ES2952961T3 - Anticuerpos anti-TIGIT y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a inmunorreceptores de células T con dominios de Ig e ITIM (TIGIT) (por ejemplo, TIGIT humana) y antagonizan la función de TIGIT. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresión y células huésped para producir estos anticuerpos, y métodos para tratar a un sujeto usando estos anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-TIGIT y métodos de uso de los mismos
1. Campo
La presente divulgación se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana) y usos de los mismos, como se especifica en las reivindicaciones.
2. Antecedentes
La proteína inmunorreceptora de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT), también conocida como VSIG9 o VSTM3, es una proteína transmembrana de tipo I de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig). Tiene un único dominio Ig, un dominio transmembrana de tipo I, un único motivo inhibidor basado en tirosina de inmunorreceptor intracelular (ITIM) y un único motivo de fosforilación similar a la tirosina de cola de inmunoglobulina (ITT) y se expresa en células T reguladoras (Tregs) positivas para CD4/CD25 activadas, células T positivas para CD45RO de memoria y células asesinas naturales (NK), pero no células T vírgenes.
El receptor del poliovirus (PVR, también conocido como CD155) tiene una alta expresión en monocitos y células dendríticas, y es capaz de activar las células T efectoras y las células NK, así como atenuar la actividad de las Treg, al unirse a sus dos receptores CD226 y CD96. TIGIT se une a PVR y se ha demostrado que antagoniza la interacción de PVR con CD226 y CD96, lo que suprime la actividad inmune mediada por células T y células NK. Los documentos WO2016/191643, WO2017/030823 y WO2017/059095 divulgan anticuerpos anti-TIGIT.
Dado el papel aparente de la TIGIT humana en la modulación de las respuestas inmunes, los agentes terapéuticos diseñados para antagonizar la señalización de la TIGIT son muy prometedores para el tratamiento de enfermedades que implican la supresión inmune.
3. Resumen
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana) y antagonizan la función de TIGIT, por ejemplo, inmunosupresión mediada por TIGIT. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresión y células huésped para producir estos anticuerpos y métodos para tratar a un sujeto usando estos anticuerpos. Los anticuerpos divulgados en el presente documento son particularmente útiles para aumentar la activación de células T y células NK en respuesta a un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno de enfermedad infecciosa) y/o la disminución de la inmunosupresión mediada por Treg y, por lo tanto, son útiles para tratar el cáncer en un sujeto o tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un sujeto.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o anticuerpo aislado que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende regiones determinantes de complementariedad CDRL1, CDRL2 y CDRL3, donde:
(a) CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SYGIS (SEQ ID NO: 1) o GYTFASY (SEQ ID NO: 2);
(b) CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de GITPFFNRVDVAEKFQG (SEQ ID NO: 3) o TPFFNR (SEQ ID NO: 4);
(c) CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de DLRRGGVGDAFDI (SEQ ID NO: 5);
(d) CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de TGTSSDVGSHNYVS (SEQ ID NO: 6);
(e) CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de EVSYRPS (SEQ ID NO: 7); y/o
(f) CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SSYTPSSATV (SEQ ID NO: 8).
En cierta divulgación, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 6, 7 y 8, respectivamente. En cierta divulgación, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente.
En cierta divulgación, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 9 es glutamato (E). En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 9 es piroglutamato (pE).
En cierta divulgación, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 10 es glutamina (Q). En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 10 es piroglutamato (pE).
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 9 es glutamato (E). En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 9 es piroglutamato (pE).
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 10 es glutamina (Q). En cierta divulgación, X en la SEQ ID NO: 10 es piroglutamato (pE).
En la presente invención se proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, X en la SEQ ID NO: 9 es glutamato (E). En ciertas realizaciones, X en la SEQ ID NO: 9 es piroglutamato (pE). En ciertas realizaciones, X en la SEQ ID NO: 10 es glutamina (Q). En ciertas realizaciones, X en la SEQ ID NO: 10 es piroglutamato (pE).
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humano, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*01 humano. La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humano, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*06 humano. La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humano, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*12 humano.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGLV2-14*01 humana. La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGLV2-23*02 humana. La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGLV2-11*01 humana.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende una región de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34 o 35. La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que comprende una región de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 37-39 y 60.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une al mismo epítopo de TIGIT humana que un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo de TIGIT humana que un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo ubicado dentro de una región de TIGIT humana, la secuencia de aminoácidos de la región consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 31-33.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, en donde el anticuerpo se une a un epítopo ubicado dentro de una región de TIGIT humana, en donde la secuencia de aminoácidos de la región consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 31-33.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une a uno o más residuos de aminoácidos de TIGIT humana seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47, N49, H90 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a uno o más residuos de aminoácidos de TIGIT humana seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une al residuo de aminoácido T96 de TIGIT humano, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une al residuo de aminoácido Q35 de TIGIT humano, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une al residuo de aminoácido I47 de TIGIT humano, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une al residuo de aminoácido N49 de TIGIT humano, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une al residuo de aminoácido H90 de TIGIT humano, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la unión entre el anticuerpo y una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En cierta divulgación, el anticuerpo no se une a uno o más de los residuos de aminoácidos de TIGIT humana seleccionados del grupo que consiste en T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100 y F102, numerados de acuerdo con a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido T34 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido L52 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido H55 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido I56 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido S57 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido P58 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido S59 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido T98 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido R100 de TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une a uno o más residuos de aminoácidos de TIGIT humana seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47, N49, H90 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une a uno o más residuos de aminoácidos de TIGIT humana seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al residuo de aminoácido T96 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al residuo de aminoácido Q35 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al residuo de aminoácido I47 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al residuo de aminoácido N49 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo se une al residuo de aminoácido H90 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión entre el anticuerpo y una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48 está sustancialmente debilitado (por ejemplo, reducido en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) en relación con la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une a uno o más de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T34, L52, H55, I56, S57, P58., S59, T98, R100 y F 102 de TIGIT humana, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido T34 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido L52 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido H55 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido I56 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido S57 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido P58 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido S59 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido T98 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido R100 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une al residuo de aminoácido F102 de la TIGIT humana, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que la unión del anticuerpo a una proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56 no se debilita sustancialmente (por ejemplo, no se reduce en más del 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %) con respecto a la unión del anticuerpo a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a la TIGIT humana, en el que el anticuerpo no se une a ninguno de los residuos de aminoácidos T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100 y F102 de la TIGIT humana, numerada de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 humana.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende una mutación N297A, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la IgG1 de región constante de cadena pesada comprende las mutaciones L234F, L235F y N297A, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la IgG1 de región constante de cadena pesada comprende las mutaciones S239D e I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la IgG1 de región constante de cadena pesada comprende las mutaciones S239D, A330L y I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la IgG1 DE región constante de cadena pesada comprende las mutaciones L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
En ciertas realizaciones, la IgG1 de región constante de cadena pesada está afucosilada.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1comprende las mutaciones S267E e L328F, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
Preferiblemente, el aumento de la actividad de FcyRIIIA y/o FcyRIIA en una primera célula citotóxica en contacto con el anticuerpo es mayor que el aumento de la actividad de FcyRIIIA y/o FcyRIIA en una segunda célula citotóxica en contacto con un anticuerpo de referencia que comprende la misma región variable de cadena pesada que el anticuerpo y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. En ciertas realizaciones, la célula citotóxica es una célula asesina natural.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende una mutación S228P, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo:
(a) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 11-18; y/o
(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 11-18; y/o la secuencia de aminoácidos de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Preferiblemente, el anticuerpo es antagonista de la TIGIT humana.
Preferiblemente, el anticuerpo mata preferentemente a las células T reguladoras sobre las células T efectoras en una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) in vitro. Preferiblemente, el anticuerpo disminuye o inhibe la unión de TIGIT humana a PVR o PVRL2 en relación con el nivel de unión en ausencia del anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo induce la producción de IL-2 y/o IFNγ por PBMC estimuladas con enterotoxina A estafilocócica (SEA).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico, un agente citostático, una toxina, un radionúclido o un marcador detectable. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se entrecruza con un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo.
La presente divulgación proporciona un fragmento de unión a antígeno aislado del anticuerpo divulgado en el presente documento, en el que el fragmento de unión a antígeno se une específicamente a TIGIT humana.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se divulga en el presente documento, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que codifica la VH y la VL o la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un vector que comprende un polinucleótido como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido o vector como se divulga en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a la TIGIT humana, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo el método cultivar una célula huésped como se divulga en el presente documento de manera que el polinucleótido se exprese y el anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno, se produce.
Se describe un método para aumentar la activación de células T en respuesta a un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica como se divulga en el presente documento. Se divulga un método para disminuir o inhibir la actividad Treg en respuesta a un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica como se divulga en el presente documento. Se divulga un método para aumentar la activación de células NK en respuesta a un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica como se divulga en el presente documento. Se divulga un método para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica como se divulga en el presente documento.
La presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula huésped de la invención o la composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. En ciertas realizaciones, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica se administra por vía intravenosa a 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg o más, opcionalmente a un intervalo de una vez cada tres semanas.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la composición farmacéutica se administra por vía intratumoral. En determinadas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la composición farmacéutica se administran por vía intratumoral a 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg o más, opcionalmente en un intervalo de una vez cada tres semanas.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. En determinadas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno o la composición farmacéutica se administra a un ganglio linfático que drena el tumor.
En ciertas realizaciones, un uso divulgado en el presente documento comprende además administrar un agente terapéutico adicional al sujeto. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional se administra sistémicamente. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un tumor sólido y el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo anti-PD-1, en el que opcionalmente el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab o nivolumab.
En ciertas realizaciones, el sujeto tiene carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y en donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-EGFR, opcionalmente en donde el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab, opcionalmente en donde el uso comprende además administrar un agente quimioterapéutico al sujeto, opcionalmente en donde el agente quimioterapéutico se administra sistémicamente y opcionalmente en donde el agente quimioterapéutico es gemcitabina.
En ciertas realizaciones, el sujeto tiene cáncer de mama HER2+ y en donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-HER2, opcionalmente en donde el anticuerpo anti-HER2 es trastuzumab, opcionalmente en donde el uso comprende además administrar un agente quimioterapéutico al sujeto, opcionalmente en donde el agente quimioterapéutico se administra sistémicamente, opcionalmente en donde el agente quimioterapéutico es gemcitabina. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico o un agente dirigido a puntos de control. En determinadas realizaciones, el agente orientado a puntos de control se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-TIM-3 antagonista, un anticuerpo anti-LAG-3 antagonista, un anticuerpo VISTA antagonista, un anticuerpo CD96 antagonista, un anticuerpo anti-CEACAM1antagonista, un anticuerpo anti-CD137 agonista, un anticuerpo anti-GITR agonista, y un anticuerpo anti-OX40 agonista.
En determinadas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO). En ciertas realizaciones, el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en epacadostat, F001287, indoximod y NLG919.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional es una vacuna. En ciertas realizaciones, la vacuna comprende un complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC) que comprende una proteína de choque térmico complejada con un péptido antigénico. En determinadas realizaciones, la proteína de choque térmico es hsc70 y forma un complejo con un péptido antigénico asociado a un tumor. En determinadas realizaciones, la proteína de choque térmico es la proteína gp96 y forma un complejo con un péptido antigénico asociado a un tumor, en donde el HSPPC se deriva de un tumor obtenido de un sujeto.
Se divulga un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o composición farmacéutica como se divulga en el presente documento.
4. Breve descripción de los dibujos
Figuras 1A-1D son una serie de sensogramas de resonancia de plasmón superficial (SPR) que muestran la unión del anticuerpo anti-TIGIT BA002 a la proteína TIGIT purificada. Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran la unión de TIGIT-Fc dimérica humana, TIGIT-Fc dimérica de cynomolgus y TIGIT-His monomérica humana, respectivamente, a BA002 capturado. La Figura 1D muestra la unión de BA002 (en formato Fab) a la proteína TIGIT-Fc dimérica humana capturada. En cada sensograma, las unidades de respuesta (RU) se representan frente al tiempo después de la inyección de proteína.
Figuras 2A-2D son una serie de gráficos que muestran la unión del anticuerpo anti-TIGIT BA002 o un IgG1 anticuerpo de control de isotipo de IgG1 para células que expresan TIGIT humana de superficie celular o TIGIT de mono cynomolgus. Los niveles de unión de BA002 o un anticuerpo de control de isotipo de IgG1 a células Jurkat modificadas para expresar TIGIT humana (Figura 2A), células T CD4+ CD25+ primarias activadas (Figura 2B), células T CD8+ CD25+ primarias activadas (Figura 2C) o células CHO modificadas para expresar TIGIT de cynomolgus (Figura 2D), según lo evaluado por la intensidad de fluorescencia media (MFI), se representan frente a las concentraciones de BA002 incubados con las células.
Figuras 3A-3B son una serie de histogramas y gráficos que muestran que BA002 no se unió a los miembros de la familia CD96 y CD226 relacionados con TIGIT. Los niveles de unión de BA002 o un anticuerpo de control de isotipo de IgG1 a células Jurkat modificadas para expresar TIGIT, CD96 y CD226 humanos (Figura 3A) o solo CD96 y CD226 (Figura 3B), según lo evaluado por la intensidad de fluorescencia mediana (MFI), son representado frente a las concentraciones de BA002 incubados con las células.
Figuras 4A-4F son una serie de gráficos que muestran que BA002 interrumpió la unión entre TIGIT y su ligando, CD155/PVR, a niveles comparables o mayores que un panel de anticuerpos anti-TIGIT de referencia.
Figuras 5A-5F son una serie de gráficos que muestran que BA002 interrumpió la unión entre TIGIT y su ligando, CD112/PVRL2, a niveles comparables o mayores que un panel de anticuerpos anti-TIGIT de referencia.
Figura 6 es un gráfico que muestra que BA002 mejoró la secreción de interferón-y (IFNy) por PBMC estimuladas por SEA en mayor grado que los anticuerpos anti-TIGIT de referencia, y que la combinación de BA002 y un anticuerpo anti-PD-1 mejoró aún más la secreción de IFNy por PBMC estimuladas por SEA más allá de lo observado para BA002 solo. El grado de mejora observado en la combinación anti-PD-1 también fue mayor para BA002 que para los anticuerpos anti-TIGIT de referencia.
Figuras 7A-7B son una serie de gráficos que muestran que la combinación de BA002 con un anticuerpo anti-CTLA-4 mejoró la secreción de interleucina-2 (IL-2) por PBMC estimuladas con SEA de dos donantes diferentes, en comparación con los controles de isotipo.
Figuras 8A-8D son una serie de gráficos que muestran que BA006 se unió a células que expresan TIGIT humana y TIGIT de mono cynomolgus, y que BA006 no se unió a los miembros de la familia relacionados CD96 y CD226. BA006 se unió a células T CD4+ humanas primarias activadas (Figura 8A) y a células CHO modificadas para expresar TIGIT de cynomolgus (Figura 8B). BA006 se unió a células Jurkat que expresan TIGIT, CD96 y CD226 (Figura 8C), pero no se unió a células Jurkat que expresan CD96 y CD226 solos (Figura 8D). En cada gráfico, la intensidad de fluorescencia media (MFI) se representa frente a la concentración de anticuerpos.
Figuras 9A-9D son una serie de gráficos que muestran que las variantes Fc de BA002 mejoraron aún más la secreción de citoquinas de PBMC (Figuras 9A-9B) y la activación de células T, según lo medido por la regulación positiva de CD25 (Figuras 9C-9D). Las variantes Fc de BA002 también mostraron una mejora adicional de la secreción de citoquinas y la activación de células T cuando se combinaron con un anticuerpo anti-PD-1.
Figuras 10A-10E son una serie de gráficos que muestran que BA002 y sus variantes Fc potenciaron la secreción de IL-2 en PBMC estimuladas con SEA de cinco donantes distintos de una manera dependiente de la dosis. En un donante, BA002, las variantes Fc BA006 y BA005, y una forma afucosilada de BA002 (BA002_AF) mejoraron la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA (Figura 10A). En un segundo donante, la combinación de BA002 o una variante del mismo con un anticuerpo anti-PD-1 también potenció la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA (Figura 10B). BA006 y BA002 mejoraron la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA de un tercer donante en presencia de CD155-Fc (Figura 10C). Las Figuras 10D y 10E muestran la activación dependiente de la dosis por BA006 de PBMC de dos donantes diferentes en presencia de una concentración baja (10 ng/mL) de SEA. Figuras 11A-11B son una serie de gráficos que muestran que BA002 y sus variantes potenciaron la secreción de IFNy por PBMC estimuladas con SEA de dos donantes diferentes, en relación con los anticuerpos de control de isotipo. Figuras 12A-12B son una serie de gráficos que muestran la capacidad de diversas variantes de Fc del anticuerpo anti-TIGIT BA002 para señalar a través de FcyRIIA (Figura 12A) o FcyRIIIA (Figura 12B) cuando se acoplan conjuntamente con células objetivo que expresan TIGIT (células Jurkat modificadas para expresar TIGIT humana). En la Figura 12A, controles de isotipo para BA002 (es decir, isotipo 002) y cada variante (es decir, isotipo 003, isotipo 005, isotipo 006 e isotipo 007) solo se analizaron con la concentración de anticuerpos más alta (es decir, 1000ng/mL). En la Figura 12B, los controles de isotipo solo se analizaron en las dos concentraciones de anticuerpos más altas (es decir, 30 y 10 ng/mL).
Figuras 13A-13B son dos series de gráficos que muestran que BA002 y sus variantes promovieron la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células que expresan TIGIT. Porcentaje de matanza celular de células Jurkat que expresan TIGIT en cuatro puntos de tiempo (0 horas, 1 hora, 2 horas y 3 horas) después de la incubación con anticuerpos en tres concentraciones diferentes (0,1 µg/mL, 1 µg/mL y 10 µg/ mL) se muestra en la Figura 13A. En la Figura 13B se muestra la orientación preferencial de las células T reguladoras por BA002 y BA006 para la ADCC mediada por células NK en un entorno de cocultivo, en comparación con las células T efectoras activadas.
Figura 14 es un gráfico que muestra que los anticuerpos anti-TIGIT BA002 y BA006 mejoraron la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA, exhibiendo BA006 una mejora sustancialmente mayor de la secreción de IL-2 que los anticuerpos anti-TIGIT de referencia.
Figuras 15A-15I son una serie de gráficos que muestran que los anticuerpos anti-TIGIT BA002 y BA006 pueden combinarse eficazmente con un anticuerpo anti-PD-1 antagonista (Figura 15A), un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista (Figuras 15B y 15C), un anticuerpo anti-CD137 antagonista (Figura 15D), un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista (Figura 15E), un anticuerpo anti-LAG-3 antagonista (Figura 15F y 15G), o un anticuerpo anti-OX40 agonista (Figuras 15H y 15I) para promover la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA.
Figuras 16A-16B son una serie de gráficos que muestran la producción de IL-2 (Figura 16A) e IFNy (Figura 16B) a partir de PBMC de cynomolgus después de la incubación con BA002 o BA006 en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-PD-1. Los anticuerpos de control de isotipo para BA002 y BA006 son "Isotipo.G1" e "Isotipo.3M", respectivamente. El anticuerpo de control de isotipo para el anticuerpo anti-PD-1 es "Isotipo.G4".
Figuras 17A-17F son una serie de gráficos e histogramas que muestran el efecto de los anticuerpos anti-TIGIT en la recuperación de células T de memoria mediada por MHC de clase I. La Figura 17A es un gráfico que muestra la producción de interferón gamma (IFNy) a lo largo del tiempo por PBMC reactivas con CMV estimuladas con el péptido pp65 de CMV y BA002 o BA006. La Figura 17B es un conjunto de histogramas representativos que muestran la expresión de TIGIT, CD226 y CD96 en células T de memoria efectoras CD8 activadas (área gris; las líneas negras con rellenos blancos indican tinción de células con anticuerpos de control de isotipo). Las Figuras 17C y 17D muestran la producción de IFNy y TNFα, respectivamente, a partir de las PBMC estimuladas. Las Figuras 17E y 17F muestran el porcentaje de células en proliferación, como indica la tinción positiva de Ki67, en la población de células T de memoria efectoras CD8 y la población de células T de memoria efectoras CD4 de PBMC estimuladas.
Figuras 18A-18D son una serie de gráficos que muestran el efecto de los anticuerpos anti-TIGIT en la recuperación de células T de memoria mediada por MHC de clase II. Las Figuras 18A y 18B son gráficos representativos de tres donantes seropositivos para CMV que muestran los niveles de expresión de TIGIT en subconjuntos de células T CD4 y células T CD8 de PBMC reactivas con CMV estimuladas con antígeno completo de CMV, que se sabía que se procesaban y presentaban principalmente en MHC de clase II. Las Figuras 18C y 18D muestran la producción de IFNγ por PBMC de dos donantes diferentes en presencia o ausencia de BA002, BA006, un anticuerpo de referencia anti-TIGIT y/o un anticuerpo anti-PD-1.
Figura 19 es un gráfico que muestra el porcentaje de matanza de células tumorales que expresan NY-ESO-1 a lo largo del tiempo por células T humanas primarias cocultivadas que expresan un TCR NY-ESO-1 en presencia o ausencia de BA002 o su anticuerpo de control de isotipo ("Isotipo IgG1 "), BA006 o su anticuerpo de control de isotipo ("Isotipo IgG1-3M"), o un anticuerpo anti-PD-1 o su anticuerpo de control de isotipo ("Isotipo IgG4"), ya sea solo o en combinación, medido por formación de imágenes de células vivas, en relación con el número de células tumorales en el momento de la adición de las células T.
Figuras 20A-20G muestran los efectos de los anticuerpos anti-TIGIT sobre la activación de las células NK. La Figura 20A es una serie de gráficos que muestran los parámetros de activación para identificar células NK de la población de PBMC y un histograma que muestra la distribución del marcador de activación de CD107a. Las Figuras 20B-20G son una serie de gráficos que muestran el porcentaje de células positivas para CD107a (Figuras 20B y 20E), IFNy (Figuras 20C y 20F) y TNFα (Figuras 20D y 20G) de todas las células NK en la población de PBMC, después de la incubación de la población de PBMC con los anticuerpos indicados solos (Figuras 20B-20D) o en un cultivo conjunto con células K562 (Figuras 20E-20G). "Ref. 1 IgG1" se refiere al anticuerpo de referencia #1 en formato IgG1, y "Ref. 1-FcE" se refiere a una variante del anticuerpo de referencia #1 que comprende las sustituciones S239D/A330L/I332E en la región Fc.
Figura 21 es una alineación de secuencias de TIGIT humana (SEQ ID NO: 29) y TIGIT de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 70). Las regiones del epítopo BA002 identificadas por espectrometría de masas de intercambio de hidrógenodeuterio (HDX) se indican en negrita y subrayadas, y las diferencias entre las secuencias humana y de cynomolgus en estas regiones se muestran sin subrayar. El péptido señal y los dominios transmembrana de TIGIT se indican con recuadros.
Figuras 22A-22B son diagramas de cinta que muestran la estructura de la proteína TIGIT humana con residuos de aminoácidos específicos resaltados. La Figura 22A muestra los residuos de aminoácidos en las regiones del epítopo BA002 de TIGIT, identificadas por HDX, frente a la superficie de unión a PVR de la proteína. La Figura 22B muestra Q35, I47, H90, T96 y N49, que pueden constituir un epítopo conformacional unido por BA006.
Figuras 23A-23F son una serie de gráficos que muestran la inhibición de la progresión del tumor por un anticuerpo anti-TIGIT en un modelo de ratón con xenoinjerto en el que los anticuerpos de prueba se administraron en una etapa temprana de la progresión del tumor. Los volúmenes tumorales medios se representan frente al tiempo en la Figura 23A, y los volúmenes tumorales de cada ratón individual se representan frente al tiempo en las Figuras 23B-23F (n=5 por grupo de tratamiento).
Figuras 24A-24G son una serie de gráficos que muestran la inhibición de la progresión tumoral por varios anticuerpos anti-TIGIT sustitutos en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 en un modelo de ratón con xenoinjerto en el que los anticuerpos de prueba se administraron en una etapa temprana de la progresión tumoral. Los volúmenes tumorales medianos se representan frente al tiempo en las Figuras 24A y 24B (con diferentes escalas en el eje y), y los volúmenes tumorales de cada ratón individual se representan frente al tiempo en las Figuras 24C-24G (n=5 por grupo de tratamiento). Los anticuerpos sustitutos "anti-TIGIT mIgG2a", "anti-TIGIT mIgG2a-N297Q", "anti-TIGIT mIgG1" y "anti-TIGIT mIgG2 (potenciado con Fc)" difieren solo en sus regiones Fc de acuerdo con sus nombres.
Figuras 25A-25E son una serie de gráficos que muestran la inhibición de la progresión tumoral por el anticuerpo sustituto mIgG2a anti-TIGIT ("anti-TIGIT mIgG2a") o su anticuerpo de control de isotipo (" Control 1 de Isotipo"), o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) ("anti-TIGIT TIGIT mIgG2 (potenciado con Fc)") o su anticuerpo de control de isotipo ("Control 2 de Isotipo"), en un modelo de ratón con xenoinjerto en el que los anticuerpos de prueba se administraron en una etapa tardía de la progresión del tumor. Los volúmenes tumorales medios se representan frente al tiempo en la Figura 25A, y los volúmenes tumorales de cada ratón individual se representan frente al tiempo en las Figuras 25B-25E (n=10 por grupo de tratamiento). La línea de puntos en las Figuras 25B-25E representa un estándar para sacrificar ratones que tienen volúmenes de tumor superiores a 2000 mm3.
Figuras 26A-26B son una serie de gráficos que muestran la inhibición de la progresión tumoral por el anticuerpo sustituto mIgG2a anti-TIGIT ("anti-TIGIT mIgG2a") o su anticuerpo de control de isotipo (" Control 1 de Isotipo"), o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) ("anti-TIGIT TIGIT mIgG2 (potenciado con Fc)") o su anticuerpo de control de isotipo ("Control 2 de Isotipo"), en combinación con otro anticuerpo modulador de punto de control en un modelo de ratón con xenoinjerto en el que los anticuerpos de prueba se administraron en una etapa tardía de la progresión del tumor. Los volúmenes tumorales medios de los ratones tratados con un anticuerpo anti-TIGIT y un anticuerpo anti-PD-1 (Figura 26A) o un anticuerpo anti-CTLA-4 (Figura 26B) se representan frente al tiempo (n=10 por grupo de tratamiento para cada figura).
Figuras 27A-27F son una serie de gráficos que muestran un diseño de estudio y comparaciones de las cantidades de subconjuntos de células T en tumores y ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) en un modelo con xenoinjerto de ratón después de la administración del anticuerpo sustituto anti-TIGIT mIgG2a ("anti-TIGIT mIgG2a") o su anticuerpo de control de isotipo ("Control 1 de Isotipo"), o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) ("anti-TIGIT mIgG2 (potenciado con Fc)") o su anticuerpo de control de isotipo ("Control 2 de Isotipo"). Se usó un anticuerpo anti-GITR agonista ("DTA-1 (mIgG2a)") como control positivo para el agotamiento de las células T reguladoras. La Figura 27A ilustra el diseño del estudio. Los cambios relativos en las cantidades de células T reguladoras FoxP3+ intratumorales (Tregs) (Figura 27B), no-Tregs CD4+ intratumorales (Figura 27C), Tregs FoxP3+ en los ganglios linfáticos que drenan el tumor (TDLN) (Figura 27D) y células T CD8+ intratumorales (Figura 27E) se representan frente al tiempo posterior a la inyección del anticuerpo anti-TIGIT. Las proporciones de células T CD8+ intratumorales a Tregs intratumorales se muestran en la Figura 27F (n=4 por grupo de tratamiento y punto de tiempo).
Figuras 28A-28C son una serie de gráficos que muestran la participación de FcyRIV en la activación de células T mediada por anticuerpos anti-TIGIT. La Figura 28A muestra los resultados de ensayos de reportero de luciferasa basados en células que examinaron el efecto de diversas concentraciones de anticuerpo sustituto anti-TIGIT mIgG2a ("anti-TIGIT mIgG2a") o su anticuerpo de control de isotipo ("Control 1 de Isotipo"), o anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) ("anti-TIGIT mIgG2 (potenciado con Fc)") o su anticuerpo de control de isotipo (" Control 2 de Isotipo") sobre la activación de células T efectoras en un cocultivo de células T efectoras que expresan FcyRIV y células CHO que expresan TIGIT murinas. La actividad relativa de luciferasa (RLU) se representa frente a la concentración de anticuerpos. Las Figuras 28B y 28C muestran los resultados de un ensayo de activación inmune murino in vivo que examinó el efecto de anti-TIGIT mIgG2a o un anticuerpo mIgG2 anti-CTLA-4 ("anti-CLTA-4 mIgG2a") en la proliferación de células T CD4+ (Figuras 28B) y CD8+ (Figuras 28C) en respuesta al superantígeno SEB en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-FcyRIV (n=4 ratones por grupo, datos representativos de al menos dos experimentos independientes). La proliferación se determinó analizando el porcentaje de células T Ki67+ mediante citometría de flujo.
5. Descripción detallada
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y antagonizar la función TIGIT, por ejemplo, supresión inmune mediada por TIGIT. La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresión y células huésped para producir estos anticuerpos, y anticuerpos para usar en el tratamiento de un sujeto usando estos anticuerpos como se especifica en las reivindicaciones. Los anticuerpos descritos en el presente documento son particularmente útiles para aumentar la activación de células T y células NK en respuesta a un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno de enfermedad infecciosa) y, por lo tanto, son útiles para tratar el cáncer en un sujeto o tratar o prevenir una enfermedad infecciosa en un sujeto. Todos los casos de "anticuerpos aislados" descritos en el presente documento se contemplan adicionalmente como anticuerpos que pueden aislarse, pero no necesariamente. Todos los casos de "polinucleótidos aislados" descritos en el presente documento se contemplan adicionalmente como polinucleótidos que pueden aislarse, pero no necesariamente. Todos los casos de "anticuerpos" descritos en el presente documento se contemplan adicionalmente como anticuerpos que pueden aislarse, pero no necesariamente. Todos los casos de "polinucleótidos" descritos en el presente documento se contemplan adicionalmente como polinucleótidos que pueden aislarse, pero no necesariamente.
5.1 Definiciones
Como se usa en el presente documento, los términos "aproximadamente" y "aproximadamente", cuando se usan para modificar un valor numérico o un intervalo numérico, indican que las desviaciones del 5 % al 10 % por encima de (por ejemplo, hasta 5 % a 10 % por encima) y 5 % a 10 % por debajo (por ejemplo, hasta 5 % a 10 % por debajo) el valor o intervalo permanece dentro del significado pretendido del valor o intervalo mencionado.
Como se usa en el presente documento, el término "TIGIT" se refiere al inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (también conocido como VSIG9 o VSTM3) que en humanos está codificado por el gen TIGIT. Como se usa en el presente documento, el término "TIGIT humana" se refiere a una proteína TIGIT codificada por un gen TIGIT humano de tipo silvestre (por ejemplo, GenBank™ número de acceso NM_173799.3) o un dominio extracelular de dicha proteína. Se proporciona una secuencia de aminoácidos de ejemplo de una proteína TIGIT humana inmadura como la SEQ ID NO: 29. Se proporciona una secuencia de aminoácidos de ejemplo de una proteína TIGIT humana madura como la SEQ ID NO: 40. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de un dominio extracelular de una proteína TIGIT humana madura se proporcionan como las SEQ ID NOs: 30, 41 y 42.
Como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" incluyen anticuerpos de longitud completa, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos de longitud completa y moléculas que comprenden CDR de anticuerpos, regiones VH y/o regiones VL. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (incluyendo los anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, inmunoglobulinas, anticuerpos sintéticos, anticuerpos tetraméricos que comprenden dos moléculas de cadena pesada y dos de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena pesada de anticuerpo-cadena ligera de anticuerpo, intracuerpos, anticuerpos heteroconjugados, conjugados anticuerpo-fármaco, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos monovalentes, anticuerpos de cadena simple o Fv de cadena simple (scFv), anticuerpos camellizados, afficuerpo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, Fv enlazados por disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-anti-Id), y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se refieren a poblaciones de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo. (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY), cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a o IgG2b) de la molécula de inmunoglobulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos IgG o una clase (por ejemplo, IgG1 o IgG4 humana) o subclase del mismo. En una realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado. En otra realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.
Como se usa en el presente documento, los términos "región VH" y "región VL" se refieren, respectivamente, a regiones variables de cadena pesada y ligera de un solo anticuerpo, que comprenden FR (Regiones marco) 1, 2, 3 y 4 y CDR (Regiones determinantes de complementariedad) 1, 2 y 3 (véase Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Publicación NIH No.91-3242, Bethesda)).
Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" se refiere a los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem.
252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)), donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. En ciertas realizaciones, el término "CDR" es una CDR como se define por MacCallum et al., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)) y Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", en Antibody Engineering, Kontermann y Dübel, eds., Capítulo 31, págs. 422-439, Springer-Verlag, Berlín (2001).). En ciertas realizaciones, el término "CDR" es una CDR como se define por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991). En ciertas realizaciones, las CDR de cadena pesada y las CDR de cadena ligera de un anticuerpo se definen usando diferentes convenciones. En determinadas realizaciones, las CDR de cadena pesada y/o las CDR de cadena ligera se definen realizando un análisis estructural de un anticuerpo e identificando residuos en las regiones variables previstas para hacer contacto con una región epitópica de una molécula objetivo (por ejemplo, TIGIT humana y/o o de cynomolgus). CDRH1, CDRH2 y CDRH3 indican las CDR de cadena pesada, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 indican las CDR de cadena ligera.
Como se usa en el presente documento, el término "residuos de aminoácidos marco (FR)" se refiere a aquellos aminoácidos en la región marco de una cadena de inmunoglobulina. El término "región marco" o "región FR", como se usa en el presente documento, incluye los residuos de aminoácidos que forman parte de la región variable, pero no forman parte de las CDR (por ejemplo, utilizando la definición de CDR de Kabat o MacCallum).
Como se usa en el presente documento, los términos "región variable" y "dominio variable" se usan indistintamente y son comunes en la técnica. La región variable típicamente se refiere a una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente aproximadamente 110 a 120 aminoácidos amino-terminales o 110 a 125 aminoácidos en la cadena pesada madura y aproximadamente 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera madura, que difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que las regiones más conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Sin pretender limitarse a ningún mecanismo o teoría en particular, se cree que las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno. En ciertas realizaciones, la región variable es una región variable humana. En ciertas realizaciones, la región variable comprende CDR de roedor o murino y regiones marco (FR) humanas. En realizaciones particulares, la región variable es una región variable de primate (por ejemplo, primate no humano). En ciertas realizaciones, la región variable comprende CDR de roedor o murino y regiones marco (FR) de primate (por ejemplo, primates no humanos).
Los términos "VL" y "dominio VL" se usan indistintamente para referirse a la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo.
Los términos "VH" y "dominio VH" se usan indistintamente para referirse a la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, los términos "región constante" y "dominio constante" son intercambiables y comunes en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo, por ejemplo, una porción carboxilo terminal de una cadena ligera y/o pesada que no está directamente involucrada en la unión de un anticuerpo a un antígeno pero que puede exhibir diversas funciones efectoras, tal como la interacción con un receptor Fc (por ejemplo, receptor gamma Fc). La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada en relación con un dominio variable de inmunoglobulina.
Como se usa en el presente documento, el término "cadena pesada" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gamma (γ) y mu (µ), con base en la secuencia de aminoácidos del dominio constante, que dan lugar a IgA, IgD, IgE, IgG y clases IgM de anticuerpos, respectivamente, incluyendo las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Como se usa en el presente documento, el término "cadena ligera" cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, kappa (κ) o lambda (λ) con base en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
Como se usa en el presente documento, el término "sistema de numeración de la EU" se refiere a la convención de numeración de la EU para las regiones constantes de un anticuerpo, como se describe en Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Estados Unidos, 63, 78-85 (1969) y Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 5.ª edición, 1991.
La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente se puede representar mediante la constante de disociación (KD). La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, la constante de disociación en equilibrio (KD), y constante de asociación de equilibrio (KA). La KD se calcula a partir del cociente de kapagado/kencendido, mientras que KA se calcula a partir del cociente de kencendido/kapagado. kencendido se refiere a la constante de tasa de asociación de, por ejemplo, un anticuerpo contra un antígeno, y kapagado se refiere a la constante de tasa de disociación de, por ejemplo, un anticuerpo contra un antígeno. La kencendido y kapagado pueden determinarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tal como BIAcore® o KinExA. Como se usa en el presente documento, una "afinidad más baja" se refiere a una mayor KD.
Como se usa en el presente documento, los términos "se une específicamente", "reconoce específicamente", "se une inmunoespecíficamente" y "reconoce inmunoespecíficamente" son términos análogos en el contexto de anticuerpos y se refieren a moléculas que se unen a un antígeno (por ejemplo, epítopo o inmunocomplejo) tal como lo entenderá un experto en la técnica. Por ejemplo, una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos, generalmente con menor afinidad según lo determinado por, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID), u otros ensayos conocidos en la técnica. En una realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno se unen al antígeno con una KA eso es al menos 2 registros (por ejemplo, factores de 10), 2.5 logaritmos, 3 logaritmos, 4 logaritmos o más que el KA cuando las moléculas se unen de forma no específica a otro antígeno.
En otra realización específica, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas en condiciones de unión similares. En otra realización específica, las moléculas que se unen específicamente a TIGIT no reaccionan de forma cruzada con otras proteínas que no son TIGIT. En una realización específica, en el presente documento se proporciona un anticuerpo que se une a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humano) con mayor afinidad que a otro antígeno no relacionado. En el presente documento se divulga un anticuerpo que se une a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana) con 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor afinidad que a otro antígeno no relacionado, medido por, por ejemplo, un radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial o ensayo de exclusión cinética. En una divulgación específica, el grado de unión de un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento a una proteína que no es TIGIT no relacionada es inferior al 10 %, 15 % o 20 % de la unión del anticuerpo a la proteína TIGIT medida por, por ejemplo, un radioinmunoensayo.
Como se usa en el presente documento, un "epítopo" es un término en la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que se puede unir específicamente un anticuerpo. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, por ejemplo, provenir de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (conformacionales, no lineales, epítopo discontinuo o no contiguo). En determinadas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo puede determinarse mediante, por ejemplo, Espectroscopía de RMN, estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas por electropulverización por cromatografía líquida), ensayos de escaneo de oligopéptidos basados en matrices (por ejemplo, péptidos restrictivos usando CLIPS (Chemical Linkage of Peptides on Scaffolds) para mapear epítopos discontinuos o conformacionales), y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo: antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando software de ordenador tales como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; EE. UU. 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 y Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 para obtener una descripción de las técnicas de mutagénesis, incluyendo las técnicas de mutagénesis por escaneo de alanina. CLIPS (Chemical Linkage of Peptides on Scaffolds) es una tecnología para presentar uno o más péptidos en una configuración estructuralmente restringida para comportarse como miméticos funcionales de dominios proteicos complejos. Véase, por ejemplo, Publicación de EE. UU. Nos US 2008/0139407 A1 y US 2007/099240 A1, y Patente de EE. UU. No. 7,972,993. En una realización específica, el epítopo de un anticuerpo se determina usando estudios de mutagénesis de barrido de alanina. En una realización específica, el epítopo de un anticuerpo se determina utilizando intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas. En una realización específica, el epítopo de un anticuerpo se determina utilizando la tecnología de mapeo de epítopos CLIPS de Pepscan Therapeutics. En una realización específica, el epítopo de un anticuerpo se determina mediante mutagénesis de proteínas, por ejemplo, generando mutantes de cambio de un antígeno con porciones de su ortólogo de otra especie y luego analizando los mutantes de cambio para determinar la pérdida de unión del anticuerpo (por ejemplo, mediante un ensayo de unión celular basado en FACS, como se describe en el presente documento).
Como se usa en el presente documento, el término "un epítopo ubicado dentro" de una región de TIGIT humana se refiere a un epítopo que comprende uno o más de los residuos de aminoácidos de la región especificada. En cierta divulgación, el epítopo comprende cada uno de los residuos de aminoácidos ubicados dentro de la región especificada. En cierta divulgación, el epítopo consiste en cada uno de los residuos de aminoácidos ubicados dentro de la región especificada. En cierta divulgación, uno o más residuos de aminoácidos adicionales de TIGIT humana fuera de la región especificada se unen a un anticuerpo junto con un epítopo ubicado dentro de la región especificada.
Como se usa en el presente documento, la unión entre un anticuerpo de prueba y un primer antígeno se "debilita sustancialmente" en relación con la unión entre el anticuerpo de prueba y un segundo antígeno si la unión entre el anticuerpo de prueba y el primer antígeno se reduce en al menos 30 %. 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en relación con la unión entre el anticuerpo de prueba y el segundo antígeno, por ejemplo, en un experimento dado, o usando valores medios de múltiples experimentos, según lo evaluado, por ejemplo, un ensayo de unión divulgado en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, los términos "receptor de células T" y "TCR" se usan indistintamente y se refieren a TCR αβ o γδ heterodiméricos de longitud completa, fragmentos de unión a antígeno de TCR de longitud completa y moléculas que comprenden TCR CDR o regiones variables. Los ejemplos de los TCR incluyen, entre otros, los TCR de longitud completa, fragmentos de unión a antígeno de los TCR de longitud completa, los TCR solubles que carecen de regiones transmembrana y citoplásmicas, los TCR de cadena única que contienen regiones variables de los TCR unidos por un conector flexible, cadenas de los TCR unidas mediante un enlace disulfuro modificado, los TCR monoespecíficos, los TCR multiespecíficos (incluyendo los TCR biespecíficos), las fusiones de TCR, los TCR humanos, los TCR humanizados, los TCR quiméricos, los TCR producidos de forma recombinante y los TCR sintéticos. El término abarca los TCR de tipo silvestre y los TCR modificados genéticamente. (por ejemplo, un TCR quimérico que comprende una cadena de TCR quimérico que incluye una primera porción de un TCR de una primera especie y una segunda porción de un TCR de una segunda especie).
Como se usa en el presente documento, los términos "complejo mayor de histocompatibilidad" y "MHC" se usan indistintamente y se refieren a una molécula de MHC de clase I y/o una molécula de MHC de clase II.
Como se usa en el presente documento, el término "complejo de péptido-MHC" se refiere a una molécula de MHC (MHC de clase I o MHC de clase II) con un péptido unido en el bolsillo de unión de péptido reconocido en la técnica del MHC.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar", "que trata" y "tratamiento" se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en el presente documento. Los métodos de "tratamiento" emplean la administración de un anticuerpo a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno, o está predispuesto a tener dicha enfermedad o trastorno, para prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o enfermedad o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de una terapia a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que logra un efecto profiláctico o terapéutico deseado.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. En una realización, el sujeto es un mamífero humano o no humano. En una realización, el sujeto es un ser humano.
La determinación del "porcentaje de identidad" entre dos secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo específico, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin S y Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modificado como en Karlin S y Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST establecidos, por ejemplo, para puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el conjunto de parámetros del programa XBLAST, por ejemplo, para puntuar 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineaciones con espacios con fines de comparación, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389-3402. Alternativamente, PSI BLAST se puede usar para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, de XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar (véase, por ejemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) en la web mundial, ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo específico, no limitativo, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11-17. Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de intervalo de 12 y una penalización de intervalo de 4.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin permitir espacios. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente solo se cuentan las coincidencias exactas.
5.2 Anticuerpos anti-TIGIT
En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y antagonizan la función de TIGIT. Las secuencias de aminoácidos de los ejemplos de anticuerpos se exponen en la Tabla 1 del presente documento.
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-TIGIT eem lares.
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Tabla 2. Genes de línea erminal más cercanos a los anticuer os anti-TIGIT eem lares.
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Tabla 3. Secuencias eem lares de TIGIT.
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En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende una, dos o las tres CDR de un dominio VH establecidas en Tabla 1 en el presente documento. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRH1 de un dominio VH expuesto en la Tabla 1. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRH2 de un dominio VH expuesto en la Tabla 1. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRH3 de un dominio VH expuesto en la Tabla 1.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo un dominio VL que comprende una, dos o las tres CDR de un dominio VL divulgado en la Tabla 1 en el presente documento. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRL1 de un dominio VL expuesto en la Tabla 1. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRL2 de un dominio VL expuesto en la Tabla 1. En cierta divulgación, el anticuerpo comprende el CDRL3 de un dominio VL expuesto en la Tabla 1.
En cierta divulgación, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con Kabat et al., J. Biol. Chem.
252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest (1991). En cierta divulgación, las CDR de cadena ligera de un anticuerpo se determinan de acuerdo con Kabat y las CDR de cadena pesada de un anticuerpo se determinan de acuerdo con MacCallum (supra). En cierta divulgación, las CDR de cadena pesada y/o las CDR de cadena ligera se definen realizando un análisis estructural de un anticuerpo e identificando residuos en las regiones variables previstas para hacer contacto con una región epitópica de una molécula objetivo (por ejemplo, TIGIT humana y/o de cynomolgus).
En cierta divulgación, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de los bucles estructurales de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; y Patente de EE. UU. No.
7,709,226). Por lo general, cuando se usa la convención de numeración de Kabat, el bucle Chothia CDRH1 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 26 a 32, 33 o 34, el bucle Chothia CDRH2 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 52 a 56 y el bucle Chothia CDRH3 está presente en los aminoácidos de cadena pesada 95 a 102, mientras que el bucle Chothia CDRL1 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 24 a 34, el bucle Chothia CDRL2 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 50 a 56, y el bucle Chothia CDRL3 está presente en los aminoácidos de cadena ligera 89 a 97. El final del bucle Chothia CDRH1 cuando se numera utilizando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 según la longitud del bucle (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca las inserciones en H35A y H35B; si no están presentes ni 35A ni 35B, el bucle termina en 32; si solo está presente 35A, el bucle termina en 33; si están presentes tanto 35A como 35B, el bucle termina en 34).
En cierta divulgación, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Véase también, por ejemplo, Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", en Antibody Engineering, Kontermann y Dübel, eds., Capítulo 31, págs.422-439, Springer-Verlag, Berlín (2001).).
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo las CDR de VH de Chothia de una VH divulgada en la Tabla 1 en el presente documento. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo las CDR de VL de Chothia de una VL divulgada en la Tabla 1 en el presente documento. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo las CDR de VH de Chothia y las CDR de VL de Chothia de un anticuerpo divulgado en la Tabla 1 en el presente documento. En cierta divulgación, los anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) comprenden una o más CDR, en donde las CDR de Chothia y Kabat tienen la misma secuencia de aminoácidos. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y comprende combinaciones de CDR de Kabat y CDR de Chothia.
En cierta divulgación, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el sistema de numeración IMGT como se describe en Lefranc MP, (1999) The Immunologist 7: 132-136 y Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. De acuerdo con el esquema de numeración IMGT, CDRH1 está en las posiciones 26 a 35, CDRH2 está en las posiciones 51 a 57, CDRH3 está en las posiciones 93 a 102, CDRL1 está en las posiciones 27 a 32, CDRL2 está en las posiciones 50 a 52 y CDRL3 está en las posiciones 89 a 97.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y comprenden las CDR de un anticuerpo divulgado en la Tabla 1 en el presente documento, según lo determinado por el sistema de numeración IMGT, por ejemplo, como se describe en Lefranc M-P (1999) supra y Lefranc M-P et al., (1999) supra.
En cierta divulgación, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar de acuerdo con el esquema de numeración AbM, que se refiere a las regiones hipervariables de AbM, que representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son utilizadas por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.). En una realización particular, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y comprenden CDR de un anticuerpo divulgado en la Tabla 1 del presente documento según lo determinado por el esquema de numeración de AbM.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de la región CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de un dominio VH expuesto en la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de la región CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de un dominio VL expuesto en la SEQ ID NO: 10, en donde cada CDR se define de acuerdo con la definición de MacCallum, la definición de Kabat, la definición de Chothia, el sistema de numeración IMGT, la definición AbM de CDR, el análisis estructural o una combinación de los mismos, en el que el análisis estructural identifica residuos en las regiones variables previstas para hacer contacto con una región epítopo de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y comprende una combinación de CDR definidas por la definición de Kabat y CDR definidas por análisis estructural del anticuerpo, en donde el análisis estructural identifica residuos en las regiones variables que se prevé que hagan contacto con una región epitópica de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus).
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo:
(a) una CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SYGIS (SEQ ID NO: 1) o GYTFASY (SEQ ID NO: 2); (b) una CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de GITPFFNRVDVAEKFQG (SEQ ID NO: 3) o TPFFNR (SEQ ID NO: 4);
(c) una CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de DLRRGGVGDAFDI (SEQ ID NO: 5);
(d) una CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de TGTSSDVGSHNYVS (SEQ ID NO: 6);
(e) una CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de EVSYRPS (SEQ ID NO: 7); y/o
(f) una CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SSYTPSSATV (SEQ ID NO: 8).
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo:
(a) una CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SYGIS (SEQ ID NO: 1) o GYTFASY (SEQ ID NO: 2); (b) una CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de GITPFFNRVDVAEKFQG (SEQ ID NO: 3) o TPFFNR (SEQ ID NO: 4);
(c) una CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de DLRRGGVGDAFDI (SEQ ID NO: 5);
(d) una CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de TGTSSDVGSHNYVS (SEQ ID NO: 6);
(e) una CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de EVSYRPS (SEQ ID NO: 7); y
(f) una CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SSYTPSSATV (SEQ ID NO: 8).
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en el que el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 establecidas en la SEQ ID NOs: 1, 3 y 5, respectivamente. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 establecidas en las SEQ ID NOs: 2, 4 y 5, respectivamente. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo comprende un dominio VL que comprende las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 establecidas en las SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3, y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde las regiones CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 6, 7 y 8, respectivamente. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende las regiones CDRH1, CDRH2 y CDRH3, y una región variable de cadena ligera que comprende las regiones CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en donde las regiones CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % (por ejemplo, al menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % (por ejemplo, al menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % (por ejemplo, al menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % (por ejemplo, al menos 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69 humana. En cierta divulgación, la secuencia de la línea germinal de IGHV1-69 humana se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de la línea germinal de IGHV1-69*01 humana (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34), una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*06 humana (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35), y una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*12 humana. Una o más regiones seleccionadas del marco 1, marco 2, marco 3, CDRH1 y CDRH2 (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco de estas regiones) pueden derivar de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69 humana. En una realización, el marco 1, el marco 2, el marco 3, CDRH1 y CDRH2 se derivan todos de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69 humana. En cierta divulgación, la región variable de la cadena pesada comprende una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en IGLV2-14 (por ejemplo, IGLV2-14*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, o IGLV2-14*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60), IGLV2-23 (por ejemplo, IGLV2-23*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38), e IGLV2-11 (por ejemplo, IGLV2-11*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39). Una o más regiones seleccionadas del marco 1, marco 2, marco 3, CDRL1 y CDRL2 (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco de estas regiones) se pueden derivar de una secuencia de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en IGLV2-14 (por ejemplo, IGLV2-14*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, o IGLV2-14*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60), IGLV2-23 (por ejemplo, IGLV2-23*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38), e IGLV2-11 (por ejemplo, IGLV2-11*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39). En una realización, el marco 1, el marco 2, el marco 3, CDRL1 y CDRL2 se derivan todos de una secuencia de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en IGLV2-14 (por ejemplo, IGLV2-14*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, o IGLV2-14*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60), IGLV2-23 (por ejemplo, IGLV2-23*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38) e IGLV2-11 (por ejemplo, IGLV2-11*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39). En cierta divulgación, la región variable de la cadena ligera comprende una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal de IGHV1-69 humana (por ejemplo, una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*01 humana (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34), una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*06 humana (por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35), o una secuencia de línea germinal de IGHV1-69*12 humana); y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de línea germinal humana seleccionada del grupo que consiste en IGLV2-14 (por ejemplo, IGLV2-14*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, o IGLV2-14*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60), IGLV2-23 (por ejemplo, IGLV2-23*02, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38) e IGLV2-11 (por ejemplo, IGLV2-11*01, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39). En cierta divulgación, la región variable de la cadena pesada comprende una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, y la región variable de la cadena ligera comprende una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que comprende una región de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34 o 35. En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena ligera que comprende una región de aminoácidos que es al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 37-39 y 60.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que compite de forma cruzada para unirse a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) con un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera expuestas en las SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo o un anticuerpo aislado que se une, por ejemplo, se une específicamente al mismo epítopo de TIGIT humano que un anticuerpo de la presente invención. En cierta divulgación, el epítopo se determina mediante intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), por ejemplo, como se describe en los ejemplos, o mediante mutagénesis de proteínas, por ejemplo, como se describe en los ejemplos.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une al mismo o a un epítopo superpuesto de TIGIT (por ejemplo, un epítopo de TIGIT humana o un epítopo de TIGIT de cynomolgus) como un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera expuestas en las SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente. En cierta divulgación, el epítopo de un anticuerpo puede determinarse mediante, por ejemplo, Espectroscopía de RMN, resonancia de plasmones superficiales (BIAcore®), estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas (por ejemplo, cromatografía líquida, espectrometría de masas por electropulverización), ensayos de barrido de oligopéptidos basados en matriz y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23, Chayen NE (1997) Estructura 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo: antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando software de ordenador tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 y 115, eds Wyckoff HW et al.; Solicitud de Patente de EE.UU. No.
2004/0014194), y BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar usando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) supra y Cunningham BC & Wells JA (1989) supra para obtener una descripción de las técnicas de mutagénesis, incluyendo las técnicas de mutagénesis por escaneo de alanina. En una realización específica, el epítopo de un anticuerpo se determina usando estudios de mutagénesis de barrido de alanina. Además, los anticuerpos que reconocen y se unen a los mismos o epítopos superpuestos de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) pueden identificarse usando técnicas de rutina tal como un inmunoensayo, por ejemplo, al mostrar la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo, es decir, un ensayo de unión competitiva. También se pueden usar ensayos de unión competitivos para determinar si dos anticuerpos tienen una especificidad de unión similar para un epítopo. La unión competitiva se puede determinar en un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición intercalado (véase Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); biotina-avidina directa en fase sólida EIA (véase Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo intercalado marcado directo en fase sólida (véase Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); marcador directo de fase sólida RIA usando el marcador I-125 (véase Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); biotina-avidina directa en fase sólida EIA (véase Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52); y marcado directo RIA (véase Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Por lo general, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado (por ejemplo, TIGIT, tal como la TIGIT humana o la TIGIT de cynomolgus) unidas a una superficie sólida o células que contienen cualquiera de estas, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se puede medir determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % o más. Un ensayo de unión competitiva se puede configurar en una gran cantidad de formatos diferentes utilizando antígenos marcados o anticuerpos marcados. En una versión común de este ensayo, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos. A continuación, se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados al antígeno utilizando marcadores radiactivos o enzimáticos. Para más detalles véase, por ejemplo, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 y Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editores supra, pp.386-389.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31, 32 o 33. En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31, 32 o 33. En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana, la secuencia de aminoácidos de la región que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31, 32 o 33. En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo discontinuo ubicado dentro de una región de TIGIT humana que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos, consistiendo cada una de la pluralidad de secuencias de aminoácidos en, que consiste esencialmente en, o que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31, 32 o 33 (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 31 y 32, las SEQ ID NOs: 31 y 33, las SEQ ID NOs: 32 y 33, o las SEQ ID NOs: 31, 32 y 33).
En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que, cuando se une a una proteína TIGIT humana o un fragmento de la misma, reduce el intercambio de hidrógeno/deuterio en una región que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 31 en relación con el intercambio de hidrógeno/deuterio en la región que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31 en ausencia del anticuerpo, según lo determinado por un ensayo de intercambio de hidrógeno/deuterio. En cierta divulgación, la reducción en el intercambio de hidrógeno/deuterio se mide utilizando el intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), por ejemplo, como se describe en el presente documento en los ejemplos.
En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 32. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que, cuando se une a una proteína TIGIT humana o un fragmento de la misma, reduce el intercambio de hidrógeno/deuterio en una región que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 32 en relación con el intercambio de hidrógeno/deuterio en la región que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 32 en ausencia del anticuerpo, según lo determinado por un ensayo de intercambio de hidrógeno/deuterio. En cierta divulgación, la reducción en el intercambio de hidrógeno/deuterio se mide utilizando el intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), por ejemplo, como se describe en el presente documento en los ejemplos.
En cierta divulgación, el anticuerpo aislado se une a un epítopo ubicado dentro de una región de la TIGIT humana que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que, cuando se une a una proteína TIGIT humana o un fragmento de la misma, reduce el intercambio de hidrógeno/deuterio en una región que consiste en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 33 en relación con el intercambio de hidrógeno/deuterio en la región que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33 en ausencia del anticuerpo, según lo determinado por un ensayo de intercambio de hidrógeno/deuterio. En cierta divulgación, la reducción en el intercambio de hidrógeno/deuterio se mide utilizando el intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX), por ejemplo, como se describe en el presente documento en los ejemplos.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo conformacional ubicado dentro de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 31 y 32; 31 y 33; o 32 y 33. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo conformacional ubicado dentro de las secuencias de aminoácidos 31, 32 y 33.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47, N49, H90 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende el residuo de aminoácido de Q35, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende el residuo de aminoácido de I47, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende el residuo de aminoácido de N49, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende el residuo de aminoácido de H90, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende el residuo de aminoácido de T96, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende dos o más, tres o más, o cuatro o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47, N49, H90 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende los residuos de aminoácidos de Q35, I47, N49, H90 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende dos o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en Q35, I47 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el anticuerpo se une a un epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) que comprende los residuos de aminoácidos de Q35, I47 y T96, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100 y F102, numerados de acuerdo el amino secuencia de ácido de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de T34, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de L52, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de H55, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de I56, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de S57, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de P58, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de S59, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de T98, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de R100, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende el residuo de aminoácido de F102, numerado de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho o al menos nueve de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende ninguno de los residuos de aminoácidos de T34, L52, H55, I56, S57, P58, S59, T98, R100 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 40.
En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L52, H55, I56, S57, P58, S59 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L52, H55, I56, S57, P58, S59 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo del anticuerpo no comprende ninguno de los residuos de aminoácidos de L52, H55, I56, S57, P58, S59 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos uno de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L52, H55 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo (por ejemplo, epítopo conformacional) del anticuerpo no comprende al menos dos de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en L52, H55 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40. En cierta divulgación, el epítopo del anticuerpo no comprende ninguno de los residuos de aminoácidos de L52, H55 y F102, numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
En cierta divulgación, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), en donde el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT o un dominio extracelular de la misma que comprende una mutación de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Q35A, I47E, N49A, L52E, H90A, T96A, T96I, C48Y/N49S/A50V y T96I/T98K. La afinidad de unión se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, el método divulgado en el Ejemplo 5 del presente documento). En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT o a un dominio extracelular de la misma que comprende una mutación Q35A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación Q35A es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación Q35A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación I47E. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación I47E es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación I47E consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación N49A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación N49A es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación N49A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación L52E. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación L52E es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación L52E consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación H90A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación H90A es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación H90A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación T96A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación T96A es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación T96A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación T96I. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación T96I es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación T96I consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación C48Y/N49S/A50V. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación C48Y/N49S/A50V es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación C48Y/N49S/A50V consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo no se une sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación T96I/T98K. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación T96I/T98K es al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % inferior a la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína TIGIT que comprende una mutación T96I/T98K consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos de la proteína TIGIT que comprende una mutación T96I/T98K consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59.
En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en T34A, L52A, H55A, P58A, T98A, R100A, F102A e I56V/S57A/P58S/S59V. La afinidad de unión se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, el método divulgado en el Ejemplo 5 del presente documento). En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación T34A. En ciertas realizaciones, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación T34A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación T34A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación L52A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación L52A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación L52A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación H55A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación H55A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación H55A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación P58A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación P58A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación P58A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación T98A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación T98A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación T98A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación R100A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación R100A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación R100A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación F102A. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación F 102A es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación F102A consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42. En cierta divulgación, el anticuerpo se une específica y/o sustancialmente a una proteína TIGIT que comprende una mutación I56V/S57A/P58S/S59V. En cierta divulgación, la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína TIGIT o el dominio extracelular de la misma que comprende una mutación I56V/S57A/P58S/S59V es mayor o igual a 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o el 95 % de la afinidad de unión del anticuerpo a una proteína TIGIT de tipo silvestre (por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40) o un dominio extracelular correspondiente del mismo. En cierta divulgación, la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de una proteína TIGIT que comprende una mutación I56V/S57A/P58S/S59V consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular correspondiente de la proteína TIGIT de tipo silvestre consiste o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la unión de TIGIT humana a PVR, PVRL2 y/o PVRL3 humanos. Preferiblemente, la unión de TIGIT humana a PVR humana se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de TIGIT humana a PVR humana en ausencia del anticuerpo. Preferiblemente, la unión de TIGIT humana a PVRL2 humana se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de TIGIT humana a PVRL2 humana en ausencia del anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la unión de un fragmento soluble de TIGIT humana a un fragmento soluble de PVR, PVRL2 y/o PVRL3 humanos. Preferiblemente, la unión de un fragmento soluble de TIGIT humana a un fragmento soluble de PVR humano se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de un fragmento soluble de TIGIT humana a un fragmento soluble de PVR humano en ausencia del anticuerpo. Preferiblemente, la unión de un fragmento soluble de TIGIT humana a un fragmento soluble de PVRL2 humano se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de un fragmento soluble de TIGIT humana a un fragmento soluble de PVRL2 humano en ausencia del anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la unión de una célula que expresa TIGIT a un fragmento soluble de PVR, PVRL2 y/o PVRL3 humanos. Preferiblemente, la unión de una célula que expresa TIGIT a un fragmento soluble de PVR humano se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de una célula que expresa TIGIT a un fragmento soluble de PVR humano en ausencia del anticuerpo. Preferiblemente, la unión de una célula que expresa TIGIT a un fragmento soluble de PVRL2 humano se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de una célula que expresa TIGIT a un fragmento soluble de PVRL2 humano en ausencia del anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la unión de una célula que expresa TIGIT a una célula que expresa PVR, PVRL2 y/o PVRL3 humanos. Preferiblemente, la unión de una célula que expresa TIGIT a una célula que expresa PVR se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de una célula que expresa TIGIT a una célula que expresa PVR en ausencia del anticuerpo. Preferiblemente, la unión de una célula que expresa TIGIT a una célula que expresa PVRL2 se reduce en más del 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en presencia del anticuerpo en relación con la unión de una célula que expresa TIGIT a una célula que expresa PVRL2 en ausencia del anticuerpo.
Preferiblemente, el anticuerpo no se une específicamente a CD226 (por ejemplo, CD226 humana). Preferiblemente, la afinidad de unión del anticuerpo a TIGIT es más fuerte en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % que la afinidad de unión del anticuerpo a CD226, según lo evaluado mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por uno de habilidad en la técnica. Preferiblemente, la afinidad de unión del anticuerpo a TIGIT es más fuerte al menos 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, 100 plegamientos, o más que la afinidad de unión del anticuerpo a CD226, evaluado mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, la KD que representa la afinidad del anticuerpo por CD226 es superior a 1, 2, 5, 10, 20, 50 o 100 µg/ml.
Preferiblemente, el anticuerpo no se une específicamente a CD96 (por ejemplo, CD96 humana). Preferiblemente, la afinidad de unión del anticuerpo a TIGIT es más fuerte en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % que la afinidad de unión del anticuerpo a CD96, según lo evaluado mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por uno de habilidad en la técnica. Preferiblemente, la afinidad de unión del anticuerpo a TIGIT es más fuerte al menos 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, 100 plegamientos, o más que la afinidad de unión del anticuerpo a CD96, evaluado mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, la KD que representa la afinidad del anticuerpo por CD96 es superior a 1, 2, 5, 10, 20, 50 o 100 µg/mL.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17. En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 11 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 12 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 14 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 15 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 16 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 17 y 27, respectivamente. En ciertas realizaciones, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 18 y 27, respectivamente. Puede usarse cualquier formato de anticuerpo en los anticuerpos divulgados en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario o un Fv monocatenario (scFv). En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un scFv fusionado con una región Fc (scFv-Fc). En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento Fab. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento F(ab')2.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y un segundo antígeno.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento se conjuga con un segundo anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. En determinadas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento se conjuga covalentemente con un segundo anticuerpo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento está conjugado de forma no covalente con un segundo anticuerpo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento se entrecruza con un segundo anticuerpo. En ciertas realizaciones, el segundo antígeno es un antígeno asociado a un tumor (por ejemplo, un polipéptido sobreexpresado en un tumor, un polipéptido derivado de un oncovirus, un polipéptido que comprende una modificación postraduccional específica de un tumor, un polipéptido mutado específicamente en un tumor). En ciertas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es EGFR (por ejemplo, EGFR humano), opcionalmente en el que el segundo anticuerpo es cetuximab. En ciertas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es Her2 (por ejemplo, Her2 humano), opcionalmente en el que el segundo anticuerpo es trastuzumab. En ciertas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es CD20 (por ejemplo, CD20 humano).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo divulgado en el presente documento se conjuga con un agente citotóxico, un agente citostático, una toxina, un radionúclido o un marcador detectable. En ciertas realizaciones, el agente citotóxico puede inducir la muerte o destrucción de una célula en contacto con el mismo. En ciertas realizaciones, el agente citostático puede prevenir o reducir sustancialmente la proliferación y/o inhibe la actividad o función de una célula en contacto con ella. En ciertas realizaciones, el agente citotóxico o agente citostático es un agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac y 186Re. En ciertas realizaciones, el marcador detectable comprende una fracción fluorescente o un identificador químico de clic.
Puede usarse cualquier región constante de inmunoglobulina (Ig) en los anticuerpos divulgados en el presente documento. La región Ig puede ser una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY humana, de cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2), o cualquier subclase (por ejemplo, IgG2a e IgG2b) de la molécula de inmunoglobulina. En una realización, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 humana.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En ciertas realizaciones, una, dos o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) se introducen en la región Fc de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, dominio CH2 (residuos 231-340 de IgG1 humana) y/o dominio CH3 (residuos 341-447 de IgG1humana) y/o la región bisagra, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la vida media en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. En ciertas realizaciones, una, dos o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) se introducen en la región bisagra de la región Fc (dominio CH1) de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región bisagra (por ejemplo, aumentado o disminuido) como se describe en, por ejemplo, la Patente de EE. UU. No.
5,677,425. El número de residuos de cisteína en la región bisagra del dominio CH1 puede alterarse para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas, o modificar (por ejemplo, aumentar o disminuir) la estabilidad del anticuerpo.
En una realización específica, una, dos o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o eliminaciones) se introducen en un dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo que se une a FcRn (preferiblemente un fragmento de dominio Fc o bisagra-Fc) para alterar (por ejemplo, disminuir o aumentar) la vida media del anticuerpo in vivo. Véase, por ejemplo, Publicaciones internacionales Nos. WO 02/060919; WO 98/23289; y WO 97/34631; y Patentes de EE. UU. Nos. 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 y 6,165,745, para ejemplos de mutaciones que alterarán (por ejemplo, disminuir o aumentar) la vida media de un anticuerpo in vivo. En ciertas realizaciones, una, dos o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o eliminaciones) se introducen en un dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo que se une a FcRn (preferiblemente un fragmento de dominio Fc o bisagra-Fc) para disminuir la vida media del anticuerpo in vivo. En otras realizaciones, una, dos o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o eliminaciones) se introducen en un dominio constante de IgG, o un fragmento del mismo que se une a FcRn (preferiblemente un fragmento de dominio Fc o bisagra-Fc) para aumentar la vida media del anticuerpo in vivo. En una realización específica, los anticuerpos pueden tener una o más mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en el segundo dominio constante (CH2) (residuos 231-340 de IgG1 humana) y/o el tercer dominio constante (CH3) (residuos 341-447 de IgG1 humana), numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En una realización específica, la región constante de la IgG1 de un anticuerpo descrito en el presente documento comprende una sustitución de metionina (M) por tirosina (Y) en la posición 252, una sustitución de serina (S) por treonina (T) en la posición 254 y una sustitución de treonina (T) por ácido glutámico (E) en posición 256, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. Véase la Patente de EE. UU. No.7,658,921. Se ha demostrado que este tipo de IgG mutante, denominado "mutante YTE", muestra una vida media cuatro veces mayor en comparación con las versiones de tipo silvestre del mismo anticuerpo (véase Dall'Acqua WF et al., (2006) J Biol Chem 281: 23514-24). En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende un dominio constante de IgG que comprende una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos de residuos de aminoácidos en las posiciones 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 y 428-436, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU.
En ciertas realizaciones, una, dos o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos) se introducen en la región Fc de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, dominio CH2 (residuos 231-340 de IgG1 humana) y/o dominio CH3 (residuos 341-447 de IgG1 humana) y/o la región bisagra, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, para aumentar o disminuir la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc (por ejemplo, un receptor Fc activado) en la superficie de una célula efectora. Las mutaciones en la región Fc de un anticuerpo que disminuyen o aumentan la afinidad de un anticuerpo por un receptor Fc y las técnicas para introducir dichas mutaciones en el receptor Fc o fragmento del mismo son conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos de mutaciones en el receptor Fc de un anticuerpo que se pueden hacer para alterar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fc se describen en, por ejemplo, Smith P. et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186, Patente de EE. UU. No. 6,737,056, y Publicaciones Internacionales Nos. WO 02/060919; WO 98/23289; y WO 97/34631.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que es una variante de una región constante de cadena pesada de tipo silvestre, en donde la región constante de cadena pesada variante se une a FcyRIIB con mayor afinidad que la región constante de cadena pesada de tipo silvestre se une a FcyRIIB. En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada variante es una región constante de cadena pesada humana variante, por ejemplo, una IgG1 humana variante, una IgG2 humana variante o una IgG4 humana variante de región constante de cadena pesada. En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada de IgG humana variante comprende una o más de las siguientes mutaciones de aminoácidos, de acuerdo con el sistema de numeración de la EU: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F y L328E. En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada de IgG humana variante comprende un conjunto de mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: S267E y L328F; P238D y L328E; P238D y una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E233D, G237D, H268D, P271G, y A330R; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G, y A330R; G236D y S267E; S239D y S267E; V262E, S267E, y L328F; yV264E, S267E, y L328F, de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el FcyRIIB se expresa en una célula seleccionada del grupo que consiste en macrófagos, monocitos, células B, células dendríticas, células endoteliales y células T activadas.
En una realización adicional, se introducen una, dos o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc de dominio constante de IgG para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 239, 243, 267, 292, 297, 300, 318, 320, 322, 328, 330, 332 y 396, numerados de acuerdo con al sistema de numeración de la EU, se pueden reemplazar con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. El ligando efector por el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de EE. UU. Nos. 5,624,821 y 5,648,260. En ciertas realizaciones, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo circulante, aumentando así la localización del tumor. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Nos.
5,585,097 y 8,591,886, para una descripción de las mutaciones que eliminan o inactivan el dominio constante y, por lo tanto, aumentan la localización del tumor. En ciertas realizaciones, se pueden introducir una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo descrito en el presente documento para eliminar los posibles sitios de glicosilación en la región Fc, lo que puede reducir la unión al receptor Fc (véase, por ejemplo, Shields RL et al., (2001) J Biol Chem 276: 6591-604). En diversas realizaciones, se pueden realizar una o más de las siguientes mutaciones en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento: una sustitución N297A; una sustitución N297Q; una sustitución L234A; una sustitución L234F; una sustitución L235A; una sustitución L235F; una sustitución L235V; una sustitución L237A; una sustitución S239D; una sustitución E233P; una sustitución L234V; una sustitución L235A; una deleción C236; una sustitución P238A; una sustitución S239D; una sustitución F243L; una sustitución D265A; una sustitución S267E; una sustitución L328F; una sustitución de R292P; una sustitución Y300L; una sustitución A327Q; una sustitución de P329A; una sustitución A332L; una sustitución I332E; o una sustitución P396L, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU.
En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en D265A, P329A y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en L235A, L237A y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en S267E, L328F y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en S239D, I332E, opcionalmente A330L y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en L235V, F243L, R292P, Y300L, P396L y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, una mutación seleccionada del grupo que consiste en S267E, L328F y una combinación de los mismos, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, puede realizarse en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento.
En una realización específica, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende el dominio constante de una IgG1 con una sustitución de aminoácido N297Q o N297A, numerados según el sistema de numeración de la EU. En una realización, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende el dominio constante de una IgG1 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en D265A, P329A y una combinación de los mismos, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En otra realización, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende el dominio constante de una IgG1 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en L234A, L235A y una combinación de las mismas, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En otra realización, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende el dominio constante de una IgG1 con una mutación seleccionada del grupo que consiste en L234F, L235F, N297A y una combinación de los mismos, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, los residuos de aminoácidos en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento en las posiciones correspondientes a las posiciones L234, L235 y D265 en una cadena pesada de IgG 1 humana, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, no son L, L y D, respectivamente. Este enfoque se describe en detalle en la Publicación Internacional No. WO 14/108483. En una realización particular, los aminoácidos correspondientes a las posiciones L234, L235 y D265 en una cadena pesada de IgG 1 humana son F, E y A; o A, A y A, respectivamente, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU.
En ciertas realizaciones, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 en la región constante de un anticuerpo descrito en el presente documento, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo ha alterado la unión a C1q y/o reducido o abolido la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con más detalle en LA Patente de EE. UU. No. 6,194,551 (Idusogie et al.). En ciertas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 a 238 en la región N-terminal del dominio CH2 de un anticuerpo descrito en el presente documento se alteran para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento, numerados de acuerdo con el Sistema de numeración de la EU. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación Internacional No. WO 94/29351. En determinadas realizaciones, la región Fc de un anticuerpo descrito en el presente documento se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy mediante la mutación de uno o más aminoácidos ácidos (por ejemplo, introduciendo sustituciones de aminoácidos) en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, o 439, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. Este enfoque se describe con más detalle en la Publicación Internacional No. WO 00/42072.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende un dominio constante modificado de una IgG1, en el que la modificación aumenta la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En ciertas realizaciones, 0,1, 1 o 10 µg/ml del anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular de al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % de las células que expresan TIGIT en 1, 2 o 3 horas, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, el dominio constante modificado de una IgG1 comprende las sustituciones S239D e I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el dominio constante modificado de una IgG1 comprende las sustituciones S239D, A330L e I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el dominio constante modificado de una IgG1 comprende las sustituciones L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular en células T efectoras y Tregs, en donde el porcentaje de Tregs que experimentan muerte celular es mayor que el porcentaje de células T efectoras que experimentan muerte celular en al menos 1,2 plegamientos, 1,3 plegamientos, 1,4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 1.6 plegamientos, 1.7 plegamientos, 1.8 plegamientos, 1.9 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos o 5 plegamientos.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende la región constante de un anticuerpo IgG4 y la serina en el residuo de aminoácido 228 de la cadena pesada, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU, se sustituye por prolina. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), comprendiendo el anticuerpo una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
En ciertas realizaciones, cualquiera de las mutaciones o modificaciones de la región constante descritas en el presente documento puede introducirse en una o ambas regiones constantes de la cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento que tiene dos regiones constantes de la cadena pesada.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y funciona como un antagonista (por ejemplo, disminuye o inhibe la actividad TIGIT).
La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y disminuye o inhibe TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, evaluado mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por los expertos en la técnica, en relación con TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y disminuye o inhibe la TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4,5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, 100 plegamientos, o más, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica, relativo a actividad TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana)). Ejemplos no limitativos de actividad TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) puede incluir señalización TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus); TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) uniéndose a su ligando (por ejemplo, PVR (por ejemplo, PVR humano o de cynomolgus), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano o de cynomolgus), PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano o de cynomolgus), o un fragmento y/o proteína de fusión del mismo); activación de una célula T (por ejemplo, una célula T que expresa TIGIT humana); activación de una célula asesina natural (NK); disminución o inhibición de una Treg; aumento de citoquinas (por ejemplo, producción de IL-2, IFN-γ y/o TNF-α); aumento de la actividad de PVR (por ejemplo, PVR humano), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano), y/o PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano); y activación de una célula presentadora de antígeno (APC) que expresa PVR (por ejemplo, PVR humano), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano) y/o PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano). En la divulgación específica, un aumento en una actividad TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se evalúa como se describe en los Ejemplos, infra.
Preferiblemente, un anticuerpo aislado se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y disminuye o inhibe TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o de cynomolgus) que se une a su ligando (por ejemplo, VRP (por ejemplo, PVR humano o de cynomolgus), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano o de cynomolgus), PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano o de cynomolgus), o un fragmento y/o proteína de fusión del mismo) en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, según lo evaluado mediante los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) que se une a este ligando sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o de cynomolgus)). Preferiblemente, un anticuerpo aislado se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o de cynomolgus) y aumenta TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o de cynomolgus) que se une a su ligando (por ejemplo, PVR (por ejemplo, PVR humano o de cynomolgus), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano o de cynomolgus), PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano o de cynomolgus), o un fragmento y/o proteína de fusión del mismo) en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, relativo a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humano) que se une a este ligando sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o de cynomolgus)).
Preferiblemente, un anticuerpo aislado se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y activa una célula T (por ejemplo, una célula T que expresa TIGIT humana). En ciertas realizaciones, la célula T es una célula T de memoria. Preferiblemente, la célula T es una célula Jurkat que expresa TIGIT. Preferiblemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento aumenta la actividad del factor nuclear de células T activadas (NFAT) en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, según lo evaluado mediante los métodos descritos en el presente documento (véanse los ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la actividad de NFAT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo descrito en el presente documento aumenta la actividad de NFAT en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, o más, según lo evaluado por métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la actividad de NFAT sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo aumenta la actividad de NFAT en presencia de un ligando de TIGIT (por ejemplo, PVR (por ejemplo, PVR humano o de cynomolgus), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano o de cynomolgus), PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano o de cynomolgus), un fragmento y/o proteína de fusión del mismo), y/o una célula que expresa un ligando de TIGIT (por ejemplo, un monocito, una célula dendrítica).
Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y aumenta la producción de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IFN-γ y/o TNF-α) en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, según lo evaluado mediante los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de citoquinas sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y aumenta la producción de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IFN-γ y/o TNF-α) en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3,5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, o 100 plegamientos, o más, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de citoquinas sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo aumenta la producción de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IFN-γ y/o TNF-α) en presencia de un ligando de TIGIT (por ejemplo, PVR (por ejemplo, PVR humano o de cynomolgus), PVRL2 (por ejemplo, PVRL2 humano o de cynomolgus), PVRL3 (por ejemplo, PVRL3 humano o de cynomolgus), un fragmento y/o proteína de fusión del mismo), y/o una célula que expresa un ligando de TIGIT (por ejemplo, un monocito, una célula dendrítica). Preferiblemente, el anticuerpo aumenta la producción de IL-2 en relación con la producción de IL-2 sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)) en mayor medida que el anticuerpo aumenta la producción de IFN-γ en relación con la producción de IFN-γ sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)).
Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y que solo o en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, pembrolizumab o nivolumab), aumenta la producción de IFNγ y/o IL-2 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en respuesta a la estimulación de Staphylococcus Enterotoxin A (SEA) en al menos 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de IFNγ y/o IL-2 sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)).
Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y que solo o en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab), aumenta la producción de IFNγ y/o IL-2 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en respuesta a la estimulación de Staphylococcus Enterotoxin A (SEA) en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplo, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de IFNγ y/o IL-2 sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)).
Preferiblemente, células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) estimuladas con Enterotoxina A de Staphylococcus (SEA) en presencia de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), han aumentado la producción de IFNγ y/o IL-2 en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, en relación con la producción de IFNγ y/o IL-2 a partir de PBMC solo estimuladas con SEA sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)), según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplo, infra) o conocidos por un experto en la técnica.
Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y aumenta o promueve la recuperación de memoria de una célula T de memoria. Preferiblemente, la célula T de memoria es una célula T de memoria efectora CD8. Preferiblemente, la célula T de memoria es una célula T de memoria efectora CD4. Preferiblemente, el anticuerpo aumenta el número de células T de memoria en proliferación cuando las células T de memoria están en contacto con sus antígenos afines en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos. plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplo, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con el número de células T de memoria en proliferación cuando las células T de memoria están en contacto con sus antígenos afines en ausencia de cualquier anticuerpo o en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo aumenta la producción de una citoquina (por ejemplo, IFNγ, TNFα) de una célula T de memoria cuando la célula T de memoria está en contacto con su antígeno afín en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos o 100 plegamientos, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de la citoquina a partir de una célula T de memoria cuando la célula T de memoria está en contacto con su antígeno afín en ausencia de cualquier anticuerpo o en presencia de un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)).
Preferiblemente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y activa una célula NK. Preferiblemente, las células NK se aíslan. Preferiblemente, las células NK están en un cultivo mixto de PBMC. Preferiblemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento aumenta el nivel de expresión de CD107a en las células NK en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, según lo evaluado mediante los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con el nivel de expresión de CD107a en células NK sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento aumenta el nivel de expresión de CD107a en las células NK en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4,5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, o 100 plegamientos, o más, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con el nivel de expresión de CD107a en células NK sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento aumenta la producción de citoquinas (por ejemplo, IFNγ y/o TNFα) de las células NK en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de citoquinas (por ejemplo, IFNγ y/o TNFα) a partir de células NK sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Preferiblemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento aumenta la producción de citoquinas (por ejemplo, IFNγ y/o TNFα) de las células NK en al menos aproximadamente 1.2 plegamientos, 1.3 plegamientos, 1.4 plegamientos, 1.5 plegamientos, 2 plegamientos, 2.5 plegamientos, 3 plegamientos, 3.5 plegamientos, 4 plegamientos, 4.5 plegamientos, 5 plegamientos, 6 plegamientos, 7 plegamientos, 8 plegamientos, 9 plegamientos, 10 plegamientos, 15 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos, o 100 plegamientos, o más, según lo evaluado por los métodos descritos en el presente documento (véanse los Ejemplos, infra) o conocidos por un experto en la técnica, en relación con la producción de citoquinas (por ejemplo, IFNγ y/o TNFα) a partir de células NK sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (por ejemplo, un anticuerpo que no se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)).
5.3 Composiciones farmacéuticas
En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento que tiene el grado de pureza deseado en un portador, excipiente o estabilizador fisiológicamente aceptable (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURÓNICOS™ o polietilenglicol (PEG).
En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento, y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo descrito en el presente documento y, opcionalmente, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es el único ingrediente activo incluido en la composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden ser útiles para aumentar o promover actividad TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y el tratamiento de una afección, tal como el cáncer o una enfermedad infecciosa. La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica de la presente invención que comprende un anticuerpo anti-TIGIT de la presente invención para su uso como medicamento. En una realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables usados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa isotónica, inyección de agua estéril, inyección de dextrosa y Ringer lactato. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijos de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de maní. Se pueden agregar agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales envasadas en recipientes de dosis múltiples que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil y propil phidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen polisorbato 80 (TWEEN® 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles en agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
Una composición farmacéutica se puede formular para cualquier vía de administración a un sujeto. Los ejemplos específicos de vías de administración incluyen intranasal, oral, pulmonar, transdérmica, intradérmica y parenteral. También se contempla en el presente documento la administración parenteral, caracterizada por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los inyectables, soluciones y emulsiones también contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad y otros agentes tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.
Las preparaciones para la administración parenteral de un anticuerpo incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un solvente justo antes de su uso, incluyendo tabletas hipodérmicas, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listo para combinarse con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.
Si se administra por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Las mezclas tópicas que comprenden un anticuerpo se preparan como se describe para la administración local y sistémica. La mezcla resultante puede ser una solución, suspensión, emulsiones o similares y puede formularse como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, atomizadores, supositorios, vendas, parches dérmicos o cualquier otra formulación adecuada para la administración tópica.
Un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se puede formular como un aerosol para aplicación tópica, tal como por inhalación (ver, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nos. 4,044,126, 4,414,209 y 4,364,923, que describen aerosoles para el suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma). Estas formulaciones para administración a las vías respiratorias pueden estar en forma de aerosol o solución para nebulizador, o como polvo microfino para insuflaciones, solas o en combinación con un portador inerte tal como la lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación tendrán, en una realización, diámetros de menos de 50 micrómetros, en una realización de menos de 10 micrómetros.
Un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento puede formularse para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica en la piel y las membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas, y lociones y para aplicación en el ojo o para aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para la administración transdérmica y también para la administración en los ojos o mucosas, o para terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del anticuerpo solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los parches transdérmicos, incluyendo los dispositivos iontoforéticos y electroforéticos, son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden usarse para administrar un anticuerpo. Por ejemplo, dichos parches se divulgan en las Patentes de EE. UU Nos.
6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010,715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433, y 5,860,957. En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo descrito en el presente documento es un polvo liofilizado, que puede reconstituirse para su administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También se puede reconstituir y formular como sólidos o geles. El polvo liofilizado se prepara disolviendo un anticuerpo descrito en el presente documento, o un derivado del mismo farmacéuticamente aceptable, en un disolvente adecuado. En ciertas realizaciones, el polvo liofilizado es estéril. El disolvente puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El disolvente también puede contener un tampón, tal como citrato, fosfato sódico o potásico u otro tampón conocido por los expertos en la técnica, en una realización, a un pH aproximadamente neutro. La filtración estéril posterior de la solución seguida de liofilización en condiciones estándar conocidas por los expertos en la técnica proporciona la formulación deseada. En una realización, la solución resultante se repartirá en viales para liofilización. Cada vial contendrá una dosificación única o múltiples dosificaciones del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, tal como a aproximadamente 4 °C hasta temperatura ambiente. La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para uso en administración parenteral. Para la reconstitución, el polvo liofilizado se agrega a agua estéril u otro portador adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Tal cantidad se puede determinar empíricamente.
Los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgados en el presente documento y otras composiciones proporcionadas en el presente documento también se pueden formular para dirigirse a un tejido, receptor u otra área particular del cuerpo del sujeto que se va a tratar. Muchos de estos métodos de direccionamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica. Todos estos métodos de direccionamiento se contemplan en el presente documento para su uso en las presentes composiciones. Para ver ejemplos no limitativos de métodos de segmentación, véase, por ejemplo, Números de Patente de EE. UU.
6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 y 5,709,874. En una realización específica, un anticuerpo descrito en el presente documento se dirige a un tumor.
Las composiciones que se van a utilizar para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de, por ejemplo, membranas de filtración estériles.
5.4 Métodos de uso y usos
Se divulga un método para tratar a un sujeto usando los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgados en el presente documento. Cualquier enfermedad o trastorno en un sujeto que se beneficiaría de la disminución de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se puede tratar con los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgados en el presente documento. La presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula huésped de la invención o la composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de una enfermedad infecciosa. En ciertas realizaciones, la enfermedad o el trastorno es resistente a un agente orientado a puntos de control (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista o un anticuerpo anti-PD-1 antagonista). En ciertas realizaciones, la enfermedad o el trastorno es recurrente después del tratamiento con un agente orientado a puntos de control (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista o un anticuerpo anti-PD-1 antagonista).
Los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana) divulgados en el presente documento son particularmente útiles para inhibir la tolerancia del sistema inmune a los tumores y, en consecuencia, pueden usarse como inmunoterapia para sujetos con cáncer. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la cantidad de células T (por ejemplo, células T citotóxicas CD8+, células T auxiliares CD4+, células NKT, células T efectoras o células T de memoria) en respuesta a un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composición farmacéutica del mismo, como se describe en el presente documento. La presente divulgación proporciona un método para disminuir o inhibir la actividad de las células T reguladoras (Treg) en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composición farmacéutica del mismo, como se divulga en el presente documento. La presente divulgación divulga un método para aumentar la activación de las células NK en respuesta a un antígeno en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composición farmacéutica del mismo, como se divulga en el presente documento. Se divulga un método para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o composición farmacéutica, como se divulga en el presente documento. La presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula huésped de la invención o la composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.
Cánceres que se pueden tratar con los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento incluyen, sin limitación, un tumor sólido, un cáncer hematológico (por ejemplo, leucemia, linfoma, mieloma, por ejemplo, mieloma múltiple) y una lesión metastásica. En una realización, el cáncer es un tumor sólido. Ejemplos de tumores sólidos incluyen neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas y carcinomas, por ejemplo, adenocarcinomas de los diversos sistemas de órganos, tales como los que afectan al pulmón, mama, ovario, linfoide, gastrointestinal (por ejemplo, colon), anal, genitales y aparato genitourinario (por ejemplo, renal, urotelial, células de la vejiga, próstata), faringe, SNC (por ejemplo, cerebro, células neurales o gliales), cabeza y cuello, piel (por ejemplo, melanoma) y páncreas, así como adenocarcinomas que incluyen neoplasias malignas tales como cáncer de colon, cáncer de recto, carcinoma de células renales, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas o cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago. El cáncer puede estar en una etapa temprana, intermedia, tardía o cáncer metastásico. En ciertas realizaciones, el cáncer es resistente a un agente orientado a puntos de control (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista o un anticuerpo anti-PD-1 antagonista). En ciertas realizaciones, el cáncer es recurrente después del tratamiento con un agente dirigido a puntos de control (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista o un anticuerpo anti-PD-1 antagonista). En una realización, el cáncer se elige entre cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón o cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (por ejemplo, NSCLC con histología escamosa y/o no escamosa, o adenocarcinoma de NSCLC)), melanoma (por ejemplo, un melanoma avanzado), cáncer renal (por ejemplo, un carcinoma de células renales), cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), mieloma (por ejemplo, un mieloma múltiple), un cáncer de próstata, un cáncer de mama (por ejemplo, un cáncer de mama que no expresa uno, dos o todos los receptores de estrógeno, receptores de progesterona o Her2/neu, por ejemplo, un cáncer de mama triple negativo), un cáncer de ovario, un cáncer colorrectal, un cáncer de páncreas, un cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer anal, cáncer gastroesofágico (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de esófago), mesotelioma, cáncer de nasofaringe, cáncer de tiroides, cáncer de cuello uterino, cáncer epitelial, cáncer peritoneal o una enfermedad linfoproliferativa (por ejemplo, una enfermedad linfoproliferativa postrasplante). En una realización específica, el cáncer es un cáncer de cuello uterino. En una realización, el cáncer es un cáncer hematológico, por ejemplo, una leucemia, un linfoma o un mieloma. En una realización, el cáncer es una leucemia, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mieloblástica aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide crónica leucemia (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia linfocítica crónica (CLL) o leucemia de células pilosas. En una realización, el cáncer es un linfoma, por ejemplo, linfoma de células B, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma difuso de células B grandes similar a células B activadas (ABC), linfoma difuso de células B grandes del centro germinal (GCB), linfoma de células del manto, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma no Hodgkin en recaída, linfoma no Hodgkin refractario, linfoma no Hodgkin folicular recurrente, linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos pequeños, linfoma folicular, linfoma linfoplasmocitario o linfoma de la zona marginal extraganglionar. En una realización, el cáncer es un mieloma, por ejemplo, mieloma múltiple.
En otra realización, el cáncer se elige de un carcinoma (por ejemplo, carcinoma avanzado o metastásico), melanoma o carcinoma de pulmón, por ejemplo, un carcinoma de pulmón de células no pequeñas.
En una realización, el cáncer es un cáncer de pulmón, por ejemplo, un adenocarcinoma de pulmón, un cáncer de pulmón de células no pequeñas o un cáncer de pulmón de células pequeñas.
En una realización, el cáncer es un melanoma, por ejemplo, un melanoma avanzado. En una realización, el cáncer es un melanoma avanzado o irresecable que no responde a otras terapias. En otras realizaciones, el cáncer es un melanoma con una mutación BRAF (por ejemplo, una mutación BRAF V600). En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o la composición farmacéutica divulgada en el presente documento se administra después del tratamiento con un anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab) con o sin un inhibidor de BRAF (por ejemplo, vemurafenib o dabrafenib).
En otra realización, el cáncer es una hepatocarcinoma, por ejemplo, un hepatocarcinoma avanzado, con o sin infección viral, por ejemplo, una hepatitis viral crónica.
En otra realización, el cáncer es un cáncer de próstata, por ejemplo, un cáncer de próstata avanzado.
En otra realización más, el cáncer es un mieloma, por ejemplo, mieloma múltiple.
En otra realización más, el cáncer es un cáncer renal, por ejemplo, un carcinoma de células renales (RCC) (por ejemplo, un RCC metastásico, carcinoma de células renales de células claras (CCRCC) o carcinoma de células papilares renales).
En otra realización más, el cáncer se elige entre un cáncer de pulmón, un melanoma, un cáncer renal, un cáncer de mama, un cáncer colorrectal, una leucemia o una lesión metastásica del cáncer.
Se divulga un método para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composición farmacéutica del mismo, como se divulga en el presente documento. Se divulgan métodos para prevenir y/o tratar una infección (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana, una infección por hongos, una infección por protozoos o una infección parasitaria). La presente invención se refiere a un anticuerpo de la invención, el polinucleótido de la invención, el vector de la invención, la célula huésped de la invención o la composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de una enfermedad infecciosa. La infección tratada de acuerdo con el uso puede ser causada por un agente infeccioso identificado en el presente documento. Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o una composición del mismo es el único agente activo administrado a un sujeto. Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o una composición del mismo se usa en combinación con intervenciones antiinfecciosas (por ejemplo, antivirales, antibacterianos, antifúngicos o antihelmínticos) para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Preferiblemente, el anticuerpo y/o la composición farmacéutica de la presente invención es para uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa, opcionalmente en donde el anticuerpo o la composición farmacéutica es el único agente activo administrado a un sujeto, o en donde el anticuerpo o la composición farmacéutica se utiliza en combinación con intervenciones antiinfecciosas.
Enfermedades infecciosas que se pueden tratar y/o prevenir con anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento son causadas por agentes infecciosos que incluyen, pero no se limitan a, bacterias, parásitos, hongos, protozoos y virus. En una realización específica, la enfermedad infecciosa tratada y/o prevenida por anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento es causada por un virus. Las enfermedades virales o infecciones virales que pueden prevenirse y/o tratarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, aquellas causadas por hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, influenza (por ejemplo, influenza A o influenza B), varicela, adenovirus, herpes simplex tipo I (HSV-I), herpes simplex tipo II (HSV-II), peste bovina, rinovirus, echovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma, virus papova, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la poliomielitis, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I), virus de la inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades virales tales como la meningitis viral, la encefalitis, el dengue o la viruela.
Las infecciones bacterianas que pueden prevenirse y/o tratarse incluyen infecciones causadas por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans y Pseudomonas aeruginosa. Enfermedades bacterianas causadas por bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans y Pseudomonas aeruginosa) que se pueden prevenir y/o tratar de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria, S. pneumonia, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (ántrax), tétanos, Streptococcus, Staphylococcus, mycobacterium, pertissus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionella.
Las enfermedades por protozoos o infecciones por protozoos causadas por protozoos que pueden prevenirse y/o tratarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, leishmania, coccidiosis, tripanosoma esquistosoma o malaria. Las enfermedades parasitarias o infecciones parasitarias causadas por parásitos que pueden prevenirse y/o tratarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, clamidia y rickettsia.
Las enfermedades fúngicas o las infecciones fúngicas que pueden prevenirse y/o tratarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otras, las causadas por infecciones de Candida, zigomicosis, mastitis Candida, tricosporonosis diseminada progresiva con tricosporonemia latente, candidiasis diseminada, paracoccidioidomicosis pulmonar, aspergilosis pulmonar, neumonía Pneumocystis carinii, meningitis criptocócica, meningoencefalitis coccidioidal y vasculitis cerebroespinal, infección de Aspergillus niger, queratitis por fusarium, micosis de los senos paranasales, endocarditis de Aspergillus fumigatus, discondroplasia tibial, vaginitis de Candida glabrata, candidiasis orofaríngea, enfermedad granulomatosa crónica ligada al cromosoma X, tinea pedis, candidiasis cutánea, placentitis micótica, tricosporonosis diseminada, aspergilosis broncopulmonar alérgica, queratitis micótica, infección de Cryptococcus neoformans, peritonitis fúngica, infección de Curvularia geniculata, endoftalmitis estafilocócica, esporotricosis y dermatofitosis.
En determinadas realizaciones, estos usos comprenden además la administración de un agente terapéutico adicional al sujeto. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico o de puntos de control. En determinadas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un agente hipometilante (por ejemplo, azacitidina). En determinadas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un agente inductor de daños en el ADN (por ejemplo, gemcitabina). En determinadas realizaciones, el agente dirigido a puntos de control se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista, un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, un anticuerpo anti-TIM-3 antagonista, un anticuerpo anti-LAG-3 antagonista, un anticuerpo anti-VISTA antagonista, un anticuerpo anti-CD96 antagonista, un anticuerpo anti-CEACAM1 antagonista, un anticuerpo anti-CD137 agonista, un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-OX40 agonista. En determinadas realizaciones, el agente dirigido al punto de control se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L2 antagonista y un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, en el que los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento actúan sinérgicamente con el agente dirigido a puntos de control.
En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención para usar en un método de la presente invención, en el que el método comprende además administrar un agente terapéutico adicional al sujeto. La presente divulgación se refiere a (a) un anticuerpo y/o una composición farmacéutica de la presente invención y (b) un agente terapéutico adicional para usar como medicamento. En una realización, la presente invención se refiere a (a) un anticuerpo y/o una composición farmacéutica de la presente invención y (b) un agente terapéutico adicional para usar en un método para el tratamiento del cáncer. La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica, kit o kit de piezas que comprende (a) un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención y (b) un agente terapéutico adicional. En una realización, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico, radioterapéutico o de control de puntos de control.
En ciertas realizaciones, se usa en el presente documento un anticuerpo anti-PD-1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab, también conocido como BMS-936558 o MDX1106, desarrollado por Bristol-Myers Squibb. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab, también conocido como lambrolizumab o MK-3475, desarrollado por Merck & Co. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es pidilizumab, también conocido como CT-011, desarrollado por CureTech. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es MEDI0680, también conocido como AMP-514, desarrollado por Medimmune. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es PDR001 desarrollado por Novartis Pharmaceuticals. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es REGN2810 desarrollado por Regeneron Pharmaceuticals. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es PF-06801591 desarrollado por Pfizer. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es BGB-A317 desarrollado por BeiGene. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es TSR-042 desarrollado por AnaptysBio y Tesaro. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es SHR-1210 desarrollado por Hengrui.
Otros ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-PD-1 que pueden usarse en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento se describen en las siguientes patentes y solicitudes de patente: Patente de EE. UU. No.
6,808,710; Patente de EE. UU. No. 7,332,582; Patente de EE. UU. No. 7,488,802; Patente de EE. UU. No.
8,008,449; Patente de EE. UU. No. 8,114,845; Patente de EE. UU. No. 8,168,757; Patente de EE. UU. No.
8,354,509; Patente de EE. UU. No. 8,686,119; Patente de EE. UU. No. 8,735,553; Patente de EE. UU. No.
8,747,847; Patente de EE. UU. No. 8,779,105; Patente de EE. UU. No. 8,927,697; Patente de EE. UU. No.
8,993,731; Patente de EE. UU. No. 9,102,727; Patente de EE. UU. No. 9,205,148; Publicación de EE. UU. No. EE. UU.2013/0202623 A1; Publicación de EE. UU. No. EE. UU.2013/0291136 A1; Publicación de EE. UU. No. EE. UU.
2014/0044738 A1; Publicación de EE. UU. No. EE. UU. 2014/0356363 A1; Publicación de EE. UU. No. EE. UU.
2016/0075783 A1; y Publicación PCT No. WO 2013/033091 A1; Publicación PCT No. WO 2015/036394 A1; Publicación PCT No. WO 2014/179664 A2; Publicación PCT No. WO 2014/209804 A1; Publicación PCT No. WO 2014/206107 A1; Publicación PCT No. WO 2015/058573 A1; Publicación PCT No. WO 2015/085847 A1; Publicación PCT No. WO 2015/200119 A1; Publicación PCT No. WO 2016/015685 A1; y Publicación PCT No. WO 2016/020856 A1.
En ciertas realizaciones, se usa un anticuerpo anti-PD-L1 en los métodos divulgados en el presente documento. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab desarrollado por Genentech. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es durvalumab desarrollado por AstraZeneca, Celgene y Medimmune. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es avelumab, también conocido como MSB0010718C, desarrollado por Merck Serono y Pfizer. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105 desarrollado por Bristol-Myers Squibb. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es AMP-224 desarrollado por Amplimmune y GSK.
Los ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-PD-L1 que pueden usarse en los usos de tratamiento divulgados en el presente documento se divulgan en las siguientes patentes y solicitudes de patente: Patente de EE. UU. No.
7,943,743; Patente de EE. UU. No. 8,168,179; Patente de EE. UU. No. 8,217,149; Patente de EE. UU. No.
8,552,154; Patente de EE. UU. No.8,779,108; Patente de EE. UU. No.8,981,063; Patente de EE. UU. No.9,175,082; Publicación de EE. UU. No. US 2010/0203056 A1; Publicación de EE. UU. No. US.2003/0232323 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2013/0323249 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2014/0341917 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2014/0044738 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2015/0203580 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2015/0225483 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2015/0346208 A1; Publicación de EE. UU. No. US 2015/0355184 A1; y Publicación PCT No. WO 2014/100079 A1; Publicación PCT No. WO 2014/022758 A1; Publicación PCT No. WO 2014/055897 A2; Publicación PCT No. WO 2015/061668 A1; Publicación PCT No. WO 2015/109124 A1; Publicación PCT No. WO 2015/195163 A1; Publicación PCT No. WO 2016/000619 A1; y Publicación PCT No. WO 2016/030350 A1.
En ciertas realizaciones, se usa en el presente documento un anticuerpo anti-CTLA-4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab desarrollado por Bristol-Myers Squibb.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un compuesto que se dirige a una(s) enzima(s) inmunomoduladora(s) tales como IDO (indoleamina-(2,3)-dioxigenasa) y/o TDO (triptófano 2,3-dioxigenasa). Por lo tanto, en una realización, el agente terapéutico adicional es un compuesto que se dirige a una enzima o enzimas inmunomoduladoras, tal como un inhibidor de indolamina-(2,3)-dioxigenasa (IDO). En ciertas realizaciones, dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en epacadostat (Incyte Corp; ver, por ejemplo, WO 2010/005958), F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), indoximod (NewLink Genetics) y NLG919 (NewLink Genetics).
En una realización, el compuesto es epacadostat. En otra realización, el compuesto es F001287. En otra realización, el compuesto es indoximod. En otra realización, el compuesto es NLG919. En una realización específica, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de IDO para tratar el cáncer. El inhibidor de IDO como se describe en el presente documento para usar en el tratamiento del cáncer está presente en una forma de dosificación sólida de una composición farmacéutica tal como una tableta, una píldora o una cápsula, en donde la composición farmacéutica incluye un inhibidor de IDO y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como tal, el anticuerpo como se divulga en el presente documento y el inhibidor de IDO como se divulga en el presente documento se pueden administrar por separado, secuencial o simultáneamente como formas de dosificación separadas. En una realización, el anticuerpo se administra por vía parenteral y el inhibidor de IDO se administra por vía oral. En realizaciones particulares, el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en epacadostat (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), indoximod (NewLink Genetics) y NLG919 (NewLink Genetics). El epacadostat se ha descrito en la Publicación PCT No. WO 2010/005958. En una realización, el inhibidor es epacadostat. En otra realización, el inhibidor es F001287. En otra realización, el inhibidor es indoximod. En otra realización, el inhibidor es NLG919.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con una vacuna. La vacuna puede ser, por ejemplo, una vacuna peptídica, una vacuna de ADN o una vacuna de ARN. En ciertas realizaciones, la vacuna es una vacuna tumoral basada en proteínas de choque térmico o una vacuna patógena basada en proteínas de choque térmico. En una realización específica, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con una vacuna tumoral basada en proteína de choque térmico. Las proteínas de choque térmico (HSP) son una familia de proteínas altamente conservadas que se encuentran de forma ubicua en todas las especies. Su expresión puede inducirse poderosamente a niveles mucho más altos como resultado de un choque térmico u otras formas de estrés, incluyendo la exposición a toxinas, estrés oxidativo o privación de glucosa. Se han clasificado cinco familias de acuerdo con el peso molecular: HSP-110, -90, -70, -60 y -28. Las HSP suministran péptidos inmunogénicos a través de la vía de presentación cruzada en células presentadoras de antígenos (APC), tales como macrófagos y células dendríticas (DC), lo que lleva a la activación de las células T. Las HSP funcionan como portadores de chaperonas de péptidos antigénicos asociados a tumores que forman complejos capaces de inducir inmunidad específica de tumores. Tras la liberación de las células tumorales moribundas, los complejos HSP-antígeno son captados por células presentadoras de antígenos (APC), en las que los antígenos se procesan en péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I y clase II, lo que lleva a la activación de células T antitumorales CD8+ y CD4+. La inmunidad provocada por los complejos de HSP derivados de las preparaciones tumorales se dirige específicamente contra el repertorio de péptidos antigénicos únicos expresados por el cáncer de cada sujeto. La presente divulgación se refiere a (a) un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención y (b) una vacuna para usar como medicamento, por ejemplo, para usar en un método para el tratamiento del cáncer. La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica, kit o kit de piezas que comprende (a) un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención y (b) una vacuna. En una realización, la vacuna es una vacuna tumoral basada en proteína de choque térmico. En una realización, la vacuna es una vacuna patógena basada en proteína de choque térmico. En ciertas realizaciones, la vacuna es como se describe en el documento WO 2016/183486.
Un complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC) es un complejo peptídico de proteína que consiste en una proteína de choque térmico complejada de forma no covalente con péptidos antigénicos. Las HSPPC provocan respuestas inmunes tanto innatas como adaptativas. En una realización específica, el(los) péptido(s) antigénico(s) muestra(n) antigenicidad para el cáncer que se está tratando. Las HSPPC son capturadas eficientemente por las APC a través de receptores de membrana (principalmente CD91) o mediante la unión a receptores tipo Toll. La internalización de HSPPC da como resultado la maduración funcional de las APC con la producción de quimiocinas y citoquinas que conducen a la activación de células asesinas naturales (NK), monocitos y respuestas inmunes mediadas por Th1 y Th-2. En ciertas realizaciones, las HSPPC utilizadas en los métodos divulgados en el presente documento comprenden una o más proteínas de choque térmico de la familia de proteínas de estrés hsp60, hsp70 o hsp90 complejadas con péptidos antigénicos. En determinadas realizaciones, las HSPPC comprenden hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, calreticulina o combinaciones de dos o más de las mismas.
En una realización específica, el complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC) comprende proteínas de choque térmico recombinantes (por ejemplo, hsp70 o hsc70) o un dominio de unión a péptido del mismo complejado con péptidos antigénicos recombinantes. Las proteínas de choque térmico recombinantes se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, utilizando la secuencia humana hsc70 como se describe en Dworniczak y Mirault, Nucleic Acids Res.15:5181-5197 (1987)) y el número de acceso de GenBank. P11142 y/o Y00371. En ciertas realizaciones, las secuencias de Hsp70 son como se describe en Hunt y Morimoto Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.82 (19), 6455-6459 (1985) y el número de acceso de GenBank. P0DMV8 y/o M11717. Los péptidos antigénicos también se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica.
Preferiblemente, los péptidos antigénicos comprenden un aminoácido modificado. En ciertas realizaciones, el aminoácido modificado comprende una modificación postraduccional. Preferiblemente, el aminoácido modificado comprende un mimético de una modificación postraduccional. Preferiblemente, el aminoácido modificado es Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys o His que se ha fosforilado en un hidroxilo o amina de la cadena lateral. Preferiblemente, el aminoácido modificado es un mimético de un aminoácido Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys o His que se ha fosforilado en un hidroxilo o amina de la cadena lateral.
En una realización específica, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC), por ejemplo, complejo peptídico de proteína de choque térmico-96 (HSPPC-96), para tratar el cáncer. HSPPC-96 comprende una proteína de choque térmico (Hsp) de 96 kDa, gp96, complejada con péptidos antigénicos. HSPPC-96 es una inmunoterapia contra el cáncer fabricada a partir del tumor de un sujeto y contiene la "huella dactilar" antigénica del cáncer. Preferiblemente, esta huella digital contiene antígenos únicos que están presentes solo en las células cancerosas específicas de ese sujeto en particular y la inyección de la vacuna pretende estimular el sistema inmune del sujeto para que reconozca y ataque cualquier célula con la huella cancerosa específica. Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención en combinación con un complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC) para usar como medicamento y/o para usar en un método para el tratamiento del cáncer.
En ciertas realizaciones, el HSPPC, por ejemplo, HSPPC-96, se produce a partir del tejido tumoral de un sujeto. En una realización específica, el HSPPC (por ejemplo, HSPPC-96) se produce a partir de un tumor del tipo de cáncer o metástasis del mismo que se está tratando. En otra realización específica, el HSPPC (por ejemplo, HSPPC-96) es autólogo al sujeto que se está tratando. En ciertas realizaciones, el tejido tumoral es tejido tumoral no necrótico. Preferiblemente, al menos 1 gramo (por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 gramos) de tejido tumoral no necrótico es utilizado para producir un régimen de vacunas. Preferiblemente, después de la resección quirúrgica, el tejido tumoral no necrótico se congela antes de usarlo en la preparación de la vacuna. Preferiblemente, por ejemplo, HSPPC-96, se aísla del tejido tumoral mediante técnicas de purificación, se filtra y se prepara para una vacuna inyectable. En ciertas realizaciones, a un sujeto se le administran 6-12 dosis de HSPPC, por ejemplo, HSPCC-96. En tales realizaciones, el HSPPC, por ejemplo, HSPPC-96, las dosis pueden administrarse semanalmente para las primeras 4 dosis y luego cada dos semanas para las 2-8 dosis adicionales.
Otros ejemplos de HSPPC que pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento se divulgan en las siguientes patentes y solicitudes de patente: Patentes de EE.UU. Nos.
6,391,306, 6,383,492, 6,403,095, 6,410,026, 6,436,404, 6,447,780, 6,447,781 y 6,610,659.
Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un adyuvante. Se pueden usar diversos adyuvantes dependiendo del contexto del tratamiento. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, adyuvante completo de Freund (CFA), adyuvante incompleto de Freund (IFA), montanide ISA (adyuvante séptico incompleto), el sistema adyuvante Ribi (RAS), Titer Max, péptidos de muramilo, Formulación adyuvante de Syntex (SAF), alumbre (hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio), adyuvantes de sal de aluminio, Gerbu® adyuvantes, antígeno absorbido en nitrocelulosa, antígeno encapsulado o atrapado, monofosforil lípido A 3 De-O-acilado (3 D-MPL), oligonucleótidos inmunoestimuladores, ligandos del receptor tipo toll (TLR), ligandos de lectina de unión a manano (MBL), agonistas de STING, complejos inmunoestimulantes tales como saponinas, Quil A, QS-21, QS-7, ISCOMATRIX, entre otros. Otros adyuvantes incluyen oligonucleótidos CpG y moléculas de ARN de doble cadena, tales como poli(A) y poli(U). También se pueden usar combinaciones de los adyuvantes anteriores. Véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos. 6,645,495; 7,029,678; y 7,858,589. En una realización, el adyuvante utilizado en el presente documento es QS-21 STIMULON.
Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un agente terapéutico adicional que comprende un TCR. Preferiblemente, el agente terapéutico adicional es un TCR soluble. Preferiblemente, el agente terapéutico adicional es una célula que expresa un TCR. La presente divulgación se refiere a un anticuerpo y/o composición farmacéutica de la presente invención en combinación con un agente terapéutico adicional que comprende un TCR para uso como medicamento y/o para uso en un método para el tratamiento del cáncer.
Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). Preferiblemente, la célula es una célula T.
Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un anticuerpo mimético de TCR. Preferiblemente, el anticuerpo mimético de TCR es un anticuerpo que se une específicamente a un complejo péptido-MHC. Para ejemplos no limitantes de anticuerpos miméticos de TCR, véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. No.9,074,000 y las Publicaciones de EE.UU. Nos. EE. UU.2009/0304679 A1 y EE. UU.2014/0134191 A1.
Preferiblemente, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) divulgado en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un receptor de células T biespecífico (BiTE) (por ejemplo, como se describe en el documento WO2005061547A2) y/o un anticuerpo de reorientación de doble afinidad (DART) (por ejemplo, como se describe en el documento WO2012162067A2). Preferiblemente, BiTE y/o DART se unen específicamente a un antígeno asociado a un tumor (por ejemplo, un polipéptido sobreexpresado en un tumor, un polipéptido derivado de un oncovirus, un polipéptido que comprende una modificación postraduccional específica de un tumor, un polipéptido mutado específicamente en un tumor) y una molécula en una célula efectora (por ejemplo, CD3 o CD16). Preferiblemente, el antígeno asociado al tumor es EGFR (por ejemplo, EGFR humano), opcionalmente en el que BiTE y/o DART comprenden las secuencias VH y VL de cetuximab. Preferiblemente, el antígeno asociado al tumor es Her2 (por ejemplo, Her2 humano), opcionalmente en el que BiTE y/o DART comprenden las secuencias VH y VL de trastuzumab. Preferiblemente, el antígeno asociado al tumor es CD20 (por ejemplo, CD20 humano).
El anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y el agente terapéutico adicional (por ejemplo, quimioterapéutico, radioterapéutico, agente dirigido al punto de control, inhibidor de IDO, vacuna, adyuvante, un TCR soluble, una célula que expresa un TCR, una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico y/o un anticuerpo mimético de TCR) pueden administrarse por separado, secuencial o simultáneamente como formas de dosificación separadas. En una realización, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se administra por vía parenteral y un inhibidor de IDO se administra por vía oral.
Un anticuerpo o una composición farmacéutica descritos en el presente documento pueden administrarse a un sujeto por una variedad de rutas. Estos incluyen, pero no se limitan a, vías parenteral, intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, tópica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, intratumoral, conjuntival, intraarterial y subcutánea. También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y una formulación con un agente aerosolizante para uso como un aerosol. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en el presente documento se administra por vía subcutánea o intravenosa. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o la composición farmacéutica descritos en el presente documento se administra por vía intraarterial. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o la composición farmacéutica descritos en el presente documento se administra por vía intratumoral. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en el presente documento se administra en un ganglio linfático que drena el tumor.
La cantidad de un anticuerpo o composición que será eficaz en el tratamiento y/o prevención de una afección dependerá de la naturaleza de la enfermedad y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar.
La dosis precisa que se va a emplear en una composición dependerá también de la vía de administración, y de la gravedad de la infección o enfermedad provocada por la misma, y deberá decidirse de acuerdo con el juicio del facultativo y las circunstancias de cada sujeto. Por ejemplo, las dosis efectivas también pueden variar según el medio de administración, el lugar de destino, el estado fisiológico del paciente (incluyendo la edad, el peso corporal y la salud), si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados o si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, incluyendo los mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento se titulan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.
Un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento también se puede usar para analizar TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo inmunoensayos, tal como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación o transferencia Western. Los marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados se conocen en la técnica e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. Dichos marcadores se pueden usar para marcar un anticuerpo descrito en el presente documento. Alternativamente, un segundo anticuerpo que reconoce un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento se puede marcar y usar en combinación con un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) para detectar niveles de proteína de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). La presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo de la presente invención para detección in vitro de proteína TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en una muestra biológica. En otra realización, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo anti-TIGIT de la invención, para analizar y/o detectar niveles de proteína TIGIT (por ejemplo, humana TIGIT o cynomolgus TIGIT) en una muestra biológica in vitro, opcionalmente, en el que el anticuerpo anti-TIGIT se conjuga con un radionúclido o marcador detectable, y/o porta un marcador descrito en el presente documento, y/o en el que se usa un método inmunohistológico.
Ensayo para el nivel de expresión de proteína TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) pretende incluir la medición o estimación cualitativa o cuantitativa del nivel de proteína TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en una primera muestra biológica directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel de proteína absoluto) o relativamente (por ejemplo, comparando con el nivel de proteína asociado a la enfermedad en una segunda muestra biológica). El nivel de expresión del polipéptido TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en la primera muestra biológica puede medirse o estimarse y compararse con un nivel de proteína TIGIT estándar (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), tomándose el estándar, por ejemplo, de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o se determina promediando los niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel de polipéptido TIGIT "estándar" (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), se puede usar repetidamente como estándar para la comparación. Por lo tanto, en una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un método in vitro para ensayar y/o detectar niveles de proteína TIGIT, por ejemplo, niveles de proteína TIGIT humana, en una muestra biológica, que comprende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de proteína TIGIT, por ejemplo, proteína TIGIT humana, en una muestra biológica, mediante un método inmunohistológico.
Como se usa en el presente documento, el término "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra biológica obtenida de un sujeto, línea celular, tejido u otra fuente de células que expresen potencialmente TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). Métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de animales (por ejemplo, humanos o monos cynomolgus) son bien conocidos en la técnica. Las muestras biológicas incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento se puede usar para aplicaciones de pronóstico, diagnóstico, monitorización y detección, que incluyen aplicaciones in vitro e in vivo bien conocidas y estándar para el experto en la técnica y basadas en la presente divulgación. Ensayos y kits de pronóstico, diagnóstico, monitorización y cribado para la valoración y la evaluación in vitro del estado del sistema inmune y/o la respuesta inmune pueden utilizarse para predecir, diagnosticar y monitorizar para evaluar muestras de pacientes, incluyendo aquellos que se sabe o se sospecha que tienen una disfunción del sistema inmune o con respecto a una respuesta anticipada o deseada del sistema inmune, respuesta al antígeno o respuesta a la vacuna. La valoración y evaluación del estado del sistema inmune y/o la respuesta inmune también es útil para determinar la idoneidad de un paciente para un ensayo clínico de un fármaco o para la administración de un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico o un anticuerpo en particular, incluyendo las combinaciones del mismo, frente a un agente o anticuerpo diferente. Este tipo de seguimiento y evaluación de pronóstico y diagnóstico ya está en práctica utilizando anticuerpos contra la proteína HER2 en el cáncer de mama (HercepTest™, Dako) donde el ensayo también se usa para evaluar pacientes para terapia de anticuerpos usando Herceptin®. Las aplicaciones in vivo incluyen la terapia celular dirigida y la modulación del sistema inmune y la obtención de imágenes por radio de las respuestas inmunes. Por lo tanto, en una realización, la presente divulgación se relaciona con un anticuerpo anti-TIGIT y/o una composición farmacéutica de la presente invención para uso como diagnóstico. En una realización, la presente divulgación se relaciona con un anticuerpo anti-TIGIT y/o una composición farmacéutica de la presente invención para su uso en un método para la predicción, diagnóstico y/o monitorización de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una disfunción del sistema inmune y/o con respecto a una respuesta anticipada o deseada del sistema inmune, respuesta antigénica o respuesta vacunal. En otra realización, la presente divulgación se relaciona con el uso del anticuerpo anti-TIGIT de la invención, para predecir, diagnosticar y/o monitorizar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una disfunción del sistema inmune y/o con respecto a una disfunción anticipada o respuesta deseada del sistema inmune, respuesta al antígeno o respuesta a la vacuna analizando y/o detectando los niveles de proteína TIGIT humana en una muestra biológica del sujeto in vitro.
En una realización, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se puede utilizar en inmunohistoquímica de muestras de biopsia. En una realización, el método es un método in vitro. En otra realización, un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se pueden usar para detectar niveles de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), o niveles de células que contienen TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en la superficie de su membrana, cuyos niveles pueden vincularse con ciertos síntomas de enfermedades. Los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descritos en el presente documento pueden llevar un marcador detectable o funcional y/o pueden conjugarse con un radionúclido o un marcador detectable. Cuando se usan marcadores de fluorescencia, se pueden utilizar microscopía y análisis clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) actualmente disponibles o una combinación de ambos procedimientos conocidos en la técnica para identificar y cuantificar los miembros de unión específicos. Los anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descritos en el presente documento pueden llevar o pueden conjugarse con un marcador de fluorescencia. Los ejemplos de marcadores de fluorescencia incluyen, por ejemplo, sondas reactivas y conjugadas, por ejemplo, Aminocumarina, Fluoresceína y Rojo Texas, tintes Alexa Fluor, tintes Cy y tintes DyLight. Un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) puede llevar o puede estar conjugado con un marcador radiactivo o un radionúclido, tal como los isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac y 186Re. Cuando se utilizan marcadores radiactivos, se pueden utilizar los procedimientos de recuento actualmente disponibles conocidos en la técnica para identificar y cuantificar la unión específica de anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). En el caso de que el marcador sea una enzima, la detección puede realizarse mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas, como se conoce en la técnica. Esto se puede lograr poniendo en contacto una muestra o una muestra de control con un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) se detectan y comparan en la muestra y el control. A la luz de la unión específica de los anticuerpos descritos en el presente documento para TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), los anticuerpos se pueden usar para detectar específicamente la expresión TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en la superficie de las células. Los anticuerpos descritos en el presente documento también se pueden usar para purificar TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) mediante purificación por inmunoafinidad. También se incluye en el presente documento un sistema de ensayo que se puede preparar en forma de un kit de prueba, kit o kit de piezas para el análisis cuantitativo de la extensión de la presencia de, por ejemplo, complejos de ligando TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)/TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). El sistema, kit de prueba, kit o kit de piezas puede comprender un componente marcado, por ejemplo, un anticuerpo marcado y uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales.
5.5 Polinucleótidos, vectores y métodos para producir anticuerpos anti-TIGIT
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada) que se une específicamente a un antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y vectores, por ejemplo, vectores que comprenden dichos polinucleótidos para la expresión recombinante en células huésped (por ejemplo, E. coli y células de mamífero). En el presente documento se proporcionan polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una cadena pesada y ligera de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, así como vectores que comprenden tales secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, vectores de expresión para su expresión eficiente en células huésped, por ejemplo, células mamíferas.
Como se usa en el presente documento, un polinucleótido o molécula de ácido nucleico "aislado" es uno que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural (por ejemplo, en un ratón o un ser humano) de la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, el término "sustancialmente libre" incluye preparaciones de polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico que tienen menos del 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % (en particular, menos del 10 %) de otro material, por ejemplo, material celular, medio de cultivo, otras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos y/u otros productos químicos. En una realización específica, se aísla o purifican moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento.
En el presente documento se describen polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos, que se unen específicamente a un polipéptido TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y comprende una secuencia de aminoácidos como se divulga en el presente documento, así como anticuerpos que compiten con dichos anticuerpos para unirse a un polipéptido TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) (por ejemplo, de forma dependiente de la dosis), o que se une al mismo epítopo que el de dichos anticuerpos.
En ciertos aspectos, se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de la invención. Se divulga que los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifican una cadena ligera que comprende las VL FR y las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, Tabla 1) o secuencias de nucleótidos que codifican una cadena pesada que comprende las VH FR y CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, Tabla 1).
También se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que codifican un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) que están optimizados, por ejemplo, por optimización de codón/ARN, reemplazo con secuencias señal heterólogas y eliminación de elementos de inestabilidad de ARNm. Se pueden llevar a cabo métodos para generar ácidos nucleicos optimizados que codifican un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o un fragmento del mismo (por ejemplo, cadena ligera, cadena pesada, dominio VH o dominio VL) para la expresión recombinante introduciendo cambios de codones y/o eliminando regiones inhibidoras en el ARNm, adaptando los métodos de optimización descritos en, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos.
6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; y 6,794,498, respectivamente. Por ejemplo, sitios potenciales de empalme y elementos de inestabilidad (por ejemplo, elementos ricos en A/T o A/U) dentro del ARN pueden mutarse sin alterar los aminoácidos codificados por las secuencias de ácido nuclei
recombinante. Las alteraciones utilizan la degeneración del código genético, por ejemplo, utilizando un codón alternativo para un aminoácido idéntico. Puede ser deseable alterar uno o más codones para codificar una mutación conservadora, por ejemplo, un aminoácido similar con estructura química y propiedades y/o funciones similares al aminoácido original. Dichos métodos pueden aumentar la expresión de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o fragmento del mismo en lo menos 1 plegamiento, 2 plegamientos, 3 plegamientos, 4 plegamientos, 5 plegamientos, 10 plegamientos, 20 plegamientos, 30 plegamientos, 40 plegamientos, 50 plegamientos, 60 plegamientos, 70 plegamientos, 80 plegamientos, 90 plegamientos 100 plegamientos o más relativo a la expresión de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) codificado por polinucleótidos que no se han optimizado.
En cierta divulgación, una secuencia polinucleotídica optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo (por ejemplo, dominio VL y/o dominio VH) pueden hibridar a un polinucleótido antisentido (por ejemplo, complementario) de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo (por ejemplo, dominio VL y/o dominio VH). En una divulgación específica, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con un polinucleótido antisentido de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. En una realización específica, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo se hibrida en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o baja con un polinucleótido antisentido de una secuencia de nucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. Se ha descrito información sobre las condiciones de hibridación, véase, por ejemplo, publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. US 2005/0048549 (por ejemplo, párrafos 72-73).
Los polinucleótidos pueden obtenerse y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Las secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, los anticuerpos descritos en la Tabla 1, y las versiones modificadas de estos anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, es decir, los codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares se ensamblan de tal manera que generan un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Tal polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier G y col., (1994), BioTechniques 17: 242-6), que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligadura de esos oligonucleótidos, y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento puede generarse a partir de un ácido nucleico de una fuente adecuada (por ejemplo, un hibridoma) utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR y otros métodos de clonación molecular). Por ejemplo, la amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida se puede realizar usando ADN genómico obtenido de células de hibridoma que producen el anticuerpo de interés. Dichos métodos de amplificación por PCR se pueden usar para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo. Dichos métodos de amplificación por PCR se pueden usar para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la región de la cadena ligera variable y/o la región de la cadena pesada variable de un anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados se pueden clonar en vectores para la expresión en células huésped y para una clonación adicional, por ejemplo, para generar anticuerpos quiméricos y humanizados.
Si no se dispone de un clon que contenga un ácido nucleico que codifique un anticuerpo en particular, pero se conozca la secuencia de la molécula del anticuerpo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente poli A ARN, aislado de cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo descrito en el presente documento) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden luego clonarse en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica.
El ADN que codifica anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descritos en el presente documento pueden aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como E. coli células, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, Células CHO del sistema CHO GS™ (Lonza)), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en las células huésped recombinantes.
Para generar anticuerpos completos, pueden usarse cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias VH o VL en clones scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de cadena pesada, por ejemplo, la región constante gamma 1 humana o gamma 4 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante de cadena ligera, por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. En ciertas realizaciones, los vectores para expresar los dominios VH o VL comprenden un promotor EF-1α, una señal de secreción, un sitio de clonación para la región variable, dominios constantes y un marcador de selección tal como la neomicina. Los dominios VH y VL también se pueden clonar en un vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan luego en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias murinas, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina.
También se divulgan polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o baja con polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento. En realizaciones específicas, los polinucleótidos descritos en el presente documento se hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o baja con polinucleótidos que codifican un dominio VH y/o un dominio VL proporcionados en el presente documento.
Las condiciones de hibridación se han descrito en la técnica y son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la hibridación en condiciones estrictas puede implicar la hibridación con el ADN unido al filtro en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0.2xSSC/0.1 % SDS a aproximadamente 50-65 °C; La hibridación en condiciones muy estrictas puede implicar la hibridación con ácido nucleico unido al filtro en 6xSSC a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 0.1xSSC/0.2 % SDS a aproximadamente 68 °C. La hibridación en otras condiciones de hibridación estrictas es conocida por los expertos en la técnica y se ha descrito, véase, por ejemplo, Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3.
En ciertos aspectos, se proporcionan células en el presente documento (por ejemplo, células huésped) que expresan (por ejemplo, de forma recombinante) anticuerpos descritos en el presente documento que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) y polinucleótidos y vectores de expresión relacionados. En el presente documento se proporcionan vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) o un fragmento para la expresión recombinante en células huésped, preferiblemente en células de mamífero (por ejemplo, células CHO). También se proporcionan en el presente documento células huésped que comprenden tales vectores para expresar recombinantemente anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo humano o humanizado). En un aspecto particular, en el presente documento se proporcionan métodos para producir un anticuerpo descrito en el presente documento, que comprende expresar dicho anticuerpo a partir de una célula huésped.
Expresión recombinante de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa, cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, o un anticuerpo de cadena sencilla descrito en el presente documento) que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) implica generalmente la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo (por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y/o ligera) descrito en el presente documento, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, los métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, cadena ligera o cadena pesada) que codifica la secuencia de nucleótidos se describen en el presente documento. Se pueden usar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, cadena ligera o cadena pesada) que codifican secuencias y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. También se proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, enlazada operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden, por ejemplo, incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales Nos. WO 86/05807 y WO 89/01036; y Patente de EE. UU. No. 5,122,464) y las regiones variables del anticuerpo se pueden clonar en un vector de este tipo para la expresión de toda la cadena pesada, toda la cadena ligera o ambas cadenas, pesada y ligera.
Un vector de expresión se puede transferir a una célula (por ejemplo, célula huésped) mediante técnicas convencionales y las células resultantes pueden luego cultivarse mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento o fragmentos del mismo, o una cadena pesada y ligera del mismo, o un fragmento del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla descrito en el presente documento, unido operativamente a un promotor para la expresión de tales secuencias en la célula huésped. En ciertas realizaciones, para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera, individualmente, pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación. En determinadas realizaciones, una célula huésped contiene un vector que comprende un polinucleótido que codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo. En realizaciones específicas, una célula huésped contiene dos vectores diferentes, un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada o una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo, y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, una primera célula huésped comprende un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada o una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo, y una segunda célula huésped comprende un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento. En realizaciones específicas, una cadena pesada/región variable de cadena pesada expresada por una primera célula asociada con una cadena ligera/región variable de cadena ligera de una segunda célula para formar un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, en el presente documento se proporciona una población de células huésped que comprende dicha primera célula huésped y dicha segunda célula huésped.
En el presente documento se divulga una población de vectores que comprende un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera/región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento, y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada/región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del huésped para expresar las moléculas de anticuerpos descritas en el presente documento (véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,807,715). Dichos sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés se pueden producir y posteriormente purificar, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento in situ. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformados con, por ejemplo, vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformados con, por ejemplo, vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas celulares de insectos infectados con, por ejemplo, vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales (por ejemplo, algas verdes tales como Chlamydomonas reinhardtii) infectados con, por ejemplo, vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con, por ejemplo, vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS (por ejemplo, COS1 o COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa y NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, BW, LM, BSC1, células BSC40, YB/20 y BMT10) que albergan, por ejemplo, constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia). En una realización específica, las células para expresar anticuerpos descritas en el presente documento son células de ovario de hámster chino (CHO), por ejemplo, células CHO del sistema CHO GS™ (Lonza). En ciertas realizaciones, la cadena pesada y/o la cadena ligera de un anticuerpo producido por una célula CHO puede tener un residuo de glutamina o glutamato N-terminal reemplazado por piroglutamato. En una realización particular, las células para expresar anticuerpos descritas en el presente documento son células humanas, por ejemplo, líneas celulares humanas. En una realización específica, un vector de expresión de mamífero es pOptiVEC™ o pcDNA3.3. En una realización particular, las células bacterianas tales como Escherichia colio células eucariotas (por ejemplo, células de mamífero), especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa, se utilizan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamíferos tales como las células CHO, junto con un vector como el principal elemento intermedio promotor del gen temprano del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para los anticuerpos. Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; y Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8(7): 662-7). En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento son producidos por células CHO o células NS0. En una realización específica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos descritos en el presente documento que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicho anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruether U y Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), en el que la secuencia codificante del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z para que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509); y similares. Por ejemplo, los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de agarosa de glutatión de la matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de trombina o factor Xa proteasa para que el producto del gen objetivo clonado pueda liberarse de la fracción GST.
En un sistema de insectos, el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), por ejemplo, puede usarse como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
En células huésped de mamífero, se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de codificación del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede luego insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. Inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que sea viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan J y Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9). También se pueden requerir señales de iniciación específicas para la traducción eficiente de secuencias codificantes de anticuerpos insertados. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Bitter G y col., (1987) Métodos Enzymol.153: 516-544).
Además, se puede elegir una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden utilizar células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamífero incluyen, entre otras, CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente cualquier cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, COS (por ejemplo, COS1 o COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, BW, LM, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 y HsS78Bst. En ciertas realizaciones, anticuerpos anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descritos en el presente documento se producen en células de mamífero, tales como células CHO.
En una realización específica, los anticuerpos descritos en el presente documento tienen un contenido de fucosa reducido o ningún contenido de fucosa. Dichos anticuerpos se pueden producir utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en células deficientes o que carecen de la capacidad de fucosilar. En un ejemplo específico, las líneas celulares con una desactivación de ambos alelos de α1,6-fucosiltransferasa se pueden usar para producir anticuerpos con contenido de fucosa reducido. El sistema Poteligente® (Lonza) es un ejemplo de un sistema de este tipo que se puede utilizar para producir anticuerpos con un contenido reducido de fucosa.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se pueden generar células de expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética. En realizaciones específicas, una célula proporcionada en el presente documento expresa de forma estable una cadena ligera/región variable de cadena ligera y una cadena pesada/región variable de cadena pesada que se asocian para formar un anticuerpo descrito en el presente documento.
En ciertos aspectos, en lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del polinucleótido/ADN extraño, las células modificadas pueden crecer durante 1 o 2 días en un medio enriquecido y luego cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método se puede usar ventajosamente para modificar líneas celulares que expresan un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. Dichas líneas celulares modificadas pueden ser particularmente útiles en la selección y evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Se pueden usar varios sistemas de selección, incluyendo, entre otros, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-32), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska EH y Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-23) genes en células tk-, hgprt- o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede utilizar como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan RC y Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; y Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); y hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-56). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante se pueden aplicar de manera rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel FM et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)); y en Capítulos 12 y 13, Dracopoli NC et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)); Colbère-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14s.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden aumentar mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, vol.3 (Prensa Académica, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
La célula huésped se puede cotransfectar con dos o más vectores de expresión descritos en el presente documento, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena ligera y pesada. Las células huésped se pueden cotransfectar con diferentes cantidades de los dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, las células huésped se pueden transfectar con una cualquiera de las siguientes proporciones de un primer vector de expresión y un segundo vector de expresión: aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, o 1:50.
Alternativamente, se puede usar un solo vector que codifique y sea capaz de expresar polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre de tóxicos (Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; y Köhler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico. El vector de expresión puede ser monocistrónico o multicistrónico. Un constructo de ácido nucleico multicistrónico puede codificar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más genes/secuencias de nucleótidos, o en el intervalo de 2-5, 5-10 o 10-20 genes/ secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, un constructo de ácido nucleico bicistrónico puede comprender, en el siguiente orden, un promotor, un primer gen (por ejemplo, cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento), y un segundo gen y (por ejemplo, cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento). En dicho vector de expresión, la transcripción de ambos genes puede ser impulsada por el promotor, mientras que la traducción del ARNm del primer gen puede ser por un mecanismo de exploración dependiente de la tapa y la traducción del ARNm del segundo gen puede ser por un mecanismo independiente de la tapa, por ejemplo, por un IRES.
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento mediante expresión recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico después de la Proteína A, y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.
Además, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden fusionar con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Se aísla un anticuerpo descrito en el presente documento. Generalmente, un anticuerpo aislado es aquel que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes a las del anticuerpo aislado. Por ejemplo, en una realización particular, una preparación de un anticuerpo descrito en el presente documento está sustancialmente libre de material celular y/o precursores químicos. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el anticuerpo se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpos que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % (en peso seco) de anticuerpos heterólogos. proteína (también denominada en el presente documento "proteína contaminante") y/o variantes de un anticuerpo, por ejemplo, diferentes formas modificadas postraduccionales de un anticuerpo u otras versiones diferentes de un anticuerpo (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos). Cuando el anticuerpo se produce de forma recombinante, generalmente también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, 10 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % del volumen de la preparación de proteínas. Cuando el anticuerpo se produce por síntesis química, generalmente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que intervienen en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo de interés. En una realización específica, los anticuerpos descritos en el presente documento se aíslan o purifican.
Se pueden producir anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, por ejemplo, por síntesis química o por técnicas de expresión recombinante. los métodos descritos en el presente documento emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro del conocimiento de la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en las referencias citadas en el presente documento y se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
En una realización específica, un anticuerpo descrito en el presente documento es un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo recombinante) preparado, expresado, creado o aislado por cualquier medio que implique la creación, por ejemplo, vía síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN. En ciertas realizaciones, tal anticuerpo comprende secuencias (por ejemplo, secuencias de ADN o secuencias de aminoácidos) que no existen naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos de un animal o mamífero (por ejemplo, humano) in vivo.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) que comprende cultivar una célula o una célula huésped descrita en el presente documento. En una realización, el método se realiza in vitro. En cierto aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) que comprende expresar (por ejemplo, expresando recombinantemente) el anticuerpo usando una célula o célula huésped descrita en el presente documento (por ejemplo, una célula o una célula huésped que comprende polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento). En una realización particular, la célula es una célula aislada. En una realización particular, los polinucleótidos exógenos se han introducido en la célula. En una realización particular, el método comprende además el paso de purificar el anticuerpo obtenido de la célula o célula huésped.
Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5.ª ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, Nueva York).
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes y de expresión en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow E & Lane D, Antibodies: Un manual de laboratorio, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling GJ et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir de forma recombinante a partir de células huésped que expresan exógenamente un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo, por ejemplo, la cadena ligera y/o la cadena pesada de dicho anticuerpo.
En realizaciones específicas, un "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, es un anticuerpo producido por una sola célula (por ejemplo, hibridoma o célula huésped que produce un anticuerpo recombinante), en el que el anticuerpo se une específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) según se determine, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los ejemplos proporcionados en el presente documento. En realizaciones particulares, un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monovalente o anticuerpo multivalente (por ejemplo, bivalente). En realizaciones particulares, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoespecífico o multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico). Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento pueden, por ejemplo, prepararse mediante el método de hibridoma como se describe en Kohler G y Milstein C (1975) Nature 256: 495, o puede, por ejemplo, aislarse de bibliotecas de fagos usando las técnicas que se describen en el presente documento, por ejemplo. Otros métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por ellas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5ta Ed., Ausubel FM et al., supra).
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo se une a un antígeno de forma multivalente (por ejemplo, bivalentemente) cuando el anticuerpo comprende al menos dos (por ejemplo, dos o más) dominios de unión monovalentes, cada dominio de unión monovalente capaz de unirse a un epítopo en el antígeno. Cada dominio de unión monovalente puede unirse al mismo o diferentes epítopos en el antígeno.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como una oveja, una cabra, un conejo, una rata, un hámster o un mono macaco, para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína (por ejemplo, TIGITO (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)) utilizados para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Además, se puede utilizar una técnica RIMMS (inmunización repetitiva en múltiples sitios) para inmunizar a un animal (Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9).
Los ratones (u otros animales, tales como ratas, monos, burros, cerdos, ovejas, hámsteres o perros) pueden inmunizarse con un antígeno (por ejemplo, TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)) y una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA), para formar hibridomas. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitada. En determinadas realizaciones, los ganglios linfáticos de los ratones inmunizados se recogen y se fusionan con células de mieloma NS0.
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Los métodos emplean células de mieloma que se fusionan de manera eficiente, respaldan la producción estable de anticuerpos de alto nivel por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas líneas celulares de mieloma se encuentran líneas de mieloma murino, tal como la línea celular NS0 o las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA, EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8.653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor D (1984) J Inmunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos estándar (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, supra). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI 1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tal como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos que reconocen un TIGIT específico (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), y que pueden generarse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 descritos en el presente documento se pueden producir por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Un fragmento Fab corresponde a uno de los dos brazos idénticos de una molécula de anticuerpo y contiene la cadena ligera completa emparejada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada. El fragmento AF(ab')2 contiene los dos brazos de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo unidos por enlaces disulfuro en la región bisagra.
Además, los anticuerpos descritos en el presente documento también se pueden generar usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se muestran en la superficie de las partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican a partir de bibliotecas de ADNc de animales (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humano o murino de los tejidos afectados). El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con un enlazador scFv mediante PCR y se clona en un vector fagémido. El vector se electropora en E. coli y el E. coli está infectado con el fago auxiliar. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13, y los dominios VH y VL generalmente se fusionan de forma recombinante con el gen III o el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de presentación de fagos que se pueden usar para producir los anticuerpos descritos en este documento incluyen los divulgados en Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR y Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; Número de solicitud PCT PCT/GB91/001134; Publicaciones Internacionales Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, y WO 97/13844; y Patentes de EE. UU. Nos 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,7 80,225, 5,658,727, 5,733,743 y 5,969,108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe abajo. Técnicas para producir de forma recombinante fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también se pueden emplear utilizando métodos conocidos en la técnica, como los divulgados en Publicación PCT No. WO 92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; y Better Metal et al., (1988) Science 240: 1041-1043.
Para generar anticuerpos completos, se pueden usar cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias VH o VL de una plantilla. por ejemplo, clones de scFv. Utilizando técnicas de clonación conocidas por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VH, y los dominios VL amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VL. por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios VH y VL también se pueden clonar en un vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan luego en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede contener una región variable de un anticuerpo monoclonal de ratón o rata fusionada con una región constante de un anticuerpo humano. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; y Patente de EE. UU. Nos.5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, y 6,331,415.
Un anticuerpo humanizado es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y las CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, una inmunoglobulina murina). Preferiblemente, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. Un anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos humanizados se pueden producir utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, el injerto de CDR (Patente Europea No. EP 239400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y Patentes de EE. UU. Nos. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), revestimiento o renovación de la superficie (Patentes Europeas Nos. EP 592106 y EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28 (4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; y Roguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969-973), barajar en cadena (Patente de EE. UU. No.5,565,332), y las técnicas divulgadas en, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 6,407,213, Patente de EE.UU. No. 5,766,886, Publicación Internacional No. WO 93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al., (2000) Protein Eng.13(5): 353-60; Morea V et al., (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res.55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55 (8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 y Pedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. Véase también la Publicación de Solicitud de EE. UU. No. US 2005/0042664 A1 (24 de febrero de 2005).
Se han descrito métodos para hacer multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos.
7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992 y 8,586,713.
Los anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo, los anticuerpos que carecen de las cadenas ligeras se pueden producir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; Patente de EE. UU. No.6,005,079; y Publicaciones Internacionales Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 y WO 01/44301.
Además, los anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) puede, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" un antígeno usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; y Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438.
En realizaciones particulares, un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une al mismo epítopo de TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) como un anticuerpo anti-TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) descrito en el presente documento, es un anticuerpo humano. En una divulgación, un anticuerpo descrito en el presente documento, que bloquea competitivamente (por ejemplo, de manera dependiente de la dosis) cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, desde la unión a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus), es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. En particular, los complejos génicos de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humana. Los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH previene la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir descendencia homocigótica que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una parte de un antígeno (por ejemplo, TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener a partir de ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de las células B y, posteriormente, experimentan un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, usando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para obtener una descripción general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y Patente de EE. UU. Nos. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 y 5,939,598. Los ejemplos de ratones capaces de producir anticuerpos humanos incluyen el Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; Patentes de EE. UU. Nos. 6,075,181 y 6,150,184), el ratón HuAb™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; Patentes de EE. UU. Nos.
5,545,806 y 5,569, 825), el ratón Trans Chromo™ (Kirin) y el ratón KM™ (Medarex/Kirin).
Se pueden preparar anticuerpos humanos que se unen específicamente a TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase también Patentes de EE. UU. Nos. 4,444,887, 4,716,111, y 5,885,793; y Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
Los anticuerpos humanos se pueden producir usando hibridomas de ratón-humano. Por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica humana transformados con el virus de Epstein-Barr (EBV) pueden fusionarse con células de mieloma de ratón para producir hibridomas de ratón-humano que secretan anticuerpos monoclonales humanos, y estos hibridomas de ratón-humano pueden cribarse para determinar los que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a un antígeno objetivo(por ejemplo, TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus)). Dichos métodos son conocidos y se describen en la técnica, véase, por ejemplo, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.
5.6 Kits
También se describen kits que comprenden uno o más anticuerpos descritos en el presente documento, o composiciones farmacéuticas o conjugados de los mismos. En el presente documento se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, tal como uno o más anticuerpos proporcionados en el presente documento. En cierta divulgación, los kits contienen una composición farmacéutica descrita en el presente documento y cualquier agente profiláctico o terapéutico, tal como los descritos en el presente documento. En cierta divulgación, los kits pueden contener un mitógeno de células T, tal como, por ejemplo, por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA) y/o acetato de miristato de forbol (PMA), o un anticuerpo estimulante del complejo TCR, tal como un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Asociado opcionalmente con dichos recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.
También se proporcionan kits que se pueden usar en los métodos anteriores. En una divulgación, un kit comprende un anticuerpo descrito en el presente documento, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una divulgación específica, los kits descritos en el presente documento contienen un antígeno TIGIT sustancialmente aislado (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) como control. En otra divulgación específica, los kits descritos en el presente documento comprenden además un anticuerpo de control que no reacciona con un antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). En otra divulgación específica, los kits divulgados en el presente documento contienen uno o más elementos para detectar la unión de un anticuerpo a un antígeno TIGIT(por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) (por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable, tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable). En la divulgación específica, un kit proporcionado puede incluir un antígeno TIGIT producido de forma recombinante o sintetizado químicamente (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). El antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) proporcionado en el kit también se puede unir a un soporte sólido. En una divulgación más específica, los medios de detección del kit descrito anteriormente incluyen un soporte sólido al que se une un antígeno TIGIT(por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus). Dicho kit también puede incluir un anticuerpo anti-humano o un anticuerpo anti-ratón/rata no adherido y marcado con un reportero. En esta divulgación, la unión del anticuerpo al antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) puede detectarse mediante la unión de dicho anticuerpo marcado con reportero. En una divulgación, la presente divulgación se relaciona con el uso de un kit de la presente divulgación para ensayar in vitro y/o detectar antígeno TIGIT (por ejemplo, TIGIT humana o TIGIT de cynomolgus) en una muestra biológica.
6. Ejemplos
Los ejemplos en esta Sección (es decir, la Sección 6) se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. 6.1 Ejemplo 1: Caracterización del anticuerpo BA002 anti-TIGIT
Este ejemplo describe la caracterización de BA002, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humana. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de BA002 se proporcionan en la Tabla 1.
6.1.1 El anticuerpo BA002 anti-TIGIT humana se une a proteínas TIGIT humanas y de cynomolgus purificadas La capacidad del anticuerpo BA002 para unirse a la proteína TIGIT purificada se evaluó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR).
Brevemente, los experimentos de resonancia de plasmones superficiales se realizaron utilizando un instrumento Biacore T200, y la tasa de asociación (Ka), la tasa de disociación (Kd), y la constante de disociación (KD) se calcularon a partir de cada experimento utilizando un modelo de unión 1:1 con el software de evaluación Biacore T200.
Para medir la afinidad de unión de TIGIT humana y de cynomolgus al BA002 capturado, se capturó BA002 a un caudal de 10 µl/min en la célula de flujo 2, manteniendo la célula de flujo 1 como referencia, en un chip CM5 en el que se había inmovilizado un anticuerpo Fab antihumano mediante acoplamiento de amina. TIGIT humana y de cynomolgus fusionada con Fc ("TIGIT-Fc"), una forma dimérica de TIGIT, se corrieron de forma independiente en todas las células de flujo a las concentraciones de 20, 6.66, 2.22 y 0.74 nM a 50 µl/min durante 90 segundos, seguida de una fase de disociación de 400 segundos. Las trazas de las unidades de respuesta frente al tiempo después de la inyección de proteína para cada concentración probada se muestran en las Figuras 1A (TIGIT-Fc humana) y 1B (TIGIT-Fc de cynomolgus), respectivamente. Con base en estos datos, BA002 capturado se unió a TIGIT-Fc humano con una Ka calculada de 1.29 × 106 M-1s-1, una Kd calculada de 1.60 × 10-4 s-1, y una KD calculada de 0.12 nM. BA002 capturado unido a cynomolgus TIGIT-Fc con una Ka calculada de 4.28 × 106 M-1s-1, una Kd calculada de 3.02 × 10-3 s-1 y una Kd calculada de 0.70 nM.
En un experimento similar que evaluó la unión de una forma monomérica de TIGIT humana fusionada con una etiqueta de polihistidina ("TIGIT-His") a BA002, se capturó BA002 en la célula de flujo 2 de un chip de proteína A, manteniendo la célula de flujo 1 como referencia a un caudal de 10 µL/min. Se corrió TIGIT-His en ambas células de flujo a las concentraciones de 125, 25, 5 y 1 nM a 30 µL/min durante 240 segundos, seguido de una fase de disociación de 900 segundos. Las trazas de las unidades de respuesta frente al tiempo para cada concentración probada se muestran en la Figura 1C. Con base en estos datos, BA002 capturado se unió a TIGIT-His humana con una Ka calculada de 4.1 × 106 M-1s-1, una Kd calculada de 3.6 × 10-2 s-1, y una KD calculada de 8.6 nM. La mayor tasa de disociación calculada entre TIGIT humana monomérica (TIGIT-His) y BA002, en relación con la tasa de disociación calculada entre TIGIT humana dimérica (TIGIT-Fc) y BA002 descrita anteriormente, es consistente con la presencia de un efecto de avidez con la forma dimérica de TIGIT.
En un experimento similar que midió la unión de una forma monovalente de BA002 a TIGIT-Fc humana, se capturó TIGIT-Fc humana en la célula de flujo 2 de un chip CM5, manteniendo la célula de flujo 1 como referencia, a un caudal de 5 µL/ mín. BA002 en formato Fab se pasó por ambas células de flujo a las concentraciones de 200, 50, 12.5, 3.125, 0.78 y 0.195 nM a 20 µL/min durante 120 segundos, seguido de una fase de disociación de 600 segundos. Las trazas de las unidades de respuesta frente al tiempo para cada concentración probada se muestran en la Figura 1D. Con base en estos datos, la TIGIT-Fc humana inmovilizada se unió a BA002 Fab con una Ka calculada de 2.8 × 106 M-1s-1, una Kd calculada de 1.9 × 10-2 s-1 y una KD calculada de 6.8 nM. La mayor tasa de disociación calculada entre TIGIT-Fc humana y BA002 Fab, en relación con la tasa de disociación calculada entre TIGIT-Fc humana y BA002 de longitud completa descrita anteriormente, es consistente con la presencia de un efecto de avidez con la forma bivalente de BA002.
6.1.2 El anticuerpo BA002 anti-TIGIT humana se une a células que expresan TIGIT humana y de mono cynomolgus La capacidad del anticuerpo BA002 anti-TIGIT IgG1 humana para unirse a células que expresan TIGIT humana o TIGIT de mono cynomolgus se probó en una variedad de tipos de células.
Células Jurkat que expresan TIGIT humanas
Se evaluó la capacidad de BA002 para unirse a TIGIT humana expresada en la superficie de células Jurkat. Brevemente, las células Jurkat se transfectaron con un vector que codificaba TIGIT humana y se seleccionó un clon que expresaba de forma estable un alto nivel de TIGIT. Esta línea celular estable se cultivó en medio RPMI 1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10 % y normocina al 2 % (Invivogen, Cat # ANT-NR-1). Para el ensayo de unión de anticuerpos, las células se sembraron en una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos a una densidad de 1 × 105 células por pocillo y se incubaron con Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution, Biolegend, Cat # 422302) diluido 1:50 en PBS complementado con 2 % de FBS inactivado por calor (tampón FACS) durante 10 minutos a 4 °C. A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con una dilución en serie de BA002 o anticuerpo de control de isotipo a concentraciones de 50 µg/mL a 0.64 ng/ml diluido en tampón FACS. Para la tinción de anticuerpos, las células se lavaron dos veces con tampón FACS frío y se resuspendieron en tampón FACS que contenía R-ficoeritrina AffiniPure F(ab')2 Fragmento Donkey Anti-Humano IgG (H+L) (Jackson, Cat # 09-116-149) a una dilución de 1:200 y Tinción de Células Muertas de Infrarrojo Cercano Reparable LIVE/DEAD® (Life Technologies, Cat # L10119). Después de una incubación de 10 minutos en hielo, las células se lavaron dos veces con tampón FACS frío y se analizaron mediante citometría de flujo (citometría de flujo BD LSR Fortessa). Los datos se analizaron con el software FlowJo seleccionando secuencialmente FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a Tinción de Células Muertas y SSC-A frente a PE. Se calcularon los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) y los datos se trazaron mediante el software GraphPad Prism.
Como se muestra en la Figura 2A, BA002 se unió a células Jurkat que expresan TIGIT humana de manera dependiente de la dosis.
Células T humanas primarias activadas
En experimentos similares, se probó la capacidad de BA002 para unirse a células T CD4+ o CD8+ humanas activadas. Brevemente, una alícuota congelada de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se recuperó del nitrógeno líquido y se descongeló inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. A continuación, las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado. Se extrajeron 10 µL y se añadieron a 390 µL de colorante de viabilidad para recuento de las células y comprobar la viabilidad utilizando un aparato Muse. Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y luego se suspendieron hasta una concentración final de 0.1 × 106 células/mL con medio R10. Se añadió una solución madre de 1 µg/mL de SEA a las células PBMC preparadas como se describió anteriormente hasta una concentración final de 100 ng/mL. Se pipetearon 100 µl de células estimuladas en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C en CO2 al 5 % por cinco días.
Se preparó un intervalo de dosis de anticuerpo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Primero, se prepararon 600 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en tampón. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 3 pipeteando 200 µL de la dilución anterior en 400 µL de tampón de muestra. Se prepararon un total de 12 diluciones desde 50 µg/mL hasta 0.0002 µg/mL. Después de 5 días, la placa de muestra se centrifugó durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Las muestras se bloquearon con bloque FcyR preparado en tampón FAC a razón de 5 µL por 100 µL de prueba (550 µL de reactivo de Bloqueo del Receptor Fc diluido en 10.45 mL de tampón FAC) durante 10 minutos. A continuación, las placas de muestra se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Luego, las células se volvieron a suspender en 100 µL de anticuerpo anti-TIGIT o un control de isotipo relevante en las concentraciones que se muestran en las Figuras 2B-2C. Las placas de muestra se incubaron durante 20 minutos a 4 °C. Las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío y se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Este lavado se repitió una vez.
A continuación, las células se resuspendieron en un cóctel de anticuerpos marcados con fluorescencia. Se preparó un cóctel de anticuerpos marcados con fluorescencia suficientes para todas las muestras en tampón FAC. A continuación, se añadieron 100 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. La placa de muestra se incubó durante 20 minutos en hielo. Las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío, se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartaron los sobrenadantes. Este lavado se repitió una vez. Se preparó un cóctel final de anticuerpo IgG antihumano secundario marcado con PE en 11 mL de tampón FAC. Se añadieron 100 µL de anticuerpo secundario por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. La placa de muestra se incubó durante 5 minutos en hielo. Las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío, se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se desecharon los sobrenadantes. Este lavado se repitió una vez. La unión de anticuerpos se midió mediante citometría de flujo utilizando un Citómetro de Flujo BD LSR Fortessa. Se utilizaron células de control sin teñir para seleccionar la población de linfocitos mediante un gráfico de área de dispersión frontal (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A) y otro gráfico de FSC-A frente a FSC-Altura (FSC-H) para selección de células individuales. Se usaron tubos de células teñidas con cada anticuerpo individual para calcular la compensación de los diversos colores usados en el experimento. Se registraron 100,000 eventos para cada muestra. Las muestras se analizaron seleccionando secuencialmente las siguientes poblaciones: FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a LIVE/DEAD, CD4 frente a CD8 y SSC frente a CD25. Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Como se muestra en las Figuras 2B y 2C, BA002 se unió a células T CD4+ humanas primarias activadas (Figura 2B) y células T CD8+ humanas primarias activadas (Figura 2C) de una manera dependiente de la dosis.
Células CHO que expresan TIGIT de mono cynomolgus
En experimentos similares, se probó la capacidad de BA002 para unirse a células de ovario de hámster chino (CHO) diseñadas para expresar TIGIT de mono cynomolgus en sus superficies celulares (células TIGIT-CHO de cynomolgus). Brevemente, una alícuota congelada de células TIGIT-CHO de cynomolgus se descongeló en agua a 37 °C y luego se transfirió a un tubo que contenía 9 mL de medio R10 precalentado. Las células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 20 mL de medio R10. Luego, las células se transfirieron a un matraz T75 y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 8 % de CO2 por 1 día. A continuación, las células se retiraron de la incubadora y se trataron con 5 mL de TrypLE express. A continuación, las células liberadas se diluyeron con 10 mL de medio R10 y se centrifugaron durante dos minutos a 2000 RPM. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 mL de medio R10 y se evaluó el recuento y la viabilidad. Luego, las muestras de células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se volvieron a suspender hasta una concentración final de 1 × 106 células/mL con medio R10. A continuación, se pipetearon 100 µL de células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos para una concentración final de 100.000 células por pocillo.
Se preparó un intervalo de dosis de anticuerpo en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 600 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en tampón FAC. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 5 pipeteando 120 µL de la dilución anterior en 600 µL de tampón de muestra. Se prepararon un total de 12 diluciones desde 50 µg/mL hasta 0.000001024 µg/mL. Las placas de muestra se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se desecharon los sobrenadantes. Las muestras se lavaron dos veces con tampón FACs. A continuación, las células se volvieron a suspender en 100 µL de anticuerpo anti-TIGIT BA002 o un control de isotipo en las concentraciones que se muestran en la Figura 2D. A continuación, las placas de muestra se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío y se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Este lavado se repitió una vez. A continuación, las células se resuspendieron en un cóctel de tinción viva/muerta y anticuerpo IgG antihumano secundario marcado con PE. Las placas de muestra se incubaron durante 10 minutos en hielo. Las células se lavaron y centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Este lavado se repitió una vez.
La unión de anticuerpos se midió mediante citometría de flujo utilizando un Citómetro de Flujo BD LSR Fortessa. Se utilizaron células de control sin teñir para seleccionar la población de linfocitos mediante un gráfico de área de dispersión frontal (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A) y otro gráfico de FSC-A frente a FSC-Altura (FSC-H) para selección de células individuales. Se usaron tubos de células teñidas con cada anticuerpo individual para calcular la compensación de los diversos colores usados en el experimento. Se registraron 100,000 eventos para cada muestra. Las muestras se analizaron seleccionando secuencialmente las siguientes poblaciones: FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a LIVE/DEAD, y SSC-A frente a PE. Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Como se muestra en la Figura 2D, BA002 se unió a las células CHO que expresan TIGIT de mono cynomolgus de una manera dependiente de la dosis.
6.1.3 El anticuerpo anti-TIGIT se une selectivamente a TIGIT
En este ejemplo, se probó la selectividad de BA002 para TIGIT en comparación con los miembros de la familia relacionados CD96 y CD226. Específicamente, se probó la unión de BA002 a dos líneas celulares Jurkat diseñadas, una que expresaba TIGIT, CD96 y CD226 humanos en su superficie celular (TIGIT+ CD96+ CD226+), y uno que expresaba CD96 y CD226, pero no TIGIT (TIGIT- CD96+ CD226+).
Brevemente, se recuperaron alícuotas congeladas de células TIGIT-Jurkat Clon D3 y células Jurkat de tipo silvestre a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron en agua a 37 °C. Cada clon se transfirió a un tubo separado que contenía 9 mL de medio R10 precalentado. Las células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 20 mL de medio R10. Luego, las células se transfirieron a un matraz T75 y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % durante 1 día. Después de la incubación, se evaluó el recuento y la viabilidad de las células. Luego, las muestras de células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se volvieron a suspender hasta una concentración final de 1 × 106 células/mL con medio R10. A continuación, se pipetearon 100 µL de células en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos para una concentración final de 100,000 células por pocillo.
Se preparó un intervalo de dosis de cada anticuerpo (es decir, BA002 o control de isotipo) en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en tampón FAC. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 5 pipeteando 80 µL de la dilución anterior en 320 µL de tampón de muestra. Se prepararon un total de 8 diluciones desde 50 µg/mL hasta 0.00064 µg/mL.
Las placas de muestra se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartaron los sobrenadantes. Las muestras se bloquearon con FcyR Block preparado en tampón FACs (550 µL de reactivo de Bloqueo del Receptor Fc diluido en 10.45 mL de tampón FACs) durante diez minutos. A continuación, las placas de muestra se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Luego, las células se resuspendieron en 100 µL de BA002 o control de isotipo a las concentraciones que se muestran en las Figuras 3A-3B. Las placas de muestra se incubaron con anticuerpo durante 30 minutos a 4°C. A continuación, las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío y se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Este lavado se repitió una vez. A continuación, las células se resuspendieron en un cóctel de tinción viva/muerta y se preparó un anticuerpo IgG antihumano secundario marcado con PE en 20 mL de tampón FAC. Las placas de muestra se incubaron durante 10 minutos en hielo. Las células se lavaron mediante la adición de tampón FAC frío, se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se desecharon los sobrenadantes. Este lavado se repitió una vez.
La unión de anticuerpos se midió mediante citometría de flujo utilizando un Citómetro de Flujo BD LSR Fortessa. Se usaron células de control sin teñir para seleccionar la población de linfocitos mediante un gráfico de área de dispersión frontal (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A) y otro gráfico de FSC-A frente a FSC-Altura (FSC-H) para la selección de células individuales. Se usaron tubos de células teñidas con cada anticuerpo individual para calcular la compensación de los diversos colores usados en el experimento. Se registraron 100,000 eventos para cada muestra. Las muestras se analizaron seleccionando secuencialmente las siguientes poblaciones: FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a LIVE/DEAD, y SSC-A frente a PE. Se calculó la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, BA002 se unió fuertemente a las células Jurkat que expresan TIGIT humana pero no mostró reactividad cruzada con los miembros de la familia relacionados CD96 y CD226.
6.1.4 El anticuerpo anti-TIGIT bloquea la unión del ligando a TIGIT
Unión TIGIT a CD155/PVR
En este ejemplo, se probó la capacidad de BA002 para bloquear la unión entre TIGIT y su ligando CD155 (también denominado PVR). Específicamente, BA002, una serie de anticuerpos anti-TIGIT de referencia y controles de isotipo se probaron para determinar su capacidad para bloquear la unión entre TIGIT soluble y CD155 in vitro.
Brevemente, se preparó una solución madre intermedia concentrado 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, anticuerpos anti-TIGIT de referencia # 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y los controles de isotipo correspondientes) suficiente para dos réplicas en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 60 µL de 250 µg/mL de cada anticuerpo en PBS. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 3 pipeteando 20 µL de la dilución anterior en 40 µL de tampón de muestra. Se preparó un total de 12 diluciones de trabajo que oscilaban entre 50 µg/ml y 0.00028 µg/mL. Se preparó una solución que comprendía 4 ng/µl de CD155-His en tampón de ensayo. Se combinaron 2 µL de tampón de ensayo TIGIT 3x, 2 µL de solución de CD155-His y 2 µL de agua destilada para producir una mezcla maestra y luego se agregaron 6 µL de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de ensayo. También se preparó una solución que comprendía 2 ng/µL de TIGIT biotinilado (TIGIT-biotina) en tampón de ensayo, de los cuales se añadieron 2 µL por pocillo y se incubó durante 60 minutos. Además, las perlas Aceptoras de Quelato de Ni (PerkinElmer #AL108C) se diluyeron 250 veces con tampón de ensayo 1x y se agregaron 10 µL de la solución de perlas aceptoras diluidas por pocillo. Después de agitar brevemente, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se diluyeron 125 veces las perlas de donante conjugadas con estreptavidina (PE # 6760002S) con tampón de ensayo 1x y se añadieron 10 µL de la solución diluida de perlas de donante por pocillo. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se obtuvieron recuentos alfa y se calcularon y normalizaron los valores relativos de unidades de luz de acuerdo con métodos estándar para determinar el porcentaje de unión entre TIGIT y CD155 en presencia de cada anticuerpo probado.
Como se muestra en las Figuras 4A-4F, BA002 mostró un bloqueo sustancial de la unión de TIGIT a CD155. La actividad de bloqueo de ligandos de BA002 para CD155 fue comparable o mayor que la observada para la serie de anticuerpos anti-TIGIT de referencia. Para facilitar la visualización, se muestran los mismos datos para BA002 y el control de isotipo en cada una de las Figuras 4A-4F, mientras que en cada Figura se muestran datos para un anticuerpo de referencia diferente.
Unión TIGIT a CD112/PVRL2
En este ejemplo, se probó la capacidad de BA002 para bloquear la unión entre TIGIT y su ligando CD112 (también denominado PVRL2). Específicamente, BA002, una serie de anticuerpos anti-TIGIT de referencia y controles de isotipo se probaron para determinar su capacidad para bloquear la unión entre TIGIT soluble y CD112 in vitro.
Brevemente, se preparó una solución madre intermedia concentrado 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, anticuerpos anti-TIGIT de referencia # 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y los controles de isotipo correspondientes) suficiente para dos réplicas en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 60 µL de 250 µg/mL de cada anticuerpo en PBS. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 3 pipeteando 20 µL de la dilución anterior en 40 µL de tampón de muestra. Se preparó un total de 12 diluciones de trabajo que oscilaban entre 50 µg/ml y 0.00028 µg/mL. Se preparó una solución que comprendía 4 ng/µL de histidina CD112 en tampón de ensayo. Se combinaron 2 µl de tampón de ensayo TIGIT 3x, 2 µl de solución de CD112-His y 2 µl de agua destilada para producir una mezcla maestra y luego se agregaron 6 µL de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de ensayo. También se preparó una solución que comprendía 2 ng/µL de TIGIT biotinilado (TIGIT-biotina) en tampón de ensayo, de los cuales se añadieron 2 µL por pocillo y se incubó durante 60 minutos. Además, las perlas Aceptoras de Quelato de Ni (PerkinElmer #AL108C) se diluyeron 250 veces con tampón de ensayo 1x y se agregaron 10 µL de la solución de perlas aceptoras diluidas por pocillo. Después de agitar brevemente, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se diluyeron 125 veces las perlas de donante conjugadas con estreptavidina (PE # 6760002S) con tampón de ensayo 1x y se añadieron 10 µL de la solución diluida de perlas de donante por pocillo. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se obtuvieron recuentos alfa y se calcularon y normalizaron los valores relativos de unidades de luz de acuerdo con métodos estándar para determinar el porcentaje de unión entre TIGIT y CD112 en presencia de cada anticuerpo probado.
Como se muestra en las Figuras 5A-5F, BA002 mostró un bloqueo sustancial de la unión de TIGIT a CD112. La actividad de bloqueo de ligandos de BA002 para CD112 fue comparable o mayor que la observada para la serie de anticuerpos anti-TIGIT de referencia. Para facilitar la visualización, se muestran los mismos datos para BA002 y el control de isotipo en cada una de las Figuras 5A-5F, mientras que en cada Figura se muestran datos para un anticuerpo de referencia diferente.
6.2 Ejemplo 2: Funcionalidad de anticuerpos anti-TIGIT y terapias combinadas
6.2.1 El anticuerpo anti-TIGIT potencia la TH1 secreción de citoquinas por células primarias
El anticuerpo anti-TIGIT mejora la secreción de IFNy por PBMC estimuladas
En este ejemplo, se probó la capacidad de BA002 y una serie de anticuerpos anti-TIGIT de referencia para promover la secreción de IFNγ por PBMC estimuladas con Enterotoxina A estafilocócica (SEA). También se analizó la cooperatividad de los anticuerpos anti-TIGIT con un anticuerpo anti-PD-1 en este ensayo.
Se preparó un solución madre intermedia concentrada 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, anticuerpos anti-TIGIT de referencia #1, 3, 5 o 6, o un control de isotipo) en tubos de bala de 1,2 mL. Un juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo anti-PD-1, mientras que otro juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo de isotipo IgG4, cada uno representando una solución madreintermedia concentrada 5x de anticuerpo de isotipo anti-PD-1 o IgG4. En primer lugar, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo anti-TIGIT suplementado con 25 µg/mL de anticuerpo de isotipo anti-PD-1 o IgG4 en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Para contar las células y comprobar la viabilidad, se extrajeron 10 µL de muestra y se añadieron a 390 µL de colorante de viabilidad, se mezclaron y se leyeron con un aparato Muse.
Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA agregando 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µL de una solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a los 9.60 mL de células preparadas anteriormente. Se agregaron 80 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante cuatro días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL de sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA (Perkin Elmer) para medir la secreción de IFNγ. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón AlphaLISA HiBlock 10X en 22.5 mL de agua. Se usó analito de IFNγ humano para preparar una dilución estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de anti-IFNγ AlphaLISA 1.6x y anticuerpo anti-IPNγ biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3X en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision.
Como se muestra en la Figura 6, BA002 mejoró la secreción de IFNγ por las PBMC estimuladas con SEA en mayor medida que los anticuerpos de referencia o el control de isotipo. Además, la combinación de BA002 y el anticuerpo anti-PD-1 resultó en un aumento sustancial en la secreción de IFNγ en comparación con el tratamiento con BA002 solo. Este aumento fue mayor que el observado para los anticuerpos anti-TIGIT de referencia.
El anticuerpo anti-TIGIT mejora la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas
En este ejemplo, se probó la capacidad de BA002 y un anticuerpo anti-TIGIT de referencia para promover la secreción de la citoquina interleucina-2 (IL-2) por PBMC estimuladas con SEA. También se analizó la cooperatividad de los anticuerpos anti-TIGIT con un anticuerpo anti-CTLA-4 en este ensayo.
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, anticuerpo anti-TIGIT de referencia #4 o un control de isotipo) en tubos de bala de 1.2 mL. Un juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo anti-CTLA-4, mientras que otro juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo de isotipo IgG1, cada uno representando una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo de isotipo anti-CTLA-4 o anti-IgG1. En primer lugar, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo anti-TIGIT suplementado con 25 µg/mL de anticuerpo de isotipo anti-CTLA-4 o IgG1 en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Para contar las células y comprobar la viabilidad, se extrajeron 10 µL de muestra y se añadieron a 390 µL de colorante de viabilidad, se mezclaron y se leyeron con un aparato Muse.
Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA agregando 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µL de una solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a los 9.60 mL de células preparadas anteriormente. Se agregaron 80 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante cuatro días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL de sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos. Para el análisis de citoquinas se usaron kits AlphaLISA (Perkin Elmer) para medir la secreción de IL-2. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón de inmunoensayo AlphaLISA 10x en 22.5 ml de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de AlphaLISA anti-IL-21.6x y anticuerpo anti-IL-2 biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3x en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision.
Como se muestra en las Figuras 7A-7B, la combinación de BA002 y el anticuerpo anti-CTLA-4 resultó en un aumento sustancial en la secreción de IL-2 en comparación con el tratamiento con BA002 o el anticuerpo anti-CTLA-4 solo. Este aumento fue mayor que el observado para el anticuerpo anti-TIGIT de referencia analizado en este experimento, el anticuerpo de referencia #4.
6.3 Ejemplo 3: Variantes Fc del anticuerpo anti-TIGIT
6.3.1 Caracterización de variantes de anticuerpos anti-TIGIT con diferentes regiones Fc
En este ejemplo, se analizó el impacto de la interacción región Fc/FcyR en la actividad funcional y de unión de BA002. En particular, la región VH de BA002 se expresó con diversos esqueletos Fc, como se resume en la Tabla 4.
Tabla 4. Variantes Fc de BA002.
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Además, se expresó BA002_AF, una versión afucosilada de BA002 con secuencias de cadena ligera y pesada idénticas.
Estas variantes de BA002 luego se probaron en ensayos funcionales y de unión, como se describe a continuación. Unión a células T humanas primarias activadas
Se probó la capacidad de BA006 para unirse a las células T CD4+ primarias activadas, utilizando el mismo diseño experimental y las mismas condiciones que se describen para BA002 en la Sección 6.1.2. Como se muestra en la Figura 8A, BA006 se unió a las células T CD4+ primarias activadas de manera dependiente de la dosis.
Unión a células CHO que expresan TIGIT de mono cynomolgus
Se probó la capacidad de BA006 para unirse a la TIGIT de mono cynomolgus expresada en la superficie de células CHO modificadas genéticamente, utilizando el mismo diseño experimental y las mismas condiciones que se describen para BA002 en la Sección 6.1.2. Como se muestra en la Figura 8B, BA006 se unió a células CHO que expresaban TIGIT de mono cynomolgus de una manera dependiente de la dosis.
Unión celular y selectividad para TIGIT humana
La variante Fc del anticuerpo BA006 anti-TIGIT se analizó para determinar su capacidad para unirse a TIGIT humana, así como su selectividad para TIGIT humana sobre sus miembros de la familia relacionados CD96 y CD226. Específicamente, BA006 o el control de isotipo se probaron para unirse a (i) células Jurkat TIGIT+ CD96+ CD226+, o (ii) células Jurkat TIGIT- CD96+ CD226+, utilizando el mismo diseño experimental y condiciones que se describen para BA002 en la Sección 6.1.3. En estos experimentos, BA006 se unió fuertemente a las células Jurkat que expresaban TIGIT humana (Figura 8C), pero no mostró reactividad cruzada con los miembros de la familia relacionados CD96 y CD226 (Figura 8D).
Las variantes Fc de BA002 mejoran aún más la secreción de IL-2 por las PBMC estimuladas solas y en combinación con el anticuerpo anti-PD-1
En este ejemplo, se probó la capacidad de las variantes Fc de BA002 para promover la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA. También se analizó la cooperatividad de los anticuerpos anti-TIGIT con un anticuerpo anti-PD-1 en este ensayo.
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009 o controles de isotipo para IgG1 e IgG4) en tubos de bala de 1.2 mL. Un juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo anti-PD-1, mientras que otro juego de tubos también recibió 25 µg/mL de anticuerpo de control de isotipo IgG4, cada uno representando una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo de control de isotipo anti-PD-1 o IgG4. En primer lugar, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo anti-TIGIT suplementado con 25 µg/mL de anticuerpo de isotipo anti-PD-1 o IgG4 en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Se contaron las células y se comprobó su viabilidad. Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA agregando 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µL de una solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a los 9.60 mL de células preparadas anteriormente. Se agregaron 80 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante cuatro días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL de sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA (Perkin Elmer) para medir la secreción de IL-2. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón de inmunoensayo AlphaLISA 10x en 22.5 ml de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de AlphaLISA anti-IL-21.6x y anticuerpo anti-IL-2 biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3x en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision. Este experimento se realizó en cuatro repeticiones utilizando PBMC obtenidas de dos donantes diferentes.
Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, las variantes Fc de BA002 mejoraron aún más la secreción de IL-2 por las PBMC estimuladas con SEA más allá del efecto observado para BA002. En particular, BA002_AF, BA005, BA006 y BA007 indujeron cada uno una mayor secreción de IL-2 que BA002, que a su vez indujo una mayor secreción de IL-2 que BA003, BA008, BA009 o el control de isotipo. La combinación de variantes Fc de BA002 con un anticuerpo anti-PD-1 también produjo una mejora adicional en la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA.
Las variantes Fc de BA002 mejoraron aún más la activación de células T CD4+ y CD8+ solas y en combinación con anticuerpos anti-PD-1
En este ejemplo, se probó la capacidad de las variantes Fc de BA002 para promover la activación de células T. También se analizó la cooperatividad de los anticuerpos anti-TIGIT con un anticuerpo anti-PD-1 en este ensayo.
Una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo (es decir, BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009, control de isotipo IgG1 o control de isotipo IgG4, cada uno con una cantidad equivalente de un anticuerpo anti-PD-1 o se preparó un control de isotipo IgG4) suficiente para cuatro repeticiones para dos donantes en tubos de bala de 1.2 ml. Primero, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de solución de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de donantes humanos de PBMC indicados a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron en agua a 37 °C. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. A continuación, se contaron las células y se evaluó la viabilidad. A continuación, las muestras de células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron hasta una concentración intermedia. Se preparó una concentración de solución madre intermedia de SEA diluyendo 10 µL de 1000 µg/mL de SEA en 90 µL de medio R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µL de una solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a 7.20 mL de las células preparadas anteriormente. Se añadieron 60 µL de células y la mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una cámara humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % por cinco días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de 5 días, la placa de muestra se centrifugó durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Las muestras se lavaron dos veces y se bloquearon con bloque FcyR a 5 µL por 100 µL de prueba (es decir, 550 µL de reactivo de Bloqueo del Receptor Fc diluido en 10.45 mL de tampón FAC) durante 10 minutos. A continuación, las placas de muestra se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Se preparó un cóctel de anticuerpos marcados con fluorescencia suficiente para todas las muestras en 11 mL de tampón FAC. A continuación, se añadieron 100 µL de cóctel de anticuerpos fluorescentes por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo utilizando una pipeta a multicanal. La placa de muestra se incubó durante 20 minutos en hielo. Las células se lavaron mediante la adición de tampón de muestra frío, se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm y se desecharon los sobrenadantes. Este lavado se repitió una vez antes de proceder al análisis de citometría de flujo. Las muestras se analizaron seleccionando secuencialmente las siguientes poblaciones: FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a LIVE/DEAD, CD4 frente a CD8 y SSC frente a CD25. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células T CD4+ CD25+ o las células T CD8+ CD25+ se calculó y exportó a Excel para su análisis. GraphPad Prism se utilizó para trazar los datos.
Como se muestra en las Figuras 9C y 9D, las variantes Fc BA005, BA006 y BA007, y una forma afucosilada de BA002 (BA002_AF), mejoraron la activación de las células T CD4+ y CD8+ en un grado sustancialmente mayor que los controles de isotipo. Esta mejora aumentó aún más cuando estos anticuerpos se combinaron con un anticuerpo anti-PD-1.
Los anticuerpos anti-TIGIT muestran una mejora dependiente de la dosis de la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA solas y en combinación con un anticuerpo anti-PD-1
En otro ejemplo, BA002 y varias variantes Fc del mismo (es decir, BA005, BA006 y BA002_AF) se analizaron para determinar su capacidad para promover la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA de diferentes donantes a diversas concentraciones de anticuerpos. En un experimento, se realizó una titulación de dosis para los anticuerpos BA002, BA002_AF, BA005, BA006 y el control de isotipo, cada uno solo (Figura 10A). En un segundo experimento, se realizó una titulación de dosis para los anticuerpos BA002, BA002_AF, BA006 y el control de isotipo, cada uno en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 (Figura 10B). En un tercer experimento, se realizó una titulación de dosis para anticuerpos BA002, BA006 y control de isotipo en PBMC obtenidas de un tercer donante en presencia de CD155-Fc, cada anticuerpo solo (Figura 10C).
Para cada uno de los dos primeros experimentos descritos anteriormente en esta sección, se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo suficiente para tres repeticiones por donante en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 400 µL de 250 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1 a 4 pipeteando 100 µL de la dilución anterior en 300 µL de tampón de muestra. Se prepararon un total de 8 diluciones que oscilaban de 50 a 0.003052 µg/mL (véanse las concentraciones que se muestran en las Figuras 10A-10C). A continuación, se añadieron 20 µL de cada mezcla de anticuerpos por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Para el segundo experimento (es decir, la combinación de anticuerpo anti-TIGIT y anticuerpo anti-PD-1), se preparó un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo de control de isotipo IgG4 como una solución madre intermedia concentrada 5X. A continuación, se añadieron 20 µl de anticuerpo anti-PD-1 o mezcla de control de isotipo IgG4 por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
Las alícuotas congeladas de las PBMC humanas indicadas se recuperaron del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos. Se contaron las células y se evaluó su viabilidad. Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA diluyendo 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para hacer una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 50 µL de una solución madre intermedia de 100 µg/ml de SEA a los 30 ml de células preparadas anteriormente. Se añadieron 60 µL de la mezcla de células y SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una cámara humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % por cuatro días. Se utilizó un total de 0.1×106 células/pocillo y una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora, se agitaron suavemente a mano y se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL del sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos (Perkin Elmer) para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA para las mediciones de IL-2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón de inmunoensayo AlphaLISA 10X en 22.5 ml de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras AlphaLISA anti-II,-21.6X y anticuerpo biotinilado anti-IL-2 en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de perlas de donante de estreptavidina 2.3X en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision.
Como se muestra en la Figura 10A, BA006 mostró la mayor potenciación de la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA cuando se administró solo. BA005, BA002_AF y BA002 también mostraron una mejora de la secreción de IL-2 cuando se administraron solos. Como se muestra en la Figura 10B, BA006, BA002 y BA002_AF también mostraron una mejora de la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA cuando se combinaron con un anticuerpo anti-PD-1, con BA006 induciendo el nivel más fuerte de secreción de IL-2.
Para el tercer experimento descrito anteriormente en esta sección, se evaluó la capacidad de BA006 y BA002 para mejorar la secreción de IL-2 por parte de las PBMC en presencia de CD155-Fc recubierto de placa en un rango de concentraciones de anticuerpos.
Para preparar placas recubiertas con CD155-Fc, se reconstituyeron 50 µg de proteína CD155-Fc humana recombinante en 100 µL de PBS para hacer una concentración de solución madre de 500 µg/mL. A continuación, la proteína reconstituida se diluyó a una concentración de trabajo de 1 µg/mL añadiendo 24 µL de la solución madre de CD155-Fc de 500 µg/ml a 11.976 ml de PBS. A continuación, se recubrió una placa de alta unión de 96 pocillos con proteína CD155-Fc añadiendo 100 µL de la concentración de trabajo de solución de proteína CD155-Fc a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. A continuación, la placa se selló con un adhesivo y se incubó durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, la placa se centrifugó a 2000 rpm durante dos minutos. Se descartó el sobrenadante y se agregaron los anticuerpos como se describe a continuación.
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo suficiente para tres repeticiones por donante en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 420 µL de 500 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. A continuación, los anticuerpos se diluyeron en serie de 1-3 transfiriendo 140 µL de la dilución anterior a 280 µL de medio R10. Se prepararon un total de ocho diluciones que oscilaban entre 100 y 0.045725 µg/mL. A continuación, se añadieron 20 µl de la mezcla de anticuerpos a los pocillos correspondientes de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. A continuación, se contaron las células y se evaluó la viabilidad. Las células se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA diluyendo 10 µL de 1000 µg/mL de SEA en 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µL de la solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a 960 mL de células. Se añadieron 80 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una cámara humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % por cuatro días. Se utilizó un total de 0.1×106 células/pocillo y una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora, se agitaron suavemente a mano y luego se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL del sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos (Perkin Elmer) para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA para las mediciones de IL-2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó añadiendo 2.5 mL de Tampón de Inmunoensayo AlphaLISA 10X a 22.5 mL de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de AlphaLISA anti-IL-21.6X y una mezcla de anticuerpo anti-IL-2 biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de perlas de donante de estreptavidina 2.3X en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision.
Como se muestra en la Figura 10C, BA006 y BA002 mejoraron la secreción de IL-2 de una manera dependiente de la dosis de PBMC estimuladas con SEA cocultivadas con CD155-Fc unido a la placa. BA006 mejoró la secreción de IL-2 en mayor medida que BA002, lo que a su vez aumentó la secreción de IL-2 en relación con el control de isotipo.
En experimentos adicionales, se probó la activación de PBMC por BA006 en presencia de una concentración más baja de SEA. El experimento se configuró de manera similar a lo dispuesto en la sección 6.2.1, excepto que se utilizó una solución madre intermedia de SEA de 10 µg/mL. El cultivo celular final contenía un total de 1.2 × 105 células/pocillo y una concentración final de 10 ng/mL de péptido SEA. Después de cuatro días de incubación, se midió la producción de IL-2 de las células mediante el kit AlphaLISA (Perkin Elmer).
Como se muestra en las Figuras 10D y 10E, BA006 mejoró la secreción de IL-2 de manera dependiente de la dosis en PBMC de dos donantes diferentes en presencia de 10 ng/mL de SEA. Los valores EC50 medidos de estos dos experimentos fueron 68 ng/mL y 56 ng/mL, respectivamente. Por lo tanto, BA006 aumentó efectivamente la sensibilidad de las PBMC al antígeno SEA.
Las variantes Fc del anticuerpo anti-TIGIT estimulan la secreción de IFNy por PBMC estimuladas
En este ejemplo, se probó la capacidad de las variantes Fc de BA002 para promover la secreción de IFNγ por PBMC estimuladas con SEA.
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de cada anticuerpo (es decir, BA002, BA002_AF, BA003, BA005, BA006, BA007, BA008, BA009 o controles de isotipo para IgG1 e IgG4) en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Para contar las células y comprobar la viabilidad, se extrajeron 10 µL de muestra y se añadieron a 390 µL de colorante de viabilidad, se mezclaron y se leyeron con un aparato Muse.
Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA agregando 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µl de una solución madre intermedia de 100 µg/ml de SEA a los 7.20 mL de células preparadas anteriormente. Se agregaron 60 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante cuatro días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL de sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA (Perkin Elmer) para medir la secreción de IFNγ. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón AlphaLISA HiBlock 10X en 22.5 mL de agua. Se usó analito de IFNγ humano para preparar una dilución estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de anti-IFNγ AlphaLISA 1.6x y anticuerpo anti-IPNγ biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3X en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision.
Como se muestra en las Figuras 11A-11B, BA002 y sus variantes Fc potenciaron la secreción de IFNγ por PBMC estimuladas con SEA de dos donantes diferentes.
6.3.2 Las variantes Fc del anticuerpo anti-TIGIT mostraron una capacidad variable para señalar a través de FcyRIIA y FcyRIIIA
Señalización FcyRIIA
En un ejemplo, se probó la capacidad de las variantes de BA002 Fc para activar células reporteras que expresan FcγRIIAH131. Brevemente, se añadieron células objetivo (es decir, células Jurkat diseñadas para expresar TIGIT humana) a los pocillos de una placa de ensayo ADCP (2.4 x 106 células/mL). Se añadieron diluciones en serie de anticuerpo (es decir, anticuerpo anti-TIGIT BA002 o variantes Fc del mismo, o controles de isotipo apropiados (Evitria); un anticuerpo por pocillo) a los pocillos de la placa de ensayo con tampón de ensayo ADCP. Se añadieron a cada pocillo 150,000 células efectoras (es decir, células reporteras Jurkat NFAT-luciferasa que sobreexpresan FcγRIIA CD32A con un polimorfismo 131 H/H de alta afinidad, menos de seis semanas en cultivo; Promega) y luego las mezclas se incubaron durante 20 horas a 37 °C. La unión del complejo anticuerpo/antígeno en las superficies de las células objetivo a CD32A en las superficies de las células efectoras daría como resultado la señalización al constructo reportero y la expresión de luciferasa.
Al día siguiente, las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se agregaron 75 µL de Reactivo de Ensayo de Luciferasa Bio-Glo (Promega Catalog #G7940) por pocillo. A continuación, las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas (Envision). Las unidades relativas de luz (RLU) se calcularon como RLU inducidas - RLU de fondo.
Como se muestra en la Figura 12A, para la unión y señalización de FcyRIIA, BA005 exhibió el nivel más alto de señalización seguido en orden por BA008, BA006, BA007, BA002 y BA002_AF. BA003 y los controles de isotipo no mostraron sustancialmente señalización.
Señalización FcyRIIIA
En otro ejemplo, la capacidad de las variantes BA002 Fc para activar células reporteras que expresan FcγRIIIAV158 se probó. Brevemente, se añadieron células objetivo (es decir, células Jurkat modificadas para expresar TIGIT humana) a los pocillos de una placa de ensayo ADCC (2.4 x 106 células/mL). Se añadieron diluciones en serie de anticuerpo (es decir, anticuerpo anti-TIGIT BA002 o variantes Fc del mismo, o controles de isotipo apropiados (Evitria); un anticuerpo por pocillo) a los pocillos de la placa de ensayo con tampón de ensayo ADCC. Se añadieron a cada pocillo 150,000 células efectoras (es decir, células reporteras Jurkat NFAT-luciferasa que sobreexpresan FcγRIIIA CD16A con un polimorfismo de alta afinidad 158 V/V, menos de seis semanas en cultivo; Promega) y las mezclas se incubaron durante 20 horas a 37 °C. La unión del complejo anticuerpo/antígeno en las superficies de las células objetivo a CD16A en las superficies de las células efectoras daría como resultado la señalización al constructo reportero y la expresión de luciferasa.
Al día siguiente, las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se agregaron 75 µL de Reactivo de Ensayo de Luciferasa Bio-Glo (Promega Catalog #G7940) por pocillo. A continuación, las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos y se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas (Envision). RLU se calculó como RLU inducida - RLU de fondo.
Como se muestra en la Figura 12B, para la unión y señalización de FcγRIIIA, BA006 exhibió el mayor nivel de señalización, seguido en orden por BA002_AF, BA005, BA007 y BA002. BA003 y los controles de isotipo no mostraron sustancialmente señalización.
6.3.3 Variantes Fc de BA002 matanza mejorada de células TIGIT+ Jurkat en cocultivo con células NK CD16+ Se examinó la capacidad de las variantes Fc de BA002 para inducir la actividad de citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos en un cocultivo de células Jurkat que expresan TIGIT y células asesinas naturales (NK) que expresan CD16. Brevemente, las células Jurkat se cultivaron en RPMI 1640 (catálogo de Corning #10-040-CM, lote 35316005) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (catálogo de referencia #100-106, lote A69E00F) y glutamina Pen Strep al 1 % (catálogo de Gibco #10378-016, Lote 1835954). Las células NK se cultivaron en medio basal NK MACS (catálogo de MACS #130-107-209) complementado con un suplemento de medio NK MACS al 2 % (catálogo de MACS #130-107-210, lote 5160804070), suero humano al 5 % (catálogo de Sigma #H4522), Lote SLBQ9160V), Pen Strep Glutamina al 1 % (catálogo de Gibco #10378-016, Lote 1835954), 100 Unidades/mL IL-2 (catálogo de R&D Systems #202-16, Lote AE6016102), y 100 Unidades/mL IL-15 (catálogo de R&D Systems #247-II,B, Lote TLM1016102). Se sedimentaron dos millones de células Jurkat mediante centrifugación durante 5 minutos a 1200 rpm. Las células se tiñeron resuspendiendo el sedimento en 1 ml de CellTrace Far Red 0.5 µM (catálogo de Invitrogen #C34565, lote 1764050) en PBS (catálogo de Corning #21-040-CV, lote 00217005) e incubando durante 30 minutos a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 9 ml de PBS y las células se transformaron en pellas mediante centrifugación durante 5 minutos a 1200 rpm. A continuación, el sedimento celular se resuspendió en medio de cultivo Jurkat. Los anticuerpos se diluyeron en medio de cultivo Jurkat que contenía reactivo de detección verde CellEvent Caspase-3/71 µM (catálogo Invitrogen #C10423, lote 1849709) a seis veces su concentración final. Las células Jurkat teñidas se diluyeron a 0.5 millones de células por mL y las células NK a 0.75 millones de células por mL. El ensayo se realizó en placas de microscopía de 384 pocillos (Greiner, Cat. No. 781936, Lote E161233K) pipeteando 10 µL de los anticuerpos (concentraciones finales: 0.1, 1 y 10 µg/mL), 30 µL de células Jurkat teñidas (15000 células) y 20 µL de células NK (15000 células) por pocillo.
Inmediatamente después se realizaron imágenes en vivo utilizando un microscopio ImageXpress Micro Confocal High-Content (Molecular Devices) bajo control ambiental (37°C, CO2 al 5 %) y se adquirieron imágenes cada hora de los canales Cy5 (CellTrace Far Red) y FITC (Caspase 3/7) para células Jurkat y células Jurkat positivas para Caspase 3/7, respectivamente, en el transcurso de tres horas. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software de análisis MetaXpress (Molecular Devices). Se identificaron células Jurkat a partir del canal Cy5 y se cuantificó la cantidad de señal de Caspasa 3/7 por célula a partir del canal FITC. Las células con una intensidad de caspasa 3/7 por encima del fondo se designaron como apoptóticas. El número de células apoptóticas se normalizó frente al recuento total de células por condición para determinar una medida de destrucción porcentual.
Como se muestra en la Figura 13A, las variantes de Fc que exhibieron una unión mejorada a FcγRIIIA (BA006, BA007, BA005 y BA002_AF) promovieron la eliminación de células Jurkat que expresan TIGIT en mayor medida que BA002, que a su vez promovió la eliminación de células Jurkat que expresan TIGIT en mayor medida que BA003, que contiene la mutación N297A "Fc-silent" y control de isotipo.
6.3.4 BA002 y BA006 matan preferentemente a las células T reguladoras en comparación con las células T efectoras En un ejemplo, se examinó la capacidad de BA002 y BA006 para inducir ADCC en células T reguladoras primarias (Treg) y células T efectoras (Teff). Brevemente, el anticuerpo BA002, el anticuerpo BA006 y un anticuerpo de control de isotipo IgG1 se examinaron para determinar la actividad de ADCC en un cocultivo de células NK que expresan CD16 y (i) células T efectoras primarias o (ii) células T reguladoras primarias. Se aislaron células T primarias de PBMC y se expandieron durante 10 días de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. La identidad de las células T efectoras y las células T reguladoras se confirmó mediante análisis de citometría de flujo de los marcadores apropiados. Antes del ensayo ADCC, las células T efectoras y las células T reguladoras se depositaron en medio X-VIVO 15 (catálogo de Lonza #04-418Q, Lote 0000542070) complementado con 50 unidades/mL de IL-2 (catálogo de R&D Systems #202-16, Lote AE6016102), o estimulado en medio X-VIVO 15 suplementado con 50 unidades/mL de IL-2 y 25 µL por ml de activador de células T CD3/CD28 (catálogo Stemcell #10971, Lote 16L75402), durante 16 horas. Las células NK se cultivaron en medio basal NK MACS (catálogo de MACS #130-107-209) complementado con un suplemento de medio NK MACS al 2 % (catálogo de MACS #130-107-210, lote 5160804070), suero humano al 5 % (catálogo de Sigma #H4522), Lote SLBQ9160V), Pen Strep Glutamina al 1 % (catálogo de Gibco #10378-016, Lote 1835954), 100 Unidades/mL IL-2 (catálogo de R&D Systems #202-16, Lote AE6016102), y 100 Unidades/mL IL-15 (catálogo de R&D Systems #247-II,B, Lote TLM1016102). Las células T se sedimentaron por centrifugación durante 5 minutos a 1200 rpm. Las células se tiñeron resuspendiendo el sedimento en 1 mL de CellTrace Far Red 0.5 µM (catálogo de Invitrogen #C34565, lote 1764050) en PBS (catálogo de Corning #21-040-CV, lote 00217005) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de la incubación, se añadieron 9 ml de PBS y las células se transformaron en pellas mediante centrifugación durante 5 minutos a 1200 rpm. El sedimento celular se resuspendió en medio X-VIVO 15. Los anticuerpos se diluyeron en medio X-VIVO 15 que contenía reactivo de detección verde CellEvent Caspase-3/71 µM (catálogo de Invitrogen #C10423, lote 1849709) a seis veces su concentración final. Las células T teñidas se diluyeron a 0.5 millones de células por mL y las células NK a 0:75 millones de células por mL. El ensayo se realizó en placas de microscopía de 384 pocillos (catálogo de Greiner #781936, lote E161233K) pipeteando 10 µl de los anticuerpos (concentraciones finales: 1 y 10 µg/mL), 30 µL de células Jurkat teñidas (15000 células) y 20 µL de células NK (15000 células) por pocillo.
Inmediatamente después se realizaron imágenes en vivo utilizando un microscopio ImageXpress Micro Confocal High-Content (Molecular Devices) bajo control ambiental (37°C, CO2 al 5 %) y se adquirieron imágenes cada hora de los canales Cy5 (CellTrace Far Red) y FITC (Caspase 3/7) para células T y células T positivas para Caspase 3/7, respectivamente, en el transcurso de tres horas. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software de análisis MetaXpress (Molecular Devices). Las células T se identificaron a partir del canal Cy5 y la cantidad de señal de Caspasa 3/7 se cuantificó por célula a partir del canal FITC. Las células con una intensidad de caspasa 3/7 por encima del fondo se designaron como apoptóticas. El número de células apoptóticas se normalizó frente al recuento total de células por condición para determinar una medida de destrucción porcentual.
Como se muestra en la Figura 13B, tanto el anticuerpo anti-TIGIT BA002 como su variante Fc, BA006, mataron preferentemente las células T reguladoras en comparación con las células T efectoras a concentraciones de anticuerpo de 1 µg/mL y 10 µg/mL. BA006 exhibió generalmente niveles más altos de eliminación de células T y eliminación preferencial de células T reguladoras que BA002.
Sin querer limitarse a ningún mecanismo o teoría en particular, se contempla que BA002 bloquee la interacción entre TIGIT y PVR, inhibiendo así los mecanismos inhibidores de células T y NK mediados por TIGIT y promoviendo la señalización coestimuladora mediada por CD226. Esto puede resultar en la mejora de la función efectora de las células T y la secreción de citoquinas TH1. También se contempla que BA006 mejore aún más la unión y la señalización a través de FcyRIIIA y, por lo tanto, promueva interacciones más fuertes entre la célula T y APC. Esto, a su vez, puede mejorar la señalización de las células T y, al mismo tiempo, mantener un potente antagonismo de TIGIT. Por lo tanto, se contempla que al fortalecer la sinapsis inmune entre la célula T y APC, BA006 puede mejorar aún más la función efectora de la célula T y la secreción de citoquinas.
6.4 Ejemplo 4: Caracterización de un anticuerpo TIGIT antihumano variante Fc
Este ejemplo describe una caracterización adicional de BA006.
6.4.1 BA006 promueve la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA de un donante humano
Se probó la capacidad de BA006 para promover la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas con SEA de un donante humano.
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de anticuerpo BA006, anticuerpo BA002 o anticuerpos de control de isotipo para BA002 en tubos de bala de 1.2 mL. También se prepararon soluciones madre intermedias de un panel de anticuerpos anti-TIGIT de referencia y un anticuerpo de control de isotipo para BA006. Primero, se prepararon 400 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. A continuación, se añadieron 20 µL de anticuerpo por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas del nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Se contaron las células y se comprobó su viabilidad.
Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA agregando 10 µL de 1000 µg/mL de SEA a 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 12 µl de una solución madre intermedia de 100 µg/ml de SEA a los 7.20 mL de células preparadas anteriormente. Se agregaron 60 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante cuatro días. Un total de 0.1×106 células/pocillo y se utilizó una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se transfirieron 5 µL de sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA (Perkin Elmer) para medir la secreción de IL-2. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón de inmunoensayo AlphaLISA 10x en 22.5 ml de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar. Se preparó una mezcla de perlas aceptoras de AlphaLISA anti-IL-21.6x y anticuerpo anti-IL-2 biotinilado en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3x en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. Las unidades relativas de luz (RLU) se midieron utilizando el protocolo AlphaScreen en un lector de placas EnVision. Este experimento se realizó en cuatro repeticiones utilizando PBMC obtenidas de dos donantes diferentes.
Como se muestra en la Figura 14, los anticuerpos anti-TIGIT BA002 y BA006 mejoraron cada uno la secreción de IL-2 por las PBMC estimuladas con SEA, en comparación con los controles de isotipo y los anticuerpos de referencia, y BA006 indujo una secreción de IL-2 sustancialmente mayor en comparación con los otros anticuerpos anti-TIGIT probados.
6.4.2 Combinación de anticuerpos anti-TIGIT con anticuerpos que modulan otras moléculas de puntos de control inmunes
En este ejemplo, BA002 y su variante Fc, BA006, se probaron para determinar su capacidad para promover la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA cuando se administraron solos o en combinación con anticuerpos dirigidos a diversas moléculas de puntos de control inmunes (anticuerpos antagonistas anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 y anti-LAG-3 y anticuerpos agonistas anti-CD137 y anti-OX40).
Se preparó una solución madre intermedia concentrada 5x de cada anticuerpo suficiente para ocho repeticiones para dos donantes en tubos de bala de 1.2 mL. Primero, se prepararon 600 µL de 50 µg/mL de cada anticuerpo en medio R10. Para las muestras que recibirían una combinación de dos anticuerpos (es decir, combinaciones por pares entre (i) BA002 o BA006, y (ii) un anticuerpo antagonista anti-PD-1, un anticuerpo antagonista anti-PD-L1, un agonista anti-CD137 anticuerpo, o un anticuerpo agonista anti-OX40), ambos anticuerpos se prepararon en el mismo tubo de bala de 1.2 mL. A continuación, se añadieron 20 µL de mezcla de anticuerpos por pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo redondo para alcanzar concentraciones finales de 10 µg/mL de BA002 o BA006 en combinación con 5 µg/mL de anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1 o anticuerpo anti-OX40, o 5 µg/ml de BA002 o BA006 en combinación con 10 µg/ml de anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-LAG-3 o anticuerpo anti-CD137.
Se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC humanas a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C. Las células se transfirieron a 9 mL de medio R10 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 2000 rpm durante dos minutos. Se contaron las células y se evaluó su viabilidad. Las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante dos minutos y se resuspendieron a una concentración intermedia. Se hizo una concentración de solución madre intermedia de SEA diluyendo 10 µL de 1000 µg/mL de SEA en 90 µL de R10 para obtener una concentración intermedia de 100 µg/mL. Para estimular las células, se añadieron 40 µL de la solución madre intermedia de 100 µg/mL de SEA a los 32 ml de células preparadas como se describe anteriormente. Se añadieron 80 µL de células y mezcla SEA a los pocillos correspondientes y se incubaron en una cámara humidificada a 37 °C y CO2 al 5 % por cuatro días. Se utilizó un total de 0.1×106 células/pocillo y una concentración final de 100 ng/mL de SEA.
Después de cuatro días de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y se agitaron suavemente con la mano. A continuación, las placas se centrifugaron durante dos minutos a 2000 rpm. Se añadieron 5 µL del sobrenadante a una placa AlphaLISA de 384 pocillos (Perkin Elmer) para el análisis de citoquinas. Se usaron kits AlphaLISA para las mediciones de IL-2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el tampón de ensayo se preparó pipeteando 2.5 mL de tampón de inmunoensayo AlphaLISA 10X en 22.5 ml de agua. Se usó analito de IL-2 humana para preparar una dilución estándar. Se preparó una mezcla anti-IL-2 de anticuerpo biotinilado perlas aceptoras de AlphaLISA anti-IL-21.6X en tampón de ensayo. Se agregaron 8 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 90 minutos. Se preparó una solución madre intermedia de Perlas de Donante de Estreptavidina 2.3X en tampón de ensayo. Se agregaron 10 µL a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente, rotando a 500 rpm durante 20 minutos. Las placas AlphaLISA se centrifugaron brevemente a 2000 rpm. A continuación, se midieron las unidades de luz relativas (RLU) utilizando el protocolo AlphaScreen en un Lector de Placas EnVision.
Como se muestra en las Figuras 15A-15I, los anticuerpos BA002 y BA006 anti-TIGIT potenciaron la secreción de IL-2 por PBMC estimuladas por SEA cuando se proporcionaron solos. La secreción de IL-2 mejoró aún más cuando se administró el anticuerpo BA002 o BA006 en combinación con un anticuerpo antagonista anti-PD-1 (Figura 15A), uno de los dos anticuerpos antagonistas anti-PD-L1 (Figuras 15B-15C), un anticuerpo agonista anti-CD137 (Figura 15D), un anticuerpo antagonista anti-CTLA-4 (Figura 15E), un anticuerpo antagonista anti-LAG3 probado con células de dos donantes diferentes (Figuras 15F y 15G), o un anticuerpo agonista anti-OX40 probado con células de dos donantes diferentes (Figuras 15H y 15I).
Las capacidades de BA002 y BA006 para activar las PBMC de cynomolgus se examinaron mediante un método similar. Brevemente, se estimularon PBMC primarias de mono cynomolgus de los donantes 12 y 13 con 100 ng/mL de superantígeno de enterotoxina A estafilocócica (SEA) en presencia de 10 µg/mL de BA002 o BA006, y 10 µg/mL de un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo de control de isotipo durante 4 días. Las cantidades de IL-2 e IFNγ en los sobrenadantes de cultivo se midieron usando kits AlphaLISA.
Como se muestra en la Figura 16A, BA002 y BA006 mejoraron la secreción de IL-2 de las PBMC de cynomolgus solos o en combinación con el anticuerpo anti-PD-1. De manera similar, como se muestra en la Figura 16B, BA002 y BA006 aumentaron la secreción de IFNγ de las PBMC de cynomolgus solos o en combinación con el anticuerpo anti-PD-1.
6.4.3 Los anticuerpos anti-TIGIT mejoran la recuperación de la memoria de las células T
En este ejemplo, las funciones de BA002 y BA006 se probaron en ensayos de memoria de células T tipo I y tipo II. Recuperación de la memoria de células T tipo I
En el ensayo de recuperación de memoria de células T de tipo I, se recuperaron alícuotas congeladas de PBMC HLA-A*02:01 reactivas al citomegalovirus primario (CMV) de un donante humano a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente en agua a 37 °C hasta que se observó hielo flotante. Las células se transfirieron a 9 mL de medio X-Vivo 15 precalentado y se centrifugaron inmediatamente a 1500 rpm, 5 min. A continuación, las células se volvieron a suspender en 10 mL de medio R10 precalentado. Para contar las células y verificar la viabilidad, se extrajeron 20 µL de muestra y se agregaron a 380 µL de colorante de viabilidad, se mezcló y se leyó usando un aparato Muse. A continuación, las células se volvieron a suspender hasta una concentración intermedia 2X y un volumen total de 10 mL.
Las PBMC primarias se estimularon con una concentración final de 1.75 µg/mL de péptido CMV pp65 (NLVPMVATV; SEQ ID NO: 61), y se trató con 10 µg/mL de BA002, BA006, anticuerpo de referencia anti-TIGIT #7 o un anticuerpo de control de isotipo. Específicamente, se añadieron 35 µL de una solución madre de 1000 µg/ml de péptido CMVpp65 a los 10 mL de células preparadas anteriormente. Las células se mezclaron suavemente invirtiéndolas y se pipetearon 100 µL de la mezcla en los pocillos correspondientes. Los anticuerpos anti-TIGIT se prepararon de forma similar en soluciones madre intermedias 2X y se añadieron 100 µL de cada anticuerpo a los pocillos. Las células a una densidad final de 2.5×105 células/pocillo se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada.
Se añadieron diariamente péptido CMVpp65 fresco y anticuerpos anti-TIGIT durante 5 días. Específicamente, las células se centrifugaron a 1500 rpm, 2 min, se retiraron 20 µL de sobrenadante y se añadieron a las células 10 µL de péptido CMV pp65 y 10 µL de un anticuerpo anti-TIGIT. Las concentraciones finales del péptido CMV pp65 y del anticuerpo anti-TIGIT fueron de 1.75 µg/mL y 10 µg/mL, respectivamente. La secreción de IFNγ se evaluó diariamente durante seis días mediante el kit AlphaLISA (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Como se muestra en la Figura 17A, BA002 y BA006 indujeron una secreción creciente de IFNγ a lo largo del tiempo en el ensayo de recuperación de memoria tipo I en relación con el anticuerpo de referencia #7 o el control de isotipo, y BA006 indujo mayores niveles de IFNγ que BA002.
Para caracterizar la expresión de TIGIT en células T de memoria, se estimularon PBMC HLA-A*02:01 reactivas con CMV con 1.75 µg/mL de péptido pp65 de CMV durante 5 días como se describe anteriormente. Los linfocitos T de memoria efectora CD8 se enriquecieron seleccionando secuencialmente FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a SSC-H, CD3 frente a SSC-A, CD4 frente a CD8 y CD45RO contra CD197. Las células T de memoria efectoras CD8 se identificaron como CD8+ CD4- CD45RO+ CD197-. Los niveles de expresión de TIGIT, CD226 y CD96 en células T de memoria efectoras CD8 se determinaron mediante citometría de flujo.
Como se muestra en la Figura 17B, TIGIT, CD226 y CD96 se expresaron todos en las células T de memoria efectoras CD8. Este resultado sugirió que un anticuerpo anti-TIGIT podría tener un efecto directo sobre las células T de memoria efectoras CD8.
Para caracterizar aún más la función de los anticuerpos anti-TIGIT en la recuperación de la memoria de las células T, se estimularon PBMC HLA-A*02:01 reactivas con CMV con 1.75 µg/mL de péptido CMV pp65 en presencia de 10 µg/mL de BA002, BA006, anticuerpo de referencia anti-TIGIT #7 y/o un anticuerpo anti-PD-1 durante 5 días como se describe anteriormente. La secreción de IFNγ y TNFα se evaluó mediante kits AlphaLISA (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En un experimento similar, se estimularon PBMC HLA-A*02:01 reactivas con CMV con 1.75 µg/mL de péptido CMV pp65 en presencia de 10 µg/mL de BA002, BA006, anticuerpo de referencia anti-TIGIT #7 y/o un anticuerpo anti-PD-1 durante 6 días como se describe anteriormente. Las células T de memoria efectoras CD8 se identificaron como CD8+ CD45RO+ CD197-, y las células T de memoria efectoras CD4 se identificaron como CD4+ CD45RO+ CD197-, y la proliferación de células T se evaluó mediante la expresión de Ki67 mediante citometría de flujo.
Como se muestra en las Figuras 17C y 17D, BA002 y BA006 mejoraron la secreción de IFNγ y TNFα en el ensayo de recuperación de memoria tipo I, y BA006 fue más potente que BA002. La adición del anticuerpo anti-PD-1 aumentó aún más la secreción de IFNγ y TNFα. BA002 y BA006 también mejoraron la proliferación de células T de memoria efectoras CD8 en el ensayo de recuperación de memoria tipo I, y BA006 fue más potente que BA002 (Figura 17E). La adición del anticuerpo anti-PD-1 no aumentó sustancialmente la proliferación de células T de memoria efectoras CD8 en el grupo de tratamiento BA006. La proliferación de células T de memoria efectoras CD4 no se vio afectada sustancialmente por BA002, BA006 o el anticuerpo anti-PD-1 (Figura 17F).
Recuperación de la memoria de células T tipo II
En el ensayo de recuperación de memoria de células T tipo II, 1 µg/mL de antígeno completo de CMV (Astarte Biologics, Cat # 1004), que se sabe que se procesa principalmente y se presenta en moléculas MHC de clase II (aunque estos antígenos también se pueden presentar de forma cruzada en moléculas MHC de clase I), se usaron para estimular las PBMC reactivas con CMV. Específicamente, se añadieron 200 µL de una solución madre de 100 µg/mL de antígeno completo de CMV a 10 mL de PBMC de donante en medio R10. Las células se mezclaron suavemente invirtiéndolas y se pipetearon 100 µL de la mezcla en los pocillos correspondientes. Se añadieron 10 µg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 a algunos de los pocillos. Las células se incubaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y CO2 al 5 % dentro de una cámara humidificada durante 4 días a una densidad de 220,000 células/pocillo (Donante 11) o 250,000 células/pocillo (Donante 10). Las muestras de células se analizaron seleccionando secuencialmente FSC-A frente a SSC-A, FSC-H frente a FSC-A, SSC-A frente a SSC-H, CD3 frente a SSC-A y CD4 frente a CD8. El subconjunto de células T CD4+ se identificó como CD4+ CD8-, y el subconjunto de células T CD8+ se identificó como CD8+ CD4-. Dentro de cada subconjunto, las células T ingenuas, las células T efectoras (TEff), células T de memoria efectoras (TEM), y células T de memoria central (TCM) se identificaron como CD45RO-CD197+, CD45RO-CD197-, CD45RO+CD197-, y CD45RO+CD197+, respectivamente. Cada subconjunto se analizó en cuanto a su expresión de TIGIT detectada por un anticuerpo anti-TIGIT conjugado con APC.
Como se muestra en la Figura 18A, el antígeno completo de CMV aumentó el nivel de expresión de TIGIT en células CD4+ TEff, TEM, y TCM, y el anticuerpo anti-PD-1 mejoró aún más la expresión de TIGIT en células TEM y TCM. También se observó una mayor expresión de TIGIT en células CD8+ TEff, TEM, y TCM (Figura 18B), probablemente debido a la presentación cruzada de los antígenos en las moléculas MHC de clase I.
Para caracterizar aún más la función de los anticuerpos anti-TIGIT en la recuperación de memoria de células T tipo II, se incubaron PBMCs reactivas con CMV con 1 µg/mL de antígeno completo de CMV en presencia o ausencia de 10 µg/mL de BA002, BA006, anticuerpo de referencia anti-TIGIT #7 y/o un anticuerpo anti-PD-1 durante 4 días. La secreción de IFNγ en el medio de cultivo se analizó mediante kits AlphaLISA (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Como se muestra en las Figuras 18C y 18D, BA002 y BA006, cuando se combinaron con el anticuerpo anti-PD-1, ambos aumentaron la secreción de IFNγ de las PBMC, y BA006 fue más potente que BA002.
6.4.4 Los anticuerpos anti-TIGIT mejoran la citotoxicidad de las células T específicas de antígeno
En este ejemplo, se probaron los efectos de BA002 y BA006 sobre la citotoxicidad de las células T. Específicamente, las células T humanas primarias que expresan ectópicamente un NY-ESO-1 TCR se cocultivaron con células tumorales U251MG que expresan NY-ESO-1 durante 13 días para modelar el agotamiento de las células T. Para obtener imágenes en vivo, las células KARPAS 299 que expresan ectópicamente NY-ESO-1 se incubaron primero con 1 µM CellTrace Far Red Cell Proliferation Dye (Life Technologies) en PBS durante 30 minutos a 37 °C y CO2 al 5 % para marcar los cuerpos celulares. Las células marcadas se resuspendieron en medios de cultivo frescos y se sembraron a una densidad de 15,000 células por pocillo en una placa de microscopía de 384 pocillos. A continuación, se añadieron las células T agotadas a una densidad de 30,000 células por pocillo. Se añadió BA002, BA006 o un anticuerpo de control de isotipo correspondiente al cocultivo a una concentración de 10 µg/mL en combinación con 10 µg/mL de un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo de control de isotipo.
Las imágenes en vivo se recopilaron utilizando un microscopio ImageXpress Micro Confocal High-Content (Molecular Devices) a 37 °C y CO2 al 5 % en el canal Cy5 (CellTrace Far Red Cell Proliferation Dye) cada dos horas durante un curso de 24 horas. En total, para cada condición en cada momento, se adquirieron ocho imágenes (aumento de 20x) con un promedio de 1,211 células (±88 células, desviación estándar). El análisis de imágenes para cuantificar la cantidad de células KARPAS 299 asesinadas se realizó utilizando el software de análisis MetaXpress (Molecular Devices).
Como se muestra en la Figura 19, BA002 y BA006, solos o en combinación con el anticuerpo anti-PD-1, potenciaron la citotoxicidad de las células T contra las células tumorales que expresan antígenos.
6.4.5 Los anticuerpos anti-TIGIT mejoran la actividad de las células NK
En este ejemplo, se estudiaron los efectos de BA002 y BA006 sobre la activación de células NK.
Brevemente, se cultivaron PBMC recién descongeladas en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 % y 100 UI de IL-2 e IL-15. Las células se trataron con 20 µg/mL de BA002, BA006, anticuerpo de referencia #1 (IgG1 humana), anticuerpo de referencia #1 variante potenciada con Fc (IgG1 humana con sustituciones S239D/A330L/I332E en la región Fc), o un correspondiente anticuerpo de control de isotipo durante 5 horas. Las células K562 se agregaron opcionalmente como células objetivo para el cocultivo en una cantidad del 10 % de las PBMC.
Para teñir el marcador de activación de células NK CD107a, se añadió al cultivo celular un anticuerpo anti-CD107a conjugado con APC (Biolegend) a una dilución de 1:400. También se agregó monensina (eBiosciences) para prevenir la acidificación de las vesículas endocíticas, evitando así la degradación de CD107a que se reinternalizó desde la superficie celular. Además, se agregó Brefeldin A (eBiosciences) al cultivo celular para prevenir la exocitosis de vesículas que contienen citoquinas, lo que permite la visualización de la producción de citoquinas después de la estimulación.
Después del tratamiento, las PBMC se tiñeron para detectar marcadores de superficie celular durante 30 min usando un anticuerpo anti-CD56 conjugado con BUV737 (BD Biosciences) y un anticuerpo anti-CD3 conjugado con BV421 (Biolegend). Después del lavado, las células se incubaron en solución BD Cytofix/Cytoperm durante 20 min a 4 °C para la fijación y permeabilización. A continuación, las células se lavaron dos veces y se incubaron durante 30 min a 4 °C con un anticuerpo anti-IFNγ conjugado con AlexaFluor700 y un anticuerpo anti-TNFα conjugado con PECy7 (BD Biosciences) en solución BD Perm/Wash. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo.
Como se muestra en la Figura 20A, la población de linfocitos se identificó mediante un primer gráfico seleccionando el área de dispersión frontal (FSC-A) frente al área de dispersión lateral (SSC-A), y un segundo gráfico seleccionando el FSC-A frente a la altura del FSC (FSC-H) para la selección de células individuales. Las células NK se identificaron además de la población de linfocitos como CD3- CD56+. Las células NK activadas se identificaron como CD107a+. Como se muestra en la Figura 20B, los anticuerpos anti-TIGIT mejoraron el marcador de activación de CD107a en las células NK de las PBMC. Los anticuerpos anti-TIGIT también aumentaron la producción de IFNγ (Figura 20C) y TNFα (Figura 20D) en las células NK. Se observaron efectos similares con las células NK en PBMCs cocultivadas con células objetivo K562 (Figuras 20E-20G). BA006 mostró efectos más potentes sobre la activación de células NK que BA002. De manera similar, la variante del anticuerpo #1 de referencia que comprende sustituciones S239D/A330L/I332E en la región Fc fue más potente en la activación de células NK que el anticuerpo #1 de referencia que comprende una región Fc de IgG1 de tipo silvestre.
6.5 Ejemplo 5: Mapeo de epítopos
Los epítopos de BA002 y BA006 se estudiaron mediante espectrometría de masas de intercambio de hidrógenodeuterio (HDX) y mutagénesis de antígenos.
6.5.1 Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TIGIT por HDX
La interacción de TIGIT con el fragmento F(ab')2 de BA002 (BA002-F(ab')2) se evaluó utilizando los métodos que se describen a continuación.
Interacción de TIGIT con TIGIT F(ab')2 anti-humano
Se incubaron 10 µL de TIGIT humana (6.16 µg) o 20 µL de TIGIT humana y mezcla de F(ab')2 (6.16 µg: 30.8 µg) con 110 µL de tampón marcador de óxido de deuterio (fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 100 mM a pD 7.4) durante 0 seg, 60 seg, 300 seg, 1800 seg, 7200 seg y 14400 seg a 24 °C. El intercambio de hidrógeno/deuterio se detuvo añadiendo 125 µL de clorhidrato de guanidina 4 M, tampón TCEP 0.85 M (pH final 2.5). Posteriormente, las muestras templadas se sometieron a digestión en columna con pepsina/proteasa XIII y análisis LC-MS como se describe a continuación. Los espectros de masas se registraron en modo solo MS.
Análisis de datos HDX
Los datos de MS sin procesar se procesaron utilizando el software HDX WorkBench para el análisis de los datos de MS de intercambio H/D. Los niveles de deuterio se calcularon usando la diferencia de masa promedio entre el péptido deuterado y su forma nativa (t0). Para el cálculo de la incorporación de deuterio, los espectros de masas para un péptido dado se combinaron a través del pico del cromatograma de iones extraído y se calculó el promedio ponderado m/z. El aumento de masa desde la masa del péptido nativo (0 minutos) hasta la masa promedio ponderada corresponde al nivel de incorporación de deuterio.
Digestión con pepsina/proteasa XIII y LC-MS
Se desnaturalizaron 5 µg de TIGIT nativa o humana en 120 µL de tampón de control (fosfato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM a pH 7.4) añadiendo 120 µL de clorhidrato de guanidina 4 M, tampón TCEP 0.85 M (el pH final es 2.5) e incubando la mezcla durante tres minutos a 24 °C. A continuación, la mezcla se sometió a digestión con pepsina/proteasa XIII en columna utilizando una columna empaquetada de pepsina/proteasa XIII (p/p, 1:1), y los péptidos resultantes se analizaron utilizando un sistema UPLC-MS compuesto por un Waters Acquity UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo). Los péptidos se separaron en una columna C8 de 50 mm x 1 mm con un gradiente de 20.5 min del disolvente B al 2-28 % (ácido fórmico al 0.2 % en acetonitrilo). La identificación de péptidos se realizó buscando datos de MS/MS frente a la secuencia TIGIT humana con Mascot. La tolerancia de masa para los iones precursores y productos fue de 10 ppm y 0.05 Da, respectivamente. Unión al epítopo de TIGIT F(ab')2 anti-humano
La mayoría de los péptidos TIGIT mostraron niveles de deuterio idénticos o similares con y sin BA002-F(ab')2 presente. Sin embargo, se encontró que varios segmentos de péptidos tenían una incorporación de deuterio significativamente menor en BA002-F (ab')2 vinculante. Todos los residuos en este párrafo están numerados de acuerdo con la secuencia TIGIT de longitud completa establecida en SEQ ID NO: 29. Dos regiones, que consisten en los residuos 110-125 (YHTYPDGTYTGRIFLE, SEQ ID NO: 31) y residuos 54-57 (VTQV, SEQ ID NO: 32), mostraron una protección sustancial contra el deuterio cuando TIGIT humana se unió a BA002-F(ab')2. Una región adicional que consiste en los residuos 68-81 (ICNADLGWHISPSF, SEQ ID NO: 33) también mostró protección contra el deuterio cuando la TIGIT humana se unió a BA002-F(ab')2. Por lo tanto, estas regiones corresponden a uno o más epítopos, o porciones de los mismos, de BA002 en TIGIT humana, tal como se muestra en la Figura 21.
6.5.2 Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TIGIT por mutagénesis de antígenos
En este ejemplo, la unión de BA006, así como de seis anticuerpos de referencia, a TIGIT humana y proteínas mutantes se caracterizó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Brevemente, la estructura del dominio extracelular de la TIGIT humana se obtuvo de la base de datos PDB (referencia No. 3UDW) y se aisló de la estructura de un complejo TIGIT-PVR. Entre los residuos de aminoácidos ubicados dentro de las regiones epitópicas identificadas en la Sección 6.5.1, se encontró que T34, Q35, I47, N49, L52, H55, P58, H90, T96, T98, R100 y F102 tienen una cadena lateral que mira hacia la superficie de unión de PVR (Figura 22A). Estos residuos se seleccionaron para el análisis de mutagénesis de antígenos. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas TIGIT humanas mutadas se proporcionan en la Tabla 3.
En el experimento SPR, los anticuerpos anti-TIGIT se capturaron individualmente a un caudal de 10 µl/min en las células de flujo 2, 3 y 4, manteniendo como referencia la célula de flujo 1, en un chip CM5 en el que se había inmovilizado un anticuerpo Fab antihumano mediante acoplamiento de amina. Las proteínas TIGIT mutantes y de tipo silvestre se analizaron de forma independiente en todas las células de flujo a una concentración de 100 nM a 50 µl/min durante 90 segundos, seguido de una fase de disociación de 400 segundos. La respuesta de unión máxima se midió en función de los sensogramas, y los porcentajes de unión de cada anticuerpo en relación con la afinidad por la proteína TIGIT de tipo silvestre se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Unión de anticuer os anti-TIGIT a TIGIT de ti o silvestre mutante.
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Como se muestra en la Tabla 5, las mutaciones individuales de Q35A, I47E, N49A, H90A, T96A y T96I redujeron la unión de BA006 a TIGIT humana, lo que sugiere que BA006 probablemente se une a TIGIT a través de uno o más epítopos conformacionales que comprenden Q35, I47, N49, H90 y/o T96 (Figura 22B). BA006 no fue sensible a las mutaciones de L52A, H55A, F102A e I56V/S57A/P58S/S59V en estos experimentos, lo que indica que probablemente BA006 no se unió directamente a L52, H55, I56, S57, P58, S59 o F102 de TIGIT humano. Este conjunto de epítopos es único y no es idéntico a los resultados del mapeo de epítopos de los anticuerpos de referencia.
6.6 Ejemplo 6: Farmacología in vivo de un anticuerpo anti-TIGIT en un modelo de ratón
Como se describió anteriormente, BA002 y BA006 mejoraron considerablemente las actividades de las células T in vitro. Sin embargo, estos anticuerpos no se unieron a la proteína TIGIT murina. Para estudiar las funciones in vivo de BA002 y BA006 en modelos de ratón, se generaron anticuerpos sustitutos que se unieron a TIGIT murino. Brevemente, las regiones VH y VL de un anticuerpo de referencia TIGIT se unieron a regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera murinas, respectivamente. El anticuerpo sustituto mIgG2a, el anticuerpo sustituto mIgG2a-N297Q, el anticuerpo sustituto mIgG1 y el anticuerpo sustituto mIgG2 (potenciado con Fc) tienen diferentes regiones Fc, pero comparten la misma secuencia de cadena ligera. Generalmente se reconoce en la técnica que mIgG2a es funcionalmente similar a la IgG1 humana. Las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-TIGIT sustitutos de ratón.
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6.6.1 Los anticuerpos anti-TIGIT inhibieron el crecimiento tumoral en un modelo de intervención temprana
Los anticuerpos sustitutos de ratón se probaron en un modelo de ratón de intervención temprana. Específicamente, los ratones Balb/c (Jackson Labs #000651) de 6 a 8 semanas de edad se aclimataron primero durante dos semanas y se afeitaron y etiquetaron. Células de carcinoma colorrectal de ratón CT26 (ATCC® CRL-2638™) se expandieron en cultivo tisular en medio RPMI suplementado con FBS inactivado por calor al 10 % y normocina durante 1 semana. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 1 × 105 células CT26 suspendidas en 100 μL de PBS. Se permitió que las células tumorales implantadas se establecieran durante 7 días para alcanzar un tamaño de aproximadamente 35-40 mm3. Luego, los ratones se aleatorizaron y se trataron con 200 µg de anticuerpo sustituto mIgG2a, anticuerpo sustituto mIgG2a-N297Q, anticuerpo sustituto mIgG1 o un anticuerpo de control de isotipo (mIgG2a) dos veces por semana mediante administración intraperitoneal. A modo de comparación, se administraron 200 µg de un anticuerpo anti-PD-1 a los ratones por vía intraperitoneal dos veces por semana. Los volúmenes de los tumores se midieron quincenalmente con un calibrador y se calcularon como largo × ancho2 × 0.5.
Como se muestra en las Figuras 23A-23F, el anticuerpo sustituto mIgG2a condujo a una respuesta completa en uno de cinco ratones y suprimió sustancialmente el crecimiento tumoral en tres de cinco ratones. El anticuerpo anti-PD-1 también redujo la tasa de crecimiento del tumor. Por el contrario, el anticuerpo sustituto mIgG2a-N297Q y el anticuerpo sustituto mIgG1 tuvieron poco efecto sobre el crecimiento tumoral. Este resultado corroboró la observación in vitro de que la función efectora de Fc mejoró la capacidad de un anticuerpo anti-TIGIT para activar la inmunidad de las células T.
A continuación, se probaron tratamientos combinados de un anticuerpo anti-TIGIT y un anticuerpo anti-PD-1 en el modelo de intervención temprana. Los ratones que albergaban tumores CT26 se generaron como se describió anteriormente y se trataron con 200 µg de anticuerpo sustituto mIgG2a, anticuerpo sustituto mIgG2a-N297Q, anticuerpo sustituto mIgG1 o un anticuerpo de control de isotipo (mIgG2a) en combinación con 200 µg del anticuerpo anti-PD- 1 dos veces por semana vía administración intraperitoneal.
Como se muestra en las Figuras 24A-24G, el tratamiento combinado del anticuerpo sustituto mIgG2a y el anticuerpo anti-PD-1 condujo a una respuesta completa en tres de cinco ratones. Por el contrario, la combinación del anticuerpo sustituto mIgG2a-N297Q y el anticuerpo anti-PD-1 tuvo poco efecto sobre el crecimiento tumoral en relación con el anticuerpo anti-PD-1 solo.
6.6.2 Los anticuerpos anti-TIGIT inhiben el crecimiento tumoral en un modelo de intervención tardía
Los anticuerpos anti-TIGIT y las combinaciones también se examinaron en un modelo de ratón de intervención tardía. Específicamente, los ratones Balb/c (Jackson Labs #000651) de 6 a 8 semanas de edad se aclimataron primero durante dos semanas y se afeitaron y etiquetaron. Células de carcinoma colorrectal de ratón CT26 (ATCC® CRL-2638™) se expandieron en cultivo tisular en medio RPMI suplementado con FBS inactivado por calor al 10 % y normocina durante 1 semana. Los ratones fueron inyectados con 5x104 células CT26 en 100 μL de PBS por vía subcutánea. Se permitió que las células tumorales implantadas se establecieran durante 12 días, cuando el tamaño medio del tumor era de 85 mm3. Los ratones sin tumores detectables o con volúmenes tumorales superiores a 300 mm3 se excluyeron del estudio. En los días 12, 16 y 20 posteriores a la implantación del tumor, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 100 µg de anticuerpo sustituto mIgG2a o anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc), o el anticuerpo de control de isotipo respectivo. Los volúmenes de los tumores se midieron quincenalmente con un calibrador y se calcularon como largo × ancho2 × 0.5.
Como se muestra en las Figuras 25A-25E, el anticuerpo sustituto mIgG2a y el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) redujeron el crecimiento tumoral, y el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) fue más potente que el anticuerpo sustituto mIgG2a.
El efecto de combinar un anticuerpo anti-TIGIT con otra molécula dirigida a un punto de control sobre la supresión tumoral también se probó en el modelo de intervención tardía. Específicamente, los ratones se inocularon como se describe anteriormente, y el tamaño medio del tumor 12 días después de la inoculación fue de 70-120 mm3. Los ratones se trataron con 100 µg de anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc), 100 µg de un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA-4, o una combinación de los mismos, los días 12, 16 y 20 postimplantación tumoral. El crecimiento del tumor se monitorizó cada dos semanas usando un calibrador digital.
Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, las combinaciones del anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) con el anticuerpo anti-PD-1 o el anticuerpo anti-CTLA-4 redujeron sustancialmente el crecimiento tumoral en este modelo animal.
6.6.3 Los anticuerpos anti-TIGIT promueven la infiltración de células T CD8+ en tumores
La inhibición del crecimiento tumoral por parte de los anticuerpos anti-TIGIT podría deberse a la activación de las células T efectoras o a la supresión de las células T reguladoras (Tregs). Para comprender el mecanismo de esta regulación, se inocularon ratones BALB/c con 5×104 células CT26 por vía subcutánea. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 50-80 mm3 después de 12-14 días, los ratones se aleatorizaron y se trataron con una dosis única de 100 µg de anticuerpo sustituto mIgG2a, anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) o el anticuerpo de control de isotipo respectivo mediante administración intraperitoneal. Se usó como control positivo un anticuerpo anti-GITR en el formato mIgG2a ("DTA-1 (mIgG2a)") que se sabía que agotaba las Tregs. Los ratones se sacrificaron a las 0, 24, 72 o 120 horas después del tratamiento para la recogida de muestras de tumores y de ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) (Figura 27A).
Como se muestra en las Figuras 27B-27F, la administración del anticuerpo sustituto m!gG2a o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) no afectó sustancialmente la cantidad de FoxP3+ Tregs intratumoral, CD4+ intratumoral no Tregs, o TDLN FoxP3+ Tregs, pero aumentó significativamente la cantidad de células T CD8+ intratumorales. Por lo tanto, aunque no se desea limitar la teoría, se planteó la hipótesis de que el anticuerpo sustituto mIgG2a o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) inhibía el crecimiento tumoral al promover la infiltración de células T CD8+ en los tumores.
6.6.4 Los anticuerpos anti-TIGIT activan las células T efectoras de manera dependiente de FcyRIV
Como se describió anteriormente, el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) fue más potente que el anticuerpo sustituto mIgG2a en la supresión tumoral, lo que sugiere que la capacidad del Fc para unirse a los receptores Fcy podría desempeñar un papel en la función de los anticuerpos anti-TIGIT. El FcyRIV murino se conocía como un receptor primario de mIgG2a, y se sabía que la región Fc del anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) se unía al FcyRIV murino con una mayor afinidad que la región Fc del anticuerpo sustituto mIgG2a. Por lo tanto, se examinó la capacidad del anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) para potenciar la señalización de FcyRIV. Brevemente, las células CHO modificadas para expresar TIGIT murina se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 %, HEPES 10 mM, Pen/Strep-Glutamina 1X y puromicina 1 µg/ml. Las células se resuspendieron en medio de cultivo fresco a 2.4 x 106 células/mL y se añadieron 25 µL de las células a cada pocillo de una placa de ensayo blanca de 96 pocillos. Se preparó una serie de diluciones del anticuerpo sustituto m!gG2a, o su anticuerpo de control de isotipo, o el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) o su anticuerpo de control de isotipo, en medio de cultivo, y se añadieron 25 µl del anticuerpo a las células. Células T efectoras (células Jurkat) que expresan de forma estable FcyRIV murino y que tienen un reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor sensible al factor nuclear de células T activadas (NFAT) (variante ADCC V, Promega) se descongelaron y resuspendieron a 6 × 106 células/mL en RPMI 1640 suplementado con FBS al 4 % y se añadieron 25 µl de las células efectoras a cada pocillo. El cocultivo se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 20 horas. Se añadieron 75 µl de reactivo de ensayo Bio-Glo Luciferase a cada pocillo y se midieron los valores de luminiscencia con un lector de placas (Envision) después de 5-10 minutos de incubación a temperatura ambiente.
Como se muestra en la Figura 28A, el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) indujo una actividad NFAT más fuerte en las células T efectoras que el anticuerpo sustituto mIgG2a, lo que indica que el anticuerpo sustituto mIgG2a (potenciado con Fc) tenía una mayor función efectora.
Para dilucidar aún más la función de FcyRIV en la activación de células T mediada por anticuerpos anti-TIGIT, se pretrataron ratones C57BL/6 con 100 µg de un anticuerpo anti-FcyRIV (Biolegend, catálogo # 149502) o vehículo de control mediante inyección intraperitoneal. Después de 30 minutos, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 100 µg del superantígeno SEB junto con 100 µg del anticuerpo sustituto m!gG2a, un anticuerpo anti-CTLA-4 (m!gG2a) o un anticuerpo de control de isotipo. Las células T se aislaron de la sangre periférica después de 3 días, y las células T efectoras CD4+ o CD8+ específicas de SEB (Vβ8+) (CD44+CD62L-) se cuantificaron mediante citometría de flujo para la proliferación ( % Ki67 positivo).
Como se muestra en las Figuras 28B y 28C, el anticuerpo anti-FcyRIV redujo significativamente la proliferación de células T efectoras CD4+ y CD8+ específicas de antígeno mediadas por el anticuerpo sustituto mIgG2a o el anticuerpo anti-CTLA-4. Por lo tanto, la participación conjunta de FcyR mejoró la coestimulación de células T mediada por los anticuerpos anti-TIGIT y anti-CTLA-4 en este modelo murino de cebado de células T.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el anticuerpo una región variable (VH) de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10.
2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 humana.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende:
(a) una región constante de cadena pesada de IgG1, opcionalmente en la que
(i) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; (ii) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende una mutación N297A, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(iii) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; (iv) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1comprende las mutaciones L234F, L235F y N297A, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(v) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; (vi) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende las mutaciones S239D e I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(vii) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22; (viii) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende las mutaciones S239D, A330L e I332E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(ix) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23; (x) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende las mutaciones L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(xi) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24; (xii) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende las mutaciones S267E y L328F, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de la EU;
(xiii) la región constante de cadena pesada de IgG1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; o (xiv) la región constante de cadena pesada de IgG1 está afucosilada; o
(b) una región constante de cadena pesada de IgG4, opcionalmente en la que
(i) la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgG4 comprende una mutación S228P, numerada de acuerdo con el sistema de numeración de la EU; y/o
(ii) la región constante de cadena pesada de IgG4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
4. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28.
5. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 11-18 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
6. El anticuerpo aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que:
(a) el anticuerpo es un anticuerpo humano;
(b) el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico;
(c) el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico, agente citostático, toxina, radionúclido o marcador detectable; y/o
(d) el anticuerpo se entrecruza con un segundo anticuerpo o un fragmento del mismo.
7. Un polinucleótido aislado que codifica VH y VL, o una cadena pesada y una cadena ligera, del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7.
9. Una célula huésped recombinante que comprende:
(a) el polinucleótido de la reivindicación 7;
(b) el vector de la reivindicación 8; o
(c) un primer polinucleótido que codifica la VH, o una cadena pesada, del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un segundo polinucleótido que codifica la VL, o la cadena ligera, del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1- 6.
10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, el polinucleótido de la reivindicación 7, el vector de la reivindicación 8 o la célula huésped de la reivindicación 9, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humana, comprendiendo el método cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 de modo que se exprese el polinucleótido y se produzca el anticuerpo.
12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, el polinucleótido de la reivindicación 7, el vector de la reivindicación 8, la célula huésped de la reivindicación 9, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento del cáncer o el tratamiento de una enfermedad infecciosa, opcionalmente en el que
(a) el anticuerpo es
(i) administrado por vía intravenosa, opcionalmente a 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, o más, opcionalmente a intervalos de una vez cada tres semanas;
(ii) administrado por vía subcutánea;
(iii) administrado por vía intratumoral, opcionalmente a 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg /kg, o más, opcionalmente a intervalos de una vez cada tres semanas; o
(iv) administrado a un ganglio linfático de drenaje tumoral; y/o
(b) se administra un agente terapéutico adicional, opcionalmente en el que el agente terapéutico adicional se administra sistémicamente, opcionalmente en el que
(i) el anticuerpo se administra para su uso en el tratamiento de un tumor sólido y el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo anti-PD-1, en el que opcionalmente el anticuerpo anti-PD-1 es pembrolizumab o nivolumab; (ii) el anticuerpo se administra para su uso en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-EGFR, opcionalmente en el que el anticuerpo anti-EGFR es cetuximab, opcionalmente en el que se administra un agente quimioterapéutico, opcionalmente en el que el agente quimioterapéutico se administra sistémicamente, y opcionalmente en el que el agente quimioterapéutico es gemcitabina;
(iii) el anticuerpo se administra para su uso en el tratamiento del cáncer de mama HER2+ y el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-HER2, opcionalmente en el que el anticuerpo anti-HER2 es trastuzumab, opcionalmente en el que se administra un agente quimioterapéutico, opcionalmente en el que el agente quimioterapéutico es administrado sistémicamente, opcionalmente en el que el agente quimioterapéutico es gemcitabina;
(iv) el agente terapéutico adicional es un quimioterapéutico o un agente dirigido a puntos de control, en el que el agente dirigido a puntos de control se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, anticuerpo PD-L2, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista, un anticuerpo anti-TIM-3 antagonista, un anticuerpo anti-LAG-3 antagonista, un anticuerpo VISTA antagonista, un anticuerpo CD96 antagonista, un anticuerpo anti-CEACAM1 antagonista, un anticuerpo anti-CD137 agonista, un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-OX40 agonista;
(v) el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO), en el que opcionalmente el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en epacadostat, F001287, indoximod y NLG919; o
(vi) el agente terapéutico adicional es una vacuna, opcionalmente en el que la vacuna comprende un complejo peptídico de proteína de choque térmico (HSPPC) que comprende una proteína de choque térmico complejada con un péptido antigénico, opcionalmente en el que
(1) la proteína de choque térmico es hsc70 y forma un complejo con un péptido antigénico asociado a tumores; o (2) la proteína de choque térmico es la proteína gp96 y forma un complejo con un péptido antigénico asociado a un tumor, en el que la HSPPC se deriva de un tumor.
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