimiento relativamente bajo (Stolz et al., 2007).
No se ha logrado con anterioridad la eliminación de las dos vías principales de degradación de la serina (de serina a piruvato y de serina a glicina). Además, se sabe que la serina se vuelve tóxica incluso a bajas concentraciones en cepas que carecen de la vía de degradación de piruvato (Zhang y Newman, 2008). Se espera que la serina pueda inhibir la producción de aminoácidos ramificados en E. coli (Hama et al., 1990) y la conversión de serina a hidroxipiruvato y acrilatos, que es tóxico para la célula (de Lorenzo, 2014). Para la producción eficiente de L-serina o un derivado de la misma, es por tanto deseable tanto suprimir las vías de degradación de la serina como abordar los problemas asociados con la toxicidad de la serina.
Sumario de la invención
El objetivo de la presente invención es proporcionar medios que permiten una producción de L-serina más eficiente. Más particularmente, un objetivo de la presente invención es proporcionar medios que permiten la producción de L-serina con un mayor rendimiento nominal y un rendimiento en masa mejorado.
Esto se logra gracias al descubrimiento de que la producción de L-serina puede mejorarse mediante la inactivación de los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.
Por tanto, la presente invención proporciona en un primer aspecto una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, especialmente una bacteria que tiene la capacidad de producir L-serina, en donde dicha bacteria se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.
La presente invención proporciona, en un segundo aspecto, un método para producir L-serina que comprende: cultivar la bacteria como se ha descrito anteriormente en un medio.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Eliminación de los principales genes implicados en la degradación de la serina, sdaA, sdaB, tdcG y glyA en E. coli. Se demostró la eliminación de los cuatro genes usando PCR con cebadores específicos para los genes relevantes.
Figura 2: Mapas de vectores para las construcciones (ejemplo 2).
Figura 3: Producción de serina durante la fermentación discontinua en matraces de agitación.
Figura 4: Puede lograrse tolerancia aumentada a la serina mediante la sobreexpresión de ydeD, un potencial transportador de serina. La figura muestra el crecimiento de las células en presencia de diversas concentraciones de serina.
Figura 5: Puede lograrse tolerancia aumentada a la serina mediante mutagénesis aleatoria. Se muestran las velocidades de crecimiento de la cepa precursora (Q1) y las cepas evolucionadas a diferentes concentraciones de serina.
Figura 6: Experimento de evolución adaptativa en laboratorio (ALE) para mejorar la tolerancia a la serina. (A) Velocidades de crecimiento durante el experimento de evolución. (B) Crecimiento mejorado de células evolucionadas en presencia de altas concentraciones de serina.
Figura 7: El efecto de las mutaciones en thrA en la tolerancia a la serina. Se introdujeron tres mutaciones específicas de thrA (Y356C, S357R, S359R) en el origen de Q1 y se comparó el crecimiento de los clones con el crecimiento de la cepa Q1 en presencia de 6,25 g/l de serina.
Figura 8: Identificación de mutaciones que causan tolerancia aumentada a la serina. Se usó análisis de secuenciación de amplicones para analizar el efecto de las mutaciones ALE después de la introducción en la cepa Q1 (DE3) mediante MAGE.
Figura 9: (A) Producción de serina y densidad celular (DO 600 nm) medidas en diferentes puntos de tiempo durante la fermentación discontinua alimentada de las cepas Q1(DE3) y Q3(DE3). (B) Producción de serina a partir de la glucosa añadida al fermentador. La pendiente de la curva indica el rendimiento en masa durante la fermentación.
Figura 10: (A) Densidad celular y título de serina de la cepa ALE 8-8 (DE3). (B) Rendimiento en masa a partir de glucosa.
Figura 11: Velocidad de crecimiento de cepas mutantes de E. coli que tienen diferentes sustituciones de aminoácidos observadas en las posiciones 356 (11A), 357 (11B) y 359 (11C) de ThrA, respectivamente (la sustitución de aminoácidos se indica por el respectivo código de una letra). La velocidad de crecimiento de E. coli que porta el gen thrA de tipo silvestre se indica como "ts".
A continuación, se describe la presente invención con más detalle.
Descripción detallada de la invención
Salvo que se definan específicamente en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en los campos de bioquímica, genética y microbiología.
Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en este documento. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique de otro modo.
La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología y ADN recombinante, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE. UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de los Estados Unidos n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, redactores jefe, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, los vol.154 y 155 (Wu et al. eds.) y el vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Bacteria de la invención
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se basa, entre otras cosas, en el descubrimiento de que la producción de L-serina puede mejorarse mediante la inactivación de los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, especialmente una bacteria que tiene la capacidad de producir L-serina, en donde dicha bacteria se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.
Los genes sdaA, sdaB y tdcG codifican la L-serina desaminasa I (SdaA), la L-serina desaminasa II (SdaB) y la L-serina desaminasa III (TdcG), respectivamente, que son las tres enzimas que llevan la etapa única en la vía de la degradación de la L-serina, que convierte la serina en el bloque de construcción celular básico, piruvato. Se encuentra disponible información adicional acerca de sdaA, sdaB y tdcG de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con los números de referencia EG10930, EG11623 y G7624, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos representativas de sdaA, sdaB y tdcG se exponen en las SEQ ID NO: 1 a 3, respectivamente.
El gen glyA codifica serina hidroximetiltransferasa (GlyA) que convierte la serina en glicina, transfiriendo un grupo metilo al tetrahidrofolato, formando de este modo 5,10-metilen-tetrahidrofolato (5,10-mTHF). El 5,10-mTHF es la principal fuente de unidades C1 en la célula, lo que hace que GlyA sea una enzima clave en la biosíntesis de purinas, timidina, metionina, colina y lípidos. Se encuentra disponible información adicional acerca de glyA de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10408. Se expone una secuencia de nucleótidos representativa de glyA en la SEQ ID NO: 4.
El reemplazo génico mediado por lambda-red (Datsenko y Wanner, 2000) es un método particularmente adecuado para inactivar uno o más genes como se describe en el presente documento. Por tanto, de acuerdo con realizaciones particulares, los genes se inactivan usando reemplazo génico mediado por lambda-red.
Como se muestra en la figura 3, la inactivación de los cuatro genes (sdaA, sdaB, tdcG y glyA) implicados en la degradación de la serina da como resultado la máxima productividad específica y el máximo rendimiento a partir de la glucosa para la inactivación únicamente de los tres genes implicados en la degradación de la L-serina a través de la vía de serina a piruvato (sdaA, sdaB y tdcG).
La serina se produce a partir de gliceraldehído-3-fosfato usando tres enzimas codificadas por los genes serA (que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa), serB (que codifica una fosfoserina fosfatasa) y serC (que codifica una fosfoserina aminotransferasa). A fin de aumentar la producción de L-serina, estos genes pueden sobreexpresarse. Se encuentra disponible información relevante acerca de serA, serB y serC de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con los números de referencia EG10944, EG10945 y EG10946, respectivamente.
Por tanto, de acuerdo con determinadas realizaciones, la bacteria se ha modificado para sobreexpresar una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, una fosfoserina fosfatasa y una fosfoserina aminotransferasa. Más particularmente, la bacteria se ha modificado adicionalmente para sobreexpresar los genes serA, serB y serC. Esto puede lograrse introduciendo en la bacteria una o más (tal como dos o tres) moléculas de ácido nucleico exógenas, tal como uno o más vectores, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoserina fosfatasa y/o una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoserina aminotransferasa.
La 3-fosfoglicerato deshidrogenasa puede proceder de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa o puede proceder de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga). De acuerdo con ciertas realizaciones, la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa procede de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa procede de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga).
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Además, preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
Además, es beneficioso sobreexpresar un gen serA mutante que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa que es resistente frente a la inhibición por retroalimentación de la serina. Esto puede, por ejemplo, lograrse mediante la eliminación de los cuatro restos C-terminales de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa de tipo silvestre (SerA). Como alternativa, la inhibición por retroalimentación de SerA puede eliminarse mutando los tres restos H344, N346 y N364 a alanina. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de dicho mutante de 3-fosfoglicerato deshidrogenasa en la SEQ ID NO: 6. Por tanto, de acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa que es resistente a la degradación por retroalimentación de la serina. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad 3fosfoglicerato deshidrogenasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad 3-fosfoglicerato deshidrogenasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
La fosfoserina fosfatasa puede proceder de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa o puede proceder de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga). De acuerdo con ciertas realizaciones, la fosfoserina fosfatasa procede de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, la fosfoserina fosfatasa procede de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga).
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoserina fosfatasa. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina fosfatasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina fosfatasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina fosfatasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina fosfatasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina fosfatasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina fosfatasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina fosfatasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina fosfatasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
La fosfoserina aminotransferasa puede proceder de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa o puede proceder de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga). De acuerdo con ciertas realizaciones, la fosfoserina aminotransferasa procede de la misma especie que la bacteria en la que se sobreexpresa.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, la fosfoserina aminotransferasa procede de una especie diferente a aquella en la que se sobreexpresa (es decir, es heteróloga).
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoserina aminotransferasa. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina aminotransferasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina aminotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina aminotransferasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina aminotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina aminotransferasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina aminotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad fosfoserina aminotransferasa. Más preferentemente, el polipéptido tiene una actividad fosfoserina aminotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.
Una bacteria, tal como Escherichia coli, que se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA, puede mostrar baja tolerancia a la serina. Por tanto, sería deseable proporcionar una bacteria que muestre tolerancia aumentada frente a la serina.
A este respecto, los presentes inventores han descubierto que puede reducirse la toxicidad del producto mediante la sobreexpresión de nuevos exportadores, mediante evolución de cepas bacterianas mediante mutagénesis aleatoria y mediante evolución adaptativa. Como resultado, se proporcionan bacterias que tienen tolerancia aumentada a la serina. "Tolerancia aumentada", como se usa en el presente documento, significa que una bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6,25 g/l.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6.25 g/l (tal como al menos aproximadamente 12,5 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 12,5 g/l (tal como al menos aproximadamente 25 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 25 g/l (tal como al menos aproximadamente 40 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 40 g/l (tal como al menos aproximadamente 50 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 50 g/l (tal como al menos aproximadamente 75 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 75 g/l (tal como al menos aproximadamente 100 g/l). De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 100 g/l.
Preferentemente, el medio de cultivo mínimo, tal como medio mínimo M9, se suplementa con glicina 2 mM y 2 g/l de glucosa. La bacteria se cultiva generalmente usando aireación adecuada a aproximadamente 37 °C durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 40 horas.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6.25 g/l (tal como al menos aproximadamente 12,5 g/l) a una velocidad de crecimiento de al menos 0,1 Ir1 durante el crecimiento exponencial. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 12,5 g/l (tal como al menos aproximadamente 25 g/l) a una velocidad de crecimiento de al menos 0,1 h'1 durante el crecimiento exponencial. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo (tal como medio mínimo M9) que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 25 g/l (tal como al menos aproximadamente 50 g/l) a una velocidad de crecimiento de al menos 0,1 i r 1 durante el crecimiento exponencial.
Preferentemente, el medio de cultivo mínimo, tal como medio mínimo M9, se suplementa con glicina 2 mM y 2 g/l de glucosa. La bacteria se cultiva generalmente usando aireación adecuada a aproximadamente 37 °C durante un periodo de aproximadamente 24 a aproximadamente 40 horas.
Un nuevo exportador que cuando se sobreexpresa en una bacteria mejoró la tolerancia a la serina es la proteína exportadora de O-acetilserina/cisteína codificada por el gen ydeD. Se encuentra disponible información adicional acerca de ydeD de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG11639. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de dicha proteína exportadora en la SEQ ID NO: 9. Por tanto, la presente invención proporciona una bacteria que se ha modificado para sobreexpresar el gen ydeD.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el producto de proteína del gen ydeD. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9.
Se expone un polipéptido de YdeD modificado que contiene un tramo adicional de 6 restos de histidina en el extremo C-terminal en la SEQ ID NO: 10. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. La molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína. Más preferentemente, el polipéptido tiene actividad transportadora de O-acetilserina y/o cisteína similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10.
Como se muestra en la figura 4, el crecimiento de una bacteria, tal como E. coli, que carece de las principales vías de degradación de la serina es un crecimiento gravemente inhibido en presencia de concentraciones incluso bajas de serina. Tras la sobreexpresión de ydeD, aumenta sustancialmente la tolerancia frente a la serina, lo que sugiere que YdeD puede potencialmente transportar la serina fuera de la célula.
Una bacteria de la invención que tiene tolerancia aumentada frente a la serina, tal como una capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6,25 g/l como se ha mencionado anteriormente, puede obtenerse mediante mutagénesis aleatoria o mediante evolución adaptativa. Los detalles pertinentes se proporcionan en los ejemplos 4 y 5, respectivamente.
La evolución adaptativa puede, por ejemplo, lograrse llevando a cabo el siguiente método: Antes de iniciar el experimento, se rellenan tubos adecuados con 25 ml de medio de cultivo que se mantienen a 37 °C en un bloque de calentamiento. Se obtiene aireación controlada usando agitadores por volteo magnéticos dentro de los tubos y centrifugando a 1.800 rpm. Al comienzo del experimento, se cultiva una sola colonia (de la cepa inicial) durante una noche en uno de los tubos y se usan alícuotas de 100 pl para inocular un nuevo tubo que contiene 25 ml de medio de cultivo fresco. A medida que crecen las bacterias, se efectúan múltiples mediciones de la DO a 600 nm. Las velocidades de crecimiento se calculan tomando la pendiente de un ajuste lineal de regresión lineal de mínimos cuadrados al logaritmo de las mediciones de la DO. Una vez que se alcanza una DO diana de 0,4, se usan 100 pl de cultivo para inocular un nuevo tubo que contiene 25 ml de medio de cultivo. De esta forma, los cultivos se pasan en serie (2-3 veces al día) a tubos con medio fresco después de alcanzar la densidad celular diana, de tal forma que nunca se alcanza la fase estacionaria. El experimento se inicia con una concentración de L-serina de 3 g/l de serina, seguido de un aumento a 6 g/l de L-serina después de que se haya alcanzado la velocidad de crecimiento deseada. Una vez que las poblaciones lograron un fenotipo estable (es decir, velocidad de crecimiento), se aumenta la concentración de L-serina hasta 12 g/l. Este proceso se repite de manera iterativa usando 24, 50, 75 y 100 g/l de L-serina. Después, puede emplacarse la población final en el LB-agar para el cultivo y la selección adicional de una cepa tolerante a L-serina. El método anterior puede efectuarse manualmente o usando un sistema automatizado que permite la propagación de las poblaciones en evolución a lo largo de varios días mientras se monitorizan sus velocidades de crecimiento.
Como se demuestra adicionalmente en el presente documento, los presentes inventores han identificado mutaciones beneficiosas en una serie de genes que confieren tolerancia frente a la L-serina. Los genes respectivos y las mutaciones se representan en la tabla S5.
Un gen de este tipo es thrA, que codifica una aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa (ThrA). Se encuentra disponible información adicional acerca de thrA de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10998. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de una aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa I de tipo silvestre (ThrA) en la SEQ ID NO: 11. Como se demuestra en el ejemplo 6 y 10, la introducción de ciertas mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa da como resultado un aumento muy significativo en la tolerancia frente a la serina (figuras 7 y 11). En particular, se ha demostrado que las siguientes mutaciones son beneficiosas: Y356C, S357R y S359R.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que expresa un mutante de aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa I (ThrA) que no se inhibe por L-serina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en Y356, S357 y S359. Una bacteria de la invención puede expresar, por tanto, una aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa I (ThrA) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en Y356, S357 y S359. Más particularmente, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en Y356, S357 y S359. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356. De acuerdo con realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L. De acuerdo con otras realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L. De acuerdo con realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356W, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356W, Y356F, Y356I, Y356P, Y356R y Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356C en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356C. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356T en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356T. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356V en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356V. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356S en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356S. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356W en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356W. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356G en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356G. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356N en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356N. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356D en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356D. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356E en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356E. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356F en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356F. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356A en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356I. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356A en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356I. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356P en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356P. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356H en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356H. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356R en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356R. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356L en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357. De acuerdo con realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M. De acuerdo con otras realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F y S357H. De acuerdo con realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357A, S357N y S357F. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S357A y S357F.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357R en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357R. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357V en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357V. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357P en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357P. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357G en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357G. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357L en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357l . De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357Y en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357Y. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357A en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357A. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357N en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357N. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357F en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357F. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357H en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357H. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357K en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357k . De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357I en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357i. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357M en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357m .
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S359. De acuerdo con realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L. De acuerdo con otras realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L. De acuerdo con realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359E y S359L. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359T, S359P, S359Q, S359A, S359E y S359L. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359T, S359Q, S359A y S359E. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359T y S359A. De acuerdo con otras realizaciones más particulares, la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo que consiste en S359R y S359A.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359R en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359R. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359G en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359G. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359M en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359M. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359F en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359F. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359T en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359T. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359P en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359P. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359V en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359V. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359Q en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359Q. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359A en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359A. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359C en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359C. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359K en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359K. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359E en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359e . De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359L en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359l .
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356, una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357 y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357m ; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356 y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I yS357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356 y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357 y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356, una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357 y una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356 y una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I yS357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356 y una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F y Y356A; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357 y una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y/o Y357, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y/o S359, en donde la sustitución en la posición y 356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356v , Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición s 357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357p , S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, s 359F, S359t , S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S359, en donde la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y Y357, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F y Y356A; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357 y S359, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, s 359F, S359t , S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por cisteína. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por treonina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por valina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por serina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por triptófano. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por glutamina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por glicina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por asparagina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por ácido aspártico. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por ácido glutámico. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por fenilalanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por alanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por isoleucina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por prolina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por histidina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por arginina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por leucina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por valina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por prolina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por glicina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por leucina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por tirosina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por alanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por asparagina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por fenilalanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por histidina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por lisina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por isoleucina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por metionina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por arginina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por glicina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por metionina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por fenilalanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por treonina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por prolina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por valina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por glutamina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por alanina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por cisteína. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por lisina. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por ácido glutámico. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por leucina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, s 359F, S359t , S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y/o S357, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S359, en donde la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 93 %, tal como al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 93 %, tal como al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 93 %, tal como al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S359, en donde la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357, en donde la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S359, en donde la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y S357, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356 y S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición S357 y S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359t , S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L; y en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido adicionales están sustituidos, eliminados y/o insertados.
La bacteria puede expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L; y en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido adicionales están sustituidos, eliminados y/o insertados.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una o más (tal como dos o tres) sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C y S357R. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C y S357R. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C y S359R. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C y S359R. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en S357R y S359R. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una o más (tal como dos) sustituciones de aminoácidos en el polipéptido codificado seleccionadas entre el grupo que consiste en S357R y S359R.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución Y356C en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución Y356C. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S357R en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S357R. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución S359R en el polipéptido codificado. Por lo tanto, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una sustitución S359r .
Una bacteria de la invención puede expresar, por tanto, una aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa I (ThrA) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R. Más particularmente, una bacteria de la invención puede expresar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por cisteína. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por arginina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por cisteína.
De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 356, la tirosina se reemplaza por cisteína.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por arginina. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en la posición 359, la serina se reemplaza por arginina.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R, en donde 1 o más, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40, de aproximadamente 1 a aproximadamente 35, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido adicionales están sustituidos, eliminados y/o insertados. La bacteria puede expresar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una o más sustituciones seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R, en donde de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido adicionales están sustituidos, eliminados y/o insertados.
Los uno o más mutantes del polipéptido ThrA descritos anteriormente pueden (sobre)expresarse por la bacteria por medio de una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un vector de expresión, que se ha introducido en la bacteria. Por tanto, de acuerdo con determinadas realizaciones, la bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de aspartato cinasa I/homoserina deshidrogenasa I (ThrA) mutante como se ha descrito anteriormente.
Por ejemplo, una bacteria de la invención puede comprender una molécula de ácido nucleico exógena, tal como un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria de la invención comprende por tanto una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99%, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99%, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
A este respecto, la presente invención proporciona además una molécula de ácido nucleico (aislada), tal como un vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un mutante de ThrA como se ha descrito anteriormente. Dicho ácido nucleico puede introducirse en la bacteria de la invención. De acuerdo con ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, tal como al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, s 359F, S359t , S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359. De acuerdo con ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 que comprende una sustitución de aminoácidos en la posición Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
La molécula de ácido nucleico (aislada) puede ser el ácido nucleico exógeno detallado anteriormente. La molécula de ácido nucleico (aislada) puede comprender elementos reguladores adecuados, tales como un promotor que es funcional en la célula bacteriana para provocar la producción de una molécula de ARNm y que está ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido. Se proporcionan detalles adicionales acerca de elementos reguladores adecuados con respecto a una molécula de ácido nucleico "exógena" y se aplican cambiando lo que sea necesario.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen Irp una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de Irp de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10547. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen Irp, en donde en dicho polipéptido en la posición 143, D se reemplaza por G. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen Irp en la SEQ ID NO: 12. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ iD NO: 12, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 143, D se reemplaza por G.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen Irp una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen Irp una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición D143. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 143, D se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen rho una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional relativa a rho de, por ejemplo, Escherichia coli, tal como una secuencia de nucleótidos del gen o una secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10845. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen rho, en donde en dicho polipéptido en la posición 87, R se reemplaza por L. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen rho en la SEQ ID NO: 13. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 87, R se reemplaza por L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen rho una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen rho una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición R87. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 87, R se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen eno una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de eno de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10258. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen eno, en donde en dicho polipéptido en la posición 164 V se reemplaza por L. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen eno en la SEQ ID NO: 14. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención puede expresar por tanto un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 164 V se reemplaza por L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen eno una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen eno una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición V164. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 164 V se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen argP una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de argP de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10490. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen argP, en donde en dicho polipéptido en la posición 132, Q se reemplaza por K. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen argP en la SEQ ID NO: 15. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 132, Q se reemplaza por K.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen argP una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen argP una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Q132. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 132, Q se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen tufA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos G19V en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de thrA de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG11036. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen tufA, en donde en dicho polipéptido en la posición 19, G se reemplaza por V. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen tufA en la SEQ ID NO: 16. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 19, G se reemplaza por V.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen tufA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen tufA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición G19. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 19, G se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen cycA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos I220V en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de cycA de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG12504. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen cycA, en donde en dicho polipéptido en la posición 220, I se reemplaza por V. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen cycA en la SEQ ID NO: 17. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 220, I se reemplaza por V.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen cycA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen cycA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición 1220. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 220, I se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen rpe una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos I202T en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de rpe de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia M004. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen rpe, en donde en dicho polipéptido en la posición 202, I se reemplaza por T. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen rpe en la SEQ ID NO: 18. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 202, I se reemplaza por T.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen rpe una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen rpe una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición 2021. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 202, I se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen yojI una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D334H en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de yojI de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG12070. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen yojI, en donde en dicho polipéptido en la posición 334, D se reemplaza por H. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen yojI en la SEQ ID NO: 19. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 334, D se reemplaza por H.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen yojI una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen yojI una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición D334. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 334, D se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen hyaF una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V120G en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de hyaF de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10473. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen hyaF, en donde en dicho polipéptido en la posición 120 V se reemplaza por G. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen hyaF en la SEQ ID NO: 20. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 120 V se reemplaza por G.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen hyaF una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen hyaF una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición V120. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 20, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 120 V se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen pykF una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos E250* en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada. Como alternativa, el gen pykF puede comprender una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la terminación del polipéptido codificado en una posición cadena arriba de la posición 250. Se encuentra disponible información adicional acerca de pykF de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10804. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen pykF, en donde dicho polipéptido termina después de la posición 249 o cualquier posición cadena arriba de la misma. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen pykF en la SEQ ID NO: 21. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 22.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen pykF (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen maIT una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Q420* en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada. Como alternativa, el gen maIT puede comprender una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la terminación del polipéptido codificado en una posición cadena arriba de la posición 420. Se encuentra disponible información adicional acerca de maIT de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10562. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen maIT, en donde dicho polipéptido termina después de la posición 419 o cualquier posición cadena arriba de la misma. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen maIT en la SEQ ID NO: 23. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 24.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen maIT (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen rpoB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos P520L en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de rpoB de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10894. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen rpoB, en donde en dicho polipéptido en la posición 520, P se reemplaza por L. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen rpoB en la SEQ ID NO: 25. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 520, P se reemplaza por L.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen rpoB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen rpoB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición P520. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 25, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 520, P se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen fumB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos T218P en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de fumB de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10357. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen fumB, en donde en dicho polipéptido en la posición 218, T se reemplaza por P. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen fumB en la SEQ ID NO: 26. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 218, T se reemplaza por P.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen fumB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen fumB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición T218. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 26, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 218, T se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen gshA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos A178V en el polipéptido codificado. Se encuentra disponible información adicional acerca de gshA de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10418. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen gshA, en donde en dicho polipéptido en la posición 178 A se reemplaza por V. Se proporciona una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen gshA en la SEQ ID NO: 27. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición en la posición 178 A se reemplaza por V.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una bacteria que comprende en el gen gshA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la tolerancia frente a la L-serina. Más particularmente, se proporciona una bacteria que comprende en el gen gshA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición A178. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 178 A se reemplaza por otro aminoácido. Preferentemente, las una o más sustituciones de aminoácidos son sustituciones no conservativas.
La presente invención también proporciona una bacteria que comprende en el gen lamB una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Q112 * en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada. Como alternativa, el gen lamB puede comprender una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado la terminación del polipéptido codificado en una posición cadena arriba de la posición 112. Se encuentra disponible información adicional relativa a lamB de, por ejemplo, Escherichia coli, tal como una secuencia de nucleótidos del gen o una secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG10528. De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen lamB, en donde dicho polipéptido termina después de la posición 111 o cualquier posición cadena arriba de la misma. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de un polipéptido codificado por el gen lamB en la SEQ ID NO: 28. De acuerdo con realizaciones particulares, una bacteria de la invención expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen lamB (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
Una bacteria de la presente invención puede comprender una o más, tal como dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más, mutaciones génicas como se ha mencionado.
Por ejemplo, la bacteria puede comprender una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición D143 en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición R87 en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición V164 en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición V164 en el polipéptido codificado.
Por ejemplo, la bacteria puede comprender una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356, seleccionándose dicha sustitución entre el grupo que consiste en Y356c , y 356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357, seleccionándose dicha sustitución entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357M; y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359, seleccionándose dicha sustitución entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L; y una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición D143 (tal como D143G) en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos en la posición R87 (tal como R87L) en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos en la posición V164 (tal como V164L) en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición V164 (tal como V164L) en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención comprende una o más sustituciones de nucleótidos en el gen thrA que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos en el polipéptido seleccionado seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R; y una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención comprende una o más sustituciones de nucleótidos en el gen thrA que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Y356C en el polipéptido codificado; y una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención comprende una o más sustituciones de nucleótidos en el gen thrA que dan como resultado la sustitución de aminoácidos S357R en el polipéptido codificado; y una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la presente invención comprende una o más sustituciones de nucleótidos en el gen thrA que dan como resultado la sustitución S359R en el polipéptido codificado; y una o más (tal como dos o más) mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una eliminación de los primeros 5 pb del gen rhtA, una eliminación completa de los genes ompX e ybiP, una eliminación de 239 pb del gen rybA y una eliminación de 77 pb del gen mntS. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una eliminación de aproximadamente 2854 pb de una ubicación que corresponde a la ubicación 850092 en la secuencia genómica NC_000913. Esta eliminación da como resultado una eliminación de los primeros 5 pb del gen rhtA, una eliminación completa de los genes ompXe ybiP, una eliminación de 239 pb del gen rybA y una eliminación de 77 pb del gen mntS. Dicha eliminación puede lograrse usando el sistema lambda-red o cam-sacB.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) en la región intergénica entre los genes trxA y rho. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) en la hebra retardada en una ubicación que corresponde a la ubicación 3966174 en la secuencia genómica NC_000913. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende además una duplicación de aproximadamente 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de 1 pb en la región intergénica entre los genes gcvA e ygdI. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una inserción de 1 pb en una ubicación que corresponde a la ubicación 2942629 en la secuencia genómica NC_000913.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS4 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 1342 pb) en la región intergénica entre los genes gcvA e ygdI. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS4 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 1342 pb) en una ubicación que corresponde a la ubicación 2942878 en la secuencia genómica NC_000913. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende además una duplicación de aproximadamente 13 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de 1 pb en la región intergénica entre los genes dapA y gcvR. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una inserción de 1 pb en una ubicación que corresponde a la ubicación 2599854 en la secuencia genómica NC_000913.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) que da lugar a un truncamiento del gen frc. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) en la hebra retardada en una ubicación que corresponde a la ubicación 2492323 en la secuencia genómica NC_000913. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende además una duplicación de 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen frc (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS5 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 1195 pb) que da lugar a la eliminación de la mayoría del gen aroP. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma un elemento de secuencia de inserción IS5 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 1195 pb) en una ubicación que corresponde a la ubicación 121518 en la secuencia genómica NC_000913. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende además una duplicación de 4 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen aroP (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) en la región intergénica entre los genes mdtJ y tqsA. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma un elemento de secuencia de inserción IS1 (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 768 pb) en la hebra retardada en una ubicación que corresponde a la ubicación 1673670 en la secuencia genómica NC_000913. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria comprende además una duplicación de aproximadamente 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una sustitución de nucleótidos, tal como una sustitución C->T, en la región intergénica entre los genes trxB e Irp. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una sustitución de nucleótidos, tal como una sustitución C->T, en una ubicación que corresponde a la ubicación 923321 en la secuencia genómica NC_000913. Dicha mutación se encuentra a 271 pb cadena arriba de trxB y a 274 pb cadena arriba de Irp.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención comprende en su genoma una sustitución de nucleótidos, tal como una sustitución T->C, en la región intergénica entre los genes yftB y fklB. De acuerdo con ciertas realizaciones, la bacteria comprende en su genoma una sustitución de nucleótidos, tal como una sustitución T->C, en una ubicación que corresponde a la ubicación 4428871 en la secuencia genómica NC_000913. Dicha mutación se encuentra a 154 pb cadena arriba de yftB y a 64 pb cadena arriba de fklB.
Como se demuestra adicionalmente en el presente documento, la atenuación (por ejemplo, mediante inactivación del gen) de la expresión de un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH) en una cepa modificada por ingeniería genética inversa dio como resultado una producción y rendimiento significativamente aumentados de L-serina a partir de glucosa, como se muestra en la tabla S9 (ejemplo 8).
Por tanto, de acuerdo con determinadas realizaciones, se ha modificado una bacteria de la invención para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH). Más particularmente, la presente invención proporciona una bacteria que se ha modificado para atenuar la expresión del gen zwf. Se encuentra disponible información adicional acerca de zwf de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG11221. Se expone una secuencia de nucleótidos representativa de zwf en la SEQ ID NO: 30.
La expresión génica puede atenuarse mediante la inactivación del gen. Por tanto, una bacteria de acuerdo con la invención puede ser una que se ha modificado para inactivar el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH) (por ejemplo, mediante inactivación del gen).
La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
De acuerdo con ciertas realizaciones, una bacteria de la invención expresa un polipéptido codificado por el gen brnQ, en donde dicho polipéptido termina después de la posición 308 o cualquier posición cadena arriba de la misma. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, una bacteria de la invención se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen brnQ (por ejemplo, mediante inactivación del gen). La atenuación y más particularmente la inactivación, de la expresión génica puede lograrse como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse reemplazo génico mediado por lambda red para inactivar la expresión génica.
De acuerdo con ciertas realizaciones, se ha modificado adicionalmente una bacteria de la invención para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH); expresar un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde en dicho polipéptido, en la posición 357 la serina se reemplaza por arginina; expresa un polipéptido codificado por el gen rho, en donde en dicho polipéptido, en la posición 87 R se reemplaza por L; y expresa un polipéptido codificado por el gen brnQ, en donde dicho polipéptido termina después de la posición 308 o cualquier posición cadena arriba de la misma. Como alternativa, la bacteria puede modificarse para atenuar la expresión del gen brnQ (por ejemplo, mediante inactivación del gen). Se han descrito anteriormente métodos adecuados para la atenuación de la expresión génica.
Se encuentra disponible información adicional acerca de brnQ de, por ejemplo, Escherichia coli en EcoCyc (www.biocyc.org) con el número de referencia EG12168. Se expone una secuencia de aminoácidos representativa de brnQ en la SEQ ID NO: 31.
De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen zwf (por ejemplo, mediante inactivación del gen); expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina; expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 87, R se reemplaza por L; y expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32.
De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria se ha modificado adicionalmente para atenuar la expresión del gen zwf y brnQ (por ejemplo, mediante inactivación de los genes); y expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11 o un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 357, la serina se reemplaza por arginina; expresa un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13 o un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13, en donde en dicha secuencia de aminoácidos en la posición 87, R se reemplaza por L.
Como se ha detallado anteriormente, una bacteria de la invención puede haberse modificado para sobreexpresar ciertos polipéptidos como se detalla en el presente documento, lo que significa que se ha introducido en la bacteria una molécula de ácido nucleico exógena, tal como una molécula de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido. Los expertos en la materia conocen técnicas para introducir una molécula de ácido nucleico exógena, tal como una molécula de ADN, en una célula bacteriana e incluyen transformación (por ejemplo, transformación por choque térmico o natural), entre otras.
Para facilitar la sobreexpresión de un polipéptido en la bacteria, la molécula de ácido nucleico exógena puede comprender elementos reguladores adecuados, tales como un promotor que es funcional en la célula bacteriana para provocar la producción de una molécula de ARNm y que está ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido.
Los promotores útiles de acuerdo con la invención son cualquier promotor conocido que sea funcional en una célula hospedadora dada para provocar la producción de una molécula de ARNm. La persona experta conoce muchos de estos promotores. Dichos promotores incluyen promotores normalmente asociados con otros genes y/o promotores aislados de cualquier bacteria. Los expertos en la técnica de biología molecular conocen generalmente el uso de promotores para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase Sambrook et al., "Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. El promotor empleado puede ser inducible, tal como un promotor inducible por temperatura (por ejemplo, los promotores pL o pR de fago lambda, cada uno de los cuales puede estar controlado por el represor lambda sensible a la temperatura c1857). El término "inducible" usado en el contexto de un promotor significa que el promotor solo dirige la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente si hay un estímulo presente, como un cambio de temperatura o la presencia de una sustancia química ("inductor químico"). Como se usa en el presente documento, "inducción química" de acuerdo con la presente invención se refiere a la aplicación física de una sustancia exógena o endógena (incluyendo macromoléculas, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos) a una célula hospedadora. Esto tiene el efecto de hacer que el promotor diana presente en la célula hospedadora aumente la velocidad de transcripción. Como alternativa, el promotor empleado puede ser constitutivo. El término "constitutivo" utilizado en el contexto de un promotor significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente en ausencia de estímulo (como choque térmico, productos químicos, etc.).
Los sistemas de inducción por temperatura funcionan, por ejemplo, empleando promotores que se reprimen mediante represores termolábiles. Estos represores son activos a temperaturas inferiores, por ejemplo, a 30 °C, mientras que son incapaces de plegarse correctamente a 37 °C y por tanto son inactivos. Por lo tanto, dichos circuitos pueden usarse para regular directamente los genes de interés (St-Pierre et al. 2013) también mediante integración genómica de los genes junto con los represores. Los ejemplos de estos, tales como un sistema de expresión inducible por temperatura, se basan en los promotores pL y/o pR de fago A, que están regulados por el represor cl857 termolábil. De manera similar al sistema DE3 integrado en el genoma, también puede controlarse la expresión del gen de ARN polimerasa T7 usando un sistema promotor regulado por temperatura (Mertens et al. 1995), mientras que la expresión de los genes de interés puede controlarse usando un promotor T7.
Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en bacterias, tales como Escherichia coli, incluyen promotores constitutivos e inducibles, tales como el promotor T7, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; promotor de fosfatasa alcalina (phoA), un sistema de promotor de triptófano (trp), promotor de tetraciclina, promotor del fago lambda, promotores de proteínas ribosómicos; y promotores híbridos, tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos y sintéticos.
Además de un promotor, la molécula de ácido nucleico exógena puede comprender además al menos un elemento regulador seleccionado entre una región 5' no traducida (5'UTR) y una región 3' no traducida (3'UTR). Los expertos conocen bien muchas de estos 5' UTR y 3' UTR procedentes de procariotas y eucariotas. Dichos elementos reguladores incluyen 5' UTR y 3' UTR normalmente asociadas con otros genes y/o 5' UTR y 3' UTR aisladas de cualquier bacteria.
Normalmente, la 5' UTR contiene un sitio de unión al ribosoma (RBS), también conocido como la secuencia Shine Dalgarno, que generalmente tiene 3-10 pares de bases cadena arriba del codón de inicio.
La molécula de ácido nucleico exógena puede ser un vector o parte de un vector, tal como un vector de expresión. Normalmente, dicho vector se mantiene extracromosómico en la célula bacteriana, lo que significa que se encuentra fuera del núcleo o la región nucleoide de la bacteria.
En la presente invención también se contempla que la molécula de ácido nucleico exógena se integre de manera estable en el genoma de la bacteria. Los expertos en la materia conocen bien medios para la integración estable en el genoma de una célula hospedadora, por ejemplo, mediante recombinación de homólogos.
Una bacteria de acuerdo con la presente invención puede producirse a partir de cualquier bacteria adecuada que pertenezca a la familia Enterobacteriaceae.
Los ejemplos de bacterias que pueden usarse para obtener una bacteria de la invención son bacterias que pertenecen a un género seleccionado entre el grupo que consiste en Escherichia, Arsenophonus, Biostraticola, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Cosenzaea, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Ewingella, Gibbsiella, Hafnia, Klebsiella, Leclercia, Leminorella, Lonsdalea, Mangrovibacter, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phaseolibacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Proteus, Rahnella, Raoultella, Saccharobacter, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shimwellia, Sodalis, Tatumella, Thorsellia, Trabulsiella, Wigglesworthia, Yersinia y Yokenella.
De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria pertenece al género Escherichia. De acuerdo con realizaciones particulares, la bacteria es Escherichia coli. Los ejemplos no limitantes de una bacteria que pertenece al género Escherichia, que pueden usarse para obtener una bacteria de la invención, son Escherichia coli K-12 (especialmente la subcepa MG1655 o W3110), BL21, W o Crooks. De acuerdo con realizaciones más particulares, la bacteria es Escherichia coli K-12.
Método de la invención
La presente invención también proporciona métodos para producir L-serina o un derivado de L-serina usando una bacteria de acuerdo con la presente invención. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-serina o un derivado de L-serina, comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir L-serina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-serina, comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la L-serina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir un derivado de L-serina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir un derivado de L-serina, comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El derivado de L-serina puede seleccionarse entre el grupo que consiste en L-cisteína, L-metionina, L-glicina, O-acetilserina, L-triptófano, tiamina, etanolamina y etilenglicol. El método puede comprender además recoger el derivado de L-serina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir L-cisteína. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-cisteína, comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la L-cisteína del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir L-metionina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-metionina; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la L-metionina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir L-glicina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-glicina; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la L-glicina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir O-acetilserina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir O-acetilserina; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la O-acetilserina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir L-triptófano. En particular, la presente invención proporciona un método para producir L-triptófano; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger el L-triptófano del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir tiamina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir tiamina; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la tiamina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir etanolamina. En particular, la presente invención proporciona un método para producir etanolamina; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger la etanolamina del medio de cultivo.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir etilenglicol. En particular, la presente invención proporciona un método para producir etilenglicol; comprendiendo dicho método cultivar una bacteria como se detalla en el presente documento en un medio de cultivo. El método puede comprender además recoger el etilenglicol del medio de cultivo.
El medio de cultivo empleado puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar una célula bacteriana en cuestión y puede estar compuesto de acuerdo con los principios de la técnica anterior. El medio normalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de la bacteria respectiva, tales como fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas. Los medios adecuados, por ejemplo, medios mínimos o complejos, están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse según las recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Un medio convencional no limitante bien conocido para el experto incluye caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrosa (SD), caldo MS, Levadura Peptona Dextrosa, BMMY, GMMY o caldo de extracto de levadura y malta (YM), que están disponibles comercialmente. Un ejemplo no limitante de medios adecuados para cultivar células bacterianas, tales como células de E. coli, incluye medios mínimos y medios enriquecidos, tales como caldo Luria (LB), medio M9, medio M17, medio SA, medio MOPS, Caldo Terrific, YT y otros.
Para aumentar adicionalmente la producción de L-serina o de derivado de L-serina, el medio de cultivo puede suplementarse adicionalmente con L-treonina. El medio de cultivo puede contener generalmente L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 g/l, tal como de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2,5 g/l, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 g/l o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 g/l. De acuerdo con ciertas realizaciones, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 g/l. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2,5 g/l. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 g/l. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 g/l. De acuerdo con ciertas realizaciones distintas, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 g/l. De acuerdo con otras realizaciones, el medio de cultivo contiene L-treonina a una concentración de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 g/l.
La fuente de carbono puede ser cualquier sustrato de carbono adecuado conocido en la técnica y en particular, cualquier sustrato de carbono comúnmente usado en el cultivo de bacterias y/o fermentación. Los ejemplos no limitantes de sustratos de carbono fermentables adecuados son los azúcares C5 (tales como arabinosa o xilosa), los azúcares C6 (tales como glucosa), acetato, glicerol, aceites vegetales, extracto de levadura, peptona, casaminoácidos o mezclas de los mismos. Una fuente de carbono particularmente interesante es un azúcar C6, tal como glucosa.
Como fuente de nitrógeno, pueden usarse varias sales de amonio, tales como amoniaco y sulfato de amonio, otros compuestos de nitrógeno, tales como aminas, una fuente de nitrógeno natural, tal como peptona, hidrolizado de soja y un microorganismo fermentador digerido. Como minerales, pueden usarse monofosfato de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro de calcio y similares.
El cultivo puede llevarse a cabo preferentemente en condiciones aerobias, tal como mediante cultivo agitado y mediante un cultivo agitado con aireación, a una temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 °C, tal como de aproximadamente 30 a 38 °C, preferentemente a aproximadamente 37 °C. El pH del cultivo normalmente es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, tal como entre aproximadamente 6,5 y 7,5. El pH del cultivo puede ajustarse con amoniaco, carbonato de calcio, diversos ácidos, diversas bases y tampones. Normalmente, el cultivo de 1 a 5 días da lugar a la acumulación de L-serina en el medio de cultivo.
Después del cultivo, pueden retirarse del medio de cultivo los sólidos, tales como células, mediante centrifugación o filtración en membrana. La L-serina o el derivado de L-serina puede recogerse mediante un método convencional para el aislamiento y la purificación de compuestos químicos de un medio. Los métodos de purificación bien conocidos incluyen, pero sin limitación, centrifugación o filtración, precipitación, intercambio iónico, métodos cromatográficos, tales como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de filtración en gel y métodos de cristalización.
La presente invención proporciona por tanto L-serina o un derivado de L-serina obtenible mediante un método como se detalla en el presente documento. Otras definiciones concretas
La expresión "bacteria que tiene la capacidad de producir L-serina", como se usa en el presente documento, significa una bacteria que es capaz de producir y provocar la acumulación de L-serina en un medio de cultivo, puede significar que la bacteria tiene la capacidad de causar la acumulación en una cantidad no menor de 0,4 g/l, cuando se cultiva en medio M9 mínimo suplementado con 2 g/l de glucosa, glicina 2 mM y treonina 1 mM a 37 °C con aireación adecuada durante 40 horas.
La frase "bacteria que se ha modificado para atenuar la expresión de genes que codifican polipéptidos que tienen actividad serina desaminasa", como se usa en el presente documento, significa que la bacteria se ha modificado de tal modo que la bacteria modificada contiene una cantidad reducida de los polipéptidos que tienen actividad serina desaminasa. Más particularmente, la frase significa que la bacteria es incapaz de sintetizar polipéptidos que tienen actividad serina desaminasa.
La frase "bacteria que se ha modificado para atenuar la expresión del gen que codifica un polipéptido que tiene actividad serina hidroximetiltransferasa", como se usa en el presente documento, significa que la bacteria se ha modificado de tal forma que la bacteria modificada contiene una cantidad reducida del polipéptido que tiene actividad serina hidroximetiltransferasa. Más particularmente, la frase significa que la bacteria es incapaz de sintetizar un polipéptido que tiene actividad serina hidroximetiltransferasa.
La frase "bacteria que se ha modificado para atenuar la expresión del gen que codifica un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH)", como se usa en el presente documento, significa que la bacteria se ha modificado de tal forma que la bacteria modificada contiene una cantidad reducida del polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH). Más particularmente, la frase significa que la bacteria es incapaz de sintetizar un polipéptido que tiene actividad glucosa 6-fosfato-1-deshidrogenasa (G6PDH).
La frase "inactivación de un gen" puede significar que el gen modificado codifica una proteína completamente no funcional. También es posible que la región de ADN modificada sea incapaz de expresar naturalmente el gen debido a la eliminación de una parte o de la totalidad de la secuencia génica, el desplazamiento del marco de lectura del gen, la introducción de mutaciones de sentido perdido/sin sentido o la modificación de una región adyacente del gen, incluyendo secuencias que controlan la expresión génica, tales como un promotor, potenciador, atenuador, sitio de unión a ribosomas, etc. Preferentemente, un gen de interés se inactiva mediante la eliminación de una parte de la secuencia génica completa, tal como mediante reemplazo génico.
La presencia o ausencia de un gen en el cromosoma de una bacteria puede detectarse mediante métodos bien conocidos, incluyendo PCR, transferencia de Southern y similares. Además, puede estimarse el nivel de expresión génica midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen usando varios métodos bien conocidos, incluyendo transferencia de Northern, RT-PCR cuantitativa y similares. La cantidad de proteína codificada por el gen puede medirse mediante métodos bien conocidos, incluyendo SDS-PAGE seguida de un ensayo de inmunotransferencia (análisis de transferencia de Western) y similares.
"Polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para indicar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente mediante un enlace de amida, independientemente de la longitud o de la modificación postraduccional (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Dentro de esta definición se incluyen D- y L-aminoácidos y mezclas de D- y L-aminoácidos.
"Ácido nucleico" o "polinucleótido" se usan indistintamente en este documento para indicar un polímero de al menos dos unidades o bases de monómero de ácido nucleico (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timina) unidos covalentemente por un enlace fosfodiéster, independientemente de la longitud o la modificación de base.
"Recombinante" o "de origen no natural" cuando se usa con referencia a, por ejemplo, una célula hospedadora, ácido nucleico o polipéptido, se refiere a un material o a un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que ha sido modificado de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o es idéntico a los mismos pero producido o derivado de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando técnicas recombinantes. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, células hospedadoras recombinantes que expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o que expresan genes nativos que de otro modo se expresan a un nivel diferente.
"Heterólogo", como se usa en el presente documento, significa que un polipéptido normalmente no se encuentra o se produce (es decir, expresa) por el organismo hospedador, pero procede de una especie diferente.
"Sustitución" o "sustituido" se refiere a la modificación del polipéptido reemplazando un resto de aminoácido con otro, por ejemplo, el reemplazo de un resto de serina con un resto de glicina o alanina en una secuencia de polipéptido es una sustitución de aminoácidos. Cuando se usa con referencia a un polinucleótido, "sustitución" o "sustituido" se refiere a la modificación del polinucleótido mediante el reemplazo de un nucleótido por otro, por ejemplo, el reemplazo de una citosina con una timina en una secuencia de polinucleótido es una sustitución de nucleótidos.
"Sustitución conservativa", cuando se usa con referencia a un polipéptido, se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido con un resto distinto que tiene una cadena lateral similar y por tanto, normalmente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos de la misma clase de aminoácidos o una similar. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede sustituirse con otro aminoácido alifático, por ejemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina; un aminoácido con cadena lateral de hidroxilo se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral de hidroxilo, por ejemplo, serina y treonina; un aminoácido que tiene una cadena lateral aromática se sustituye con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina; un aminoácido con una cadena lateral básica se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral básica, por ejemplo, lisina y arginina; un aminoácido con una cadena lateral ácida se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral ácida, por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico; y un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se reemplaza con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente.
"Sustitución no conservativa", cuando se usa con referencia a un polipéptido, se refiere a una sustitución de un aminoácido en un polipéptido con un aminoácido con propiedades de cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden usar aminoácidos entre, en lugar de dentro de, los grupos definidos y afecta a (a) la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la sustitución (por ejemplo, serina por glicina), (b) la carga o la hidrofobia o (c) el volumen de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservativa a modo de ejemplo puede ser un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido con un aminoácido pequeño; y un aminoácido hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.
"Eliminación" o "eliminado", cuando se usa con referencia a un polipéptido, se refiere a la modificación del polipéptido mediante la retirada de uno o más aminoácidos en el polipéptido de referencia. Las eliminaciones pueden comprender la retirada de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o 20 o más aminoácidos, hasta un 10 % del número total de aminoácidos o hasta un 20 % del número total de aminoácidos que forman el polipéptido, mientras que conserva la actividad enzimática y/o conserva las propiedades mejoradas de una enzima modificada por ingeniería genética. Las eliminaciones pueden estar dirigidas a las porciones internas y/o las porciones terminales del polipéptido, en diversas realizaciones, la eliminación puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinua.
"Inserción" o "insertado", cuando se usa con referencia a un polipéptido, se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido de referencia. Las inserciones pueden comprender la adición de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos o 20 o más aminoácidos. Las inserciones pueden estar en las porciones internas del polipéptido o en el extremo carboxilo o amino. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido de referencia.
La "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido (por ejemplo, enzima codificada) que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.
Como se usa en el presente documento, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ácido nucleico bicatenario en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión". Ciertos vectores diferentes tienen la capacidad de facilitar la inserción de una molécula de ácido nucleico exógena en un genoma de una bacteria. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de transformación". En general, los vectores útiles en las técnicas de ácido nucleico recombinante normalmente se encuentran en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de un vector. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.
Como se usa en el presente documento, "promotor" se refiere a una secuencia de ADN, generalmente cadena arriba (5') de la región codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante proporcionando sitios de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa y otros factores que pueden ser necesarios para el inicio de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la secuencia de ácido nucleico de interés. Un "promotor" adecuado es normalmente uno que es capaz de soportar el inicio de la transcripción en una bacteria de la invención, causando la producción de una molécula de ARNm.
Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de su modo previsto. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control. Una secuencia promotora está "unidad operativamente" a un gen cuando está suficientemente cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen para regular la transcripción del gen.
"Porcentaje de identidad de secuencia", "% de identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" se usan en el presente documento para referirse a comparaciones entre una secuencia de aminoácidos y una secuencia de aminoácidos de referencia. El "% de identidad de secuencia", como se usa en el presente documento, se calcula a partir de las dos secuencias de aminoácidos de la siguiente manera:
Las secuencias se alinean usando la Versión 9 de GAP (programa de alineación global) del Genetic Computing Group, usando la matriz BLOSUM62 predeterminada (véase a continuación) con una penalización de apertura de hueco de -12 (para el primer nulo de un hueco) y una penalización de extensión de hueco de -4 (por cada nulo adicional en el hueco). Después de la alineación, el porcentaje de identidad se calcula expresando el número de coincidencias como un porcentaje del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia.
Se utiliza la siguiente matriz BLOSUM62:
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"Secuencia de referencia" o "secuencia de aminoácidos de referencia" se refiere a una secuencia definida con la que se compara otra secuencia. En el contexto de la presente invención, una secuencia de aminoácidos de referencia puede, por ejemplo, ser una secuencia de aminoácido expuesta en la SEQ ID NO: 5 o 6.
Como se usa en el presente documento, "derivado de L-serina" se refiere a un compuesto, tal como un aminoácido, que es el resultado de la reacción de L-serina en el grupo amino o el grupo carboxilo o del reemplazo de cualquier hidrógeno de la L-serina por un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de un "derivado de L-serina" incluyen L-cisteína, L-metionina, L-glicina, O-acetilserina, L-triptófano, tiamina, etanolamina y etilenglicol. Se describen ejemplos adicionales de un "derivado de L-serina" en Chemical Entities of Biological Interest (ChEBI) [https://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do], por ejemplo, en la ID de ChEBI CHEBI:84135.
Cuando se indique un límite numérico o un intervalo en este documento, se incluyen los extremos. Asimismo, todos los valores y sub intervalos dentro de un límite numérico o intervalo se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.
Habiendo descrito generalmente la presente invención, se puede obtener una mayor comprensión haciendo referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplos
Por primera vez, los presentes inventores demuestran que puede producirse una bacteria, tal como E. coli, que carece de los cuatro genes de degradación de la serina (sdaA, sdaB, tdcG y glyA) (ejemplo 1). Dicha cepa muestra mayor rendimiento de producción de serina que las variantes con supresiones génicas individuales y triples, cuando la vía de la serina está regulada positivamente (ejemplo 2). Sin embargo, la cepa resultante tenía baja tolerancia a la serina, lo que también se ha comunicado en una cepa de E. coli con triple eliminación que carece de sdaA, sdaB y tdcG (Zhang y Newman, 2008). Además, los inventores demuestran que puede reducirse la toxicidad del producto mediante la sobreexpresión de nuevos exportadores (ejemplo 3), evolucionando cepas mediante mutagénesis aleatoria (ejemplo 4) y mediante evolución adaptativa (ejemplo 5). Además, la cepa se modificó por ingeniería genética inversa para identificar las mutaciones causantes (ejemplo 6). Durante la fermentación discontinua, la cepa tolerante muestra producción de serina mejorada (12,6 g/l con un rendimiento de masa del 36,7% a partir de glucosa) cuando se comparó con la cepa de cuádruple eliminación precursora (ejemplo 7). Este es el máximo rendimiento en masa de serina comunicado hasta la fecha a partir de glucosa en cualquier organismo de producción.
Los inventores demuestran además que la inhibición de la vía de pentosa fosfato mediante la eliminación de zwf en presencia de otras mutaciones causantes da lugar a un aumento adicional en el rendimiento de producción de serina (ejemplo 8).
Ejemplo 1 - Eliminación de vías de degradación clave
La serina tiene dos vías de degradación principales en E. coli: de serina a piruvato, que está codificada por tres desaminasas, a saber, sdaA, sdaB y tdcG y la conversión de serina a glicina, que está codificada por glyA. La eliminación de glyA hace que la E. coli sea auxótrofa para la glicina. La eliminación de sdaA, sdaB y tdcG se efectuó secuencialmente usando el método de reemplazo génico mediado por lambda red (Datsenko y Wanner, 2000). El protocolo aplicado para eliminar estos genes es similar al protocolo descrito por Sawitzke et al. (2013). Los cebadores para la amplificación del casete de kanamicina se muestran en la tabla S1. La reacción de la PCR contenía 250 nM de cada uno de los cebadores KF y KR del gen dado, 250 pM de mezcla de dNTP, 4 unidades de polimerasa Phusion (Thermoscientific, Waltham, MA, EE.UU.), 40 pl de tampón HF y 10 ng de plásmido pKD4. Se usó el siguiente protocolo de PCR en dos etapas para la amplificación por la PCR: Una etapa inicial de desnaturalización a 98 °C durante 40 segundos, seguida de 5 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 90 segundos cada ciclo, seguido de 20 ciclos, donde se aumentó la temperatura de hibridación de 55 °C a 65 °C. Los productos de la PCR se purificaron en columna (Macherey Nagel, Durn, Alemania) y se midió la concentración usando un instrumento Nanodrop (Thermoscientific, Waltham, m A, EE. UU.) y se sometió a digestión con Dpnl durante una noche. Se usó E. coli MG1655 como cepa precursora para producir supresiones génicas secuenciales. La cepa precursora se transformó con pKD46 y se cultivó en medio 2YT-amp a 30 °C y 250 rpm. Se indujo la expresión de las proteínas exo, beta y gamma mediante la adición de arabinosa 20 mM a la mitad de la fase logarítmica (D.O. 0,4 a 0,5) y las células se recogieron después de 1 h de incubación adicional. Después, se transfirió el cultivo a tubos Falcon enfriados en hielo de 50 ml y se centrifugaron a 6500 rpm durante 5 min a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con glicerol al 10 % enfriado en hielo. Estas células electrocompetentes se transformaron con 200 ng de casete de kanamicina y los transformantes se sembraron en placas de LB-kan. Se retiró el casete de kanamicina usando el plásmido pcp20 que codifica el gen de flipasa. Los cebadores para comprobar la eliminación se muestran en la tabla S2. La serina hidroximetiltransferasa codificada por glyA se retiró usando el protocolo del sistema de fago P1 (Thomason et al., 2007). Se cultivó una cepa de la colección Keio (Baba et al., 2006) que portaba glyA::kan en 5 ml de medio ]LB-kan suplementado con glucosa al 0,2 %, CaCl2 25 mM y glicina 1 mM. En la fase logarítmica temprana (D.O. 0,1), el cultivo se transdujo con lisado de fago P1. El cultivo se incubó durante tres horas a 37 °C y a 250 rpm para la lisis celular. El lisado se esterilizó por filtración usando un filtro de 0,45 um. Se resuspendió 1 ml de cultivo de una noche de la cepa de E. coli que tenía eliminación de sdaA, sdaB y tdcG en 200 pl de solución salina P1 y se incubó con 100 pl del lisado anterior durante 1 h. Después, se cultivaron las células durante una noche en 2 ml de medio LB suplementado con glicina 2 mM y citrato de sodio 200 mM. Las células se sembraron en una placa de LB-kan suplementado con glicina 2 mM y citrato de sodio 10 mM. Los clones se volvieron a sembrar en estrías en una nueva placa para retirar cualquier contaminación por fago y se comprobó la inserción del casete en las colonias aisladas. La eliminación se efectuó usando plásmido pcp20. La cepa resultante con cuádruple eliminación (figura 1) se denomina Q1. Este ejemplo demuestra que es posible eliminar sdaA, sdaB, tdcG y glyA en E. coli, algo que no se había logrado anteriormente y por tanto, es inesperado.
T l 1: r r l m lifi i n l k n mi in
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Tab 2: r r m r r l limin i n n íficos
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Ejemplo 2 - Sobreexpresión de la vía de biosíntesis de serina para la producción de serina
La serina se produce en E. coli a partir de tres enzimas codificadas por serA, serB y serC. Todos los genes se aislaron de E. coli MG1655 usando cebadores con los nombres de gen respectivos (tabla S3). La mezcla de la PCR de 100 j l contiene 250 nM de cada uno del cebador directo e inverso, 250 jM de dNTP, 2 U de polimerasa Phusion, 1 X tampón HF, 1 j l de cultivo de una noche. Se usó el siguiente protocolo de PCR en dos etapas para la amplificación por la PCR: Una etapa inicial de desnaturalización a 98 °C durante 40, seguida de 5 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 90 segundos cada ciclo, seguido de 20 ciclos, donde se aumentó la temperatura de hibridación de 55 °C a 65 °C. Después de la purificación en columna, se digirieron los productos génicos y los plásmidos usando enzimas de digestión rápida (Thermoscientific, Waltham, MA, EE.UU.). Se sometieron aproximadamente 500 ng de producto de la PCR o 1 pg de plásmidos a digestión mediante 1 j l de cada una de las enzimas de restricción en tampón de digestión rápida 1X. La reacción se incubó durante 3h y después se purificó en columna nuevamente. Se sometió serA a doble digestión con Ncol y Notl mientras que serC se digirió con Ndel y Pacl. pCDF-Duet se digirió en primer lugar con Ncol y Notl para la clonación de serA, dando lugar al plásmido pCDF-Duet-serA y este plásmido se usó posteriormente para la clonación de serC, produciendo de este modo pCDF-Duet-serA-serC. El gen que codifica serB se clonó en el vector pACYC-Duet en el sitio de Ncol y Pacl, dando lugar a pACYC-serB. La reacción de ligamiento típica incluye tampón de ligasa T4 1 X, 50 ng de ADN plasmídico y 100 ng de inserto y 0,3 |jl/10 j l de ADN ligasa de T4 (Thermoscientific, Waltham, MA, EE.UU.).
La inhibición por retroalimentación de serA se retiró mutando tres restos, H344, N346 y N364 a alanina (Al-Rabiee et al., 1996) mediante mutagénesis dirigida al sitio (tabla S4). La mezcla maestra se usó como se ha mencionado anteriormente con la única modificación de que la mezcla maestra se dividió en dos alícuotas iguales, tras lo cual se añadieron cebadores directos e inversos a cada alícuota. Se usó como molde un total de 100 ng de plásmido pCDF-Duet-serA-serC. El programa de PCR en dos etapas: desnaturalización inicial a 98 °C durante 40 s, desnaturalización a 98 °C durante 10 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 4 min y 30 s se repitió 5 veces y después se mezclaron las dos alícuotas y se redistribuyeron para 15 ciclos adicionales. Para permitir el intercambio de las cadenas principales del vector, se retiró el sitio de Ncol dentro de serC con la misma estrategia usando los cebadores listados en la tabla S4.
La figura 2 muestra los mapas de vectores de las construcciones de plásmido.
T l : r r l m lifi i n l n i n l ví r i n rin
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Tabla S4: r r l m n i iri i l ii l ví r i n serina
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Integración de DE3 y producción de serina durante la fermentación discontinua
Se comprobó la producción de serina en medio M9 mínimo. El medio mínimo glucosa M9 consistía en 2 g/l de glucosa, CaCl20,1 mM, MgSO42,0 mM, solución de oligoelementos 1 x y sales M91x. La solución madre de oligoelementos 4.000x consistía en 27 g/l de FeCh*6H2O, 2 g/l de ZnCh*4H2O, 2 g/l de CoCh*6H2O, 2 g/l de NaMoO4*2H2O, 1 g/l de CaCl2*H2O, 1,3 g/l de CuCh*6H2O, 0,5 g/l de H3BO3 y HCI concentrado disuelto en ddH2O y esterilizado por filtración. La solución madre de sales M910x consistía en 68 g/l de Na2HPO4 anhidro, 30 g/l de KH2PO4, 5 g/l de NaCl y 10 g/l de NH4Cl disuelto en ddH2O y autoclavada.
Para usar vectores pET como sistema de expresión, se integró un casete de DE3 que contenía polimerasa T7 en el genoma de cada mutante de eliminación usando un kit de lisogenización de DE3 Lambda (Millipore, Damstadt, Alemania). Posteriormente, se transformaron cepas (MG1655 (DE3)) que portaban eliminaciones individuales (AsdaA), triples (AsdaA, AtdcG, AsdaB) y cuádruples (AsdaA, AtdcG, AsdaB y AglyA) con pCDF-Duet1-serAmut-serC y pACYC-serB. Las soluciones madre de glicerol resultantes se cultivaron durante una noche en medio 2YT que contenía glucosa al 0,1 % y suplementado con los antibióticos necesarios (espectinomicina y cloranfenicol). Los cultivos de una noche se inocularon en triplicados en matraces que contenían medio M9 suplementado con glucosa al 0,2 %, treonina 1 mM, los antibióticos necesarios (para la cepa de cuádruple eliminación, solo se suplementó con glicina 2 mM). Los matraces se incubaron a 37 °C a 250 rpm. La producción de serina se indujo mediante la adición de IPTG 40 pM después de que los cultivos alcanzasen una densidad óptica de 0,55 a 0,65. Las mediciones de D.O. y la toma de muestras se efectuaron a intervalos de tiempo regulares durante las 60 h siguientes. Las muestras se filtraron y sometieron a HPLC para el análisis de la glucosa y los subproductos usando un método anteriormente descrito (Kildegaard et al., 2014) con la única excepción de que la temperatura de la columna se mantuvo a 30 °C. Las concentraciones de serina se determinaron usando CLEm . El sistema de CL-EM/EM consistía en un módulo automuestreador CTC, una bomba de mezclado a alta presión y un módulo de columna (Advance, Bruker, Fremont, CA, EE.UU.). El volumen de inyección fue de 1 pl. La cromatografía se llevó a cabo en una columna ZIC-cHILIC, 150 mm x 2,1 mm, tamaño de poro de 3 pm, (SeQuant, Merck Millipore). Delante de la columna de separación había un filtro de profundidad de 0,5 p y una columna de guarda, el filtro (KrudKatcher Classic, Phenomenex) y columna de guarda ZIC-cHILIC, 20 x2,1 mm (SeQuant, Merck). Eluyente A: acetato de amonio 20 mM con pH ajustado a 3,5 con ácido fórmico en agua milliQ. Eluyente B: Acetonitrilo. El caudal total del eluyente A y B fue de 0,4 ml/min. La elución isocrática al 35 % y el tiempo total de ejecución fue de 5 minutos. El tiempo de retención fue de 2,8 minutos para la serina. La detección por EM-EM se llevó a cabo en un instrumento de triple cuadrupolo EVOQ (Bruker, California, EE. UU.) equipado con una interfaz de ionización a presión atmosférica (API). El espectrómetro de masas se empleó con electronebulización en el modo de ion positivo (IEN+). El voltaje de nebulización se ajustó a 4500 V. El flujo continuo de gas fue de 20 l/h y la temperatura del cono se ajustó a 350 °C. El flujo de gas de la sonda calentada se ajustó a 50 l/h con una temperatura de 350 °C. El caudal del nebulizador se ajustó a 50 l/h y se activó el gas de escape. Se usó argón como gas de colisión a una presión de 1,5 mTorr. La detección se llevó a cabo en el modo de monitorización de reacción múltiple (MRM). La transición cuantitativa fue de 106 ^ 60 y la transición cualitativa fue 106 ^ 70. La energía de colisión se optimizó a 7eV para ambas transiciones.
Se prepararon patrones de calibración de serina en los medios usados para la producción de serina y se diluyeron a 50:50 con ácido fórmico al 0,2 % en acetonitrilo. La concentración de los patrones de calibración se encontraba en el intervalo de 0,001 a 0,5 g/l.
El experimento demuestra que la eliminación de los cuatro genes implicados en la degradación de la serina en E. coli, citada como Q1(DE3), da como resultado la máxima productividad específica y el máximo rendimiento a partir de glucosa, como se muestra en la figura 3.
Ejemplo 3: Reducción de la toxicidad de producto mediante la sobreexpresión de transportador
La eliminación de las principales vías de degradación de la serina en E. coli da como resultado una tolerancia significativamente reducida a la serina. Para aumentar la tolerancia, se sobreexpresó un transportador con una especificidad potencial por serina (ydeD) y se evaluó durante el crecimiento en altas concentraciones de serina. Se clonó ydeD en pCDF-1b en los sitios de NcoI y PacI mediante amplificación con los cebadores mencionados en la tabla S3 y el protocolo proporcionado en el ejemplo 1.
Se transformó Q1(DE3) con el vector vacío pCDF-1b y el plásmido de pCDF-ydeD-c-His (figura 4). Los transformantes se seleccionaron en placas de LB-espectinomicina. Los cultivos de una noche de estos transformantes se inocularon en medio M9 suplementado con glicina 2 mM, 2 g/l de glucosa y espectinomicina a una relación 1:50. Los cultivos se inocularon a 37 °C a 250 rpm a una densidad óptica de 0,4 a 0,5, tras lo cual se añadieron 800 pl a una placa de Biolector de 48 pocillos (M2P labs, Baeswieler, Alemania) que contenía 800 pl de medio M9 con diversas concentraciones de serina (12,5, 25 y 50 g/l) y glicina 2 mM. La expresión de ydeD se indujo con IPTG 100 pM. Después, se monitorizó el crecimiento en el instrumento Biolector (M2P labs, Baeswieler, Alemania) a 37 °C y una humedad del 70 % con agitación continua. La ganancia se ajustó al 20 % y la intensidad de dispersión se midió cada 5 min durante las 40 h siguientes.
El experimento demuestra que el crecimiento de E. coli que carece de las principales vías de degradación de serina está gravemente inhibido en presencia de concentraciones incluso bajas de serina. Tras la sobreexpresión de ydeD, aumenta sustancialmente la tolerancia a la serina (figura 4), lo que sugiere que YdeD puede potencialmente transportar la serina fuera de la célula.
Ejemplo 4 - Mutagénesis aleatoria para la cepa tolerante a serina
La inactivación de las principales vías de degradación de la serina en E. coli da como resultado una tolerancia significativamente reducida a la serina. Para aumentar la tolerancia, se cultivó la cepa Q1 (obtenida en el ejemplo 1) en medio M9 suplementado con glicina 2 mM y 3 g/l de serina durante una noche. Se dispersó 1 ml de cultivo en una placa de Petri de 6 pocillos y se expuso a irradiación UV (CBS Scientific, San Diego, CA, EE. UU.) durante 30 min. Después, se añadieron al cultivo 5 ml de medio M9 suplementado con glicina 2 mM, 2 g/l de glucosa y 50 g/l de serina para el enriquecimiento de los mutantes tolerantes. El cultivo se incubó a 37 °C y 250 rpm durante 3 días y después se sembraron en la placa de M9 suplementado con 50 g/l de serina para la selección de los clones tolerantes. Las colonias se aislaron y se estimaron las velocidades de crecimiento y la tolerancia usando el siguiente método:
Los cultivos se cultivaron durante una noche en medio 2xYT. Después, se inocularon en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos con 150 pl de medio M9 que contenía glucosa al 0,2 % y diversas concentraciones de serina (en triplicados). Para las cepas que contenían la eliminación de glyA, también se suplementó glicina 2 mM en el medio.
Se usó como inóculo un total de 1,5 |jl de células (1:100). En caso necesario, se efectuaron cambios menores en el volumen para asegurar una cantidad igual de células. Las placas se sellaron con película adhesiva transparente Microamp (Applied Biosystems, Warrington, R. U.) y se incubaron en un lector de placas de microtitulación (Biotek, Winooski VT, Ee . UU.). El lector se ajustó a 37 °C con agitación continua y se monitorizó la D.O. cada 5 a 10 minutos a 630 nm durante 32 horas.
El experimento demuestra que puede usarse mutagénesis aleatoria para aumentar significativamente la tolerancia a la serina (figura 5). La cepa resultante se cita a continuación como Q3.
Ejemplo 5 - Evolución adaptativa para la tolerancia a la L-serina
Aparte de la mutagénesis aleatoria, también se aumentó la tolerancia a la serina de una cepa que tenía inactivadas las principales vías de degradación de la serina mediante evolución adaptativa. Se evolucionaron de manera adaptativa siete poblaciones independientes de la cepa Q1 en medio mínimo M9 suplementado con glicina 2 mM y concentraciones crecientes del aminoácido L-serina a 37 °C a lo largo de 60 días.
Se logró un experimento de evolución adaptativa en laboratorio (ALE) usando un sistema automatizado, lo que permite la propagación de poblaciones en evolución a lo largo del transcurso de varios días mientras se monitorizan sus velocidades de crecimiento. Antes de iniciar el experimento, el sistema rellena los tubos necesarios con 25 ml de medio de cultivo y los mantiene a 37 °C en un bloque de calentamiento. Se obtuvo aireación controlada usando agitadores por volteo magnéticos dentro de los tubos y centrifugando a 1.800 rpm. Al comienzo del experimento, se cultivó durante una noche una sola colonia en uno de los tubos colocados dentro del sistema y se usaron alícuotas de 100 j l por la plataforma robotizada para inocular siete matraces independientes. A medida que crecieron las bacterias, el sistema automatizado llevó a cabo múltiples medidas de DO a 600 nm para cada matraz. Las velocidades de crecimiento se calcularon automáticamente tomando la pendiente de un ajuste lineal de regresión lineal de mínimos cuadrados al logaritmo de las mediciones de la DO (figura 6). Una vez que se alcanza una DO diana de 0,4, se usaron 100 j l de cultivo para inocular un nuevo matraz. De esta forma, los cultivos se pasaron en serie (~2-3 veces al día) a matraces con medio fresco después de alcanzar una densidad celular diana, de tal forma que nunca se alcanzó la fase estacionaria. Las poblaciones se incubaron inicialmente con 3 g/l de serina. Después de alcanzarse la velocidad de crecimiento deseada, el cultivo se suplementó con 6 g/l de L-serina. Cuando las poblaciones lograron un fenotipo estable (es decir, velocidad de crecimiento), se aumentó la concentración de L-serina hasta 12 g/l. Este proceso se repitió de manera iterativa usando 24, 50, 75 y 100 g/l de L-serina. La población final se sembró en LB-agar y se seleccionaron 2 clones de cada una de las poblaciones. Las cepas evolucionadas tenían una tolerancia significativamente aumentada cando se evaluó su crecimiento en presencia de altas concentraciones de serina usando el ensayo basado en MTP descrito en el ejemplo 5, anterior. Los resultados se muestran en la figura 6.
Extracción de ADN genómico, secuenciación y análisis de bibliotecas
Se secuenció el genoma de dos clones de cada uno de los cultivos evolucionados, así como de la cepa evolucionada mediante mutagénesis UV aleatoria (ejemplo 5). El ADN genómico se extrajo a partir de 1,5 ml de cultivos de una noche de cepas de E. coli usando el kit QlAamp DNA Mini (QIAGEN, Alemania). Las bibliotecas genómicas se generaron usando el kit de preparación de muestras TruSeq ®Nano DNA LT (Illumina Inc., San Diego CA, EE. UU.). En resumen, se fragmentaron 100 ng de ADN genómico diluido en 52,5 ul de tampón TE en microtubos Covaris Crimp Cap en un dispositivo de ultrasonidos Covaris E220 (Covaris, Brighton, R. U.) con un factor de trabajo del 5 %, potencia incidente máxima de 175 W, 200 ciclos/ráfaga y una duración de 50 s en modo de barrido de frecuencia a de 5,5 a 6 °C (recomendaciones de Illumina para un tamaño de fragmento medio de 350 pb). Los extremos del ADN fragmentado se repararon mediante a Dn polimerasa T4, ADN polimerasa Klenow y polinucleótido cinasa T4. Después, se usó la enzima Klenow exo minus para añadir una base de "A" al extremo 3' de los fragmentos de ADN. Después del ligamiento de los adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN, se recuperaron fragmentos de ADN en el intervalo de 300-400 pb mediante purificación con perlas. Finalmente, se enriquecieron los fragmentos de ADN modificados con adaptador mediante PCR de 3 ciclos. La concentración final de cada biblioteca se midió mediante un fluorómetro Qubit® 2.0 y un ensayo de ADN de amplio espectro Qubit (Life Technologies, Paisley, R. U.). Se determinó el tamaño medio de la biblioteca de ADNbc usando el kit Agilent DNA 7500 en un bioanalizador Agilent 2100. Las bibliotecas se normalizaron y agruparon en Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, más Tween 20 al 0,05 % a la concentración final de 10 nM. Desnaturalizadas en NaOH 0,2N, se cargó un grupo 10 pM de 20 bibliotecas en 600 j l de tampón HT1 enfriado en hielo en la celda de flujo proporcionada en el kit de reactivo MiSeq v2 durante 300 ciclos y se secuenció en una plataforma MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) con un protocolo de extremos emparejados y longitudes de lectura de 151 nt.
Se usó Breseq Pipeline (Deatherage y Barrick, 2014) versión 0.23 con bowtie2 (Langmead y Salzberg) para mapear las lecturas de secuenciación e identificar variantes de secuencia en relación con el genoma de referencia de E. coli K12 MG1655 (n.° de referencia del NCBI NC_000913.2). Las eliminaciones génicas presentes en las cepas se verificaron manualmente en las regiones de cobertura ausentes en el genoma. Las variantes comunes halladas en cultivos madre de MG1655 (Freddolino et al., 2012) se excluyeron de los análisis posteriores. Todas las muestras de secuenciación tenían una cobertura media mapeada de al menos 25x. Este experimento identifica mutaciones que provocan tolerancia aumentada a altas concentraciones de serina, como se muestra en la tabla S5.
Tabla S5: Mutaciones halladas en las cepas evolucionadas para tolerancia aumentada a la serina. El número de refe
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continuación
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*: indica un codón de parada
Inserción1: Inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 de 768 pb de longitud en la hebra retardada en la ubicación 3966174, que es una región intergénica entre los genes trxA y rho. Se observa una duplicación de 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
Inserción2: Inserción de 1 pb en la ubicación 2942629, que es una región intergénica entre los genes gcvA e ygdI. Inserción3: Inserción de un elemento de secuencia de inserción IS4 de 1342 pb en la ubicación 2942878, que es una región intergénica entre los genes gcvA e ygdI. Se observa una duplicación de aproximadamente 13 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
Inserción4: Inserción de 1 pb en la ubicación 2599854, que es una región intergénica entre los genes dapA y gcvR. Inserción5: Inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 de 768 pb de longitud en la hebra retardada en la ubicación 2492323, que da lugar a un truncamiento del gen frc. Se observa una duplicación de 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
Eliminación6: Eliminación de 2854 pb de la ubicación 850092, que da como resultado la eliminación de los primeros 5 pb de rhtA, eliminación completa de los genes ompXe ybiP, eliminación de 239 pb del gen rybA y eliminación de 77 pb del gen mntS.
Inserción7: Inserción de un elemento de secuencia de inserción IS5 de 1195 pb de longitud en la ubicación 121518 que da lugar a la eliminación de la mayoría de aroP. Se observa una duplicación de 4 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
Inserción8: Inserción de un elemento de secuencia de inserción IS1 de 768 pb de longitud en la hebra retardada en la ubicación 1673670, que es una región intergénica entre los genes mdtJ y tqsA. Se observa una duplicación de 9 pb cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de inserción.
Intergénica9: mutación C->T en la ubicación 923321 que es una región intergénica entre trxB e Irp. La mutación se encuentra a 271 pb cadena arriba de trxB y a 274 pb cadena arriba de Irp.
Intergénica10: mutación T-> C en la ubicación 4428871 que es una región intergénica entre yftB y fklB. La mutación se encuentra a 154 pb cadena arriba de yftB y a 64 pb cadena arriba de fklB.
Ejemplo 6 - Ingeniería inversa de mutaciones de ALE mediante el sistema cam-scB e ingeniería genómica multiplexada
Para identificar mutaciones que provocan tolerancia aumentada a la serina, se introdujeron mutaciones identificadas en el ejemplo 5 en la cepa Q1(DE3) usando dos métodos diferentes como se describe a continuación.
A. Introducción de mutaciones de thrA
Se introdujeron mutaciones en thrA en el genoma de la cepa Q1(DE3) usando un sistema de selección basado en cam-sacB. Se insertó cam-sacB usando el plásmido pKD46 que portaba los genes exo, beta y gamma para la recombinación. La selección positiva para la inserción del casete se efectuó seleccionando clones por su resistencia al cloranfenicol. La pérdida del casete se seleccionó emplacando clones por duplicado en una placa de LB-cloranfenicol y LB-sacarosa que contenía sacarosa al 15 % (sin NaCl). El casete de cam-sacB se amplificó usando los cebadores thrA_camsacB_F y R (tabla S6), respectivamente. Aparte del molde y el tiempo de extensión, la mezcla de reacción y el programa de la PCR fue el mismo al descrito en el ejemplo 1. El tiempo de extensión fue de 2 min y 30 s, mientras que el molde fue 1 pl de cultivo de una noche del cultivo de E. coli que contenía el casete de cam-sacB. Después, se transformaron células Q1(DE3) competentes con 200 ng de casete thrA-cam-sacB y se emplacaron en placas de LB-cloranfenicol-ampicilina después de dos horas y se incubaron durante una noche a 30 °C. Se recogió una sola colonia y se hizo electrocompetente después de 1 h de inducción (ejemplo 1) y se transformó con alelos de thrA. Después de 2 horas de recuperación, las células se sembraron en placas de LB-sacarosa y se incubaron a 37 °C para curar el plásmido pKD46. Se sembraron por duplicado 24 clones de cada experimento en placas de LB-cloranfenicol y LB. Se comprobó la pérdida del casete de los clones que no crecieron en las placas de cloranfenicol mediante PCR de colonias y posteriormente se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger.
Las tres cepas que contenían mutaciones de thrA (Y356C, S357R o S359R) se cultivaron en medio M9 suplementado con glicina 2 mM, 2 g/l de glucosa y 6,25 g/l de L-serina. En este experimento, no se restó el fondo de las mediciones, dando como resultado un aumento aparente en la DO para la cepa Q1. Sin embargo, en estas condiciones, la cepa Q1 no mostró un crecimiento significativo. Por otra parte, cada una de las mutaciones de thrA dio como resultado un aumento similar y muy significativo en la tolerancia frente a la L-serina (figura 7), que les permite crecer a una concentración de L-serina de al menos 6,25 g/l, a diferencia de la cepa Q1 precursora. Ya que todos los mutantes de thrA tuvieron el mismo perfil de crecimiento, se seleccionó el mutante S357R como cepa precursora (citada como cepa Q1(DE3)-thrAS357R) para la ingeniería genómica multiplexada descrita más adelante.
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B. Ingeniería genómica multiplexada, detección sistemática y secuenciación de amplicones de mutaciones de ALE seleccionadas
Para identificar mutaciones que provocan tolerancia aumentada a la serina, se introdujeron mutaciones seleccionadas identificadas en el ejemplo 5 en la cepa Q1(DE3)-thrAS357R usando ingeniería genómica multiplexada (Wang et al., 2011). El protocolo aplicado para la ingeniería genómica multiplexada fue similar al método publicado por Wang y Church, 2011. La cepa Q1(DE3)-thrAS357R se transformó con el plásmido pMA1 (que contenía únicamente la proteína beta bajo el control del promotor inducible por arabinosa). Los clones se emplacaron en placas de LB-ampicilina y se incubaron a 37 °C. Las colonias se cultivaron durante una noche en medio TY-amp-gly a 37 °C y se volvieron a inocular en 25 ml de medio TY-gly fresco al día siguiente. Después de alcanzar una D.O. de 0,4 a 37 °C, se añadió arabinosa a una concentración final del 0,2 %. Las células se volvieron a incubar a 37 °C y 250 rpm durante 15 min adicionales y después se hicieron electrocompetentes lavándolas dos veces con glicerol al 10 % (enfriado en hielo). El volumen final de células electrocompetentes se ajustó a 200 pl usando glicerol al 10 %. Los cebadores que se dirigen a los loci (lrp D143G, eno V164L, argP Q132K, cycA 1220V, pykF E250*, rpoB520L, gcvA*, yojL D334H, rho R87L) se proporcionan en la tabla S7. Todos los cebadores se agruparon y ajustaron a una concentración final de 10 pmol/pl. A 50 pl de células, se le añadió 1 pl de esta mezcla y se transformaron mediante electroporación. Las células transformadas se añadieron directamente a 25 ml de medio TY-gly y se incubaron a 37 °C, 250 rpm durante dos horas hasta alcanzar una D.O. de 0,4, seguido de la inducción de arabinosa y la transformación como en el caso anterior para una segunda ronda de ingeniería multiplexada. El proceso se repitió seis veces. Después de la 6.a ronda de ingeniería genómica multiplexada, las células se incubaron durante una noche. La biblioteca de mutantes resultantes se cultivó posteriormente en medio mínimo M9 con y sin serina. De esta forma, se enriquecieron las mutaciones que dieron como resultado velocidades de crecimiento aumentadas en medio mínimo o tolerancia aumentada a la serina: Se añadieron un total de 1,5 |jl de cultivo de una noche en triplicado a los pocilios en placas de microtitulación que contenían triplicados de 150 j l de medio M9 suplementado con glicina 2 mM y 2 g/l de glucosa (medio mínimo) o medio M9 con glicina 2 mM, 2 g/l de glucosa y 25 g/l de serina (medio mínimo con serina). Los perfiles de crecimiento se monitorizaron a 37 °C con agitación rápida continua en una placa de microtitulación durante 40 h. La densidad óptica se midió a 630 nm cada 5 min. Los triplicados se reunieron y usaron como molde para la generación de amplicones. El programa de la PCR y la composición de la reacción fue como se ha descrito en el ejemplo 1. Se siguió el protocolo de Illumina para el procesamiento de los amplicones y la secuenciación de última generación fue como se describe en el ejemplo 5. Los resultados de la secuenciación se analizaron computacionalmente y se calculó el enriquecimiento de las diversas mutaciones como la frecuencia de las mutaciones o bien en medio mínimo o en medio mínimo con serina, dividida entre la frecuencia de las mutaciones en la biblioteca no seleccionada (figura 8). Este experimento muestra que las mutaciones en Irp, rho, argP y eno dan como resultado una tolerancia aumentada a la serina.
Figure imgf000045_0002
T l : r r l n i i n m li n
Figure imgf000045_0001
continuación
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Ejemplo 7 - Producción de serina por E. co li tolerante y susceptible durante la fermentación discontinua
Se construyó un nuevo vector para regular positivamente la expresión del exportador junto con la vía de serina en el vector pACYC-Duet siguiendo la misma estrategia de antes mencionada en el ejemplo 2. Se clonó serB usando doble digestión con Ncol y Hindlll seguida de ligamiento. Después, se sometió el vector resultante (pACYC-Duet-serB) a doble digestión con Ndel y PacI para la clonación de ydeD-c-His. Ambas cepas, Q1 (DE3) y Q3 (DE3) se hicieron electrocompetentes cultivando las células en 30 ml de medio 2xYT suplementado con glucosa al 0,2 % (37 °C, 250 rpm) hasta la fase logarítmica media. Las células se recogieron por centrifugación a 6500 rpm durante 5 min a 4 °C y se lavaron dos veces en glicerol al 10 % enfriado en hielo. Finalmente, las células se resuspendieron en 500 pl de glicerol al 10 % y se transformaron 50 pl de células con los plásmidos pCDF-Duet1-serAmut-serC y pACYC-serB-ydeD-c-His para la producción de serina.
La producción de serina se demostró durante la fermentación discontinua alimentada en fermentadores de 1 l (Sartorius, Gottingen, Alemania). El medio contenía 2 g/l de MGSO4*7H2O, 2 g/l de KH2PO4, 5 g/l de (NH4)2SO4, 7,5 g/l de glucosa, 2 g/l de extracto de levadura, 0,6 g/l de glicina, 0,12 g/l de treonina, oligoelementos 4X (como se menciona en el ejemplo 2), 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de cloranfenicol. Para la cepa E. coli Q1(DE3), la concentración inicial de glucosa fue de 10 g/l para potenciar el crecimiento antes de la inducción. La alimentación normalmente contenía 140 g/l de glucosa, 24 g/l de sulfato de amonio, 2 g/l de glicina, 0,12 g/l de treonina, 2,5 g/l de cada uno de MGSO4*7H2O y KH2PO4, oligoelementos 1X, 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de cloranfenicol, mientras que la alimentación para la cepa Q1(DE3) contenía 120 g/l de glucosa.
Se usó un cultivo en fase logarítmica para inocular 500 ml de medio mediante una relación de inoculación de 1:50. Se dejaron crecer los cultivos durante una noche en el fermentador a 37 °C, 1000 rpm de velocidad del deflector y saturación de aire al 20 %. La alimentación a la velocidad de 8 g/h se inició después de que la concentración de glucosa fuese inferior a 250 mg/l en el medio. La producción se indujo en la fase logarítmica tardía (D.O. 7,5 a 9,5) mediante la adición de IPTG 40 pM y la velocidad de alimentación se redujo a 6 g/h. Se tomaron muestras a intervalos regulares y se sometieron a análisis por HPLC y CLEM como se ha mencionado anteriormente.
El experimento demuestra que puede producirse serina con un título elevado y con un alto rendimiento en E. coli usando fermentación discontinua alimentada (figura 9). Los títulos fueron de 6,8 g/l y 12,5 g/l para la cepa Q1(DE3) y la cepa Q3(DE3), respectivamente. Las fermentaciones dieron como resultado una rendimiento de masa sorprendentemente elevado del 36,7 % a partir de glucosa en la cepa Q3(DE3) cuando se comparó con un 24,3 % en la cepa Q1(DE3) (figura 9B). Esto muestra que puede lograrse un título y un rendimiento mayores usando la cepa de producción que es tolerante a la serina.
Ejemplo 8 - Cepas modificadas por ingeniería genética inversa que muestran producción aumentada de serina
Se comprobó la tolerancia a la serina de las cepas modificadas por ingeniería genética inversa en el ejemplo 6 como se menciona en el ejemplo 3. Se comprobó la producción de serina de la cepa más tolerante a la serina (F7) y también se secuenció su genoma como se describe en el ejemplo 5. Se introdujeron plásmidos para la sobreexpresión de la vía de producción de serina como se describe en el ejemplo 7. Se llevaron a cabo experimentos en matraz de agitación como se describe en el ejemplo 2, siendo la única diferencia que la concentración de glucosa era de 2,5 g/l. Las mediciones de la D.O. y la toma de muestras se efectuaron a intervalos regulares y las muestras se analizaron usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Sorprendentemente, dicha cepa dio como resultado una producción y rendimiento significativamente aumentados de serina a partir de glucosa, como se muestra en la tabla S9. La secuencia genómica reveló una eliminación de zwf, que codifica la primera enzima en la vía de pentosa fosfato. Además, la cepa portaba las mutaciones thrAS357R y rhoR87L. Además, la cepa también tenía un truncamiento del exportador de aminoácidos de cadena ramificada brnQ (se eliminaron 105 pb comenzando en la ubicación 419986. La proteína de 439 aminoácidos se truncó después de 308 aminoácidos).
T l : Ef Azwf n l r i n rin
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Ejemplo 9 - Producción mediante ALE 8
Para usar vectores pET como sistema de expresión, se integró un casete de DE3 que contenía polimerasa T7 en el genoma del mutante ALE 8-8 (ejemplo 5) usando un kit de lisogenización de d E3 Lambda (Millipore, Damstadt, Alemania) dando como resultado la cepa ALE 8-8(DE3). Posteriormente, ALE 8-8(DE3) se hizo electrocompetente cultivando las células en 30 ml de medio 2xYT suplementado con glucosa al 0,2 % (37 °C, 250 rpm) hasta la fase logarítmica media. Las células se recogieron por centrifugación a 6500 rpm durante 5 min a 4 °C y se lavaron dos veces en glicerol al 10 % enfriado en hielo. Finalmente, las células se resuspendieron en 500 pl de glicerol al 10 % y se transformaron 50 pl de células con los plásmidos pCDF-Duet1-serAmut-serC y pACYC-serB para la producción de serina.
La producción de serina se demostró durante la fermentación discontinua alimentada en fermentadores de 1 l (Sartorius, Gottingen, Alemania) como se menciona en el ejemplo 7. El medio contenía 2 g/l de MGSO4*7H2O, 2 g/l de KH2PO4, 5 g/l de (NH4)2SO4, 10 g/l de glucosa, 2 g/l de extracto de levadura, 0,6 g/l de glicina, oligoelementos 4X (como se menciona en el ejemplo 2), 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de cloranfenicol. Los 375 g de alimentación contenían 400 g/l de glucosa, 24 g/l de sulfato de amonio, 2 g/l de glicina, 2,5 g/l de MGSO4*7H2O y 5 g/l de KH2PO4, oligoelementos 1X, 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de cloranfenicol. Se usó un cultivo en fase logarítmica para inocular 500 ml de medio mediante una relación de inoculación de 1:50. Se dejaron crecer los cultivos durante una noche en el fermentador a 37 °C, 1000 rpm de velocidad del deflector y saturación de aire al 20 %. La producción se indujo en la fase logarítmica tardía (D.O. 8,5 a 9,5) mediante la adición de IPTG 80 pM y se inició la alimentación a la velocidad de 8 g/h. Se tomaron muestras a intervalos regulares y se sometieron a análisis por HPLC y CLEM como se ha mencionado anteriormente.
El experimento demuestra que se pueden obtener tanto una alta densidad celular como un elevado título de serina (55,0 g/l) en la cepa ALE 8-8 (DE3) (figura 10A) con un rendimiento de masa a partir de glucosa del 36,0 % (figura 10B).
Ejemplo 10 - Sobreexpresión y mutagénesis por saturación de sitio de thrA en el sitio Y356, S357 y S359
Usando mutagénesis por saturación de sitio (SSM), pueden mutarse los restos de aminoácidos seleccionados a todos los otros 20 aminoácidos. Esto hace posible investigar el efecto de las sustituciones de aminoácidos en la actividad enzimática y a su vez, en el fenotipo. El gen thrA se amplificó a partir de la cepa MG-1655 ts usando los cebadores thrA_NcoI_F y thrAJHindlll (secuencias de cebador en la tabla S10) y se clonaron en el plásmido pACYC-Duet1 usando las enzimas Ncol y Hindlll. El protocolo de clonación fue el mismo que para la clonación de serB en el ejemplo 2. El vector construido fue pACYC-thrA. Este plásmido se usó como molde para la SSM. La SSM para las mutaciones thrA observadas en las cepas ALE (Y356, S357 y S359) se llevó a cabo usando los cebadores proporcionados en la tabla S10. El protocolo de SSM fue similar al protocolo de SDM aplicado en el ejemplo 2 para la mutagénesis de serA insensible a la retroalimentación. El producto de la PCR se digirió con Dpnl y se transformó en la cepa Q1 (DE3), que porta el gen thrA de tipo silvestre en su genoma y se sembró en placas de LB-cloranfenicol suplementadas con glucosa al 0,1 % y glicina 4 mM. Se suplementó con cloranfenicol en todos los medios siguientes para la estabilidad del plásmido.
Se recogieron colonias individuales y se inocularon en placas MTP de 96 pocillos que contenían medio 2x TY suplementado con glucosa al 0,1 % y glicina 2 mM. Se recogieron 90 clones (1 placa de microtitulación (MTP)) de cada biblioteca de SSM (3 placas en total). Se inoculó la cepa Q1(DE3) que portaba el vector vacío pACYC-Duet y pACYC-thrAwt como cepa de control en cada placa. La placa se incubó a 37 °C y 300 rpm durante una noche. Esta placa de precultivo se usó como inóculo a partir del cual se añadió 1 pl a una nueva placa MTP de 96 pocillos que contenía 100 pl de medio M9 suplementado con glucosa al 0,2 %, glicina 2 mM. El cultivo se incubó durante 4 h, tras lo cual se añadieron 25 ul de IPTG 1 mM para inducir la expresión. Posteriormente, la placa se incubó durante 2 h y después se añadió medio M9 que contenía glucosa al 0,2 %, glicina 2 mM y 12,5 g/l de L-serina, alcanzando de este modo una concentración final de serina de 6,25 g/l. Después, se incubó la placa con agitación en un lector de MTP para analizar el crecimiento como se ha descrito anteriormente. Se recogieron clones seleccionados de cada placa que mostraban tolerancia en 1 placa y se repitieron para estas cepas los estudios de tolerancia. Los plásmidos para los clones tolerantes se secuenciaron y se estimaron las velocidades de crecimiento a partir de la fase logarítmica de cultivo. De esta forma, se identificó un número de sustituciones de aminoácidos que daban como resultado tolerancia a la serina (figura 11). La figura 11 (A-C) muestra la velocidad de crecimiento de cepas mutantes que tienen diferentes sustituciones de aminoácidos observadas en las posiciones 356, 357 y 359 de ThrA, respectivamente (indicadas por el respectivo código de una letra). La velocidad de crecimiento de E. coli que porta el gen thrA de tipo silvestre se indica como "ts".
El experimento demuestra que las sustituciones de aminoácidos en la posición 356, 357 y/o 359 en la proteína ThrA nativa confieren tolerancia aumentada de las cepas modificadas a la L-serina. Los datos demuestran adicionalmente que la sobreexpresión de mutantes de ThrA puede aumentar la tolerancia a la L-serina incluso en cepas que tienen un gen thrA nativo presente en su genoma.
Tabla thrA.
Figure imgf000048_0001
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae que se ha modificado para inactivar los genes sdaA, sdaB, tdcG y glyA.
2. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha bacteria se ha modificado adicionalmente para sobreexpresar una 3-fosfoglicerato deshidrogenasa, una fosfoserina fosfatasa y una fosfoserina aminotransferasa.
3. La bacteria de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6,25 g/l.
4. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha bacteria es capaz de crecer en un medio de cultivo mínimo que comprende L-serina a una concentración de al menos aproximadamente 6,25 g/l a una velocidad de crecimiento de al menos 0,1 h'1 durante el crecimiento exponencial.
5. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre el grupo que consiste en Y356, S357 y S359.
6. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha bacteria comprende en el gen thrA una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición Y356, una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S357 y/o una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado una sustitución de aminoácidos en el polipéptido codificado en la posición S359; en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356A, Y356I, Y356P, Y356H, Y356R, Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F, S357H, S357K, S357I y S357m ; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
7. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha bacteria expresa un polipéptido codificado por el gen thrA, en donde dicho polipéptido comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en Y356C, S357R y S359R.
8. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha bacteria expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, que comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones Y356, S357 y/o S359, en donde la sustitución en la posición Y356 se selecciona entre el grupo que consiste en Y356C, Y356T, Y356V, Y356S, Y356W, Y356Q, Y356G, Y356N, Y356D, Y356E, Y356F, Y356a , Y356I, Y356P, Y356H, Y356R y Y356L; la sustitución en la posición S357 se selecciona entre el grupo que consiste en S357R, S357V, S357P, S357G, S357L, S357Y, S357A, S357N, S357F y S357H; y la sustitución en la posición S359 se selecciona entre el grupo que consiste en S359R, S359G, S359M, S359F, S359T, S359P, S359V, S359Q, S359A, S359C, S359K, S359E y S359L.
9. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha bacteria se ha modificado adicionalmente para sobreexpresar el gen ydeD.
10. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha bacteria comprende una o más mutaciones génicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: una o más sustituciones de nucleótidos en el gen Irp que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D143G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rho que dan como resultado la sustitución de aminoácidos R87L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen eno que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V164L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen argP que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Q132K en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen tufA que dan como resultado la sustitución de aminoácidos G19V en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen cycA que dan como resultado la sustitución de aminoácidos I220V en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rpe que dan como resultado la sustitución de aminoácidos I202T en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen yojI que dan como resultado la sustitución de aminoácidos D334H en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen hyaF que dan como resultado la sustitución de aminoácidos V120G en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen pykF que dan como resultado la sustitución de aminoácidos E250* en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen maIT que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Q420* en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen rpoB que dan como resultado la sustitución de aminoácidos P520L en el polipéptido codificado, una o más sustituciones de nucleótidos en el gen fumB que dan como resultado la sustitución de aminoácidos T218P en el polipéptido codificado, una o más sustituciones en el gen gshA que dan como resultado la sustitución de aminoácidos A178V en el polipéptido codificado y una o más sustituciones de nucleótidos en el gen lamB que dan como resultado la sustitución de aminoácidos Q ll2 * en el polipéptido codificado, donde * indica un codón de parada.
11. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha bacteria pertenece al género Escherichia.
12. La bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha bacteria es Escherichia coli.
13. Un método para producir L-serina o un derivado de L-serina, comprendiendo el método cultivar una bacteria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un medio de cultivo.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el derivado de L-serina se selecciona entre el grupo que consiste en L-cisteína, L-metionina, L-glicina, O-acetilserina, L-triptófano, tiamina, etanolamina y etilenglicol.
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