ES2967627T3

ES2967627T3 - Composición para tratar enfermedades relacionadas con IL-6

Info

Publication number: ES2967627T3
Application number: ES16755677T
Authority: ES
Inventors: Takahiro Kakehi; Akinori Yamada; Yoshimasa Ishida
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2036-02-26
Also published as: SG11201705093UA; TW201642902A; BR112017014067A2; TWI759261B; TWI873632B; AU2016224409B2; KR20170095802A; EP3263132B1; US20260132209A1; AU2021202594C1; JP6775463B2; RU2017133485A; EP3263132C0; EP4269440A2; JPWO2016136933A1; RU2730590C2; CA2972393A1; TWI805046B; US20210017286A1; RU2017133485A3

Abstract

Una composición farmacéutica para tratar enfermedades relacionadas con IL-6 que tiene como ingrediente activo un inhibidor de IL-6, en donde la composición farmacéutica se administra como de costumbre después de un período de dosificación de intervalo corto donde se administra la misma dosis que la dosis habitual en un período más corto. intervalo que el intervalo de dosificación habitual. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para tratar enfermedades relacionadas con IL-6

La presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas o a un régimen de dosificación usado para tratar enfermedades relacionadas con IL-6.

La interleucina-6 (IL-6) es una citocina también denominada factor 2 estimulante de linfocitos B (BSF2) o interferón P2. La IL-6 se descubrió como un factor de diferenciación implicado en la activación de las células linfoides B (documento no de patente 1), y posteriormente se descubrió que era una citocina multifuncional que afecta a las funciones de una variedad de células (documento no de patente 2). Se ha notificado que la IL-6 induce la maduración de células linfoides T (documento no de patente 3).

La IL-6 transmite su actividad biológica a través de dos tipos de proteínas en las células. Una de ellas es el receptor de IL-6, que es una proteína de unión a ligando que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kD a la que se une IL-6 (documentos no de patente 4 y 5). El receptor de IL-6 existe como receptor de IL-6 soluble, que está compuesto principalmente por su región extracelular, además de una forma unida a membrana expresada en la membrana celular y que penetra a través de la membrana celular.

La otra es la proteína de membrana gp130, que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kDa y está implicada en la transducción de señales sin unión a ligando. La actividad biológica de IL-6 se transmite al interior de una célula a través de la formación de un complejo de IL-6/receptor de IL-6 por IL-6 y el receptor de IL-6, seguido de la unión del complejo con gp130 (documento no de patente 6).

Los inhibidores de IL-6 son sustancias que inhiben la transmisión de la actividad biológica de IL-6. Hasta ahora, se han conocido anticuerpos contra IL-6 (anticuerpos anti-IL-6), anticuerpos contra el receptor de IL-6 (anticuerpos anti receptor de IL-6), anticuerpos contra gp130 (anticuerpos anti-gp130), variantes de IL-6, péptidos parciales de IL-6 o el receptor de IL-6, y tales.

Hay varios informes referentes a los anticuerpos anti-receptor de IL-6 (documentos no de patente 7 y 8, y documentos de patente 1-3). Uno de ellos es un anticuerpo PM-1 humanizado obtenido trasplantando la región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo de ratón PM-1 (documento no de patente 9) en un anticuerpo humano (documento de patente 1).

Tocilizumab, que es un anticuerpo anti-receptor de IL-6, actualmente se usa para tratar enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide y enfermedad de Castleman (documento no de patente 10), y también se ha confirmado que es eficaz para enfermedades tales como neuromielitis óptica (NMO) (documento no de patente 11).

También se han notificado efectos terapéuticos de los anticuerpos frente a IL-6 sobre la miastenia grave (documento no de patente 12).

Los anticuerpos humanizados tales como tocilizumab son productos farmacéuticos de anticuerpos de primera generación. Actualmente están desarrollándose productos farmacéuticos de anticuerpos de segunda generación mejorando la eficacia farmacológica, la conveniencia y el coste de los productos farmacéuticos de anticuerpos de primera generación (documento de patente 2). Como producto farmacéutico de anticuerpo de segunda generación, se ha producido SA237, un nuevo anticuerpo anti-receptor de IL-6, aplicando tecnologías de mejora tales como aquellas para mejorar la función efectora, capacidad de unión a antígeno, farmacocinética y estabilidad, o aquellas para reducir los riesgos inmunogénicos, y ya se ha introducido en ensayos clínicos. El documento no de patente 14 revisa el tratamiento de enfermedades relacionadas con IL-6, artritis reumatoide, con un anticuerpo anti-receptor de IL-6, tocilizumab. Dosificaciones subcutáneas de 162 mg cada semana y cada dos semanas a pacientes con bajo peso corporal fueron eficientes. También se administró tocilizumab a 81 mg cada de dos a 4 semanas.

Aunque actualmente están realizándose muchos tratamientos con anticuerpos, se ha confirmado la atenuación de los efectos terapéuticos debido al desarrollo de anti-anticuerpos en alemtuzumab. Para evitar esta atenuación, se ha notificado que es eficaz administrar un mutante que no se une a células que puede administrarse en dosis altas, en lugar de inducir tolerancia inmunológica mediante la administración de una dosis alta de alemtuzumab (documento no de patente 13).

A continuación se muestran los documentos de la técnica anterior relacionados con la invención de esta solicitud.

Documentos de la técnica anterior

[Documentos no de patente]

[Documento no de patente 1] Hirano, T.et al.,Nature (1986) 324, 73-76

[Documento no de patente 2] Akira, S.et al.,Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78

[Documento no de patente 3] Lotz, M.et al.,J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258

[Documento no de patente 4] Taga, T.et al.,J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981

[Documento no de patente 5] Yamasaki, K.et al.,Science (1988) 241, 825-828

[Documento no de patente 6] Taga, T.et al.,Cell (1989) 58, 573-581

[Documento no de patente 7] Novick, D.et al.,Hybridoma (1991) 10, 137-146

[Documento no de patente 8] Huang, Y. W.et al.,Hybridoma (1993) 12, 621-630

[Documento no de patente 9] Hirata, Y.et al.,J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906

[Documento no de patente 10] Nishimoto, N.et al.,Blood. 2005 Oct 15;

[Documento no de patente 11] Arakiet al.,Mod. Rheumatol. (2013) 23(4), 827-831

[Documento no de patente 12] Aricha, R.et al.,J. Autoimmun. (2011) 36(2), 135-141

[Documento no de patente 13] Charlotte L.et al.,Nature Reviews Rheumatology (2010) 6, 558-559.

[Documento no de patente 14] Besada, Patient Preference and Adherence, (2014), página 1051

[Documentos de patente]

[Documento de patente 1] Publicación de solicitud de patente internacional n.°WO 92-19759

[Documento de patente 2] Publicación de solicitud de patente internacional n.°WO 2010/035769

Sumario de la invención

[Problemas que va a resolver la invención]

Incluso con SA237 (un anticuerpo que tiene la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 4), que se produce aplicando tecnologías para reducir la inmunogenicidad, en un estudio de fase I (SA-001JP) de administración subcutánea de una única dosis de 120 mg de SA237 a sujetos masculinos adultos sanos, se generaron anticuerpos anti-SA237 en el 54,2 % de los casos (39 de 72 casos) y se produjo un problema inmunogénico. Un objetivo de la presente invención es suprimir la generación de anticuerpos y proporcionar composiciones farmacéuticas o un régimen de dosificación más eficaces para usarse en el tratamiento de enfermedades relacionadas con IL-6.

[Medios para resolver los problemas]

Para resolver los problemas mencionados anteriormente, los presentes inventores se centraron en la tolerancia inmunológica, y descubrieron que la generación de anti-anticuerpos puede suprimirse administrando una composición farmacéutica con un método de administración y una dosis predeterminados.

Más específicamente, los presentes inventores descubrieron que la generación de anti-anticuerpos puede suprimirse usando una composición farmacéutica administrada a una dosis y un método de administración predeterminados para tratar enfermedades relacionadas con IL-6 y, por lo tanto, completaron la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones, es decir, una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-6 que comprende un inhibidor de IL-6 como principio activo, en donde la composición farmacéutica se administra rutinariamente a intervalos de cuatro semanas después de un período de dosificación de intervalo corto donde se administra la misma dosis que la dosis de rutina múltiples veces a intervalos de dos semanas, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo frente a receptor de IL-6 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, y en donde la enfermedad relacionada con IL-6 es artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, enfermedad de Castleman, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, enfermedad de Crohn, linfoma, colitis ulcerosa, anemia, vasculitis, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Still, amiloidosis, esclerosis múltiple, trasplante, degeneración macular relacionada con la edad, espondilitis anquilosante, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), nefropatía por IgA, osteoartritis, asma, nefropatía diabética, GVHD, endometriosis, hepatitis (NASH), infarto de miocardio, arteriosclerosis, septicemia, osteoporosis, diabetes, mieloma múltiple, cáncer de próstata, cáncer de riñón, linterna no Hodgkin de linfocitos B, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer de colon, caquexia por cáncer, invasión nerviosa del cáncer, neovascularización coroidea miópica, neovascularización coroidea idiopática, uveítis, tiroiditis crónica, hipersensibilidad retardada, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, mesotelioma, polimiositis, dermatomiositis, panuveítis, uveítis anterior, uveítis intermedia, escleritis, queratitis, inflamación orbital, neuritis óptica, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa, ojo seco, inflamación posoperatoria, neuromielitis óptica, miastenia grave o hipertensión pulmonar.

Preferiblemente, el período de dosificación de intervalo corto es de cuatro semanas desde la administración inicial.

Preferiblemente, la dosis de rutina es de 50 mg a 800 mg por administración.

Preferiblemente, la dosis de rutina es 120 mg por administración.

Preferiblemente, el anticuerpo frente a receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

Preferiblemente, el anticuerpo frente a receptor de IL-6 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Preferiblemente, la composición farmacéutica es una formulación para administración subcutánea. Las referencias a los métodos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Efectos de la invención

La composición farmacéutica o el régimen de la presente invención puede resolver el problema inmunogénico de la generación de anticuerpos anti-fármaco, y proporcionar una composición farmacéutica con menos carga para el paciente ya que no expone al paciente a altas dosis.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 indica cambios en el valor medio (y desviación estándar) de la concentración sérica de SA237. La figura 1a muestra cambios en la concentración de SA237 durante el período de evaluación primaria, la figura 1b muestra cambios en la concentración de SA237 durante el período de extensión y la figura 1c muestra cambios en la concentración sérica de SA237 hasta la semana 8.

La figura 2 indica cambios en el valor medio (y la desviación estándar) de la concentración sérica de slL-6R que es el marcador farmacodinámico de SA237. La figura 2a muestra cambios en la concentración de slL-6R durante el período de evaluación primaria, y la figura 2b muestra el cambio en la concentración sérica de sIL-6R durante el período de extensión.

La figura 3 indica el cambio en el valor medio (y la desviación estándar) de la concentración sérica de CRP que es el marcador farmacodinámico de SA237. La figura 3a muestra cambios en la concentración de CRP durante el período de evaluación primaria, y la figura 3b muestra cambios en la concentración de CRP durante el período de extensión.

En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas o un régimen de dosificación para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con IL-6.

“Inhibidores de IL-6” como se describe en el presente documento son sustancias que bloquean la transducción de señales por IL-6, e inhiben las actividades biológicas de IL-6. Los inhibidores de IL-6 son preferiblemente sustancias que tienen efectos inhibidores contra la unión a cualquiera de IL-6, receptor de IL-6 y gp130.

Los ejemplos de un inhibidor de IL-6 como se describe en el presente documento incluyen, pero no se limitan particularmente a, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-gp130, variantes de IL-6, variantes del receptor de IL-6 soluble o péptidos parciales de IL-6 o receptor de IL-6, y sustancias de bajo peso molecular que muestran una actividad similar. Los ejemplos de un inhibidor de IL-6 como se describe en el presente documento pueden ser preferiblemente anticuerpos que reconocen el receptor de IL-6.

El origen de los anticuerpos como se describe en el presente documento no está particularmente limitado, pero es preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano.

Un anticuerpo anti-IL-6 usado en el presente documento puede obtenerse como un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos conocidos. Se prefiere particularmente un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero para el anticuerpo anti-IL-6 usado en la presente invención. Los anticuerpos monoclonales derivados de un mamífero incluyen los producidos por un hibridoma y los producidos por un huésped transformado con un vector de expresión que contiene un gen de anticuerpo usando métodos de ingeniería genética. Al unirse a IL-6, este anticuerpo inhibe la unión de IL-6 a un receptor de IL-6, y bloquea la transducción de la actividad biológica de IL-6 en células.

Los ejemplos de tal anticuerpo incluyen el anticuerpo MH166 (Matsuda, T.et al.,Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) y el anticuerpo SK2 (Sato, K.et al.,The abstracts of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21, 166).

Básicamente, pueden producirse hibridomas que producen un anticuerpo anti-IL-6 usando técnicas conocidas como a continuación. Específicamente, los hibridomas pueden producirse realizando inmunización mediante un método de inmunización convencional usando IL-6 como antígeno de sensibilización, fusionando las células inmunitarias resultantes con células progenitoras conocidas mediante un método de fusión celular convencional y luego cribando las células que producen anticuerpos monoclonales usando un método de cribado convencional.

Específicamente, pueden producirse anticuerpos anti-IL-6 como a continuación. Puede obtenerse IL-6 humana que va a usarse como antígeno de sensibilización para obtener anticuerpos, por ejemplo, usando el gen de IL-6 y/o las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988)140, 1534 1541; y Agr. Biol. Chem. (1990)54, 2685-2688.

Después de que una célula huésped apropiada se transforme con un sistema de vector de expresión conocido en el que se inserta una secuencia génica de iL-6, la proteína IL-6 diana se purifica del interior de la célula huésped o del sobrenadante de cultivo usando un método conocido. Esta proteína IL-6 purificada puede usarse como antígeno de sensibilización. Alternativamente, puede usarse una proteína de fusión de la proteína IL-6 y otra proteína como antígeno de sensibilización.

Un anticuerpo anti-receptor de IL-6 usado en la presente invención puede obtenerse como un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos conocidos. Se prefiere particularmente un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero para el anticuerpo anti-receptor de IL-6 como se usa en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales derivados de un mamífero incluyen los producidos por un hibridoma y los producidos por un huésped transformado con un vector de expresión que contiene un gen de anticuerpo usando métodos de ingeniería genética. Al unirse a un receptor de IL-6, este anticuerpo inhibe la unión de IL-6 a un receptor de IL-6, y bloquea la transducción de la actividad biológica de IL-6 en células.

Los ejemplos de tal anticuerpo incluyen el anticuerpo MR16-1 (Tamura, T.et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), anticuerpo PM-1 (Hirata, Y.et al.,J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), anticuerpo AUK12-20, anticuerpo AUK64-7 y anticuerpo AUK146-15 (publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 92-19759). Entre ellos, el anticuerpo PM-1 se enumera como un ejemplo de un anticuerpo monoclonal preferido contra el receptor de IL-6 humano, y el anticuerpo MR16-1 se enumera en un ejemplo de un anticuerpo monoclonal preferido contra el receptor de IL-6 de ratón.

Básicamente, pueden producirse hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6 usando técnicas conocidas como a continuación. Específicamente, los hibridomas pueden producirse realizando inmunización mediante un método de inmunización convencional usando un receptor de IL-6 como antígeno de sensibilización, fusionando las células inmunitarias resultantes con células progenitoras conocidas mediante un método de fusión celular convencional, y luego cribando células que producen anticuerpos monoclonales usando un método de cribado convencional.

Específicamente, pueden producirse anticuerpos anti-receptor de IL-6 como a continuación. Un receptor de IL-6 humano o receptor de IL-6 de ratón que va a usarse como antígeno de sensibilización para obtener anticuerpos puede obtenerse, por ejemplo, usando el gen del receptor de IL-6 y/o las secuencias de aminoácidos, respectivamente, dadas a conocer en la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 325474 y la publicación de la solicitud de patente japonesa Kokai n.° (JP-A) H03-155795 (solicitud de patente japonesa publicada, no examinada).

Hay dos tipos de proteínas de receptor de IL-6: una expresada en la membrana celular y la otra separada de la membrana celular (receptor de IL-6 soluble) (Yasukawa, K.et al.,J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El receptor de IL-6 soluble está compuesto esencialmente por la región extracelular del receptor de IL-6 unido a la membrana celular, y difiere del receptor de IL-6 unido a la membrana en que carece de la región transmembrana o de las regiones tanto transmembrana como intracelular. Cualquier receptor de IL-6 puede emplearse como proteína de receptor de IL-6, siempre que pueda usarse como antígeno de sensibilización para producir un anticuerpo anti-receptor de IL-6 que va a usarse en la presente invención.

Después de que una célula huésped apropiada se transforme con un sistema de vector de expresión conocido en el que se inserta una secuencia génica del receptor de IL-6, la proteína de receptor de IL-6 diana se purifica del interior de la célula huésped o del sobrenadante de cultivo usando un método conocido. Esta proteína de receptor de IL-6 purificada puede usarse como antígeno de sensibilización. Alternativamente, puede usarse una célula que expresa el receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la proteína de receptor de IL-6 y otra proteína como antígeno de sensibilización.

Un anticuerpo anti-gp130 como se usa en el presente documento puede obtenerse como un anticuerpo policlonal o monoclonal usando métodos conocidos. Se prefiere particularmente un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero para el anticuerpo anti-gp130 usado en la presente invención. Los anticuerpos monoclonales derivados de un mamífero incluyen los producidos por un hibridoma y los producidos por un huésped transformado con un vector de expresión que contiene un gen de anticuerpo usando un método de ingeniería genética. Al unirse a gp130, este anticuerpo inhibe la unión de un complejo de IL-6/receptor de IL-6 a gp130, y bloquea la transducción de la actividad biológica de IL-6 en células.

Los ejemplos de tal anticuerpo incluyen el anticuerpo AM64 (documento JP-A (Kokai) H03-219894), anticuerpos 4B11 y 2H4 (documento US 5571513) y los anticuerpos B-S12 y B-P8 (documento JP-A (Kokai) H08-291199).

Básicamente, pueden producirse hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-gp130 usando técnicas conocidas como a continuación. Específicamente, los hibridomas pueden producirse realizando inmunización mediante un método de inmunización convencional usando gp130 como antígeno de sensibilización, fusionando las células inmunitarias resultantes con células progenitoras conocidas mediante un método de fusión celular convencional, y luego cribando células que producen anticuerpos monoclonales usando un método de cribado convencional.

Específicamente, los anticuerpos monoclonales se pueden producir como a continuación. Por ejemplo, puede obtenerse gp130 que va a usarse como antígeno de sensibilización para obtener anticuerpos usando el gen de gp130 y/o las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 411946.

Después de que una célula huésped apropiada se transforme con un sistema de vector de expresión conocido en el que se inserta una secuencia génica de gp130, la proteína gp130 diana se purifica del interior de la célula huésped o del sobrenadante de cultivo usando un método conocido. Esta proteína gp13o purificada puede usarse como antígeno de sensibilización. Alternativamente, puede usarse una célula que expresa gp130 o una proteína de fusión de la proteína gp130 y otra proteína como antígeno de sensibilización.

Los mamíferos que van a inmunizarse con un antígeno de sensibilización no están particularmente limitados, pero se seleccionan preferiblemente teniendo en cuenta la compatibilidad con las células progenitoras usadas para la fusión celular. Normalmente, se usan roedores tales como ratones, ratas y hámsteres.

Los animales se inmunizan con un antígeno de sensibilización de acuerdo con métodos conocidos. Normalmente, la inmunización se realiza mediante, por ejemplo, inyección intraperitoneal o subcutánea del antígeno de sensibilización a un mamífero. Específicamente, es preferible diluir o suspender el antígeno de sensibilización en solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, y similares, hasta un volumen apropiado, y mezclarlo con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional tal como adyuvante completo de Freund si se desea y emulsionarlo, y luego administrarlo al mamífero cada cuatro a 21 días varias veces. También puede usarse un portador apropiado para la inmunización con el antígeno de sensibilización.

Después de inmunizar al mamífero de esta manera, y confirmar que el nivel en suero de un anticuerpo deseado ha aumentado, se extraen células inmunizadas del mamífero y se someten a fusión celular. Se prefieren particularmente células del bazo como células inmunizadas que van a someterse a fusión celular.

Se usan células de mieloma de mamíferos como células progenitoras que van a fusionarse con las células inmunizadas. Hasta ahora, se usan adecuadamente diversas líneas celulares conocidas tales como P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F.et al.,J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H.et al.,Cell (1976) 8, 405-415), SP2/O (Shulman, M.et al.,Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F.et al.,J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) y R210 (Galfre, G.et al.,Nature (1979) 277, 131-133).

Básicamente, la fusión celular de las células inmunitarias mencionadas anteriormente con células de mieloma puede realizarse de acuerdo con métodos conocidos tales como el método de Milsteinet al.(Kohler, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Más específicamente, se realiza la fusión celular, por ejemplo, en un medio de cultivo de nutrientes convencional en presencia de un promotor de fusión celular. Por ejemplo, se usa polietilenglicol (PEG) o virus Sendai (HVJ) como promotor de fusión, y si se desea, puede añadirse además un adyuvante tal como dimetilsulfóxido para su uso en la mejora de la eficiencia de fusión.

La razón de células inmunitarias con respecto a células de mieloma usada es preferiblemente, por ejemplo, de 1 a 10 células inmunitarias por cada célula de mieloma. El medio de cultivo usado para la fusión celular es, por ejemplo, un medio de cultivo RPMI1640 o MEM adecuado para la proliferación de las líneas celulares de mieloma. También pueden usarse otros medios de cultivo convencionales usados para este tipo de cultivo celular. Además, también pueden usarse en combinación suplementos de suero tales como suero de ternera fetal (FCS).

Para la fusión celular, se forman células de fusión (hibridomas) de interés mezclando meticulosamente cantidades predeterminadas de la célula inmunitaria y la célula de mieloma mencionadas anteriormente en el medio de cultivo mencionado anteriormente, añadiendo una disolución de PEG (por ejemplo, una disolución de PEG con un peso molecular promedio de aproximadamente 1.000 a 6.000) precalentado hasta aproximadamente 37 °C, habitualmente a una concentración del 30 % al 60 % (p/v), y luego mezclándolos. A continuación, pueden eliminarse los agentes de fusión celular y similares que no son adecuados para el crecimiento de hibridomas repitiendo la operación de añadir secuencialmente un medio de cultivo apropiado y eliminar el sobrenadante por centrifugación.

Los hibridomas se seleccionan cultivando en un medio de cultivo de selección general, por ejemplo, el medio de cultivo HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en el medio de cultivo HAT se continúa durante un período suficiente, generalmente de varios días a varias semanas, para destruir células distintas de los hibridomas de interés (células no fusionadas). A continuación, se realiza un método de dilución limitante convencional para cribar y clonar hibridomas que producen un anticuerpo de interés.

Además de obtener los hibridomas inmunizando animales no humanos con un antígeno, pueden obtenerse anticuerpos humanos deseados que tienen una actividad de unión a un antígeno deseado o célula que expresa un antígeno deseado sensibilizando un linfocito humano con una proteína antigénica deseada o célula que expresa antígenoin vitro,y fusionando el linfocito B sensibilizado con una célula de mieloma humano tal como U266 (véase la publicación de la solicitud de patente japonesa Kokoku n.° (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente japonesa aprobada examinada publicada para oposición)). Además, puede administrarse un antígeno o célula que expresa antígeno a un animal transgénico que tiene un repertorio de genes de anticuerpos humanos, y luego puede obtenerse un anticuerpo humano deseado siguiendo el método mencionado anteriormente (véanse las publicaciones de solicitud de patente internacional n.osWO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735).

Los hibridomas preparados como tales que producen anticuerpos monoclonales pueden subcultivarse en un medio de cultivo convencional y almacenarse en nitrógeno líquido durante un largo período.

Para obtener anticuerpos monoclonales de los hibridomas, pueden emplearse los siguientes métodos: cultivar los hibridomas de acuerdo con métodos convencionales y obtener los anticuerpos como un sobrenadante de cultivo o hacer que los hibridomas proliferen administrándolos a un mamífero compatible y obteniendo los anticuerpos de ascitis; y así sucesivamente. El primer método es adecuado para obtener anticuerpos con alta pureza, y el último es adecuado para la producción de anticuerpos a gran escala.

Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas que producen anticuerpos anti-receptor de IL-6 mediante el método dado a conocer en el documento JP-A (Kokai) H03-139293. Tal preparación puede llevarse a cabo inyectando hibridomas que producen anticuerpos PM-1 en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c, obteniendo ascitis y después purificando los anticuerpos PM-1 de la ascitis; o cultivando los hibridomas en un medio apropiado (tal como un medio RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 10 % y BM-Condimed H1 al 5 % (Boehringer Mannheim); el medio SFM de hibridoma (GIBCO-BRL); o el medio PFHM-II (GlBcO-BRL)) y después purificando los anticuerpos PM-1 del sobrenadante de cultivo.

Pueden usarse anticuerpos recombinantes como los anticuerpos monoclonales como se describe en el presente documento, en donde los anticuerpos recombinantes se producen usando técnicas de recombinación genética clonando un gen de anticuerpo a partir de un hibridoma, insertando el gen en un vector apropiado y después introduciendo el vector en un huésped (véase, por ejemplo, Borrebaeck, C. A. K. y Larrick, J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Más específicamente, se aíslan ARNm que codifican regiones variables (V) de anticuerpo de células que producen anticuerpos de interés, tales como hibridomas. Los ARNm pueden aislarse preparando ARN totales de acuerdo con métodos conocidos, tal como el método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M.etal.,Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) y el método AGPC (Chomczynski, P.et al.,Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), y preparando ARNm usando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia) y similares. Alternativamente, pueden prepararse ARNm directamente usando el kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

Se sintetizan ADNc de las regiones V de anticuerpo a partir de los ARNm obtenidos usando transcriptasa inversa. Pueden sintetizarse ADNc usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa de AMV y similares. Además, para sintetizar y amplificar los ADNc, puede usarse el método 5'-RACE (Frohman, M. A.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.et al.,Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) usando el kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) y PCR. Un fragmento de ADN de interés se purifica de los productos de PCR obtenidos y después se liga con un ADN de vector. A continuación, se prepara un vector recombinante usando lo anterior, y se introduce enEscherichia coliy similares, y después se seleccionan sus colonias para preparar un vector recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN de interés se confirma mediante un método conocido tal como el método didesoxi.

Cuando se obtiene un ADN que codifica la región V del anticuerpo de interés, el ADN se liga con un ADN que codifica la región constante (región C) de un anticuerpo deseado, y se inserta en un vector de expresión. Alternativamente, puede insertarse un ADN que codifica una región V de anticuerpo en un vector de expresión que comprende un ADN de una región C de anticuerpo.

Para producir un anticuerpo que va a usarse en la presente invención, se inserta un gen de anticuerpo en un vector de expresión de modo que se exprese bajo el control de una región reguladora de la expresión tal como un potenciador y promotor, como se describe a continuación. A continuación, el anticuerpo puede expresarse transformando una célula huésped con este vector de expresión.

Como se describe en el presente documento, pueden usarse anticuerpos recombinantes modificados artificialmente, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos, por ejemplo, para reducir la heteroantigenicidad contra seres humanos. Estos anticuerpos modificados pueden prepararse usando métodos conocidos.

Puede obtenerse un anticuerpo quimérico ligando un ADN que codifica una región V de anticuerpo obtenida como anteriormente con un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano, insertándolo en un vector de expresión e introduciendo el vector en un huésped para producir el anticuerpo quimérico (véanse la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 125023; la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 92-19759). Este método conocido puede usarse para obtener anticuerpos quiméricos útiles para la presente invención.

Los anticuerpos humanizados también se denominan anticuerpos humanos reformados o anticuerpos convertidos en el tipo humano. Se producen trasplantando las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano (por ejemplo, un ratón) en las CDR de un anticuerpo humano. También se conocen métodos generales para esta recombinación génica (véanse la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 125023, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 92-19759).

Más específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para ligar las CDR de un anticuerpo de ratón con las regiones marco (FR) de un anticuerpo humano se sintetizan por PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos para contener porciones solapantes en sus extremos. El ADN obtenido se liga con un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano y se inserta en un vector de expresión, y el vector de expresión se introduce en un huésped para producir el anticuerpo humanizado (véanse la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 239400, la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 92-19759).

Las FR de anticuerpo humano que van a ligarse a través de las CDR se seleccionan de modo que las CDR formen sitios de unión a antígeno satisfactorios. El/los aminoácido(s) dentro de las regiones marco de las regiones variables del anticuerpo pueden sustituirse según sea necesario para que las CDR del anticuerpo humano reformado formen sitios de unión a antígeno apropiados (Sato, K.et al.,Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Se usan regiones C de anticuerpos humanos para los anticuerpos quiméricos y humanizados. Los ejemplos de regiones C de anticuerpos humanos incluyen Cy y, por ejemplo, pueden usarse Cy1, Cy2, Cy3 o Cy4. Además, para mejorar la estabilidad de los anticuerpos o su producción, las regiones C de anticuerpo humano pueden modificarse.

Los anticuerpos quiméricos están compuestos por la región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y la región C derivada de un anticuerpo humano; y los anticuerpos humanizados están compuestos por las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y las regiones marco y las regiones C derivadas de un anticuerpo humano. Su antigenicidad en el cuerpo humano se reduce y, por lo tanto, son útiles como anticuerpos para su uso en la presente invención.

Los ejemplos específicos preferidos de anticuerpos humanizados para su uso en la presente invención incluyen un anticuerpo PM-1 humanizado (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 92-19759).

Adicionalmente, además de los métodos mencionados anteriormente para obtener anticuerpos humanos, también se conocen técnicas para obtener anticuerpos humanos mediante cribado usando una biblioteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, la región variable de un anticuerpo humano puede expresarse en una superficie de fago como un anticuerpo monocatenario (scFv) usando el método de presentación en fagos, y entonces pueden seleccionarse fagos de unión a antígeno. Al analizar los genes de los fagos seleccionados, puede determinarse la secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo humano que se une al antígeno. Una vez que se revela la secuencia de ADN de un scFv que se une al antígeno, puede prepararse un vector de expresión apropiado que comprende la secuencia para obtener un anticuerpo humano. Estos métodos ya se conocen, y pueden usarse las publicaciones, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388 como referencias.

El gen de anticuerpo construido como se describió anteriormente puede expresarse de acuerdo con métodos conocidos. Cuando se usa una célula de mamífero, el gen de anticuerpo puede expresarse usando un ADN en el que un gen de promotor eficaz comúnmente usado, el gen de anticuerpo que va a expresarse y una señal de poli A en el lado 3' (aguas abajo) del gen del anticuerpo se unen operativamente entre sí, o usando un vector que comprende el ADN. Los ejemplos de un promotor/potenciador incluyen el promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus humano.

Además, otros promotores/potenciadores que pueden usarse para expresar los anticuerpos para su uso incluyen promotores/potenciadores virales de retrovirus, virus del polioma, adenovirus, virus de simio 40 (SV40), y similares; y promotores/potenciadores derivados de células de mamífero tales como el factor de elongación humano 1a (HEF1a).

La expresión puede realizarse fácilmente, por ejemplo, siguiendo el método en Mulliganet al.(Mulligan, R. C.et al.,Nature (1979) 277, 108-114) cuando se usa el promotor/potenciador de SV40, o siguiendo el método en Mizushimaet al.(Mizushima, S. y Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/potenciador HEF1a.

Cuando se usaE. coli,el gen de anticuerpo puede expresarse uniendo operativamente un gen de promotor eficaz comúnmente usado, una secuencia señal para la secreción de anticuerpos y el gen de anticuerpo que va a expresarse. Los ejemplos del promotor incluyen un promotor lacZ y un promotor araB. El promotor AlacZ puede usarse de acuerdo con el método de Wardet al.(Ward, E. S.et al.,Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S.et al.,FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); y puede usarse un promotor araB de acuerdo con el método de Betteret al.(Better, M.et al.,Science (1988) 240, 1041-1043).

Cuando el anticuerpo se produce en el periplasma deE. coli,puede usarse la secuencia señal pel B (Lei, S. P.et al.,J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) como secuencia señal para la secreción de anticuerpos. El anticuerpo producido en el periplasma se aísla, y luego se repliega adecuadamente la estructura del anticuerpo que va a usarse (véase, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como origen de replicación, pueden usarse los derivados de SV40, virus del polioma, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Además, para aumentar el número de copias de genes en un sistema de células huésped, el vector de expresión puede comprender el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), gen de timidina cinasa (TK), gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa deE. coli(Ecogpt), gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), y similares, como marcador de selección.

Puede usarse cualquier sistema de producción para preparar los anticuerpos para su uso en la presente invención. Los sistemas de producción para la preparación de anticuerpos incluyen sistemas de producciónin vitroein vivo.Los sistemas de producciónin vitroincluyen aquellos que usan células eucariotas o aquellos que usan células procariotas.

Cuando se usan células eucariotas, los sistemas de producción incluyen aquellos que usan células animales, células vegetales o células fúngicas. Tales células animales incluyen (1) células de mamífero tales como CHO, COS, mieloma, riñón de cría de hámster (BHK), HeLa y Vero; (2) células de anfibios tales como ovocitos deXenopus;y (3) células de insecto tales como sf9, sf21 y Tn5. Las células vegetales conocidas incluyen células derivadas deNicotiana tabacum,que pueden cultivarse en callos. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales comoSaccharomyces(por ejemplo,Saccaromyces cerevisiae)y hongos de moho tales comoAspergillus(por ejemplo,Aspergillus niger).

Cuando se usan células procariotas, los sistemas de producción incluyen aquellos que usan células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyenE. coli.yBacillus subtilis.

Pueden obtenerse anticuerpos introduciendo el gen de anticuerpo de interés en estas células mediante transformación, y luego cultivando las células transformadasin vitro.Las células se cultivan de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, puede usarse DMEM, MEM, RPMI 1640 o IMDM como medio de cultivo, y pueden usarse suplementos de suero tales como suero de ternera fetal (FCS) en combinación. Alternativamente, las células en las que se introduce el gen de anticuerpo pueden transferirse a la cavidad abdominal y similar de un animal para producir los anticuerposin vivo.

Mientras tanto, los sistemas de producciónin vivoincluyen aquellos que usan animales o aquellos que usan plantas. Cuando se usan animales, los sistemas de producción incluyen aquellos que usan mamíferos o insectos.

Los mamíferos que pueden usarse incluyen cabras, cerdos, ovejas, ratones y bovinos (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Además, los insectos que pueden usarse incluyen gusanos de seda. Cuando se usan plantas, puede usarse tabaco y similares.

Se introduce un gen de anticuerpo en estos animales o plantas, y los anticuerpos se producen en el cuerpo de los animales o plantas y luego se recuperan. Por ejemplo, puede prepararse un gen de anticuerpo como un gen de fusión insertándolo en el medio de un gen que codifica una proteína producida de manera única en la leche, tal como p caseína de cabra. Se introducen fragmentos de ADN que comprenden el gen de fusión, que incluye el gen de anticuerpo insertado, en embriones de cabra, y los embriones se introducen en cabras hembra. Los anticuerpos deseados se obtienen de la leche producida por cabras transgénicas nacidas de las cabras que recibieron los embriones, o sus progenies. Cuando sea apropiado, a las cabras transgénicas se les pueden dar hormonas para aumentar el volumen de leche que contiene los anticuerpos deseados que producen (Ebert, K. M.et al.,Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se usan gusanos de seda, los gusanos de seda se infectan con un baculovirus en el que se inserta el gen de anticuerpo de interés, y los anticuerpos deseados se obtienen de los fluidos corporales de estos gusanos de seda (Maeda, S.et al.,Nature (1985) 315, 592-594). Además, cuando se usa tabaco, el gen de anticuerpo de interés se inserta en un vector de expresión de plantas tal como pMON530, y el vector se introduce en bacterias tales comoAgrobacterium tumefaciens.Esta bacteria se usa para infectar tabaco comoNicotiana tabacum,y luego se obtiene el anticuerpo deseado de las hojas de este tabaco (Julian, K.-C. Maet al.,Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando se producen anticuerpos usando sistemas de producciónin vitrooin vivocomo se describió anteriormente, pueden insertarse ADN que codifican una cadena pesada (cadena H) y una cadena ligera (cadena L) de anticuerpo en vectores de expresión separados, y luego se cotransforma un huésped con los vectores. Alternativamente, el<a>D<n>que codifica la cadena H y el ADN que codifica la cadena L pueden insertarse en un único vector de expresión para transformar un huésped (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 94-11523).

Los anticuerpos usados en el presente documento pueden ser fragmentos de anticuerpos o productos modificados de los mismos, siempre que puedan usarse adecuadamente en el presente documento. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv y Fv monocatenario (scFv) en el que los Fv de las cadenas H y L se unen a través de un enlazador apropiado.

Específicamente, los fragmentos de anticuerpo se producen tratando anticuerpos con enzimas tales como papaína o pepsina o, alternativamente, construyendo genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo e introduciéndolos en vectores de expresión, y luego expresando los vectores en células huésped apropiadas (véase, por ejemplo, Co, M. S.et al.,J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E. Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J.et al.,Methods in Enzymology (1989) 121,663-666; y Bird, R. E.et al.,TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Puede obtenerse un scFv uniendo la región V de la cadena H y la región V de la cadena L de un anticuerpo. En este scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se unen a través de un enlazador, preferiblemente a través de un enlazador peptídico (Huston, J. S.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Las regiones V de las cadenas H y L en un scFv pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Los enlazadores peptídicos para unir las regiones V incluyen, por ejemplo, un péptido arbitrario de cadena sencilla que consiste en de 12 a 19 residuos de aminoácidos.

Puede obtenerse un ADN que codifica un scFv amplificando una porción de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos deseada en secuencias molde con PCR usando un par de cebadores que definen los extremos terminales de la porción, en donde se usan un ADN que codifica una cadena H o una región V de cadena H y un ADN que codifica una cadena L o una región V de cadena L de los anticuerpos mencionados anteriormente como moldes, y luego amplificando adicionalmente la porción de ADN amplificada con un ADN que codifica una porción de enlazador peptídico y un par de cebadores que definen ambos extremos del enlazador de modo que pueda unirse a cada una de las cadenas H y L.

Una vez que se ha preparado ADN que codifica scFv, puede obtenerse un vector de expresión que comprende el ADN y un huésped transformado con el vector de expresión de acuerdo con métodos convencionales. Además, puede obtenerse un scFv de acuerdo con métodos convencionales usando el huésped.

De manera similar a lo anterior, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse obteniendo sus genes, expresándolos y luego usando un huésped. Un “anticuerpo” como se usa en el presente documento abarca tales fragmentos de anticuerpo.

También pueden usarse anticuerpos unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) como anticuerpos modificados. Un “anticuerpo” como se usa en el presente documento abarca tales anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Tales métodos ya están establecidos en la técnica.

Los anticuerpos producidos y expresados como anteriormente pueden aislarse del interior o del exterior de las células o de los huéspedes, y después purificarse hasta la homogeneidad. Los anticuerpos para su uso en la presente invención pueden aislarse y purificarse mediante cromatografía de afinidad. Las columnas usadas para la cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los portadores usados para las columnas de proteína A incluyen HyperD, POROS y Sepharose F.F. Pueden usarse otros métodos usados para el aislamiento y/o la purificación de proteínas habituales sin limitación.

Por ejemplo, los anticuerpos usados para la presente invención pueden aislarse y purificarse seleccionando y combinando apropiadamente cromatografías distintas de la cromatografía de afinidad descrita anteriormente, filtración, ultrafiltración, desalación, diálisis, y similares. Los ejemplos de cromatografías incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba y filtración en gel. Estas cromatografías pueden aplicarse a cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Alternativamente, puede usarse HPLC de fase inversa.

La concentración de los anticuerpos obtenidos como anteriormente puede determinarse mediante medición de absorbancia, ELISA, y similares. Específicamente, cuando se usa medición de absorbancia, la concentración puede determinarse diluyendo apropiadamente la disolución de anticuerpo con PBS(-), midiendo su absorbancia a 280 nm y calculando la concentración usando el factor de conversión 1,35 DO / 1 mg/ml. Alternativamente, cuando se usa ELISA, la concentración puede determinarse como a continuación. Específicamente, se añaden 100 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (TAG) diluido hasta 1 |ig/ml con tampón bicarbonato 0,1 M (pH 9,6) a una placa de 96 pocillos (Nunc) y se incuba durante la noche a 4 °C para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, se añaden 100 |il de un anticuerpo apropiadamente diluido para su uso en la presente invención o una muestra apropiadamente diluida que comprende el anticuerpo, o IgG humana (CAPPEL) como patrón, y la placa se incuba durante una hora a temperatura ambiente.

Después del lavado, se añaden 100 |il de anticuerpo anti-IgG humano marcado con fosfatasa alcalina diluido 5.000 x (BIO SOURCE), y la placa se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Después de otro lavado, se añade la disolución de sustrato, se incuba la placa y se mide la absorbancia a 405 nm usando el lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo de interés.

Las variantes de IL-6 usadas en la presente invención son sustancias que tienen actividad de unión a un receptor de IL-6 y que no transmiten la actividad biológica de IL-6. Es decir, las variantes de IL-6 compiten con IL-6 por la unión a un receptor de IL-6, pero no transmiten la actividad biológica de IL-6, y así bloquean la transducción de señales mediada por IL-6.

Las variantes de IL-6 se producen introduciendo mutación/mutaciones sustituyendo residuo(s) de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de IL-6. Puede usarse cualquier IL-6 de la que se derive la variante de IL-6, pero se prefiere IL-6 humana, considerando la antigenicidad y similares.

Más específicamente, las sustituciones de aminoácidos se realizan prediciendo la estructura secundaria de IL-6 a partir de la secuencia de aminoácidos de IL-6 usando programas de modelado molecular conocidos tales como WHATIF (Vriendetal.,J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), y evaluando adicionalmente la influencia del/de los residuo(s) de aminoácido sustituido(s) en la molécula completa. Después de determinar el/los residuo(s) de aminoácido apropiado(s) que va(n) a sustituirse, se introduce(n) mutación/mutaciones mediante un método de PCR comúnmente realizado usando un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen de IL-6 humana como molde para provocar sustitución/sustituciones de aminoácidos, y de este modo se obtiene el gen que codifica la variante de<i>L-6. Si es necesario, este gen se inserta en un vector de expresión apropiado, y la variante de IL-6 puede obtenerse de acuerdo con los métodos de expresión, producción y purificación de anticuerpos recombinantes mencionados anteriormente.

Se dan a conocer ejemplos específicos de las variantes de IL-6 en Brakenhoffet al.,J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93; Savinoet al.,EMBO J. Am. (1994) 13, 1357-1367; documentos WO 96-18648; y WO 96-17869.

Los péptidos parciales de IL-6 o el receptor de IL-6 que van a usarse en el presente documento son sustancias que tienen una actividad de unión al receptor de IL-6 o IL-6, respectivamente, y que no transmiten las actividades biológicas de IL-6. Es decir, los péptidos parciales de IL-6 o el receptor de IL-6 se unen a y capturan el receptor de IL-6 o IL-6, y de ese modo inhiben específicamente la unión de IL-6 al receptor de IL-6. Como resultado, las actividades biológicas de IL-6 no se transmiten y, por lo tanto, se bloquea la transducción de señales mediada por IL-6.

Los péptidos parciales de IL-6 o el receptor de IL-6 son péptidos que están compuestos por toda la secuencia de aminoácidos de la región de la secuencia de aminoácidos de IL-6 o del receptor IL-6 o una parte de la misma implicada en la unión entre IL-6 y el receptor de IL-6. Tales péptidos se componen habitualmente de 10 a 80, preferiblemente de 20 a 50, más preferiblemente de 20 a 40 residuos de aminoácidos.

Los péptidos parciales de IL-6 o el receptor de IL-6 pueden producirse especificando la región de la secuencia de aminoácidos de IL-6 o del receptor IL-6 implicada en la unión entre IL-6 y el receptor de IL-6, y aplicando métodos generalmente conocidos tales como técnicas de ingeniería genética y métodos de síntesis de péptidos a toda la secuencia de aminoácidos de la región especificada o una porción de la misma.

Para preparar un péptido parcial de IL-6 o un receptor de IL-6 mediante métodos de ingeniería genética, se inserta una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado en un vector de expresión, y luego puede obtenerse el péptido aplicando los métodos mencionados anteriormente para expresar, producir y purificar anticuerpos recombinantes.

Para producir un péptido parcial de IL-6 o un receptor de IL-6 por métodos de síntesis de péptidos, pueden usarse métodos de síntesis de péptidos usados generalmente, tales como métodos de síntesis en fase sólida y métodos de síntesis en fase líquida.

Específicamente, los péptidos pueden sintetizarse de acuerdo con el método descrito en “The sequel of Development of Pharmaceuticals (Zoku Iyakuhin no Kaihatsu), vol. 14, Peptide Synthesis (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)”. Como método de síntesis en fase sólida, puede emplearse el siguiente método y similares: unir el aminoácido correspondiente al extremo C terminal del péptido que va a sintetizarse a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y luego alargar la cadena peptídica repitiendo alternativamente (1) la reacción de condensación de aminoácidos cuyos grupos a-amino y grupos funcionales de cadena ramificada están protegidos con grupos protectores apropiados, uno a la vez en una dirección C-terminal a N-terminal; y (2) la reacción de eliminación de los grupos protectores de los grupos a-amino de los aminoácidos o péptidos unidos a resina. La síntesis de péptidos en fase sólida se clasifica ampliamente en el método Boc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupos protectores usados.

Después de sintetizar el péptido de interés como anteriormente, se llevan a cabo la reacción de desprotección y la reacción de escisión de la cadena peptídica del soporte. Para la reacción de escisión de la cadena peptídica, se usa generalmente fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc, y se usa generalmente TFA para el método Fmoc. En el método Boc, por ejemplo, la resina unida a péptido protegido se trata con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. A continuación, el péptido se recupera eliminando los grupos protectores y escindiendo el péptido de su soporte. Al liofilizar el péptido recuperado, puede obtenerse un péptido en bruto. En el método Fmoc, la reacción de desprotección y la reacción de escisión de la cadena peptídica del soporte pueden realizarse en TFA y similares mediante operaciones similares a las descritas anteriormente.

Los péptidos en bruto obtenidos pueden separarse y purificar aplicando HPLC. La elución puede realizarse en condiciones óptimas usando un sistema de disolventes de agua-acetonitrilo, que generalmente se usa para la purificación de proteínas. Las fracciones correspondientes a los picos del perfil cromatográfico obtenido se recogen y se liofilizan. Las fracciones de péptidos purificadas de esta manera se identifican mediante análisis de peso molecular por medio de análisis de espectro de masas, análisis de la composición de aminoácidos, análisis de la secuencia de aminoácidos, y similares.

Se dan a conocer ejemplos específicos de los péptidos parciales de IL-6 y el receptor de IL-6 se describen en los documentos JP-A (Kokai) H02-188600, JP-A (Kokai) H07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098 y la publicación de patente de EE.UU. US5210075.

Los anticuerpos usados en la presente invención pueden ser anticuerpos conjugados que están unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radiactivas y toxinas. Tales anticuerpos conjugados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Los métodos para la modificación de anticuerpos ya se han establecido en este campo. En consecuencia, el término “anticuerpo” como se usa en el presente documento abarca tales anticuerpos conjugados.

Como se describe en el presente documento, “enfermedad relacionada con IL-6” se refiere a una enfermedad relacionada con IL-6, y los ejemplos incluyen artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, enfermedad de Castleman, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, enfermedad de Crohn, linfoma, colitis ulcerosa, anemia, vasculitis, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Still, amiloidosis, esclerosis múltiple, trasplante, degeneración macular relacionada con la edad, espondilitis anquilosante, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), nefropatía por IgA, osteoartritis, asma, nefropatía diabética, GVHD, endometriosis, hepatitis (NASH), infarto de miocardio, arteriosclerosis, septicemia, osteoporosis, diabetes, mieloma múltiple, cáncer de próstata, cáncer de riñón, linfoma no Hodgkin de linfocitos B, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer de colon, caquexia por cáncer, invasión nerviosa del cáncer, infarto de miocardio, neovascularización coroidea miópica, neovascularización coroidea idiopática, uveítis, tiroiditis crónica, hipersensibilidad retardada, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, mesotelioma, polimiositis, dermatomiositis, panuveítis, uveítis anterior, uveítis intermedia, escleritis, queratitis, inflamación orbital, neuritis óptica, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa, ojo seco, inflamación posoperatoria, neuromielitis óptica, miastenia grave e hipertensión pulmonar.

Como se describe en el presente documento, “ intervalo de dosificación de rutina” se refiere a un intervalo de dosificación generalmente usado para los productos farmacéuticos mencionados anteriormente (composiciones farmacéuticas de la presente invención), por ejemplo, un intervalo de dosificación para administración de rutina que puede describirse en un prospecto como “las dosis posteriores deben administrarse a intervalos de cuatro semanas” y similares. El intervalo de dosificación de rutina en la presente invención no está particularmente limitado, pero los ejemplos incluyen de un día a 24 semanas, preferiblemente de dos semanas a ocho semanas, más preferiblemente de tres a cinco semanas, e incluso más preferiblemente cuatro semanas. Los intervalos de dosificación de rutina pueden tener un cierto intervalo.

Como se describe en el presente documento, “dosis de rutina” es una dosis comúnmente usada para los productos farmacéuticos mencionados anteriormente (composiciones farmacéuticas de la presente invención), por ejemplo, una dosis administrada generalmente que puede describirse en un prospecto como “generalmente, una única dosis es de 8 mg por kg de peso corporal”. La dosis de rutina no está particularmente limitada, pero la dosis por administración puede ser, por ejemplo, de dos a 20 mg de inhibidor de IL-6 por kg de peso corporal (2-20 mg/kg) o de 50 mg a 800 mg de inhibidor de IL-6, preferiblemente de dos a ocho mg de inhibidor de IL-6 por kg de peso corporal (2-8 mg/kg) o de 80 a 160 mg de inhibidor de IL-6, o más preferiblemente 8 mg de inhibidor de IL-6 por kg de peso corporal (8 mg/kg) o 120 mg de inhibidor de IL-6.

Como se describe en el presente documento, “período de dosificación de intervalo corto” se refiere a un período de administración para inducir tolerancia inmunológica contra fármacos (composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento) para suprimir la generación de anticuerpos anti-fármaco debido a inmunogenicidad. El período de dosificación de intervalo corto se refiere a un período donde se administra la misma dosis que la dosis de rutina múltiples veces en un intervalo más corto que el intervalo de dosificación de rutina. Aunque el periodo de intervalo corto no está particularmente limitado siempre que sea un periodo en el que se induce tolerancia inmunológica, el período es preferiblemente de una a ocho semanas desde la administración inicial, y más preferiblemente cuatro semanas desde la administración inicial. “La misma dosis que la dosis de rutina” incluye dosis que proporcionan la misma concentración en sangre del inhibidor de IL-6 que una dosis de rutina. “Intervalo más corto que el intervalo de dosificación de rutina” no está particularmente limitado siempre que sea más corto que un intervalo de dosificación de rutina, y es preferiblemente la mitad de un intervalo de dosificación de rutina, por ejemplo, dos semanas cuando el intervalo de dosificación de rutina es de cuatro semanas. Por ejemplo, el período de dosificación de intervalo corto puede tener un cierto intervalo, tal como de una a dos semanas. “(Que se) administra múltiples veces” se refiere a dos o más administraciones incluida la administración inicial, y es preferiblemente de dos a cinco administraciones incluida la administración inicial, más preferiblemente tres administraciones incluida la administración inicial. Si se ha inducido tolerancia inmunológica, puede determinarse observando si se suprime la generación de anticuerpos anti-fármaco.

“Administración de rutina” se refiere a una administración comúnmente usada para los productos farmacéuticos mencionados anteriormente (composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento), por ejemplo, una administración a la “dosis de rutina” e “intervalo de dosificación de rutina” descritos anteriormente.

Los ejemplos preferidos de un “anticuerpo frente a receptor de IL-6” incluyen tocilizumab que es un anticuerpo IgG1 anti-receptor de IL-6 humanizado, y anticuerpos anti-receptor de IL-6 humanizados producidos modificando las regiones variables y constantes de tocilizumab, específicamente, un anticuerpo que contiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. Un ejemplo más preferible es un anticuerpo que contiene una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID<n>O:3 (cadena pesada de SA237) y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4 (cadena ligera de SA237). Se prefiere particularmente SA237.

Tales anticuerpos pueden obtenerse de acuerdo con los métodos descritos en los documentos WO2010/035769, WO2010/107108, WO2010/106812, y similares. Específicamente, los anticuerpos pueden producirse usando técnicas de recombinación genética conocidas por los expertos en la técnica, basándose en la secuencia del anticuerpo frente a receptor de IL-6 mencionado anteriormente (véase, por ejemplo, Borrebaeck CAK y Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Puede obtenerse un anticuerpo recombinante clonando un ADN que codifica el anticuerpo a partir de un hibridoma o una célula productora de anticuerpos tal como un linfocito sensibilizado productor de anticuerpos, insertando el ADN en un vector apropiado e introduciendo el vector en un huésped (célula huésped) para producir el anticuerpo.

Tales anticuerpos pueden aislarse y purificarse usando métodos de aislamiento y purificación usados convencionalmente para la purificación de anticuerpos, sin limitación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden aislarse y purificarse seleccionando y combinando apropiadamente cromatografía en columna, filtración, ultrafiltración, desalación, precipitación con disolvente, extracción con disolventes, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, isoelectroenfoque, diálisis, recristalización, y similares.

Como se describe en el presente documento, el periodo de administración rutinario comienza desde la administración final del periodo de dosificación de intervalo corto. Más específicamente, la administración final en el periodo de dosificación de intervalo corto va seguida por un intervalo de dosificación de rutina, y luego se lleva a cabo la primera administración en el periodo de administración de rutina.

La composición farmacéutica es preferiblemente una composición farmacéutica en la que se administra la misma dosis de un inhibidor de IL-6 que la dosis de rutina de dos a cinco veces con intervalos de una a tres semanas desde la administración inicial en el periodo de dosificación de intervalo corto, y luego se administra el inhibidor de IL-6 con intervalos de dos a ocho semanas a partir de la administración final en el período de dosificación de intervalo corto usando una dosis de rutina de 50 mg a 800 mg por administración; o más preferiblemente una composición farmacéutica en la que se administra SA237 tres veces a la misma dosis que la dosis de rutina con intervalos de dos semanas desde la administración inicial en el periodo de dosificación de intervalo corto (es decir, en la semana 0, semana 2 y semana 4), y luego se administra SA237 rutinariamente con intervalos de ocho semanas a partir de la administración final en el período de dosificación de intervalo corto (es decir, en la semana 12, semana 20, semana 28 y así sucesivamente con intervalos de ocho semanas, contando desde la administración inicial en el periodo de dosificación de intervalo corto) usando una dosis de rutina de 120 mg por administración.

El programa de administración preferido para el inhibidor de IL-6 puede ajustarse, por ejemplo, extendiendo apropiadamente el intervalo de administración mediante la monitorización de las condiciones de la enfermedad y los cambios en los valores de análisis de sangre.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención usadas con fines terapéuticos o preventivos pueden formularse para producir formulaciones liofilizadas o formulaciones en disolución mezclando, si es necesario, con portadores, vehículos, y similares farmacéuticamente aceptables adecuados. Los portadores y vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, agua esterilizada, solución salina fisiológica, estabilizadores, excipientes, antioxidantes (tales como ácido ascórbico), tampones (tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos), antisépticos, tensioactivos (tales como PEG y Tween), agentes quelantes (tales como EDTA) y aglutinantes. Pueden estar contenido también otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulinas, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, ácido glutámico, ácido aspártico, metionina, arginina y lisina, azúcares e hidratos de carbono tales como polisacáridos y monosacáridos, y alcoholes de azúcar tales como manitol y sorbitol. Cuando se prepara una disolución acuosa para inyección, pueden usarse solución salina fisiológica y disoluciones isotónicas que comprenden glucosa y otros adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio; y pueden usarse en combinación solubilizantes apropiados tales como alcohol (por ejemplo, etanol), polialcoholes (tales como propilenglicol y PEG) y tensioactivos no iónicos (tales como polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 188 y h CO-50). Al mezclar hialuronidasa en la formulación, puede administrarse un mayor volumen de fluido por vía subcutánea (Expert Opin. Drug Deliv. Julio de 2007; 4(4): 427-40). Además, pueden precargarse jeringas con la composición farmacéutica de la presente invención. Pueden prepararse formulaciones en disolución de acuerdo con el método descrito en el documento WO2011/090088.

Si es necesario, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden encapsularse en microcápsulas (por ejemplo, aquellas hechas de hidroximetilcelulosa, gelatina y poli(metacrilato de metilo)), o incorporarse en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsión, nanopartículas y nanocápsulas) (véase, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science 16a edición”, Oslo Ed (1980)). También se conocen métodos para preparar los agentes farmacéuticos como agentes farmacéuticos de liberación controlada, y tales métodos pueden aplicarse a las composiciones farmacéuticas de la presente invención (Langeret al.,J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); patente de EE. UU. n.° 3.773.919; publicación de solicitud de patente europea n.° EP 58.481; Sidmanet al.,Biopolymers 22: 547-556 (1983); y documento EP 133.988).

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un paciente a través de cualquier vía apropiada. Por ejemplo, puede administrarse a un paciente por vía intravenosa mediante inyección en bolo o mediante infusión continua, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, transdérmica, subcutánea, intraarticular, sublingual, intrasinovial, oral, por inhalación, localmente o externamente, durante un cierto período de tiempo. Se prefiere la administración intravenosa o la administración subcutánea.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos.

[Ejemplo 1] Preparación de inhibidores de IL-6

SA237, el anticuerpo frente a receptor de IL-6 descrito en el documento de patente, WO2010/035769 (un anticuerpo que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26 del documento WO 2010/035769 (<s>E<q>ID NO: 3 de la presente memoria descriptiva) y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 29 del documento WO 2010/035769 (SEQ ID NO: 4 de la presente memoria descriptiva) en el documento WO2010/035769), se produjo de acuerdo con la descripción en el documento de patente mencionado anteriormente. El anticuerpo producido se usó para preparar formulaciones para administración subcutánea mediante el método en el documento de patente WO2011/090088.

[Ejemplo 2] Examen mediante administración subcutánea única a sujetos masculinos adultos sanos japoneses y caucásicos (SA001JP)

Se evaluaron la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética y biodisponibilidad de SA237 cuando se administra por vía subcutánea a sujetos masculinos adultos sanos japoneses y caucásicos. En este estudio, se administró SA237 por vía subcutánea o intravenosa por infusión por goteo a 48 individuos japoneses, y se administró por vía subcutánea a 24 individuos caucásicos. La seguridad y tolerabilidad en una sola administración de SA237 fueron en su mayor parte satisfactorias en 24 casos. La biodisponibilidad absoluta de SA237 para administraciones subcutáneas de 60 mg y 120 mg fue del 64,6 % y el 69,4 %, respectivamente. Se observó desarrollo de anticuerpos anti-SA237 en 39 de 72 sujetos a los que se administró SA237.

[Ejemplo 3] Estudio comparativo abierto, de grupos paralelos mediante administración subcutánea múltiple a pacientes japoneses con artritis reumatoide (SA-105JP)

Se seleccionaron como sujetos pacientes que cumplían los siguientes criterios:

(1) diagnóstico de artritis reumatoide (AR) de acuerdo con los criterios del American College of Rheumatology (ACR) 1987;

(2) duración de la enfermedad de AR durante seis meses o más;

(3) mostraron un nivel de proteína C reactiva (CRP) por encima del límite superior del intervalo de referencia de laboratorio en una prueba realizada en el plazo de dos semanas antes de iniciar la administración del medicamento en investigación (iMP);

(4) 20 años de edad o más en el momento del consentimiento informado;

(5) firma del formulario de consentimiento informado en persona;

(6) no ha recibido tratamiento con metotrexato (MTX) después de o a las 16 semanas antes de iniciar la administración del IMP;

(7) no ha recibido tratamiento con leflunomida después de o a las 12 semanas antes de iniciar la administración del IMP (o después de o a las cuatro semanas antes de iniciar la administración del agente en investigación, si se ha llevado a cabo un tratamiento convencional con colestiramina o eliminación de fármacos con carbón activado); (8) no ha recibido tratamiento con DMARD o agentes inmunosupresores distintos de los descritos anteriormente más tarde o a las cuatro semanas antes de iniciar la administración del agente en investigación; y

(9) no ha recibido un tratamiento superior a 10 mg al día como equivalencia de prednisolona, más tarde o a las dos semanas antes de iniciar la administración del agente en investigación.

Los sujetos se aleatorizaron en tres grupos (grupos A, B y C) según el método de registro central, y se realizó el estudio comparativo abierto, de grupos paralelos (véase la tabla 1). La aleatorización se estratificó por peso corporal. Este estudio clínico comprende un período de evaluación primaria, un período de extensión y un período de seguimiento.

En el período de evaluación primaria, se administraron 120 mg de SA237 en la semana 0, semana 2 y semana 4; y se administraron 120 mg, 60 mg y 30 mg de SA237 a los grupos A, B y C, respectivamente, desde la semana 8 hasta la semana 16 con intervalos de cuatro semanas. Posteriormente, en principio, se observaron los grupos A, B y C hasta las semanas 32, 28 y 24, respectivamente, momento en el cual se esperaba que las concentraciones séricas de SA237 fueran niveles indetectables en cada uno de los grupos (la observación incluyó mediciones de anticuerpos anti-SA237). En el período de extensión, se administraron 120 mg de SA237 en la semana 0, semana 2 y semana 4; y se administraron 120 mg de SA237 desde la semana 8 hasta las 20 semanas con intervalos de cuatro semanas, y la observación continuó hasta la semana 32.

El fármaco de prueba estaba en forma de un vial lleno de 1,0 ml de una disolución que contenía 120 mg de SA237. La disolución contenía L-histidina, L-arginina, ácido L-aspártico y polioxietilen (160) polioxipropilen (30) glicol como aditivos, y se ajustó a pH 5,5 a 6,5. En principio, el fármaco se administró por vía subcutánea al área abdominal. [Tabla 1]

Número de casos:

En las evaluaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas, y en el examen de eficacia (en el conjunto de análisis completo (FAS)) y seguridad de administrar repetidamente SA237 a pacientes con AR, los antecedentes de los sujetos en los respectivos grupos de 11 casos (33 casos en total) sometidos a cada análisis fueron de 59,0 a 65,0 años de edad (mediana del intervalo para cada uno de los grupos; lo mismo se aplica a continuación) y de 50,30 a 57,90 kg de peso corporal. El porcentaje de mujeres en cada grupo fue alto, y fue del 81,8 % en el grupo A (9/11 casos), el 90,9 % en el grupo B (10/11 casos) y el 63,6 % en el grupo C (7/11 casos). Los sujetos que recibieron el agente en investigación hasta el final del período de evaluación primaria fueron 10/11 casos (90,9 %) en el grupo A, 10/11 casos (90,90 %) en el grupo B y 9/11 casos (81,8 %) en el grupo C; y los sujetos que pudieron observarse durante toda la duración (el período de evaluación primaria y el período de extensión) fueron 10/11 casos (90,9 %) en el grupo A, 7/11 casos (63,6 %) en el grupo B y 7/11 casos (63,60 %) en el grupo C.

(1) Farmacocinética

Método de evaluación: La observación y las pruebas se llevaron a cabo de acuerdo con las tablas 2 y 3. Donde no se especifique particularmente, las evaluaciones se llevaron a cabo antes de la administración del agente en investigación. Incluso si el período de evaluación primario definido no se había completado, cuando se llevó a cabo la evaluación el día o después de la administración inicial del período de extensión, se determinó que la observación y las pruebas posteriores para el período de evaluación primaria eran innecesarias. Los períodos de prueba se definieron como a continuación.

Periodo de evaluación primaria: En principio, el período de observación y prueba que comienza desde el primer día de administración del agente en investigación hasta las semanas 32, 28 y 24 para los grupos A, B y C, respectivamente, momento en el cual se esperaba que se eliminaran las concentraciones séricas de SA237. Sin embargo, en el caso en el que se confirmó el nivel indetectable de la concentración sérica de SA237 y se inició la administración en el periodo de extensión antes del final del periodo anterior, el período de evaluación primaria se establecería en el período hasta la observación y pruebas antes de la primera administración en el período de extensión.

Periodo de extensión: Comenzando desde la administración inicial en el período de extensión tras la finalización del período de evaluación primaria, y hasta la observación y pruebas en la semana 24 del periodo de extensión.

Periodo posterior a la observación: Comenzando desde la finalización de la observación y las pruebas en la semana 24 del período de extensión y hasta la semana 32.

[Tabla 2]

Programa de observación y pruebas (periodo de evaluación primaria)

[Tabla 3]

Programa de observación y pruebas (periodo de extensión y período de seguimiento)

Resultados: Los gráficos que indican la farmacocinética en este estudio se muestran en la figura 1. Los niveles mínimos de la concentración sérica de SA237 fueron aproximadamente constantes desde la semana 4 en adelante tanto en el período de evaluación primaria para el grupo A como en el período de extensión. Por otro lado, las concentraciones séricas de SA237 en los grupos B y C durante el período de evaluación primaria disminuyeron desde la semana 8 en adelante. Dado que el período de evaluación primaria y el período de extensión no mostraron diferencias significativas en la concentración sérica de SA237 y la AUC<0>-<2>W hasta la semana 8, la farmacocinética no cambió cuando se interrumpió la administración de SA237 y luego se reanudó.

(2) Evaluaciones farmacodinámicas

Resultados: Los gráficos de las evaluaciones farmacodinámicas en este estudio se muestran en las figuras 2 y 3. Desde la semana 8 hasta la semana 20 en el grupo A durante el período de evaluación primaria, y desde la semana 8 hasta la semana 24 durante el período de extensión, donde la concentración sérica de SA237 se mantuvo a un nivel constante, y la concentración sérica de sIL-6R también se mantuvo a un nivel aproximadamente constante. Por otro lado, desde la semana 8 en adelante en los grupos B y C durante el período de evaluación primaria, la concentración sérica de slL-6R, que es un marcador de PD para la inhibición de IL-6, disminuyó junto con la reducción en la concentración de SA237.

Durante el período de evaluación primaria, CRP, que es un marcador de PD para la inhibición de IL-6, fue inferior al límite inferior de cuantificación (0,005 mg/dl) desde la semana 4 hasta la semana 20 en aproximadamente la mitad de los sujetos en el grupo A, y la media también permaneció baja alrededor de 0,01 mg/dl. El valor aumentó hasta 0,1 mg/dl o más desde la semana 16 en adelante en el grupo B y desde la semana 8 en adelante en el grupo C. El porcentaje de normalización de CRP (0,3 mg/dl o menos) también mostró una tendencia similar al cambio en la media. Los porcentajes en la semana 4 para cada uno de los grupos fueron del 81,8 % al 90,9 %; y posteriormente, cuando los porcentajes en la semana 20 se compararon con los de la semana 8, el grupo A no mostró cambio desde el 100 %, el grupo B mostró un cambio desde el 81,8 % hasta el 80,0 % y fue aproximadamente el mismo, y el grupo C mostró una disminución desde el 90,9 % hasta el 33,3 %. En la mayoría de los sujetos y puntos de tiempo, se consideró que la CRP estaba disminuida desde el nivel inicial, siempre que la concentración sérica de SA237 sea cuantificable (0,2 |ig/ml).

(3) Eficacia

Método de evaluación: DAS28 (puntuación de actividad de enfermedad modificada basada en recuentos de 28 articulaciones) es un indicador para evaluar la actividad de la artritis reumatoide, que se calcula a partir de la siguiente ecuación usando el recuento de articulaciones sensibles (TJC) y el recuento de articulaciones hinchadas (SJC) en las 28 articulaciones, ESR, y la “evaluación global del paciente”. Se examinó el cambio en el DAS28 desde el inicio de la administración hasta el último día de observación. Resumen estadístico (media, desviación estándar, mediana, valor mínimo y valor máximo) para cada grupo y cada período. Además, se calculó la tasa de remisión clínica.

Veintiocho articulaciones examinadas para DAS28

Los criterios de mejora de ACR al 20 %, 50 % y 70 % (ACR20, ACR50 y ACR70) se evaluaron como a continuación.

Criterios de mejora de ACR

Resultados: El curso de tiempo de las puntuaciones de DAS28 en el período de evaluación primaria, que indica la eficacia en este examen, se muestran a continuación en la Tabla 4.

[Tabla 4]

Valores estadísticos de DAS28 en cada Grupo A Grupo B Grupo C visita 120 mg 60 mg 30 mg

__________________________________________(N=11)____________ (N=11)_____________(N=11)

Cambio desde el nivel inicial en la

semana 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-6 que comprende un inhibidor de IL-6 como principio activo, en donde la composición farmacéutica se administra rutinariamente a intervalos de cuatro semanas después de un período de dosificación de intervalo corto donde se administra la misma dosis que la dosis de rutina múltiples veces a intervalos de dos semanas, en donde el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo frente a receptor de IL-6 que comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, y en donde la enfermedad relacionada con IL-6 es artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, enfermedad de Castleman, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, enfermedad de Crohn, linfoma, colitis ulcerosa, anemia, vasculitis, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Still, amiloidosis, esclerosis múltiple, trasplante, degeneración macular relacionada con la edad, espondilitis anquilosante, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), nefropatía por IgA, osteoartritis, asma, nefropatía diabética, GVHD, endometriosis, hepatitis (NASH), infarto de miocardio, arteriosclerosis, sepsis, osteoporosis, diabetes, mieloma múltiple, cáncer de próstata, cáncer de riñón, linfoma no Hodgkin de linfocitos B, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer de colon, caquexia por cáncer, invasión nerviosa del cáncer, neovascularización coroidea miópica, neovascularización coroidea idiopática, uveítis, tiroiditis crónica, hipersensibilidad retardada, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, mesotelioma, polimiositis, dermatomiositis, panuveítis, uveítis anterior, uveítis intermedia, escleritis, queratitis, inflamación orbital, neuritis óptica, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa, ojo seco, inflamación postoperatoria, neuromielitis óptica, miastenia grave o hipertensión pulmonar.

2. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1, en la que el período de dosificación de intervalo corto es de cuatro semanas desde la administración inicial.

3. Composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la dosis de rutina es de 50 mg a 800 mg por administración.

4. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la dosis de rutina es de 120 mg por administración.

5. Composición farmacéutica para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo frente a receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

6. Composición farmacéutica para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo frente a receptor de IL-6 comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.

7. Composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición farmacéutica es una formulación para administración subcutánea.