ES2960763T3 - Anticuerpos monoclonales contra el epítopo de HER2 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos monoclonales contra el epítopo de HER2 y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Suministro de anticuerpos monoclonales totalmente humanos que reconocen HER2 y métodos para utilizar dichos anticuerpos monoclonales en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales contra el epítopo de HER2 y métodos de uso de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere, en general, a la generación de anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor HER2 humano, a anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos de HER2 específicos dentro del dominio extracelular del receptor HER2 humano y a métodos de uso de estos anticuerpos monoclonales como terapéuticos y/o diagnósticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los miembros de la familia ErbB de tirosina cinasas receptoras son mediadores importantes del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros distintos, que incluyen receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbB1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2). Tanto los homo- como los heterodímeros están formados por los cuatro miembros de la familia de EGFR, siendo HER2 el componente de dimerización preferido y más potente para otros receptores de ErbB (Graus-Porta et al., Embo 3 1997; 16:1647-1655; Tao et al., J Cell Sci 2008; 121:3207-3217). HER2 no tiene ligando conocido, pero se puede activar por homodimerización cuando se sobreexpresa, o por heterodimerización con otros receptores de ErbB ocupados por ligando.
El gen HER2 (también conocido como el gen HER2/neu y ErbB2) se amplifica en el 20-30 % de cánceres de mama de estadio temprano, que hace que sobreexprese los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la membrana celular (Bange, et al., Nature Medicine 7 (5): 548-552). Además del cáncer de mama, la expresión de HER2 también se ha asociado a otros tipos de carcinoma humano, que incluyen cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de esófago y carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (Garcia de Palazzo et al., Int J Biol Markers 1993; 8:233-239; Ross et al., Oncologist 2003; 8:307-325; Osman et al., J Urol 2005; 174:2174-2177; Kapitanovic et al., Gastroenterology 1997; 112:1103-1113; Turken et al., Neoplasma 2003; 50:257-261; y Oshima et al., Int J Biol Markers 2001; 16:250-254).
Trastuzumab (Herceptin®) es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante dirigido contra el dominio IV de la proteína HER2, bloqueando así la homodimerización de HER2 independiente de ligando y a un menor grado la heterodimerización de HER2 con otros miembros de la familia en células con elevada sobreexpresión de HER2 (Cho et al., Nature 2003; 421:756-760 y Wehrman et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103:19063-19068). Herceptin® ha sido autorizado tanto para tratamiento de primera línea como adyuvante de HER2 que se sobreexpresa en cáncer de mama metastásico, ya sea en combinación con quimioterapia, o como un único agente después de uno o más tratamientos de quimioterapia. Se ha descubierto que trastuzumab solo es eficaz en el 20-50 % de pacientes con tumor de mama que sobreexpresan HER2 y muchos de los respondedores iniciales muestran recaída después de algunos meses (Dinh et al., Clin Adv Hematol Oncol 2007; 5:707-717).
Pertuzumab (Omnitar/Perjeta®, también llamado 2C4) es otro anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el dominio II de la proteína HER2, lo que da como resultado la inhibición de la heterodimerización inducida por ligando (es decir, HER2 que dimeriza con otro miembro de la familia de ErbB al que se ha unido un ligado); un mecanismo informado que no requiere estrictamente altos niveles de expresión de HER2 (Franklin et al., Cancer cell 2004; 5:317-328.). Pertuzumab está autorizado para el tratamiento de cáncer de mama con sobreexpresión del receptor HER2, en combinación con trastuzumab y docetaxel.
Un conjugado anticuerpo contra HER2-fármaco (ADC), trastuzumab emtansina (ado-trastuzumab emtansina, Kadcyla®), es un conjugado anticuerpo-fármaco que consiste en el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin) unido al agente citotóxico mertansina (DM1). Kadcyla como agente individual ha sido autorizado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico (MBC) con sobreexpresión del receptor HER2 (HER2+) que recibió previamente trastuzumab y un taxano, por separado o en combinación.
Aunque muchos factores participan en la selección de un anticuerpo adecuado para la terapia dirigida a HER2, normalmente es una ventaja para un enfoque de ADC si el complejo de anticuerpo contra HER2 se internaliza eficientemente tras la unión al anticuerpo. Sin embargo, en comparación con EGFR, se altera la internalización de HER2.
Spiridon et al. informan del direccionamiento de múltiples epítopos de Her-2 con anticuerpos monoclonales, y desvelan supuestamente la actividad anti-crecimiento mejorada de línea de una célula de cáncer de mama humanain vitroein vivo(Spiridon et al.; Clinical Cancer Research; The American Association for Cancer Research; US; Vol. 8; No. 6; 1 de junio de 2002; páginas 1720-1730).
El documento de patente US 2012/321583 A1 (Yurkovetskiy Aleksandr et al.; 20 de diciembre de 2012) informa de un conjugado de fármaco que comprende una molécula de reconocimiento basada en proteína (PBRM) y armazones poliméricos para conjugar con una PBRM para formar un conjugado polímero-fármaco-PBRM.
Los complejos mecanismos que regulan la función de HER2 garantizan una investigación adicional en nuevas y optimizadas estrategias terapéuticas contra este protoncogén.
Por consiguiente, existe una necesidad de terapias que se dirijan a las actividades biológicas de HER2.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, como se proporciona por la reivindicación 1.
La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente HER2, también conocidos como (ErbB2, p185neu y/o HER2/neu). Los anticuerpos desvelados en el presente documento son capaces de y útiles en modular, por ejemplo, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la vía de PI3K-Akt que promueve la supervivencia celular reduciendo los niveles de AKT fosforilado. Los anticuerpos desvelados en el presente documento también son capaces de y útiles en modular, por ejemplo, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la homodimerización y/o heterodimerización independiente de ligando de HER2. Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen anticuerpos que se unen a HER2 soluble.
Los anticuerpos de la presente invención presentan características de unión a HER2 que se diferencian de los anticuerpos descritos en la técnica. Particularmente, los anticuerpos desvelados en el presente documento se unen a epítopos de HER2 diferentes, en eso se bloquean de forma cruzada entre sí, pero no la unión de trastuzumab, pertuzumab, Fab37 ni chA21 a HER2. Además, a diferencia de los anticuerpos conocidos, los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden internalizarse eficientemente en células que expresan HER2 sin promover la proliferación celular.
Los anticuerpos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento son anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen a epítopos novedosos y/o tienen otras propiedades favorables para uso terapéutico. Las propiedades a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, características de unión favorable a células cancerosas que expresan HER2 humano a altos o bajos niveles, unión específica a HER2 recombinante humano y de macaco cangrejero, internalización eficiente tras la unión a HER2, elevada capacidad para destruir células cancerosas que expresan altos o bajos niveles de HER2 cuando se administran como un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), sin efecto agonista sustancial sobre la proliferación de células cancerosas que expresan HER2 y proporcionan destrucción eficaz mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de células que expresan HER2, así como cualquier combinación de las propiedades anteriores.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye los residuos 452 a 531 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 474 a 553 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 452 a 531 de SEQ ID NO: 39.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que une al menos una porción del extremo N de dominio IV del receptor HER2 humano, pero no compite de forma cruzada con un anticuerpo que se une al epítopo 4D5 del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en el presente documento no compiten de forma cruzada con trastuzumab para unirse al receptor HER2 humano, ya que se sabe que trastuzumab se une al epítopo 4D5 del receptor HER2 humano. Como se usa en el presente documento, el término epítopo 4D5 del receptor HER2 humano se refiere a los residuos de aminoácidos 529 a 627 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 551 a 649 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 529 a 627 de SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo también se une a al menos un epítopo en el receptor HER2 de macaco cangrejero.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye los residuos 452 a 500 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 474 a 522 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 452 a 500 de SEQ ID NO: 39.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye al menos uno de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos E521, L525 y R530 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 543, 547 y 552 de SEQ ID NO: 38, y los residuos 521, 525 y 530 de SEQ ID NO: 39. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos dos residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos E521, L525 y R530 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye al menos los residuos de aminoácidos E521, L525 y R530 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. En algunas realizaciones, cualquiera o todos de estos anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también se unen a al menos un epítopo en el receptor HER2 de macaco cangrejero.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a al menos una porción de dominio III y al menos una porción del extremo N de dominio IV del receptor HER2 humano, pero no compite de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal Fab37 o un anticuerpo que se une al epítopo 4D5 del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en el presente documento no compiten de forma cruzada con el anticuerpo monoclonal Fab37 y/o trastuzumab por la unión al receptor HER2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo también se une a al menos un epítopo en el receptor HER2 de macaco cangrejero.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye los residuos 520 a 531 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 542 a 553 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 520 a 531 de SEQ ID NO: 39.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los residuos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 475, 478, 495, 498, 517, 518, 519 y 521 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 453, 456, 473, 476, 495, 496, 497 y 499 de SEQ ID NO: 39. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos dos residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos tres residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos cuatro residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos cinco residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos seis residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos residuos de aminoácidos C453, H456, H473, N476, R495, G496, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. En algunas realizaciones, cualquiera o todos de estos anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también se unen a al menos un epítopo en el receptor HER2 de macaco cangrejero.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que incluye al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los residuos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano, por ejemplo, los residuos 475, 495, 498, 517, 519, y 521 de SEQ ID NO: 38 o los residuos 453, 473, 476, 495, 497 y 499 de SEQ ID NO: 39. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos dos residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos tres residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos cuatro residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos cinco residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos seis residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. Por ejemplo, los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del dominio extracelular del receptor HER2 humano que incluye al menos los residuos de aminoácidos C453, H473, N476, R495, H497 y W499 del dominio extracelular del receptor HER2 humano. En algunas realizaciones, cualquiera o todos de estos anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos también se unen a al menos un epítopo en el receptor HER2 de macaco cangrejero.
Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.
Los anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, el anticuerpo XMT 1517, el anticuerpo XMT 1518, el anticuerpo XMT 1519 y el anticuerpo XMT 1520 descritos en el presente documento. Alternativamente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se bloquea de forma cruzada mutuamente pero no se une al mismo epítopo que trastuzumab, pertuzumab, Fab37 o chA21 (que se unen a epítopos específicos en el dominio IV, dominio II, dominio III y dominio I de HER2, respectivamente) o biosimilares del mismo. Estos anticuerpos se denominan respectivamente en el presente documento anticuerpos contra "HER2". Los anticuerpos contra HER2 incluyen anticuerpos monoclonales completamente humanos, así como anticuerpos monoclonales humanizados y anticuerpos quiméricos. Estos anticuerpos muestran especificidad por HER2 humano, y se ha mostrado que modulan, por ejemplo, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren de otro modo con la vía de PI3K-Akt que promueve la supervivencia celular reduciendo los niveles de AKT fosforilado. Estos anticuerpos se internalizan desde la superficie celular de células que expresan HER2 a una tasa que es la misma o sustancialmente similar a la tasa a la que se internaliza trastuzumab o un biosimilar del mismo. Por ejemplo, estos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno tienen una tasa de internalización que es aproximadamente el 50 % de la superficie total unida en tiempo 0 que se internaliza en 4 horas.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3, 5, y 7 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una combinación de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en (i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (iii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (iv) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 respectivamente.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una combinación de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en (i) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 2; (ii) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 4; (iii) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 6; y (iv) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 2.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 6.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 11, 13 y 15 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una combinación de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (iii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (iv) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 11, 13 y 15 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una combinación de secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en (i) la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10; (ii) la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12; (iii) la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 14; y (iv) la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 10.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, el anticuerpo desvelado en el presente documento contiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13, y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 16.
Las tres CDR de cadena pesada de los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 25, y 30; una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 23, 26, y 31; y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 27.
Las tres CDR de cadena ligera de los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (CDRL1) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 y 28; una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 y 24; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y 29.
Los anticuerpos incluyen una combinación de secuencia de CDR de cadena pesada y secuencias de CDR de cadena ligera que incluyen una CDRH1 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 25 y 30; una CDRH2 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 23, 26 y 31; una CDRH3 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 27; una CDRL1 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 y 28; una CDRL2 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 y 24; y una CDRL3 que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o más idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y 29.
Las tres CDR de cadena pesada de los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen una CDRH1 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 25 y 30; una CDRH2 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 23, 26 y 31; y una CDRH3 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 27.
Las tres CDR de cadena ligera de los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen una CDRL1 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 y 28; una CDRL2 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 y 24; y una CDRL3 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y 29.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento incluyen una combinación de secuencias de CDR de cadena pesada y cadena ligera que incluye una CDHR1 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 25 y 30; una CDRH2 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 23, 26 y 31; una CDRH3 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 y 27; una CDRL1 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 y 28; una CDRL2 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 y 24; y una CDRL3 que incluye una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 y 29.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen una combinación de secuencias de aminoácidos de región determinante de la complementariedad de cadena pesada y región determinante de la complementariedad de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste en (i) la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SEQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 18, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 22; (ii) la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de S<e>Q ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 23, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 24 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de S<e>Q ID NO: 22; (iii) la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SEQ ID NO: 25, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID n O: 26, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 27, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 28, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 29; y (iv) la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SEQ ID NO: 30, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 31, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 27, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 28, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SEQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 18, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 22.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SeQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 23, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 24 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de SEQ ID NO: 25, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 26, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 27, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 28, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 29.
En algunos ejemplos, los anticuerpos desvelados en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de S<e>Q ID NO: 30, la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de SEQ ID NO: 31, la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de SEQ ID NO: 27, la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de SEQ ID NO: 28, la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, el anticuerpo contra HER2 desvelado en el presente documento también incluye un agente conjugado al anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una toxina o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el agente es (a) un compuesto de auristatina; (b) un compuesto de caliqueamicina; (c) un compuesto de duocarmicina; (d) SN38, (e) una pirrolobenzodiacepina; (f) un compuesto de vinca; (g) un compuesto de tubulisina; (h) un compuesto de camptotecina no natural; (i) un compuesto de maitansinoide; (j) un fármaco de unión a ADN; (k) un inhibidor de cinasas; (l) un inhibidor de MEK; (m) un inhibidor de KSP; (n) un inhibidor de la topoisomerasa; y sus análogos o análogos de la misma. En algunas realizaciones, el agente está conjugado con el anticuerpo contra HER2 por un conector. En algunas realizaciones, el conector es un conector escindible. En algunas realizaciones, el conector es un conector no escindible. En algunas realizaciones, el agente es cualquiera de las toxinas descritas en el presente documento.
En un aspecto, el conjugado de anticuerpo contra HER2 descrito en el presente documento incluye un anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo conectado directa o indirectamente a uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico (D). En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo contra HER2 también incluye uno o más armazones poliméricos conectados al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde cada uno del uno o más D se conecta independientemente al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo por el uno o más armazones poliméricos.
En algunas realizaciones, cada uno de los uno o más armazones poliméricos que están conectados al anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende, independientemente, poli(1-hidroximetiletilenhidroximetil-formal) (PHF) que tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa.
En algunas realizaciones, cada uno del uno o más armazones poliméricos es independientemente de la fórmula (Ic):
en donde:
LD1 es un resto que contiene carbonilo;
cada aparición de
en
es independientemente un primer conector que contiene un enlace biodegradable de manera que cuando se rompe el enlace, se libera D en una forma activa para su efecto terapéutico previsto; y
entre LD1 y D indica unión directa o indirecta de D a LD1;
cada aparición de
----- C(=0)-Ld1— <El p2
es independientemente un segundo conector todavía no conectado al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que LP2 es un resto que contiene un grupo funcional que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, y
entre LD1 y LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 a LD1, y cada aparición del segundo conector es distinta de cada aparición del primer conector;
cada aparición de
--- C(=0)-Ld1-^ -Lp2-£ - _
' ^ ^ i
es independientemente un tercer conector que conecta cada armazón polimérico que lleva D al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en que el
terminal unido a LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo tras la formación de un enlace covalente entre un grupo funcional de LP2 y un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo; y cada aparición del tercer conector es distinta de cada aparición del primer conector;
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40,
m3 es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 18,
m4 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10;
la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300; y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es 10 o menos.
El conjugado descrito en el presente documento puede incluir una o más de las siguientes características: Por ejemplo, en la fórmula (Ic), el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo tiene un peso molecular de 40 kDa o mayor (por ejemplo, 60 kDa o mayor, 80 kDa o mayor, 100 kDa o mayor, 120 kDa o mayor, 140 kDa o mayor, 160 kDa o mayor, 180 kDa o mayor, o 200 kDa o mayor, o aproximadamente 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 100-140 kDa o 140-150 kDa). En algunos ejemplos, el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es cualquier anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la divulgación, que incluye, a modo de ejemplo no limitante, el anticuerpo XMT 1517, el anticuerpo XMT 1518, el anticuerpo XMT 1519 y el anticuerpo XMt 1520 descrito en el presente documento.
Por ejemplo, en la fórmula (Ic), m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 120 (por ejemplo, aproximadamente 1-90) y/o m3 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, aproximadamente 1-8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 6 kDa hasta aproximadamente 20 kDa (es decir, la suma de m, m<1>, m<2>, m<3>y m<4>varía desde aproximadamente 45 hasta aproximadamente 150), m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 20, m3 es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 75 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 4-45).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 8 kDa hasta aproximadamente 15 kDa (es decir, la suma de m, mu, m<2>, m3 y mu varía desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 110), m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 55 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 4-30).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa (es decir, la suma de m, mu, m<2>, m3 y mu varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150), m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, m<3>varía desde 0 hasta aproximadamente 9), m<4>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 y/o m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70 y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa (es decir, la suma de m, mu, m<2>, m3 y mu varía desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110), m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, mu varía desde 0 hasta aproximadamente 7), mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 y/o mu es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa, (es decir, la suma de m, mu, mu, mu y mu varía desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75), m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 3-10), mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 5 (por ejemplo, mu varía desde 0 hasta aproximadamente 4), mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, mu varía desde 1 hasta aproximadamente 5) y/o mu es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 5-35) y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cada aparición de D es independientemente un agente terapéutico que tiene un peso molecular de < 5 kDa.
Por ejemplo, cada aparición de D es independientemente un fármaco antineoplásico, por ejemplo, seleccionado de alcaloides de la vinca, auristatinas, tubulisinas, duocarmicinas, compuestos de camptotecina no naturales, maitansinoides, compuestos de caliqueamicina, inhibidores de la topoisomerasa, fármacos que se unen a ADN, inhibidores de cinasas, inhibidores de MEK, inhibidores de KSP y sus análogos.
Por ejemplo, cada
cuando no está conectado al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, independientemente comprende un grupo terminal WP, en el que cada WP es independientemente:
( i )( 2 ) ( 3 )
-f-SH . f S R 1A. -|-N 3.
9?
en la que R1K es un grupo saliente (por ejemplo, haluro o RC(O)O- en la que R es hidrógeno, un resto alifático, heteroalifático, carbocíclico o heterocicloalquilo), R1A es un grupo protector de azufre y el anillo A es cicloalquilo o heterocicloalquilo, y R1J es hidrógeno, un resto alifático, heteroalifático, carbocíclico o heterocicloalquilo.
Por ejemplo, cada R1A es independientemente
en la que r es 1 o 2 y cada uno de Rs1, Rs2 y Rs3 es hidrógeno, un resto alifático, heteroalifático, carbocíclico o heterocicloalquilo.
Por ejemplo, el grupo funcional de LP2 que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo se selecciona de -SRp, -S-S-LG,
y halógeno, en la que LG es un grupo saliente, R<p>es H o un grupo protector de azufre, y uno de X<a>y X<b>es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o X<a>y X<b>, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono. Por ejemplo, el grupo funcional de L<P2>que aún no ha formado un enlace covalente es un grupo funcional que no ha reaccionado con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, por ejemplo,
como el grupo funcional de L<P2>, en la que uno de X<a>y X<b>es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o X<a>y X<b>.
Por ejemplo, L<D1>comprende -X-(CH<2>)<v>-C(=O)- con X conectado directamente al grupo carbonilo de 1 a 6.
en la que X es CH<2>, O o NH, y v es un número entero de
Por ejemplo, cada aparición de
es independientemente -C(=O)-X-(CH<2>)<v>-C(=O)-NH-(CH<2>)<u>-NH-C(=O)-(CH<2>)<w>-(OCH<2>)<x>-NHC(=O)-(CH<2>)<y>M, en la que X es CH<2>, O, o NH, cada uno de v, u, w, x e y es independientemente un número entero desde 1 hasta 6, y M es
en donde uno de X<a>y X<b>es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o X<a>y X<b>, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono.
Por ejemplo, cada uno de v, u, w, x e y es 2.
Por ejemplo, la relación entre D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 25:1,24:1,23:1,22:1,21:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1, 7 :1 ,6;1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1.
Por ejemplo, la relación entre D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 20:1, 15:1, 10:1,5:1,2:1 o 1:1.
Por ejemplo, la relación entre D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 o 10:1.
Por ejemplo, la relación entre D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1, 12:1 o 11:1.
Por ejemplo, la relación entre D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1 o 12:1.
Por ejemplo, la relación entre the D y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1.
Por ejemplo, cada uno del uno o más armazones poliméricos que llevan D es independientemente de la fórmula (Id):
en donde:
m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17,
m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, y
el
terminal indica la unión directa del uno o más armazones poliméricos al anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa o mayor.
El armazón de la fórmula (Id) puede incluir una o más de las siguientes características:
La suma de m3a y m3b es entre 1 y 18.
Cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300, mi es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140, m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 18, y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es 10 o menos.
Cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 10, y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8.
Cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 8; y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
Cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75, m<1>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35, m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 4, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 5, la suma de m<3>a y m<3>b varía desde 1 hasta aproximadamente 5; y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
En ciertas realizaciones, la relación entre auristatina F hidroxilpropil amida ("AF HPA") y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1,23:1, 22:1,21:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1, 7:1 o 6:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 25:1,24:1,23:1,22:1,21:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En otras realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 o 10:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1, 12:1 o 11:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1 o 12:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 10:1 ,9 :1,8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1.
En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1.
En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1.
En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser aproximadamente 4:1,3:1 o 2:1.
Los restos de bloqueo de maleimido soluble en agua (por ejemplo, X<a>o X<b>) son restos que se pueden unir covalentemente a uno de los dos átomos de carbono de la olefina tras la reacción del grupo maleimido con un compuesto que contiene tiol de la fórmula (II):
R<90>-(CH<2>)<d>-SH (II)
en donde:
R<90>es NHR<91>, OH, COOR<93>, CH(NHR<91>)COOR<93>o un grupo fenilo sustituido;
R<93>es hidrógeno o alquilo C<1-4>;
R<91>es hidrógeno, CH<3>o CH<3>CO y
d es un número entero desde 1 hasta 3.
En una realización, el compuesto de bloqueo de maleimido soluble en agua de la fórmula (II) puede ser cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanoico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (es decir, HOCH<2>SH), bencil tiol en el que fenilo está sustituido con uno o más sustituyentes hidrófilos, o 3-aminopropano-1-tiol. El uno o más sustituyentes hidrófilos en el fenilo comprenden OH, SH, metoxi, etoxi, COOH, CHO, CO-alquilo C<1-4>, NH<2>, F, ciano, SO<3>H, PO<3>H y similares.
En otro aspecto, el grupo de bloqueo de maleimido soluble en agua es -S-(CH<2>)<d>-R<90>, en el que,
R<90>es OH, COOH o CH(NHR<91>)COOR<93>;
R<93>es hidrógeno o CH<3>;
R<91>es hidrógeno o CH<3>CO; y
d es 1 o 2.
En otra realización, el grupo de bloqueo de maleimido soluble en agua es -S-CH<2>-CH(NH<2>)COOH.
En ciertas realizaciones, el conjugado descrito en el presente documento comprende uno o más PHF que llevan D, cada uno de los cuales es independientemente de la fórmula (If), en donde PHF tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa:
en donde:
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
mi es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40,
m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17,
m<3>b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8;
la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 18;
la suma de m, m<1>, m<2>, m3a, y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300;
el
terminal indica la unión de uno o más armazones poliméricos de PHF al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano y comprende una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 1 (CDRH1) que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 2 (CDRH2) que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 3 (CDRH3) que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 1 (CDRL1) que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 2 (CDRL2) que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 3 (CDRL3) que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); y
la relación entre PHF y el anticuerpo es 10 o menos.
El armazón de la fórmula (If) puede incluir una o más de las siguientes características:
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m<3a>y m<3b>varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, m<3a>es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, m<3b>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m<3a>y m<3b>varía desde 1 hasta aproximadamente 10, y la relación entre PHF y el anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8.
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m<3a>y m<3b>varía desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, m<3a>es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, m<3b>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m<3a>y m<3b>varía desde 1 hasta aproximadamente 8; y la relación entre PHF y el anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m<3a>y m<3b>varía desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75, m<1>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35, m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, m<3a>es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 4, m<3b>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 5, la suma de m<3a>y m<3b>varía desde 1 hasta aproximadamente 5; y la relación entre PHF y el anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
En ciertas realizaciones, la relación entre auristatina F hidroxilpropil amida ("AF HPA") y el anticuerpo puede ser aproximadamente 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1, 7:1 o 6:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 25:1,24:1,23:1,22:1, 21:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En otras realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 o 10:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1, 12:1 o 11:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1 o 12:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 10:1,9:1,8:1,7:1,6:1,5:1, 4:1,3:1,2:1 o 1:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 8:1, 7:1,6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1.
En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1. En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1. En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 4:1,3:1 o 2:1.
En otro aspecto, el conjugado descrito en el presente documento es de la fórmula (Ib):
en donde:
ANTICUERPO HER2 indica el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento;
entre LP2 y ANTICUERPO HER2 indica unión directa o indirecta de ANTICUERPO HER2 a LP2, cada aparición de ANTICUERPO HER2 tiene independientemente un peso molecular inferior a 200 kDa, m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 2200,
m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 660,
m<2>es un número entero desde 3 hasta aproximadamente 300,
m3 es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 110,
m4 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 60; y
la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde aproximadamente 150 hasta aproximadamente 2200.
En la fórmula (Ib), mi es un número entero desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 660 (por ejemplo, aproximadamente 10-250).
Cuando PHF en la fórmula (Ib) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 50 kDa hasta aproximadamente 100 kDa (es decir, la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde aproximadamente 370 hasta aproximadamente 740), m<2>es un número entero desde 5 hasta aproximadamente 100, m3 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40, m4 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20 y/o m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 220 (por ejemplo, siendo m<1>aproximadamente 15-80).
En la fórmula (Ib), cada ANTICUERPO HER2 tiene independientemente un peso molecular de 120 kDa o menos, 80 kDa o menos, 70 kDa o menos, 60 kDa o menos, 50 kDa o menos, 40 kDa o menos, 30 kDa o menos, 20 kDa o menos o 10 kDa o menos, o aproximadamente 4 kDa a 80 kDa (por ejemplo, 4-20 kDa, 20-30 kDa, o 30-70 kDa). Otro aspecto de la invención caracteriza un método de preparación de un conjugado de la invención como se describe en las reivindicaciones. El método incluye hacer reaccionar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo con un armazón polimérico de la fórmula (Ia) de manera que se forma el conjugado:
en donde:
LD1 es un resto que contiene carbonilo;
cada aparición de
es independientemente un primer conector que contiene un enlace biodegradable de manera que cuando se rompe el enlace, se libera D en una forma activa para su efecto terapéutico previsto; y
entre LD1 y D indica unión directa o indirecta de D a LD1;
cada aparición de
es independientemente un segundo conector todavía no conectado al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que LP2 es un resto que contiene un grupo funcional que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, y
entre LD1 y LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 a LD1, y cada aparición del segundo conector es distinta de cada aparición del primer conector;
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40,
m<3>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 18, y
la suma de m, m<1>, m<2>y m3 varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300.
En las fórmulas para armazones poliméricos desvelados en el presente documento, la desconexión o hueco entre las unidades de poliacetal indica que las unidades se pueden conectar entre sí en cualquier orden. En otras palabras, los grupos adjuntos que contienen, por ejemplo, D, LP2 y el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, pueden distribuirse aleatoriamente a lo largo del esqueleto de polímero.
La presente divulgación también proporciona métodos de tratamiento, prevención, retraso de la progresión o mejoría de otro modo de un síntoma de una o más patologías asociadas a la expresión, función y/o activación anómala de HER2 o alivio de un síntoma asociado a dichas patologías, administrando un anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento a un sujeto en el que se desea dicho tratamiento o prevención. El sujeto que se va a tratar es, por ejemplo, un humano. El anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado a la patología.
La presente divulgación también proporciona métodos de tratamiento, prevención, retraso de la progresión o mejoría de otro modo de un síntoma de una o más patologías asociadas a la expresión, función y/o activación anómala de HER2 o alivio de un síntoma asociado a dichas patologías, administrando un anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento a un sujeto en el que se desea dicho tratamiento o prevención. El sujeto que se va a tratar es, por ejemplo, un humano. El anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un síntoma asociado a la patología.
Las patologías tratadas y/o prevenidas usando los anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, un cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, prevención, retraso de la progresión o mejoría de otro modo de un síntoma de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, sarcoma, hemangioma, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de laringe, cáncer de boca, mesotelioma, cáncer de piel, mieloma, cáncer bucal, cáncer de recto, cáncer de garganta, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal y cáncer gástrico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco del mismo desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, prevención, retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de mama.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco del mismo desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer gástrico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco del mismo desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC).
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco del mismo desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, el anticuerpo contra Her2 o fragmento de unión al antígeno del mismo es para su uso en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma de un cáncer (por ejemplo, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, sarcoma, hemangioma, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de laringe, cáncer de boca, mesotelioma, cáncer de piel, mieloma, cáncer de boca, cáncer de recto, cáncer de garganta, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal, y cáncer gástrico) compite para unirse al mismo epítopo de Her-2 con un anticuerpo que comprende (1) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (s Eq ID NO: 28); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21) y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); (2) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSGRSMN (SEQ ID NO: 30); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos YISSDSRTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 31); Cd Rh 3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); (3) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19), y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22); o (4) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos GIWWDGSNEKYADSVKG (SEQ ID NO: 23); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19); y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASRRAT (SEQ ID NO: 24); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22).
En otra realización, el anticuerpo contra Her2 o fragmento de unión al antígeno del mismo es para su uso en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma de un cáncer (por ejemplo, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, sarcoma, hemangioma, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de laringe, cáncer de boca, mesotelioma, cáncer de piel, mieloma, cáncer de boca, cáncer de recto, cáncer de garganta, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal, y cáncer gástrico) compite para unirse al mismo epítopo de Her-2 con un anticuerpo que comprende (1) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SE<q>ID NO: 28); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21) y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); (2) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSGRSMN (SEQ ID NO: 30); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos YISSDSRTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 31); C<d>R<h>3 que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); (3) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19), y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22); o (4) región variable de cadena pesada CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17); CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos GIWWDGSNEKYADSVKG (SEQ ID NO: 23); CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19); y región variable de cadena ligera CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20); CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASRRAT (SEQ ID NO: 24); y CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22), en donde el anticuerpo contra Her2 o fragmento de unión al antígeno del mismo está conjugado directa o indirectamente con al menos un agente terapéutico, en donde el agente terapéutico es una molécula pequeña que tiene un peso molecular < aproximadamente 5 kDa, < aproximadamente 4 kDa, < aproximadamente 3 kDa, < aproximadamente 1,5 kDa o < aproximadamente 1 kDa. La divulgación también proporciona kits y/o métodos de identificación o refino de otro modo, por ejemplo, estratificación, de una población de pacientes adecuada para administración terapéutica de un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco del mismo desvelados en el presente documento identificando pacientes que tienen baja expresión de HER2 antes del tratamiento con un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo, y/o conjugados del mismo desvelado en el presente documento. Baja expresión de HER2 representa los pacientes que tienen inferior o igual a 100.000, inferior o igual a 90.000, o inferior o igual a 80.000 moléculas de HER2 por célula, por ejemplo, como se mide por célula en una población de células de prueba. El nivel de expresión de HER2, es decir, número de moléculas de HER2 por célula, se puede medir usando cualquier método reconocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, el uso de los ensayos de viabilidad basados en células mostrados en los ejemplos de trabajo proporcionados en el presente documento (véase, por ejemplo, el Ejemplo 18).
La divulgación también proporciona kits y/o métodos de identificación o refino de otro modo, por ejemplo, estratificación, de una población de pacientes adecuados para administración terapéutica de un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo, y/o conjugados del mismo desvelados en el presente documento identificando la puntuación de HER2 del sujeto antes del tratamiento con un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo, y/o conjugados del mismo desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 1+ o 2+ para la expresión de HER2. En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 1+ o 2+ para la expresión de HER2 como se detecta por análisis de inmunohistoquímica (IHC) realizados en una población de células de prueba, y en donde el gen HER2 no se amplifica en la población de células de prueba. En algunas realizaciones, la población de células de prueba deriva de tejido fresco no congelado de una muestra de biopsia. En algunas realizaciones, la población de células de prueba deriva de un tejido congelado de una muestra de biopsia.
La prueba de IHC mide la cantidad de proteína de receptor HER2 sobre la superficie de células en una muestra de tejido de cáncer, por ejemplo, una muestra de tejido de cáncer de mama o una muestra de cáncer gástrico, y asigna al nivel detectado de receptor HER2 de la superficie celular una puntuación de HER2 de 0, 1+, 2+ o 3+. Si la puntuación de HER2 del sujeto está en el intervalo de 0 a 1+, se considera que el cáncer es "HER2 negativo". Si la puntuación es 2+, el cáncer se denomina "limítrofe" y una puntuación de 3+ significa que el cáncer es "HER2 positivo".
En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 1+ o 2+ para la expresión de HER2 y es resistente a quimioterapia, que incluye agentes quimioterapéuticos habituales de primera línea. Como se usa en el presente documento, el término sujeto incluye seres humanos y otros mamíferos. En algunas realizaciones, se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 1+ o 2+ para la expresión de HER2 y está padeciendo cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) o cáncer de ovario.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de mama en pacientes que tienen HER2 IHC 1+ o HER2 IHC 2+ sin amplificación génica, por ejemplo, FISH- (o hibridación de fluorescenciain situnegativa).
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de mama en pacientes que tienen cáncer de mama avanzado HER2 positivo y que han recibido tratamiento anterior con Kadcyla.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de mama en pacientes que tienen cáncer de mama avanzado HER2 positivo y que no han recibido previamente tratamiento anterior con Kadcyla.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer gástrico en pacientes que tienen HER2 IHC 1+ o HER2 IHC 2+ sin amplificación génica, por ejemplo, FISH-.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos y/o conjugados de PBRM-polímero-fármaco desvelados en el presente documento son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma del cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) en pacientes que tienen HER2 IHC 2+, HER2 IHC 3+, cualquier amplificación génica de HER2 o estado de mutación.
En algunas realizaciones, el sujeto es resistente a quimioterapia, que incluye agentes quimioterapéuticos habituales de primera línea. En algunas realizaciones, el sujeto es resistente al tratamiento con Kadcyla.
Un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo y/o anticuerpo contra HER2 conjugado o fragmento de unión al antígeno del mismo se puede administrar en cualquier estadio de la enfermedad. Por ejemplo, dicho anticuerpo contra HER2 y/o anticuerpo contra HER2 conjugado se puede administrar a un paciente que padece cáncer de cualquier estadio, de temprano a metastásico.
Un anticuerpo contra HER2 y/o anticuerpo contra HER2 conjugado usado en cualquiera de estos métodos y usos se puede administrar tanto solo como en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos u otros agentes. En algunos ejemplos, el agente es cualquiera de las toxinas descritas en el presente documento. En algunos ejemplos, el agente es (1) inhibidores de HER2, (2) inhibidores de EGFR (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasas o anticuerpos anti-EGFR dirigidos), (3) inhibidores de BRAF, (4) inhibidores de ALK, (5) inhibidores de receptores de hormona, (6) inhibidores de mTOR, (7) inhibidores de VEGF o (8) vacunas contra el cáncer. En algunos ejemplos, el agente es un agente quimioterapéutico habitual de primera línea, tal como, por ejemplo, trastuzumab, pertuzumab, ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla), lapatinib, anastrozol, letrozol, exemestano, everolimus, fulvestrant, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, fluoximesterona, etinil estradiol, paclitaxel, capecitabina, gemcitabina, eribulina, vinorelbina, ciclofosfamida, carboplatino, docetaxel, paclitaxel unido a albúmina, cisplatino, epirubicina, ixabepilona, doxorubicina, fluorouracilo, oxaliplatino, fluoropirimidina, irinotecán, ramucirumab, mitomicina, leucovorina, cetuximab, bevacizumab, erlotinib, afatinib, crizotinib, permetrexed, ceritinib, etopósido, vinblastina, vincristina, ifosfamid, doxorubicina liposómica, topotecán, altretamina, melfalán o acetato de leuprolida. En algunos ejemplos, el segundo agente es Kadcyla.
En algunos ejemplos, el agente es al menos un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a HER2. En algunos ejemplos, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado se administran en combinación con un anticuerpo contra HER2, un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2 o una combinación de un anticuerpo contra HER2 y un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2, tal como, por ejemplo, trastuzumab o pertuzumab, o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado se administran en combinación con un biosimilar de trastuzumab o un biosimilar de pertuzumab o una combinación de los mismos.
Estas combinaciones de anticuerpos contra HER2 y/o anticuerpos contra HER2 conjugados son útiles en el tratamiento de patologías tales como, por ejemplo, un cáncer. Por ejemplo, estas combinaciones de anticuerpos contra HER2 y/o anticuerpos contra HER2 conjugado, por ejemplo, un anticuerpo contra HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo y/o anticuerpos contra HER2 conjugados (por ejemplo, conjugados anticuerpo contra HER2-polímero-fármaco) desvelados en el presente documento en combinación con trastuzumab, pertuzumab o tanto trastuzumab como pertuzumab o un biosimilar de trastuzumab, un biosimilar de pertuzumab o ambos biosimilares, son útiles en el tratamiento, la prevención, el retraso de la progresión o la mejoría de otro modo de un síntoma de un cáncer (por ejemplo, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, sarcoma, hemangioma, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de laringe, cáncer de boca, mesotelioma, cáncer de piel, mieloma, cáncer bucal, cáncer de recto, cáncer de garganta, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal y cáncer gástrico).
Estas combinaciones también son útiles para aumentar la degradación de HER2 cuando una célula que expresa HER2 se pone en contacto con estas combinaciones. El nivel de degradación de HER2 se detecta usando cualquier método de detección de degradación de HER2 reconocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, detectar niveles de degradación de HER2 en la presencia y ausencia de una combinación de anticuerpos contra HER2 (o biosimilares del mismo) como se muestra en los ejemplos de trabajo proporcionados en el presente documento (véase, por ejemplo, el Ejemplo 14). Por ejemplo, el nivel de degradación de HER2 se determina usando análisis Western de los lisados de células que expresan HER2 que se han tratado con una combinación de anticuerpos contra HER2, en comparación con el nivel de degradación de HER2 en células que expresan HER2 que no se han tratado con una combinación de anticuerpos contra HER2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y agente(s) adicional(es) se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y agente adicional son para administración simultánea. Alternativamente, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y agente adicional están separados entre sí, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y el agente adicional se administran simultáneamente, o el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y el agente adicional se administran en momentos diferentes durante una pauta de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado se administran antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado se administran posterior a la administración del agente adicional, o el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y el agente adicional se administran en un modo alterno. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo contra HER2 y/o el anticuerpo contra HER2 conjugado y agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
Las composiciones farmacéuticas según la divulgación pueden incluir un anticuerpo, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento y un vehículo adecuado. Estas composiciones farmacéuticas se pueden incluir en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
Un experto en la técnica apreciará que los anticuerpos desvelados en el presente documento tienen una variedad de usos. Por ejemplo, las proteínas desveladas en el presente documento se usan como agentes terapéuticos. Los anticuerpos desvelados en el presente documento también se usan como reactivos en kits de diagnóstico o como herramientas de diagnóstico, o estos anticuerpos se pueden usar en ensayos de competición para generar reactivos terapéuticos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. En la memoria descriptiva, las formas en singular también incluyen el plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1a muestra el agrupamiento de epítopos para los anticuerpos XMT 1517 y XMT 1518 por agrupamiento de epítopos por Octet Red384.
La Figura 1b muestra el agrupamiento de epítopos para los anticuerpos XMT 1519 y XMT 1520 por agrupamiento de epítopos por Octet Red384.
La Figura 2 muestra la unión de superficie celular de anticuerpos XMT 1517, XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520 a células JIMT-1.
La Figura 3a muestra afinidades de unión de anticuerpos XMT 1517, XMT 1518 por HER2 humano recombinante y HER2 de macaco cangrejero.
La Figura 3b muestra afinidades de unión de anticuerpos XMT 1519, XMT 1520 a HER2 humano recombinante y HER2 de macaco cangrejero.
La Figura 3c muestra las afinidades de unión de XMT 1519 y el Ejemplo 16H un HER2 humano recombinante. La Figura 3d muestra las afinidades de unión de XMT 1519 y el Ejemplo 16H a HER2 de macaco cangrejero. La Figura 4 muestra que los anticuerpos XMT 1518 y XMT 1519 compiten por unirse a HER2.
La Figura 5 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) para trastuzumab y anticuerpos XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520.
La Figura 6 muestra la tasa de internalización para trastuzumab y anticuerpos HT XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520.
La Figura 7 muestra la internalización de anticuerpos contra HER2 en células SKBR3.
La Figura 8 muestra la degradación de HER2 inducida por una combinación de anticuerpos anti-HER2. La Figura 9 ilustra la eficacia antitumoral del Ejemplo 16A, trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 16D, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón NCI-N87.
La Figura 10 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla; Ejemplo 16A, trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))); y Ejemplo 16D, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón JIMT-1.
La Figura 11 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla; pertuzumab; una combinación de Kadcyla y pertuzumab; y Ejemplo 16D, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón JIMT-1.
La Figura 12 ilustra la eficacia antitumoral del ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))); una combinación de trastuzumab y pertuzumab; o una combinación triple de trastuzumab; pertuzumab y Ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón NCI-N87.
La Figura 13 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón SNU5.
La Figura 14 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla y Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón TOV-21G.
La Figura 15 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón H522.
La Figura 16 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón SKOV3.
La Figura 17 ilustra la eficacia antitumoral del ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón Calu-3.
La Figura 18 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto derivado de paciente BRE-0333 HER2 1+.
La Figura 19 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto derivado de paciente MAXF_1162 HER23+.
La Figura 20 ilustra la eficacia antitumoral de Kadcyla, Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Ejemplo 17C, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) como se mide en un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón BT474.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a HER2 humano en forma soluble, o unido a membrana (es decir, cuando se expresa sobre una superficie celular). La divulgación proporciona además anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a HER2. Estos anticuerpos se denominan conjuntamente en el presente documento anticuerpos contra "HER2".
Los anticuerpos de la presente divulgación se unen a un epítopo de HER2 con una constante de disociación en equilibrio (K<d>o K<d>) de <1 pM, por ejemplo, < 100 nM, preferentemente < 10 nM, y más preferentemente < 1 nM. Por ejemplo, los anticuerpos contra HER2 proporcionado en el presente documento presentan una K<d>en el intervalo aproximadamente entre < 1 nM a aproximadamente 1 pM.
Los anticuerpos contra HER2 desvelados en el presente documento sirven para modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la actividad funcional de HER2. Las actividades funcionales de HER2 incluyen, por ejemplo, modulación de la actividad de la vía de PI3K-Akt. Por ejemplo, los anticuerpos contra HER2 inhiben completa o parcialmente la actividad funcional de HER2 modulando, bloqueando, inhibiendo, reduciendo, antagonizando o interfiriendo de otro modo interfiriendo parcialmente o completamente con la actividad de la vía de PI3K-Akt. La actividad de la vía de PI3K-Akt se evalúa usando cualquier método reconocido en la técnica de detección de actividad de la vía de PI3K-Akt, que incluye, pero no se limita a, detectar niveles de Akt fosforilado en presencia y ausencia de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno desvelado en el presente documento.
Se considera que los anticuerpos contra HER2 modulan, bloquean, inhiben reducen, antagonizan, neutralizan completamente o interfieren de otro modo con la actividad funcional de HER2 cuando el nivel de actividad funcional de HER2 en presencia del anticuerpo contra HER2 disminuye en al menos 95 %, por ejemplo, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de actividad funcional de HER2 en ausencia de unión con un anticuerpo contra HER2 descrito en el presente documento. Se considera que los anticuerpos contra HER2 modulan, bloquean, inhiben reducen, antagonizan, neutralizan parcialmente o interfieren de otro modo con la actividad funcional de HER2 cuando el nivel de actividad de HER2 en presencia del anticuerpo contra HER2 disminuye en menos del 95 %, por ejemplo, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % en comparación con el nivel de actividad de HER2 en ausencia de unión con un anticuerpo contra HER2 descrito en el presente documento.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y técnicos usados a propósito de la presente invención deben tener los significados que son comúnmente entendidos por los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, términos en singular deben incluir pluralidades y términos en plural deben incluir el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas a propósito de, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular y química de proteínas y oligo- o polinucleótidos e hibridación descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas convencionales se usan para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan, en general, según los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que son citadas y tratadas en toda la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas a propósito de, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas convencionales se usan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes.
Como se utiliza según la presente divulgación, se debe entender que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
Como se usa en el presente documento, los términos "HER2" (también conocido como ErbB-2, NEU, HER-2 y CD340), cuando se usan en el presente documento, se refieren a receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (SwissProt P04626) e incluye cualquier variante, isoforma y homólogos de especie de HER2 que se expresan naturalmente por células, que incluyen células tumorales, o se expresan en células transfectadas con el gen HER2. Los homólogos de especie incluyen HER2 de macaco de la India(Macaca mulatta; n.° de acceso de GenBank GI:109114897). Estos términos son sinónimos y se pueden usar indistintamente.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo contra HER2" o "anticuerpo anti-HER2" es un anticuerpo que se une específicamente al antígeno HER2.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "dirigido contra" se indica que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos ni se une a una afinidad mucho menor (K<d>> 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, fragmentos Fab, Fab' y F<(ab)2>, scFv y una biblioteca de expresión de Fab.
Se sabe que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferencian entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG<1>, IgG<2>, y otras. Además, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un producto génico de cadena ligera único y un producto génico de cadena pesada único. En particular, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por él.
En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de seres humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferencian entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, tales como IgG<1>, IgG<2>, y otras. Además, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por restos de aminoácidos de las regiones variables aminoterminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres extensiones altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesadas y ligeras, denominadas "regiones hipervariables," están intercaladas entre extensiones flanqueantes más conservadas conocidas como "regiones estructurales" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos, que se encuentran naturalmente entre, y son adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas las unas con respecto a las otras en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR." La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Los términos "fragmento", "fragmento de anticuerpo", "fragmento que se une al antígeno" y "fragmento de unión al antígeno" se usan indistintamente en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario.
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o fragmento de la misma, o un receptor de linfocitos T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos consisten normalmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 pM; por ejemplo, < 100 nM, preferentemente < 10 nM y más preferentemente < 1 nM.
Cuando se usa en el presente documento en el contexto de dos o más anticuerpos, el término "compite con" o "compite de forma cruzada con" indica que los dos o más anticuerpos compiten para unirse a HER2, por ejemplo, compiten por la unión a HER2 en el ensayo descrito en los Ejemplos 5 o 8. Un anticuerpo "bloquea" o "bloquea de forma cruzada" que uno o varios de otros anticuerpos se unan a HER2 si el anticuerpo compite con el uno o varios de otros anticuerpos 25 % o más, representando 25 %-74 % "bloqueo parcial" y representando 75 %-400 % "bloqueo completo", preferentemente como se determina usando el ensayo de los Ejemplos 5 y 8. Para algunos pares de anticuerpos, la competición o bloqueo en el ensayo de los Ejemplos 5 o 8 solo se observa cuando un anticuerpo está recubierto sobre la placa y el otro se usa para competir, y no viceversa. A menos que se defina de otro modo o sea negado por el contexto, los términos "compite con", "compite de forma cruzada con", "bloquea" o "bloquea de forma cruzada", cuando se usan en el presente documento, también pretenden cubrir dichos pares de anticuerpos.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "inhibe la dimerización de HER" debe significar un anticuerpo que inhibe, o interfiere con, la formación de un dímero de HER. Preferentemente, dicho anticuerpo se une a HER2 en el sitio de unión heterodimérico del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo inhibidor de la dimerización en el presente documento es pertuzumab o MAb 2C4. Otros ejemplos de anticuerpos que inhiben la dimerización de HER incluyen anticuerpos que se unen a EGFR e inhiben la dimerización del mismo con uno o varios de otros receptores de HER, tales como, por ejemplo, anticuerpo monoclonal contra EGFR 806, MAb 806, que se une para EGFR activado o "desconectado" (véase Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); anticuerpos que se unen a HER3 e inhiben la dimerización del mismo con uno o varios de otros receptores HER; y anticuerpos que se unen a HER4 e inhiben la dimerización del mismo con uno o varios de otros receptores HER.
El término "inhibidor de la dimerización de HER2" como se usa en el presente documento debe significar un agente que inhibe la formación de un dímero o heterodímero que comprende HER2.
Como se usa en el presente documento, el término "internalización", cuando se usa en el contexto de un anticuerpo contra HER2, incluye cualquier mecanismo por el que el anticuerpo se internaliza en una célula que expresa HER2 de la superficie celular y/o del medio circundante, por ejemplo, por endocitosis.
Como se usa en el presente documento, los términos "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que ocurre entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La intensidad, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica, se puede expresar en términos de la constante de disociación (K<d>) de la interacción, en donde una K<d>más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando métodos bien conocidos en la técnica. Dicho método implica medir las tasas de formación y disociación de complejos de sitio de unión al antígeno/antígeno, en donde las tasas dependen de las concentraciones de los componentes del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de asociación" (K<as>) como la "constante de disociación" (K<dis>) se pueden determinar calculando las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación (véase Nature 361:186-87 (1993)). La relación entre K<dis>/K<as>permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación K<d>(véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente a HER2 cuando la constante de disociación en equilibrio (K<d>o K<d>) es < 1 pM, preferentemente < 100 nM, más preferentemente < 10 nM, y lo más preferentemente < 100 pM a aproximadamente 1 pM, como se mide por ensayos, tales como ensayos de unión a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en el presente documento, debe significar un polinucleótido de genómico, ADNc, u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado a todo o a una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está operativamente unido a un polinucleótido, al que no está unido en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Los polinucleótidos según la divulgación incluyen las secuencias del ácido nucleico de SEQ ID NO: 34 y 36, así como moléculas del ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada presentadas en SEQ ID NO: 1,3, 5 y 7, y las secuencias del ácido nucleico de SEQ ID NO: 35 y 37, así como moléculas del ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera representadas en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8.
El término "proteína aislada", al que se hace referencia en el presente documento, significa una proteína de ADNc, ARN recombinante, u origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada a proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por tanto, los fragmentos nativos de proteínas, y análogos, son especies del género de polipéptido. Los polipéptidos según la divulgación comprenden las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada representadas en SEQ ID NO: 1,3, 5 y 7, y las moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera representadas en SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, así como las moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y sus análogos.
El término "que existe de forma natural", como se usa en el presente documento, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otro modo existe de forma natural.
El término "operativamente unidos", como se usa en el presente documento, se refiere a las posiciones de componentes así descritos en una relación que les permita funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante se liga de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logre en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que se unen. La naturaleza de dichas secuencias de control se diferencia dependiendo del organismo hospedador en procariotas; dichas secuencias de control incluyen, en general, promotor, sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas; en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias conductoras y secuencias de componentes de fusión. El término "polinucleótido", al que se hace referencia en el presente documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas mono- y bicatenarias de ADN.
El término "oligonucleótido", al que se hace referencia en el presente documento, incluye nucleótidos que existen de forma natural y modificados unidos juntos por enlaces de oligonucleótidos que existen de forma natural y que no existen de forma natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden, en general, una longitud de 200 bases o menos. Preferentemente, los oligonucleótidos tienen 10 a 60 bases de longitud y lo más preferentemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son normalmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos desvelados en el presente documento son oligonucleótidos sentido o antisentido.
El término "nucleótidos que existen de forma natural", al que se hace referencia en el presente documento, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados", al que se hace referencia en el presente documento, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos, y similares. El término "enlaces de oligonucleótido", al que se hace referencia en el presente documento, incluye enlaces de oligonucleótidos, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patente de EE. UU. n.° 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una marca para la detección, si se desea.
El término "hibridar selectivamente", al que se hace referencia en el presente documento, significar unir detectablemente y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos según la divulgación se hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden usar condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectivas, como se conoce en la técnica, y se tratan en el presente documento. En general, la homología de secuencias del ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos desvelados en el presente documento y una secuencia del ácido nucleico de interés será de al menos el 80 %, y más normalmente con homologías preferentemente crecientes de al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 99 % y 100 %. Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85 % de homología significa que el 85 % de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para un correspondencia máxima. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se hacen corresponder) para maximizar la correspondencia, se prefieren longitudes de huecos de 5 o menos, siendo más preferido 2 o menos. Alternativamente y preferentemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, como se usa este término en el presente documento, si tienen una puntuación de alineamiento de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutaciones y una penalización por hueco de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el Suplemento 2 en este volumen, pp. 1 -10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferentemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en un 50 % o más cuando se alinean óptimamente usando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se usa en el presente documento para significar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no está relacionada estrictamente evolutivamente) a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. Por oposición, el término "complementario a" se usa en el presente documento para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
Los siguiente términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de genes dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia de ADNc o de genes completa. En general, una secuencia de referencia tiene al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente al menos 24 nucleótidos o 8 aminoácidos de longitud, y frecuentemente al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Puesto que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan normalmente comparando secuencias de las dos moléculas en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos, en donde una secuencia de polinucleótidos o secuencia de aminoácidos se puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en los paquetes de software Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks o MacVector), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) generado por los diversos métodos.
El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o resto por resto) en la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en el que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o resto ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones equiparadas, dividiendo el número de posiciones equiparadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial", como se usa en el presente documento, indica una característica de una secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más normalmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente en una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que hacen un total del 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2.a edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, tales como aminoácidosa-,a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina,Y-carboxiglutamato,£-N,N,N-trimetil-lisina,e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina,o-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección derecha es la dirección carboxiterminal, según uso y convención habituales.
Similarmente, a menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos monocatenarias es el extremo 5', la dirección izquierda de secuencias de polinucleótidos bicatenarias se denomina la dirección 5'. La dirección de adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de transcripción; regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en la dirección 5'", regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN se denominan "secuencias en la dirección 3'".
Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas óptimamente, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo más preferentemente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencia.
Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas se diferencian por sustituciones de aminoácidos conservativas.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la intercambiabilidad de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutámicoaspártico y asparagina-glutamina.
Como se trata en el presente documento, se contempla que variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están englobadas por la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 80 %, 90 %, 95 %, y lo más preferentemente el 99 %. En particular, se contemplan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen, en general, en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares sin carga son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la hidroxi familia alifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tenga un efecto importante sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica a un aminoácido dentro de un sitio de la región estructural. Si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional, se puede determinar fácilmente ensayando la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen con detalle en el presente documento. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden ser fácilmente preparados por los expertos habituales en la técnica. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de dominios funcionales. Se pueden identificar dominios estructurales y funcionales por comparación de datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación computerizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas predichas que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen los métodos de identificación de secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se pueden usar para definir dominios estructurales y funcionales, según la divulgación.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia de péptidos que existe de forma natural. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que existe naturalmente (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio(s) que forma contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos conocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
El término "fragmento de polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción aminoterminal y/o carboxiterminal, pero donde el resto de la secuencia de aminoácidos es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que existe de forma natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos son normalmente de al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que comprenden un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene unión específica a HER2, en condiciones de unión adecuadas. Normalmente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o adición o deleción) con respecto a la secuencia que ocurre naturalmente. Los análogos son normalmente de al menos 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y pueden ser frecuentemente tan largos como un polipéptido que existe de forma natural de longitud completa.
Los análogos de péptido se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido modelo. Estos tipos de compuesto no peptídico se llaman "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Dichos compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelado molecular computerizado. Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH<2>NH--, --CH<2>S-, --CH<2>-CH<2>--, --CH=CH-- (cis y trans), --COCH<2>--, CH(OH)CH<2>- y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. Se puede usar la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, añadiendo restos internos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.
Como se usa en el presente documento, los términos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos de biotinilo que se pueden detectar por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar por métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la marca o marcador también pueden ser terapéuticos. Se conocen en la técnica diversos métodos de marcado de polipéptidos y glucoproteínas y se pueden usar. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos biotinilo quimioluminiscentes, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de la cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítopos). En algunas realizaciones, las marcas están unidas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. El término "agente farmacéutico o fármaco", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.
Otros términos químicos en el presente documento se usan según el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y 99 %. Lo más preferentemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Se debe interpretar que el uso de los artículos "un", "una", "el" y "la", tanto en la siguiente descripción como en las reivindicaciones, cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que es de" como "que es de una fórmula química", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significan "que incluyen, pero no se limitan a"), a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, un armazón polimérico de una cierta fórmula incluye todas las unidades de monómero mostradas en la fórmula y también puede incluir unidades de monómero adicionales no mostradas en la fórmula. Adicionalmente, siempre que se use "que comprende" u otro término de extremos abiertos en una realización, se debe entender que la misma realización puede ser reivindicada más estrechamente usando el término intermedio "que consiste esencialmente en" o el término cerrado "que consiste en".
El término "alrededor de", "aproximadamente" o "aproximado", cuando se usa a propósito de un valor numérico, significa que se incluye un conjunto o intervalo de valores. Por ejemplo, "aproximadamente X" incluye un intervalo de valores que son ±20 %, ±10 %, ±5 %, ±2 %, ±1 %, ±0,5 %, ±0,2 %, o ±0,1 % de X, donde X es un valor numérico. En un ejemplo, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que son 5 % más o inferior al valor especificado. En otro ejemplo, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que son 2 % más o inferior al valor especificado. En otro ejemplo, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que son 1 % más o inferior al valor especificado.
La citación de intervalos de valores pretende servir simplemente de método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara individualmente en el presente documento. Un intervalo usado en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, incluye los dos límites del intervalo. Por ejemplo, las expresiones "siendo x un número entero entre 1 y 6" y "siendo x un número entero de 1 a 6" significan ambos "siendo x 1,2, 3, 4, 5 o 6", es decir, los términos "entre X e Y” y el "intervalo de X a Y", incluyen X e Y y los números enteros intermedios.
Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente de otro modo por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, está previsto simplemente para ilustrar mejor la invención.
"Molécula de reconocimiento basada en proteína" o "PBRM" se refiere a una molécula que reconoce y se une a un marcador de superficie celular o receptor, tal como, una proteína transmembranaria, proteína inmovilizada en superficie, o protoglicano. Los ejemplos de PBRM incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo XMT 1517, el anticuerpo XMT 1518, el anticuerpo XMT 1519 y el anticuerpo XMT 1520 descritos en el presente documento, así como otros anticuerpos (por ejemplo, trastuzumab, cetuximab, rituximab, bevacizumab, epratuzumab, veltuzumab, labetuzumab, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, MUC-1, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1 y anti-5T4) y anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en el presente documento) o péptidos (péptidos que se dirigen al receptor LHRH, péptido EC-1), lipocalinas, tales como, por ejemplo, anticalinas, proteínas, tales como, por ejemplo, interferones, linfocinas, factores de crecimiento, factores estimulantes de colonias y similares, péptidos o peptidomiméticos y similares. La molécula de reconocimiento basada en proteína, además de dirigir el conjugado de polímero modificado a una célula, tejido o localización específica, también puede tener cierto efecto terapéutico, tal como actividad antiproliferativa (citostática y/o citotóxica) contra una célula o vía diana. La molécula de reconocimiento basada en proteína comprende o se puede manipular para comprender al menos un grupo químicamente reactivo, tal como -COOH, amina primaria, amina secundaria -NHR, -SH, o un resto de aminoácido químicamente reactivo o cadenas laterales, tales como, por ejemplo, tirosina, histidina, cisteína o lisina.
"Biocompatible", como se usa en el presente documento, está previsto para describir compuestos que ejercen efectos destructivos o de respuesta del huésped mínimos mientras que están en contacto con líquidos corporales o células vivas o tejidos. Por lo tanto, ungrupo biocompatible,como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alifático, cicloalquilo, heteroalifático, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, que entra dentro de la definición del términobiocompatible,como se ha definido anteriormente y en el presente documento. El término "biocompatibilidad", como se usa en el presente documento, también se entiende que significa que los compuestos presentan interacciones mínimas con proteínas de reconocimiento, por ejemplo, anticuerpos que existen de forma natural, proteínas celulares, células y otros componentes de sistemas biológicos, a menos que dichas interacciones sean específicamente deseables. Por lo tanto, se considera que las sustancias y grupos funcionales específicamente previstas para causar las interacciones mínimas anteriores, por ejemplo, fármacos y profármacos, son biocompatibles. Preferentemente (con excepción de compuestos previstos para ser citotóxicos, tal como, por ejemplo, agentes antineoplásicos), los compuestos son "biocompatibles" si su adición a células normalesin vitro,a concentraciones similares a las concentracionesin vivosistémicas previstas, da como resultado inferior o igual al 1 % de muerte celular durante el tiempo equivalente a la semivida del compuestoin vivo(por ejemplo, el periodo de tiempo requerido para el 50 % del compuesto administradoin vivoa eliminar/depurar), y su administraciónin vivoinduce inflamación mínima y médicamente aceptable, reacción de cuerpos extraños, inmunotoxicidad, toxicidad química y/u otros efectos adversos tales. En la frase anterior, el término "células normales" se refiere a células que no pretenden ser destruidas o afectadas significativamente de otro modo por el compuesto que se prueba.
"Biodegradable": como se usa en el presente documento, polímeros "biodegradables" son polímeros que son susceptibles al procesamiento biológicoin vivo.Como se usa en el presente documento, compuestos "biodegradables" 0 restos son los que, cuando son absorbidos por las células, pueden ser degradados por la maquinaria liposómica y otra maquinaria química o por hidrólisis en componentes que las células pueden o reutilizar o prescindir de ellas sin efecto tóxico significativo sobre las células. El término "bioescindible", como se usa en el presente documento, tiene el mismo significado que "biodegradable". Los fragmentos de degradación inducen preferentemente poco o ninguna sobrecarga de órganos o células o procesos patológicos causados por dicha sobrecarga u otros efectos adversosin vivo.Los ejemplos de procesos de biodegradación incluyen hidrólisis enzimática y no enzimática, oxidación y reducción. Condiciones adecuadas para la hidrólisis no enzimática de los conjugados biodegradables de proteínapolímero-fármaco (o sus componentes, por ejemplo, el vehículo polimérico biodegradable y los conectores entre el vehículo y el anticuerpo o la molécula de fármaco) descritos en el presente documento, por ejemplo, incluyen exposición de los conjugados biodegradables a agua a una temperatura y un pH del compartimento intracelular lisosómico. La biodegradación de algunos conjugados proteína-polímero-fármaco (o sus componentes, por ejemplo, el vehículo polimérico biodegradable y los conectores entre el vehículo y el anticuerpo o la molécula de fármaco), también se pueden potenciar extracelularmente, por ejemplo,en regiones de pH bajo del cuerpo animal, por ejemplo,un área inflamada, en estrecha vecindad de macrófagos activados u otras células que liberan factores que facilitan la degradación. En ciertas realizaciones preferidas, el tamaño eficaz del vehículo polimérico a pH~7,5 no cambia detectablemente durante 1 a 7 días, y sigue estando dentro del 50 % del tamaño polimérico original durante al menos varias semanas. A pH~5, por otra parte, el vehículo polimérico se degrada preferentemente detectablemente durante 1 a 5 días, y se transforma completamente en fragmentos de bajo peso molecular dentro de un periodo de tiempo de dos semanas a varios meses. La integridad del polímero en dichas pruebas se puede medir, por ejemplo, por HPLC de exclusión de tamaño. Aunque la degradación más rápida puede ser en algunos casos preferible, en general, puede ser más deseable que el polímero se degrade en las células con una tasa que no supera la tasa de metabolización o eliminación de fragmentos de polímero por las células. En realizaciones preferidas, los polímeros y subproductos de biodegradación de polímeros son biocompatibles.
"Compuesto de bloqueo de maleimido": como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que puede reaccionar con maleimida para convertirla en succinimida y "resto de bloqueo de maleimido" se refiere al resto químico unido a la succinimida tras la conversión. En ciertas realizaciones, el compuesto de bloqueo de maleimido es un compuesto que tiene un grupo tiol terminal para reaccionar con la maleimida. En una realización, el compuesto de bloqueo de maleimido es cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanoico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (es decir, HOCH<2>SH), bencil tiol en el que el fenilo está sustituido con uno o más sustituyentes hidrófilos, o 3-aminopropano-1-tiol.
"Hidrófilo": el término "hidrófilo", en relación con sustituyentes, por ejemplo, en las unidades monoméricas de polímero o en un resto de bloqueo de maleimido, para hacerlos hidrófilos o solubles en agua, no se diferencia esencialmente del significado común de este término en la técnica, e indica restos químicos que contienen átomos ionizables, polares o polarizables, o que de otro modo pueden estar solvatados por moléculas de agua. Por lo tanto, ungrupo hidrófilo,como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alifático, cicloalquilo, heteroalifático, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, que entra dentro de la definición del términohidrófilo,como se ha definido anteriormente. Los ejemplos de restos orgánicos hidrófilos particulares que son adecuados incluyen, sin limitación, grupos alifáticos o heteroalifáticos que comprenden una cadena de átomos en un intervalo de entre aproximadamente uno y doce átomos, hidroxilo, hidroxialquilo, amina, carboxilo, amida, éster carboxílico, tioéster, aldehído, nitrilo, isonitrilo, nitroso, hidroxilamina, mercaptoalquilo, heterociclo, carbamatos, ácidos carboxílicos y sus sales, ácidos sulfónicos y sus sales, ásteres de ácido sulfónico, ácidos fosfóricos y sus sales, ásteres de fosfato, éteres de poliglicol, poliaminas, policarboxilatos, poliésteres y politioésteres. En ciertas realizaciones, los sustituyentes hidrófilos comprenden un grupo carboxilo (COOH), un grupo aldehido (CHO), un grupo cetona (CO-alquilo C<1-4>), un metilol (CHzOH) o un glicol (por ejemplo, CHOH-CHzOH o CH-(CHzOH)z), NH<2>, F, ciano, SO<3>H, PO<3>H y similares.
El término "hidrófilo", como se refiere a los polímeros desvelados en el presente documento, no se diferencia, en general, del uso de este término en la técnica, e indica polímeros que comprenden grupos funcionales hidrófilos, como se han definido anteriormente. En una realización preferida, polímero hidrófilo es un polímero soluble en agua. La hidrofilia del polímero puede ser medida directamente a través de la determinación de energía de hidratación, o determinada a través de investigación entre dos fases líquidas, o por cromatografía en fases sólidas con hidrofobia conocida, tal como, por ejemplo, C4 o C18.
"Vehículo polimérico": el término vehículo polimérico, como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero o un polímero modificado, que es adecuado para unirse covalentemente a o puede unirse covalentemente a una o más moléculas de fármaco con un conector designado y/o una o más PBRM con un conector designado.
"Condiciones fisiológicas": la expresión "condiciones fisiológicas", como se usa en el presente documento, se refiere al intervalo de condiciones químicas (por ejemplo, pH, fuerza iónica) y bioquímicas (por ejemplo, concentraciones de enzima) que probablemente se van a encontrar en los líquidos extracelulares de tejidos vivos. Para la mayoría de los tejidos normales, el pH fisiológico varía desde aproximadamente 7,0 hasta 7,4. El plasma sanguíneo circulante y el líquido intersticial normal representan ejemplos típicos de condiciones fisiológicas normales.
"Fármaco": como se usa en el presente documento, el término "fármaco" se refiere a un compuesto que es biológicamente activo y proporciona un efecto fisiológico deseado tras la administración a un sujeto en necesidad del mismo (por ejemplo, un componente farmacéutico activo).
"Citotóxico":como se usa en el presente documento, el término "citotóxico" significa tóxico para las células o una población de células deseada (por ejemplo, células cancerosas). El efecto tóxico puede dar como resultado muerte celular y/o lisis. En ciertos casos, el efecto tóxico puede ser un efecto destructor subletal sobre la célula, por ejemplo, ralentizando o deteniendo el crecimiento celular. Para lograr un efecto citotóxico, el fármaco o profármaco se puede seleccionar de un grupo que consiste en un agente que daña el ADN, un agente disruptor de microtúbulos, o una proteína o polipéptido citotóxico, entre otros.
"Citostático": como se usa en el presente documento, el término "citostático" se refiere a un fármaco u otro compuesto que inhibe o detiene el crecimiento y/o multiplicación celular.
"Molécula pequeña": como se usa en el presente documento, el término "molécula pequeña" se refiere a moléculas, tanto que existen de forma natural como artificialmente creadas (por ejemplo, por síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo. Las moléculas pequeñas preferidas son biológicamente activas en que producen un efecto local o sistémico en animales, preferentemente mamíferos, más preferentemente seres humanos. En ciertas realizaciones preferidas, la molécula pequeña es un fármaco y la molécula pequeña se denomina "molécula de fármaco" o "fármaco" o "agente terapéutico". En ciertas realizaciones, la molécula de fármaco tiene un MW inferior o igual a aproximadamente 5 kDa. En otras realizaciones, la molécula de fármaco tiene un MW inferior o igual a aproximadamente 1,5 kDa. En realizaciones, la molécula de fármaco se selecciona de alcaloides de la vinca, auristatinas, duocarmicinas, tubulisinas, compuestos de camptotecina no naturales, inhibidores de la topoisomerasa, fármacos de unión a ADN, inhibidores de cinasas, inhibidores de MEK, inhibidores de KSP, caliqueamicinas, SN38, pirrolobenzodiacepinas y sus análogos. Preferentemente, aunque no necesariamente, el fármaco es uno que ya se ha considerado seguro y eficaz para su uso por una agencia gubernamental u organismo apropiado, por ejemplo, la FDA. Por ejemplo, fármacos para uso humano enumerados por la FDA bajo el artículo 21 del C.F.R. §§ 330.5, 331 a 361, y 440 a 460; fármacos para uso veterinario enumerados por la FDA bajo 21 C.F.R. §§ 500 a 589, se consideran todos adecuados para su uso con los presentes polímeros hidrófilos.
"Derivado de fármaco" o "fármaco modificado"o similares, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que comprende la molécula de fármaco prevista para ser administrada por el conjugado desvelado en el presente documento y un grupo funcional capaz de unir la molécula de fármaco al vehículo polimérico.
"Forma activa", como se usa en el presente documento, se refiere a la forma de un compuesto que presenta eficacia farmacéutica previstain vivooin vitro.En particular, cuando una molécula de fármaco prevista para ser administrada por el conjugado desvelado en el presente documento se libera del conjugado, la forma activa puede ser el fármaco en sí o sus derivados, que presentan las propiedades terapéuticas previstas. La liberación del fármaco del conjugado se puede lograr por escisión de un enlace biodegradable del conector que fija el fármaco al vehículo polimérico. Por consiguiente, los derivados de fármaco activo pueden comprender una porción del conector.
"PHF"se refiere a poli(1 -hidroximetiletilen-hidroximetil-formal).
Como se usa en el presente documento, los términos "unidad de polímero", "unidad monomérica", "monómero", "unidad de monómero", "unidad" se refieren todos a una unidad estructural repetible en un polímero.
Como se usa en el presente documento, "peso molecular" o "MW" de un polímero o vehículo polimérico/armazón o conjugados de polímero se refiere al peso molecular medio ponderal del polímero no modificado, a menos que se especifique lo contrario.
La presente invención pretende incluir todos los isótopos de átomos que ocurren en los presentes compuestos. Isótopos incluyen los átomos que tienen el mismo número atómico, pero diferente número másico. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
La presente invención pretende incluir todos los isómeros del compuesto, que se refieren a e incluyen, isómeros ópticos, e isómeros tautómeros, donde los isómeros ópticos incluyen enantiómeros y diaestereómeros, isómeros quirales e isómeros no quirales, y los isómeros ópticos incluyen isómeros ópticos aislados, así como mezclas de isómeros ópticos que incluyen mezclas racémicas y no racémicas; donde un isómero puede estar en forma aislada o en una mezcla con uno o varios de otros isómeros.
Anticuerpos contra HER2
Los anticuerpos monoclonales desvelados en el presente documento tienen la capacidad de inhibir la actividad de la vía de PI3K-Akt mediada por HER2.
Los anticuerpos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento incluyen, por ejemplo, el anticuerpo XMT 1517, el anticuerpo XMT 1518, el anticuerpo XMT 1519 y el anticuerpo XMT 1520. Estos anticuerpos muestran especificidad por HER2 humano y se ha mostrado que inhiben la actividad funcional de HER2in vitro.
Cada uno de los anticuerpos monoclonales contra HER2 descritos en el presente documento incluye una cadena pesada (HC), región variable de cadena pesada (VH), cadena ligera (LC) y una región variable de cadena ligera (VL), como se muestra en las secuencias de aminoácidos y del ácido nucleico correspondientes presentadas a continuación. La región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera para cada anticuerpo están sombreadas en las secuencias de aminoácidos a continuación. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y la cadena ligera están subrayadas en las secuencias de aminoácidos presentadas a continuación. Los aminoácidos que engloban las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son como se definen por E.A. Kabat et al. (véase Kabat, E.A., et al., Sequences of Protein of immunological interest, quinta edición, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)).
> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de XMT 1517 (región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 9) región constante de la cadena pesada de IgG1 (SEQ ID NO: 32))
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVTWYDGSNKYYADSV
KGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEAPYYAKDYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPS
VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM
ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE
WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PG* (SEQ ID NO: 1)
CDRH1: FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17)
CDRH2: VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18)
CDRH3: EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19)
> Secuencia del ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada de XMT 1517 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCCGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAGGAAGCTCCCTACTACGCTAAAGATTA CATGGACGTATGGGGCAAGGGTACAACTGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 34)
> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de XMT 1517 (región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 10) región constante de la cadena ligera (SEQ ID NO: 33)) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSDYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYVSYWTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIF P P S D E QLKS G TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2)
CDRL1: RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20)
CDRL2: GASSRAT (SEQ ID NO: 21)
CDRL3: QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22)
> Secuencia del ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera de XMT 1517 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCGACTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG TGTATTACTGTCAGCAGTACGTCAGTTACTGGACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAA
A (SEQ ID NO: 35)
> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de XMT 1518 (región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 11) constante de cadena pesada de IgG1 (SEQ ID NO: 32)) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAGIWWDGSNEKYADSV KGRF TISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEAPYYAKDYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG* (SEQ ID NO: 3)
CDRH1: FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17)
CDRH2: GIWWDGSNEKYADSVKG (SEQ ID NO: 23)
CDRH3: EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19)
> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de XMT 1518 (región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 12) constante de cadena ligera (SEQ ID NO: 33))
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSDYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYVSYWTFGGGTKVEIKRTVAAP5V FIFPP5DEQLK5G TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4)
CDRL1: RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20)
CDRL2: GASRRAT (SEQ ID NO: 24)
CDRL3: QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22)
> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de XMT 1519 (región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 13) región constante de la cadena pesada de IgG1 (SEQ ID NO: 32))
EVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF S SYSMNWVRQAPGKGLEWVSY IS S SSSTIYYADSV KGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGHGYFDLWGRGTLVTVSSAS TKGP SVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
(SEQ ID NO: 5)
CDRH1: FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25)
CDRH2: YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26)
CDRH3: GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27)
> Secuencia del ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada de XMT 1519 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAA GGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTAGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGTGGACACGGATATTTCGACCTATG GGGGAGAGGTACCTTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 36)
> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de XMT 1519 (región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 14) región constante de la cadena ligera (SEQ ID NO: 33))EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYHHSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 6)
CDRL1: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)
CDRL2: GASSRAT (SEQ ID NO: 21)
CDRL3: QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)
> Secuencia del ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera de XMT 1519
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CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCA
GGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT
GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAG
TGTATTACTGTCAGCAGTACCACCACAGTCCTCTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGAT
CAAA (SEQ ID NO: 37)
> Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de XMT 1520 (región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 15) región constante de la cadena pesada de IgG1 (SEQ ID NO: 32))
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGRSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSDSRTIYYADSV
KGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAED TAVYYCARGGHGYFDLWGRGTLVTVSSAS TKGP SVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
(SEQ ID NO: 7)
CDRH1: FTFSGRSMN (SEQ ID NO: 30)
CDRH2: YISSDSRTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 31)
CDRH3: GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27)
> Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de XMT 1520 (región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 16) región constante de la cadena ligera (SEQ ID NO: 33))
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS
GSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYHHSPLTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKS
GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8)
CDRL1: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28)
CDRL2: GASSRAT (SEQ ID NO: 21)
CDRL3: QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29)
También se incluyen en la divulgación anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo o compiten de forma cruzada para unirse al mismo epítopo que los anticuerpos de la invención y fragmentos de unión al antígeno de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno desvelados en el presente documento se unen específicamente a HER2, en donde el anticuerpo o fragmento se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de aminoácidos en HER2 humano (por ejemplo, n.° de acceso de GenBank P04626.1).
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos desvelados en el presente documento se unen específicamente a un epítopo en el receptor HER2 humano de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos:
1 MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY
51 QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR
101 IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK
151 GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK
201 GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS
251 DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP
301 YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL
351 REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF
401 ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI
451 SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP
501 EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL
551 PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC
601 PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP
651 LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL
701 TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV
751 AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL
801 MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN
851 VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT
901 HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID
951 VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL
1001 DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS
1051 STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS
1101 LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP
1151 SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ
1201 GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG
1251 LDVPV (SEQ ID NO: 38)
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos desvelados en el presente documento se unen específicamente a un epítopo en el dominio extracelular (ECD) del receptor HER2 humano que comprende la secuencia de aminoácidos:
1 TQVCTGTDMK LRLPASPETH LDMLRHLYQG CQVVQGNLEL TYLPTNASLS
51 FLQDIQEVQG YVLIAHNQVR QVPLQRLRIV RGTQLFEDNY ALAVLDNGDP
101 LNNTTPVTGA SPGGLRELQL RSLTEILKGG VLIQRNPQLC YQDTILWKDI
151 FHKNNQLALT LIDTNRSRAC HPCSPMCKGS RCWGESSEDC QSLTRTVCAG
201 GCARCKGPLP TDCCHEQCAA GCTGPKHSDC LACLHFNHSG ICELHCPALV
251 TYNTDTFESM PNPEGRYTFG ASCVTACPYN YLSTDVGSCT LVCPLHNQEV
301 TAEDGTQRCE KCSKPCARVC YGLGMEHLRE VRAVTSANIQ EFAGCKKIFG
351 SLAFLPESFD GDPASNTAPL QPEQLQVFET LEEITGYLYI SAWPDSLPDL
401 SVFQNLQVIR GRILHNGAYS LTLQGLGISW LGLRSLRELG SGLALIHHNT
451 HLCFVHTVPW DQLFRNPHQA LLHTANRPED ECVGEGLACH QLCARGHCWG
501 PGPTQCVNCS QFLRGQECVE ECRVLQGLPR EYVNARHCLP CHPECQPQNG
551 SVTCFGPEAD QCVACAHYKD PPFCVARCPS GVKPDLSYMP IWKFPDEEGA
601 CQPCPINCTH SCVDLDDKGC PAEQRASPLT (SEQ ID NO:: 39)
Los expertos en la técnica reconocerán que es posible determinar, sin excesiva experimentación, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento (por ejemplo, XMT 1517, XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520) determinando si el primero previene que el último se una a un componente de unión natural u otra molécula que se asocia con HER2. Si el anticuerpo monoclonal que se prueba compite con el anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento, como se muestra por una disminución en la unión por el anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento, entonces los dos anticuerpos monoclonales se unen en el mismo epítopo, o uno estrechamente relacionado.
Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento es incubar previamente el anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento con HER2 soluble (con la que normalmente es reactivo), y luego añadir el anticuerpo monoclonal que se prueba para determinar si el anticuerpo monoclonal que se prueba se inhibe en su capacidad para unirse a HER2. Si el anticuerpo monoclonal que se prueba se inhibe, entonces, con toda probabilidad, tiene la misma especificidad epitópica, o funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal desvelado en el presente documento.
El cribado de anticuerpos monoclonales desvelados en el presente documento también se puede llevar a cabo, por ejemplo, midiendo la actividad de la vía de PI3K-Akt mediada por HER2, y determinando si el anticuerpo monoclonal de prueba es capaz de modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la actividad de la vía de PI3K-Akt.
Los anticuerpos contra HER2 se generan, por ejemplo, usando los métodos descritos en los Ejemplos proporcionados en el presente documento. Alternativamente o, además, se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra HER2, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de los mismos (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en las que la secuencia entera de tanto la cadena ligera como la cadena pesada, que incluyen las CDR, surgen de genes humanos. Dichos anticuerpos se llaman "anticuerpos humanos" o "anticuerpos completamente humanos" en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en los ejemplos proporcionados más adelante. Los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar usando la técnica de triomas; la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de híbridos de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Col, et al., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES a Nd CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden utilizar y se pueden producir usando hibridomas humanos (véase Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con el virus de Epstein Barrin vitro(véase Cole, et al., 1985, en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Los anticuerpos se purifican por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de afinidad usando proteína A o proteína G, que proporcionan principalmente la fracción de IgG del antisuero. Posteriormente, o alternativamente, el antígeno específico que es la diana de la inmunoglobulina buscada, o un epítopo de la misma, se puede inmovilizar sobre una columna para purificar el anticuerpo específico inmunitario por cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas se trata, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (17 de abril de 2000), pp. 25-28).
Los anticuerpos monoclonales que modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren de otro modo con la actividad de la vía de PI3K-Akt mediada por HER2 se generan, por ejemplo, inmunizando un animal con HER2 unido a membrana y/o soluble, tal como, por ejemplo, HER2 murino, de rata o humano, o un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. Alternativamente, el animal se inmuniza con células transfectadas con un vector que contiene una molécula del ácido nucleico que codifica HER2 de forma que HER2 se exprese y asocie a la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, los anticuerpos se obtienen por cribado de una biblioteca que contiene anticuerpo o secuencias del dominio de unión al antígeno para unirse a HER2. Esta biblioteca se prepara, por ejemplo, en bacteriófago como fusiones de proteína o péptido con una proteína de la cubierta del bacteriófago que se expresa sobre la superficie de partículas de fago ensambladas y las secuencias de ADN codificantes contenidas dentro de las partículas de fago (es decir, "biblioteca presentada en fago"). Los hibridomas resultantes de fusiones de mieloma/linfocitos B se criban entonces para reactividad a HER2. Además, los anticuerpos se seleccionan de, y opcionalmente se optimizan en, bibliotecas de presentación de anticuerpos de levadura y sistemas de presentación de bibliotecas de levadura, como se describen en, por ejemplo: Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, Hufton SE. Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene. 2004 Nov 24;342(2):211-8; Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan;33(1):1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9. Review; Lauer TM, Agrawal NJ, Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J Pharm Sci. 2012 Jan;101 (1):102-15; Orcutt K.D. y Wittrup K.D. (2010), 207-233 doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15; Rakestraw JA, Aird D, Aha PM,
Baynes BM, Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun;24(6):525-30; documentos de patente US 8.258.082; US 6.300.064; US 6.696.248; US 6.165.718; US 6.500.644; US 6.291.158; US 6.291.159; US 6.096.551; US 6.368.805; US 6.500.644. Los sistemas de presentación en la biblioteca de levadura a modo de ejemplo se describen en, por ejemplo, los documentos de patente WO2008118476; WO2009/036379; WO2010105256; y WO2012009568. En ciertos ejemplos, dichas bibliotecas de presentación de anticuerpos de levadura o sistemas de presentación de bibliotecas de levadura se diseñan para imitar o reflejar la diversidad característica del repertorio de anticuerpos preinmunes humanos. En ciertos ejemplos, dicha diversidad de bibliotecas de presentación de anticuerpos de levadura o diversidad del sistemas de presentación de bibliotecas de levadura se genera por ordenador. En ciertos ejemplos, dichas bibliotecas de presentación de anticuerpos de levadura o sistemas de presentación de bibliotecas de levadura comprenden células de levadura de Sacaromyces, tales como células deSacaromyces cerevisiae.En ciertos ejemplos, dichas bibliotecas de presentación de anticuerpos de levadura o sistemas de presentación de bibliotecas de levadura comprenden células dePichia.
Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza normalmente con un agente inmunizante para inducir a los linfocitos a que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.
El agente inmunizante incluirá normalmente el antígeno de proteína, un fragmento del mismo, o una proteína de fusión del mismo. En general, se usan o linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células de los ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. Los linfocitos se fusionan entonces con una estirpe celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Las estirpes celulares inmortalizadas son células de mamífero normalmente transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Normalmente, se emplean estirpes celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si la células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficientemente, soportan la expresión estable de alto nivel del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Las estirpes celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. También se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales (véanse Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)).
El medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan se puede ensayar entonces para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Además, en aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tienen un alto grado de especificidad y una alta afinidad de unión por el antígeno diana.
Después de que se identifiquen células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos convencionales (véase Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden cultivarin vivocomo ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o líquido ascítico por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden preparar por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales desvelados en el presente documento puede ser aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma desveladas en el presente documento sirven de fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede poner en vectores de expresión, que luego se transfectan en células hospedadoras, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (véase la patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniendo covalentemente con la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Dicho polipéptido distinto de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo desvelado en el presente documento, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo desvelado en el presente documento para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos monoclonales desvelados en el presente documento incluyen anticuerpos completamente humanos o anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos son adecuados para administración a seres humanos sin generar una respuesta inmunitaria por el humano contra la inmunoglobulina administrada.
Un anticuerpo contra HER2 humanizado o completamente humano se genera, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en los ejemplos proporcionados a continuación.
En otros métodos alternativos, un anticuerpo contra HER2 se desarrolla, por ejemplo, usando métodos de presentación en fago usando anticuerpos que contienen solo secuencias humanas. Dichos enfoques son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, en el documento de patente WO92/01047 y la patente de EE. UU. n.° 6.521.404. En este enfoque, una biblioteca combinatoria de fago que lleva pares aleatorios de cadenas ligeras y pesadas se criba usando una fuente natural o recombinante de HER2 o fragmentos del mismo. En otro enfoque, un anticuerpo contra HER2 se puede producir por un proceso en donde al menos una etapa del proceso incluye inmunizar un animal transgénico no humano con proteína HER2 humana. En este enfoque, algunos de los sitios de la cadena pesada y/o ligera kappa endógena de este animal xenogénico no humano han sido desactivados y son incapaces de la reordenación requerida para generar genes que codifican inmunoglobulinas en respuesta a un antígeno. Además, al menos un sitio de cadena pesada humana y al menos un sitio de cadena ligera humana se han transfectado establemente en el animal. Por lo tanto, en respuesta a un antígeno administrado, los sitios humanos se reordenan para proporcionar genes que codifican regiones variables humanas inmunoespecíficas del antígeno. T ras la inmunización, por lo tanto, el xenoratón produce linfocitos B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas.
Se conocen bien en la técnica una variedad de técnicas para producir animales xenogénicos no humanos. Por ejemplo, véanse las patentes de EE. UU. n.° 6.075.181 y n.° 6.150.584y. Este estrategia general se demostró a propósito de la generación de las primeras cepas de XenoMouse™ como se publicó en 1994. Véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Véanse, por lo tanto, las patentes de EE. UU. n.26.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181; y 5.939.598 y las patentes japonesas n.° 3068 180 B2, 3068506 B2 y 3068507 B2 y la patente europea n.° EP 0463 151 B1 y las solicitudes de patente internacional n.° WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y miembros de familia relacionados.
En un enfoque alternativo, otros han utilizado un enfoque de "minisitio" en que un sitio de Ig exógeno es imitado mediante la inclusión de trozos (genes individuales) del sitio de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes D<h>, uno o más genes J<h>, una región constante mu y una segunda región constante (preferentemente una región constante gamma) se conforman en una construcción para inserción en un animal. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.25.545.806; 5.545.807; 5.591.669; 5.612.205;5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.643.763; 5.661.016; 5.721.367; 5.770.429; 5.789.215; 5.789.650; 5.814.318; 5.877; 397; 5.874.299; 6.023.010; y 6.255.458; y la patente europea n.° 0546073 B1; y las solicitudes de patente internacional n.° WO 92/03918, WO 92/22645, w O 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y miembros de familia relacionados.
También se ha demostrado la generación de anticuerpos humanos de ratones en los que, mediante fusión de microcélulas, se han introduce grandes trozos de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea n.° 773288 y 843961.
Las respuestas de anticuerpos humanos antimurinos (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable inmunitaria, se espera que se observen ciertas respuestas de anticuerpos humanos antiquiméricos (HACA), particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos contra HER2 para invalidar o mitigar de otro modo las preocupaciones y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.
La producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida también se lleva a cabo por humanización, quimerización y técnicas de presentación usando bibliotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies se pueden humanizar o primatizar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) y Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés se puede manipular por técnicas de ADN recombinante para sustituir dominios CH1, CH2, CH3, bisagra y/o el dominio de región estructural con la secuencia humana correspondiente (véanse el documento de patente WO 92102190 y las patentes de EE. UU. n.25.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.792;. 5.714.350; y 5.777.085). Por tanto, se conoce en la técnica el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes quiméricos de inmunoglobulina (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) y J. Immunol. 139:3521 (1987)). El ARNm se aísla de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se usa para producir ADNc. El ADNc de interés se puede amplificar por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (patentes de EE. UU. n.° 4.683.195 y 4.683.202). Alternativamente, se prepara una biblioteca y se criba para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo se fusiona entonces con las secuencias de la región constante humana. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas se pueden encontrar en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, publicación de N.I.H. n.° 91-3242. Los genes de la región C humana están fácilmente disponibles de clones conocidos. La elección de isotipo irá guida por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación del complemento, o actividad en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgG1, IgG3 e IgG4. Se puede usar cualquiera de las regiones constantes de la cadena ligera humanas, kappa o lambda. El anticuerpo humanizado quimérico se expresa entonces por métodos convencionales.
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, F(ab<')2>y Fab, por escisión de la proteína intacta, por ejemplo, por escisión por proteasa o química. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab<')2>incluiría secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido por un codón de terminación traduccional para dar la molécula truncada.
Se pueden usar secuencias consenso de las regiones H y L J para diseñar oligonucleótidos para su uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para el posterior enlace de los segmentos de la región V con segmentos de la región C humana. Se puede modificar el ADNc de la región C por mutagénesis dirigida al sitio para poner un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.
Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YAC, episomas derivados del VEB y similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados manipulados de manera que cualquier secuencia VH o VL pueda ser fácilmente insertada y expresada. En dichos vectores, el corte y empalme ocurre normalmente entre el sitio donante de corte y empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de corte y empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de corte y empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y terminación de la transcripción ocurren en sitios cromosómicos nativos en la dirección 3' de las regiones codificantes. El anticuerpo quimérico resultante se puede unir a cualquier promotor fuerte, que incluye LTR retrovíricas, por ejemplo, promotor temprano SV-40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), virus del sarcoma de Rous LTR (Gorman et al. P.N.A.S.
79:6777 (1982)) y LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)). Por tanto, como se apreciará, se pueden usar promotores de Ig nativos y similares.
Además, se pueden generar anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies mediante tecnologías de tipo presentación, que incluyen, sin limitación, presentación en fagos, presentación retrovírica, presentación ribosómica y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en la técnica, y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, ya que dichas técnicas se conocen bien en la técnica. Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes y Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (presentación ribosómica), Parmley y Smith Gene 73:305-318 (1988) (presentación en fagos), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081 -1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992) y la patente de EE. UU. n.° 5.733.743. Si se utilizan tecnologías de presentación para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos se pueden humanizar como se ha descrito anteriormente.
Usando estas técnicas, se pueden generar anticuerpos contra células que expresan HER2, formas solubles de HER2, epítopos o péptidos de los mismos, y bibliotecas de expresión para los mismos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.703.057) que a partir de aquí se pueden cribar como se ha descrito anteriormente para las actividades descritas en el presente documento.
Los anticuerpos HER2 desvelados en el presente documento se pueden expresar por un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.
Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola de genes, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos, tal como se describen en el documento de patente WO 93/64701, que tiene un resto de direccionamiento (por ejemplo, un ligando para un receptor de superficie celular) y un resto que se une al ácido nucleico (por ejemplo polilisina), vector vírico (por ejemplo, un vector vírico de ADN o ARN), proteínas de fusión, tal como se describen en el documento de patente WO 95/22618 que es una proteína de fusión que contiene un resto diana (por ejemplo, un anticuerpo específico de una célula diana) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo, una protamina), plásmidos, fago, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.
Los vectores preferidos incluyen vectores víricos, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovíricos incluyen virus de la leucemia murina de Moloney. Se prefieren vectores víricos de ADN. Estos vectores incluyen vectores de la viruela, tales como vectores orthopox o avipox, vectores del virus del herpes, tales como un vector del virus del herpes simple I (VHS) (véanse Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), vectores de adenovirus (véanse LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol.
69:2004 (1995) y vectores de virus adenoasociados (véase Kaplitt, M. G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994).
Los vectores víricos de la viruela introducen el gen en el citoplasma de las células. Los vectores de virus de la viruela aviar solo producen una expresión del ácido nucleico a corto plazo. Se prefieren los vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados y vectores del virus del herpes simple (VHS) para introducir el ácido nucleico en células neurales. El vector de adenovirus produce un expresión a más corto plazo (aproximadamente 2 meses) que el virus adenoasociado (aproximadamente 4 meses), que a su vez es más corta que los vectores de VHS. El vector particular elegido dependerá de la célula diana y la afección que está tratándose. La introducción puede ser por técnicas convencionales, por ejemplo, infección, transfección, transducción o transformación. Los ejemplos de modos de transferencia génica incluyen, por ejemplo, ADN desnudo, precipitación de CaPO4, DEAE-dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección de células y vectores víricos.
El vector se puede emplear para actuar de forma selectiva esencialmente en cualquier célula diana. Por ejemplo, se puede usar inyección estereotáxica para dirigir los vectores (por ejemplo, adenovirus, VHS) a una localización deseada. Además, las partículas se pueden administrar por infusión intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusión de minibomba, tal como un sistema de infusión Syncromod. Un método basado en flujo global, denominado convección, también ha demostrado ser eficaz en suministrar grandes moléculas a amplias áreas del cerebro y puede ser útil en suministrar el vector a la célula diana (véanse Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)). Otros métodos que se pueden usar incluyen catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y vías de administración orales u otras conocidas.
Estos vectores se pueden usar para expresar grandes cantidades de anticuerpos que se pueden usar en una variedad de formas. Por ejemplo, para detectar la presencia de HER2 en una muestra. El anticuerpo también se puede usar para intentar unirse a y alterar la señalización relacionada con HER2.
Se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos de una proteína antigénica desvelada en el presente documento (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.946.778). Además, se pueden adaptar métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (véase, por ejemplo, Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por una proteína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos para un antígeno de proteína se pueden producir por técnicas conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a: (i) un fragmento F(ab')<2>producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab<)2>; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.
La invención también incluye fragmentos anti-HER2 Fv, Fab, Fab' y F(ab<')2>o fragmentos anti-HER2, anticuerpos anti-HER2 monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos en los que al menos un brazo se une a HER2 y anticuerpos anti-HER2 heteroconjugados.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por HER2. El segundo agente de unión es cualquier otro antígeno, que incluyen una proteína de la superficie celular o receptor o subunidad receptora.
Se conocen en la técnica métodos de preparación de anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas/cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la diversidad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza normalmente por etapas de cromatografía de afinidad. Se desvelan procedimientos similares en el documento de patente WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Se pueden fusionar dominio variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) con secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para más detalles de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Según otro enfoque descrito en documento de patente WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede manipular para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')<2>). Las técnicas de generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos de forma proteolítica para generar fragmentos F(ab')<2>. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de complejación de ditiol arsenito sódico para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Además, los fragmentos Fab' pueden ser directamente recuperados de E. coli y se acoplan químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab<')2>completamente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado de E. coli y se somete a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que expresan en exceso el receptor de ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.
También se han descrito diversas técnicas de preparación y aislamiento de fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se asociaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo de preparación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V<h>y V<l>de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V<l>y V<h>complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia de preparación de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antígeno de proteína desvelado en el presente documento. Alternativamente, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula de receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores de Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), de manera que se centren los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el antígeno particular. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antígeno y un brazo que se une al agente citotóxico o un radionúclido quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une el antígeno de proteína descrito en el presente documento y además se une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestas de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (véase la patente de EE. UU. n.° 4.676.980), y para el tratamiento de infección por VIH (véanse los documentos de patente WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos se puedan prepararin vitrousando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, que incluye aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los desvelados, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980.
Se puede desear modificar el anticuerpo desvelado en el presente documento con respecto a la función efectora, para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados a la expresión y/o actividad de HER2. Por ejemplo, se pueden introducir residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) elevadas (véanse Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, se puede manipular un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y puede así tener lisis del complemento y capacidades de ADCC potenciadas (véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
Conjugados de anticuerpos contra HER2:
La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena de exotoxina A (dePseudomonas aeruginosa),cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor deMomordica charantia,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Está disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.
Se preparan conjugados de anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluilen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1 -isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (véase el documento de patente WO94/11026).
Los expertos habituales en la técnica reconocerán que se puede acoplar una gran variedad de restos posibles a los anticuerpos resultantes desvelados en el presente documento (véase, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse y R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989).
El acoplamiento se puede llevar a cabo por cualquier reacción química que unirá las dos moléculas mientras que el anticuerpo y el otro resto retendrán sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. La unión preferida es, sin embargo, la unión covalente. La unión covalente se puede lograr ya sea por condensación directa de cadenas laterales existentes, o por la incorporación de moléculas de puente externas. Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente invención, a otras moléculas. Por ejemplo, agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos, tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que, más bien, es un modo de ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes (véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
Se describen en la bibliografía conectores preferidos (véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res.
44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase, por lo tanto, la patente de EE. UU. n.° 5.030.719, que describe el uso de derivado de acetilhidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo a modo de un conector oligopeptídico. Los conectores particularmente preferidos incluyen: (i) clorhidrato de EDC (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato de succinimidilo (Pierce Chem. Co., Cat. n.° 21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (6-[3-(2-piridilditio)-propianamida]hexanoato de sulfosuccinimidilo (Pierce Chem. Co. Cat. n.° 2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. n.° 24510) conjugado con EDC.
Los conectores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, así que conducen a conjugados con propiedades fisioquímicas diferentes. Por ejemplo, los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los conectores que contienen éster de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el conector SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con elevada estabilidad. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces debido a que el enlace disulfuro se escindein vitro,dando como resultado menos conjugado disponible. El sulfo-NHS, en particular, puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tales como EDC), cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las patentes de EE. UU. n.° 4.485.045 y 4.544.545. En la patente de EE. UU. n.° 5.013.556 se desvelan liposomas con tiempo de circulación potenciado.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido dando liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por una reacción de intercambio de disulfuro.
En un aspecto, el conjugado descrito en el presente documento incluye un anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo conectado directa o indirectamente a uno o más armazones poliméricos que llevan D que comprende independientemente poli(1 -hidroximetiletilenhidroximetil-formal) (PHF) que tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa, en donde cada uno del uno o más armazones poliméricos que llevan D es independientemente de la fórmula (Ic):
en donde:
cada aparición de D, independientemente, es un agente terapéutico o de diagnóstico;
LD1 es un resto que contiene carbonilo;
cada aparición de
es independientemente un primer conector que contiene un enlace biodegradable de manera que cuando se rompe el enlace, se libera D en una forma activa para su efecto terapéutico previsto; y
en
----C(=0)-Ld1—|_D
entre LD1 y D indica unión directa o indirecta de D a LD1;
cada aparición de
es independientemente un segundo conector todavía no conectado al anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que LP2 es un resto que contiene un grupo funcional que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, y
entre LD1 y LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 a LD1, y cada aparición del segundo conector es distinta de cada aparición del primer conector;
cada aparición de
es independientemente un tercer conector que conecta cada armazón polimérico que lleva D al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que
terminal unido a LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo tras la formación de un enlace covalente entre un grupo funcional de LP2 y un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo; y cada aparición del tercer conector es distinta de cada aparición del primer conector;
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40,
m3 es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 18,
m4 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10;
la suma de m, mu, m<2>, m3 y mu varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300; y el número total de LP2 unidos al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es 10 o menos.
El conjugado puede incluir una o más de las siguientes características.
Por ejemplo, en la fórmula (Ic), mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 120 (por ejemplo, aproximadamente 1-90) y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, aproximadamente 1-8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 6 kDa hasta aproximadamente 20 kDa (es decir, la suma de m, m<1>, m<2>, m<3>y m4 varía desde aproximadamente 45 hasta aproximadamente 150), m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 20, mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 75 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 4-45).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 8 kDa a aproximadamente 15 kDa (es decir, la suma de m, mu, m<2>, m3 y muvaría desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 110), m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, mu es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, mues un número entero desde 1 hasta aproximadamente 10 y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 55 (por ejemplo, siendo mu aproximadamente 4-30).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa (es decir, la suma de m, mu, mu, mu y muvaría desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150), mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, mues un número entero desde 0 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, m<3>varía desde 0 hasta aproximadamente 9), m4 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, y/o mu es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70 y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa (es decir, la suma de m, mu, mu, muy muvaría desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110), mues un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, mues un número entero desde 0 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, muvaría desde 0 hasta aproximadamente 7), mues un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 y/o mu es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Ic) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa (es decir, la suma de m, mu, mu, muy muvaría desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75), m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 (por ejemplo, siendo muaproximadamente 3-10), mues un número entero desde 0 hasta aproximadamente 5 (por ejemplo, muvaría desde 0 hasta aproximadamente 4), mues un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, muvaría desde 1 hasta aproximadamente 5) y/o mu es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35 (por ejemplo, siendo m1 aproximadamente 5-35) y el número total de LP2 conectados al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo varía desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 6-20 kDa o aproximadamente 8-15 kDa, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, mu) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1-20, o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o aproximadamente 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa o mayor (por ejemplo, 60 kDa o mayor; 80 kDa o mayor; 100 kDa o mayor; 120 kDa o mayor; 140 kDa o mayor; 160 kDa o mayor, 180 kDa o mayor, o 200 kDa o mayor, o aproximadamente 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40-140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 100-140 kDa o 140-150 kDa). En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 6-20 kDa o aproximadamente 8-15 kDa, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1-20, o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o aproximadamente 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 140 kDa a 180 kDa o de 140 kDa a 150 kDa. En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
El anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo en este intervalo de peso molecular incluye, pero no se limitan a, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, tales como, IgG, IgM.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa, el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1 20 o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o aproximadamente 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 60 kDa a 120 kDa. En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno del mismo en este intervalo de peso molecular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, Fab2 y camélidos.
En cierta realización, D es un agente terapéutico. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico es una molécula pequeña que tiene un peso molecular < aproximadamente 5 kDa, < aproximadamente 4 kDa, < aproximadamente 3 kDa, < aproximadamente 1,5 kDa o < aproximadamente 1 kDa.
En ciertas realizaciones, el agente terapéutico tiene una CI<50>de aproximadamente inferior a 1 nM.
En otra realización, el agente terapéutico tiene una CI<50>de aproximadamente superior a 1 nM, por ejemplo, el agente terapéutico tiene una CI<50>de aproximadamente 1 a 50 nM.
Algunos agentes terapéuticos que tienen una CI<50>superior a aproximadamente 1 nM (por ejemplo, "fármacos menos potentes") son inadecuados para conjugación con un anticuerpo usando técnicas de conjugación reconocidas en la técnica. Sin desear quedar ligado a teoría, dichos agentes terapéuticos tienen una potencia que es insuficiente para su uso en conjugados anticuerpo-fármaco dirigidos usando técnicas convencionales ya que copias suficientes del fármaco (es decir, superiores a 8) no se pueden conjugar usando técnicas reconocidas en la técnica sin dar como resultado propiedades farmacocinéticas y fisioquímicas reducidas del conjugado. Sin embargo, se pueden lograr cargas suficientemente altas de estos fármacos menos potentes usando las estrategias de conjugación descritas en el presente documento, dando así como resultado elevadas cargas del agente terapéutico, mientras se mantienen las propiedades farmacocinéticas y fisioquímicas deseables. Por lo tanto, la invención también se refiere a un conjugado anticuerpo-polímero-fármaco que incluye el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo,<p>H<f>y al menos ocho restos de agente terapéutico, donde D es auristatina, dolastatina, monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), auristatina F, AF HPA, fenilendiamina (AFP).
Por ejemplo, la duocarmicina o análogos de la misma es duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, CC-1065, adozelesina, bizelesina o carzelesina.
Otros ejemplos de D incluyen los descritos en, por ejemplo, la publicación de solicitud de EE. UU. n.° 2013-0101546, la patente de EE. UU. n.° 8.815.226, US 2015-0104407 A1 y las solicitudes pendientes de tramitación con n.° de serie de EE. UU. 61/988.011 presentada el 2 de mayo de 2014 y 62/010.972 presentada el 11 de junio de 2014.
En algunas realizaciones, el número de armazones poliméricos que llevan D que se puede conjugar con un anticuerpo está limitado por el número de restos de cisteína libres. En algunas realizaciones, restos de cisteína libres se introducen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo por los métodos descritos en el presente documento. Los conjugados a modo de ejemplo desvelados en el presente documento pueden incluir anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína manipulados (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). En algunas realizaciones, uno o más restos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin el uso de manipulación, en cuyo caso los restos de cisteína libres existentes se pueden usar para conjugar el anticuerpo a un armazón polimérico que lleva D. En algunas realizaciones, un anticuerpo se expone a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más restos de cisteína libres.
En ciertas realizaciones, en el conjugado descrito en el presente documento, el armazón polimérico que lleva D de la fórmula (Ic) es de la fórmula (Ie):
en donde,
PHF tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa; cada aparición de D es independientemente un agente terapéutico que tiene un peso molecular de < 5kDa, y
entre D y el grupo carbonilo indica unión directa o indirecta de D al grupo carbonilo,
X es CH<2>, O o NH;
uno de Xa y Xb es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o Xa y Xb, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono, m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m7 es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40, y la suma de m<1>y m7 es aproximadamente 2 a aproximadamente 180
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17,
m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, y la suma de m3a y m3b es entre 1 y 18, y la suma de m, m<1>, m7, m3a y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300.
En ciertas realizaciones, en el conjugado descrito en el presente documento, el armazón polimérico que lleva D de la fórmula (Ie) es de la fórmula (Id):
en donde:
uno de Xa y Xb es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o Xa y Xb, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono;
m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17,
m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, y la suma de m3a y m3b es entre 1 y 18, y la suma de m, m<1>, m<2>, m3a, y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es mayor que 1:1 e inferior o igual a 10:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es aproximadamente 9 :1 ,8 :1 ,7 :1,6:1 ,5 :1 ,4:1,3 :1 , o 2:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es entre 2:1 y 8:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es aproximadamente 8 :1,7:1 ,6 :1,5:1 ,4 :1 ,3:1, o 2:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es entre 2:1 y 4:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es aproximadamente 4:1,3:1, o 2:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es aproximadamente 3:1 y 5:1.
Por ejemplo, la relación entre m<2>y m3b es aproximadamente 3:1,4:1 o 5:1.
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8.
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8 y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, un número entero desde 2 hasta aproximadamente 6 o un número entero desde 2 hasta aproximadamente 4).
Por ejemplo, cuando PHF en la fórmula (Id) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75, m<1>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35, m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 4, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 5 y la relación entre PHF y el anticuerpo contra HER2 aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, un número entero desde 2 hasta aproximadamente 6 o un número entero desde 2 hasta aproximadamente 4).
Por ejemplo, los restos de bloqueo de maleimido solubles en agua son restos que pueden unirse covalentemente a uno de los dos átomos de carbono de la olefina tras la reacción del grupo de maleimido con un compuesto que contiene tiol de la fórmula (II):
R90-(CH2)d-SH (II)
en donde:
R<90>es NHR<91>, OH, COOR<93>, CH(NHR91)COOR93 o un grupo fenilo sustituido;
R93 es hidrógeno o alquilo C<1-4>;
R<91>es hidrógeno, CH<3>o CH<3>CO y
d es un número entero desde 1 hasta 3.
Por ejemplo, el compuesto de bloqueo de maleimido soluble en agua de la fórmula (II) puede ser cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanoico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (es decir, HOCH<2>SH), bencil tiol en el que el fenilo está sustituido con uno o más sustituyentes hidrófilos, o 3-aminopropano-1-tiol. El uno o más sustituyentes hidrófilos en el fenilo comprenden OH, SH, metoxi, etoxi, COOH, CHO, CO-alquilo C<1-4>, NH<2>, F, ciano, SO<3>H, PO<3>H y similares.
Por ejemplo, el grupo de bloqueo de maleimido soluble en agua es -S-(CH2)d-R90, en el que, R<90>es OH, COOH o CH(NHR91)COOR93;
R93 es hidrógeno o CH<3>;
R91 es hidrógeno o CH<3>CO; y
d es 1 o 2.
Por ejemplo, el grupo de bloqueo de maleimido soluble en agua es -S-CH<2>-CH(NH<2>)COOH.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1 -20 o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o aproximadamente 2-10). Este armazón se pueden usar, por ejemplo, para conjugar un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa o mayor (por ejemplo, 60 kDa o mayor; 80 kDa o mayor; o 100 kDa o mayor; 120 kDa o mayor; 140 kDa o mayor; 160 kDa o mayor, 180 kDa o mayor, o 200 kDa o mayor, o aproximadamente 40-200 kDa, 40-180 kDa, 40 140 kDa, 60-200 kDa, 60-180 kDa, 60-140 kDa, 80-200 kDa, 80-180 kDa, 80-140 kDa, 100-200 kDa, 100-180 kDa, 100-140 kDa o 140-150 kDa). En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1-20 o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o aproximadamente 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno que tiene un peso molecular de 140 kDa to 180 kDa o de 140 kDa a 150 kDa. En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno en este intervalo de peso molecular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, tales como, IgG, IgM.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40, (por ejemplo, aproximadamente 1-20 o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno que tiene un peso molecular de 60 kDa a 120 kDa. En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno en este intervalo de peso molecular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, Fab2, scFcFv y camélidos.
Por ejemplo, cuando PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa, (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa), el número de fármacos por PHF (por ejemplo, m<2>) es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40 (por ejemplo, aproximadamente 1-20 o aproximadamente 2-15 o aproximadamente 3-10 o 2-10). Este armazón se puede usar, por ejemplo, para conjugar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa a 80 kDa. En esta realización, la relación entre el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo y PHF es entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:9, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:7, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:8, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:6, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:5, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:4, entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:3, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:4, o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:5.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno en este intervalo de peso molecular, es decir, aproximadamente 40 kDa a aproximadamente 80 kDa, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, Fab.
En ciertas realizaciones, en el conjugado descrito en el presente documento, el armazón polimérico que lleva D de la fórmula (Ie) es de la fórmula (If), en donde el polímero es PHF que tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa:
en donde:
m es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 300,
mi es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 140,
m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 40,
m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 17,
m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8;
la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 18;
la suma de m, m<1>, m<2>, m3a, y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300;
el
terminal indica la unión de uno o más armazones poliméricos al anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano y comprende una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 1 (CDRH1) que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 2 (CDRH2) que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 3 (CDRH3) que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 1 (CDRL1) que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 2 (CDRL2) que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 3 (CDRL3) que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); y
la relación entre PHF y el anticuerpo es 10 o menos.
El armazón de la fórmula (If) puede incluir una o más de las siguientes características:
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 20 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 9, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 10, y la relación entre PHF y anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8.
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 3 kDa hasta aproximadamente 15 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 15, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 7, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 8; y la relación entre PHF y el anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
Cuando PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 75, m<1>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 35, m<2>es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, m3a es un número entero desde 0 hasta aproximadamente 4, m3b es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 5, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta aproximadamente 5; y la relación entre PHF y anticuerpo es un número entero desde 2 hasta aproximadamente 8 (por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4).
En ciertas realizaciones, la relación entre auristatina F hidroxilpropil amida ("AF HPA") y el anticuerpo puede ser aproximadamente 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 25:1,24:1,23:1,22:1, 21:1,20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En otras realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1,9:1,8:1,7:1 o 6:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 o 10:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1, 12:1 o 11:1.
En algunas realizaciones, la relación entre AF HPA y el anticuerpo puede ser aproximadamente 15:1, 14:1, 13:1 o 12:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 10:1,9:1,8:1,7:1,6:1,5:1, 4:1,3:1,2:1 o 1:1.
En ciertas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 8:1, 7:1,6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1.
En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1,2:1 o 1:1. En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1,3:1 o 2:1. En otras realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 6:1,5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 5:1,4:1 o 3:1.
En algunas realizaciones, la relación entre PHF y el anticuerpo puede ser aproximadamente 4:1,3:1 o 2:1.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno en este intervalo de peso molecular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab.
Otras realizaciones de conjugados anticuerpo-fármaco de polímero son aquellas descritas en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.28.815.226; US 2015-0104407 A1; y n.2 serie US 61/988.011 presentada el 2 de mayo de 2014.
La presente divulgación también se refiere a un fármaco derivado así modificado que puede conjugarse directamente con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo ausente de un vehículo polimérico, y los conjugados de fármaco-anticuerpo del mismo.
En algunas realizaciones, los conjugados anticuerpo-fármaco incluyen un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo conjugado, es decir, covalentemente unido, al resto de fármaco. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se une covalentemente al resto de fármaco a través de un conector, por ejemplo, un conector no polimérico.
El resto de fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) puede incluir cualquier compuesto, resto o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático como se define en el presente documento. En ciertas realizaciones, un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que se dirige a una célula tumoral, un resto de fármaco (D) y un resto conector (L) que une Ab a D. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al resto conector (L) a través de uno o más residuos de aminoácidos, tales como lisina y/o cisteína.
En ciertas realizaciones, el ADC tiene la fórmula (Ig):
Ab-(L-D)p (Ig),
donde p es 1 a aproximadamente 20.
En algunas realizaciones, el número de restos de fármaco que se puede conjugar con un anticuerpo está limitado por el número de restos de cisteína libres. En algunas realizaciones, restos de cisteína libres se introducen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo por los métodos descritos en el presente documento. Los ADC a modo de ejemplo de la fórmula Ig incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína manipulados (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). En algunas realizaciones, uno o más restos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin el uso de manipulación, en cuyo caso los restos de cisteína libres existentes se pueden usar para conjugar el anticuerpo con un fármaco. En algunas realizaciones, un anticuerpo se expone a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más restos de cisteína libres.
En algunas realizaciones, el "conector" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para enlazar uno o más restos de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) de la fórmula Ig. En algunas realizaciones, los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar usando un conector que tiene funcionalidades reactivas para unirse covalentemente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un tiol de cisteína de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un conector o un producto intermedio fármaco-conector para preparar un ADC.
En un aspecto, un conector tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. A modo de ejemplo no limitante, dichas funcionalidades reactivas incluyen maleimida, haloacetamidas, a-haloacetilo, ésteres activados, tales como ésteres de succinimida, ésteres 4-nitrofenílicos, ésteres pentafluorofenílicos, ésteres tetrafluorofenílicos, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Véase, por ejemplo, el método de conjugación en la página 766 de Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, y los ejemplos en el presente documento.
En algunas realizaciones, un conector tiene funcionalidad que es capaz de reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. A modo de ejemplo, dichos grupos electrófilos incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo de aldehído y cetona. En algunas realizaciones, un heteroátomo de la funcionalidad reactiva del conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. A modo de ejemplo no limitante, dichas funcionalidades reactivas incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida.
Un conector puede comprender uno o más componentes de conector. A modo de ejemplo, los componentes de conector incluyen 6-maleimidocaproílo ("MC"), maleimidopropanoílo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit" o "vc"), alaninafenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB"), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo ("SPP") y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carboxilato ("MCC"). Se conocen en la técnica diversos componentes de conector, algunos de los cuales se describen a continuación.
Un conector puede ser un "conector escindible", que facilita la liberación de un fármaco. Conectores escindibles a modo de ejemplo no limitantes incluyen conectores lábiles en ácidos (por ejemplo, que comprenden hidrazona), conectores sensibles a proteasas (por ejemplo, sensibles a peptidasa), conectores fotolábiles o conectores que contienen disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
En ciertas realizaciones, un conector tiene la siguiente fórmula (Ilg):
-Aa-Ww-Yy (Ilg)
en donde:
A es una "unidad de estiramiento" y a es un número entero desde 0 hasta 1;
W es una "unidad de aminoácido" y w es un número entero desde 0 hasta 12;
Y es una "unidad espadadora" e y es un número entero 0, 1 o 2. Un ADC que comprende el conector de la fórmula (Ilg) tiene la fórmula I(A): Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p, en donde Ab, D y p se definen como antes para la fórmula (Ig). Realizaciones a modo de ejemplo de dichos conectores se describen en la patente de EE. UU. n.° 7.498.298.
En algunas realizaciones, un componente de conector comprende una "unidad de estiramiento" (A) que enlaza un anticuerpo con otro componente conector o con un resto de fármaco. A modo de ejemplo no limitante, unidades de estiramiento se muestran a continuación (en donde la línea ondulada indica sitios de unión covalente a un anticuerpo, fármaco o componentes conectores adicionales):
En algunas realizaciones, un componente conector comprende una "unidad de aminoácido" (W). En algunas de dichas realizaciones, la unidad de aminoácido permite la escisión del conector por una proteasa, facilitándose así la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosómicas (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Unidades de aminoácido a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Dipéptidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalanina-lisina (fk o phe-lys); fenilalaninahomolisina (phe-homolys); y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Los tripéptidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Una unidad de aminoácido puede comprender residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos que no existen de forma natural, tales como citrulina. Se pueden diseñar unidades de aminoácidos y optimizar para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Normalmente, los conectores de tipo péptido se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, según un método de síntesis en fase líquida (por ejemplo, E. Schrider y K. Lubke (1965) "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, Academic Press).
En algunas realizaciones, un componente conector comprende una unidad "espaciadora" que enlaza el anticuerpo a un resto de fármaco, ya sea directamente o a través de una unidad de estiramiento y/o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser "auto-inmolativa" o "no auto-inmolativa." Una unidad espaciadora "no autoinmolativa" es una en la que parte de toda la unidad espaciadora sigue unida al resto de fármaco tras la escisión del ADC. Los ejemplos de unidades espaciadoras no auto-inmolativas incluyen, pero no se limitan a, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. En algunas realizaciones, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina por una proteasa asociada a célula tumoral da como resultado la liberación de un resto de glicina-glicina-fármaco del resto del ADC. En algunas de dichas realizaciones, el resto de glicina-glicina-fármaco se somete a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora de glicina del resto de fármaco.
Una unidad espaciadora "auto-inmolativa" permite la liberación del resto de fármaco. En ciertas realizaciones, una unidad espaciadora de un conector comprende una unidad de p-aminobencilo. En algunas de dichas realizaciones, un alcohol p-aminobencílico está unido a una unidad de aminoácido por un enlace amida, y se prepara un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el fármaco (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En algunas realizaciones, la unidad espaciadora comprende p-aminobenciloxicarbonilo (PAB). En algunas realizaciones, un ADC que comprende un conector auto-inmolativo tiene la estructura:
en donde:
Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), halógeno, nitro o ciano;
n6 es un número entero desde 0 hasta 4;
Xa puede ser una o más unidades espaciadoras adicionales o puede estar ausente; y
p es un número entero desde 1 hasta aproximadamente 20.
En algunas realizaciones, p es un número entero desde 1 hasta 10, 1 a 7, 1 a 5, o 1 a 4. Unidades espaciadoras Xa a modo de ejemplo incluyen:
en donde R<101>y R<102>se seleccionan independientemente de H y alquilo C<1>-C<6>. En algunas realizaciones, R<101>y R<102>son cada uno -CH<3>.
Otros ejemplos de espaciadores auto-inmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo de PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (patente de EE. UU. n.° 7.375.078; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales. En algunas realizaciones, se pueden usar espaciadores que experimentan ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y sin sustituir (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). El enlace de un fármaco al carbono a de un resto de glicina es otro ejemplo de un espaciador auto-inmolativo que puede ser útil en ADC (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
En algunas realizaciones, el conector L puede ser un conector de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco a un anticuerpo a través de un resto conector multifuncional de ramificación (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761 -1768). Los conectores dendríticos pueden aumentar la relación molar entre fármaco y anticuerpo, es decir, carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Por lo tanto, donde un anticuerpo posea solo un grupo tiol de cisteína reactivo, se puede unir una multitud de restos de fármaco a través de un conector dendrítico.
Conectores no limitantes a modo de ejemplo se muestran a continuación para ADC de la fórmula (Ig):
en donde R<101>y R<102>se seleccionan independientemente de H y alquilo C<1>-C<6>;
n5 es un número entero desde 0 hasta 12.
En algunas realizaciones, n es un número entero 2 a 10. En algunas realizaciones, n es un número entero desde 4 hasta 8.
En algunas realizaciones, R<101>y R<102>son cada uno -CH<3>.
ADC a modo de ejemplo no limitantes adicionales incluyen las estructuras:
cada R<103>es independientemente H o alquilo C<1>-C<6>; y n7 es un número entero desde 1 hasta 12.
En algunas realizaciones, un conector está sustituido con grupos que modulan la solubilidad y/o reactividad. Como ejemplo no limitante, un sustituyente cargado, tal como sulfonato (-SO<3->) o amonio, puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo conector y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo conector con el anticuerpo y/o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (producto intermedio anticuerpo-conector) con D, o D-L (producto intermedio fármaco-conector) con Ab, dependiendo de la ruta de síntesis empleada para preparar el ADC. En algunas realizaciones, una porción del conector se acopla al anticuerpo y una porción del conector se acopla al fármaco, y entonces Ab-(porción de conector)<a>se acopla a fármaco-(porción de conector)<b>para formar el ADC de la fórmula Ig.
Los compuestos desvelados en el presente documento contemplan explícitamente, pero no se limitan a, ADC preparados con los siguientes reactivos conectores: bis-maleimido-trioxietilenglicol (BMPEO), éster de N-(pmaleimidopropiloxi)-N-hidroxisuccinimida (BMPS), éster de N-(s-maleimidocaproiloxi)succinimida (Em CS), éster de N-[Y-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), 1,6-hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de succinimidilo (LC-SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de succinimidilo (SBAP), yodoacetato de succinimidilo (SIA), (4-yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (SIAB), 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), 6-[(P-maleimidopropionamido)hexanoato] de succinimidilo (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato (SVSB), e incluyendo reactivos de bis-maleimida: ditiobismaleimidoetano (Dt ME), 1,4-bismaleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (b Mh), bismaleimidoetano (BMOE), b M(PEG)<2>(mostrado a continuación) y BM(PEG)3 (mostrado a continuación); derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de bis-flúor activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). En algunas realizaciones, los reactivos de bismaleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a un resto de fármaco que contiene tiol, conector, o producto intermedio de conector-fármaco. Otros grupos funcionales que son reactivos con grupos tiol incluyen, pero no se limitan a, yodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
Ciertos reactivos conectores útiles se pueden obtener de diversas fuentes comerciales, tales como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, Colo.), o sintetizar según procedimientos descritos en la técnica; por ejemplo, en Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M. A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; patente de EE. UU. n.° 6.214.345; documentos de patente WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase, por ejemplo, el documento de patente WO 94/11026.
Métodos de preparación de conjugados de anticuerpo contra HER2:
En ciertas realizaciones, los conjugados se forman en varias etapas. Estas etapas incluyen (1) modificar un polímero de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del fármaco o su derivado; (2) hacer reaccionar el polímero modificado con el fármaco o su derivado de manera que el fármaco se enlace al polímero; (3) modificar el conjugado polímero-fármaco de manera que el polímero contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo o su derivado; y (4) hacer reaccionar el conjugado polímero modificado-fármaco con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para formar el conjugado desvelado en el presente documento. La etapa (3) puede ser omitida si el polímero modificado producido por la etapa (1) contiene un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
En otra realización, los conjugados se forman en varias etapas: (1) modificar un polímero de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional de un primer fármaco o su derivado; (2) hacer reaccionar el polímero modificado con el primer fármaco o su derivado de manera que el primer fármaco se enlace al polímero; (3) modificar el conjugado polímero-fármaco de manera que contenga un grupo funcional diferente que puede reaccionar con un grupo funcional de un segundo fármaco o su derivado; (4) hacer reaccionar el conjugado polímero modificado-fármaco con el segundo fármaco o su derivado de manera que el segundo fármaco se enlace con el conjugado polímero-fármaco; (5) modificar el conjugado polímero-fármaco que contiene 2 fármacos diferentes de manera que el polímero contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; y (6) hacer reaccionar el conjugado de polímero modificado-fármaco de la etapa (5) con el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo o su derivado para formar el conjugado desvelado en el presente documento. Las etapas (5) y (6) se pueden repetir si se van a conjugar 2 anticuerpos aislados diferentes o fragmentos de unión al antígeno del mismo o sus derivados se van a conjugar para formar un conjugado polímero-fármaco que comprende dos fármacos diferentes y dos anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos diferentes.
En otra realización más, los conjugados se forman en varias etapas. Estas etapas incluyen (1) modificar un polímero de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del fármaco o su derivado; (2) modificar adicionalmente el polímero de manera que también contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; (3) hacer reaccionar el polímero modificado con el fármaco o su derivado de manera que el fármaco se enlace con el polímero; y (4) hacer reaccionar el conjugado de polímero modificado-fármaco con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para formar el conjugado desvelado en el presente documento. La secuencia de las etapas (1) y (2) o la de las etapas (3) y (4) puede ser invertida. Cualquier etapa (1) o (2) adicional puede ser omitida si el polímero modificado contiene un grupo funcional que puede reaccionar con tanto un grupo funcional del fármaco como sus derivados y un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
En otra realización, los conjugados se forman en varias etapas: (1) modificar un polímero de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional de un primer fármaco o su derivado; (2) modificar adicionalmente un polímero de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; (3) hacer reaccionar el polímero modificado con el primer fármaco o su derivado de manera que el primer fármaco se enlace con el polímero; (4) modificar el conjugado polímerofármaco de manera que contenga un grupo funcional diferente que pueda reaccionar con un grupo funcional de un segundo fármaco o su derivado; (5) hacer reaccionar el conjugado de polímero modificado-fármaco con el segundo fármaco o su derivado de manera que el segundo fármaco se enlace con el conjugado polímero-fármaco; (6) hacer reaccionar el conjugado polímero modificado-fármaco que contiene 2 fármacos diferentes de manera que el polímero con el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo o su derivado forme el conjugado desvelado en el presente documento. La etapa (6) se puede repetir si 2 anticuerpos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos diferentes o sus derivados se van a conjugar para formar un conjugado polímero-fármaco que comprende dos fármacos diferentes y dos anticuerpos o fragmento de unión al antígeno de los mismos diferentes. La etapa (4) se puede llevar a cabo después de la etapa (1) de manera que el polímero modificado contenga dos grupos funcionales diferentes que pueden reaccionar con dos fármacos diferentes o sus derivados. En esta realización, el polímero modificado que contiene dos grupos funcionales diferentes que pueden reaccionar con dos fármacos diferentes o sus derivados puede modificarse adicionalmente de manera que contenga un grupo funcional que puede reaccionar con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; antes de la reacción del polímero modificado con cualesquiera dos fármacos diferentes (etapa (3) y etapa (5) o anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (etapa (6)).
En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, los conjugados desvelados en el presente documento para su uso en aplicaciones biomédicas, tales como administración de fármacos e ingeniería de tejidos, y el vehículo polimérico son biocompatibles y biodegradables. En ciertas realizaciones, el vehículo es un polímero soluble, nanopartícula, gel, liposoma, micela, sutura, implante, etc. En ciertas realizaciones, el término "polímero soluble" engloba polímero biocompatible biodegradable, tal como un polial (por ejemplo, poliacetal o policetal hidrófilo). En ciertas otras realizaciones, el vehículo es un polímero completamente sintético, semisintético o que existe de forma natural. En ciertas otras realizaciones, el vehículo es hidrófilo. Los ejemplos de vehículos poliméricos adecuados para producir los conjugados desvelados en el presente documento se describen en la patente de EE. UU. n.° 8.815.226.
En una realización, el vehículo polimérico comprende unidades de la fórmula (IV):
en donde X' indica el sustituyente para el grupo hidroxilo del esqueleto de polímero. Como se muestra en la fórmula (IV) y las otras fórmulas descritas en el presente documento, cada unidad de poliacetal tiene un único grupo hidroxilo unido al resto de glicerol de la unidad y un grupo X' unido al resto de glicolaldehído de la unidad. Esto es por comodidad solo y se debe interpretar que el polímero que tiene unidades de la fórmula (IV) y otras fórmulas descritas en el presente documento pueden contener una distribución aleatoria de unidades que tienen un grupo X' (u otro sustituyente, tal como un conector que comprende un extremo de maleimida) unido al resto de glicolaldehído de las unidades y las que tienen un único grupo X' (u otro sustituyente, tal como un conector que comprende un extremo de maleimida) unido al resto de glicerol de las unidades, así como unidades que tienen dos grupos X' (u otros sustituyentes, tales como un conector que comprende un extremo de maleimida) con uno unido al extremo de glicolaldehído y el otro unido al resto de glicerol de las unidades.
En una realización, poliales biocompatibles biodegradables adecuados para poner en práctica la presente invención tienen un peso molecular de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 300 kDa. Por ejemplo, los poliales biocompatibles biodegradables tienen un peso molecular de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 300 kDa (por ejemplo, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 kDa, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 300 kDa, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 200 kDa, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 70 kDa, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 300 kDa, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 150 kDa, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40 kDa, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 20 kDa, o entre aproximadamente 8 y aproximadamente 15 kDa). Por ejemplo, el polial biocompatible biodegradable usado para el armazón de polímero o conjugado desvelado en el presente documento es PHF que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, 3-15 kDa, o 5-10 kDa.)
Se conocen en la técnica los métodos de preparación de vehículos poliméricos (por ejemplo, vehículos poliméricos biocompatibles biodegradables) adecuados para la conjugación con modificadores. Por ejemplo, se puede encontrar orientación sintética en las patentes de EE. UU. n.° 5.811.510; 5.863.990; 5.958.398; 7.838.619; 7.790.150; y 8.685.383. El profesional cualificado sabrá cómo adaptar estos métodos para preparar vehículos poliméricos para su uso en la práctica de la invención.
En un ejemplo, un método para formar los conjugados de polial biocompatible biodegradable de la presente invención comprende un proceso por el que un polisacárido adecuado se combina con una cantidad eficiente de un agente de oxidación específico de glicol para formar un producto intermedio de aldehído. El producto intermedio de aldehído, que es en sí un polial, se puede reducir entonces al poliol correspondiente, succinilar y acoplar con uno o más modificadores adecuados para formar un conjugado de polial biocompatible biodegradable que comprende enlaces que contienen succinamida.
En otro ejemplo preferido, poliales biocompatibles biodegradables completamente sintéticos para su uso en la presente invención se pueden preparar haciendo reaccionar un iniciador adecuado con un compuesto precursor adecuado. Por ejemplo, se pueden preparar poliales completamente sintéticos por condensación de éteres vinílicos con dioles sustituidos protegidos. Se pueden usar otros métodos, tales como la polimerización por apertura de ciclo, en los que la eficacia del método puede depender del grado de sustitución y la voluminosidad de los grupos protectores.
Un experto habitual en la técnica apreciará que sistemas de disolventes, catalizadores y otros factores se pueden optimizar para obtener productos de alto peso molecular.
En ciertas realizaciones, el vehículo es PHF.
En realizaciones, el polímero vehículo es PHF que tiene un índice de polidispersidad (PDI) de <1,5, por ejemplo, <1,4, <1,3, <1,2 o <1,1.
Por ejemplo, para conjugar el anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa a 200 kDa, el vehículo polimérico del armazón es un poliacetal, por ejemplo, un PHF que tiene un peso molecular (es decir, MW del PHF sin modificar) que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa).
Por ejemplo, para conjugar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 40 kDa a 80 kDa, el vehículo polimérico del armazón desvelado en el presente documento es un poliacetal, por ejemplo, un PHF que tiene un peso molecular (es decir, MW del PHF sin modificar) que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa). Por ejemplo, el PHF tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa o 15 kDa.
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo en este intervalo de peso molecular incluye, pero no se limita a, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, tales como, por ejemplo, Fab.
Por ejemplo, para conjugar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 60 kDa a 120 kDa, el vehículo polimérico del armazón desvelado en el presente documento es un poliacetal, por ejemplo, un PHF que tiene un peso molecular (es decir, MW del PHF sin modificar) que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa). Por ejemplo, el PHF tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa o 15 kDa.
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo en este intervalo de peso molecular incluye, pero no se limita a, por ejemplo, camélidos, Fab2, scFvFc y similares.
Por ejemplo, para conjugar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene un peso molecular de 140 kDa a 180 kDa o de 140 kDa a 150 kDa, el vehículo polimérico del armazón desvelado en el presente documento es un poliacetal, por ejemplo, un PHF que tiene un peso molecular (es decir, MW del PHF sin modificar) que varía desde aproximadamente 2 kDa hasta aproximadamente 40 kDa (por ejemplo, aproximadamente 2-20 kDa, o aproximadamente 3-15 kDa, o aproximadamente 5-10 kDa). Por ejemplo, el PHF tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa, 6 kDa, 7 kDa, 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa o 15 kDa.
El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo en este intervalo de peso molecular incluye, pero no se limita a, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, tales como, IgG, IgM.
Los conjugados biocompatibles biodegradables desvelados en el presente documento se pueden preparar para cumplir los requisitos deseados de biodegradabilidad e hidrofilia. Por ejemplo, en condiciones fisiológicas, se puede alcanzar un equilibrio entre biodegradabilidad y estabilidad. Por ejemplo, se conoce que moléculas con pesos moleculares más allá de un cierto umbral (generalmente, superior a 40-100 kDa, dependiendo de la forma física de la molécula) no son eliminadas a través de los riñones, ya que las moléculas pequeñas son, y pueden ser, eliminadas a través del cuerpo solo a través de captación por células y degradación en compartimentos intracelulares, principalmente en lisosomas particulares. Esta observación ejemplifica cómo materiales funcionalmente estables, pero biodegradables, se pueden diseñar modulando su estabilidad en condiciones fisiológicas generales (pH=7,5±0,5) y a pH lisosómico (pH cerca de 5). Por ejemplo, se sabe que la hidrólisis de grupos acetal y cetal es catalizada por ácidos, por lo tanto, los poliales serán, en general, menos estables en el entorno lisosómico ácido que, por ejemplo, en plasma sanguíneo. Se puede diseñar una prueba para comparar el perfil de degradación de polímeros con, por ejemplo, pH=5 y pH=7,5 a 37 °C en medios acuosos, y así para determinar el equilibrio esperado de la estabilidad del polímero en un entorno fisiológico normal y en el compartimento lisosómico "digestivo" después de la captación por células. La integridad del polímero en dichas pruebas se puede medir, por ejemplo, por HPLC de exclusión de tamaño. Un experto en la técnica puede seleccionar otros métodos adecuados para estudiar diversos fragmentos de los conjugados degradados desvelados en el presente documento.
En muchos casos, será preferible que a pH=7,5 el tamaño eficaz del polímero no cambie detectablemente durante 1 a 7 días, y siga dentro del 50 % del original durante al menos varias semanas. A pH=5, por otra parte, el polímero debe degradarse preferentemente durante 1 a 5 días, y ser transformado completamente en fragmentos de bajo peso molecular en un periodo de tiempo de dos semanas a varios meses. Aunque la degradación más rápida puede ser en algunos casos preferible, en general, puede ser más deseable que el polímero se degrade en las células con una tasa que no supera la tasa de metabolización o eliminación de fragmentos de polímero por las células. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, se espera que los conjugados de la presente invención sean biodegradables, en particular tras la captación por células, y relativamente "inertes" en relación con sistemas biológicos. Los productos de degradación de vehículos no están preferentemente cargados y no desplazan significativamente el pH del entorno. Se propone que la abundancia de los grupos alcohol pueda proporcionar una baja tasa de reconocimiento de polímeros por receptores celulares, particularmente de fagocitos. Los esqueletos de polímero de la presente invención contienen, en general, algunos, si lo hubiese, determinantes antigénicos (característicos, por ejemplo, de algunos polisacáridos y polipéptidos) y, en general, no comprenden estructuras rígidas capaces de acoplarse en interacciones de tipo "llave y cerradura"in vivoa menos que los últimos sean deseables. Por lo tanto, se predice que los conjugados solubles, reticulados y sólidos desvelados en el presente documento tienen baja toxicidad y bioadhesividad, que hace que sean adecuados para varias aplicaciones biomédicas.
En ciertas realizaciones de la presente invención, los conjugados biocompatibles biodegradables pueden formar estructuras lineales o ramificadas. Por ejemplo, los conjugados de polial biocompatibles biodegradables de la presente invención pueden ser quirales (ópticamente activos). Opcionalmente, los conjugados de polial biocompatibles biodegradables de la presente invención pueden ser escalémicos.
En ciertas realizaciones, los conjugados desvelados en el presente documento son solubles en agua. En ciertas realizaciones, los conjugados desvelados en el presente documento son insolubles en agua. En ciertas realizaciones, el conjugado inventivo está en una forma sólida. En ciertas realizaciones, los conjugados desvelados en el presente documento son coloides. En ciertas realizaciones, los conjugados desvelados en el presente documento están en forma de partícula. En ciertas realizaciones, los conjugados desvelados en el presente documento están en forma de gel.
El Esquema 1 a continuación muestra un esquema de síntesis de preparación de un armazón de fármaco polimérico desvelado en el presente documento. En un ejemplo, los conjugados se forman en varias etapas: (1) el polímero, PHF se modifica para contener un resto de COOH (por ejemplo, -C(O)-X-(CH<2>)<2>-COOH); (2) el polímero se modifica entonces adicionalmente de manera que contenga un resto de maleimido (por ejemplo, EG2-MI) que puede reaccionar con un grupo funcional de una PBRM; (3) el polímero modificado, que contiene dos grupos funcionales diferentes, se hace reaccionar con un grupo funcional de un fármaco o su derivado (por ejemplo, AF-HPA-Ala) para formar un conjugado polímero-fármaco; (4) los enlaces disulfuro de una PBRM se reducen; (5) la PBRM reducida se hace reaccionar entonces con el conjugado polímero-fármaco para formar el conjugado proteína-polímero-fármaco; y (6) los restos de maleimido restantes se hacen reaccionar opcionalmente con un compuesto bloqueante de maleimido (por ejemplo, cisteína).
En otro ejemplo, el orden de las etapas (2) y (3) puede ser invertido como se representa en la vía derecha en el Esquema 1 a continuación.
Esquema 1
En otro ejemplo más, las etapas (2) y (3) anteriores se llevan a cabo simultáneamente como se representa en el Esquema 2 a continuación.
Uso de anticuerpos contra HER2
Se apreciará que las entidades terapéuticas según la invención se pueden administrar con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejora de la transferencia, administración, tolerancia y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en la lista conocida para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15.§ ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 por Blaug, Seymour, en su interior. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas anhidras de absorción, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente divulgación, a condición de que el principio activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en su interior para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
Los anticuerpos, fragmento y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento se pueden usar como agentes terapéuticos. Dichos agentes se emplearán, en general, para diagnosticar, pronosticar, monitorizar, tratar, aliviar, prevenir y/o retrasar la progresión de una enfermedad o patología asociada a, por ejemplo, la actividad y/o expresión aberrante de HER2 en un sujeto. Una pauta terapéutica se lleva a cabo identificando un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que padece (o en riesgo de desarrollar) una enfermedad o trastorno asociado a la actividad y/o expresión aberrante de HER2, por ejemplo, un cáncer, usando métodos convencionales. Una preparación de anticuerpo, preferentemente una que tiene una alta especificidad y alta afinidad por su antígeno diana, se administra al sujeto y, en general, tendrá un efecto debido a su unión con la diana. La administración del anticuerpo puede abolir o inhibir o interferir con la función de señalización de la diana. La administración del anticuerpo puede abolir o inhibir o interferir con la unión de la diana con un ligando endógeno con el que está unido naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo se une a la diana y modula, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza, neutraliza o interfiere de otro modo con la actividad y/o expresión de HER2.
Enfermedades o trastornos relacionados con la actividad y/o expresión aberrante de HER2 incluyen, pero no se limitan a, cáncer. El cáncer objetivo puede ser cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, de cabeza y cuello, hígado, testicular, cervical, sarcoma, hemangioma, esófago, ojo, laringe, boca, mesotelioma, piel, mieloma, bucal, rectal, garganta, vejiga, mama, útero, ovario, próstata, pulmón, colon, páncreas, renal o gástrico.
En otro aspecto, las enfermedades o trastornos son cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y cáncer de ovario.
Generalmente, el alivio o tratamiento de una enfermedad o trastorno implica la reducción de uno o más síntomas o problemas médicos asociados a la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, en el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede realizar uno o una combinación de lo siguiente: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, reducir de algún modo y/o parar) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir la metástasis tumoral; inhibir, de algún modo, el crecimiento tumoral; y/o aliviar de algún modo uno o más de los síntomas asociados al cáncer. En algunos ejemplos, se puede usar una composición desvelada en el presente documento para prevenir la aparición o remanifestación de la enfermedad o trastorno en un sujeto.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento se refiere, en general, a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se observa anteriormente, esto puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento de la diana. La cantidad que se debe administrar dependerá además de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la tasa a la que un anticuerpo administrado se reduce del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y/o conjugados del mismo desvelados en el presente documento pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, desde aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, desde aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o desde aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de administración comunes pueden variar, por ejemplo, desde dos veces al día hasta una vez al mes (por ejemplo, una vez al día, una vez a la semana; una vez cada dos semanas; una vez cada 3 semanas o mensualmente). Por ejemplo, los conjugados de XMT 1519 desvelados en el presente documento, tales como el conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) o el conjugado XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), se pueden administrar (por ejemplo, como una dosis única semanal, cada 2 semanas, cada 3 semanas o mensualmente) a aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (por ejemplo, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,67 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg o 20 mg/kg). Por ejemplo, los conjugados de XMT 1519 desvelados en el presente documento, tales como el conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) o el conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), se pueden administrar (por ejemplo, como una dosis única semanal, cada 2 semanas, cada 3 semanas, o mensual) a aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg (por ejemplo, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,67 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, o 20 mg/kg) para tratar cáncer de mama de baja expresión de HER2 o gástrico de baja expresión de HER2.
La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido de diagnóstico o tratamiento del trastorno relacionado con HER2 particular. El alivio de uno o más síntomas del trastorno relacionado con HER2 indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.
Los métodos de cribado de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no se limitan a, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y otras técnicas inmunológicamente mediadas conocidas dentro de la técnica.
En otro ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra HER2 se pueden usar en métodos conocidos dentro de la técnica referentes a la localización y/o cuantificación de HER2 (por ejemplo, para su uso en la medición de niveles de HER2 en muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en métodos de diagnóstico, para su uso en obtención de imágenes de proteína, y similares). En un ejemplo dado, los anticuerpos específicos de HER2, o derivado, fragmento, análogo u homólogo de los mismos, que contienen el dominio de unión al antígeno derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo "terapéuticos").
En otra realización, un anticuerpo específico de HER2 se puede usar para aislar un polipéptido HER2, por técnicas convencionales, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína HER2 (o un fragmento de la misma) se pueden usar diagnósticamente para monitorizar niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar, por ejemplo, la eficacia de una pauta de tratamiento dada. La detección se puede facilitar acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoetrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
En aún otra realización, un anticuerpo según la invención se puede usar como un agente para detectar la presencia de proteína HER2 (o un fragmento de la misma) en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una marca detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv, o F(ab')<2>). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende englobar el marcado directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable con la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está directamente marcado. Los ejemplos de marcado indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado y marcado terminal de una sonda de ADN con biotina de forma que se pueda detectar con estreptavidina fluorescentemente marcada. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y líquidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y líquidos presentes dentro de un sujeto. Dentro del uso del término "muestra biológica" se incluye, por lo tanto, sangre y una fracción o componente de la sangre que incluye suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el método de detección desvelado en presente documento se puede usar para detectar un ARNm analito, proteína o ADN genómico en una muestra biológicain vitro,así comoin vivo.Por ejemplo, las técnicasin vitropara la detección de un ARNm analito incluyen hibridaciones Northern e hibridacionesin situ.Las técnicasin vitropara la detección de una proteína analito incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicasin vitropara la detección de un ADN genómico analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos de realización de inmunoensayos se describen, por ejemplo en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicasin vivopara la detección de una proteína analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto se pueden detectar por técnicas de obtención de imágenes habituales.
Administración terapéutica y formulaciones de anticuerpos contra HER2
Los anticuerpos, derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento (también denominados en el presente documento "compuestos activos") se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Los principios y consideraciones implicados en la preparación de dichas composiciones, así como la orientación en la elección de componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
Dichas composiciones comprenden normalmente el anticuerpo, fragmentos del mismo y/o conjugados del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Donde se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas de péptido que retienen la capacidad de unión a la secuencia de proteínas diana. Dichos péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producir por tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)).
Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia habitual en el campo. Ejemplos preferidos de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa y 5 % de albúmina de suero humano. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites no volátiles. Se conoce bien en la técnica el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, en las composiciones se contempla del uso de los mismos.
Las formulaciones que se van a usar para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril.
Una composición farmacéutica desvelada en el presente documento se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyectables, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (donde sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede causar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución previamente filtrada de forma estéril de la misma.
Las composiciones orales incluyen, en general, un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Con el fin de administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo líquido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se enjuaga y expectora o traga. Los aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes, se pueden incluir como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.
Para administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un espray en aerosol de un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a ser atravesada. Dichos penetrantes se conocen, en general, en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede llevar a cabo mediante el uso de esprays nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conocen, en general, en la técnica.
Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto de la rápida eliminación del cuerpo, tal como formulaciones de liberación sostenida/controlada, que incluyen implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.
Por ejemplo, los principios activos pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE. UU. n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y Y-etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de etileno-acetato de vinilo, degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT ™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos.
Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parentales en forma unitaria de administración para facilitar la administración y uniformidad de la administración. Forma unitaria de administración, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas aptas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de administración desveladas en el presente documento viene impuesta por y es directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.
La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que está tratándose, preferentemente aquellas actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.
En un ejemplo, los compuestos activos se administran en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles en el tratamiento de afecciones patológicas o trastornos, tales como diversas formas de cáncer, trastornos autoinmunitarios y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran sustancialmente contemporáneamente, ya sea simultáneamente o uno detrás del otro. Si se administran uno detrás del otro, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos todavía es preferentemente detectable en concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento.
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos, fragmentos de los mismos y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento coformulados con, y/o coadministrados con, uno o más anticuerpos adicionales, por ejemplo, un anticuerpo contra HER2, un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2 o una combinación de un anticuerpo contra HER2 y un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2, tal como, por ejemplo, trastuzumab, pertuzumab o una combinación de trastuzumab y pertuzumab, o un biosimilar de trastuzumab y/o pertuzumab o combinaciones de biosimilares.
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos, fragmentos de los mismos y/o conjugados de los mismos desvelados en el presente documento coformulados con, y/o coadministrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un taxano (paclitaxel o docetaxel), una antraciclina (doxorubicina o epirubicina), ciclofosfamida, capecitabina, tamoxifeno, letrozol, carboplatino, gemcitabina, cisplatino, erlotinib, irinotecán, fluorouracilo u oxaliplatino. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente menores dosis de los agentes terapéuticos administrados, evitándose así posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.
En algunas realizaciones, el (los) agente(s) terapéutico(s) adicional(es) para su uso en combinación con un anticuerpo, fragmento del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento son los agentes que interfieren en diferentes estadios en una respuesta inmunitaria y/o inflamatoria. En una realización, se pueden coformular uno o más anticuerpos descritos en el presente documento con, y/o para coadministración con, uno o más agentes adicionales.
Formulaciones diagnósticas y profilácticas
El anticuerpo contra HER2, fragmento de unión al antígeno del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento se usa en formulaciones diagnósticas y profilácticas. En un ejemplo, un anticuerpo contra HER2, fragmento de unión al antígeno del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento se administra a pacientes que están en riesgo de desarrollar una o más de las enfermedades anteriormente mencionadas, tales como, por ejemplo, sin limitación, cáncer. Una predisposición del paciente u órgano a una o más de las indicaciones mencionadas anteriormente se puede determinar usando marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En otro ejemplo, un anticuerpo contra HER2, fragmento de unión al antígeno del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento se administra a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada a una o más de las enfermedades mencionadas anteriormente, tales como, por ejemplo, sin limitación, cáncer. Tras el diagnóstico, un anticuerpo contra HER2, fragmento de unión al antígeno del mismo y/o conjugado del mismo desvelado en el presente documento se administra para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica asociada a una o más de las enfermedades mencionadas anteriormente.
En otra realización de la divulgación, un método de identificación de un paciente con cáncer de mama tributario de tratamiento con los conjugados desvelados en el presente documento comprende medir el estado de ciertas características en una muestra tumoral obtenida del paciente, e identificar el paciente para el tratamiento basado en el estado de ciertas características en la muestra tumoral.
Los anticuerpos desvelados en el presente documento también son útiles en la detección de HER2 en muestras de paciente y, por consiguiente, son útiles como diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos contra HER2 desvelados en el presente documento se usan en ensayosin vitro,por ejemplo, ELISA, para detectar niveles de HER2 en una muestra de paciente.
En una realización, un anticuerpo contra HER2 desvelado en el presente documento se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el (los) pocillo(s) de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado sirve de anticuerpo de captura para cualquier HER2 que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se aclara y se trata con un agente de bloqueo, tal como proteína de la leche o albúmina para prevenir la adsorción no específica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antígeno, o con una disolución que contiene una cantidad de patrón del antígeno. Dicha muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante que se considera que son un diagnóstico de una patología. Después de aclarar la muestra de prueba o patrón, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que está marcado detectablemente. El segundo anticuerpo marcado sirve de anticuerpo de detección. Se mide el nivel de marca detectable, y la concentración del antígeno HER2 en la muestra de prueba se determina comparando con una curva patrón desarrollada a partir de las muestras patrón.
Se apreciará que, basándose en los resultados obtenidos usando los anticuerpos contra HER2 desvelados en el presente documento en un ensayo de diagnósticoin vitro,es posible estadificar una enfermedad en un sujeto basándose en los niveles de expresión del antígeno HER2. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de sujetos que se ha diagnosticado que están en diversos estadios en la progresión de la enfermedad, y/o en diversos momentos en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. Usando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estadio de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que se puede considerar característico de cada estadio.
La citación de publicaciones y documentos de patente no está prevista como una admisión de que cualquiera sea estado de la técnica relevante, no constituye admisión en cuanto al contenido o fecha del mismo. La invención se ha descrito ahora a modo de descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se puede poner en práctica en una variedad de realizaciones y que la descripción y ejemplos anteriores que siguen son para los fines de ilustración.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos de trabajo son ilustrativos de los conectores, moléculas de fármaco y PBRM, y métodos de preparación de los mismos. Estos no pretenden ser limitantes y será fácilmente entendido por un experto en la técnica que se pueden utilizar otros reactivos o métodos.
ABREVIATURAS
Las siguientes abreviaturas se usan en los esquemas de reacción y ejemplos sintéticos que siguen. Esta lista no significa que sea una lista completa de abreviaturas usadas en la solicitud, ya que abreviaturas habituales adicionales, que son fácilmente entendidas por los expertos en la técnica de síntesis orgánica, también se pueden usar en los esquemas de síntesis y ejemplos.
AF-HPA
Auristatina F-hidroxipropilamida
BSA
Albúmina de suero bovino
DMEM
Medio Eagle modificado por Dulbecco
FBS
Suero bovino fetal
HRP
Peroxidasa de rábano picante
PBS
Solución salina tamponada con fosfato, 0,9 % NaCl
TMB
3,3',5,5'-tetrametilbencidina
INFORMACIÓN GENERAL
Se compró Kadcyla® (ado-trastuzumab emtansina) para inyección fabricado por Genentech.
Se identificaron CDR por el esquema de numeración de Kabat.
Se definió la inhibición del crecimiento tumoral (% de TGI) como el porcentaje de diferencia en la mediana de volúmenes tumorales (MTV) entre grupos tratados y de control.
La eficacia del tratamiento se determinó a partir de la incidencia y magnitud de respuestas de regresión del tamaño de tumor observadas durante el estudio. El tratamiento puede causar regresión parcial (PR) o regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta PR, el volumen del tumor fue del 50 % o menos de su volumen en el día 1 para tres mediciones consecutivas durante el transcurso del estudio, e igual a o superior a 13,5 mm3 para una o más de estas tres mediciones. En una respuesta CR, el volumen del tumor fue inferior a 13,5 mm3 para tres mediciones consecutivas durante el transcurso del estudio. Un animal con una respuesta CR al final de un estudio se clasificó adicionalmente como un superviviente sin tumor (TFS). Los animales se monitorizaron para respuestas de regresión.
La purificación por HPLC se realizó en una columna de semipreparación Phenomenex Gemini 5 pm 110 Á, 250 x 10 mm, 5 micrómetros.
Se realizó SEC en una columna Tosoh Biosciences TSK gel G5000 (7,8 mm x 30 cm, 10 um) o columna Superose 12 (GE Healthcare).
Se realizó WCX en una columna ProPac WCX-10 (94 mm x 250 mm) (ThermoFisher).
Siempre que sea posible, el contenido de fármaco de los conjugados se determinó espectrofotométricamente, por lo demás se realizó EM/CL o RMN 1H para la determinación cuantitativa del contenido de fármaco.
El contenido de proteína de los conjugados de proteína-polímero-fármaco se determinó espectrofotométricamente a 280 nm o por ELISA.
Los pesos moleculares de los conjugados de polímero (informados como los pesos moleculares medios ponderales aparentes o pesos moleculares pico) se determinaron por SEC con cualquier polisacárido o patrones de peso molecular de proteína. Más específicamente, para el polímero o conjugados polímero-fármaco, se usaron patrones de pesos moleculares de polisacárido, y para los conjugados de proteína-fármaco-polímero, se usan patrones de proteína. A menos que se indique específicamente, el peso molecular de vehículo polimérico informado es el peso molecular medio ponderal de p HF; y el peso molecular del conjugado polímero-fármaco y los conjugados de proteína-polímerofármaco es el peso molecular pico. Los conjugados de HER2-polímero-fármaco tienen un peso molecular pico de aproximadamente 170 kDa a aproximadamente 230 kDa. El polímero y los conjugados de polímero sintetizados/medidos tienen normalmente una polidispersidad <1,5.
Los conjugados de Her2-polímero-fármaco se separaron de los conjugados de fármaco-polímero residuales sin reaccionar por una amplia diafiltración. Si fuera necesario, se realizó purificación adicional por cromatografía de exclusión por tamaño y/o cromatografía WCX para retirar cualquier conjugado de Her2-polímero-fármaco agregado. En general, los conjugados de Her2-polímero-fármaco contuvieron normalmente < 5 % (p/p, por ejemplo, <2 % p/p) de fracción agregada como se ha determinado por SEC; <0,5 % (p/p, por ejemplo, <0,1 % p/p) de fármaco libre (sin conjugar) como se ha determinado por RP-HPLC o LC-MS/MS; <1 % (p/p) de conjugado polímero-fármaco libre como se ha determinado por SEC y/o RP-HPLC y <2 % (p/p, por ejemplo, <1 % p/p) de Her2 sin conjugar como se ha determinado por HIC-HPLC y/o WCX HPLC. Se prepararon anticuerpos reducidos o parcialmente reducidos usando procedimientos descritos en la bibliografía, véase, por ejemplo, Francisco et al., Blood 102 (4): 1458-1465 (2003). La concentración de fármaco total (conjugado y sin conjugar) se determinó por LC-MS/MS.
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Procedimiento general A. Conjugación de polímero con conector o fármaco
En general, la conjugación del polímero (PHF-BA o PHF-GA) con un conector que contiene amina, tal como, por ejemplo, EG2-maleimida o un conector que contiene fármaco de amina, tal como, por ejemplo, AF-HPA-Ala, HPA-Ala, se realiza en una mezcla de disolventes acuosos o 10-90 % orgánicos/acuosos en presencia de un agente de activación, tal como, por ejemplo, EDC.HCl. Los disolventes orgánicos típicos incluyen, pero no se limitan a, disolventes miscibles con agua, tales como, por ejemplo, DMSO, DMF, DMA, NMP y ACN. Para acelerar el acoplamiento, se añade un coactivador, tal como, por ejemplo, NHS. El polímero se mezcla en primer lugar con el compuesto que contiene amino, seguido por la adición del coactivador (NHS) y luego la adición del activador (EDC.HCl). La reacción se realiza a 0-10 °C, pH 4,5 a 7,5 durante 1 h a 24 horas a temperatura ambiente. El producto conjugado con polímero resultante se purifica por diafiltración o por SEC. El producto se concentra hasta 2-50 mg/ml, el pH se ajusta a 4,5 a 6,5 para asegurar la estabilidad del conector de fármaco-polímero y el conjugado se almacena congelado a -20 a -80 °C hasta uso adicional.
La conjugación del polímero con el conector que contiene amina o fármaco puede realizarse una detrás de otra, en cualquier orden, o simultáneamente.
Procedimiento general B. Reducción selectiva parcial de proteína (anticuerpo contra HER2)
La reducción selectiva parcial de los grupos disulfuro intercatenarios o disulfuro no emparejados en el anticuerpo contra HER2 relevantes antes de la conjugación con el conjugado polímero-fármaco se logra usando un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP, DTT o p-mercaptoetanol. Cuando la reducción se realiza con un exceso del agente reductor, el agente reductor se retira antes de la conjugación por SEC. El grado de conversión de los grupos disulfuro del HER2 en grupos sulfhidrilo reactivos depende de la estequiometría de HER2, agente reductor, pH, temperatura y/o duración de la reacción. Cuando algunos, pero no todos, de los grupos disulfuro en la PBRM se reducen, la PBRM reducida es un HER2 parcialmente reducido.
Procedimiento general C. Conjugación de HER2 parcialmente reducido con conjugado polímero-fármacoLa conjugación de la PBRM parcialmente reducida con el conjugado polímero-fármaco se realiza en condiciones neutras o ligeramente básicas (pH 6,5-8,5) a concentraciones de PBRM de 1-10 mg/ml y concentración de conjugado polímero-fármaco de 0,5-10 mg/ml. El conjugado polímero-fármaco se usa normalmente en un exceso de 1-5,0 veces con respecto a la estequiometria deseada del conjugado proteína-polímero-fármaco. Cuando la PBRM está conjugada con el grupo maleimido del conjugado polímero-fármaco, la conjugación se termina opcionalmente mediante la adición de un compuesto de bloqueo de maleimido soluble en agua, tal como, por ejemplo, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanoico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (es decir, HOCH<2>SH), benciltiol y similares.
El conjugado de HER2-polímero-fármaco resultante se purifica normalmente por diafiltración para retirar cualquier conjugado polímero-fármaco sin conjugar, fármaco sin conjugar e impurezas de molécula pequeña. Alternativamente o además, se pueden usar procedimientos de separación cromatográfica apropiados, tales como, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía iónica, tal como, por ejemplo, cromatografía WCX; cromatografía de fase inversa, cromatografía en hidroxilapatita, cromatografía de afinidad o combinación de las mismas para purificar el conjugado HER2-polímero-fármaco. El conjugado HER2-polímero-fármaco purificado resultante se formula normalmente en un tampón a pH 5,0-6,5.
Ejemplo 1: Selección de FACS para anticuerpos contra HER2
Se seleccionaron dos de los anticuerpos contra HER2 desvelados en el presente documento, XMT 1517 y XMT 1519, usando el procedimiento descrito a continuación. Se propagaron ocho bibliotecas de levadura sintética humana intacta, cada una de diversidad ~109, como se describe previamente (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 2009036379; WO2010105256; WO2012/009568; y Xu et al., Protein Eng Des Sel. 2013 Oct;26(10):663-70). Para las dos primeras rondas de selección, se realizó una técnica de clasificación por perlas magnética que utiliza el sistema de Miltenyi MACS, como se describe (Siegel et al., J Immunol Methods. 2004 Mar;286(1-2):141-53). Brevemente, las células de levadura (~1010 células/biblioteca) se incubaron con 3 ml de antígeno HER2 monomérico biotinilado 200 nM o antígeno de fusión HER2-Fc biotinilado 10 nM durante 15 min a temperatura ambiente en tampón de lavado FACS PBS con 0,1 % de BSA (las biotinilaciones se hicieron usando el kit EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation, Thermo Scientific, Cat. n.° 21425). Después de lavar una vez con 50 ml de tampón de lavado frío en hielo, el sedimento de células se resuspendió en 40 ml de tampón de lavado y se añadieron 500 pl de Streptavidin MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania. Cat. n.° 130-048-101) a la levadura y se incubaron durante 15 min a 4 °C. A continuación, la levadura sedimentó, se resuspendió en 5 ml de tampón de lavado y se cargó en una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania. Cat. n.° 130-042-401). Después de cargar 5 ml, la columna se lavó 3 veces con 3 ml de tampón de lavado de FACS. La columna se retiró entonces del campo magnético, y la levadura se eluyó con 5 ml de medios de crecimiento y luego se dejó crecer durante la noche. Se realizaron tres rondas siguientes de clasificación usando citometría de flujo. Sedimentaron aproximadamente 1x108 levaduras, se lavaron tres veces con tampón de lavado y se incubaron con HER2 biotinilado 200 nM, 100 o 10 durante 10 min a temperatura ambiente, respectivamente. Entonces se lavó la levadura dos veces y se tiñó con F(ab')2 kappa anti-humano de cabra-FITC diluido 1:100 (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat. n.° 2062-02) y o estreptavidina-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. n.° S21375) diluido 1:500, o ExtrAvidin-ficoeritrina (Sigma-Aldrich, St Louis, Cat. n.° E4011) diluida 1:50, reactivos secundarios durante 15 min a 4 °C. Después de lavar dos veces con tampón de lavado frío en hielo, los sedimentos de células se resuspendieron en 0,4 ml de tampón de lavado y se transfirieron a tubos de clasificación con tapón de filtro. La clasificación se realizó usando un clasificador FACS ARIA (BD Biosciences) y se determinaron puertas de clasificación para seleccionar solo los clones de unión a HER2 para dos rondas y la tercera ronda fue una clasificación negativa para reducir los aglutinantes de reactivo. Después de la ronda final de clasificación, se sembró la levadura y se recogieron colonias individuales para la caracterización.
Ejemplo 2: Maduración por afinidad de anticuerpos contra HER2
Se prepararon anticuerpos contra HER2 madurados por afinidad desvelados en el presente documento, XMT 1518 y XMT 1520, usando el procedimiento descrito a continuación. Se usó una población de unión de la ronda 5 para una diversificación de lotes de cadena ligera (LCBD). Se extrajeron los plásmidos de cadena pesada y se transformaron en una biblioteca de cadenas ligeras con una diversidad de 1 x 106. Las selecciones se realizaron como se ha descrito anteriormente con una ronda de clasificación de MACS y dos rondas de clasificación de FACS usando antígeno biotinilado 10 nM o 1 nM para las respectivas rondas.
Se realizó maduración por afinidad adicional en los mejores clones de LCBD. Cada una de las CDRH3 de las cadenas pesadas de estos clones se recombinaron individualmente en una biblioteca ya hecha con variantes de una diversidad de 1 x 108 y se realizaron selecciones como se ha descrito anteriormente. Las presiones de afinidad se aplicaron incubando el complejo de levadura de antígeno-anticuerpo con Fab parental durante diferentes cantidades de tiempo para seleccionar los anticuerpos de mayor afinidad.
Una tercera ronda de maduración por afinidad incluyó la PCR propensa a error de la cadena pesada y la cadena ligera. Las selecciones se realizaron similares a ciclos previos usando clasificación de FACS para las tres rondas y con tiempos elevados para la presión de Fab.
Ejemplo 3: Producción y purificación de anticuerpos
Se cultivaron clones de levadura hasta la saturación y luego se indujeron durante 48 h a 30 °C con agitación. Después de la inducción, las células de levadura se sedimentaron y los sobrenadantes se recogieron para la purificación. Las IgG se purificaron usando una columna de proteína A y se eluyeron con ácido acético, pH 2,0. Los fragmentos Fab se generaron por digestión con papaína y se purificaron sobre KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences, Cat. n.° 17 5458-01).
Se hizo expresión de IgG de mamífero por subclonación de anticuerpos en un nuevo vector de expresión, seguido de transfección y expresión transitorias en HEK. Brevemente, los vectores de expresión que contenían el anticuerpo de interés se transfectaron complejando con un reactivo de transfección, seguido por exposición a células HEK durante una hora, seguido de dilución de medios de cultivo hasta una densidad final de 4 millones de células por ml. Las células se cultivan entonces durante 7 días con medios de alimentación frescos cada 48 horas. Después de 7 días, el sobrenadante se recoge tras la centrifugación y la purificación se realizó usando la proteína A y, si fuera necesario, se añadió una purificación en columna CHT para alcanzar > 95 % de monómero.
Ejemplo 4: Mediciones de afinidad de anticuerpos contra HER2
La afinidad por los anticuerpos contra HER2 se determinó midiendo su K<d>por ForteBio o MSD-SET. Se realizaron mediciones de la afinidad de ForteBio, en general, como se describe previamente (Estep et al., MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8). Brevemente, las mediciones de afinidad de ForteBio se realizaron por carga de IgG en línea sobre sensores de AHQ. Los sensores se equilibraron fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 min y luego se monitorizaron en línea durante 60 segundos para el establecimiento del nivel basal. Los sensores con IgG cargadas se expusieron a antígeno 100 nM durante 5 minutos, después se transfirieron a tampón de ensayo durante 5 min para la medición de disociación. La cinética se analizó usando el modelo de unión 1:1.
Las mediciones de la afinidad en equilibrio se realizaron como se describe previamente (Estepet al.,2013). Se realizaron valoraciones en equilibrio en disolución (SET) en PBS 0,1 % de BSA sin IgG (PBSF) con antígeno mantenido constante a 50 pM y se incubaron con diluciones sucesivas de 3 a 5 veces de anticuerpo empezando en 10 nM. Los anticuerpos (20 nM en PBS) se recubrieron sobre placas de unión MSD-ECL estándar durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 30 min. Entonces se bloquearon las placas durante 30 min con agitación a 700 rpm, seguido de tres lavados con tampón de lavado (PBSF 0,05 % de Tween 20). Se aplicaron muestras de SET y se incubaron sobre las placas durante 150 s con agitación a 700 rpm seguido de un lavado. El antígeno capturado sobre una placa se detectó con 250 ng/ml de estreptavidina marcada con sulfotag en PBSF por incubación en la placa durante 3 min. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y luego se leyeron en el instrumento MSD Sector Imager 2400 usando 1x Read Buffer T con tensioactivo. El porcentaje de antígeno libre se representó en función del anticuerpo valorado en Prism y se ajustó a una ecuación cuadrática para extraer K<d>. Para mejorar el rendimiento, se usaron robots de manipulación de líquido durante todos los experimentos de MSD-SET, que incluyen la preparación de muestras de SET. La Tabla I da los resultados para las mediciones de afinidad de ForteBio y MSD-SET.
Tabla I
Ejemplo 5: Agrupamiento de epítopos Octet Red384
El agrupamiento de epítopos de los anticuerpos se realizó en un sistema Forte Bio Octet Red384 (Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA) usando un ensayo de agrupación de formato de sándwich estándar. Se cargó la IgG anti-diana de control en sensores AHQ y los sitios de unión a Fc no ocupados en el sensor se bloquearon con un anticuerpo IgG1 humana no relevante. Los sensores se expusieron entonces a antígeno diana 100 nM seguido de un segundo anticuerpo anti-diana. Los datos se procesaron usando ForteBio’s Data Analysis Software 7.0. La unión adicional por el segundo anticuerpo después de la asociación del antígeno indica un epítopo no ocupado (no competidor), mientras que ninguna unión indica el bloqueo del epítopo (competidor). Este proceso se repitió para los 4 anticuerpos de control:
(i) trastuzumab, que se une al dominio IV de HER2 (Cho et al., Nature. 2003 Feb 13;421(6924):756-60); (ii) pertuzumab que se une al dominio II de HER2 (Franklin et al., Cancer Cell. 2004 Apr; 5(4):317-28); (iii) Fab37 que se une al dominio III de HER2 (Fisher et al., J Mol Biol. 2010 Sep 10;402(1 ):217-29); y (iv) chA21 que se une al dominio I de HER2 (Zhou et al., J Biol Chem. 2011 Sep 9;286(36):31676-83.; Cheng et al., Cell Res.
2003 Feb;13(1):35-48). Las secuencias para los anticuerpos de control se muestran a continuación:
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de trastuzumab
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de pertuzumab
1 10 20' 30 40 VU SU D<I>IQW<l>
QSPSSi
LSASVi
GDRVTZ<i>
TCK1L<i>
SQDV S<s>
ISVHH<I>
YQQKP<l>
GKAP<i>
KLL1Y<i>
SASTO<i>
TTCVPS<i>70 SO' 30 100 110 120l ü i i i i i i i i i i j<K K ff': Mr?:3C;T u n>'ÍA'<1GÍ31>Sj<PEDFAT Y Y CQQYY1YPYT PG OGTkV E i K KTV AA P 3VFIFPP>
130 140 150 150 170 1BD! I I ! 1 , 1 I I ] 1 I SDSOLKSGTASWCLIíNNFYPREAKVQ'WXVDNALQSGNSQESVTBQDSKDSTYSLSfíTL'r190 200 210
i i\i i t> T.SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSyNRGEC
(SEQ ID NO: 42)
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de pertuzumab
1 10 20 30 40 . 50 60
i i t i i i i i i t i i i L'VyLVtlíSIjLiUI.VgPüüül.KLaCAAüerTFTDYTMD'rtVKgAFÜKtjilifclWVAIíVMPHSWiaiY
70 80 90 100 lio 120 HQamiFTLS™RSmTL^'MH¿LlAl¿‘TA¥YYCMI¿ePSríl,nfW¿QeTl1^VTVSSÁ 130 140 ISO- 160 170 ISO STKGP<i>SVFPI»<i>AFS5K<:>STSWT<í>AAJiCí<i>C'IiVKD<!>YFPR<,>PVWñWT<<>íSGAl<i>.TSGVK<i>TFPAV<i>IiQSSG<i>190- 200 210 220 230 240 LY3LSSWTVPSSSLG'?Q'l4lCW\nSHKPSKTKVDKK\rEpÍsCD:<THTCPE1CPAP¿LJJGGP 250 2 SC 270 2SQ 290 300 ( I I I I ! I I i ! I ISVFLFPPKE’KDTLMISKTPHVTCVVVDVSHEDPSVKFNWYVDÜVEVilUAKTKPREEQYNS310 32C- 330 340 350360TYHVV<¡>SVLTV<I>LHODW<I>LNGKEfYKCKy<I>SMKAL<I>PAPI<1>EKTISK<i>AKCO<1>PRSPOV<I>YTLPP<I>SREEM<i>370 30C 390 400 410 42Q I < I [ I I I 1 I I ! I
TKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP’/LDSDGSFFLYGKLTVDKSRWO
430 440 448
'Q6NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 43)
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de Fab37 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIWWSWIHWVRQAPGKGLEWVASISPSSGWTSYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWWSSAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 44)
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de Fab37 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWWWWPSTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 45) > Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de chA21
EVQLQQSGPEWKTGASVKISCKASGYSFTGYFINWVKKNSGKSPEWIGHISSSYATSTYNQKF
KNKAAFTVDTSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCVRSGNYEEYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID
NO: 46)
> Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de chA21
DIVLTQTPSSLPVSVGEKVTMTCKSSQTLLYSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAFTRKSGV
PDRFTGSGSGTDFTLTIGSVKAEDLAVYYCQQYSNYPWTFGGGTRLEIK (SEQ ID
NO: 47)
Se seleccionaron los anticuerpos XMT 1519, XMT 1520, XMT 1517, XMT 1518 con la mayor afinidad que no compitieron con los cuatro anticuerpos de control.
Como se muestra en la Figura 1 A, los anticuerpos XMT 1517 y XMT 1518 y en la Figura 1B los anticuerpos XMT 1519 y XMT 1520 no compitieron con los 4 anticuerpos de control.
Ejemplo 6: Mediciones de la constante de unión al anticuerpo con células JIMT-1
Se evaluó la unión a la superficie celular de los anticuerpos contra HER2 a células JIMT-1 usando un citómetro de flujo Macsquant (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Se liberaron células JIMT-1, cultivadas durante la noche hasta aproximadamente el 90 % de cultivos confluentes en medio DMEM (ATCC, Manassas, VA) con 10 % de FBS (Gibco®, Life Technologies, Grand Island, NY), de la superficie de la placa mediante tratamiento con disolución de desprendimiento de células Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA). Las células desprendidas se lavaron una vez con medio helado que contenía 6 % de suero de cabra y se resuspendieron en el mismo medio. Se tomaron 100.000 células en alícuotas por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en V y se incubaron con un intervalo de concentraciones de anticuerpo de HER2 (0,05-100 nM) en 150 pl de DMEM con 6 % de suero de cabra sobre hielo durante 3 horas. Las células se lavaron entonces una vez con PBS helado y se resuspendieron en 100 pl de DMEM con 2 % de suero de cabra y 6 pg/ml de un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado, IgG anti humana de cabra marcada con Alexa Fluor® 647 (Life Technologies Cat. n.° A-21445) durante 1 hora sobre hielo. Las células se lavaron una vez con PBS helado (Gibco®, Life Technologies, Cat. n.° 10010049) y se suspendieron en 200 pl de PBS helado con 1 % de paraformaldehído. La cantidad de fluorescencia unida por célula se determinó sometiendo 5000 células para cada tratamiento en el citómetro de flujo. Se representó la mediana del valor de fluorescencia para cada tratamiento y se calculó la constante de disociación, Kd, para cada anticuerpo con el software Graphpad Prism por regresión no lineal usando el modelo de unión específica a sitio único. La Figura 2 muestra la unión de los anticuerpos contra HER2 a células JIMT-1. Los valores Kd calculados fueron 3,4 nM para XMT 1517, 0,4 nM para XMT 1518, 1,2 nM para XMT 1519 y 1,1 nM para XMT 1520.
Ejemplo 7: Mediciones de afinidad de anticuerpos por ELISA
La afinidad de los anticuerpos para HER2 humano recombinante y de macaco cangrejero se determinó por un ensayo de ELISA. Se recubrió dominio extracelular de HER2 recombinante purificado, tanto derivado de humano (aminoácidos 23-652, Aero Biosystems, Cat. n.° HE2-H5225) como derivado de macaco cangrejero (aminoácidos 1-652, Sino Biological, Cat. n.° 90295-C08H) sobre la superficie de placas de 96 pocillos por incubación de cada pocillo con 50 pl de una disolución de 1 pg/ml en tampón bicarbonato 50 mM, pH 9,0, durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 4 veces con TTBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y 0,05 % de Tween 20). Los pocillos se bloquearon por incubación con 50 pl de TTBS que contenía 5 % de albúmina de suero bovino durante 1 h. Entonces se añadió un intervalo de diluciones (0,005 a 10 nM, diluciones sucesivas triples) de cada anticuerpo de prueba o Ejemplo 16H en 50 pl de TTBS con 3 % de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retiraron los anticuerpos de prueba sin unir con lavados con TTBS (4x). Se incubó una IgG anti-humana secundaria conjugada con HRP (Bethyl Laboratories, n.° A80-115P) a una concentración de 0,2 pg/ml en TTBS con 3 % de BSA en cada pocillo durante 1 hora. Se retiró el anticuerpo secundario sin unir por 4 lavados con TTBS. Se añadió el sustrato de HRP, TMB (Bethyl Laboratories, n.° E102) a cada pocillo y se incubó hasta que fue visible un color amarillo. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de ácido sulfúrico 0,2 N. Se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de placas (Molecular Devices, SpectraMax M5). Los valores se representaron usando el software GraphPad Prism. Kd se determinó por regresión no lineal usando el modelo de unión específica de un sitio.
La Figura 3a da los resultados para la unión de los anticuerpos anti-HER2 XMT 1517, XMT 1518 a HER2 humano y HER2 de macaco cangrejero. La Figura 3b da los resultados para la unión de los anticuerpos anti-HER2 XMT 1519, XMT 1529 a HER2 humano y HER2 de macaco cangrejero. Los valores de Kd calculados se facilitan en la Tabla II.
Tabla II
Las afinidades de unión por los 4 anticuerpos de prueba a HER2 humano y HER2 de macaco cangrejero fueron similares.
Las Figuras 3c y 3d muestran los resultados para la unión de los anticuerpos anti-HER2 XMT 1519 y Ejemplo 16H a HER2 humano y HER2 de macaco cangrejero, respectivamente. Los valores de Kd calculados se facilitan en la Tabla IIA a continuación.
Tabla IIA
Las afinidades de unión por XMT 1519 y Ejemplo 16H a HER2 humano y HER2 de macaco cangrejero fueron similares.
Ejemplo 8: Ensayo de competición de anticuerpo con células JIMT-1
Para confirmar que los anticuerpos XMT 1518 y XMT 1519 se unen a epítopos que se solapan, los anticuerpos se analizaron en un ensayo de unión por competición en células JIMT-1. Se cultivaron células JIMT-1 como se describe en el Ejemplo 6. Se tomaron en alícuotas 50.000 células en 50 gl por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en V. Entonces se añadieron 30 nM de anticuerpo XMT 1519 conjugado con Alexa Fluor®-647 en 25 gl de medio solo, o mezclado con un segundo anticuerpo no marcado (XMT 1518, XMT 1519, o trastuzumab) diluido hasta un intervalo de concentraciones (0,05-100 nM) y se incubaron sobre hielo durante 3 horas. Las células se lavaron entonces una vez con PBS helado y se resuspendieron en 100 gl de DMEM con 2 % de suero de cabra y 6 gg/ml de una IgG anti humana de cabra marcada con Alexa Fluor® 647 (Life Technologies, Cat. n.° A-21445) durante 1 hora sobre hielo. Las células se lavaron una vez con PBS helado y se suspendieron en 200 gl de PBS helado con 1 % de paraformaldehído. La cantidad de fluorescencia unida por célula se determinó sometiendo 5000 células para cada tratamiento en un citómetro de flujo MacsQuant (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Se representó la mediana del valor de fluorescencia para cada tratamiento y se calculó la constante de disociación K<d>para cada anticuerpo con GraphPad Prism por regresión no lineal usando el modelo de unión específica de sitio único. Como se muestra en la Figura 4, el anticuerpo XMT 1518 compitió por la unión de XMT 1519 marcado con Alexa Fluor® 647 a un grado similar a XMT 1519 sin marcar, que indica que ambos anticuerpos reconocen epítopos que se solapan en HER2 mientras que trastuzumab no compitió con la unión de XMT 1519 marcado con Alexa Fluor® 647.
Ejemplo 9: Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
Se cuantificó la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos anti-HER2 en células BT474. Se sembraron 5000 células por pocillo de placas de 96 pocillos en Medio DMEM que contenía 10 % de FBS y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO<2>. Se añadió un intervalo de concentraciones de anticuerpo para XMT 1518, XMT 1519, XMT 1520 o trastuzumab desde 0,001 hasta 100 nM (8 series, diluciones quíntuple) a las células y la actividad de ADCC se midió con un kit de bioensayo de Promega (Cat. n.° G7018) que usa células efectoras manipuladas para producir enzima luciferasa como indicador de actividad de ADCC. La actividad de luciferasa se midió en un espectrofotómetro (Molecular Devices, Spectramax M5). Los valores (expresados como una relación entre la actividad de luciferasa de cada muestra de células tratadas con anticuerpo y la de una muestra de células que no fueron tratadas con anticuerpo) se representaron por regresión no lineal usando el modelo de logaritmo del agonista frente a la respuesta, de pendiente variable, de cuatro parámetros, usando el software GraphPad Prism.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los valores de ADCC. XMT 1519 y XMT 1520 muestran actividad máxima similar a la de trastuzumab: la relación entre la señal con anticuerpo y la señal sin anticuerpo es 30,1 para XMT 1519 y 29,7 para XMT 1520, mientras que la de trastuzumab es 34,6. XMT 1518 tiene actividad máxima de 11,0. Los valores de CE<50>(mitad de la unión máxima) para la actividad de ADCC son 0,16 nM para XMT 1518, 0,18 nM para XMT 1519, 0,54 nM para XMT 1520 y 0,07 nM para trastuzumab, respectivamente.
Ejemplo 10: Señalización de HER2 dependiente de ligando en células MCF7
El efecto de anticuerpos anti-HER2 sobre la señalización de HER2 dependiente de ligando en células MCF7 (ATCC, HTB-22) se determinó midiendo la cantidad de AKT fosforilada después del tratamiento de las células con el ligando de HER3, neuregulina-p1. Se sembraron 300.000 células MCF7 en medio MEM con 0,01 mg/ml de insulina bovina y 10 % de FBS en cada pocillo de placas de cultivo de 6 pocillo y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO<2>. Se retiró el medio y se sustituyó con medio fresco que contenía 10 pg/ml de anticuerpo de prueba y se incubaron durante 1 hora, seguido por un tratamiento de 15 minutos con neuregulina-p1 40 pM (R&D Systems, Mineápolis, MN, Cat. n.° 377-HB-050). Las células se lavaron una vez con PBS helado y se lisaron mediante la adición de 200 pl de tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 % de Triton X-100, pastillas de mezcla de inhibidores de la proteasa cOmplete (Roche, Indianápolis, IN) y pastillas de mezcla de inhibidores de la fosfatasa PhosSTOP (Roche, Indianápolis, IN). Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para retirar residuos insolubles. Se determinaron los niveles de AKT fosforilada usando el kit de ELISA de sándwich Cell Signaling Technology PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La Tabla III muestra el aumento en la fosforilación de AKT inducida por el tratamiento con neuregulina de células MCF7, expresado como un porcentaje de lo medido en células no estimuladas.
Tabla III
El tratamiento con neuregulina aumentó en cinco veces los niveles de AKT fosforilada (522 % con respecto a las células sin estimular). XMT 1517, XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520 causaron de poca o ninguna reducción en el aumento inducido por neuregulina en la fosforilación de<a>K<t>hasta el 564, 441,381 y 439 % respectivamente, similar al causado por trastuzumab (369 %). Pertuzumab, que ha mostrado que inhibe la señalización dependiente de ligando (Franklin et al., Cancer Cell. 19 de abril de 2004; 5:317-28), redujo la estimulación de neuregulina a próxima a células no estimuladas (127 %). Estos resultados sugieren que los anticuerpos de prueba no actúan inhibiendo la heterodimerización de HER2 y HER3, que es promovida por neuregulina y se inhibe por pertuzumab.
Ejemplo 11: Señalización de HER2 independiente de ligando en células MCF7, SKBR3 y JIMT-1
Se determinó el efecto de anticuerpos anti-HER2 sobre la señalización de HER2 en células MCF7 (ATCC, HTB-22), SKBR3 (ATCC, HTB-30), JIMT-1 (ATCC, HTB-30) midiendo cambios en la cantidad de AKT fosforilada después de un tratamiento con anticuerpo de 4 horas. Las células se sembraron en medio específico de célula con 10 % de FBS en cada pocillo de placas de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO<2>. Se retiró el medio y se sustituyó con medio fresco que contenía 10 pg/ml de anticuerpo de prueba y se incubó durante 4 horas. Las células se lavaron una vez con PBS helado y se lisaron mediante la adición de 200 pl de tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 % de Triton X-100, pastillas de mezcla de inhibidores de la proteasa cOmplete (Roche, Indianápolis, IN) y pastillas de mezcla de inhibidores de la fosfatasa PhosSTOP (Roche, Indianápolis, IN). Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para retirar residuos insolubles. Se determinaron los niveles de AKT fosforilado usando el kit de ELISA de sándwich Cell Signaling Technology PathScan® Phospho-Akt1 (Ser473), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La Tabla IV muestra la inhibición de la señalización de HER2 independiente de ligando en células MCF7, SKBR3 y JIMT-1 como se indica por la cantidad de fosforilación de AKT. Los resultados se presentan con respecto al porcentaje de células sin tratar.
Tabla IV
Los anticuerpos anti-HER2 de prueba causaron una fuerte inhibición de la señalización de HER2 en células SKBR3 donde XMT 1517, XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520 redujeron los niveles de AKT fosforilado al 43 %, 59 %, 34 % y 29 % del que ocurre en células sin tratar, en comparación con una reducción al 64 % causada por trastuzumab.
Los anticuerpos anti-HER2 inhibieron la señalización de HER2 en células JIMT-1 como se indica por una reducción en AKT fosforilada al 66 %, 62 %, 84 % y 69 % de la que ocurre en células sin tratar para XMT 1517, XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520, respectivamente, similar a la reducción al 56 % causada por trastuzumab.
En células MCF7, XMT 1518, como trastuzumab, no inhibió la señalización de HER2; sin embargo, XMT 1517, XMT 1519 y XMT 1520 causaron reducciones modestas en la señalización, reduciendo la fosforilación de AKT al 79 %, 76 %, y 66 % de la que ocurre en células sin tratar.
Ejemplo 12: Señalización de HER2 independiente de ligando en células BT474
Se determinó el efecto de anticuerpos anti-HER2 sobre la señalización de HER2 en células BT474 (ATCC, HTB-20) midiendo cambios en la cantidad de AKT fosforilada después de un tratamiento con anticuerpo de 4 horas. Se sembraron células BT474 (300.000 células) en medio DMEM con 10 % de FBS en cada pocillo de placas de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO<2>. Se retiró el medio y se sustituyó con medio fresco que contenía 10 pg/ml de anticuerpo de prueba y se incubó durante 4 horas. Las células se lavaron una vez con PBS helado y se lisaron mediante la adición de 200 pl de tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 % de Triton X-100, pastillas de mezcla de inhibidores de la proteasa cOmplete (Roche, Indianápolis, IN) y pastillas de mezcla de inhibidores de la fosfatasa PhosSTOP (Roche, Indianápolis, IN). Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para retirar residuos insolubles. Se determinaron los niveles de AKT fosforilada por análisis Western. Se mezclaron 20 pl de cada extracto con 7 pl de colorante de carga NUPAGE (Life Technologies, Cat. n.° NP0007) y 2 pl de 10x agente reductor (Life Technologies, Cat. n.° NP0004) y se cargaron en un gel al 4-12 % de Bis-Tris poliacrilamida (Life Technologies, Cat. n.° NP0341) que se sometió a electroforesis en tampón de electroforesis MOPS (Life Technologies, Cat. n.° NP000102) durante 90 min a 120 voltios. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en un sistema de transferencia electroforética semiseca (Bio-Rad, sistema Transblot) durante 30 minutos a 10 voltios en tampón de transferencia (Life Technologies, Cat. n.° NP0006) que contenía 10 % de metanol. La membrana se incubó durante 1 hora en tampón de bloqueo (Li-cor, Cat. n.° 927-40000) y luego con un anticuerpo de ratón que reconoce la proteína AKT (Cell Signaling Technology, n.° 2920) diluida 1:1000, un anticuerpo de conejo que reconoce AKT fosforilada en serina 473 (Cell Signaling Technology, n.° 4060) y un anticuerpo de conejo que reconoce actina (LiCor, Cat. n.° 926-42210) diluido 1:5.000 en el mismo tampón de bloqueo durante 1 hora. Después de la incubación, la membrana se lavó 3 veces con 10 ml de TTBS y luego se incubó durante 1 hora con anticuerpos secundarios: una IgG anti-conejo de cabra conjugada con IRdye® 800CW (Li Cor, Cat. n.° 926-32211) y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con IRdye® 680RD (Li-Cor, Cat. n.° 926-68070), ambos diluidos 1:10.000 en tampón de bloqueo. La membrana se lavó nuevamente 3 veces con 10 ml de TTBS y se barrió en un escáner Li-Cor Odyssey. Las bandas correspondientes a AKT, fosfo-AKT y a actina se cuantificaron usando el software del escáner. Cada banda de fosfo-AKT se normalizó a la banda total de AKT y se expresó como un porcentaje de proteína fosfo-AKT de células que no se trataron con ningún anticuerpo anti-HER2.
También se examinó el efecto de los anticuerpos anti-HER2 sobre la fosforilación de HER3 en el mismo experimento. Las transferencias en nitrocelulosa descritas anteriormente también se sondaron con un anticuerpo de conejo que reconoce HER3 fosforilado en tirosina 1289 (Cell Signaling Technology, n.° 4791) diluido 1:1000 en tampón de bloqueo durante 1 hora. Después de la incubación, la membrana se lavó 3 veces con 10 ml de TTBS y luego se incubó durante 1 hora con una IgG anti-conejo de cabra conjugada con IRdye® 800CW (Li-Cor, Cat. n.° 926-32211) diluido 1:10.000 en tampón de bloqueo. La membrana se lavó nuevamente 3 veces con 10 ml de TTBS y se barrió en un escáner Li Cor Odyssey. Las bandas correspondientes a fosfo-HER3 y a actina se cuantificaron usando el software del escáner. Cada banda de fosfo-HER3 se normalizó a la banda total de AKT y se expresó como un porcentaje de proteína fosfo-HER3 de células que no se trataron con ningún anticuerpo anti-HER2.
La Tabla V da la inhibición de la señalización independiente de ligando de HER2 en células BT474 como se ha determinado por la cantidad de fosforilación de AKT o fosforilación de Her3. Los resultados se presentan con respecto al porcentaje de células no estimuladas.
Tabla V
Los anticuerpos anti-HER2 XMT 1519 redujeron la fosforilación de AKT en aproximadamente el 21 % y HT19B en aproximadamente el 30 % de lo observado en células sin tratar en BT474, en comparación con trastuzumab que causó una reducción hasta aproximadamente el 31 %, y pertuzumab que causó una reducción hasta aproximadamente el 44 % de células sin tratar. La fosforilación de HER3 fue afectada modestamente por todos los anticuerpos: 71 %, 76 %, 80 %, y 85 % de lo observado en células sin tratar por XMT 1519, XMT 1520, trastuzumab y pertuzumab, respectivamente.
Ejemplo 13: Mediciones de la tasa de internalización
Se determinó la tasa a la que cada anticuerpo XMT 1518, XMT 1519, XMT 1520 y trastuzumab es internalizado desde la superficie celular de células SKBR3 por fluorescencia en un ensayo basado en 96 pocillos. Se sembraron células SKBR3 en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran mediante crecimiento durante la noche en medio DMEM (ATCC, Manassas, VA, Cat. n.° 30-2002) con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Gibco®, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. n.° 16140-071) a 37 °C en 5 % de CO<2>. Las células se incubaron en medio que contenía 10 gg/ml de anticuerpo sobre hielo durante 1 hora, luego se lavaron con medio helado y se incubaron sobre hielo con 75 gl de medio que contenía 1 gg/ml de un fragmento Fab monovalente de IgG anti-humana de cabra (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, Cat. n.° 809-1102) conjugado con Alexa Fluor®-647 durante una hora. Después de lavar las células se transfirieron a una estufa de incubación a 37 °C para permitir la internalización durante diversos momentos de tiempo. Las placas se barrieron en un escáner Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) usando el canal de 700 nm. Entonces, las placas se lavaron con ácido por incubación con glicina 100 mM, MgSO420 mM, KCl 50 mM, pH 2,2, sobre hielo para retirar los anticuerpos unidos a la superficie celular, se lavaron con PBS helado y se barrieron nuevamente para determinar la cantidad de fluorescencia internalizada por las células. La Figura 6 muestra la tasa de internalización de los anticuerpos durante 4 horas. La tasa de internalización de todos los anticuerpos es casi idéntica a la de trastuzumab, teniendo todos aproximadamente el 50 % de la superficie total unida a tiempo 0 internalizada en 4 horas (Figura 6).
Ejemplo 13A: Internalización HER2 en células SKBR3
Se investigó el efecto de una combinación de anticuerpos anti-HER2 sobre la internalización de HER2 en células SKBR3 por microscopía de fluorescencia. Se conjugó trastuzumab con Alexa Fluor-647 y se usó para visualizar la localización de trastuzumab y supuestamente HER2 dentro de las células. Se sembraron células SKBR3 en portaobjetos de microscopio de 4 cámaras y se dejó que se unieran por crecimiento durante la noche en medio DMEM (ATCC, Manassas, VA, Cat. n.° 30-2002) con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Gibco®, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. n.° 16140-071) a 37 °C en 5 % de CO<2>. Se incubaron las células SKRB3 durante 90 minutos en medio que contenía o (i) una combinación de trastuzumab-Alexa-647 y pertuzumab o (ii) una combinación de trastuzumab-Alexa-647 y pertuzumab y anticuerpo contra HER2 XMT 1519. La localización de trastuzumab se visualizó usando microscopio de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 7, aunque la mayor parte de trastuzumab-Alexa Fluor-627 en combinación con pertuzumab solo se colocalizó con CellMask Orange, lo que indica localización de la membrana plasmática, la mayor parte de trastuzumab-Alexa Fluor-647 en combinación con tanto pertuzumab como XMT 1519 se colocalizó con Lysotracker, lo que indica la localización de lisosomas. Este resultado indica que la presencia de XMT 1519 en combinación con trastuzumab y pertuzumab promueve la internalización y el tráfico de HER2 a los lisosomas.
Ejemplo 13B: Mediciones de la tasa de internalización con combinación de anticuerpo anti-HER2
Se determinó el efecto de combinar múltiples anticuerpos anti-HER2 que reconocen diferentes epítopos sobre la tasa de internalización de HER2 con un ensayo basado en placa de 96 pocillos, similar al descrito en el Ejemplo 13. En este experimento, las células se trataron con un anticuerpo contra HER2 de prueba solo, en combinación con trastuzumab o con trastuzumab y pertuzumab, y se midió la cantidad del anticuerpo anti-HER2 internalizada en diversos momentos.
Para el ensayo, se sembraron 40.000 células SKBR3 en medio DMEM que contenía 10 % de FBS, en cada pocillo de tres placas de 96 pocillos (placas de color negro con pocillos de fondo transparente) y se dejó que se unieran durante la noche a 37 °C en 5 % de CO<2>. Al día siguiente, las células se trataron con anticuerpos del siguiente modo. Se sustituyó el medio en cada pocillo con medio helado fresco que contenía 5 gg/ml de uno de los anticuerpos de prueba contra HER2, o trastuzumab, y se incubó sobre hielo durante 1 h. Se retiró el anticuerpo sin unir lavando las células dos veces con medio helado. Para la detección, se añadieron 5 gg/ml de un fragmento Fab de IgG anti-humana marcada con Alexa 647 a cada pocillo en medio helado y se incubó sobre hielo durante 1 h. Se retiró el anticuerpo secundario sin unir lavando cada pocillo 2 veces con medio helado. A continuación, se añadió a cada pocillo medio que contenía o 5 gg/ml de trastuzumab, 5 gg/ml de cada uno de trastuzumab y pertuzumab, o sin anticuerpos adicionales. Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado. Un conjunto de pocillos se trató con el fragmento Fab monovalente IgG anti-humana marcado con Alexa 647 solo, y la fluorescencia medida en estos pocillos se usó para restar la fluorescencia de fondo.
Se dejó una placa sobre hielo para determinar los valores a tiempo 0 para cada tratamiento, y las otras placas se incubaron a 37 °C. Después de 1,5 horas, una placa de 37 °C, y la placa a tiempo 0, se lavaron 2 veces con PBS helado y se barrieron usando el canal de 680 nm de un escáner Licor Odyssey. La fluorescencia medida en cada pocillo se usa como la fluorescencia total para cada tratamiento. Entonces se lavaron las células con ácido 2 veces con glicina 100 mM, KCI 50 mM y MgSO420 mM, pH 2,2, luego se lavaron dos veces con PBS helado para retirar los anticuerpos unidos a la superficie. Las placas se barrieron nuevamente para determinar la cantidad de fluorescencia internalizada en cada pocillo. Se analizaron las placas a las 24 horas de las misma forma al día siguiente.
El porcentaje de cada anticuerpo contra HER2 (o de trastuzumab en los pocillos de control) internalizado se calcula por resta del fondo, promediando cada uno de los 3 duplicados, luego dividiendo la fluorescencia internalizada por la fluorescencia total para cada tratamiento y multiplicando por 100.
Como se muestra en la Tabla VA, se internalizan 80-90 % de XMT 1518, XMT 1519 y XMT 1520 en una hora y media cuando se combinan con tanto trastuzumab como pertuzumab. XMT 1517 muestra 60 % de internalización, probablemente debido a su disociación muy alta, que hace que difunda de las células durante las incubaciones. Cuando se combina con trastuzumab, 20-40 % de cada anticuerpo de prueba se internaliza en una hora y media y aproximadamente el 15 % se internaliza cuando cada anticuerpo de prueba está presente solo. Trastuzumab solo muestra aproximadamente 15 % de internalización en una hora y media, y aproximadamente 30 % cuando se combina con pertuzumab.
Por lo tanto, la combinación de tres anticuerpos contra HER2, uno cualquiera de los anticuerpos contra HER2 de prueba, trastuzumab y pertuzumab, aumenta la tasa de internalización de anticuerpo, lo más probablemente aumentando la tasa de endocitosis de HER2.
Tabla VA
Ejemplo 14: Degradación de HER2
Se determinó el efecto de anticuerpos anti-HER2 sobre la degradación de HER2 en células SKBR3 por análisis Western después del tratamiento con anticuerpo. Se sembraron 300.000 células SKBR3 en medio DMEM con 10 % de FBS en cada pocillo de placas de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO<2>. Se retiró el medio y se sustituyó con medio fresco que contenía 10 pg/ml de cada anticuerpo y se incubaron durante 4 horas. Las células se lavaron una vez con PBS helado y se lisaron mediante la adición de 200 pl de tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1 % de Triton X-100, pastillas de mezcla de inhibidores de la proteasa cOmplete (Roche, Indianápolis, IN) y pastillas de mezcla de inhibidores de la fosfatasa PhosSTOP (Roche, Indianápolis, iN). Los lisados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C para retirar residuos insolubles. Se mezclaron 20 pl de cada extracto con 7 pl de colorante de carga NUPAGE (Life Technologies, Cat. n.° NP0007) y 2 pl de 10x agente reductor (Life Technologies Cat. n.° NP0004) y se cargaron sobre un gel al 4-12 % de Bis-Tris poliacrilamida (Life Technologies, Cat. n.° NP0341) que se sometieron a electroforesis en tampón de electroforesis MOPS (Life Technologies, Cat. n.° NP000102) durante 90 min a 120 voltios. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en un sistema de transferencia electroforética semiseca (Bio-Rad, sistema Transblot) durante 30 minutos a 10 voltios en tampón de transferencia (Life Technologies, Cat. n.° NP0006) que contenía 10 % de metanol. La membrana se incubó durante 1 hora en tampón de bloqueo (Li-cor, Cat. n.° 927-40000) y luego con un anticuerpo de conejo que reconoce la proteína HER2 (Cell Signaling Technology, Cat. n.° 2165) diluida 1:1.000, y un anticuerpo de conejo que reconoce actina (LiCor, Cat. n.° 926-42210) diluida 1:5.000 en el mismo tampón de bloqueo durante 1 hora. Después de la incubación, la membrana se lavó 3 veces con 10 ml de TTBS y luego se incubó durante 1 hora con anticuerpos secundarios: una IgG anti-conejo de cabra conjugada con IRdye® 800CW (Li-Cor, Cat. n.° 926-32211) y una IgG anti-ratón de cabra conjugada con IRdye® 680RD (Li-Cor, Cat. n.° 926-68070), ambas diluidas 1:10.000 en tampón de bloqueo. La membrana se lavó nuevamente 3 veces con 10 ml de TTBS y se barrió en un escáner Li-Cor Odyssey. Las bandas correspondientes a la proteína HER2 de longitud completa y a actina se cuantificaron usando el software del escáner. Cada banda de HER2 se normalizó a la banda de actina y se expresó como un porcentaje de proteína HER2 de células que no se trataron con anticuerpos anti-HER2.
La Figura 8 muestra que el tratamiento de células SKBR3 con los anticuerpos de prueba solos o en combinación con trastuzumab tuvo poco o ningún efecto sobre los niveles de HER2, con la excepción de XMT 1518 y XMT 1520, que causaron reducciones de HER2 de longitud completa al 78 y 68 %, respectivamente, y causaron la aparición de productos de degradación de menor peso molecular. Sin embargo, combinaciones triples de trastuzumab, pertuzumab y uno de los anticuerpos contra HER2 de prueba causaron una amplia degradación de HER2, así como la aparición de productos de degradación de HER2. Las mayores reducciones se observan cuando XMT 1518, o XMT 1520, se combina con trastuzumab y pertuzumab, quedando 20 %, o 31 % de HER2. Cuando el anticuerpo XMT 1517 o XMT 1519 se combina con trastuzumab y pertuzumab, la reducción es del 40 % o 42 %, respectivamente, de la cantidad normal de HER2 que queda.
Ejemplo 15: Cartografía de epítopos
Se llevó a cabo cartografía de epítopos de anticuerpos XMT 1517 y XMT 1519 por Integral Molecular Inc., 3711 Market Street, Suite 900, Filadelfia, Pa., EE. UU., usando su Shotgun Mutagenesis Technology. Shotgun Mutagenesis usa una tecnología de expresión celular de alto rendimiento patentada que permite la expresión y análisis de grandes bibliotecas de proteínas diana mutadas dentro de las células eucariotas. Cada residuo en una proteína se muta individualmente, normalmente en múltiples otros aminoácidos, para ensayar cambios en la función. Las proteínas se expresan dentro de estirpes celulares de mamífero estándar, por lo que se pueden cartografiar incluso proteínas difíciles que requieren procesamiento traduccional o postraduccional eucariota.
La cartografía por Shotgun Mutagenesis identificó seis aminoácidos críticos para la unión de XMT 1517 (C453, H473, N476, R495, H497 y W499), que indica que XMT 1517 se une a regiones en el extremo C de los dominios III y el extremo N del dominio IV de HER2. Dos mutaciones críticas secundarias en H456 y G496 también podrían estar implicadas en la unión de XMT 1517 a HER2.
Se identificaron tres aminoácidos críticos para la unión a XMT1519 (E521, L525 y R530), que indica que XMT 1519 se une a la región en el extremo N del dominio IV de Her2.
Ejemplo 16: Síntesis de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala)))
Se prepararon los conjugados HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) usando el procedimiento descrito en el documento de patente US 2015-0104407 A1. La Tabla VI da los detalles de los conjugados anticuerpo-polímerofármaco.
Tabla VI
Los conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) tuvieron un peso molecular pico de aproximadamente 170 kDa a aproximadamente 230 kDa. El polímero y los conjugados de polímero sintetizados/medidos tienen normalmente una polidispersidad <1,5. Los conjugados polímero-fármaco (es decir, la cadena de polímero que lleva el fármaco unido al anticuerpo) contuvieron aproximadamente 27 % de moles a aproximadamente 33 % de moles de beta-alanina, aproximadamente 6,4 % moles a aproximadamente 9,6 % de moles de AF-HPA-Ala y aproximadamente 1,5 % de moles a aproximadamente 4 % de moles de EG2-MI.
Ejemplo 17: Síntesis de rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala)))
Se prepararon conjugados de rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) (control de no unión) usando el procedimiento descrito en el documento de patente US 2015-0104407 A1. La Tabla VII da los detalles de los conjugados anticuerpo-polímero-fármaco.
Tabla VII
Los conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) tuvieron un peso molecular pico de aproximadamente 170 kDa a aproximadamente 230 kDa. El polímero y los conjugados de polímero sintetizados/medidos tienen normalmente una polidispersidad <1,5. Los conjugados polímero-fármaco (es decir, la cadena de polímero que lleva el fármaco unido al anticuerpo) contuvieron aproximadamente 27 % de moles a aproximadamente 33 % de moles de beta-alanina, aproximadamente 6,4 % moles a aproximadamente 9,6 % de moles de AF-HPA-Ala y aproximadamente 1,5 % de moles a aproximadamente 4 % de moles de EG2-MI.
Ejemplo 18: Ensayos de citotoxicidad para conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala)))
Se evaluaron conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) para sus propiedades antiproliferación en estirpes celulares de tumor in vitro usando CellTiter-Glo (Promega Corp). Se cultivaron JIMT-1(medio de HER2 que expresa células, DSMZ, Braunschweig, Alemania, Cat. n.° ACC589), M<d>A-MB-361 (medio de HER2 que expresa células de cáncer de mama humano, ATCC, Cat. n.° HTB-27), células MDA-MB-453 (estirpe celular de cáncer de mama triple negativo, ATCC, Cat. n.° HTB-131) en medio DMEM (ATCC, Manassas, VA, Cat. n.° 30 2002) con 10 % de F<b>S (Gibco®, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. n.° 16140-071). Se cultivaron células NCI-H522 (estirpe celular de carcinoma de pulmón no microcítico, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-5810) y NCI-H2170 (estirpe celular de carcinoma de pulmón no microcítico, ATCC, Cat. n.° CRL-5928) en medio RPMI-1640 (ATCC, Cat. n.° 30-2001). Se cultivaron células NCI-H1581 (estirpe celular que expresa medio de estirpe celular de carcinoma de pulmón no microcítico, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-5878) en medio DMEM:F12 (ATCC, Cat. n.° 30-2006). Se cultivó SNU5 (estirpe celular de carcinoma gástrico, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-5973) en medio Dulbecco modificado con Iscove (Invitrogen Life Technologies, Cat. n.° 12440053) con 20 % de FBS. Se cultivó OVCAR3 (estirpe celular de adenocarcinoma de ovario, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-161) en medio RPMI con 20 % de FBS. Se cultivó MDA-MB-175-VII (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-25) en medio L-15 de Leibovitz con 20 % de FBS. Se cultivó CAMA-1 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-21) en 90 % de medio esencial mínimo de Eagle formulado por ATCC. Se cultivó ZR75-1 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-1500) en medio RPMI-1640. Se cultivó HCC1187 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-2322) en medio RPMI-1640. Se cultivó HCC38 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-2314) en medio RPMI-1640. Se cultivó T47D (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-133) en medio RPMI-1640. Se cultivó HCC70 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-2315) en medio RPMI-1640. Se cultivó MDA-MB-231 (estirpe celular de cáncer de mama humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-26) en medio DMEM. Se cultivó CALU3 (estirpe celular de adenocarcinoma de pulmón humano, ATCC, Cat. n.° HTB-55) en medio esencial mínimo de Eagle formulado por ATCC. Se cultivó A549 (estirpe celular de carcinoma de pulmón humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CCL-185) en medio F12K. Se cultivó NCI-H2122 (estirpe celular de adenocarcinoma de pulmón humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-5985) en medio RPMI-1640 (ATCC, Cat. n.° 30-2001). Se cultivó NCI-H460 (estirpe celular de carcinoma de pulmón humano, no amplificada, A<t>C<c>, Cat. n.° HTB-177) en medio RPMI-1640 (ATCC, Cat. n.° 30-2001). Se cultivó SHP-77 (estirpe celular de cáncer de pulmón microcítico humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° CRL-2195) en medio RPMI-1640 (ATCC, Cat. n.° 30-2001). Se cultivó KATO III (estirpe celular de carcinoma gástrico humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° HTB-103) en medio de Dulbecco modificado por Iscove con 20 % de FBS. Se cultivó MKN-45 i Ii (estirpe celular de adenocarcinoma gástrico humano, no amplificado, DSMZ, Braunschweig, Alemania, Cat. n.° ACC409) en medio RPMI-1640 (ATCC, Cat. n.° 30-2001). Se cultivó SKOV3 (estirpe celular de adenocarcinoma de ovario humano, ATCC, Cat. n.° HTB-77) en medio McCoy's 5a. Se cultivó TOV-21G (estirpe celular de adenocarcinoma de ovario humano, no amplificada, ATCC, Cat. n.° c RL-11730 en mezcla 1:1 de medio MCDB 105 que contiene una concentración final de 1,5 g/l de bicarbonato sódico y medio 199 que contiene una concentración final de 2,2 g/l de bicarbonato sódico. Se cultivó BT474 (células de cáncer de mama humano con sobreexpresión de HER2, ATCC, Cat. n.° HTB-20) en medio DMEM con 10 % de FBS. Se cultivó NCI-N87 (estirpe celular de cáncer gástrico con sobreexpresión de HER2, ATCC, Cat. n.2 CRL-5822) en medio RPMI-1640 10 % de FBS.
Para el ensayo de citotoxicidad, se sembraron células a una densidad de 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran por incubación durante la noche a 37 °C en presencia de 5 % de CO<2>. Los medios se sustituyeron entonces con medio fresco que contenía un intervalo de conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) (100 nM a 0,1 pM), o Kadcyla (Genentech) y las células se incubaron durante 72 horas o 6 días a 37 °C en presencia de 5 % de CO<2>. Se midió la supervivencia celular usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) como se describe en las instrucciones del kit. La viabilidad celular se normalizó a control no tratado y se expresó como un porcentaje. Se representaron los valores y se calcularon los valores de CI<50>con el software Graphpad Prism (San Diego, CA) usando un algoritmo de ajuste de curva de respuesta a dosis de 4 parámetros, de pendiente variable. La Tabla VIII da resultados ilustrativos de la citotoxicidad de los conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y Kadcyla.
Tabla VIII
Como se muestra en la Tabla VIII, todos los conjugados anticuerpo contra HER2-polímero-fármaco son más potentes que Kadcyla en todas las estirpes celulares probadas.
Ejemplo 19: Ensayos de citotoxicidad para conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) en una estirpe celular con un mutante HER2.
Se evaluaron conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) para sus propiedades antiproliferación en estirpes celulares de tumor in vitro usando CellTiter-Glo (Promega Corp). Se cultivaron NCI-H1781 (HER2 mutante que expresa células de cáncer de pulmón humano, ATCC, Cat. n.° CRL-5894) en medio RPMI-1640 que contiene 10 % de FBS.
Para el ensayo de citotoxicidad, se sembraron células a una densidad de 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran por incubación durante la noche a 37 °C en presencia de 5 % de CO<2>. Entonces se sustituyeron los medios con medio fresco que contenía un intervalo de conjugados de HER2-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) (100 nM a 0,1 pM), Ejemplo 17A (rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) o Kadcyla (Genentech) y las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C en presencia de 5 % de CO<2>. Se midió la supervivencia celular usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) como se describe en las instrucciones del kit. La viabilidad celular se normalizó a control no tratado y se expresó como un porcentaje. Se representaron los valores y se calcularon los valores de CI<50>con el software Graphpad Prism (San Diego, CA) usando un algoritmo de ajuste de curva de respuesta a dosis de 4 parámetros, de pendiente variable. La Tabla IX da los resultados de estos ensayos.
Tabla IX
Como se muestra en la Tabla IX, todos los conjugados anticuerpo contra HER2-polímero-fármaco son más potentes que el conjugado anticuerpo rituximab-polímero-fármaco o Kadcyla en las estirpes celulares probadas.
Ejemplo 20. Respuesta del crecimiento tumoral a la administración de conjugados de PBRM-polímero-fármaco
Se inocularon por vía subcutánea ratones CB-17 SCID hembra con células NCI-N87 (n=10 para cada grupo), células JIMT-1 (n=10 para cada grupo), células SNU-5 (n=10 para cada grupo), células H522 (n=10 para cada grupo), células SKOV3 (n=10 para cada grupo), células Calu-3 (n=10 para cada grupo), células resistentes a Kadcyla NCI-N87 (n=10 para cada grupo), células resistentes a Kadcyla NCI-N87-MSA (n=10 para cada grupo) o fragmentos tumorales BT474 (n=10 para cada grupo). Se inocularon por vía subcutánea NCr nu/nu hembra con células TOV-21G (n=10 para cada grupo). Los compuestos de prueba o vehículo se administraron por vía IV como una dosis única en el día 1 o como se indica. Se midió el tamaño del tumor en los momentos indicados en las Figuras 8 a 18 usando un compás calibrador digital. Se calculó el volumen del tumor y se usó para determinar el retraso en el crecimiento tumoral. Se sacrificaron los ratones cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 800 a 1500 mm3. Los volúmenes de tumor se informan como la media ± EEM para cada grupo.
La Figura 9 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células NCI-N87 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Ejemplo 16A, trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg; o Ejemplo 16D, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg como una dosis única en el día 1. El vehículo y trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostraron un aumento del volumen del tumor. XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró 60 % de regresiones parciales y produjo posible actividad terapéutica (TGI 88 %) basándose en el análisis de la inhibición del crecimiento tumoral en el día 29.
La Figura 10 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células JIMT-1 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 20 mg/kg; Ejemplo 16A, trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg; o Ejemplo 16d , XMT 1519-(eG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg como una dosis única en el día 1. El vehículo y Kadcyla mostraron un aumento de volumen del tumor. Los conjugados de trastuzumab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostraron potencial terapéutico y tuvieron 40 % y 70 % de regresiones, respectivamente. XMT 1519-(EG2-MI-(Ph F de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) tuvo 5 regresiones parciales y 2 regresiones completas que siguieron siendo supervivientes sin tumor al final del estudio en el día 69.
La Figura 11 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células JIMT-1 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única en el día 1; una combinación de Kadcyla a 10 mg/kg y pertuzumab a 15 mg/kg administrada semanalmente durante 3 semanas; o Ejemplo 16D, XMT 1519-(Eg 2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg como una dosis única en el día 1. El vehículo, Kadcyla y la combinación de Kadcyla y pertuzumab mostraron todos un aumento de volumen del tumor. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró 60 % de regresiones parciales y fue el más eficaz.
La Figura 12 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células NCI-N87 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))), a 0,67 mg/kg como una dosis única en el día 1; una combinación de trastuzumab a 15 mg/kg y pertuzumab a 15 mg/kg administrados semanalmente durante 3 semanas (es decir, en el día 1,8 y 15); o una triple combinación de trastuzumab a 15 mg/kg y pertuzumab a 15 mg/kg cada uno administrado semanalmente durante 3 semanas (es decir, en el día 1, 8 y 15) junto con el Ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 0,67 mg/kg as dosis única en el día 1. El vehículo mostró un aumento de volumen del tumor. XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) solo o las combinaciones mostraron todas una reducción en el tumor con la triple combinación de trastuzumab; siendo pertuzumab y el Ejemplo 16F los más eficaces y dando como resultado 100 % de regresiones parciales, mientras que el Ejemplo 16F solo o la combinación de trastuzumab y pertuzumab produjeron cada uno una respuesta parcial con frecuencia. El triplete tuvo una tasa numéricamente mayor de respuestas parciales, y condujo a una reducción significativamente mayor en el volumen del tumor (p<,05, prueba de Mann-Whitney) en comparación con o la monoterapia del Ejemplo 16F o el doblete trastuzumab pertuzumab. La respuesta parcial se define como regresión a menos del 50 % del volumen basal del tumor sostenido durante al menos 3 mediciones tumorales secuenciales.
El beneficio de la supervivencia global para XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) en combinación con pertuzumab y trastuzumab difirió significativamente frente a la administración de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) solo (P < 0,011, prueba del orden logarítmico) y fue superior a los resultados logrados por la combinación de pertuzumab y trastuzumab (P < 0,273, prueba del orden logarítmico) o la triple combinación de los anticuerpos XMT-1519, pertuzumab y trastuzumab (P < 0,05, prueba del orden logarítmico).
La Figura 13 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células SNU-5 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg, 2 mg/kg o 0,67 mg/kg como una dosis única; o Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única en el día 1. En el día 18, el vehículo mostró un aumento de volumen tumoral. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró reducción tumoral y fue más eficiente que Kadcyla o rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) y produjo el 100 % de supervivientes sin tumor a dosis de 5 mg/kg y 2 mg/kg y el 90 % de supervivientes sin tumor a dosis de 0,67 mg/kg.
La Figura 14 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células TOV-21G (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-M<i>-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg o 2 mg/kg como una dosis única en el día 1. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró retraso tumoral y fue más eficaz que Kadcyla que no obtuvo el umbral para actividad terapéutica.
La Figura 15 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células H522 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16E, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única; o Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única en el día 1.
El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró retraso tumoral y fue más eficaz que Kadcyla y rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) que no obtuvo el umbral para actividad terapéutica.
La Figura 16 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células SKOV3 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16E, XMT 1519-(E<g>2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única; o Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única en el día 1. XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) produjo 100 % de regresiones, que consiste en 10 respuestas completas y fue más eficaz que Kadcyla o rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala) que no obtuvo el umbral para actividad terapéutica.
La Figura 17 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con células Calu-3 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; o Ejemplo 16F, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única en el día 1. x Mt 1519-(eG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) produjo 100 % de respuestas de regresión que consisten en dos respuestas parciales y ocho respuestas completas, seis de los cuales siguieron sin tumor en el día 60.
La Figura 18 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en un modelo derivado de paciente de xenoinjerto BRE-0333 HER2 1+ (n=8 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 3 mg/kg como una dosis única o Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 3 mg/kg en el día 1. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró retardo tumoral y fue más eficaz que Kadcyla o rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))).
La Figura 19 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en un modelo derivado de paciente de xenoinjerto MAXF_1162 HER23+ (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 10 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 1 o 3 mg/kg o Ejemplo 17B, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 3 mg/kg como una dosis única en el día 1. XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) tanto a 1 y 3 mg/kg produjo 100 % de respuestas de regresión y supervivientes sin tumor y fue más eficaz que Kadcyla o rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 3 mg/kg.
La Figura 20 proporciona los resultados para la respuesta tumoral en ratones inoculados por vía subcutánea con fragmentos de tumor BT474 (n=10 para cada grupo) después de la administración IV de vehículo; Kadcyla a 5 mg/kg como una dosis única; Ejemplo 16H, XMT 1519-(EG2-M i-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg o 2 mg/kg como una dosis única en el día 1; Ejemplo 17C, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) a 5 mg/kg como una dosis única en el día 1 o XMT 1519 a 5 mg/kg como una dosis única. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró regresiones tumorales completas y fue más eficaz que Kadcyla, rituximab-(EG2-MI-(PHF de 10 kDa-BA-(AF-HPA-Ala))) o XMT-1519.
Dosis únicas de 1 mg/kg o 0,67 mg/kg de conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) mostraron regresión completa en modelos de cáncer de mama con baja expresión de HER2 y gástrico, donde ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla) fue inactivo a dosis de 10 mg/kg y superiores. En modelos de tumor impulsado por HER2, el conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) mostró eficacia sinérgica en combinación con las terapias anti-HER2 usadas ampliamente trastuzumab y pertuzumab. El conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) demostró un perfil farmacocinético excelente y fue bien tolerado en primates no humanos a dosis terapéuticas.
Los datos preclínicos sugieren que el conjugado de XMT 1519-(EG2-MI-(PHF-BA-(AF-HPA-Ala))) tiene el potencial de expandir enormemente el número de pacientes que pueden beneficiarse de terapias dirigidas a HER2. El conjugado proporciona administración de fármaco eficiente en cánceres donde existen tan solo 10.000 receptores de HER2, donde otras terapias son inactivas.

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano que comprende a) una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 1 (CDRH1) que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 2 (CDRH2) que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIy Ya DSVKG (SEQ ID NO: 26); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 3 (CDRH3) que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 1 (CDRL1) que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 2 (CDRL2) que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 3 (CDRL3) que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29); o b) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYGMH (SEQ ID NO: 17); una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos VIWYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 18); una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos EAPYYAKDYMDV (SEQ ID NO: 19); una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSDYLA (SEQ ID NO: 20); una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYVSYWT (SEQ ID NO: 22).
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma, y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma; una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma; una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma, y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma; o una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal quimérico, humanizado o completamente humano.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo presenta una Kd inferior a 100 nM para el receptor HER2 humano como se mide por un ensayo de unión a radioligando.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento variable monocatenario (scFv), un fragmento scFv-Fc o un anticuerpo monocatenario (scAb).
  6. 6. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un isotipo IgG o un isotipo IgG1.
  7. 7. Una molécula del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  8. 8. Un vector que comprende la molécula del ácido nucleico de la reivindicación 7.
  9. 9. Un método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 cultivando una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde la célula comprende el vector de la reivindicación 8.
  10. 10. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y uno o más agentes terapéuticos o diagnósticos (D), cada uno de los cuales se conecta independientemente directa o indirectamente al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
  11. 11. El conjugado de la reivindicación 10, que comprende además uno o más armazones poliméricos que están conectados al uno o más D y al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde cada uno del uno o más D se conecta independientemente al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo por el uno o más armazones poliméricos.
  12. 12. El conjugado de la reivindicación 11, en donde cada uno del uno o más armazones poliméricos comprende independientemente poli(1-hidroximetiletilenhidroximetil-formal) (PHF) que tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 40 kDa.
  13. 13. El conjugado de la reivindicación 12, en donde cada uno del uno o más armazones poliméricos es independientemente de la fórmula (Ic):
    en donde: LD1 es un resto que contiene carbonilo; cada aparición de
    es independientemente un primer conector que contiene un enlace biodegradable de manera que cuando se rompe el enlace, se libera D en una forma activa para su efecto terapéutico previsto; y en
    entre LD1 y D indica unión directa o indirecta de D a LD1; cada aparición de
    es independientemente un segundo conector todavía no conectado al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que LP2 es un resto que contiene un grupo funcional que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, y entre LD1 y LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 a LD1, y cada aparición del segundo conector es distinta de cada aparición del primer conector; cada aparición de
    es independientemente un tercer conector que conecta cada armazón polimérico que lleva D al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que
    terminal unido a LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo tras la formación de un enlace covalente entre un grupo funcional de LP2 y un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; y cada aparición del tercer conector es distinta de cada aparición del primer conector; m es un número entero desde 1 hasta 300, m<1>es un número entero desde 1 hasta 140, m<2>es un número entero desde 1 hasta 40, m3 es un número entero desde 0 to 18, m4 es un número entero desde 1 hasta 10; la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde 15 hasta 300; y el número total de LP2 conectados al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es 10 o menos.
  14. 14. El conjugado de la reivindicación 13, en donde la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde 15 hasta 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta 20, m3 es un número entero desde 0 hasta 10 y PHF tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 20 kDa, o en donde la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde 20 hasta 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta 15, m3 es un número entero desde 0 hasta 8; y PHF tiene un peso molecular que varía desde 3 kDa hasta 15 kDa, o en donde la suma de m, m<1>, m<2>, m3 y m4 varía desde 40 hasta 75, m<1>es un número entero desde 2 hasta 35, m<2>es un número entero desde 2 hasta 10, m3 es un número entero desde 0 hasta 5; y PHF tiene un peso molecular que varía desde 5 kDa hasta 10 kDa, o en donde el grupo funcional de LP2 se selecciona de -SRp, -S-S-LG,
    y halógeno, en el que LG es un grupo saliente, Rp es H o un grupo protector de azufre, y uno de Xa y Xb es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o Xa y Xb, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono, o en donde LD1 comprende -X-(CH<2>)v-C(=O)- con X directamente conectado al grupo carbonilo de NH, y v es un número entero desde 1 hasta 6, o en donde cada aparición de es independientemente -C(=O)-X-(CH<2>)v-C(=O)-NH-(CH<2>)u-NHC(=O)-(CH<2>)w-(OCH<2>CH<2>)x-NHC(=O)-(CH<2>)y-M, en la que X es CH<2>, O o NH, cada uno de v, u, w, x e y es independientemente un número entero desde 1 hasta 6, y M es
    en donde uno de Xa y Xb es H y el otro es un resto de bloqueo de maleimido soluble en agua, o Xa y Xb, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono.
  15. 15. El conjugado de la reivindicación 14, en donde cada uno de v, u, w, x e y es 2.
  16. 16. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde cada uno del uno o más D es un agente terapéutico que tiene un peso molecular de < 5 kDa.
  17. 17. El conjugado de la reivindicación 15, en donde cada uno del uno o más armazones poliméricos es independientemente de la fórmula (Id):
    en donde: m3a es un número entero desde 0 hasta 17, m3b es un número entero desde 1 hasta 8, y el terminal indica la unión directa del uno o más armazones poliméricos al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.
  18. 18. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde al menos uno del uno o más D es un agente de diagnóstico.
  19. 19. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo tiene un peso molecular de 40 kDa o mayor.
  20. 20. El conjugado de la reivindicación 10, en donde cada uno del uno o más D está conectado independientemente al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo por un resto de enlace no polimérico.
  21. 21. El conjugado de la reivindicación 12, en donde cada uno del uno o más armazones poliméricos es independientemente de la fórmula (If):
    en donde: m es un número entero desde 1 hasta 300, mi es un número entero desde 1 hasta 140, m<2>es un número entero desde 1 hasta 40, m3a es un número entero desde 0 hasta 17, m3b es un número entero desde 1 hasta 8; la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta 18; y la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde 15 hasta 300;
    terminal indica la unión de uno o más armazones poliméricos al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo; en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 1 (CDRH1) que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSSYSMN (SEQ ID NO: 25); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 2 (CDRH2) que comprende la secuencia de aminoácidos YISSSSSTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 26); una región determinante de la complementariedad variable de cadena pesada 3 (CDRH3) que comprende la secuencia de aminoácidos GGHGYFDL (SEQ ID NO: 27); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 1 (CDRL1) que comprende la secuencia de aminoácidos RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 28); una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 2 (CDRL2) que comprende la secuencia de aminoácidos GASSRAT (SEQ ID NO: 21); y una región determinante de la complementariedad variable de cadena ligera 3 (CDRL3) que comprende la secuencia de aminoácidos QQYHHSPLT (SEQ ID NO: 29) y en donde la relación entre PHF y el anticuerpo es 10 o menos.
  22. 22. El conjugado de la reivindicación 21, en donde PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde 2 kDa hasta 20 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde 15 hasta 150, m<1>es un número entero desde 1 hasta 70, m<2>es un número entero desde 1 hasta 20, m3a es un número entero desde 0 hasta 9, m3b es un número entero desde 1 hasta 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta 10, y la relación entre PHF y el anticuerpo anti-HER2 es un número entero desde 2 hasta 8, o en donde PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde 3 kDa hasta 15 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde 20 hasta 110, m<1>es un número entero desde 2 hasta 50, m<2>es un número entero desde 2 hasta 15, m3a es un número entero desde 0 hasta 7, m3b es un número entero desde 1 hasta 8, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta 8, y la relación entre PHF y el anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión al antígeno del mismo es un número entero desde 2 hasta 8, o en donde PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde 5 kDa hasta 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde 40 hasta 75, m<1>es un número entero desde 2 hasta 35, m<2>es un número entero desde 2 hasta 10, m3a es un número entero desde 0 hasta 4, m3b es un número entero desde 1 hasta 5, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta 5, y la relación entre PHF y el anticuerpo anti-HER2 es un número entero desde 2 hasta 8, o en donde PHF en la fórmula (If) tiene un peso molecular que varía desde 5 kDa hasta 10 kDa, la suma de m, m<1>, m<2>, m3a y m3b varía desde 40 hasta 75, m<1>es un número entero desde 2 hasta 35, m<2>es un número entero desde 2 hasta 10, m3a es un número entero desde 0 hasta 4, m3b es un número entero desde 1 hasta 5, la suma de m3a y m3b varía desde 1 hasta 5, y la relación entre PHF y el anticuerpo anti-HER2 es un número entero desde 2 hasta 6.
  23. 23. Un método de preparación de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo del receptor HER2 humano con un armazón polimérico de la fórmula (Ia) tal que se forme el conjugado:
    en donde: LD1 es un resto que contiene carbonilo; cada aparición de
    es independientemente un primer conector que contiene un enlace biodegradable de manera que cuando se rompe el enlace, se libera D en una forma activa para su efecto terapéutico previsto; y en
    entre LD1 y D indica unión directa o indirecta de D a LD1; cada aparición de
    es independientemente un segundo conector todavía no conectado al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que LP2 es un resto que contiene un grupo funcional que aún no ha formado un enlace covalente con un grupo funcional del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, y entre LD1 y LP2 indica unión directa o indirecta de LP2 a LD1, y cada aparición del segundo conector es distinta de cada aparición del primer conector; m es un número entero desde 1 hasta 300, m<1>es un número entero desde 1 hasta 140, m<2>es un número entero desde 1 hasta 40, m3 es un número entero desde 1 hasta 18, y la suma de m, m<1>, m<2>y m3 varía desde 15 hasta 300.
  24. 24. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 22 para su uso en un método de alivio de un síntoma de un cáncer en un sujeto en necesidad del mismo.
  25. 25. El conjugado para su uso según la reivindicación 24, en donde el sujeto es humano.
  26. 26. El conjugado para su uso según la reivindicación 24, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer testicular, cáncer de cuello uterino, sarcoma, hemangioma, cáncer de esófago, cáncer de ojo, cáncer de laringe, cáncer de boca, mesotelioma, cáncer de piel, mieloma, cáncer bucal, cáncer de recto, cáncer de garganta, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal y cáncer gástrico.
  27. 27. El conjugado para su uso según la reivindicación 24, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y cáncer de ovario.
  28. 28. El conjugado para su uso según la reivindicación 24, en donde el método comprende además un segundo agente.
  29. 29. El conjugado para su uso según la reivindicación 28, en donde el segundo agente: (a) es al menos un segundo anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, o (b) es un anticuerpo contra HER2, un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2, o una combinación de un anticuerpo contra HER2 y un anticuerpo inhibidor de la dimerización de HER2, o (c) comprende trastuzumab o pertuzumab o una combinación de los mismos.
  30. 30. El conjugado para su uso según la reivindicación 24, en donde se identifica que el sujeto tiene inferior o igual a 100.000 moléculas de HER2 por célula, o en donde se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 1+ o 2+ para la expresión de HER2 como se detecta por análisis de inmunohistoquímica (IHC) realizado en una población de células de prueba, y en donde el gen HER2 no se amplifica en la población de células de prueba, o en donde el sujeto es resistente a quimioterapia, o en donde el sujeto es resistente al tratamiento con ado-trastuzumab emantasina, o en donde el sujeto no es resistente al tratamiento con ado-trastuzumab emantasina, o en donde se identifica que el sujeto tiene una puntuación de 2+ o 3+ para la expresión de HER2 como se detecta por análisis de inmunohistoquímica (IHC) realizado en una población de células de prueba, y en donde el gen HER2 se amplifica o muta en la población de células de prueba.
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