ES3017699T3

ES3017699T3 - Detergent composition comprising subtilase variants

Info

Publication number: ES3017699T3
Application number: ES19198871T
Authority: ES
Inventors: Timothy O'connell; Susanne Tondera; Hendrik Hellmuth; Thomas Weber; Rolf Thomas Lenhard; Signe Eskildsen Larsen; Toscano Miguel Duarte Guilherme Pereira; Esben Peter Friis; Astrid Munch; Mikael Bauer; Bena-Marie Lue
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2025-05-13
Anticipated expiration: 2035-12-14
Also published as: DK3399031T3; US20200347323A1; EP3399031A1; EP3608403B1; US10760036B2; EP3608403A3; DK3608403T3; EP3608403A2; EP3234121A1; EP4530348A3; PL3608403T3; WO2016096714A1; PL3399031T3; US11597894B2; EP3399031B1; ES2763235T3; EP4530348A2; US20170349861A1

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas composiciones detergentes que comprenden nuevas variantes de subtilasa que presentan una estabilidad y/o un rendimiento de lavado mejorados en detergentes líquidos, así como a métodos para obtener dichas composiciones. Estas variantes son adecuadas para su uso, por ejemplo, en composiciones de limpieza o detergentes, como composiciones detergentes para ropa y lavavajillas, incluyendo composiciones para lavavajillas automáticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición detergente que comprende variantes de subtilasa

Antecedentes de la invención

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una composición detergente que comprende nuevas variantes de subtilasa que muestran una estabilidad incrementada y/o un rendimiento de lavado mejorado en composiciones detergentes líquidas. Además, la presente invención se refiere a métodos de producción de dichas composiciones detergentes y al uso de dichas composiciones detergentes en aplicaciones de limpieza.

Descripción de la técnica relacionada

En la industria de detergentes, los enzimas se han implementado en formulaciones de lavado durante muchas décadas. Los enzimas utilizados en tales formulaciones comprenden proteasas, lipasas, amilasas, celulasas, manosidasas, así como otros enzimas o mezclas de los mismos. Comercialmente, los enzimas más importantes son las proteasas.

Una subtilasa de tipo salvaje que se ha utilizado en el lavado de tejidos es la proteasa BLAP dada a conocer en el documento n.° WO 91/02792.

Un número creciente de proteasas utilizadas comercialmente son variantes de proteínas diseñadas a partir de proteasas de tipo salvaje que ocurren naturalmente: Everlase®, Relase®, Ovozyme®, Polarzyme®, Liquanase®, Liquanase Ultra® y Kannase® (Novozymes a/s), Purafast®, Purafect OXP®, FN3®, FN4® y Excellase® (Genencor InteARNtional, Inc.). Además, se describen varias variantes en la técnica, tal como en el documento n.° WO2004/041979 (NOVOZYMES A/S), que describe variantes de subtilasa que muestran alteraciones respecto a la subtilasa parental en, p. ej., rendimiento de lavado, estabilidad térmica, estabilidad durante el lavado y actividad catalítica. Las variantes resultan adecuadas para su uso en, p. ej., composiciones de limpieza o detergentes.

Se han dado a conocer variantes de la proteasa BLAP adecuadas para su uso en composiciones de limpieza o detergentes en, p. ej., el documento n.° Ep 701 605. A partir de los documentos n.° DE 102009029513 A1, n.° DE 102012215642 A1, n.°EP 2100948 A1, n.° WO 2003/038082 A2, n.° WO 2012/08201 A2, n.° WO 2012/080202 A1, n.° WO 2013/060621 A1, n.° DE 102011118021 A1, n.° WO 2011/072117 A1, n.° WO 2011/140316 A1, n.° WO 95/30011 A2 y n.° WO 2010/056653 A2, n.° CA 2829859 A1, n.° WO 2004/083362 A2, n.° WO 2005/095592 A2, n.° WO 2003/062380 A2, n.° EP 3106508 A1 y n.° WO 92/00345 A1 también se conocen proteasas adecuadas para la utilización en composiciones de limpieza o lavado.

El documento n.° WO99/57155 da a conocer enzimas detergentes, tales como proteasas modificadas mediante la unión de un dominio de unión a celulosa, a los enzimas. Se propone que la unión de los enzimas detergentes, tales como la proteasa, a textiles que contienen celulosa mejoraría el rendimiento de lavado.

Sin embargo, diversos factores hacen que la mejora adicional de las proteasas resulte ventajosa. En particular, las composiciones detergentes líquidas siguen siendo un reto para muchas proteasas detergentes y la pérdida de actividad durante el almacenamiento sigue siendo un problema para muchas buenas proteasas detergentes. De esta manera, a pesar de la intensa investigación en el desarrollo de proteasas, sigue existiendo una necesidad de nuevas proteasas mejoradas que presenten un rendimiento de lavado satisfactorio y una mayor estabilidad en las composiciones detergentes.

Descripción resumida de la Invención

La invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa que presenta una estabilidad mejorada y/o un rendimiento de lavado mejorado en detergentes líquidos en comparación con la subtilasa parental.

La invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa que presenta por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, preferentemente por lo menos 95 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 96 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 97 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 98 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición 101, y en donde la variante presenta una estabilidad incrementada en una composición detergente líquida en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y en donde el subtilasa comprende, además, la sustitución P129D (según la numeración de SEQ ID NO:1).

La invención se refiere, además, al uso de composiciones detergentes de la invención para el lavado de ropa o la limpieza de superficies duras, tales como el lavado de vajillas, p. ej., el lavado automático de vajillas.

La presente invención se refiere, además, a un método para producir una composición detergente que comprende la etapa de añadir una subtilasa variante obtenida mediante un método de obtención de dicha subtilasa variante según la presente invención, y recuperar la variante. La invención se refiere, además, a composiciones detergentes obtenidas mediante dicho método.

Definiciones

Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismolocuscromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y procesada por corte y empalme que se ha obtenido a partir de una célula eucariótica o procariótica.

ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN inicial y primario es un precursor de ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, incluyendo el procesamiento mediante corte y empalme, antes de aparecer como ARN maduro procesado.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de una variante. Los límites de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio, tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de parada, tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión de un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o foránea (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido codificante de la variante o nativas o foráneas unas respecto a otras. Entre dichas secuencias de control se incluyen, aunque sin limitación, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia de promotor, una secuencia de péptido de señal y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligado de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido codificante de una variante.

Composición detergente: La expresión "composición detergente" incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado de uso general o de alto rendimiento en forma granular o en polvo, especialmente detergentes limpiadores; agentes de lavado de uso general en forma líquida, gel o pasta, especialmente los llamados tipos líquidos de alto rendimiento (HDL, por sus siglas en inglés); detergentes líquidos para tejidos delicados; agentes para el lavado de vajillas a mano o agentes de lavado de vajillas para lavado ligero, especialmente aquellos del tipo de alto poder espumante; agentes para el lavado de vajillas a máquina, incluidos los diversos tipos de tabletas, granulados, líquidos y de enjuague para uso doméstico e institucional; agentes limpiadores y desinfectantes líquidos, incluidos los tipos antibacterianos para el lavado de manos, pastillas de limpieza, jabones en pastilla, enjuagues bucales, limpiadores de dentaduras, champús para automóviles o moquetas, limpiadores de baño; champús para el cabello y enjuagues para el cabello; geles de ducha, baños de espuma; limpiadores de metales, así como auxiliares de limpieza, tales como aditivos blanqueadores y tipos "barra quitamanchas" o tipos de pretratamiento. Las expresiones "composición detergente" y "formulación detergente" se utilizan en referencia a mezclas que están destinadas a ser utilizadas en un medio de lavado para limpiar objetos que se han ensuciado. En algunas realizaciones, la expresión se utiliza en referencia al lavado de tejidos y/o prendas de ropa (p. ej., "detergentes para tejidos"). En realizaciones alternativas, la expresión se refiere a otros detergentes, tales como los utilizados para limpiar vajillas, cubiertos, etc. (p. ej., "detergentes para el lavado de vajillas"). No se pretende que la presente invención se considere limitada a ninguna formulación o composición detergente en particular. La expresión "composición detergente" no se pretende que esté limitada a composiciones que contienen surfactantes. Se pretende que, además de las variantes según la invención, la expresión comprenda detergentes que pueden contener, p. ej., surfactantes, agentes constructores, quelantes o agentes quelantes, sistemas de blanqueo o componentes blanqueadores, polímeros, suavizantes de tejidos, potenciadores de espuma, supresores de espuma, tintes, perfume, inhibidores de manchas de taninos, blanqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de suciedad, agentes anticorrosión, inhibidores o estabilizadores de enzimas, activadores de enzimas, una o más transferasas, enzimas hidrolíticos, oxidorreductasas, agentes azulantes y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizadores.

Además de contener una variante de subtilasa tal como se da a conocer en la presente memoria, la formulación de detergente puede contener uno o más enzimas adicionales (tales como proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasa, xiloglucanasa, pectinasa, pectina liasas, xantanasas, peroxidasa, haloperoxigenasa, catalasa y mananasa, o cualquier mezcla de las mismas), y/o componentes tales como surfactantes, agentes constructores, quelantes o agentes quelantes, sistema de blanqueo o componentes de blanqueo, polímeros, acondicionadores de tejidos, potenciadores de espuma, supresores de espuma, tintes, perfume, inhibidores de manchas de taninos, blanqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de suciedad, agentes anticorrosión, inhibidores o estabilizadores de enzimas, activadores de enzimas, transferasas, enzimas hidrolíticos, oxidorreductasas, agentes azulantes y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizadores.

Lavado de vajillas: La expresión "lavado de vajillas" se refiere a todas las formas de lavado de vajillas, p. ej., a mano o mediante un lavavajillas automático. El lavado de vajillas incluye, aunque sin limitación, el lavado de todas las formas de vajilla, tales como platos, tazas, vasos, cuencos, todas las formas de cubiertos, tales como cucharas, cuchillos, tenedores y utensilios de servir, así como cerámica, plásticos, tales como melamina, metales, porcelana, vidrio y acrílicos.

Composición para el lavado de vajillas: La expresión "composición para el lavado de vajillas" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar superficies duras. La presente invención no está restringida a ningún tipo particular de composición para el lavado de vajillas ni a ningún detergente en particular.

Expresión: tal como se utiliza en la presente memoria, el término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de una variante, incluyendo, aunque sin limitación, la modificación post-transcripcional, la traducción, la modificación post-traducional y la secreción.

Vector de expresión: la expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido codificante de una variante y está ligada operablemente a secuencias de control que permiten su expresión.

Limpieza de superficies duras: la expresión "limpieza de superficies duras" se define en la presente memoria como la limpieza de superficies duras, en donde las superficies duras pueden incluir suelos, mesas, paredes, techos, etc., así como las superficies de objetos duros, tales como automóviles (lavado de coches) y vajillas (lavado de vajillas). El lavado de vajillas incluye, aunque sin limitación, el lavado de platos, tazas, vasos, cuencos y utensilios, tales como cucharas, cuchillos, tenedores, utensilios de servir, cerámicas, plásticos tales como melamina, metales, porcelana, vidrio y acrílicos.

Célula huésped: la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar, con un constructo de ácido nucleico o un vector de expresión que comprenda un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula huésped" comprende cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

Rendimiento de lavado mejorado: la expresión "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente memoria como una variante de subtilasa que muestra una alteración del rendimiento de lavado respecto a la subtilasa parental (es decir, respecto a una subtilasa que presenta la misma secuencia de aminoácidos que dicha variante pero excluyendo las alteraciones en dicha variante), tal como respecto al polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, p. ej., mediante una mayor eliminación de manchas. La expresión "rendimiento de lavado" incluye el rendimiento de lavado en el lavavajillas, aunque también en el lavado de tejidos. El rendimiento de lavado puede determinarse mediante el cálculo del denominado valor de intensidad (Int) según se define en el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA, por sus siglas en inglés) para lavado automático de vajillas en el apartado de materiales y métodos en la presente memoria.

Aislado: el término "aislado" se refiere a una sustancia en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza. Entre los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas se incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluya, aunque sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que esté por lo menos parcialmente separado de uno o más o de todos los constituyentes naturales con los que está asociado naturalmente, (3) cualquier sustancia modificada de manera artificial respecto a esa sustancia tal como se encuentra en la naturaleza, o (4) cualquier sustancia modificada mediante el incremento de la cantidad de la sustancia respecto a otros componentes con los que está naturalmente asociada (p. ej., múltiples copias de un gen codificante de la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen codificante de la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

Lavado: el término "lavado" se refiere tanto al lavado doméstico como al lavado industrial y se refiere al procedimiento de tratamiento de textiles y/o tejidos con una solución que contiene una composición detergente de la presente invención. El procedimiento de lavado se puede llevar a cabo, p. ej., utilizando una lavadora doméstica o industrial, o se puede llevar a cabo a mano.

Mutante: el término "mutante" se refiere a un polinucleótido codificante de una variante.

Parental: el término "parental" se refiere a una proteasa en la que se realiza una alteración para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. De esta manera, la molécula parental es una proteasa que presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a la de dicha variante, pero no presenta las alteraciones en uno o más, p. ej., en dos o más de dichas posiciones especificadas. Se entenderá que en el presente contexto la expresión "presenta una secuencia de aminoácidos idéntica" se refiere a una identidad de secuencia de 100 %. La molécula parental puede ser un polipéptido que ocurre de forma natural (de tipo salvaje) o una variante de la misma. En una realización particular, la molécula parental es una proteasa con por lo menos 60 % de identidad, tal como por lo menos un 65 %, por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 81 %, por lo menos 82 %, por lo menos 83 %, por lo menos 84 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o 100 % de identidad respecto al polipéptido que presenta el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

Proteasa: el término "proteasa" se define en la presente memoria como un enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Incluye cualquier enzima que pertenezca al grupo de enzimas EC 3.4 (incluyendo cada una de las trece subclases de los mismos). El número EC se refiere en inglés a "Enzyme Nomenclature" (nomenclatura de enzimas), versión de 1992 del NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1 a 5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6 y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650, respectivamente.

Actividad de proteasa: la expresión "actividad de proteasa" se refiere a una actividad proteolítica (EC 3.4). Las proteasas de la invención son endopeptidasas (EC 3.4.21). Existen varios tipos de actividad de proteasa: Los tres tipos principales de actividad son: tipo tripsina, en el que se realiza un corte de sustratos de amida después de Arg o Lys en P1; de tipo quimotripsina, en el que el corte se realiza después de uno de los aminoácidos hidrofóbicos en P1; y tipo elastasa, con corte después de una Ala en P1. Para los fines de la presente invención, la actividad de la proteasa se determina de acuerdo con el procedimiento descrito en el apartado de "Materiales y métodos", posteriormente. Las variantes de subtilasa de la presente invención presentan por lo menos 20 %, p. ej., por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % y por lo menos 100 % de la actividad de proteasa del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

Identidad de secuencia: el grado de relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia". Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utilizó como el porcentaje de identidad y se calculó de la siguiente manera:

(Identical Residues x 100)/(Length of Alignment- Total Number of Gaps in Alignment)

Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970,supra)tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al.,2000,supra),preferentemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se utilizó como el porcentaje de identidad y se calculó de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación)

Estabilidad: El término "estabilidad" incluye la estabilidad de almacenamiento y la estabilidad durante el uso, por ejemplo, durante un procedimiento de lavado (estabilidad en el lavado) y refleja la estabilidad de la variante de subtilasa según la invención en función del tiempo, p. ej., cuánto de la actividad se retiene cuando la proteasa se mantiene en solución, en particular en una solución detergente. La estabilidad se ve influenciada por muchos factores, p. ej., el pH, la temperatura, la composición detergente, p. ej., la cantidad de agentes complejantes, surfactantes, etc. La estabilidad de la proteasa puede medirse utilizando el "ensayo de estabilidad", tal como se describe en el apartado de Materiales y métodos de la presente memoria. La expresión "estabilidad mejorada" o "estabilidad incrementada" se define en la presente memoria como una proteasa variante que muestra una estabilidad aumentada en soluciones, respecto a la estabilidad de la proteasa original. Las expresiones "estabilidad mejorada" y "estabilidad aumentada" incluyen "estabilidad química mejorada", "estabilidad del detergente" o "estabilidad mejorada del detergente".

La expresión "estabilidad química mejorada" se define en la presente memoria como un enzima variante que muestra retención de la actividad enzimática después de un período de incubación en presencia de un compuesto químico o químicos, ya sea de origen natural o sintético, que reduce la actividad enzimática del enzima parental. La mejora de la estabilidad química también puede resultar en que las variantes sean más capaces de catalizar una reacción en presencia de dichos compuestos químicos. En un aspecto particular de la invención, la estabilidad química mejorada es una estabilidad mejorada en un detergente, en particular en un detergente líquido. La expresión "estabilidad del detergente" o "estabilidad mejorada del detergente" se refiere en particular a una estabilidad mejorada de la actividad de la proteasa cuando una variante de proteasa de la presente invención se mezcla en una formulación de detergente líquido, especialmente en una formulación de detergente líquido según la Tabla 1 y después se almacena a temperaturas de entre 15 °C y 50 °C, por ejemplo, de 20 °C, 30 °C o 40 °C.

La expresión "actividad térmica mejorada" se refiere a una variante que muestra un perfil de actividad dependiente de la temperatura alterado a una temperatura específica en relación con el perfil de actividad dependiente de la temperatura de la molécula parental o en relación con una proteasa de SEQ ID NO: 3. El valor de actividad térmica proporciona una medida de la eficiencia de la variante en la mejora de la catálisis de una reacción de hidrólisis en una gama de temperaturas. Una variante más termoactiva conducirá a un incremento de la potenciación de la tasa de hidrólisis de un sustrato por una composición enzimática, disminuyendo de esta manera el tiempo requerido y/o reduciendo la concentración de enzima necesaria para la actividad. Alternativamente, una variante con una actividad térmica reducida mejorará una reacción enzimática a una temperatura inferior a la temperatura óptima de la molécula parental definida por el perfil de actividad dependiente de la temperatura de la molécula parental.

Condiciones de astringencia: las diferentes condiciones de astringencia se definen de la siguiente manera.

La expresión "condiciones de astringencia muy baja" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5xSSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 2x SSC, SDS al 0,2 % a 60 °C.

La expresión "condiciones de astringencia baja" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 1x SSC, SDS al 0,2 % a 60 °C.

La expresión "condiciones de astringencia intermedia" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 1x SSC, SDS al 0,2 % a 65 °C.

La expresión "condiciones de astringencia intermedia-alta" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 0.5X SSC, SDS al 0,2 % a 65 °C.

La expresión "condiciones de astringencia alta" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 0.3X SSC, SDS al 0,2 % a 65 °C.

La expresión "condiciones de astringencia muy alta" se refiere a sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSP<e>, SDS al 0,3 %, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado y formamida al 35 %, siguiendo procedimientos estándares de transferencia southern durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos utilizando 0.15X SSC, SDS al 0,2 % a 65 °C.

Variante sustancialmente pura: la expresión "variante sustancialmente pura" se refiere a una preparación que contiene como máximo 10 %, como máximo 8 %, como máximo 6 %, como máximo 5 %, como máximo 4 %, como máximo 3 %, como máximo 2 %, como máximo 1 % y como máximo 0,5 % en peso de otro material polipeptídico con el que está asociada de forma nativa o recombinante. Preferentemente, la variante es por lo menos 92 % pura, p. ej., por lo menos 94 % pura, por lo menos 95 % pura, por lo menos 96 % pura, por lo menos 97 % pura, por lo menos 98 % pura, por lo menos 99 %, por lo menos 99,5 % pura, y 100 % pura en peso del material total de polipéptidos presente en la preparación. Las variantes de la presente invención se encuentran preferentemente en una forma sustancialmente pura. Lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la preparación de la variante mediante métodos recombinantes bien conocidos o mediante métodos de purificación clásicos.

Variante: el término "variante" se refiere a un polipéptido que presenta actividad de proteasa y que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o eliminación, en una o más (p. ej., varias) posiciones. El término "sustitución" se refiere a reemplazar el aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; "deleción" se refiere a la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; e "inserción" se refiere a añadir uno o más (p. ej.. varios) aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos cotiguos e inmediatamente posteriores al aminoácido que ocupa una posición.

Rendimiento de lavado: La expresión "rendimiento de lavado" se utiliza como la capacidad de un enzima de eliminar manchas presentes en el objeto que se va a limpiar durante, p. ej., el lavado, tal como el lavado de tejidos o la limpieza de superficies duras. La mejora del rendimiento de lavado puede cuantificarse mediante el cálculo del denominado valor de intensidad (Int) definido en el ensayo AMSA, tal como se describe en el apartado de Materiales y métodos.

Subtilasa de tipo salvaje: La expresión "subtilasa de tipo salvaje" se refiere a una proteasa expresada por un organismo natural, tal como una bacteria, arqueobacteria, levadura, hongo, planta o animal que se encuentra naturalmente. Un ejemplo de una subtilasa de tipo salvaje es BLAP, es decir, la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

Convenciones para la designación de variantes

Para los fines de la presente invención, el polipéptido BPN' maduro dado a conocer en SEQ ID NO: 1 se utiliza para determinar el residuo aminoácido correspondiente en otra proteasa. La secuencia de aminoácidos de otra proteasa está alineada con el polipéptido maduro dado a conocer en SEQ ID NO: 1, y basado en la alineación, el número de posición de aminoácido correspondiente a cualquier residuo aminoácido en el polipéptido maduro dado a conocer en SEQ ID NO: 1 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch tal como está implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite), preferentemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62).

La identificación del residuo aminoácido correspondiente en otra proteasa se puede determinar mediante una alineación de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando varios programas informáticos, incluyendo, aunque sin limitación, MUSCLE (comparación de secuencias múltiples por expectativa logarítmica; versión 3.5 o posterior), MAFFT (versión 6.857 o posterior) y EMBOSS EMMA utilizando ClustalW (1.83 o posterior), utilizando sus parámetros predeterminados respectivos.

En el caso de que el otro enzima se haya desviado del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de tal manera que la comparación tradicional basada en secuencias no pueda detectar su relación, se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede conseguir una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias (perfiles) de polipéptidos para la búsqueda en bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un procedimiento iterativo de búsqueda en base de datos y es capaz de detectar homólogos remotos. Se puede conseguir una sensibilidad todavía mayor si la familia o superfamilia del polipéptido presenta uno o más representantes en las bases de datos de estructuras proteicas. Algunos programas como GenTHREADER utilizan información de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solvatación) como entrada para una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia problema. De manera similar, el método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones pueden utilizarse, a su vez, para generar modelos de homología para el polipéptido, y tales modelos pueden evaluarse para precisión utilizando una variedad de herramientas desarrolladas con ese fin.

Para proteínas de estructura conocida, existen varias herramientas y recursos disponibles para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de proteínas SCOP han sido alineadas estructuralmente, y esas alineaciones son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o más estructuras de proteínas utilizando una variedad de algoritmos, tales como la matriz de alineación de distancias o la extensión combinatoria, y la implementación de estos algoritmos también se puede utilizar para realizar búsquedas en bases de datos de estructuras, de una estructura de interés con el fin de encontrar posibles homólogos estructurales.

En la descripción de las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita posteriormente se adapta para facilitar la referencia. Se utiliza la abreviatura de aminoácido de una letra o tres letras aceptada por la IUPAC.

SustitucionesPara una sustitución de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. De acuerdo con lo anterior, la sustitución de treonina en la posición 226 por alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan por signos de adición ("+"), p. ej., "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", que representan las sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

DelecionesPara una deleción de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: Ácido amino original, posición, *. De acuerdo con lo anterior, la deleción de glicina en la posición 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones múltiples se separan por marcas de adición ("+"), p. ej., "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

Inserciones:La inserción de un residuo aminoácido adicional, tal como, p. ej., lisina después de G195 puede indicarse como: Gly195GlyLys o G195GK. Alternativamente, la inserción de un residuo aminoácido adicional, tal como, lisina después de G195 puede indicarse como: *195aL. En el caso de que se inserte más de un residuo aminoácido, tal como, p. ej., Lys y Ala después de G195, esto puede indicarse como: Gly195GlyLysAla o G195GKA. En tales casos, el residuo o residuos de aminoácidos insertados también pueden numerarse mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del residuo aminoácido que precede al residuo o residuos aminoácidos insertados, en el presente ejemplo: *195aK *195bA. En el ejemplo anterior, de esta manera, las secuencias 194 a 196 serían:

194195 196

Savinasa A - G - L

194195195a 195b 196

Variante A -G -K -A -L

En los casos en que una sustitución y una inserción ocurren en la misma posición, esto puede indicarse como S99SD+S99A o, abreviadamente, S99AD. La misma modificación también puede indicarse como S99A *99aD.

En los casos en los que se inserta un residuo aminoácido idéntico al residuo aminoácido existente, está claro que surge degeneración en la nomenclatura. Si, por ejemplo, se inserta una glicina después de la glicina en el ejemplo anterior, esto se indicaría como G195GG o *195aGbG. El mismo cambio real podría indicarse igualmente como A194AG o *194aG para el cambio desde:

194195 196

Savinasa A - G - L

Hasta:

194195195a 196

Variante A - G - G - L

194194a 195196

Estos casos resultarán evidentes para el experto en la materia y la indicación G195GG y las indicaciones correspondientes para este tipo de inserciones de esta manera están destinadas a comprender tales indicaciones degeneradas equivalentes.

Alteraciones múltiples:las variantes que comprenden múltiples alteraciones se separan mediante signos de adición ("+"), p. ej., "Arg170Tyr+Gly195Glu" o "R170Y+G195E", que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente. Alternativamente, múltiples alteraciones pueden separarse por un espacio o una coma, p. ej., A170Y G195E o A170Y, G195E respectivamente.

Diferentes alteraciones:en donde se pueden introducir diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones se separan por una coma, p. ej., "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. De esta manera, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg 170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" y "Tyr167 Ala+Arg 170Ala".

Alternativamente, diferentes alteraciones o sustituciones opcionales pueden indicarse entre corchetes, p. ej. Arg170 [Tyr, Glu] o Arg170{Tyr, Glu}, o en forma abreviada, R170 [Y,E] o R170 {Y, E}.

Numeración de posiciones/residuos aminoácidos

Si no se menciona nada más, la numeración de aminoácidos utilizada en la presente memoria corresponde a la de la secuencia de la subtilasa BPN' (BASBPN). Para una descripción adicional de la secuencia BPN', ver SEQ NO: 1 o Siezen et al., Protein Eng. 4 (1991) 719-737.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden variantes de subtilasa que presentan una estabilidad mejorada y/o un rendimiento de lavado mejorado en detergentes líquidos. Preferentemente, la variante de subtilasa también presenta un buen rendimiento de lavado; más preferentemente la variante presenta un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la subtilasa parental, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Siempre que se mencionen las expresiones "una o más variantes" o "una o más variantes de subtilasa" más adelante, se refieren a composiciones detergentes que comprenden dicha variante o variantes de proteasa.

La subtilasa parental puede ser en principio cualquier subtilasa que ocurra naturalmente o puede ser una subtilasa modificada, generada mediante métodos conocidos de la técnica, tales como la preparación de híbridos o de dos o más subtilasas individuales, o mediante la sustitución, deleción o inserción de uno o más residuos aminoácidos en una subtilasa dada.

Muchas subtilasas presentan un historial comprobado de buen rendimiento de lavado y hay una abundancia de publicaciones que describen tales subtilasas y su uso en procedimientos de lavado de tejidos o limpieza; sin embargo, para la utilización en detergentes, también es importante que las subtilasas presenten una estabilidad satisfactoria en composiciones detergentes, tal como en detergentes líquidos. Resulta preferente utilizar una subtilasa parental que presente un buen rendimiento de lavado para proporcionar variantes de tales subtilasas que presenten una estabilidad mejorada en detergentes líquidos.

Una subtilasa parental preferente que forma parte de la composición detergente de la invención es la proteasa BLAP que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, o una subtilasa que presenta por lo menos 60%, p. ej., por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 2. La subtilasa parental preferente puede ser una subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, en la que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos han sido modificados en comparación con SEQ ID NO: 2, y en la que cada modificación es independientemente una sustitución de un residuo aminoácido por otro residuo aminoácido, una deleción de un residuo aminoácido o una inserción de un residuo aminoácido.

En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 2. En otra realización, la molécula parental es una variante alélica del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

Una subtilasa parental preferente comprendida en la composición detergente de la invención es la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 con una sustitución del residuo arginina en la posición 101 por un residuo de ácido glutámico (R101E). La secuencia de dicha subtilasa preferente se muestra en SEQ ID NO: 3.

Otra subtilasa parental preferente comprendida en la composición detergente según la invención es la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, o una subtilasa que presenta por lo menos 60%, p. ej., por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 91 %, por lo menos 92 %, por lo menos 93 %, por lo menos 94 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, por lo menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, la molécula parental comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 269 de la SEQ ID NO: 3. En otra realización, la molécula parental es una variante alélica del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3.

La subtilasa parental preferente puede ser una subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, en la que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos han sido modificados respecto a la SEQ ID NO: 3, y en la que cada modificación es independientemente una sustitución de un residuo aminoácido por otro residuo aminoácido, una deleción de un residuo aminoácido o una inserción de un residuo aminoácido.

Entre las composiciones detergentes adicionales según la invención se incluyen variantes de subtilasa que presentan por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, las cuales comprenden la sustitución P129D, en las que las posiciones están numeradas de acuerdo con SEQ ID NO: 1.

En una realización preferente, las composiciones detergentes según la invención comprenden variantes de subtilasa que presentan tanto una estabilidad mejorada en detergentes líquidos como un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia SEQ ID NO: 3. Entre los ejemplos de tales subtilasas preferentes de la presente realización se incluyen variantes de subtilasa que presentan por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3 y que comprenden la sustitución P129D.

Las variantes pueden presentar otras sustituciones, p. ej., sustituciones conocidas de la técnica que confieren una propiedad beneficiosa particular a las variantes de subtilasa. Existen abundantes sustituciones en subtilasas conocidas de la técnica y se encuentra contemplado que tales sustituciones conocidas puedan utilizarse en la presente invención con el fin de proporcionar tales efectos beneficiosos conocidos a las variantes comprendidas en las composiciones detergentes de la presente invención. Las variantes de subtilasa de la invención pueden comprender una o más sustituciones adicionales que pueden utilizarse en la presente invención con el fin de proporcionar efectos beneficiosos adicionales y/o mejorar un efecto existente, tal como la estabilidad y el rendimiento de lavado.

Entre las mutaciones adicionales preferentes se incluyen una o más de las siguientes sustituciones: V4I, N76D, V104T, N128Q, S141H, R145H, A194P, G195E, V205I, N218Q, A228V, N238E, o S265H.

Entre las mutaciones adicionales podrían incluirse S256D; L262E; Q137H; S3T; R45E,D; P55N; T58W,Y,L; Q59D,M,N,T; G61D,R; S87E; G97S; A98D,E,R; S106A,W; N117E; H120V,D,K,N; S124M; E136Q; S143W; S161T; S163A,G; Y171L; A172S; N185Q; V199M; Y209W; M222Q; N238H; N261T; L262N,Q,D.

Los ejemplos preferentes particulares de composiciones detergentes según la invención comprenden variantes de subtilasa que presentan una estabilidad mejorada y/o un rendimiento de lavado mejorado en detergente líquido en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 que incluyen variantes que comprenden las secuencias de aminoácidos:

SEQ ID NO: 3 P129D.

Las variantes de subtilasa comprendidas en las composiciones detergentes de la presente invención presentan una estabilidad mejorada en detergente líquido en comparación con el enzima parental; preferentemente, las variantes presentan una estabilidad mejorada en detergente líquido en comparación con la proteasa que presenta SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

Como ejemplos de variantes preferentes que presentan una estabilidad mejorada en detergente líquido y un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el enzima parental, se pueden mencionar:

SEQ ID NO: 3 P129D.

Estas variantes preferentes presentan una estabilidad mejorada, tal como estabilidad de detergente y/o un rendimiento de lavado mejorado o comparable al de la subtilasa parental. A este respecto, se entiende por rendimiento de lavado mejorado que el rendimiento de lavado de la variante es superior sobre por lo menos una mancha al rendimiento de lavado de la subtilasa parental, donde el rendimiento de lavado se determina utilizando un ensayo de rendimiento de lavado adecuado en una composición detergente dada bajo condiciones adecuadas.

En una realización preferente, el rendimiento de lavado mejorado se mide utilizando el ensayo AMSA, p. ej., tal como se da a conocer en el apartado de Materiales y métodos de la presente solicitud.

El rendimiento de lavado de la variante es preferentemente por lo menos 1 unidad más alto que el rendimiento de lavado de la subtilasa parental, preferentemente por lo menos 2 unidades más alto, tal como por lo menos 3 unidades más alto, tal como por lo menos 4 unidades más alto, tal como por lo menos 5 unidades más alto, tal como por lo menos 6 unidades más alto, tal como por lo menos 7 unidades más alto, tal como por lo menos 8 unidades más alto, tal como por lo menos 9 unidades más alto.

Las variantes de subtilasa pueden comprender, además, una o más alteraciones adicionales en una o más (p. ej., varias) otras posiciones, seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones: 3, 4, 9, 12, 14, 15, 40, 43, 68, 72, 79, 86, 88, 92, 98, 99, 101, 120, 146, 183, 184, 188, 194, 216, 218, 224, 228, 236, 245, 255, 261, 267 y 270, preferentemente las posiciones 9, 15, 68 y/o 120 (numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 2). Resultará evidente para el experto en la materia que si una posición ya ha sido alterada una vez, no será alterada una segunda vez. En una realización preferente, la alteración en cualquiera de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 3, 4, 9, 12, 14, 15, 40, 43, 68, 72, 79, 86, 88, 92, 98, 99, 101, 120, 146, 183, 184, 188, 194, 216, 218, 224, 228, 236, 245, 255, 261, 267 y 270 es una sustitución. En una realización más preferente, la variante de subtilasa comprende, además, una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 3{D, E, L}, 4I, 9{H, K, R, G}, 12{D, E}, 14T, 15{G, M, S, T}, 40{A, G, M, S, T}, 43{D, E}, 63G, 68{A, G, I, L, M, S, T}, 72{V, L}, N76{D, E}, 79T, 86H, 88V, 92S, 98T, 99{E, T, A, G, M, D}, 101L, 120 {I, N}, 146S, 183{E, D}, 184{E, D}, 188G, 194P, 216{D, E}, 218{E, D}, 224{S, A, T, G, M}, 228T, 236D, 245{H, K, R}, 255{D, E}, 261{D, E}, 267{I, L, V} y/o 270{G, M, S, T} (numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 2). En una realización todavía más preferente, la variante de subtilasa comprende, además, una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S3{D, E, L}, V4I, S9{H, K, R, G}, Q12{D, E}, P14T, A15{G, M, S, T}, P40{A, G, M, S, T}, N43{D, E}, V68{A, G, I, L, M, S, T}, I72{V, L}, N76{D, E}, I79T, P86H, A88V, A92S, A98T, S99{E, T, A, G, M, D}, S101L, H120{I, N}, G146S, N183{E, D}, N184{E, D}, S188G, A194P, S216{D, E}, N218{E, D}, T224{S, A, T, G, M}, A228T, S236D, Q245{H, K, R}, T255{D, E}, N261{D, E}, L267{I, L, V} y/o 270{G, M, S, T} en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o un polipéptido que presenta por lo menos 60 %, preferentemente por lo menos 70 %, preferentemente por lo menos 80 %, preferentemente por lo menos 90 %, preferentemente por lo menos 95 % de identidad de secuencia, en donde cada posición corresponde a la posición correspondiente del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

Los cambios en los aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad de la proteína; pequeñas deleciones, habitualmente de 1 a 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un pequeño péptido conector de hasta 20 a 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación mediante modificación de la carga neta u otra función, tal como un tramo polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Se encuentran ejemplos de sustituciones conservadoras en los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas de la técnica y se describen en, por ejemplo, H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en: The Proteins, Academic Press, New York. Las sustituciones habituales son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que alteran las propiedades físicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, modificar el pH óptimo, y similares.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos de la técnica, tal como la mutagénesis dirigida a sitio o la mutagénesis por escaneo de alaninas. En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo para actividad de proteasa para identificar los residuos aminoácidos que resultan críticos para la actividad de la molécula. El sitio activo del enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, según se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el etiquetado por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos putativos del sitio de contacto. Para BPN' (SEQ ID NO: 1) la tríada catalítica que comprende los aminoácidos S221, H64 y D32 resulta esencial para la actividad de proteasa del enzima.

Las variantes de subtilasa pueden consistir en 150 a 350, p. ej., 175 a 330, 200 a 310, 220 a 300, 240 a 290, 260 a 280 o 269, 270, 271,272, 273, 274 o 275 aminoácidos.

En una realización, la variante de subtilasa presenta un rendimiento de lavado mejorado. En otra realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada, preferentemente una estabilidad mejorada durante el lavado.

En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en detergente líquido en comparación con el enzima parental, en donde la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad", tal como se describe en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos en la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con la del polipéptido de SEQ ID NO: 2, en el que la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad" tal como se describe en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con la del polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad" tal como se describe en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria.

En una realización, la variante de subtilasa presenta un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el enzima parental, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el Ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para el lavado automático de vajillas, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el del polipéptido de SEQ ID NO: 2, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el Ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para lavavajillas automático, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, en donde se mide el rendimiento del lavado

SEQ ID NO: 3 T58L+S106A

SEQ ID NO: 3 T58L+A228V

SEQ ID NO: 3 S3T+T58L

SEQ ID NO: 3 T58L+S156D

SEQ ID NO: 3 T58L+Y91H

SEQ ID NO: 3 T58L+H120D

SEQ ID NO: 3 T58L+S163G

SEQ ID NO: 3 S163G+N261D

SEQ ID NO: 3 T58L+N261D

SEQ ID NO: 3 T58L+N76D

SEQ ID NO: 3 S3T+N76D+H120D

SEQ ID NO: 3 S3T+N76D+A228V

SEQ ID NO: 3 S3T+N76D+S156D

SEQ ID NO: 3 S3T+ N76D+ Y209W

SEQ ID NO: 3 S3T+ N76D Y209W V244T

SEQ ID NO: 3 N76D H120D

SEQ ID NO: 3 N76D S156D

SEQ ID NO: 3 H120D S156D

SEQ ID NO 3 R45E+L262E

SEQ ID NO 3 Q59D+G61D

SEQ ID NO 3 S87E+L262E

SEQ ID NO 3 G61D+L262E

SEQ ID NO 3 Q59D+L262E

SEQ ID NO 3 R45E+Q59D

SEQ ID NO 3 Q59D+S156D

SEQ ID NO 3 S156D+L262E

SEQ ID NO 3 S163G+N238E+L262E

SEQ ID NO 3 S3T+V4I+S163G+N261D

SEQ ID NO 3 H120D+S163G+N261D

SEQ ID NO 3 Y91H+N117H+N238H

SEQ ID NO 3 T58L+S163G+N261D

SEQ ID NO 3 S3T+V4I+S163G+N261D

SEQ ID NO 3 S87E+S163G+L262E

SEQ ID NO 3 S156D+S163G+L262E

SEQ ID NO 3 T58LS163G+N261D

SEQ ID NO 3 S156DS163G+L262E

SEQ ID NO 3 S3T+N76D+Y209W+N261D+L262E

Estas variantes preferentes presentan una estabilidad mejorada, tal como la estabilidad del detergente y/o un rendimiento de lavado mejorado o comparable con la subtilasa parental. A este respecto, se entiende por "rendimiento de lavado mejorado" que el rendimiento de lavado de la variante es superior sobre por lo menos una mancha al rendimiento de lavado de la subtilasa parental, en donde el rendimiento de lavado se determina utilizando un ensayo de rendimiento de lavado adecuado en una composición detergente dada bajo condiciones adecuadas.

En una realización preferente, el rendimiento de lavado mejorado se mide utilizando el ensayo AMSA, p. ej., tal como se da a conocer en el apartado de Métodos y materiales de la presente solicitud.

El rendimiento de lavado de la variante es preferentemente por lo menos 1 unidad superior al rendimiento de lavado de la subtilasa parental, preferentemente por lo menos 2 unidades superior, tal como por lo menos 3 unidades superior, tal como por lo menos 4 unidades superior, tal como por lo menos 5 unidades superior, tal como por lo menos 6 unidades superior, tal como por lo menos 7 unidades superior, tal como por lo menos 8 unidades superior, tal como por lo menos 9 unidades superior.

Las variantes de subtilasa pueden comprender, además, una o más alteraciones adicionales en una o más (p. ej., varias) otras posiciones, seleccionadas del grupo que consiste en las posiciones: 3, 4, 9, 12, 14, 15, 40, 43, 68, 72, 79, 86, 88, 92, 98, 99, 101, 120, 146, 183, 184, 188, 194, 216, 218, 224, 228, 236, 245, 255, 261, 267 y 270, preferentemente las posiciones 9, 15, 68 y/o 120 (numeración de acuerdo con SEQ ID NO: 2). El experto en la materia entenderá que si una posición ya ha sido alterada una vez, no será alterada una segunda vez. En una realización preferente, la alteración en cualquiera de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 3, 4, 9, 12, 14, 15, 40, 43, 68, 72, 79, 86, 88, 92, 98, 99, 101, 120, 146, 183, 184, 188, 194, 216, 218, 224, 228, 236, 245, 255, 261, 267 y 270 es una sustitución. En una realización más preferente, la variante de subtilasa comprende, además, una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en 3{D, E, L}, 4I, 9{H, K, R, G}, 12{D, E}, 14T, 15{G, M, S, T}, 40{A, G, M, S, T}, 43{D, E}, 63G, 68{A, G, I, L, M, S, T}, 72{V, L}, N76{D, E}, 79T, 86H, 88V, 92S, 98T, 99{E, T, A, G, M, D}, 101L, 120{I, N}, 146S, 183{E, D}, 184{E, D}, 188G, 194P, 216{D, E}, 218{E, D}, 224{S, A, T, G, M}, 228T, 236D, 245{H, K, R}, 255{D, E}, 261{D, E}, 267{I, L, V} y/o 270{G, M, S, T} (numeración según SEQ ID NO: 2). En una realización todavía más preferente, la variante de subtilasa comprende, además, una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S3{D, E, L}, V4I, S9{H, K, R, G}, Q12{D, E}, P14T, A15{G, M, S, T}, P40{A, G, M, S, T}, N43{D, E}, V68{A, G, I, L, M, S, T}, I72{V, L}, N76{D, E}, I79T, P86H, A88V, A92S, A98T, S99{E, T, A, G, M, D}, S101L, H120{I, N}, G146S, N183{E, D}, N184{E, D}, S188G, A194P, S216{D, E}, N218{E, D}, T224{S, A, T, G, M}, A228T, S236D, Q245{H, K, R}, T255{D, E}, N261{D, E}, L267{I, L, V} y/o 270{G, M, S, T} en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3, o un polipéptido que presenta por lo menos 60 %, preferentemente por lo menos 70 %, preferentemente por lo menos 80 %, preferentemente por lo menos 90 %, preferentemente por lo menos 95 % de identidad de secuencia con ella, en donde cada posición corresponde a la posición correspondiente del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1.

Los cambios en los aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadores que no afectan significativamente el plegamiento y/o la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de 1 a 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un pequeño péptido de enlace de hasta 20 a 25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación al modificar la carga neta u otra función, tal como un segmento de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Los ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas de la técnica y se describen, por ejemplo, en H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en: The Proteins, Academic Press, New York. Son sustituciones habituales, Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Alternativamente, los cambios en los aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos resultan alteradas. Por ejemplo, los cambios en los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio o la mutagénesis por escaneo de alaninas. En esta última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo para actividad de proteasa a fin de identificar los residuos aminoácidos que resultan críticos para la actividad de la molécula. El sitio activo del enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el etiquetado por fotoafinidad, junto con la mutación de los aminoácidos putativos del sitio de contacto. Para BPN' (SEQ ID NO: 1), la tríada catalítica que comprende los aminoácidos S221, H64 y D32 resulta esencial para la actividad de proteasa del enzima.

Según una realización y/o según cualquiera de las realizaciones anteriores, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa que presenta por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 1, y donde la variante presenta una unión reducida a celulosa en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Una realización se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa que presenta por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 1, y en donde la variante presenta una unión reducida a celulosa en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y en donde la variante comprende una sustitución de un residuo aminoácido cargado positivamente en la superficie de la proteasa por un residuo neutro o cargado negativamente; o un residuo neutro en la superficie de la proteasa es sustituido por un residuo cargado negativamente. Según una realización o cualquiera de las realizaciones anteriores, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa con por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 1, y en donde la variante presenta una unión reducida a celulosa en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y/o donde la variante comprende una sustitución de un residuo aminoácido cargado positivamente en la superficie de la proteasa por un residuo neutro o cargado negativamente; o un residuo neutro en la superficie de la proteasa es sustituido por un residuo cargado negativamente en donde la variante de subtilasa comprende una sustitución seleccionada del grupo que consiste en V4D, E, I, R10N, Q, D, E, S, H17D, K27S, N, Q, E, D, N43E, I44V, R45E, D, Q, N, G46D, S49N, D, P52E, G53D, E, Q59D, G61D, N62D, L75D, N76D, I79D, S87E, G97D, A98E, *103aE, I104T, N117E, H120D, E136K, Q, S156D, R170E, Q, N, D, S, N185D, G195E, N218A, K235L, W, N, Q, E, S, K237N, Q, D, E, S, N238D, E, V244D, R246Q, E, D, R247S, E, Q, D, K251S, D, Q, E, N, N261D, L262D, E y S265H, preferentemente las sustituciones se seleccionan de N117E, S156D, N238E, N261D y L262E y preferentemente la variante comprende, además, una sustitución seleccionada de: S3T, N128Q, Q137H, S141H, R145H, S163G, A194P, V199M, V205I, N218Q o A228V. Según una realización y/o según cualquiera de las realizaciones anteriores, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa con por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 1, y en donde la variante presenta una unión reducida a celulosa en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y donde la variante de subtilasa que comprende, además, sustituciones seleccionadas de N117E+S3T, S156D+S3T, N238E+S3T, N261D+S3T, L262E+S3T, N117E+N128Q, S156D+N128Q, N238E+N128Q, N261D+N128Q, L262E+N128Q, N117E+Q137H, S156D+Q137H, N238E+Q137H, N261D+Q137H, L262E+Q137H, N117E+S141H, S156D+S141H, N238E+S141H, N261D+S141H, L262E+S141H, N117E+R145H, S156D+R145H, N238E+R145H, N261D+R145H, L262E+R145H, N117E+S163G, S156D+S163G, N238E+S163G, N261D+S163G, L262E+S163G, N117E+A194P, S156D+A194P, N238E+A194P, N261D+A194P, L262E+A194P, N117E+V199M, S156D+V199M, N238E+V199M, N261D+V199M, L262E+V199M, N117E+V205I, S156D+V205I, N238E+V205I, N261D+V205I, L262E+V205I, N117E+N218Q, S156D+N218Q, N238E+N218Q, N261D+N218Q, L262E+N218Q, N117E+A228V, S156D+A228V, N238E+A228V, N261D+A228V y L262E+A228V. Según una realización y/o según cualquiera de las realizaciones anteriores, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una variante de subtilasa con por lo menos 90 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3, en donde la variante presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición correspondiente a la posición 101 de SEQ ID NO: 1, y en donde la variante presenta una unión reducida a celulosa en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y en donde la variante de subtilasa comprende, además, sustituciones seleccionadas de:

SEQ ID NO: 3 V4D,E,I

SEQ ID NO: 3 R10N,Q,D,E,S,

SEQ ID NO: 3 H17D

SEQ ID NO: 3 K27S,N,Q,E,D,

SEQ ID NO: 3 R45E,D,Q,N,

SEQ ID NO: 3 G53D

SEQ ID NO: 3 Q59D,

SEQ ID NO: 3 G61D

SEQ ID NO: 3 L75D

SEQ ID NO: 3 N76D

SEQ ID NO: 3 I79D

SEQ ID NO: 3 S87E

SEQ ID NO: 3 G97D,

SEQ ID NO: 3 A98E

SEQ ID NO: 3 *103aE,

SEQ ID NO:3 N117E,

SEQ ID NO:3 H120D,

SEQ ID NO:3 E136K,Q,

SEQ ID NO.3 S156D,

SEQ ID NO: 3 R170E,Q,N,D,

SEQ ID NO: 3 N185D,

SEQ ID NO: 3 G195E,

SEQ ID NO: 3 K235L,W,N,Q,E,S,

SEQ ID NO: 3 K237N,Q,D,E,S,

SEQ ID NO: 3 N238D,E,

SEQ ID NO: 3 V244D

SEQ ID NO: 3 R246Q,E,D,

SEQ ID NO: 3 R247S,E,

SEQ ID NO: 3 K251S,D,Q,E,N,

SEQ ID NO: 3 N261D,

SEQ ID NO: 3 L262D,E

SEQ ID NO: 3 S265H,

SEQ ID NO: 3 A194P G195E

SEQ ID NO: 3 G195E V199M

SEQ ID NO: 3 N76D+A228V+N261D;

SEQ ID NO: 3 N76D S163G N238E

SEQ ID NO: 3 S156D L262E

SEQ ID NO: 3 N238E L262E

SEQ ID NO: 3 S3T N76D S156D Y209W

SEQ ID NO: 3 K27Q H120D S163G N261D

SEQ ID NO: 3 V104T H120D S156D L262E

SEQ ID NO: 3 V104T S156D L262E

SEQ ID NO: 3 Q137H S141H R145H N238E L262E

SEQ ID NO: 3 S3T+V4I+A228V;

SEQ ID NO: 3 H120D S163G N261D

SEQ ID NO: 3 N76D S101E A228V L262E;

SEQ ID NO: 3 N76D Q137H S141H R145H S163G N238E

SEQ ID NO: 3 S3T N76D Q137H S141H R145H S156D Y209W

SEQ ID NO: 3 H120D Q137H S141H R145H S163G N261D

SEQ ID NO: 3 A194P+G195E+V199M+V205I;

SEQ ID NO: 3 S3T+N76D+A194P+G195E+V199M+V205I;

SEQ ID NO: 3 A228V+N261D;

SEQ ID NO: 3 N76D+A228V;

SEQ ID NO: 3 S3T+V4I+N261D;

SEQ ID NO: 3 H120D+A228V;

SEQ ID NO: 3 N76D+N261D;

SEQ ID NO: 3 A194P+G195E+V199M+V205I+A228V+N261D;

SEQ ID NO: 3 A194P+G195E+V205I+A228V; o

SEQ ID NO: 3 H120D+N261D.

Preferentemente, las variantes se seleccionan del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 3 N238E L262E

SEQ ID NO: 3 S156D L262E

SEQ ID NO: 3 S3T+V4I+A228V;

SEQ ID NO: 3 G195E V199M

SEQ ID NO: 3 H120D S163G N261D

SEQ ID NO: 3 N76D+A228V+N261D;

SEQ ID NO: 3 S3T N76D S156D Y209W

SEQ ID NO: 3 Q137H S141H R145H N238E L262E

SEQ ID NO: 3 Q137H S141H R145H S156D L262E

SEQ ID NO: 3 N76D+Q137H+S141H+R145H+ A228V+N261D;

SEQ ID NO: 3 N76D Q137H S141H R145H S163G N238E

SEQ ID NO: 3 H120D Q137H S141H R145H S163G N261D

SEQ ID NO: 3 S3T N76D Q137H S141H R145H S156D Y209W,

en donde las posiciones corresponden a las posiciones en SEQ ID NO: 1 y en donde la variante de subtilasa presenta una identidad de secuencia de por lo menos 60 %, tal como por lo menos 70 %, tal como por lo menos 80 %, tal como por lo menos 90 %, tal como por lo menos 95 %, tal como por lo menos 98 % o tal como por lo menos 99 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 3.

En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en detergente líquido en comparación con el enzima parental, en donde la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad" descrito en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos en la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, en el que la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad" descrito en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos en la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, en el que la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad" descrito en el Ejemplo 4 del apartado de Materiales y métodos en la presente memoria.

En una realización, la variante de subtilasa presenta un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el enzima parental, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para lavavajillas automático, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos en la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 2, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para lavavajillas automático, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria. En una realización, la variante de subtilasa presenta una estabilidad mejorada en comparación con el polipéptido de SEQ ID NO: 3, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para lavavajillas automático, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria.

Proteasa parental

Los enzimas que cortan los enlaces amida en los sustratos proteicos se clasifican como "proteasas", o (intercambiablemente) "peptidasas".

Serina proteasas

Una serina proteasa es un enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos, y en la que hay un residuo de serina esencial en el sitio activo.

Las serina proteasas bacterianas presentan pesos moleculares comprendidos en el intervalo de entre 20.000 y 4.,000 daltons. Resultan inhibidos por el fluorofosfato de diisopropilo. Hidrolizan ésteres terminales simples y presentan una actividad similar a la de la quimotripsina eucariótica, que también es una serina proteasa. Un término más específico, "proteasa alcalina", que cubre un subgrupo, refleja el elevado pH óptimo de algunas de las serina proteasas, que va de pH 9,0 a 11,0.

Subtilasas

Un subgrupo de serina proteasas denominado tentativamente "subtilasas" ha sido propuesto por Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 y Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. Se definen mediante el análisis de homologías de más de 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas previamente denominadas "proteasas similares a subtilisina". Una subtilisina con frecuencia se definía anteriormente como una serina proteasa producida por bacterias Gram-positivas u hongos, y según Siezen et al. actualmente es un subgrupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas, y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de varias. Para una descripción más detallada de tales subtilasas y sus secuencias de aminoácidos, se hace referencia a Siezen et al. (1997).

Subtilisinas

Un subgrupo de las subtilasas son las subtilisinas,que son serina proteasas de la familia S8, en particular de la subfamilia S8A, tal como se definen en la base de datos MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/cgibin/famsum?family=S8).

BPN' y la savinase presentan los números MEROPS S08.034 y S08.003, respectivamente.

Subtilasa parental

La expresión "subtilasa parental" describe una subtilasa definida según Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. Para más información, ver la descripción de "Subtilasas", anteriormente. Una subtilasa parental también puede ser una subtilasa aislada de una fuente natural, en la que se han realizado modificaciones posteriores (tales como una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de la cadena o cadenas laterales de aminoácidos) manteniendo la característica de una subtilasa. Además, una subtilasa parental puede ser una subtilasa que ha sido preparada mediante la técnica de "barajado de ADN" (en inglés,DNA shuffling).

Alternativamente, la expresión "subtilasa parental" puede denominarse "subtilasa de tipo salvaje". La subtilasa parental es preferentemente de los subgrupos de subtilisina. Un subgrupo de las subtilasas, I-S1 o "verdaderas" subtilisinas, comprende las subtilisinas "clásicas", tales como la subtilisina 168 (BSS168), la subtilisina BPN', la subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) y la subtilisina DY (BSSDY).

Un subgrupo adicional de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas altamente alcalinas, es reconocido por Siezen et al.(supra).Las proteasas del subgrupo I-S2 se describen como subtilisinas altamente alcalinas y comprenden enzimas tales como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S) y elastasa alcalina YaB (BSEYAB). La BPN' es la subtilisina BPN' deB. amyloliquefaciens;BPN' presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1.

Como referencia, la Tabla 1, a continuación, proporciona una lista de algunos acrónimos para diversas subtilasas mencionadas en la presente memoria. Para más acrónimos, ver Siezen et al. (1991 y 1997).

Tabla 1: Acrónimos de diversas subtilasas

(continuación)

Secuencias de subtilasa homólogas

La homología entre dos secuencias de aminoácidos se describe en el presente contexto mediante el parámetro "identidad" para los fines de la presente invención; el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch, tal como se ha descrito anteriormente. La salida de la rutina, además de la alineación de aminoácidos, es el cálculo del "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias.

Según esta descripción, es habitual que el experto en la materia identifique subtilasas homólogas adecuadas, que pueden ser modificadas según la invención.

Las variantes de subtilisina parental sustancialmente homólogas pueden presentar una o más (varias) sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos; en el presente contexto, la expresión "una o más" se utiliza de manera intercambiable con el término "varias". Estos cambios son preferentemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos tal como se ha indicado anteriormente y otras sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento tridimensional o a la actividad de la proteína o polipéptido; pequeñas eliminaciones, normalmente de entre uno y aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo metionina en el extremo amino, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20 a 25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (una etiqueta de afinidad), tal como un tramo de polihistidina, o proteína.

Aunque los cambios descritos anteriormente son preferentemente de una naturaleza menor, dichos cambios también pueden ser de una naturaleza sustantiva, tal como la fusión de polipéptidos más grandes de hasta 300 aminoácidos o más, como extensiones tanto amino- como carboxilo-terminales.

El polipéptido de SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo, puede utilizarse para diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN codificante de un progenitor de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos bien conocidos de la técnica. En particular, tales sondas pueden utilizarse para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia southern, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en la misma. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben presentar por lo menos 15, por ejemplo, por lo menos 25, por lo menos 35 o por lo menos 70 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico presenta por lo menos 100 nucleótidos de longitud, p. ej., por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 400 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos 700 nucleótidos, por lo menos 800 nucleótidos o por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas habitualmente se marcan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). Tales sondas están comprendidas en la presente invención.

Una biblioteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de tales otras cepas puede cribarse en busca de ADN que se hibrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un progenitor. El ADN genómico u otro ADN de tales otras cepas puede separarse mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede transferirse e inmovilizarse en nitrocelulosa u otro material portador adecuado.

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de una región de otro polipéptido.

La molécula parental puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el que otro polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce mediante la fusión a un polinucleótido codificante de otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen el ligado de secuencias codificantes de los polipéptidos de modo que estén en el mismo marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del mismo promotor o promotores y terminador. Los polipéptidos de fusión también pueden construirse utilizando tecnología de inteínas, en la que los polipéptidos de fusión se crean posttraducionalmente.

Un polipéptido de fusión puede comprender, además, un sitio de corte entre los dos polipéptidos. Al secretarse la proteína de fusión, se corta el sitio, liberando los dos polipéptidos.

La molécula parental puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, la expresión "obtenido de" tal como se utiliza en la presente memoria en relación con una fuente dada significa que la molécula parental codificada por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la que se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, la molécula parental se secreta extracelularmente.

La molécula parental puede ser una proteasa bacteriana. Por ejemplo, la molécula parental puede ser un polipéptido bacteriano Gram-positivo, tal como una proteasa deBacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus,o unStreptomycesproteasa, o un polipéptido bacteriano Gram-negativo como unCampylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, SalmonellaoUreaplasma.

En un aspecto, el progenitor es una proteasa deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis,oBacillus thuringiensis.

En un aspecto, la progenitora es una proteasa deBacillus amyloliquefaciens,p. ej., la proteasa de SEQ ID NO: 1 o el polipéptido maduro de la misma.

En otro aspecto, la progenitora es una proteasa deBacillus lentus,p. ej., la proteasa de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la misma.

Las cepas de dichas especies están fácilmente disponibles para el público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), and Agricultural Research Service Patent Culture Collection y Northern Regional Research Center (NRRL).

El progenitor puede identificarse y obtenerse de otras fuentes, incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., suelo, composts, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (p. ej., suelo, compost, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas de la técnica. Un polinucleótido codificante de una molécula parental puede obtenerse a continuación cribando de manera similar una biblioteca de ADN genómico o de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixta. Una vez que se ha detectado un polinucleótido codificante de una molécula parental con la sonda o sondas, se puede aislar o clonar el polinucleótido mediante la utilización de técnicas que son conocidas por el experto habitual en la materia.

Preparación de variantes

La presente invención se refiere, además, a métodos para obtener una variante de subtilasa que presenta actividad de proteasa.

Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido de la técnica, tal como la mutagénesis dirigida a sitio, la construcción de genes sintéticos, la construcción de genes semisintéticos, la mutagénesis aleatoria, el barajado, etc.

La mutagénesis dirigida a sitio es una técnica en la que se introducen una o más (p. ej., varias) mutaciones en uno o más sitios definidos en un polinucleótido codificante de la molécula parental.

La mutagénesis dirigida a sitio se puede llevar a caboin vitromediante PCR que involucra el uso de cebadores oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida a sitio también se puede llevar a caboin vitromediante mutagénesis por inserción de casete que involucra el corte por un enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido codificante de la molécula parental y el posterior ligado de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Normalmente, el enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es el mismo, permitiendo que los extremos cohesivos del plásmido y del inserto se liguen entre sí.

La mutagénesis dirigida a sitio también se puede llevar a caboin vivomediante métodos conocidos de la técnica.

Puede utilizarse cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida a sitio en la presente invención. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar variantes.

La construcción de genes sintéticos implica la síntesisin vitrode una molécula de polinucleótido diseñada para codificar para un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede llevar a cabo utilizando una serie de técnicas, tales como la tecnología multipunto basada en microchips y tecnologías similares, en las que se sintetizan y ensamblan oligonucleótidos sobre chips microfluídicos fotoprogramables.

Pueden realizarse sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de uno o múltiples aminoácidos utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o barajado, seguidos de un procedimiento de cribado relevante. Entre otros métodos que se pueden utilizar se incluyen PCR propensa a errores, exposición en fagos y mutagénesis dirigida a regiones.

Los métodos de mutagénesis/barajado se pueden combinar con métodos de cribado automatizado de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados y clonados que expresan las células huésped. Se pueden recuperar moléculas de ADN mutagenizadas codificantes de polipéptidos activos a partir de las células huésped y secuenciar rápidamente utilizando métodos estándares de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoácidos individuales en un polipéptido.

La construcción de genes semisintéticos se consigue mediante la combinación de aspectos de la construcción de genes sintéticos, y/o la mutagénesis dirigida a sitio, y/o la mutagénesis aleatoria, y/o el barajado. La construcción semisintética se caracteriza por un procedimiento que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. De esta manera, pueden sintetizarsede novoregiones definidas de los genes, mientras que otras regiones pueden amplificarse usando cebadores mutagénicos específicos de sitio, y todavía otras regiones pueden someterse a amplificación por PCR propensa a errores o no propensa a errores. A continuación, las subsecuencias polinucleotídicas pueden barajarse.

Polinucleótidos

La presente invención se refiere, además, a polinucleótidos codificantes de una variante de la presente invención.

Constructos de ácidos nucleicos

La presente invención se refiere, además, a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención, operablemente ligada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

El polinucleótido puede manipularse de diversas maneras para permitir la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido previamente a su inserción en un vector puede resultar deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas de la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por la célula huésped para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que actúan de mediadores en la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes codificantes de polipéptidos extracelulares o intracelulares, ya sean homólogos o heterólogos respecto a la célula huésped.

Son ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa deBacillus amyloliquefaciens (amyQ),del gen de alfa-amilasa deBacillus licheniformis (amyL),del gen de penicilinasa deBacillus licheniformis(penP), del gen de amilasa maltogénica deBacillus stearothermophilus (amyM),del gen de levansucrasa deBacillus subtilis (sacB),de los genesxyIAyxyIBdeBacillus subtilis,del gencryIIIAdeBacillus thuringiensis,del operónlacdeE. coli,del promotortrcdeE. coli,del gen de agarasa deStreptomyces coelicolor (dagA),y del gen de beta-lactamasa procariótica, así como del promotortac.

La secuencia de control también puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por una célula huésped para finalizar la transcripción. La secuencia de terminador está operablemente ligada al extremo 3' del polinucleótido codificante de la variante. Puede utilizarse cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped.

Los terminadores preferentes para las células huésped bacterianas se obtienen de los genes de proteasa alcalina deBacillus clausii (aprH),alfa-amilasa deBacillus licheniformis (amyL),y ARN ribosómico deEscherichia coliARN (rrnB).

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm situada cadena abajo de un promotor y cadena arriba de la secuencia codificante de un gen, lo que incrementa la expresión del gen.

Se obtienen ejemplos de regiones estabilizadoras del ARNm adecuadas a partir de un gencrylIIAdeBacillus thuringiensisy un gen SP82 deBacillus subtilis.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de un péptido de señal codificante de un péptido de señal ligado al extremo N-terminal de una variante y que dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una región codificante de péptido de señal ligada de forma natural en el mismo marco de lectura de traducción que el segmento de la región codificante de la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante del péptido de señal que es foránea respecto a la secuencia codificante. Puede ser necesario un dominio de señal de péptido foráneo en donde la secuencia codificante no contiene naturalmente una secuencia codificante de péptido de señal. Alternativamente, una secuencia codificante de péptido de señal foráneo puede simplemente sustituir la secuencia codificante del péptido de señal natural con el fin de mejorar la secreción de la variante. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante de péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de una célula huésped.

Las secuencias codificantes de péptido de señal efectivas para las células huésped bacterianas son las secuencias codificantes de péptido de señal obtenidas de los genes de la amilasa maltogénica deBacillusNCIB 11837, de subtilisina deBacillus licheniformis,de beta-lactamasa deBacillus licheniformis,de alfa-amilasa deBacillus stearothermophilus,de proteasas neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM)y deprsAdeBacillus subtilis.

La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido codificante de para un propeptido situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como "proenzima," "propolipéptido" (o "zimógeno", en algunos casos). Un propolipéptido generalmente es inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo mediante el corte catalítico o autocatalítico del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina deBacillus subtilis (aprE),proteasa neutra deBacillus subtilis (nprT),lacasa deMyceliophthora thermophila,proteinasa aspártica deRhizomucor mieheiy factor alfa deSaccharomyces cerevisiae.

En el caso de que estén presentes las secuencias tanto del péptido de señal como del propéptido, la secuencia del propéptido se encuentra situada junto al extremo N-terminal de la variante y la secuencia del péptido de señal se encuentra situada junto al extremo N-terminal de la secuencia del propéptido.

También puede resultar deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión de la variante respecto al crecimiento de la célula huésped. Son ejemplos de sistemas reguladores los que causan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Entre los sistemas regulatorios en sistemas procarióticas se incluyen los sistemas de operadorlac, tacytrp.

Vectores de expresión

La presente invención se refiere, además, a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención, un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido codificante de la variante en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse mediante la inserción del polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, en un vector adecuado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se ubica en el vector de manera que esté operablemente ligada a las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o un virus) que pueda someterse de manera conveniente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda resultar en la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se introducirá. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio que garantice su autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, una vez introducido en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en el que, o en los que, se ha integrado. Además, se puede utilizar un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o puede utilizarse un transposón.

El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la fácil selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un "marcador seleccionable" es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofía en auxótrofos, y similares.

Son ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos, genesdaldeBacillus licheniformisoBacillus subtilis,o marcadores que confieran resistencia a antibióticos, tales como ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina.

El vector contiene preferentemente uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula de manera independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido codificante de la variante o de cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una o más ubicaciones precisas en el cromosoma o cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que presenten un alto grado de identidad de secuencia respecto a la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender, además, un origen de replicación que permite al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que actúe de mediador en la replicación autónoma y funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se refiere a un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se repliquein vivo.

Son ejemplos de orígenes de replicación bacteriana los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación enE. coli,y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMI31 que permiten la replicación enBacillus.

Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula huésped para aumentar la producción de una variante. Se puede obtener un aumento del número de copia del polinucleótido mediante la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable y amplificable junto con el polinucleótido, en donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse mediante el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos indicados anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son bien conocidos por el experto en la materia.

Células huésped

La presente invención se refiere, además, a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido codificante de una variante de la presente invención, ligada operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Se introduce un constructo o vector que comprende un polinucleótido en una célula huésped para que el constructo o vector se mantenga como un integrador cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, tal como se ha indicado anteriormente. La expresión "célula huésped" comprende cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen codificante de la variante y su origen.

La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, p. ej., un procariota o un eucariota.

La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria Gram-positiva o Gram-negativa. Entre las bacterias Grampositivas se incluyen, aunque sin limitación,Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, StreptococcusyStreptomyces.Entre las bacterias Gram-negativas se incluyen, aunque sin limitación,Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, SalmonellayUreaplasma.

La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula deBacillus,incluyendo, aunque sin limitación,Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillusfirmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilisyBacillus thuringiensis.

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula deStreptococcus,incluyendo, aunque sin limitación, células deStreptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis,yStreptococcus equisubsp.Zooepidemicus.

La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula deStreptomyces,incluyendo, aunque sin limitación,Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseusyStreptomyces lividans.

La introducción de ADN en una célula deBacilluspuede llevarse a cabo mediante transformación de protoplastos, transformación de células competentes, electroporación o conjugación. La introducción de ADN en unaE. colipuede llevarse a cabo mediante transformación de protoplastos o electroporación. La introducción de ADN en unaStreptomycespuede llevarse a cabo mediante transformación de protoplastos, electroporación, conjugación o transducción. La introducción de ADN en unaPseudomonascelular puede llevarse a cabo mediante electroporación o conjugación. La introducción de ADN en una célula deStreptococcuspuede realizarse por competencia natural, transformación de protoplastos, electroporación o conjugación. Sin embargo, puede utilizarse cualquier método conocido de la técnica para introducir ADN en una célula huésped.

Métodos de producción

La presente invención se refiere, además, a métodos de producción de una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula huésped de la presente invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la variante, y (b) recuperar la variante.

Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de la variante utilizando métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse mediante cultivo en matraces de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por alimentación o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizado en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión y/o aislamiento de la variante. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno, así como sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos de la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se secreta al medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar a partir de lisados celulares.

La variante puede detectarse utilizando métodos conocidos de la técnica que son específicos para las variantes con actividad de proteasa. Entre estos métodos de detección se incluyen, aunque sin limitación, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.

La variante puede recuperarse utilizando métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, la variante puede recuperarse a partir del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales, entre los que se incluyen, aunque sin limitación, recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

La variante puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofobicidad, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción para obtener variantes sustancialmente puras.

En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se utiliza una célula huésped de la presente invención que expresa la variante como fuente de la misma.

Composiciones

En un aspecto determinado, las variantes según la invención presentan un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el enzima parental o en comparación con una proteasa que presente la misma secuencia de aminoácidos que dicha variante pero que no presenta las alteraciones en una o más de dichas posiciones especificadas o en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde el rendimiento de lavado se mide utilizando el Ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para lavavajillas automático, tal como se describe en el Ejemplo 7 del apartado de Materiales y métodos de la presente memoria.

En otro aspecto determinado, las variantes según la invención presentan un rendimiento de lavado mejorado en comparación con el enzima parental o en comparación con una proteasa que presente la misma secuencia de aminoácidos que dicha variante pero que no presente las alteraciones en una o más de dichas posiciones especificadas o en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2, en donde la estabilidad se mide utilizando el "ensayo de estabilidad durante el lavado" tal como se describe en el apartado de Materiales y métodos de la presente memoria.

De esta manera, en una realización preferente, la composición es una composición detergente, y un aspecto de la invención se refiere a la utilización de una composición detergente que comprende una variante según la invención en un procedimiento de lavado, tal como el lavado de ropa o la limpieza de superficies duras.

La elección de componentes adicionales está comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia e incluye ingredientes convencionales, incluidos los componentes no limitativos de ejemplo que se enumeran a continuación. La elección de los componentes puede incluir, para el cuidado de los tejidos, la consideración del tipo de tejido a lavar, el tipo y/o grado de suciedad, la temperatura a la que se llevará a cabo el lavado y la formulación del producto detergente. Aunque los componentes mencionados a continuación se clasifican mediante un encabezado general según una funcionalidad particular, esto no debe interpretarse como una limitación, ya que un componente puede incluir funcionalidades adicionales, tal como apreciará el experto en la materia

Enzima de la presente invención

En una realización de la presente invención, el polipéptido puede añadirse a una composición detergente en una cantidad correspondiente a 0,01 a 200 mg de proteína enzima por litro de solución de lavado, preferentemente 0,05 a 50 mg de proteína enzima por litro de solución de lavado, en particular 0,1 a 10 mg de proteína enzima por litro de solución de lavado.

Una composición para su uso en lavavajillas automáticos (LVA), por ejemplo, puede incluir entre 0,0001 % y 50 %, tal como entre 0,001 % y 30 %, tal como entre 0,01 % y 20 %, tal como entre 0,5 % y 15 % de proteína enzima en peso de la composición.

Una composición para la utilización en granulado para el lavado de tejidos, por ejemplo, puede incluir entre 0,0001 % y 50 %, tal como entre 0,001 % y 20 %, tal como entre 0,01 % y 10 %, tal como entre 0,5 % y 5 % de proteína enzima en peso de la composición.

Una composición para la utilización en líquido para el lavado de tejidos, por ejemplo, puede incluir entre 0,0001 % y 10 %, tal como entre 0,001 % y 7 %, tal como entre 0,1 % y 5 % de proteína enzima en peso de la composición.

El enzima o enzimas de la composición detergente de la invención pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizantes convencionales, p. ej., un poliol, tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado del ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado del ácido fenilborónico, tal como el ácido 4-formilfenilborónico, y la composición puede formularse tal como se describe en, por ejemplo, los documentos n.° WO 92/19709 y n.° WO 92/19708, o las variantes según la invención pueden estabilizarse utilizando aldehídos o cetonas peptídicas, tal como se describe en los documentos n.° WO 2005/105826 y n.° WO 2009/118375.

También puede incorporarse una variante de la presente invención en las formulaciones de detergente dadas a conocer en el documento n.° WO97/07202, que se incorpora como referencia en la presente memoria.

Surfactantes

La composición detergente puede comprender uno o más surfactantes, que pueden ser aniónicos y/o catiónicos y/o no iónicos y/o semipolares y/o zwiteriónicos, o una mezcla de los mismos. En una realización particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más surfactantes no iónicos y uno o más surfactantes aniónicos. El surfactante o surfactantes están presentes normalmente en un nivel de entre aproximadamente 0,1 % y 60 % en peso, tal como entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 40 %, o de entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 20 %, o de entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 10 %. El surfactante o surfactantes se seleccionan según la aplicación de limpieza deseada e incluyen cualquier surfactante o surfactantes convencionales conocidos de la técnica. Puede utilizarse cualquier surfactante conocido de la técnica para su uso en detergentes.

En el caso de que se incluya, el detergente generalmente contendrá entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 40 % en peso, tal como entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 30 %, incluyendo entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 15 %, o entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 25 % de un surfactante aniónico. Entre los ejemplos no limitativos de surfactantes aniónicos se incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, sulfonatos de alquilbenceno lineales (LAS, por sus siglas en inglés), isómeros de LAS, sulfonatos de alquilbenceno ramificados (BABS, por sus siglas en inglés), sulfonatos de fenilalcanos, sulfonatos de alfa-olefinas (AOS, por sus siglas en inglés), sulfonatos de olefinas, sulfonatos de alqueno, alquilo-2,3-diilbis(sulfatos), sulfonatos y disulfonatos de hidroxialcanos, sulfatos de alquilo (AS, por sus siglas en inglés) tales como el laurilsulfato sódico (SDS, por sus siglas en inglés), sulfatos de alcohol graso (FAS, por sus siglas en inglés), sulfatos de alcohol primario (PAS, por sus siglas en inglés), éter-sulfatos de alcohol (AES o AEOS o FES, por sus siglas en inglés, también conocidos como éter-sulfatos de alcohol etoxilado o sulfatos de éter de alcohol graso), sulfonatos de alcano secundario (SAS), sulfonatos de parafina (PS, por sus siglas en inglés), sulfonatos de éster, ésteres de glicerol de ácido graso sulfonado, ésteres metílicos de ácido graso alfa-sulfonado (alfa-SFMe o SES, por sus siglas en inglés), incluyendo sulfonato de éster metílico (MES, por sus siglas en inglés), ácido alquil- o alquenil-succínico, ácido dodecenil/tetradecenil-succínico (DTSA), derivados de ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres de ácido o jabón sulfosuccínico, y combinaciones de los mismos.

Cuando se incluye, el detergente generalmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un surfactante catiónico. Entre los ejemplos no limitativos de surfactantes catiónicos se incluyen quat de alquildimetiletanolamina (ADMEAQ, por sus siglas en inglés), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, por sus siglas en inglés), cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC, por sus siglas en inglés), y alquilbencildimetilamonio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de amonio cuaternario alcoxilados (AQA, por sus siglas en inglés), y combinaciones de los mismos.

Cuando se incluye, el detergente habitualmente contiene entre aproximadamente 0,2 % y aproximadamente 40 % en peso de un surfactante no iónico, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 30 %, en particular entre aproximadamente 1 % y aproximadamente 20 %, entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 10 %, tal como entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 5 %, o entre aproximadamente 8 % y aproximadamente 12 %. Entre los ejemplos no limitativos de surfactantes no iónicos se incluyen etoxilatos de alcohol (AE o AEO, por sus siglas en inglés), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos propoxilados (PFA, por sus siglas en inglés), alquil-ésteres de ácidos grasos alcoxilados, tales como alquil-ésteres de ácido graso etoxilado y/o propoxilado, etoxilatos de alquilfenol (APE, por sus siglas en inglés), etoxilatos de nonilfenol (NPE, por sus siglas en inglés), poliglucósidos de alquilo (APG, por sus siglas en inglés), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graso (<f>A<m>, por sus siglas en inglés), dietanolamidas de ácido graso (FADA, por sus siglas en inglés), monoetanolamidas de ácido graso etoxilado (EFAM, por sus siglas en inglés), monoetanolamidas de ácido graso propoxilado (PFAM, por sus siglas en inglés), amidas de ácidos grasos de alquilo polihidroxilados, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácido grass, FAGA, por sus siglas en inglés), así como productos disponibles bajo los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos.

Cuando se incluye, el detergente generalmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un surfactante semipolar. Entre los ejemplos no limitativos de surfactantes semipolares se incluyen óxidos de amina (AO, por sus siglas en inglés), tales como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(cocoalquil)-N,N-dimetilamina y óxido de N-(sebo-alquil)-N,N-bis(2-hidroxietil)amina, y alcanolamidas de ácido graso y alcanolamidas de ácido graso etoxilado, y combinaciones de los mismos.

Cuando se incluye, el detergente generalmente contendrá entre aproximadamente 0 % y aproximadamente 10 % en peso de un surfactante zwiteriónico. Entre los ejemplos no limitativos de surfactantes zwiteriónicos se incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína y combinaciones de los mismos.

Hidrótropos

Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofóbicos en soluciones acuosas (o, por el contrario, sustancias polares en un medio no polar). Normalmente, los hidrótropos presentan tanto un carácter hidrofílico como uno hidrofóbico (propiedades denominadas "anfifílicas", tal como se conocen en los surfactantes); sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea. Los hidrótropos no muestran una concentración crítica por encima de la cual ocurre la autoagregación, tal como se encuentra en los surfactantes y lípidos que forman micelas, láminas u otras mesofases bien definidas. Por el contrario, muchos hidrótropos muestran un proceso de agregación de tipo continuo en el que los tamaños de los agregados crecen a medida que aumenta la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fase, la estabilidad y las propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, surfactantes y polímeros. Los hidrótropos se utilizan clásicamente en diversas industrias, desde la farmacéutica, cuidado personal, alimentos hasta aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones detergentess permite, por ejemplo, formulaciones más concentradas de surfactantes (tal como en el procedimiento de compactación de detergentes líquidos mediante la eliminación de agua) sin inducir fenómenos no deseados, tales como la separación de fases o una viscosidad elevada.

El detergente puede contener entre 0 % y 5 % en peso, tal como entre aproximadamente 0,5 % y 5 %, o entre aproximadamente 3 % y 5 %, de un hidrótropo. Puede utilizarse cualquier hidrótropo conocido de la técnica para la utilización en detergentes. Entre los ejemplos no limitativos de hidrótropos se incluyen sulfonato de benceno sódico, sulfonato de p-tolueno sódico (STS, por sus siglas en inglés), sulfonato de xileno sódico (SXS, por sus siglas en inglés), sulfonato de cumeno sódico (SCS, por sus siglas en inglés), sulfonato de cimeno sódico, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoles, hidroxifenolato sódico, sulfonato de hidroxifenaleno sódico, sulfato de etilhexilo sódico y combinaciones de los mismos.

Agentes constructores y co-agentes constructores

La composición detergente puede contener entre aproximadamente 0 % y 65 % en peso, tal como entre aproximadamente 5%y 45%de un agente constructor de detergente o co-agente constructor, o una mezcla de los mismos. En un detergente de lavado de vajillas, el nivel de agente constructor habitualmente es de entre 40 % y 65 %, particularmente de entre 50 % y 65 %. El agente constructor y/o co-agente constructor puede ser particularmente un agente quelante que forma complejos solubles en agua con Ca y Mg. Puede utilizarse cualquier agente constructor y/o co-agente constructor conocido de la técnica para la utilización en detergentes para lavado de tejidos. Entre los ejemplos no limitativos de constructores se incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tales como el trifosfato sódico (STP o STPP), carbonatos tales como el carbonato sódico, silicatos solubles, tales como el metasilicato sódico, silicatos en capas (p. ej., SKS-6 de Hoechst), etanolaminas, tales como el 2-aminoetan-1-ol (MEA, por sus siglas en inglés), dietanolamina (DEA, por sus siglas en inglés, también conocida como imino-dietanol), trietanolamina (TEA, por sus siglas en inglés, también conocida como 2,2',2"-nitrilotrietanol) y carboximetil-inulina (CMI), y combinaciones de los mismos.

La composición detergente puede contener, además, entre aproximadamente 0 % y 20 % en peso, tal como entre aproximadamente 5 % y 10 % de un agente co-constructor de detergente o una mezcla del mismo. La composición detergente puede incluir un co-agente constructor solo o en combinación con un agente constructor, por ejemplo, un constructor de zeolita. Entre los ejemplos no limitativos de co-agentes constructores se incluyen homopolímeros de poliacrilato o copolímeros de los mismos, tales como el ácido poliacrílico (PAA, por sus siglas en inglés) o el copolímero de ácido acrílico/ácido maleico (PAA/PMA, por sus siglas en inglés). Entre los ejemplos no limitativos adicionales se incluyen citrato, quelantes tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico. Entre los ejemplos específicos adicionales se incluyen ácido 2,2',2"-nitrilotriacético (NTA, por sus siglas en inglés), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés), ácido dietilentriamin-pentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés), ácido imino-disuccínico (IDS, por sus siglas en inglés), ácido etilendiamín-N,N'-disuccínico (EDDS, por sus siglas en inglés), ácido metilglicinodiacético (MGDA, por sus siglas en inglés), ácido glutámico-N,N'-diacético (GLDA, por sus siglas en inglés), ácido 1-hidroxietán-1,1-difosfónico (HEDP, glutamic acid-N,N'-diacetic acid (GLDA)), ácido etilendiamín-tetra(metilén-fosfónico) (EDTMPA, por sus siglas en inglés), ácido dietilén-triamínpentakis(metanofosfónico) (DTPMPA o DTMPA, por sus siglas en inglés),ácidoN-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG, por sus siglas en inglés), ácido aspártico-N-ácido monoacético (ASMA, por sus siglas en inglés), ácido aspártico-N,N-ácido diacético (ASDA, por sus siglas en inglés), ácido aspártico-ácido N-monopropiónico (ASMP, por sus siglas en inglés), ácido imino-disuccínico (IDA, por sus siglas en inglés),ácidoN-(2-sulfometil)aspártico (SMAS, por sus siglas en inglés), ácido N-(2-sulfoetil)-aspártico (SEAS), ácido N-(2-sulfometil)glutámico (SMGl , por sus siglas en inglés), ácido N-(2-sulfoetil)glutámico (SEG<l>, por sus siglas en inglés), ácido N-metiliminodiacético (MIDA, por sus siglas en inglés), ácido a-alanina-N,N-diacético (a-ALDA, por sus siglas en inglés), ácido serina-N,N-diacético (SEDA, por sus siglas en inglés), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA, por sus siglas en inglés), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA, por sus siglas en inglés), ácido antranílico-N,N-diacético (ANDA, por sus siglas en inglés), ácido sulfanílicoácido N,N-diacético (SLDA, por sus siglas en inglés), ácido taurina-N,N-diacético (TUDA, por sus siglas en inglés) y ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA, por sus siglas en inglés), N-(2-hidroxietil)-etilidén-diamín-N,N',N'-triacetato (HEDTA, por sus siglas en inglés), dietanolglicina (DEG, por sus siglas en inglés), ácido dietilén-triamín-penta(metilénfosfónico) (DTPMP, por sus siglas en inglés), ácido aminotris(metilén-fosfónico) (ATMP, por sus siglas en inglés), y combinaciones y sales de los mismos. Se describen otros agentes constructores y/o co-agentes constructores de ejemplo en, p. ej., los documentos n.° WO 09/102854 y n.° US 5977053.

Sistemas blanqueadores

El detergente puede contener entre 0 % y 50 % en peso, tal como entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 25 % de un sistema blanqueador. Puede utilizarse cualquier sistema blanqueador conocido de la técnica para la utilización en detergentes de lavado de tejidos. Los componentes adecuados del sistema de blanqueo incluyen catalizadores de blanqueo, fotoblanqueadores, activadores de blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno, tales como el percarbonato sódico y los perboratos sódicos, perácidos preformados y mezclas de los mismos. Entre los perácidos preformados adecuados se incluyen, aunque sin limitación, ácidos y sales peroxicarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, por ejemplo, Oxone (R), y mezclas de los mismos. Entre los ejemplos no limitativos de sistemas de blanqueo se incluyen sistemas de blanqueo a base de peróxido, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, incluyendo sales de metales alcalinos tales como sales sódicas de perborato (generalmente mono- o tetra-hidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales persilicatos, en combinación con un activador de blanqueo que forma perácidos. La expresión activador de blanqueo se refiere en la presente memoria a un compuesto que reacciona con blanqueadores de peróxido, tales como el peróxido de hidrógeno, para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueador activado. Entre los activadores de blanqueo adecuados que se utilizarán en la presente memoria se incluyen aquellos que pertenecen a la clase de ésteres, amidas, imidas o anhídridos. Son ejemplos adecuados, tetracetiletilén-diamina (TAED, por sus siglas en inglés), sulfonato de 4-[(3,5,5-trimetilhexanoíl)oxi]benceno sódico (ISONOBS, por sus siglas en inglés), ácido diperoxidodecanoico, sulfonato de 4-(dodecanoiloxi)benceno (LOBS, por sus siglas en inglés), sulfonato de 4-(decanoíloxi)benceno, 4-(decanoiloxi)benzoato (DOBS, por sus siglas en inglés), sulfonato de 4-(nonanoiloxi)benceno (NOBS, por sus siglas en inglés), y/o aquellos dados a conocer en el documento n.° WO98/17767. Se da a conocer una familia particular de activadores de blanqueo de interés en el documento n.° EP624154 y resulta particularmente preferente en esta familia el citrato de trietilacetilo (ATC, por sus siglas en inglés). El ATC o un triglicérido de cadena corta como la triacetina presenta la ventaja de ser respetuoso con el medio ambiente, ya que eventualmente se descompone en ácido cítrico y alcohol. Además, el citrato de trietilacetilo y la triacetina presentan una buena estabilidad hidrolítica en el producto durante el almacenamiento y son activadores de blanqueo eficientes. Finalmente, el ATC proporciona una buena capacidad constructora para el aditivo de lavado de tejidos. Alternativamente, el sistema de blanqueo puede incluir peroxiácidos de, por ejemplo, tipo amida, imida o sulfona. El sistema de blanqueo puede incluir, además, perácidos, tales como el ácido 6-(ftalimido)peroxihexanoico (PAP, por sus siglas en inglés). El sistema de blanqueo puede incluir, además, un catalizador de blanqueo. En algunas realizaciones, el componente blanqueador puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores orgánicos que presentan las siguientes fórmulas:

(i)

(¡i)

(i¡¡) y mezclas de los mismos; en donde cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos, preferentemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos, más preferentemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, noctadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo. Se describen otros sistemas de blanqueo de ejemplo en, p. ej., los documentos n.° WO2007/087258, n.° WO2007/087244, n.° WO2007/087259 y n.° WO2007/087242. Los fotoblanqueadores adecuados pueden ser, por ejemplo, la ftalocianina de zinc sulfonada.

Polímeros

El detergente puede contener entre 0 % y 10 % en peso, tal como entre 0,5 % y 5 %, entre 2 % y 5 %, entre 0,5 % y 2 % o entre 0,2 % y 1 % de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido de la técnica para la utilización en detergentes. El polímero puede funcionar como un co-agente constructor, tal como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar propiedades de antirredepositación, protección de fibras, liberación de suciedad, inhibición de la transferencia de tintes, limpieza de grasas y/o propiedades antiespumantes. Algunos polímeros pueden presentar más de una de las propiedades mencionadas anteriormente y/o más de uno de los motivos mencionados posteriormente. Entre los polímeros de ejemplo se incluyen (carboximetil)celulosa (CMC), poli(alcohol vinílico) (PVA, por sus siglas en inglés), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenglicol) o poli(óxido de etileno) (PEG, por sus siglas en inglés), poli(etilenimina) etoxilada, carboximetil-inulina (CMI), y policarboxilatos, tales como PAA, PAA/PMA, ácido poliaspártico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico, CMC hidrofóbicamente modificado (HM-CMC, por sus siglas en inglés) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) y poli(tereftalato de oxietileno) (PET-POET, por sus siglas en inglés), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridín-N-óxido) (PVPO o PVPNO, por sus siglas en inglés) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI, por sus siglas en inglés). Entre los polímeros de ejemplo adicionales se incluyen policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO, por sus siglas en inglés) y etoxisulfato de dicaternio. Otros polímeros de ejemplo se da a conocer en, p. ej., el documento n.° WO 2006/130575. También se contemplan sales de los polímeros mencionados anteriormente.

Agentes de coloración de tejidos

Las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir, además, agentes de coloración de tejidos, tales como tintes o pigmentos, que, al ser formulados en composiciones detergentes, pueden depositarse sobre un tejido cuando dicho tejido entra en contacto con una solución de lavado que comprende dichas composiciones detergentes, alterando de esta manera el tintado de dicho tejido a través de la absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes de blanqueo fluorescente emiten por lo menos algo de luz visible. En contraste, los agentes de coloración de tejidos alteran el tintado de una superficie al absorber por lo menos una parte del espectro de luz visible. Entre los agentes de coloración de tejidos adecuados se incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y también pueden incluir pigmentos. Entre los tintes adecuados se incluyen tintes de molécula pequeña y tintes poliméricos. Entre los tintes de molécula pequeña adecuados se incluyen tintes de molécula pequeña seleccionados del grupo que consiste en tintes dentro de las clasificaciones de índice de color (C.I., por sus siglas en inglés) de azul directo, rojo directo, violeta directo, azul ácido, rojo ácido, violeta ácido, azul básico, violeta básico y rojo básico, o mezclas de los mismos, por ejemplo, tal como se describe en los documentos n.° WO2005/03274, n.° WO2005/03275, n.° WO2005/03276 y n.° EP1876226 (incorporados como referencias en la presente memoria). La composición detergente comprende preferentemente entre aproximadamente 0,00003 % en peso y aproximadamente 0,2 % en peso, entre aproximadamente 0,00008 % en peso y aproximadamente 0,05 % en peso, o incluso entre aproximadamente 0,0001%en peso y aproximadamente 0,04%en peso de agente de coloración de tejidos. La composición puede comprender entre 0,0001 % en peso y 0,2 % en peso de agente de coloración de tejidos; esto puede resultar especialmente preferente en el caso de que la composición presente la forma de una bolsa de dosis unitaria. También se da a conocer agentes de coloración adecuados en, p. ej., los documentos n.° WO 2007/087257 y n.° WO 2007/087243.

Enzimas adicionales

El aditivo detergente, así como la composición detergente, pueden comprender uno o más enzimas (adicionales), tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, p. ej., una lacasa y/o peroxidasa.

En general, las propiedades del enzima o enzimas seleccionados deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y el enzima o enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces.

Celulasas

Entre las celulasas adecuadas se incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o diseñados mediante ingeniería de proteínas. Entre las celulasas adecuadas se incluyen celulasas de los generosBacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej.,las celulas fúngicas producidas porHumicola insolens, Myceliophthora thermophilayFusarium oxysporumdadas a conocer en los documentos n.° US 4.435.307, n.° US 5.648.263, n.° US 5.691.178, n.° US 5.776.757 y n.° WO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios para el cuidado del color. Son ejemplos de tales celulasas, las celulasas descritas en los documentos n.° EP 0495 257, n.° EP 0531 372, n.° WO 96/11262, n.° WO 96/29397 y n.° WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa, tales como las descritas en los documentos n.° WO 94/07998, n.° EP 0531 315, n.° US 5.457.046, n.° US 5.686.593, n.° US 5.763.254, n.° WO 95/24471, n.° WO 98/12307 y n.° PCT/DK98/00299.

Son ejemplos de celulasas que muestran actividad de endo-beta-1,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) aquellas descritas en el documento n. WO 02/099091.

Entre otros ejemplos de celulasas se incluyen la familia de 45 celulasas descrita en el documento n.° WO 96/29397, y especialmente las variantes de las mismas que presentan sustitución, inserción y/o deleción en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones siguientes en SEQ ID NO: 8 del documento n.° WO 02/099091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, y/o 20, preferentemente seleccionados de P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H o Q146 R.

Entre las celulasas disponibles comercialmente se incluyen Celluzyme™, Celluclean and Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, y Puradax HA™ (Genencor InteARNtional Inc.) y<k>A<c>-500(B)™ (Kao Corporation).

Proteasas

Entre las proteasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano, fúngico, vegetal, vírico o animal, p. ej., de origen vegetal o microbiano. Resulta preferente el origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o diseñados mediante ingeniería de proteínas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serina proteasa o una metaloproteasa. Una serina proteasa puede ser, por ejemplo, de la familia S1, tal como la tripsina, o de la familia S8, tal como la subtilisina. Una metaloproteasa puede ser, por ejemplo, una termolisina de, p. ej., la familia M4 u otra metaloproteasa, tal como las de las familias M5, M7 o m 8.

El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de serina proteasas según Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719 737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serina proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizadas porque presentan una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas se pueden dividir en 6 subdivisiones, es decir, la familia de subtilisinas, la familia de termitasas, la familia de la proteinasa K, la familia de la peptidasa lantibiótica , la familia de la kexina y la familia de la pirolisina.

Son ejemplos de subtilasas aquellas derivadas deBacillus,tales comoBacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilusyBacillus gibsoniidescritos en los documentos n.° US7262042 y n.° WO 09/021867, y subtilisinalentus,subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg,Bacillus licheniformis,subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168, descritas en el documento n.° WO 89/06279 y la proteasa PD138, descrita en el documento n.° WO 93/18140. Otras proteasas útiles pueden ser aquellas descritas en los documentos n.° WO 92/175177, n.° WO 01/016285, n.° WO 02/026024 y n.° WO 02/016547. Son ejemplos de proteasas similares a la tripsina, la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa deFusariumdescrita en los documentos n.° WO 89/06270, n.° WO 94/25583 y n.° WO 05/040327, y las proteínas quimotripsina derivadas deCellumonasdescritas en los documentos n.° WO 05/052161 y n.° WO 05/052146.

Una proteasa preferida adicional es la proteasa alcalina deBacillus lentusDSM 5483, tal como se describe en, por ejemplo, el documento n.° WO 95/23221, y variantes de la misma que se describen en los documentos n.° W<o>92/21760, n.° WO 95/23221, n.° EP1921147 y n.° EP1921148.

Son ejemplos de metaloproteinasas la metaloproteinasa neutra, tal como se describe en el documento n.° WO 07/044993 (Genencor Int.), tales como las derivadas deBacillus amyloliquefaciens.Son ejemplos de proteasas útiles las variantes descritas en: los documentos n.° WO92/19729, n.° WO96/034946, n.° WO98/20115, n.° WO98/20116, n.° WO99/011768, n.° WO01/44452, n.° WO03/006602, n.° WO04/03186, n.° WO04/041979, n.° WO07/006305, n.° WO11/036263 y n.° WO11/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración de BPN'. Las variantes de subtilasa más preferentes pueden comprender las mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K y T274A (utilizando la numeración de BPN').

Entre los enzimas proteasas disponibles comercialmente adecuados se incluyen aquellos comercializados bajo los nombres comerciales Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase®y Esperase® (Novozymes A/S); aquellos comercializados bajo los nombres comerciales Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP (secuencia mostrada en la figura 29 del documento n.° US5352604) y variantes de las mismas (Henkel AG) y KAP (subtilisina deBacillus alkalophilus)de Kao.

Lipasas y cutinasas

Entre las lipasas y cutinasas adecuadas se incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes modificados químicamente o diseñados mediante ingeniería de proteínas. Entre los ejemplos se incluyen la lipasa deThermomyces,p. ej. deT. lanuginosus(anteriormente denominadoHumicola lanuginosa),tal como se describe en los documentos n.° EP258068 y n.° EP305216, la cutinasa deHumicola,p. ej.,H. insolens(documento n.° WO 96/13580), la lipasa de cepas dePseudomonas(algunas de estas actualmente se han redenominadoBurkholderia),p. ej.P. alcaligenesoP. pseudoalcaligenes(documento n.° EP218272),P. cepacia(documento n.° EP331376),P.sp. cepa SD705 (documentos n.° WO95/06720 y n.° WO96/27002),P. wisconsinensis(documento n.° WO96/12012), lipasas tipo GDSL deStreptomyces(documento n.° WO10/065455), la cutinasa deMagnaporthe grisea(documento n.° WO10/107560), la cutinasa dePseudomonas mendocina(documento n.° US 5.389.536), la lipasa deThermobifida fusca(documento n.° WO11/084412), la lipasa deGeobacillus stearothermophilus(documento n.° WO11/084417), la lipasa deBacillus subtilis(documento n.° WO11/084599), y la lipasa deStreptomyces griseus(documento n.° WO11/150157) y S.pristinaespiralis(documento n.° WO12/137147).

Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como las indicadas en los documentos n.° EP407225, n.° WO92/05249, n.° WO94/01541, n.° WO94/25578, n.° WO95/14783, n.° WO95/30744, n.° WO95/35381, n.° WO95/22615, n.° WO96/00292, n.° WO97/04079, n.° WO97/07202, n.° WO00/34450, n.° WO00/60063, n.° WO01/92502, n.° WO07/87508 y n.° WO09/109500.

Entre los productos comerciales de lipasa preferentes se incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente de Gist-Brocades).

Todavía otros ejemplos son las lipasas en ocasiones denominadas aciltransferasas o perhidrolasas, p. ej. aciltransferasas con homología con la lipasa A deCandida antarctica(documento n.° WO 10/111143), la aciltransferasa deMycobacterium smegmatis(documento n.° WO05/56782), las perhidrolasas de la familia CE 7 (documento n.° WO09/67279), y variantes de la perhidrolasa deM.smegmatis, en particular la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (documento n.° WO10/100028).

Amilasas

Las amilasas adecuadas que se pueden utilizar junto con las variantes de subtilasa de la invención pueden ser una alfa-amilasa o una glucoamilasa y pueden ser de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o diseñados mediante ingeniería de proteínas. Entre las amilasas se incluyen, por ejemplo, las alfaamilasas obtenidas deBacillus,p. ej., una cepa especial deBacillus licheniformis,descrita con más detalle en el documento n.° GB 1.296.839.

Entre las amilasas adecuadas se incluyen las amilasas que presentan la SEQ ID NO: 3 en el documento n.° WO 95/10603 o variantes que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 3 de la misma. Las variantes preferentes se describen en los documentos n.° WO 94/02597, n.° WO 94/1814, n.° WO 97/43424 y SEQ ID NO: 4 del documento n.° WO 99/019467, tal como variantes con sustituciones en una o más de las posiciones siguientes: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.

Entre las amilasas adecuadas se incluyen amilasas que presentan la SEQ ID NO: 6 en el documento n.° WO 02/010355 o variantes de las mismas que presentan 90 % de identidad de secuencia respecto a las mismas. Las variantes preferidas son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182 y una sustitución en la posición 193.

Otras amilasas que resultan adecuadas son la alfa-amilasa híbrida que comprende los residuos 1 a 33 de la alfaamilasa derivada de B.amyloliquefaciensmostrada en SEQ ID NO: 6 del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36 a 483 de la alfa-amilasa deB. licheniformismostrada en SEQ ID NO: 4 del documento n.° WO 2006/066594 o variantes que presentan 90 % de identidad de secuencia respecto a la misma. Las variantes preferentes de dicha alfa-amilasa híbrida son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 y Q264. Las variantes más preferentes de la alfa-amilasa híbrida que comprende los residuos 1 a 33 de la alfa-amilasa derivada deB. amyloliquefaciensmostrada en SEQ ID NO: 6 del documento n.° WO 2006/066594 y los residuos 36 a 483 de SEQ ID NO: 4 del documento n.° WO 2006/066594 son aquellas que presentan las sustituciones siguientes:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S, o G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Son amilasas adicionales que resultan adecuadas las amilasas que presentan la SEQ ID NO: 6 en el documento n.° WO 99/019467 o variantes de la misma que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 6. Las variantes preferentes de SEQ ID NO: 6 son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: R181, G182, h 183, G184, N195, I206, E212, E216 y K269. Las amilasas particularmente preferentes son aquellas que presentan una deleción en las posiciones R181 y G182, o en las posiciones H183 y G184.

Son amilasas adicionales que se pueden utilizar aquellas que presentan la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7 del documento n.° WO 96/023873 o variantes de las mismas que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7. Son variantes preferentes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7 son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 y 476. Las variantes más preferentes son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 181 y 182 o en las posiciones 183 y 184. Las variantes de amilasa más preferentes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7 son aquellas que presentan una deleción en las posiciones 183 y 184 y una sustitución en una o más de las posiciones 140, 195, 206, 243, 260, 304 y 476.

Otras amilasas que se pueden utilizar son aquellas que presentan la SEQ ID NO: 2 del documento n.° WO 08/153815, la SEQ ID NO: 10 en el documento n.° WO 01/66712 o variantes de la misma que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 2 del documento n.° WO 08/153815 o una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 10 del documento n.° WO 01/66712. Las variantes preferentes de SEQ ID NO: 10 en el documento n.° WO 01/66712 son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las posiciones siguientes: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 y 264.

Son amilasas adicionales adecuadas las amilasas que presentan la SEQ ID NO: 2 del documento n.° WO 09/061380 o variantes que presentan una identidad de secuencia de 90 % respecto a la SEQ ID NO: 2 de la misma. Las variantes preferentes de SEQ ID NO: 2 son aquellas que presentan un truncado del extremo C-terminal y/o una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 y G475. Son variantes más preferentes de SEQ ID NO: 2 aquellas que presentan la sustitución en una o más de las siguientes posiciones: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E y G475K y/o una deleción en la posición R180 y/o S181 o de T182 y/o G183. Las variantes de amilasa más preferentes de SEQ ID NO: 2 son aquellas que presentan las sustituciones siguientes:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K, o

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, en donde los variantes están truncadas en el extremo C-terminal y opcionalmente comprenden además una sustitución en la posición 243 y/o una deleción en la posición 180 y/o en la posición 181.

Otras amilasas adecuadas son la alfa-amilasa que presenta la SEQ ID NO: 12 en el documento n.° WO 01/66712, o una variante que presenta una identidad de por lo menos 90 % respecto a la SEQ ID NO: 12. Las variantes de amilasa preferentes son aquellas que presentan una sustitución, una deleción o una inserción en una o más de las siguientes posiciones de la SEQ ID NO: 12 en el documento n.° WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471 y N484. Entre las amilasas preferentes particulares se incluyen variantes que presentan una deleción de D183 y G184 y que presentan las sustituciones R118K, N195F, R320K y R458K, y una variante que adicionalmente presenta sustituciones en una o más posiciones seleccionadas del grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 y A339, más preferentemente una variante que además presente sustituciones en la totalidad de dichas posiciones.

Otros ejemplos son variantes de amilasa, tales como las indicadas en los documentos n.° WO 2011/098531, n.° WO 2013/001078 y n.° WO 2013/001087.

Son amilasas disponibles comercialmente: Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X y BAN™ (de Novozymes A/S), y Rapidase™ , Purastar™/Effectenz™, Powerase y Preferenz S100 (de Genencor InteARNtional Inc./DuPont).

Peroxidasas/Oxidasas

Entre las peroxidasas/oxidasas adecuadas se incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o diseñados mediante ingeniería de proteínas. Entre los ejemplos de peroxidasa útiles se incluyen la peroxidasa deCoprinus,p. ej., de C.cinereus,y variantes de la misma tales como las indicadas en los documentos n.° WO 93/24618, n.° WO 95/10602 y n.° WO 98/15257.

Entre las peroxidasas disponibles comercialmente se incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).

El enzima o enzimas detergentes pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contengan uno o más enzimas, o mediante la adición de un aditivo combinado que comprenda la totalidad de dichos enzimas. Un aditivo detergente de la invención,i.e.,un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspensión, etc. Las formulaciones preferentes de aditivos detergentes son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones.

Los granulados no pulverulentos pueden producirse, p. ej., tal como se da a conocer en los documentos n.° US 4.106.991 y n.° US 4.661.452, y opcionalmente pueden recubrirse mediante métodos conocidos de la técnica. Son ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso, productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1.000 a 20.000; nonilfenoles etoxilados que presentan entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento formadores de película adecuados para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado en el documento n.° GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse mediante, por ejemplo, la adición de un poliol, tal como el propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Las enzimas protegidos pueden prepararse de acuerdo con el método dado a conocer en el documento n.° EP 238.216.

Materiales auxiliares

También puede utilizarse cualquier componente de detergente conocido de la técnica para la utilización en detergentes para lavado de tejidos. Entre otros componentes de detergente opcionales se incluyen agentes anticorrosión, agentes antiencogimiento, agentes antirredeposición de suciedad, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, desintegrantes/agentes de desintegración, tintes, estabilizadores de enzimas (incluyendo ácido bórico, boratos, CMC y/o polioles tales como el propilenglicol), suavizantes de tejidos incluyendo arcillas, aditivos/rellenos, agentes de blanqueo fluorescente/blanqueadores ópticos, potenciadores de espuma, reguladores de espumas, perfumes, agentes de suspensión de suciedad, suavizantes, supresores de espuma, inhibidores de manchas de taninos y agentes de capilaridad, ya sea solos o en combinación. Puede utilizarse cualquier ingrediente conocido de la técnica para la utilización en detergentes de lavado de tejidos. La elección de tales ingredientes está perfectamente comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia.

Dispersantes:las composiciones detergentes de la presente invención pueden contener, además, dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Entre los materiales orgánicos solubles en agua adecuados se incluyen los ácidos homopoliméricos o copoliméricos o sus sales, en los que el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen en, por ejemplo, Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

Agentes inhibidores de transferencia de tintes:las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Entre los agentes inhibidores de transferencia de tintes poliméricos adecuados se incluyen, aunque sin limitación, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas de los mismos. Cuando están presentes en una composición de la invención, los agentes inhibidores de transferencia de tintes pueden estar presentes a niveles de entre aproximadamente 0,0001 % y aproximadamente 10 %, de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 5 % o incluso de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 3 % en peso de la composición.

Agente blanqueador fluorescente:las composiciones detergentes de la presente invención preferentemente contendrán además componentes adicionales que pueden teñir los artículos que se limpian, tales como agentes blanqueadores fluorescentes o blanqueadores ópticos. Donde esté presente, el agente blanqueador preferentemente se encuentra a un nivel de entre aproximadamente 0,01 % y aproximadamente 0,5 %. Puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para la utilización en una composición detergente para lavado de tejidos en la composición de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes más comúnmente utilizados son aquellos que pertenecen a las clases de derivados de ácido diaminoestilbén-sulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenil-diestirilo. Entre los ejemplos de agentes blanqueadores fluorescentes del tipo derivado de ácido diaminoestilbén-sulfónico se incluyen las sales sódicas de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazín-6-amino estilbén-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazín-6-amino)estilbén-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazína-6-amino)estilbén-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbén-2,2'-disulfonato; 4,4-bis-(2-anilino-4(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazín-6-amino)estilbén-2,2'-disulfonato y 2-(estilbil-4"-nafto-1,2':4,5)-1,2,3-triazol-2"-sulfonato. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferentes son Tinopal DMS y Tinopal CBS, disponibles de Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. El Tinopal DMS es la sal disódica de 4,4'-bis-(2-morfolino-4 anilino-s-triazín-6-amino)estilbén-disulfonato. El Tinopal CBS es la sal disódica de 2,2'-bis-(fenil-estiril)disulfonato. También resultan preferentes los agentes blanqueadores fluorescentes como el producto disponible comercialmente Parawhite KX, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India. Entre otros fluorescentes adecuados para la utilización en la invención se incluyen las 1,3-diaril-pirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas. Entre los niveles de los blanqueadores fluorescentes adecuados se incluyen niveles entre aproximadamente 0,01 %, 0,05 %, aproximadamente 0,1 %, o incluso aproximadamente 0,2 % en peso, y niveles de 0,5 % o incluso 0,75 % en peso.

Polímeros liberadores de suciedad:las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir, además, uno o más polímeros de liberación de suciedad que ayudan a eliminar la suciedad de tejidos como el algodón y de tejidos de poliéster, en particular la eliminación de suciedad hidrofóbica de tejidos basados en el poliéster. Los polímeros de liberación de suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros basados en tereftalato no iónicos o aniónicos, caprolactama de polivinilo y copolímeros relacionados, copolímeros injertados de vinilo, poliamidas de poliéster, ver, por ejemplo, el capítulo 7 en: P Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros de liberación de suciedad son los polímeros de limpieza de grasa alcoxilados anfifílicos que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina, tal como se describe en detalle en el documento n.° WO 2009/087523 (incorporada como referencia en la presente memoria). Además, los copolímeros de injerto aleatorio son polímeros de liberación de suelo adecuados. Los copolímeros de injerto adecuados se describen con más detalle en los documentos n.° WO 2007/138054, n.° WO 2006/108857 y n.° WO 2006/113314 (incorporados como referencia en la presente memoria). Otros polímeros de liberación de suelo son estructuras de polisacáridos sustituidos, especialmente estructuras celulósicas sustituidas, tales como las derivadas de celulosa modificada, tales como las descritas en el documento n.° EP 1867808 o en el documento n.° WO 2003/040279 (ambos se incorporan como referencia en la presente memoria). Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de los mismos. Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de los mismos. Entre los polímeros celulósicos adecuados se incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, éster de carboximetilcelulosa y mezclas de los mismos.

Agentes antirredeposición:las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir, además, uno o más agentes antirredeposición, tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido málico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros a base de celulosa indicados anteriormente bajo polímeros de liberación de suciedad también pueden funcionar como agentes antirredeposición.

Entre otros materiales auxiliares adecuados se incluyen, aunque sin limitación, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tintes, estabilizadores enzimáticos, suavizantes de tejidos, rellenos, reguladores de espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de espumas, solventes y estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes elastificantes de la estructura.

Formulación de productos de detergente

La composición detergente de la invención puede presentar cualquier forma conveniente, p. ej., una pastilla, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que contenga uno o más compartimentos, unos polvos regulares o compactos, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado. Existen varias formas de formulación de detergentes, tales como capas (fases iguales o diferentes), bolsas, así como formas para unidades de dosificación automática.

Las bolsas se pueden configurar como un solo compartimento o como múltiples compartimentos. Pueden presentar cualquier forma, figura y material que resulte adecuado para contener la composición, p. ej., sin permitir la liberación de la composición a partir de la bolsa antes del contacto con el agua. La bolsa está constituida por una película soluble en agua que encierra un volumen interno. Dicho volumen interno puede dividirse en compartimentos de la bolsa. Las películas preferentes son materiales poliméricos, preferentemente polímeros que se conforman en una película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados preferentes de los mismos son poliacrilatos y copolímeros de acrilato solubles en agua, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos, lo más preferentemente copolímeros de alcohol polivinílico e hidroxipropilcelulosa (HPMC). Preferentemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo, PVA, es por lo menos de 60 %. El peso molecular medio preferente es habitualmente de entre aproximadamente 20.000 y aproximadamente 150.000. Las películas también pueden ser composiciones de mezclas que comprenden mezclas de polímeros degradables hidrolíticamente y solubles en agua, tales como poliláctide y alcohol polivinílico (conocido bajo la referencia comercial M8630, comercializado por Chris Craft In). Prod. Of Gary, Ind., EE. u U.) más plastificantes como glicerol, etilenglicerol, propilenglicol, sorbitol y mezclas de los mismos. Las bolsas pueden comprender una composición detergente sólida para lavado de tejidos o componentes de partes y/o una composición de lavado líquida o componentes de partes separados por la película soluble en agua. El compartimento para componentes líquidos puede presentar una composición diferente a la de los compartimentos que contienen sólidos. Ref: (documento n.° US2009/0011970 A1).

Los ingredientes del detergente pueden separarse físicamente unos de otros mediante compartimentos en bolsas solubles en agua o en diferentes capas de tabletas. De este modo, se puede evitar la interacción de almacenamiento negativa entre los componentes. Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimentos también pueden dar lugar a una disolución retrasada de componentes seleccionados en la solución de lavado.

Un detergente líquido o en gel, que no esté dosificado en unidades, puede ser acuoso, y contener normalmente por lo menos entre 20 % en peso y 95 % de agua, tal como hasta aproximadamente 70 % de agua, hasta aproximadamente 65 % de agua, hasta aproximadamente 55 % de agua, hasta aproximadamente 45 % de agua, hasta aproximadamente 35 % de agua. Pueden incluirse otros tipos de líquidos, incluyendo, aunque sin limitación, alcanoles, aminas, dioles, éteres y polioles, en un líquido o gel acuoso. Un detergente líquido o en gel acuoso puede contener entre 0 % y 30 % de solvente orgánico. Un detergente líquido o en gel puede ser no acuoso.

Pastillas de jabón para el lavado de tejidos

Los enzimas de la invención pueden añadirse a las pastillas de jabón para lavado de tejidos y usarse para el lavado a mano de ropa, tejidos y/o textiles. La expresión "pastilla de jabón para lavado de tejidos" incluye pastillas para lavado de tejidos, pastillas de jabón, pastillas combinadas, pastillas de syndet y pastillas de detergente. Los tipos de jabón en pastilla normalmente difieren en el tipo de surfactante que contienen, y la expresión pastilla de jabón de lavado de tejidos incluye aquellos que contienen jabones de ácidos grasos y/o jabones sintéticos. El jabón de lavado de tejidos presenta una forma física que es sólida y no es un líquido, gel o unos polvos a temperatura ambiente. El término "sólido" se define como una forma física que no cambia significativamente con el tiempo, es decir, si un objeto sólido (p. ej., una pastilla de jabón de lavado de tejidos) se introduce en un recipiente, el objeto sólido no cambia para llenar el recipiente en el que se ha introducido. La pastilla es un sólido típicamente en forma de barra, pero puede presentar otras formas sólidas, tales como redonda u ovalada.

La pastilla de jabón para el lavado de tejidos puede contener uno o más enzimas adicionales, inhibidores de proteasa, tales como aldehídos peptídicos (o aductos de hidrosulfito o aductos de hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax y/o derivados de ácido fenilborónico, tales como ácido 4-formilfenilborónico, uno o más jabones o surfactantes sintéticos, polioles, tales como glicerina, compuestos controladores de pH, tales como ácidos grasos, ácido cítrico, ácido acético y/o ácido fórmico, y/o una sal de un catión monovalente y un anión orgánico, en donde el catión monovalente puede ser, por ejemplo, Na+, K+ o NH4+ y el anión orgánico puede ser, por ejemplo, formato, acetato, citrato o lactato, de tal manera que la sal de un catión monovalente y un anión orgánico puede ser, por ejemplo, formato sódico.

El jabón para lavado de tejidos puede contener, además, agentes complejantes como EDTA y HEDP, perfumes y/o diferentes tipos de rellenos, surfactantes, p. ej., surfactantes sintéticos aniónicos, agentes constructores, agentes de liberación de suciedad poliméricos, quelantes detergentes, agentes estabilizantes, rellenos, tintes, inhibidores de transferencia de tintes, policarbonatos alcoxilados, supresores de espumas, estructurantes, aglutinantes, agentes de lixiviación, activadores de blanqueo, agentes de eliminación de suciedad arcillas, agentes antirredeposición, agentes dispersantes poliméricos, blanqueadores, suavizantes de tejidos, perfumes y/o otros compuestos conocidos de la técnica.

La pastilla de jabón para lavado de tejidos puede procesarse en equipos convencionales para la fabricación de pastillas de jabón para lavado de tejidos, tales como, aunque sin limitación, mezcladoras, prensas, por ejemplo, una prensa de vacío de dos etapas, extrusoras, cortadoras, estampadoras de logotipos, túneles de enfriamiento y envolvedoras. La invención no se encuentra limitada a la preparación de pastillas de jabón para el lavado de tejidos mediante ningún método individual. La premezcla de la invención puede añadirse al jabón en diferentes etapas del procedimiento. Por ejemplo, se puede preparar la premezcla que contiene un jabón, un enzima, opcionalmente uno o más enzimas adicionales, un inhibidor de proteasas y una sal de un catión monovalente y un anión orgánico, y a continuación, prensarse la mezcla. El enzima y los enzimas opcionales adicionales pueden añadirse al mismo tiempo que el inhibidor de proteasa, por ejemplo, en forma líquida. Además de la etapa de mezcla y de la etapa de prensado, el procedimiento puede comprender, además, etapas de molienda, extrusión, corte, estampado, enfriamiento y/o envoltura.

Formulaciones granuladas de detergentes

Puede formularse un detergente granulado tal como se describe en los documentos n.° WO09/092699, n.° EP1705241, n.° EP1382668, n.° WO07/001262, n.° US6472364, n.° WO04/074419 o n.° WO09/102854. Otras formulaciones detergentes útiles se describen en los documentos n.° WO09/124162, n.° WO09/124163, n.° WO09/117340, n.° WO09/117341, n.° WO09/117342, n.° WO09/072069, n.° WO09/063355, n.° WO09/132870, n.° WO09/121757, n.° WO09/112296, n.° WO09/112298, n.° WO09/103822, n.° WO09/087033, n.° WO09/050026, n.° WO09/047125, n.° WO09/047126, n.° WO09/047127, n.° WO09/047128, n.° WO09/021784, n.° WO09/010375, n.° WO09/000605, n.° WO09/122125, n.° WO09/095645, n.° WO09/040544, n.° WO09/040545, n.° WO09/024780, n.° WO09/004295, n.° WO09/004294, n.° WO09/121725, n.° WO09/115391, n.° WO09/115392, n.° WO09/074398, n.° WO09/074403, n.° WO09/068501, n.° WO09/065770, n.° WO09/021813, n.° WO09/030632 y n.° WO09/015951,

n.° WO2011025615, n.° WO2011016958, n.° WO2011005803 , n ° WO2011005623, n.° WO2011005730 WO2011005844, n.° WO2011005904, n.° WO2011005630, n.° WO2011005830, n.° WO2011005912, WO2011005905, n.° WO2011005910, n.° WO2011005813, n.° WO2010135238, n.° WO2010120863, WO2010108002, n.° WO2010111365, n.° WO2010108000, n.° WO2010107635, n.° WO2010090915, WO2010033976, n.° WO2010033746, n.° WO2010033747, n.° WO2010033897, n.° WO2010033979, WO2010030540, n.° WO2010030541, n.° WO2010030539, n.° WO2010024467, n.° WO2010024469, WO2010024470, n.° WO2010025161, n.° WO2010014395 y n.° WO2010044905,

n.° WO2010145887, n.° WO2010142503, n.° WO2010122051, n.° WO2010102861, n.° WO2010099997, n.° WO2010084039, n.° WO2010076292, n.° WO2010069742, n.° WO2010069718, n.° WO2010069957, n.° WO2010057784, n.° WO2010054986, n.° WO2010018043, n.° WO2010003783, n.° WO2010003792,

n.° WO2011023716, n.° WO2010142539, n.° WO2010118959, n.° WO2010115813, n.° WO2010105942, n.° WO2010105961, n.° WO2010105962, n.° WO2010094356, n.° WO2010084203, n.° WO2010078979, n.° WO2010072456, n.° WO2010069905, n.° WO2010076165, n.° WO2010072603, n.° WO2010066486, n.° WO2010066631, n.° WO2010066632, n.° WO2010063689, n.° WO2010060821, n.° WO2010049187, n.° WO2010031607 y n.° WO2010000636.

Usos

La presente invención se refiere, además, a métodos para usar las composiciones según la invención en el lavado de textiles y tejidos, tales como el lavado de ropa doméstica y el lavado industrial.

La invención se refiere, además, a métodos para usar las composiciones según la invención o de limpieza de superficies duras, tales como suelos, mesas, paredes, techos, etc., así como superficies de objetos duros, tales como automóviles (lavado de coches) y vajillas (lavado de vajillas).

Una composición detergente de la presente invención puede formularse, por ejemplo, como una composición detergente para lavado a mano o a máquina que incluya una composición aditiva para el lavado adecuada para el pretratamiento de tejidos manchados y una composición suavizante de tejidos añadida durante el enjuague, o puede formularse como una composición detergente para el uso en operaciones generales de limpieza de superficies duras del hogar, o puede formularse para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.

En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo detergente que comprende un polipéptido de la presente invención tal como se describe en la presente memoria.

El procedimiento de limpieza o el procedimiento de cuidado textil puede ser, por ejemplo, un procedimiento de lavado de tejidos, un procedimiento de lavado de vajillas o la limpieza de superficies duras, tales como azulejos de baño, suelos, mesas, desagües, fregaderos y lavabos. Los procedimientos de lavado de tejidos pueden ser, por ejemplo, el lavado doméstico, aunque también pueden ser el lavado industrial de tejidos. Además, la invención se refiere a un procedimiento de lavado de tejidos y/o prendas en donde el procedimiento consiste en tratar los tejidos con una solución de lavado que contiene una composición detergente y por lo menos una variante de proteasa de la invención. El procedimiento de limpieza o un procedimiento de cuidado textil se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un procedimiento de lavado a máquina o en un procedimiento de lavado manual. La solución de lavado puede ser, por ejemplo, una solución de lavado acuosa que contenga una composición detergente.

En los últimos años ha habido un creciente interés en reemplazar componentes en detergentes, que se derivan de petroquímicos, por componentes biológicos renovables tales como enzimas y polipéptidos sin comprometer el rendimiento del lavado. Cuando los componentes de las composiciones detergentes cambian, se necesitan nuevas actividades enzimáticas o nuevos enzimas que presenten propiedades alternativas y/o mejoradas respecto a los enzimas detergentes utilizados habitualmente, tales como las proteasas, lipasas y amilasas, para conseguir un rendimiento de lavado similar o mejorado en comparación con las composiciones detergentes tradicionales.

La invención se refiere, además, a la utilización de composiciones de la invención que comprenden los variantes de subtilasa en procedimientos de eliminación de manchas proteicas. Las manchas proteicas pueden ser manchas tales como manchas de alimentos, p. ej., comida para bebés, sebo, cacao, huevo, sangre, leche, tinta, hierba o una combinación de los mismos.

Entre las composiciones de detergentes habituales se incluyen diversos componentes además de los enzimas; estos componentes presentan diferentes efectos. Algunos componentes, como los surfactantes, reducen la tensión superficial en el detergente, lo que permite que la mancha que se está limpiando se levante y se disperse, y a continuación se elimine en el lavado. Otros componentes, como los sistemas de blanqueo, eliminan la decoloración, a menudo por oxidación, y muchos blanqueadores también presentan fuertes propiedades bactericidas, y se utilizan para desinfectar y esterilizar. Todavía otros componentes como los suavizantes y quelantes ablandan, p. ej., el agua de lavado mediante la eliminación de iones metálicos en el líquido.

En una realización particular, la invención se refiere a la utilización de una composición que comprende una variante de subtilasa y uno o más componentes detergentes, tales como surfactantes, hidrótropos, agentes constructores, co agentes constructores, quelantes o agentes quelantes, sistemas de blanqueo o componentes de blanqueo, polímeros, agentes de coloración para tejidos, suavizantes de tejidos, potenciadores de espuma, supresores de espuma, dispersantes, inhibidores de transferencia de tintes, agentes de blanqueo fluorescentes, perfumes, blanqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de la suciedad, polímeros de liberación de la suciedad, agentes antirredeposición, inhibidores o estabilizadores de enzimas, activadores de enzimas, antioxidantes y solubilizadores.

En una realización particular, la invención se refiere a la utilización de una composición de la invención que comprende una variante de subtilasa tal como se da a conocer en la presente memoria y uno o más enzimas adicionales seleccionados del grupo que comprende proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasas, xiloglucanasa, pectinasas, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxidasas, catalasas y mananasas, o cualquier mezcla de las mismas.

En una realización particular, la invención se refiere a la utilización de una composición de la invención que comprende una variante de subtilasa tal como se da a conocer en la presente memoria, uno o más enzimas adicionales seleccionados del grupo que comprende proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasa, xiloglucanasas, pectinasa, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxidasas, catalasas y mananasas, o cualquier mezcla de las mismas, y uno o más componentes detergentes, tales como surfactantes, hidrótropos, agentes constructores, co-agentes constructores, quelantes o agentes quelantes, sistema de blanqueo o componentes de blanqueo, polímeros, agentes de coloración de tejidos, suavizantes de tejidos, potenciadores de espuma, supresores de espuma, dispersantes, inhibidores de transferencia de tintes, agentes blanqueadores fluorescentes, perfumes, blanqueadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de la suciedad, polímeros de liberación de la suciedad, agentes antirredeposición, inhibidores o estabilizadores de enzimas, activadores de enzimas, antioxidantes y solubilizadores.

Método de lavado

La presente invención se refiere a un método de lavado de un tejido, una vajilla o una superficie dura con una composición detergente de la invención.

Una realización preferente se refiere a un método de limpieza, en donde dicho método comprende las etapas de: puesta en contacto de un objeto con una composición detergente de la invención bajo condiciones adecuadas para la limpieza de dicho objeto. En una realización preferente, la composición detergente se utiliza en un procedimiento de lavado de tejidos o de lavado de vajilla.

Todavía otra realización se refiere a un método para eliminar manchas de tejidos o vajillas que comprende poner en contacto dicho tejido o vajilla con una composición de la invención bajo condiciones adecuadas para la limpieza de dicho objeto.

También se encuentran contemplados composiciones y métodos para el tratamiento de tejidos (p. ej., para eliminar el apresto de un tejido) utilizando una o más de las proteasas de la invención. La proteasa se puede utilizar en cualquier método de tratamiento de tejidos que sea bien conocido de la técnica (ver, p. ej., el documento n.° US6.077.316). Por ejemplo, en un aspecto, la sensación y apariencia de un tejido se mejora mediante un método que comprende la puesta en contacto del tejido con una proteasa en una solución. En un aspecto, el tejido se trata con la solución bajo presión.

Las composiciones detergentes de la presente invención resultan adecuadas para la utilización en aplicaciones de lavado de tejidos y la limpieza de superficies duras, incluyendo el lavado de vajillas. De acuerdo con lo anterior, la presente invención incluye un método para el lavado de un tejido o el lavado de una vajilla. El método comprende las etapas de poner en contacto el tejido/vajilla que se va a limpiar con una solución que comprende la composición detergente según la invención. El tejido puede comprender cualquier tejido capaz de ser lavado bajo condiciones normales de uso por parte del consumidor. La vajilla puede comprender cualquier tipo de vajilla, tal como loza, cubiertos, cerámica, plásticos tales como melamina, metales, porcelana, vidrio y acrílicos. La solución preferentemente presenta un pH de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 11,5. Las composiciones se pueden utilizar a concentraciones de entre aproximadamente 100 ppm, preferentemente 500 ppm, y aproximadamente 15.000 ppm en solución. Las temperaturas del agua normalmente están comprendidas entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 95 °C, incluyendo aproximadamente 10 °C, aproximadamente 15 °C, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C y aproximadamente 90 °C. La proporción de agua-tejido habitualmente es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 30:1.

El enzima o enzimas de la composición detergente de la invención pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizadores e inhibidores de proteasa convencionales, p. ej., un poliol, tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, diferentes sales, tales como NaCl o KCl; ácido láctico, ácido fórmico, ácido bórico o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilborónico, tal como ácido 4-formilfenilborónico, o un aldehido peptídico, tal como los aldehidos de di-, tri- o tetrapéptidos o análogos de aldehido (ya sea de la forma B1-B0-R en la que R es H, CH3, CX3, CHX2, o CH2X (X=halógeno), B0 es un solo residuo aminoácido (preferentemente con una cadena lateral alifática o aromática opcionalmente sustituida) y B1 consiste en uno o más residuos aminoácidos (preferentemente uno, dos o tres), que opcionalmente comprenden un grupo de protección N-terminal, o tal como se describe en los documentos n.° WO 09/118375 y n.° WO 98/13459) o un inhibidor de proteasa del tipo proteico, tal como RASI, BASI o WASI (inhibidores bifuncionales de alfa-amilasa/subtilisina del arroz, cebada y trigo) o CI2 o SSI. La composición puede formularse tal como se describe en, p. ej., los documentos n.° WO 92/19709, n.° WO 92/19708 y n.° u S 6.472.364. En algunas realizaciones, los enzimas utilizados en la presente memoria se estabilizan mediante la presencia de fuentes solubles en agua de iones de zinc (II), calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones terminadas que proporcionan dichos iones a los enzimas, así como otros iones metálicos (p. ej., bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estaño (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) y oxovanadio (IV)).

En algunas realizaciones preferentes, las composiciones detergentes proporcionadas en la presente memoria normalmente se formulan de tal manera que, durante la utilización en operaciones de lavado acuoso, el agua de lavado presenta un pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 11,5, o en realizaciones alternativas, incluso de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 10,5. En algunas realizaciones preferentes, los productos de lavado de tejidos granulados o líquidos se formulan para presentar un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8. Entre las técnicas para controlar el pH en los niveles de uso recomendados se incluyen el uso de tampones, álcalis, ácidos, etc., y son bien conocidas por el experto en la materia.

La presente invención se describe en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos:

Ensayo de estrés mecánico automático (AMSA) para el lavado de tejidos

Con el fin de evaluar el rendimiento de lavado en experimentos de lavado de tejidos, se llevaron a cabo ensayos utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA). Con el AMSA, se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones enzimáticas-detergentes de pequeño volumen. La placa AMSA presenta varias ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que presiona firmemente la muestra de lavado de tejidos, en donde el textil que se va a lavar está presionado contra todas las aberturas de las ranuras. Durante el periodo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el textil y la tapa se someten a agitación vigorosa para poner la solución de ensayo en contacto con el textil y aplicar estrés mecánico de manera regular, periódica y oscilante. Para una descripción más detallada, ver el documento n.° WO 02/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" (Realizaciones de método especiales), en las páginas 23 y 24.

El rendimiento de lavado se mide como el brillo del color del textil lavado. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está teñida, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el rendimiento de lavado.

Las mediciones de color se llevan a cabo con un escáner profesional de cama plana (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que se utiliza para capturar una imagen del textil lavado.

Para extraer un valor de intensidad de luz de las imágenes escaneadas, los valores de píxel de 24 bits de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB, por sus siglas en inglés). El valor de intensidad (Int) se calcula mediante la suma de los valores RGB como vectores, tomando después la longitud del vector resultante:

Tabla 1: composición de detergentes modelo y materiales de ensayo

Métodos generales de biología molecular:

A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones y transformaciones del ADN se llevaron a cabo utilizando métodos estándares de biología molecular (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood y Cutting (1990).Ensayos de actividad de proteasas:

1) Ensayo de actividad de Suc-AAPF-pNA:

La actividad proteolítica se puede determinar mediante un método que utiliza el sustrato Suc-AAPF-PNA. Suc-AAPF-PNA es la abreviatura de N-succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida, y es un péptido bloqueado que puede ser cortado por endoproteasas. Tras el corte, se libera una molécula de PNA libre que presenta un color amarillo y, por lo tanto, que se puede medir mediante espectrofotometría visible a una longitud de onda de 405 nm. El sustrato Suc-AAPF-PNA es fabricado por Bachem (n.° de cat. L1400, disuelto en DMSO).

La muestra de proteasa a analizar se diluyó en un tampón de actividad residual (Tris 100 mM, pH 8,6). El ensayo se llevó a cabo mediante transferencia de 60 pl de muestras de enzima diluidas a una placa de microtitulación de 96 pocillos y añadiendo 140 pl de la solución de sustrato de trabajo (0,72 mg/ml en Tris 100 mM, pH 8,6). La solución se mezcló a temperatura ambiente y se midió la absorbancia cada 20 segundos durante 5 minutos a una DO de 405 nm. La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la proteasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dadas. La muestra de proteasa debe diluirse hasta un nivel en el que la pendiente sea lineal.

Tergo-O-Tometer (TOM)

El Tergo-O-Tometer (TOM) es un sistema de lavado modelo a escala media que se puede aplicar al ensayo de 12 condiciones de lavado diferentes simultáneamente. Un TOM es básicamente un gran baño de agua controlado por temperatura, con hasta 12 vasos de metal abiertos sumergidos. Cada vaso representa una pequeña lavadora de carga superior y, durante un experimento, cada uno de ellos contendrá una solución de un sistema específico de detergente/enzima y los tejidos sucios y no sucios sobre las que se someterá a ensayo su rendimiento. El estrés mecánico se consigue mediante un brazo de agitación rotativo, que agita el líquido (1 litro) dentro de cada vaso. Debido a que los vasos de TOM no presentan tapa, es posible retirar muestras durante un experimento TOM y analizar la información en línea durante el lavado. En un experimento TOM, se pueden variar factores como la proporción entre lastre y suciedad y la proporción entre tejido y solución de lavado. Por lo tanto, TOM proporciona el enlace entre los experimentos a pequeña escala, tales como AMSA y el minilavado, y los experimentos a gran escala, más prolongados en lavadoras de tamaño completo.

Después del lavado y enjuague, las muestras, se extienden planas y se dejan secar al aire a temperatura ambiente durante la noche. Todos los lavados se evalúan el día después del lavado. Las evaluaciones de reflectancia de las muestras se llevan a cabo utilizando un espectrofotómetro de reflectancia Macbeth Color Eye 7000 con una gran apertura. Las mediciones se realizan sin UV en la luz incidente y extrayendo la remisión a 460 nm. Se realizan mediciones en muestras no lavadas y lavadas. La muestra de ensayo que se medirá se coloca encima de otra muestra del mismo tipo y color (muestra gemela).

Los valores de remisión para cada muestra se calculan mediante resta del valor de remisión de la muestra lavada sin enzima (blanco) procedente del valor de la muestra lavada junto con enzima.

El cálculo del efecto de las variantes de proteasa se lleva a cabo tomando las mediciones de las muestras lavadas con enzimas y restando las mediciones de las muestras lavadas sin enzima para cada mancha.

El rendimiento de las nuevas variantes de proteasas se compara con el rendimiento de referencia (REF) = SEQ ID NO 3, mediante el cálculo del rendimiento relativo (RR):

RR = (Rvariante de proteasa - Rblanco) / (Rref - Rblanco)

Ensayo de estabilidad de almacenamiento acelerado

La estabilidad de almacenamiento de las variantes de proteasas en detergente líquido se evaluó utilizando un ensayo acelerado con incubación a temperaturas elevadas durante hasta 24 horas.

Todas las muestras de proteasa purificada se diluyeron a concentraciones de 0,2 y 0,1 mg/ml basándose en la absorbancia a 280 nm y el coeficiente de extinción teórico utilizando Triton X-100 al 0,01 %. Para cada variante, se incluyeron 2 pocillos con alta concentración de proteasa y 2 pocillos con baja concentración. Como referencia, se incluyó SEQ ID NO 3 en cada placa de microtitulación. Se mezclaron 30 pl de muestra de proteasa con 270 pl de detergente (CNS) en el pocillo de una placa de microtitulación (Nunc U96 P<p>0,5 ml) utilizando una barra magnética (en la estación de pipeteado Zephyr (Caliper LifeSciences) durante 30 min). A continuación, se transfirieron 20 pl de esta mezcla a otra placa de microtitulación (Nunc U96 PP 0,5 ml con barras magnéticas añadidas) y se mezclaron con 150 pl de Tris 100 mM, pH 8,6 (por lo menos 5 minutos en Zephyr). Se transfirieron 30 pl de esta dilución a un Nunc F 96-MTP, y después de añadir 70 pl de solución de sustrato, se determinó la actividad inicial de solución de sustrato de muestra no sometida a estrés, mediante medición de la absorbancia a 405 nm cada 20 segundos durante 5 minutos (en un SpectraMax Plus). Después de sellar, la placa con detergente se incubó a una temperatura apropiada (47 °C para CNS EDTA pH 9) en un Thermomixer Eppendorf (sin agitación). Después de 1 a 4 y 20 a 25 horas de incubación, se retiraron muestras de 20 pl y se midió la actividad residual de la muestra sometida a estrés de la misma manera que la actividad inicial, sin estrés.

Se asumió que la disminución de la actividad durante la incubación con detergente era exponencial. Se hallaron las semividas (T1^ ) a partir de la regresión lineal de Log(Actividad) frente al tiempo de incubación (0, 1 a 4 y 20 a 25 horas), y se calcularon los factores de mejora de la semivida (T ^ IF) como semivida de la variante de proteasa respecto a semivida de la referencia SEQ ID NO 3.

Detergente

Ejemplo 1: preparación y expresión de variantes

La introducción de un casete de expresión enBacillus subtilis serealizó mediante la transformación de un casete de expresión adecuado utilizando la competencia natural del organismo.

A continuación se resumen las manipulaciones del ADN, tales como la introducción de mutaciones y la construcción de un casete de expresión enBacillus subtilis.Todas las manipulaciones del ADN se realizaron mediante PCR (p. ej., Sambrook et al.; Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press) y todas las manipulaciones del ADN podrán ser repetidas por cualquier experto en la materia. Se utilizaron constructos recombinantes de B.subtiliscodificantes de variantes de subtilasa para inocular matraces de agitación que contenían un medio rico (p. ej., PS-1: 100 g/l de sacarosa (n.° de cat. de Danisco) 109-0429), 40 g/l de soja de corteza (harina de soja), 10 g/l de Na2HPO4-12H2O (Merck n.° de cat. 6579), 0,1 ml/l replace- Dowfax63N10 (Dow). El cultivo generalmente tuvo lugar durante 4 días a 30 °C bajo agitación a 220 rpm.

Ejemplo 2: fermentación de variantes

La fermentación puede llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos de la técnica o de la siguiente manera. Una cepa de B.subtilisque alberga el plásmido de expresión relevante se sembró en una placa de agar LB y se cultivó durante la noche a 37 °C. Las colonias se transfirieron a 100 ml de medio PS-1 en un matraz bajo agitación de 500 ml.

Las células y otros materiales no disueltos fueron eliminados del caldo de fermentación mediante centrifugación a 4.500 rpm durante 20 a 25 minutos. Después, el sobrenadante se filtró para obtener una solución transparente.

Ejemplo 3: purificación de variantes

El caldo de cultivo se centrifugó (26.000xg, 20 min) y el sobrenadante se decantó cuidadosamente a partir del precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración Nalgene de 0,2 pm para eliminar el resto de las células huésped deBacillus.El pH en el filtrado de 0,2 pm se ajustó a pH 8 con base de Tris 3 M y el filtrado de pH ajustado se aplicó a una columna MEP Hypercel (de Pall corporation) equilibrada en Tris 20 mM/HCl, CaCh 1 mM, pH 8,0. Después del lavado de la columna con el tampón de equilibrado, la columna se eluyó escalonadamente con CH3COOH 20 mM/NaOH, CaCh 1 mM, pH 4,5. Las fracciones de la columna se analizaron para actividad de proteasas (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9) y se agruparon las fracciones pico. El pH del agrupado de la columna MEP Hypercel se ajustó a pH 6 con CH3COOH al 20 % (v/v) o base Tris 3 M, y el agrupado de pH ajustado se diluyó con agua desionizada para que presentase la misma conductividad que MES 20 mM/NaOH, CaCh 2 mM, pH 6,0. El agrupado diluido se aplicó a una columna de SP-sefarosa FF (de GE Healthcare) equilibrada en MES 20 mM/NaOH, CaCl22 mM, pH 6,0. Después del lavado de la columna con el tampón de equilibrado, la proteasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 0,5 M) en el mismo tampón en cinco volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para actividad de proteasas (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9) y las fracciones activas se analizaron mediante SDS-PAGE. Las fracciones, en las que solo se observó una banda en el gel SDS-PAGE teñido con Coomassie, se agruparon como la preparación purificada y se utilizaron para experimentos adicionales.

Ejemplo 4: estabilidad de variantes de la invención

Se generaron y purificaron variantes de la invención tal como se describe en los Ejemplos 1 a 3 y se sometieron a ensayo para estabilidad en detergente líquido a una temperatura de 47 °C utilizando el ensayo de estabilidad mencionado anteriormente y se calculó la semivida. El polipéptido de referencia era subtilasa que presentaba la SEQ ID NO: 3.

Tabla 2: estabilidad de variantes de SEQ ID NO: 3. La primera columna indica la sustitución en SEQ ID NO: 3. La segunda columna indica la semivida observada en el experimento, y en la tercera columna se indican los datos respecto a SEQ ID NO: 3. La última columna indica la desviación estándar.

Todas las variantes presentaban una estabilidad significativamente mejorada en el detergente líquido bajo estas condiciones.

Ejemplo 5: rendimiento de lavado de variantes de subtilisina

El rendimiento de lavado de las variantes de proteasas que presentan la misma secuencia de aminoácidos que SEQ ID NO: 3, excepto por las sustituciones según la tabla a continuación sobre las manchas tal como se indica; la referencia es la proteasa según la SEQ ID NO: 3. Se evaluó en la lavado de tejidos utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA), en el que se puede examinar el rendimiento de lavado de muchas soluciones de detergente enzimático de pequeño volumen. La placa AMSA presenta varias ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que presiona firmemente la muestra de lavado de tejidos, en donde el textil que se va a lavar está presionado contra las aberturas de las ranuras. Durante el lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el textil y la tapa se sometieron a agitación vigorosa para poner la solución de ensayo en contacto con el textil y aplicar estrés mecánico de manera regular, periódica y oscilante. Para una descripción más detallada, ver el documento n.° WO 02/42740, especialmente el párrafo "Special method embodiments" (Realizaciones de método especiales), en las páginas 23 y 24.

Los experimentos de lavado de tejidos se llevaron a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas en la Tabla 3.

Tabla 3:

Se utilizó el detergente modelo tal como se describe en la Tabla 1.

Tabla 4: composición de detergentes modelo y materiales de ensayo

Los materiales de ensayo se obtuvieron del Center For Testmaterials BV, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos.

Se ajustó la dureza del agua a 12 °dH mediante la adición de CaCh, MgChy NaHCO3 (Ca2+:Mg2+= 2:1:4,5) al sistema de ensayo. Después del lavado, los textiles fueron enjuagados con agua corriente y se secaron.

El rendimiento de lavado se midió como el brillo del color del textil lavado. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está teñida, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el rendimiento de lavado.

Las mediciones de color se realizaron con un escáner de cama plana Kodak iQsmart (Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que se utilizó para capturar una imagen del textil lavado.

Para extraer un valor de intensidad de luz de las imágenes escaneadas, los valores de píxel de 24 bits de la imagen se convirtieron en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calculó mediante la suma de los valores RGB como vectores, tomando después la longitud del vector resultante:

Se muestran los resultados en la Tabla 5. Los resultados se proporcionan como rendimiento relativo en comparación con SEQ ID NO: 3 a una concentración de enzima de 30 nM en tres muestras diferentes.

Tabla 5: rendimiento relativo en AMSA de las variantes en comparación con SEQ ID NO 3.

Ejemplo 6: resultado del ensayo de lavado del Terg-O-tómetro (TOM)

El experimento de lavado TOM se llevó a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas a continuación:

Tabla 7: rendimiento relativo en comparación con SEQ ID NO: 3 de variantes de subtilasa que presentan las mutaciones indicadas en comparación con SEQ ID NO:3.

Se utilizó un agente de lavado líquido con la siguiente composición como formulación base (todos los valores en porcentaje de peso): 0 % a 0,5 % de goma xantana, 0,2 % a 0,4 % de agente antiespumante, 0,2 % a 8 % de trietanolamina, 1 % a 7 % de glicerol, 0,3 % a 3 % de etanol, 0 % a 12 % de FAEOS (éter sulfato de alcohol graso), 1 % a 28 % de surfactantes no iónicos, 0,5 % a 4 % de ácido bórico, 0,5 % a 6 % de citrato sódico (dihidrato), 1 % a 6 % de sosa cáustica, 0 % a 16 % de ácido graso de coco, 0,5 % a 6 % de HEDP (1-hidroxietán-(ácido 1,1-difosfónico)), 0 % a 0,4 % de PVP (polivinilpirrolidona), 0 % a 0,05 % de blanqueadores ópticos, 0 % a 0,001 % de colorante, resto de agua desionizada.

Basándose en esta formulación base, se prepararon diversos detergentes mediante la adición de las respectivas proteasas tal como se indica en las Tablas 9. La referencia es la proteasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO.3, en donde la proteasa de referencia ya muestra un buen rendimiento de lavado, especialmente en detergentes líquidos. Se añadieron las proteasas en las mismas cantidades según el contenido total de proteínas (5 mg/l de solución de lavado).

La proporción de dosificación del agente de lavado líquido fue de 4,7 gramos por litro de solución de lavado y el procedimiento de lavado se llevó a cabo durante 60 minutos a una temperatura de 20 °C y de 40 °C, en el que el agua presentaba una dureza entre 15,5° y 16,5° (grados alemanes de dureza).

La blancura, es decir, el aclaramiento de las manchas, se determinó fotométricamente como un indicativo del rendimiento del lavado. Se utilizó un dispositivo espectrómetro Minolta CM508d, que fue calibrado previamente utilizando un patrón blanco proporcionado con la unidad.

Los resultados obtenidos son los valores de diferencia entre las unidades de remisión obtenidas con los detergentes y las unidades de remisión obtenidas con el detergente que contiene la proteasa de referencia. Por lo tanto, un valor positivo indica un rendimiento de lavado mejorado de las variantes en el detergente. Resulta evidente a partir de las Tablas 4a (resultados a 40 °C) y 4b (resultados a 20 °C) que las variantes según la invención muestran un rendimiento de lavado mejorado.

Tablas 4a y b: El rendimiento de lavado a 40 °C de las variantes de proteasa que presentan la misma secuencia de aminoácidos que SEQ ID NO: 3, excepto por las sustituciones según la tabla a continuación sobre las manchas tal como se indica; la referencia es la proteasa según la SEQ ID NO: 3

Tabla a)

Tabla b)

Tablas 4c-f: El rendimiento de lavado a 20 °C de las variantes de proteasa que presentan la misma secuencia de aminoácidos que SEQ ID NO: 3, excepto por las sustituciones según la tabla a continuación sobre las manchas tal como se indica; la referencia es la proteasa según la SEQ ID NO: 3.

Tabla c)

Tabla d)

(continuación)

Tabla e)

Tabla f)

(continuación)

Ejemplo 7: rendimiento de lavado de variantes de subtilisina

Los experimentos de lavado de tejidos se llevaron a cabo bajo las condiciones experimentales especificadas en la Tabla 5.

Tabla 5:

Se utilizó el detergente modelo tal como se describe en la Tabla 1.

Tabla 6: composición de detergentes modelo y materiales de ensayo

Se muestran los resultados en la Tabla 12. Los resultados se proporcionan como rendimiento relativo en comparación con SEQ ID NO: 3 a una concentración de enzima de 30 nM en tres muestras diferentes.

Tabla 7: rendimiento relativo en AMSA de las variantes en comparación con SEQ ID NO 3.

Tabla 8: rendimiento relativo en comparación con SEQ ID NO: 3 a una concentración de enzima de 30 nM en dos muestras diferentes.

Los resultados muestran que las variantes estabilizadas de SEQ ID NO 3 muestran un rendimiento de lavado comparable o mejorado en comparación con el rendimiento de SEQ ID NO 3.

Ejemplo 8: resultado del ensayo de lavado del Terg-O-tómetro (TOM)

Tabla 10: rendimiento relativo en comparación con SEQ ID NO: 3 de variantes de subtilasa que presentan las mutaciones indicadas en comparación con SEQ ID NO:3.

Ejemplo 9: rendimiento de lavado de variantes de proteasas

Las variantes que presentaban las mutaciones indicadas en la Tabla 15 en comparación con SEQ ID NO: 3 se lavaron bajo diferentes condiciones: lavado AMSA con baja concentración de proteasa (30 nM), lavado AMSA con alta concentración de proteasa (300 nM), lavado TOM y lavado a escala completa (FSW). Para los lavados se utilizó el detergente dado a conocer en la Tabla 1 y los materiales de ensayo PC-03 (leche de chocolate/tinta sobre algodón/poliéster). Los resultados se compararon con el rendimiento de la proteasa de referencia que presentaba la SEQ ID NO: 3 y el rendimiento mostrado en la Tabla 15, a continuación, en la que el resultado para la proteasa de referencia se establece en 1,00.

Tabla 11:

(continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

i .Composición detergente que comprende una variante de subtilasa, en donde la variante de subtilasa presenta por lo menos 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, preferentemente por lo menos 95 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 96 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 97 % de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 98 % de identidad de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 3, en el que la variante de subtilasa presenta un residuo de ácido glutámico (E) en la posición 101, y en el que la variante de subtilasa comprende, además, la sustitución P129D, en la que la variante de subtilasa presenta una estabilidad aumentada en una composición detergente líquida en comparación con la subtilasa que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y en donde las posiciones corresponden a las posiciones de SEQ ID NO: 1.
2. Composición detergente según la reivindicación 1, en la que la variante de subtilasa presenta además un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la subtilasa de SEQ ID NO: 3.
3. Composición detergente según la reivindicación 1 o 2, en la que la variante de subtilasa comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: S3T; R45E,D,Q; P55N; T58W,Y,L; Q59D,M,N,T; G61D,R; S87E; G97S; A98D,E,R; S160A,W; N117E; H120D,K,V,N; E136Q; Q137H; S143W; S156D; S161T; S163A,G; Y171L; A172S; N185Q; V199M; Y209W; M222Q; N238H; N261T y L262E,Q,N,D, en la que las posiciones corresponden a las posiciones de la SEQ ID NO: 1.
4. Composición detergente según las reivindicaciones 1 a 3, en la que la variante de subtilasa se selecciona del grupo que consiste en:

SEQ ID NO: 3 P129D, y en la que las posiciones corresponden a las posiciones de la SEQ ID NO: 1.
5. Composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición presenta la forma de una pastilla, una tableta homogénea, una tableta que presenta dos o más capas, una bolsa que presenta uno o más compartimentos, unos polvos regulares o compactos, un gránulo, una pasta, un gel, o un líquido regular, compacto o concentrado.
6. Composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición comprende además uno o más enzimas adicionales seleccionados de proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, xantanas, lacasa y/o peroxidasa.
7. Composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición es una composición detergente para el lavado de ropa o una composición para el lavado de vajillas, preferentemente una composición para el lavado de vajillas a máquina.
8. Utilización de una composición detergente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un procedimiento de lavado.
9. Utilización según la reivindicación 8, en el que el procedimiento de lavado es de lavado de tejidos.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el procedimiento de lavado es de lavado de superficies duras, tal como el lavado de vajillas.
11. Método de eliminación de una mancha de una superficie, que comprende poner en contacto la superficie con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.