ES3061236T3 - Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof - Google Patents

Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof

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Abstract

Se proporciona un polipéptido con una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que se une específicamente a la proteína Axl, así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que contienen dicha región variable y/o la región variable de cadena ligera que se unen a la proteína Axl. También se ofrecen composiciones farmacéuticas y kits que comprenden el polipéptido o los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que contienen el polipéptido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpos anti-axl, fragmentos de anticuerpos y sus inmunoconjugados y usos de los mismos
[0003] CAMPO DE DIVULGACIÓN
[0004] Esta descripción se refiere a anticuerpos anti-Axl, o fragmentos de anticuerpos, inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, e inmunoconjugados.
[0005] ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
[0006] La proteína Axl (también conocida como Ark, UFO, Tyro-7) es un receptor tirasa quirosina en la familia de quinasas Tyro-3. Los receptores quinasa Tyro-3 se caracterizan por una combinación de dos dominios de tipo inmunoglobina y repeticiones dobles de fibronectina tipo III en la región extracelular y un dominio quinasa citoplásmica. Los ligandos para las quinasas del receptor Tyro-3 son Gas6 (crecimiento-detención-específico 6) y proteína S, dos proteínas dependientes de la vitamina K que muestran un 43% de identidad de secuencia de aminoácidos y comparten estructuras de dominio similares. Cada proteína tiene un dominio GIa N-terminal que contiene 11 residuos de ácido gcarboxiglutámico, seguidos por cuatro módulos similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una estructura similar a globlin de unión a la hormona sexual C-terminal (SHBG) que consta de dos dominios tándem de laminina G El dominio SHBG es tanto necesario como suficiente para la unión y activación del receptor de quinasa Tyro-3, mientras que el dominio GIa se une a los fosfolípidos de membrana con carga negativa y desempeña un papel importante en la fagocitosis mediada por quinasa Tyro-3 de células apoptóticas.
[0007] La activación de Axl conduce a la señalización a través de PI-3-quinasa/Akt (Franke et al., Oncogene, vol.22, pp.8983-8998, 2003) y otras vías principales como Ras/Erk y β-catenina/TCF (Goruppi et al. al., Mol. Cell. Biol., Vol.21, pp.902-915, 2001). Axl se expresa débilmente en un rango de tejidos normales, incluyendo cerebro, corazón, músculo esquelético, cápsulas de órganos y tejidos conectivos de otros órganos, y en monocitos, pero no en linfocitos. La fosforilación de Akt inducida por Axl se ha descrito en la supervivencia de fibroblastos (Goruppi et al., Mol. Cell. Biol., Vol.17, pp.4442-44531997), células endoteliales (Hasanbasic et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, vol.287, H1207-H1213, 2004), células del músculo liso vascular (Melaragno et al., J. Mol. Cell. Cardiol., Vol.37, pp.881-887, 2004) y neuronas (Allen et al., Mol. Endocrinol., Vol.13, pp.191-201, 1999). Además, Axl desempeña un papel en la adhesión celular y la quimiotaxis debido a que los animales agotados de Axl muestran una estabilización de agregados plaquetarios deteriorada y formación de trombos como resultado de la activación reducida de la integrina plaquetaria IIb3.
[0008] La desregulación de Axl o su ligando Gas6 está implicada en la patogénesis de una variedad de cánceres humanos. La sobreexpresión de Axl se ha demostrado en varios tipos de cáncer, por ejemplo, de mama(Meric et al., Clin. Cancer Res., vol.8, pp.361-367, 2002; Berclaz et al., Ann. Oncol., vol.12, pp.819-824, 2001), de colon (Chen et al., Int. J. Cancer, vol. 83, pp. 579-584, 1999; Craven et al., Int. J. Cancer, vol. 60, pp. 791-797, 1995), de próstata (Jacob et al., Cancer Detect. Prey., vol. 23, pp. 325-332, 1999), de pulmón (Wimmel et al., Eur J Cancer, vol. 37, pp.
[0009] 2264-2274, 2001), gástrico (Wu et al., Anticancer Res., vol.22, pp.1071-1078, 2002), ovárico (Sun et al., Oncology, vol.
[0010] 66, pp. 450-457, 2004), endometrial (Sun et al., Ann. Oncol., vol.14, pp.898-906, 2003), renal (Chung et al., DNA Cell Biol., vol.22, pp.533-540, 2003), hepatocelular (Tsou et al., Genomics, vol.50, pp.331-340, 1998), de tiroides (Ito et al., Thyroid, vol. 12, pp. 971-975, 2002; Ito et al., Thyroid, vol. 9, pp. 563-567, 1999), y además en leucemia mielógena crónica (Janssen et al., Oncogene, vol.6, pp.2113-2120, 1991; Braunger et al., Oncogene, vol.14, pp.2619-26311997; O'Bryan et al., Mol. Cell. Biol., vol.11, pp.5016-5031, 1991), leucemia mieloide aguda (Rochlitz et al., Leukemia, vol.13, pp. 1352-1358, 1999), osteosarcoma (Nakano et al., J. Biol. Chem., vol. 270, pp. 5702-5705, 2003), melanoma (van Ginkel et al., Cancer Res., vol.64, pp.128-134, 2004), y en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (Green et al., Br J. Cancer., vol.94, pp.1446-5, 2006).
[0011] Recientemente, al perfilar la señalización de fosfotirosina, se detectó Axl activado en aproximadamente el 5% de los tumores primarios de NSCLC (Rikova et al, Cell, vol.131, pp.1190-1203, 2007). La expresión de Axl se induce mediante fármacos de quimioterapia dirigida y la expresión de Axl inducida por fármacos confiere resistencia a la quimioterapia en la leucemia mieloide aguda (Hong et al, Cancer Letters, vol.268, pp.314-324, 2008), así como resistencia a imatinib y Lapatinib/Herceptin en tumores del estroma gastrointestinal (Mehadevan, et al, Oncogene, vol.26, pp.3909-3919, 2007) y cáncer de mama (Liu et al, Cancer Research, vol.281, pp.6871-6878, 2009) , respectivamente.
[0012] Además, se ha identificado que Axl está relacionado con metástasis tumoral porque Axl está regulado positivamente en líneas de células de cáncer de mama agresivas en comparación con las células no invasivas. In vitro, se encontró que la actividad de Axl era necesaria para la migración e invasión, y esta actividad podría inhibirse mediante el tratamiento con anticuerpos (WO 04/008147). Del mismo modo, la anulación de la actividad de Axl in vivo, ya sea a través de la expresión de una versión negativa dominante de Axl (Vajkoczy, P., et al., Proc. Natl Acad Science EUA, vol.103, pp.5799-5804, 2005) o por medio de ARNsi, la regulación negativa de Axl (Holland et al., Cancer Res., Vol.65, pp.9294-9303, 2005) impidió el crecimiento de células subcutáneas y ortotópicas en experimentos de xenoinjerto murino. En Zhu C. et al., Mol. Cancer, 18(1): página 153 (2019), se analizan estrategias para orientar Axl y fármacos dirigidos a Axl para el tratamiento del cáncer.
[0013] En consecuencia, los anticuerpos monoclonales anti-Axl se han descrito para uso en el tratamiento de cánceres. Por ejemplo, las publicaciones relacionadas con los anticuerpos anti-Axl incluyen los documentos WO 2009/063965, WO 2009/062690, WO 2010/130751, WO 2011/014457, WO 2011/159980, WO 2016/005593, US 2014/0227283 y la Patente estadounidense No. 8,853,369. El documento US 2014/0227283 describe anticuerpos monoclonales anti-Axl y sus usos en métodos diagnósticos y terapéuticos. El documento WO 2009/062690 y WO 2009/062690 describen anticuerpos que se unen al dominio extracelular de la proteína Axl y pueden inhibir por lo menos parcialmente la actividad de Axl. El documento WO 2011/159980 divulga anticuerpos anti-Axl que se unen al Axl humano con una afinidad ≤ 600 pM.
[0014] Los métodos y composiciones para la unión dependiente del medio de un agente dirigido (MDTA) a un microobjetivo bajo un conjunto de condiciones de reacción mejor que bajo otro conjunto de condiciones de reacción tales como el pH, se describen en general en WO 2003/105757. El documento US 2005/0260711 describe un método para regular la interacción proteica sensible al pH mediante la inclusión de aminoácidos no naturales en la proteína, como un anticuerpo. El documento US 2014/0235482 describe polipéptidos con un dominio Fc de anticuerpo aglicosilado y que mejoran la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). El documento WO 2016/033331 describe receptores de antígenos quiméricos condicionalmente activos (CAR) y un método para generar CAR a partir de una proteína de tipo salvaje. El documento US 2015/266974 describe anticuerpos con unión dependiente del pH a su antígeno en el que la afinidad por la unión del antígeno a pH fisiológico (pH 7.4) es mayor que a pH endosómico (de 6.0 o 5.5), de modo que los anticuerpos dependientes del pH se disocian preferentemente del antígeno en el endosoma. El documento US 2012/108455 describe un método para desarrollar, seleccionar o producir proteínas terapéuticas condicionalmente activas, como anticuerpos anti-EGFR y anti-CTLA4. Kunik V. et al., PLoS Computational Biology, 8(2): página e10022388 (2012), describe un enfoque estructural de Paratome para la identificación de regiones de unión a antígenos (ABR).
[0015] Estos anticuerpos monoclonales anti-Axl se unirán a Axl en cualquier ubicación del cuerpo de un paciente con afinidad similar, incluso en las ubicaciones de los tumores que están destinados a tratar. Se espera que la unión de dichos anticuerpos a Axl en ambientes no tumorales tenga un efecto adverso en el funcionamiento normal de Axl en estos ambientes y, por lo tanto, puede causar efectos secundarios significativos. La presente invención proporciona anticuerpos anti-Axl condicionalmente activos y fragmentos de anticuerpos que tienen una mayor afinidad de unión a Axl en un microentorno tumoral en comparación con sus afinidades de unión a Axl en un entorno no tumoral. Se espera que los anticuerpos anti-Axl y los fragmentos de anticuerpos de la presente invención tengan una eficacia anticancerígena comparable o mayor con efectos secundarios reducidos, en comparación con los anticuerpos monoclonales anti-Axl conocidos en la técnica. Esto también puede permitir la administración de dosis más altas de los anticuerpos anti-Axl y fragmentos de anticuerpos o un tratamiento más frecuente, proporcionando así una opción terapéutica más efectiva.BREVE DESCRIPCIÓN DE LA DIVULGACIÓN
[0016] En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que tiene tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que tiene tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera. La región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias de SEC ID NOS: 11-13, y la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las SEC ID NOS: 7-10, y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una relación de afinidad de unión a la proteína Axl a un valor de pH de 5.0 a 6.8 en un microambiente tumoral y una afinidad de unión a la proteína Axl a un valor diferente de pH de 7.2 a 7.8 en un microambiente no tumoral de al menos 1.5:1.
[0017] En otro aspecto más, la presente invención proporciona un inmunoconjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, opcionalmente conjugado con un agente seleccionado de un agente quimioterapéutico, un átomo radiactivo, un agente citostático y un agente citotóxico.
[0018] En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o el inmunoconjugado de la invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0019] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0020] Las Figuras 1A-1B muestran alineamientos de secuencia de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera, respectivamente, de anticuerpos anti-Axl de la presente invención.
[0021] La Figura 2 muestra la unión (OD450) de varios anticuerpos condicionalmente activos de la invención al dominio extracelular de Axl a pH 6.0 y pH 7.4. Estos anticuerpos condicionalmente activos fueron más activos a pH 6.0 que a pH 7.4.
[0022] La Figura 3 muestra la selectividad de varios anticuerpos condicionalmente activos de la invención al dominio extracelular de Axl. La selectividad se midió como la relación de la afinidad de unión a una pareja de unión a pH 6.0 a la afinidad de unión a la misma pareja de unión a pH 7.4.
[0023] La Figura 4 muestra por cromatografía de exclusión de tamaño que indica que los anticuerpos condicionalmente activos de la invención no se agregan, como se describe en el Ejemplo 1.
[0024] La Figura 5 muestra la termoestabilidad de los anticuerpos condicionalmente activos de la invención antes y después del choque térmico medido por un ensayo ELISA, como se describe en el Ejemplo 1.
[0025] Las Figuras 6A-6B muestran la selectividad de anticuerpos condicionalmente activos de la invención según se mide por el ensayo SPR en el Ejemplo 1.
[0026] La Figura 7 muestra los perfiles de unión dependientes del pH para la unión de anticuerpos anti-Axl de la presente invención a Axl en tampón KREBS.
[0027] Las Figuras 8A-8E muestran los resultados de otro estudio de destrucción de células utilizando células A549 en las que se emplearon anticuerpos anti-Axl de la presente invención para la destrucción de células a pH 6.0 y pH 7.4 y a diferentes concentraciones de anticuerpos.
[0028] Las Figuras 9A-9D muestran afinidad de unión a Axl humano y Axl de mono cynomolgus para anticuerpos anti-Axl de la presente invención en diferentes tampones y a diferentes niveles de pH.
[0029] Las Figuras 10A-10H muestran la destrucción celular de diferentes líneas celulares a diferentes niveles de pH mediante anticuerpos anti-Axl de la presente invención que se conjugaron con duomicina.
[0030] La Figura 11 muestra la destrucción celular de células A549 a diferentes niveles de pH mediante anticuerpos anti-Axl de la presente invención que se conjugaron con gemcitabina.
[0031] La Figura 12 muestra los efectos sobre el volumen tumoral del tratamiento de ratones xenoinjertados con un anticuerpo anti-Axl conjugado con duomicina de la presente invención.
[0032] Las Figuras 13A-13B muestran la presencia detectada del anticuerpo anti-Axl conjugado con duomicina de la presente invención en la sangre de monos cynomolgus a lo largo del tiempo después de la inyección del conjugado.
[0033] La Figura 14A muestra la presencia detectada de Aspartate transaminasa (AST) en la sangre de monos cynomolgus a lo largo del tiempo comenzando justo antes de la inyección (pre (D-3)) hasta 3 días después de la inyección (post (D-3)) del conjugado.
[0034] La Figura 14B muestra la presencia detectada de Alanine Aspartate transaminasa (ALT) en la sangre de monos cynomolgus a lo largo del tiempo comenzando justo antes de la inyección (pre (D-3)) hasta 3 días después de la inyección (post (D-3)) del conjugado.
[0035] La Figura 15 muestra el recuento de linfocitos en el tiempo en la sangre de monos cynomolgus después de la inyección del conjugado.
[0036] Las Figuras 16A-16B muestran el tratamiento in vivo de ratones que reciben LCLC103H y DU145 respectivamente.
[0038] DEFINICIONES
[0040] Con el fin de facilitar la comprensión de los ejemplos proporcionados en este documento, algunos términos que aparecen con frecuencia se definen en este documento.
[0042] En relación con una cantidad medida, el término “aproximadamente”, como se usa en este documento, se refiere a la variación normal en esa cantidad medida que se esperaría por una persona experta que realiza la medición y ejerce un nivel de cuidado acorde con el objetivo de la medición y la precisión del equipo de medición utilizado. A menos que se indique lo contrario, “aproximadamente” se refiere a una variación de /-10% del valor proporcionado.
[0044] El término “afinidad”, como se usa en el presente documento, se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y generalmente puede representarse por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Las modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.
[0046] El término “afinidad madurada” cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo parental o fragmento de anticuerpo que no posee tales alteraciones, tales alteraciones dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo por un antígeno.
[0048] El término “aminoácido”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto orgánico que contiene un grupo amino (--NH<2>) y un grupo carboxilo (-COOH); preferiblemente como grupos libres o alternativamente después de la condensación como parte de enlaces peptídicos. Los “veinte alfa-aminoácidos formadores de polipéptidos codificados naturalmente” se entienden en la técnica y se refieren a: alanina (ala o A), arginina (arg o R), asparagina (asn o N), ácido aspártico (asp o D) , cisteína (cys o C), ácido glutámico (glu o E), glutamina (gin o Q), glicina (gly o G), histidina (his o H), isoleucina (ile o I), leucina (leu o L) , lisina (lys o K), metionina (met o M), fenilalanina (phe o F), prolina (pro o P), serina (ser o S), treonina (thr o T), triptófano (punta o W), tirosina (tyr o Y) y valina (val o V).
[0049] El término “agente antiangiogénico”, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere con, en cierto grado, el desarrollo de los vasos sanguíneos. Un agente antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o un anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento involucrado en la promoción de la angiogénesis. En una modalidad, un agente antiangiogénico es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), como el bevacizumab (AVASTIN®).
[0050] El término “fragmento de anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única (por ejemplo, scFv). Estos fragmentos de anticuerpos, que conservan cierta capacidad para unirse selectivamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno polipeptídico) del anticuerpo del cual se derivan, pueden prepararse utilizando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, supra).
[0051] El término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina intactas. Se pueden usar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para aislar cantidades preparativas de un antígeno mediante cromatografía de inmunoafinidad. Otros usos diversos de tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son para diagnosticar y/o estadificar la enfermedad (por ejemplo, neoplasia) y para la aplicación terapéutica para tratar la enfermedad, como por ejemplo: neoplasia, enfermedad autoinmune, SIDA, enfermedad cardiovascular, infecciones y similares. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos quiméricos, de tipo humano, humanizados o completamente humanos son particularmente útiles para la administración a pacientes humanos.
[0052] Un fragmento Fab consiste en un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, y puede producirse por digestión de una molécula de anticuerpo completa con la enzima papaína, para producir un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.
[0053] Se puede obtener un fragmento Fab’ de una molécula de anticuerpo tratando una molécula de anticuerpo completa con pepsina, seguida de reducción, para producir una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab’por molécula de anticuerpo tratada de esta manera.
[0054] Se puede obtener un fragmento (Fab’)2 de un anticuerpo tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento (Fab’)2 es un dímero de dos fragmentos Fab’, unidos por dos enlaces disulfuro.
[0055] Un fragmento Fv se define como un fragmento genéticamente modificado que contiene la región variable de una cadena ligera y la región variable de una cadena pesada expresada como dos cadenas.
[0056] Los términos “anticuerpo anti-Axl”, fragmento de anticuerpo anti-Axl y “un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Axl” como se usa en el presente documento se refieren a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse a Axl con una afinidad suficiente para que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para atacar a Axl. En una modalidad, el grado de unión de un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo a una proteína no relacionada con Axl es menor que aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a Axl según se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a Axl tiene una constante de disociación (Kd) de ≦ 1 μM, ≦ 100 nM, ≦ 10 nM, ≦ 1 nM, ≦ 0.1 nM, ≦ 0.01 nM, o ≦ 0.001 nM (eg 10−8 M o menos, o de 10−8M a 10−13M, o de 10−9M a 10−13 M). En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo se une a un epítopo de Axl que se conserva entre Axl de diferentes especies.
[0057] El término “trastorno angiogénico”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier desregulación de la angiogénesis, incluidas las condiciones no neoplásicas y neoplásicas. Las condiciones neoplásicas incluyen, entre otras, las que se describen a continuación (ver, por ejemplo, “Cáncer”). Los trastornos no neoplásicos incluyen, pero no se limitan a, hipertrofia no deseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (AR), psoriasis, placas psoriásicas, sarcoidosis, aterosclerosis, placas ateroscleróticas, retinopatías diabéticas y otras retinopatías de la fibroplastia, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización del injerto corneal, rechazo del injerto corneal, neovascularización retiniana/coroidea, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/SDRA, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, derrames pulmonares malignos, edema cerebral (por ejemplo, asociado a accidente cerebrovascular agudo/traumatismo craneal cerrado/traumatismo), inflamación sinovial, formación de pannus en la AR, miositis osificante, formación de hueso hipertrópico, osteoartritis (OA), ascitis refractaria, enfermedad ovárica poliquística, endometriosis, tercer espaciamiento de enfermedades de fluidos (pancreatitis, síndrome compartimental, quemaduras, enfermedad intestinal), fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como la EII (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), rechazo de aloinjerto renal, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tejido no deseado o aberrante (no canceroso), articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del vello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piógeno, fibroplasias retrolentales, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, derrame pericárdico (como el asociado a pericarditis) y derrame pleural.
[0059] El término “angiogénesis”, como se usa en este documento, se refiere a todos los procesos que involucran a Axl que contribuyen al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, en particular, pero no limitados a, nuevos vasos sanguíneos que suministran tumores. Estos procesos incluyen múltiples eventos celulares como la proliferación, supervivencia, migración y brote de células endoteliales vasculares, atracción y migración de pericitos, así como formación de membrana basal para la estabilización de vasos, perfusión de vasos o secreción de factores angiogénicos por células estromales o neoplásicas, y debe ser estimulado o mediado por actividades no catalíticas o catalíticas de Axl, incluyendo preferiblemente la fosforilación de Axl y/o la transducción de señales mediada por Axl.
[0061] El término “Axl”, como se usa en este documento, se refiere a cualquier Axl nativo de cualquier fuente de vertebrados, incluidos los mamíferos como los primates (por ejemplo, los humanos) y los roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término abarca Axl sin procesar de “longitud completa”, así como cualquier forma de Axl que resulte del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de Axl, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de Axl humano es bien conocida en la técnica y está disponible en bases de datos públicas tales como GenBank.
[0063] El término “activación de Axl”, como se usa en este documento, se refiere a la activación, o fosforilación, del receptor de Axl. En general, la activación de Axl da como resultado la transducción de señales (por ejemplo, la causada por un dominio de quinasa intracelular de un receptor de Axl que fosforila residuos de tirosina en Axl o un polipéptido de sustrato). La activación de Axl puede estar mediada por la unión del ligando de Axl (Gas6) a un receptor de Axl de interés. La unión de Gas6 a Axl puede activar un dominio de cinasa de Axl y, por lo tanto, dar como resultado la fosforilación de los residuos de tirosina en el Axl y/o la fosforilación de los residuos de tirosina en polipéptidos de sustrato adicionales.
[0065] El término “anti-apoptosis mediada por Axl”, como se usa en el presente documento, se refiere a todos los procesos que involucran a Axl que previenen las células humanas, preferiblemente, pero sin limitarse a las células cancerosas humanas, de la muerte celular programada (apoptosis). En particular, se refiere a los procesos que evitan que las células humanas, preferiblemente pero no limitadas a las células cancerosas humanas, induzcan la apoptosis a través de la abstinencia del factor de crecimiento, la hipoxia, la exposición a agentes quimioterapéuticos o la radiación, o el inicio de la mediación del receptor Fas/Apo-1. señalización, y son estimulados o mediados por actividades no catalíticas o catalíticas de Axl, incluyendo preferiblemente la fosforilación de Axl y/o la transducción de señales mediada por Axl.
[0067] El término “unión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la interacción de la región variable o un Fv de un anticuerpo con un antígeno con la interacción que depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítope) en el antígeno. Por ejemplo, una región variable de anticuerpo o Fv reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de proteínas en general. Como se usa en este documento, el término “específicamente vinculante” o “vinculante específicamente” significa que una región variable de anticuerpo o Fv se une o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un antígeno particular que con otro proteínas Por ejemplo, una región variable de anticuerpo o Fv se une específicamente a su antígeno con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que la que se une a otros antígenos. Para otro ejemplo, una región variable de anticuerpo o Fv se une a una proteína de la superficie celular (antígeno) con una afinidad material mayor que a las proteínas relacionadas u otras proteínas de la superficie celular o a los antígenos comúnmente reconocidos por los anticuerpos naturales polireactivos (es decir, por los anticuerpos naturales). se sabe que se unen a una variedad de antígenos que se encuentran naturalmente en los humanos). Sin embargo, la “unión específica” no requiere necesariamente la unión exclusiva o la unión no detectable de otro antígeno, esto se entiende por el término “unión selectiva”. En un ejemplo, la “unión específica” de una región variable de anticuerpo o Fv (u otra región de unión) se une a un antígeno, significa que la región variable de anticuerpo o Fv se une al antígeno con una constante de equilibrio (KD) de 100 nM o menos , como 50nM o menos, por ejemplo 20nM o menos, como, 15nM o menos, o 10 nΜ o menos, o 5nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos.
[0069] Los términos “cáncer” y “canceroso”, como se usan en este documento, se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulada. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
[0070] Los términos “trastorno de proliferación celular” y “trastorno proliferativo”, como se usan en este documento, se refieren a trastornos que están asociados con cierto grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno de proliferación celular es el cáncer.
[0072] El término “agente quimioterapéutico” como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquone, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilaminasas que incluyen altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin y bullatacinone); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachone; lapachol colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluido el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina; briostatina; callystatin; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos como los antibióticos enediyne (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente calicheamicina gamma1I y caliqueamicina omegaI1 (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de integrina alfa-4 oral; dinemina, incluyendo dinemina A; una esperamicina; así como cromóforos de neocarzinostatina y cromóforos relacionados con el cromoproteína enediyne (cromoproteína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azerasina, bleomicinas, cactonomicinas, adenocorrea, adenocorrea, adenocorina, adenocorina, carabicina, carzinofilina, chromomycins, dactinomicina, y otras partes de la especie. , doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolinodoxorrubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, doopsorubicina HCl liposomas inlcientes) (Particiales) (Parciales) Parciales/Parciales/Parciales/Parentalidad (CAELYX®), y desoxydoxorubicina, ypirubicina, yorubicina, yorubicina, marcelomicina, mitomicina, ácido micofenólico, yogalacinina, oligomicina, peplomicina, pencomicina, porfiromicina, puromicina, glucomicina, oligomicina, olcomicina, porfiromicina, purina de pulpa, porospirina, por ej. zorubicina; antimetabolitos como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina demecolcina diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbazina; Complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oregón); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinósido (“Ara-C”); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas desarrolladas con albúmina de paclitaxel (ABRAXANE ™) y docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que evitan que la polimerización de tubulina forme microtúbulos, incluida la vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMF®); retinoides como el ácido retinoico, incluido el bexaroteno (TARGRETIN®); bifosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tilita.), o risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas como la vacuna THERATOPE® y las vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Inhibidor de Bcl-2 como el oblimersen sódico. (GENASENSE®); pixantrona; Inhibidores de EGFR (ver definición más abajo); inhibidores de la tirasa quirosina (ver definición más abajo); inhibidores de la serina-treonina quinasa, tales como la rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibidores de la farnesiltransferasa, como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.
[0073] Los agentes quimioterapéuticos como se definen en el presente documento incluyen “agentes antihormonales” o “terapias endocrinas” que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer. Pueden ser hormonas en sí mismas, entre las que se incluyen: antiestrógenos con perfil mixto agonista/antagonista, incluidos tamoxifeno (NOLVADEX®), 4-hidroxitamoxifeno, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno, droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®) , trioxifeno, keoxifeno, y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), tales como SERM3; antiestrogénicos puros sin propiedades agonistas, como fulvestrant (FASLODEX®) y EM800 (tales agentes pueden bloquear la dimerización del receptor de estrógeno (ER), inhibir la unión al ADN, aumentar el recambio de ER y/o suprimir los niveles de ER); los inhibidores de la aromatasa, incluidos los inhibidores de la aromatasa esteroidea como formestane y exemestano (AROMASIN®), y los inhibidores de la aromatasa no esteroidea como anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida y otros inhibidores de la aromatasa incluyen vorozol (RIVIS) (MEGASE®), fadrozol y 4 (5)-imidazoles; los agonistas de la hormona liberadora de la hormona lutenizante, incluyendo leuprolide (LUPRON® y ELIGARD®), goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, que incluyen progestinas como el acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos como el dietilestilbestrol y la premarina, y andrógenos/retinoides como la fluoximesterona, todo el ácido transretiónico y fenretinida; onapristona; anti-progesterones; reguladores de receptores de estrógeno (ERD); anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
[0075] El término “anticuerpo quimérico” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que la fracción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente diferente. fuente o especie.
[0077] El término “clase” de un anticuerpo, como se usa en este documento, se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan α, δ, ε, γ y μ, respectivamente.
[0079] Los términos “anticuerpo condicionalmente activo” y “fragmento de anticuerpo condicionalmente activo”, como se usan en este documento, se refieren a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es más activo a un valor de una condición en un microentorno tumoral en comparación con un valor diferente de la misma condición en un no.-Microentorno. En comparación con las condiciones en el microentorno no tumoral, las condiciones en el microentorno tumoral pueden incluir un pH más bajo, una concentración más alta de lactato y/o piruvato, hipoxia, una concentración más baja de glucosa y una temperatura ligeramente más alta. Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo condicionalmente activo o fragmento de anticuerpo puede ser virtualmente inactivo a una temperatura corporal normal, pero activo a una temperatura más alta que puede encontrarse en un microentorno tumoral. En otra modalidad más, el anticuerpo condicionalmente activo o fragmento de anticuerpo puede ser menos activo en sangre oxigenada normal que en un entorno menos oxigenado que puede existir en un microentorno tumoral. Existen otras condiciones en el microentorno tumoral conocidas por una persona experta en el campo que también pueden seleccionarse para su uso como la condición que puede desencadenar que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl tengan diferentes actividades a diferentes valores de esa condición.
[0081] El término “constitutivo” como se usa en este documento, como por ejemplo aplicado a la actividad de Axl, se refiere a la actividad de señalización continua de la quinasa receptora que no depende de la presencia de un ligando u otras moléculas activadoras. Dependiendo de la naturaleza de la quinasa receptora, toda la actividad puede ser constitutiva o la actividad del receptor puede activarse aún más por la unión de otras moléculas (por ejemplo, ligandos). Los eventos celulares que conducen a la activación de la quinasa receptora son bien conocidos entre los expertos en la técnica. Por ejemplo, la activación puede incluir oligomerización, por ejemplo, dimerización, trimerización, etc., en complejos receptores de orden superior. Los complejos pueden comprender una única especie de proteína, es decir, un complejo homomérico. Alternativamente, los complejos pueden comprender por lo menos dos especies de proteínas diferentes, es decir, un complejo heteromérico. La formación de complejos puede ser causada, por ejemplo, por la sobreexpresión de formas normales o mutantes de receptor en la superficie de una célula. La formación de complejos también puede ser causada por una mutación específica o mutaciones en un receptor.
[0083] El término “agente citostático”, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición que detiene el crecimiento de una célulain vitrooin vivo. Por lo tanto, un agente citostático puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de células en la fase S. Otros ejemplos de agentes citostáticos incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular al inducir la detención de G0/G1 o la detención de la fase M. El trastuzumab humanizado anti-Her2 anticuerpo (HERCEPTIN®) es un ejemplo de un agente citostático que induce la detención de G0/G1. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II, como la doxorrubicina, la epirubicina, la daunorubicina, el etopósido y la bleomicina. Ciertos agentes que detienen el G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbazina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y el ara-C. Se puede encontrar más información en Mendelsohn e Israel, eds.,Molecular Basis of Cancer, Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs” por Murakami et al. (W.B. Saunders, Filadelfia, 1995), por ejemplo, p.13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos contra el cáncer derivados del tejo. El docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la despolimerización, lo que resulta en la inhibición de la mitosis en las células.
[0084] El término “agente citotóxico”, como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalina, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes de intercalación); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibioticos toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos; y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos descritos a continuación.
[0085] El término “diacuerpos” como se usa en el presente documento se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V<H>) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V<L>) en la misma cadena polipeptídica (V<H>-V<L>). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. El término “funciones efectoras” como se usa en el presente documento se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); Unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación hacia abajo de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, Receptor de células B); y la activación de las células B.
[0086] El término “cantidad efectiva” de un agente como se usa en el presente documento, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y por períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico o profiláctico deseado.
[0087] El término “región Fc” como se usa en este documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. En una modalidad, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, también denominado índice de la UE, como se describe en Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md., 1991.
[0088] El término “marco” o “FR”, como se usa en el presente documento, se refiere a residuos de dominio variable distintos de la región hipervariable (HVR o H1-3 en la cadena pesada y L1-3 en la cadena ligera). El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en V<H>(o V<L>): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
[0089] El término “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” o “anticuerpo completo” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de unión a antígeno (VHor VL) así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada , CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos de longitud completa pueden asignarse a diferentes “clases”. Hay cinco clases principales de anticuerpos de longitud completa: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse en “subclases” (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
[0090] Los términos “célula hospedadora”, “línea celular hospedadora” y “cultivo de células hospedadoras”, como se usan en este documento, se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluida la progenie de dichas células. Las células hospedadoras incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen las células transformadas primarias y la progenie derivada de ellas sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula madre, pero puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada o seleccionada en la célula originalmente transformada se incluye aquí.
[0091] El término “anticuerpo humano” como se usa en este documento es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por una célula humana o humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otros anticuerpos humanos. secuencias de codificación. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
[0092] El término “marco de consenso humano” como se usa en el presente documento es un marco que representa los residuos de aminoácidos que ocurren con mayor frecuencia en una selección de secuencias de inmunoglobulina humana V<L>o V<H>. En general, la selección de las secuencias de inmunoglobulina humana V<L>o V<H>es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols.1-3. En una modalidad, para el V<L>, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., Supra. En una modalidad, para el V<H>, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., Supra.
[0093] El término anticuerpo “humanizado” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanos y residuos de aminoácidos de las FR humanas. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a los de un anticuerpo no humano, y todos o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido humanización.
[0094] El término “región hipervariable” o “HVR” como se usa en el presente documento se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”). En general, los anticuerpos de cuatro cadenas nativas comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Los HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR), siendo esta última de la mayor variabilidad de secuencia y/o involucrada en el reconocimiento de antígenos. Ejemplares de bucles hipervariables ocurren en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., Vol.196, pp.901-9171987) CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3 (Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Salud pública Servicio, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, Md.1991). Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden “residuos que determinan la especificidad” o “SDR”, que son residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de las regiones de los CDR denominados CDR abreviados, o CDRs. Ejemplares de a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) ocurren en los residuos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Ver Almagro y Fransson,Front. Biosci., Vol.13, pp.1619-1633, 2008). A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran aquí de acuerdo con Kabat et al., supra.
[0095] El término “inmunoconjugado” como se usa en este documento es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, que incluyen, entre otras, un agente citotóxico.
[0096] El término “individuo” o “sujeto” tal como se usa en el presente documento se refiere a un mamífero. Los mamíferos incluyen, entre otros, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.
[0097] El término “inhibir el crecimiento o la proliferación celular” como se usa en este documento significa disminuir el crecimiento o la proliferación de una célula por lo menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, o 100%, e incluye inducir la muerte celular.
[0098] El término anticuerpo “aislado” como se usa en este documento es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica a una pureza superior al 95% o 99% según lo determinado, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio iónico o inverso fase de HPLC). Para una revisión de los métodos para evaluar la pureza de los anticuerpos, ver, por ejemplo, Flatman et al.,J. Chromatogr. B., vol.848, pp.79-87, 2007.
[0099] El término ácido nucleico “aislado” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de manera extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
[0100] El término “ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Axl” como se usa en el presente documento se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos (o fragmentos de los mismos), incluidas dichas moléculas de ácido nucleico en un solo vector o por separado. vectores y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
[0101] El término “independiente de ligando” como se usa en el presente documento, como por ejemplo aplicado a la actividad de señalización del receptor, se refiere a la actividad de señalización que no depende de la presencia de un ligando. Un receptor que tenga actividad quinasa independiente del ligando no excluirá necesariamente la unión del ligando a ese receptor para producir una activación adicional de la actividad quinasa.
[0102] El término “metástasis”, como se usa en este documento, se refiere a todos los procesos que involucran a Axl que ayudan a las células cancerosas a dispersarse desde un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y/o sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo y crecer en un foco distante (metástasis) en Tejidos normales en otras partes del cuerpo. En particular, se refiere a eventos celulares de células tumorales tales como proliferación, migración, independencia de anclaje, evasión de la apoptosis o secreción de factores angiogénicos, que subyacen a la metástasis y son estimulados o mediados por actividades no catalíticas o catalíticas de Axl, de preferencia incluyendo Fosforilación de Axl y/o transducción de señales mediada por Axl.
[0103] El término “microentorno” como se usa en este documento significa cualquier porción o región de un tejido o cuerpo que tiene diferencias constantes o temporales, físicas o químicas de otras regiones del tejido o regiones del cuerpo. Para los tumores, el término “microentorno tumoral”, como se usa en el presente documento, se refiere al entorno en el que existe un tumor, que es el área no celular dentro del tumor y el área directamente fuera del tejido tumoral pero que no pertenece al compartimento intracelular de la célula cancerosa en sí. El tumor y el microentorno tumoral están estrechamente relacionados e interactúan constantemente. Un tumor puede cambiar su microentorno, y el microentorno puede afectar la forma en que un tumor crece y se propaga. Típicamente, el microentorno tumoral tiene un pH bajo en el rango de 5.8 a 7.0, más comúnmente en el rango de 6.2 a 6.8, más comúnmente en el rango de 6.4-6.8. Por otro lado, un pH fisiológico normal suele estar en el rango de 7.2 a 7.8. También se sabe que el microentorno tumoral tiene una menor concentración de glucosa y otros nutrientes, pero una mayor concentración de ácido láctico, en comparación con el plasma sanguíneo. Además, el microentorno tumoral puede tener una temperatura de 0.3 a 1°C más alta que la temperatura fisiológica normal. El microentorno tumoral se ha discutido en Gillies et al., “MRI of the Tumor Microenvironment”,Journal of Magnetic Resonance Imaging, vol.16, pp.430-450, 2002. El término “microentorno no tumoral” se refiere a un microentorno en un sitio que no sea un tumor.
[0104] El término “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, a excepción de posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen naturalmente ocurren mutaciones o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, dichas variantes generalmente están presentes en pequeñas cantidades. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador “monoclonal” indica que el carácter del anticuerpo se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la presente invención se pueden producir mediante una variedad de técnicas, que incluyen, entre otras, el método del hibridoma, los métodos de ADN recombinante, los métodos de exposición de fagos y los métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los loci de inmunoglobulina humana, tales métodos y otros métodos ejemplares para hacer anticuerpos monoclonales se describen en el presente documento.
[0105] El término “anticuerpo puro” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo puro puede estar presente en una formulación farmacéutica.
[0106] El término “anticuerpos nativos”, como se usa en el presente documento, se refiere a los naturales Moléculas de inmunoglobulina con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por disulfuro. Desde el extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (V<H>), también denominada dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De manera similar, desde el extremo N al término C, cada cadena ligera tiene una región variable (V<L>), también llamada dominio variable de luz o dominio variable de cadena ligera, seguida de un dominio de luz constante (C<L>). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, llamados kappa (κ) y lambda (λ), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
[0107] El término “prospecto” como se usa en este documento se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, la terapia de combinación, las contraindicaciones y/o las advertencias relacionadas con el uso de tales productos terapéuticos.
[0108] El término “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia como se usa en este documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible públicamente como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines del presente documento, los valores de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha archivado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado bajo el Registro de Derechos de Autor de los EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluido UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
[0109] En situaciones en las que ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A, con, o en contra de una secuencia de aminoácidos determinada B (que puede alternarse como un aminoácido dado) la secuencia A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B) determinada se calcula de la siguiente manera:
[0111] 100 * (X/Y)
[0112] en donde X es el número de residuos de aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de A y B de ese programa, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el% de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al% de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos que se especifique lo contrario, todos% los valores de identidad de la secuencia de aminoácidos utilizados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.
[0113] El término “formulación farmacéutica” como se usa en el presente documento se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en el mismo sea efectiva, y que no contenga componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto para el cual el Se administraría la formulación.
[0114] El término “portador farmacéuticamente aceptable” como se usa en el presente documento se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante, o conservador.
[0115] Los términos “purificado” y “aislado” utilizados aquí se refieren a un anticuerpo de acuerdo con la invención o a una secuencia de nucleótidos, de que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término “purificado” como se usa aquí significa preferiblemente por lo menos 75% en peso, más preferiblemente por lo menos 85% en peso, más preferiblemente todavía por lo menos 95% en peso, y lo más preferiblemente por lo menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas de el mismo tipo están presentes. Una molécula de ácido nucleico “aislada” que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o fracciones adicionales que no afectan de manera perjudicial a las características básicas de la composición.
[0116] El término “anticuerpo recombinante” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado o humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se expresa por una célula hospedadora recombinante que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Los ejemplos de “células hospedadoras” para producir anticuerpos recombinantes incluyen: (1) células de mamíferos, por ejemplo, ovario de hámster chino (CHO), COS, células de mieloma (incluidas las células Y0 y NS0), riñón de hámster (BHK), Células Hela y Vero; (2) células de insecto, por ejemplo, sf9, sf21 y Tn5; (3) células vegetales, por ejemplo, plantas que pertenecen al género Nicotiana (por ejemplo, Nicotiana tabacum); (4) células de levadura, por ejemplo, las que pertenecen al géneroSaccharomyces(por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae) o el géneroAspergillus(por ejemplo,Aspergillus niger); (5) células bacterianas, por ejemplo células deEscherichia coli o células deBacillus subtilis, etc.
[0117] El término “cantidad terapéuticamente efectiva” del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención significa una cantidad suficiente del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para tratar una enfermedad o afección, con una relación razonable de riesgo/beneficio aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y las composiciones de la presente invención serán decididos por el médico a cargo dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente efectiva específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; actividad del anticuerpo específico o fragmento de anticuerpo empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del anticuerpo específico o fragmento de anticuerpo empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el anticuerpo específico empleado; y factores similares bien conocidos en las artes médicas. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica de la técnica iniciar dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.
[0118] El término “Fv de cadena única” (“scFv”) como se usa en este documento es un heterodímero V<H>:V<L>enlazado covalentemente que generalmente se expresa a partir de una fusión de genes que incluye genes V<L>y codificadores V<L>unidos por un enlazador que codifica péptidos. “DsFv” es un heterodímero V<H>:V<L>estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFvs monovalentes, o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.
[0119] El término “tratamiento”, “tratar” o “que trata”, como se usa en el presente documento, se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se está tratando, y se puede realizar ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis y disminuir la tasa de enfermedad. progresión, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para retardar la progresión de una enfermedad.
[0120] El término “tumor”, como se usa en el presente documento, se refiere a todo el crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos “cáncer”, “canceroso”, “trastorno proliferativo celular”, “trastorno proliferativo” y “tumor” no se excluyen mutuamente como se menciona aquí.
[0121] El término “región variable” o “dominio variable”, como se usa en el presente documento, se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (V<H>y V<L>, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, y cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al.Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un solo dominio V<H>o V<L>puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse utilizando un dominio V<H>o V<L>de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios V<H>o V<L>complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al.,J. Immunol.,Vol.150, pp.880-887, 1993; Clarkson et al., Nature, vol.352, pp.624-628, 1991.
[0122] El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unida. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en el presente documento como “vectores de expresión”.
[0123] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0124] Se debe tener en cuenta que, tal como se utiliza en el presente documento, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, los términos “un” (o “uno” y “una”), “uno o más” y “por lo menos uno” se pueden usar indistintamente en este documento. Los términos “que comprende”, “que incluye”, “que tiene” y “construido a partir de” también se pueden usar de manera intercambiable.
[0125] A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades como el peso molecular, porcentaje, proporción, condiciones de reacción, etc., utilizados en la especificación deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”, si el término “aproximadamente” está presente o no. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la especificación son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener en la presente divulgación. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse por lo menos a la luz del número de dígitos significativos informados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo ordinarias. A pesar de que los rangos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la divulgación son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
[0126] Debe entenderse que cada componente, compuesto, sustituyente o parámetro descrito en el presente documento debe interpretarse como que se describe para su uso solo o en combinación con uno o más de cada uno de los demás componentes, compuestos, sustituyentes o parámetros descritos en el presente documento.
[0127] También debe entenderse que cada cantidad/valor o rango de cantidades/valores para cada componente, compuesto, sustituyente o parámetro descrito en el presente documento debe interpretarse como también divulgado en combinación con cada cantidad/valor o rango de cantidades/valores divulgado para cualquier otro componente(s), compuesto(s), sustituyente(s) o parámetro(s) descrito(s) en el presente documento y que cualquier combinación de cantidades/valores o rangos de cantidades/valores para dos o más componentes, El (los) sustituto(s) o los parámetros descritos en este documento también se describen en combinación unos con otros para los fines de esta descripción.
[0128] Además, se entiende que cada límite inferior de cada rango descrito en el presente documento debe interpretarse como se describe en combinación con cada límite superior de cada rango descrito en el presente documento para el mismo componente, compuestos, sustituyente o parámetro. Por lo tanto, una divulgación de dos rangos se debe interpretar como una revelación de cuatro rangos derivados combinando cada límite inferior de cada rango con cada límite superior de cada rango. Una divulgación de tres rangos se debe interpretar como una revelación de nueve rangos derivados de la combinación de cada límite inferior de cada rango con cada límite superior de cada rango, etc. Además, las cantidades/valores específicos de un componente, compuesto, sustituyente o parámetro descrito en la descripción o en un ejemplo deben interpretarse como una divulgación de un límite inferior o superior de un rango y, por lo tanto, pueden combinarse con cualquier otro valor inferior. o el límite superior de un rango o una cantidad/valor específico para el mismo componente, compuesto, sustituyente o parámetro descrito en otra parte de la solicitud para formar un rango para ese componente, compuesto, sustituyente o parámetro.
[0129] A. Regiones de Anticuerpos Anti-Axl o Fragmentos de Anticuerpos
[0130] En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la proteína Axl humana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye tres regiones determinantes de complementariedad, secuencias H1, H2 y H3, y una región variable de cadena ligera que incluye tres regiones determinantes de complementariedad L1, L2 y L3, en donde
[0131] la región variable de cadena pesada está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias SEC ID NOS: 11-13,
[0132] y la región variable de cadena ligera está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias SEC ID NOS: 7-10.
[0133] La alineación de las regiones variables de cadena pesada se muestra en la Figura 1A, donde las regiones determinantes de la complementariedad H1, H2 y H3 están en recuadro.
[0134] La alineación de las regiones variables de cadena ligera se muestra en la Figura 1B, donde las regiones determinantes de la complementariedad L1, L2 y L3 están en recuadro.
[0135] Los polipéptidos de región variable de cadena pesada aislados y polipéptidos de región variable de cadena ligera aislados se identifican a partir de un anticuerpo parental usando un método descrito en la patente estadounidense No. 8,709,755. La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo parental (063-hum10F10) también están alineadas en las Figuras 1A-1B para mostrar las mutaciones en los polipéptidos aislados de la región variable de la cadena pesada y los polipéptidos aislados de la región variable de la cadena ligera.
[0136] El ADN que codifica el anticuerpo de tipo salvaje se desarrolló para generar una biblioteca de anticuerpos mutantes mediante el uso de la Evolución Positiva Comprensiva (CPE), en la que cada posición en el anticuerpo de plantilla se aleatoriza una por una. Cada anticuerpo mutante en la biblioteca tiene una sola mutación puntual. Los anticuerpos mutantes en la biblioteca se generaron mediante la selección simultánea de la afinidad de unión selectiva a Axl a pH 6.0 sobre pH 7.4 mediante ELISA. Se utilizaron dos diluciones de anticuerpos mutantes: diluciones 1:3 y 1:9. Los anticuerpos mutantes que tienen por lo menos 1.5 relación de afinidad de unión a pH 6.0 a pH 7.4 bajo dilución 1:3 o 1:9 se seleccionan como anticuerpos condicionalmente activos, con las mutaciones puntuales indicadas en cada una de las cadenas pesada y ligera. región variable de la cadena (Tablas 1 y 2).
[0137] TABLA 1: Regiones variables de cadena pesada de anticuerpo anti-Axl condicionalmente activo
[0139]
[0141] Tabla 2: Regiones variables de cadena ligera del anticuerpo anti-Axl condicionalmente activo
[0143]
[0145] En otro aspecto, útil para entender la invención, se identificaron las regiones variables de cadena pesada como se representan en la FIG.1A y las regiones variables de cadena ligera como se presentan en la FIG.1B. Algunas regiones variables de cadena pesada están codificadas por secuencias de ADN con las SEC ID No: 11-13. Algunas regiones variables de cadena ligera están codificadas por secuencias de ADN con las SEC ID No: 7-10. Estas regiones variables de cadena pesada y ligera pueden unirse específicamente a Axl. Se ha encontrado que los anticuerpos que comprenden una de estas regiones variables de cadena pesada y ligera tienen una mayor afinidad de unión a Axl a un pH encontrado en el microentorno tumoral que a un pH en un microentorno no tumoral.
[0146] En una modalidad útil para entender la invención, la presente descripción también incluye variantes de las regiones variables de cadena pesada y ligera presentadas en las Figuras 1A-1B y codificadas por secuencias de ADN con SEC ID No: 9-13 que pueden unirse específicamente a Axl. Para obtener estas variantes, se determinó que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones variables de cadena pesada (H1-H3) y las CDR de las regiones variables de cadena ligera (L1-L3) deben permanecer intactas.
[0147] Al derivar estas variantes, una se guía por el proceso como se describe en este documento. Las variantes de estas regiones variables de cadena pesada y ligera pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Se puede hacer cualquier combinación de eliminación (es), inserción (s) y sustitución (s) para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea por lo menos una de las características deseadas, por ejemplo, la unión a antígeno.
[0148] Variantes de Sustitución, Inserción y Eliminación
[0149] Se proporcionan variantes de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las CDR y las regiones marco (FR). Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 3 bajo el encabezado de “sustituciones conservadoras”. Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 3 bajo el encabezado de “sustituciones ejemplares”, y como se describe más adelante en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de interés y los productos seleccionados para una actividad deseada, por ejemplo, la unión a antígeno retenida/mejorada, o la inmunogenicidad disminuida.
[0150] Tabla 3: Sustituciones de aminoácidos
[0153]
[0155] Los aminoácidos pueden agruparse según las propiedades comunes de cadena lateral:
[0156] (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0157] (2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0158] (3) ácido: Asp, Glu;
[0159] (4) básico: His, Lys, Arg;
[0160] (5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
[0161] (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0162] Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
[0164] Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para el estudio adicional tendrá modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo parental y/o habrá retenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas de la anticuerpo parental Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de afinidad basadas en la presentación de fagos, tales como las descritas en este documento. Brevemente, uno o más residuos de CDR se mutan y los anticuerpos variantes se muestran en el fago y se analizan para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
[0166] Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las CDR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden hacer en los “puntos calientes” de la CDR, es decir, los residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury,Methods Mol. Biol., Vol.207, pp.179-196, 2008), y/o SDR (a-CDRs), con la variante resultante VH o VL que se está probando para determinar la afinidad de unión. La maduración de la afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. enMethods in Molecular Biology, vol.178, pp.1-37, 2001). En algunas modalidades útiles para entender la maduración por afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, combinación de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. La biblioteca se selecciona para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos por CDR, en los cuales varios residuos de CDR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) son aleatorizados. Los residuos de CDR implicados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, utilizando mutagénesis o modelado de alanina. CDR-H3 y CDR-L3 en particular son a menudo objetivos.
[0168] En ciertas modalidades, útiles para entender la invención pueden ocurrir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de uno o más HVR, siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras (por ejemplo, Las sustituciones conservadoras que se proporcionan en este documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión se pueden realizar en las CDR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los “puntos calientes” de CDR o SDR. En ciertas modalidades útiles para entender la invención, de las secuencias V<H>y V<L>variantes son proporcionadas anteriormente, cada CDR no está alterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
[0170] Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que puede ser objeto de mutagénesis se denomina “mutagénesis de escaneo de alanina” como se describe en Cunningham y Wells,Science, vol.244, pp.1081-1085, 1989. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido con carga neutra o negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden seleccionarse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes pueden examinarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.
[0172] Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasequentes de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción del anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.
[0174] Se contemplan las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado simplemente injertando CDR en V<H>y V<L>de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR de V<H>y V<L>de un anticuerpo humano, la actividad de unión del antígeno se reduce en comparación con la de El anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios residuos de aminoácidos de V<H>y V<L>del anticuerpo no humano, no solo en las CDR sino también en las FR, están asociados directa o indirectamente con la actividad de unión al antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos residuos de aminoácidos con diferentes residuos de aminoácidos derivados de las FR de las V<H>y V<L>del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión. Para resolver el problema, en los anticuerpos injertados con CDR humana, se deben hacer intentos para identificar, entre las secuencias de aminoácidos de la FR de la V<H>y la V<L>de los anticuerpos humanos, un residuo de aminoácido que está directamente asociado con la unión al anticuerpo, o que interactúa con un residuo de aminoácido de CDR, o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociada con la unión al antígeno. La actividad reducida de unión al antígeno podría aumentarse reemplazando los aminoácidos identificados con residuos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (−0.4); treonina (−0.7); serina (−0.8); triptófano (−0.9); tirosina (−1.3); prolina (−1.6); histidina (−3.2); glutamato (−3.5); glutamina (−3.5); aspartato (−3.5); asparagina (−3.5); lisina (−3.9); y arginina (−4.5).
[0175] Dos secuencias de aminoácidos son “sustancialmente homólogas” o “sustancialmente similares” cuando más del 80%, preferiblemente más del 85%, preferiblemente más del 90% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente el 90%, preferiblemente más del 95%, son similares (funcionalmente idénticos) en toda la longitud de la secuencia más corta. Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineación utilizando, por ejemplo, el programa de acumulación de GCG (Genetics Computer Group, Manual de Programa para el Paquete GCG, Versión 7, Madison, WI), o cualquiera de los algoritmos de comparación de secuencias como BLAST, FASTA, etc.
[0176] Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntaje hidropático similar y aún pueden dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente.
[0177] Como se describió anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
[0178] Variantes de la Región Fc
[0179] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo, generando así una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
[0180] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, una variante de anticuerpo puede poseer algunas, pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la vida media del anticuerpoin vivoes importante, pero ciertas funciones efectoras (como ADCC) son innecesarias o perjudicial Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcγR (por lo tanto, probablemente carezca de actividad ADCC), pero retiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcγRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 5 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rdo. Immunol., Vol.9, pp.457-492, 1991. Los ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en las patentes estadounidenses No. 5,500,362 (véase también, por ejemplo, Hellstrom et al.Proc. Nat'l Acad. Sci.EUA, vol.83, pp.7059-7063, 1986) y Hellstrom, I et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci.EUA, vol.82, pp.1499-1502, 1985; Patente estadounidense No. 5,821,337 (véase también Bruggemann et al., J. Exp. Med.,Vol.166, pp.1351-1361, 1987). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, California; y el ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al.Proc. Nat'l Acad. Sci.EUA, vol.95, pp.652-656, 1998. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por lo tanto, carece de actividad de CDC. Véase, por ejemplo, el ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods, vol.202, pp.163-171, 1996; Cragg, M. S. et al.,Blood, vol.101, pp.1045-1052, 2003; y Cragg, M. S, y M. J. Glennie,Blood, vol.103, pp.2738-2743, 2004). La unión a FcRn y las determinaciones de eliminación/vida media in vivo también se pueden realizar usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Petkova, S. B. et al.,Int'l. Immunol., Vol.18, pp.1759-1769, 2006).
[0181] Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 de la región Fc (Patente estadounidense No. 6,737,056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el llamado mutante Fc “DANA” con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente estadounidense No.7,332,581).
[0182] Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión mejorada o disminuida a FcRs. (Véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No.6,737,056; WO 2004/056312, y Shields et al.,J. Biol. Chem., Vol.9, pp.6591-6604, 2001.
[0183] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración de residuos en la UE).
[0184] En algunas modalidades útiles para entender la invención, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión C1q alterada (es decir, mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense No. 6,194,551, WO 99/51642, e Idusogie et al.J. Immunol., Vol.164, pp.4178-4184, 2000.
[0185] Los anticuerpos con vidas medias aumentadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al.,J. Immunol., Vol.117, pp.587-593, 1976 y Kim et al.,J. Immunol.,Vol.24, p.249, 1994), se describen en el documento US2005/0014934. Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen/e aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (Patente estadounidense No.7,371,826). Véase también Duncan & Winter,Nature, vol.322, pp.738-740, 1988; Patente estadounidense No. 5,648,260; Patente estadounidense No. 5,624,821; y el documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.
[0186] Variantes de Anticuerpos Diseñados por Cisteína
[0187] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, puede ser deseable crear anticuerpos diseñados por cisteína, por ejemplo, “tioMAbs”, en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo están sustituidos con residuos de cisteína. En particular, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se colocan de ese modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros fracciones, tales como fracciones de fármaco o fracciones enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe más adelante en este documento. Uno o más de los siguientes residuos pueden estar sustituidos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de la UE) de la cadena pesada; y 5400 (numeración de la UE) de la región de la cadena pesada Fc. Los anticuerpos modificados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense No.7,521,541.
[0188] Derivados de Anticuerpos
[0189] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede modificarse adicionalmente para contener fracciones no proteicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Las fracciones adecuados para la derivación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli 1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de propileno/óxido de etileno, poli (polioxietileno) polioles (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o el tipo de polímeros utilizados para la derivación pueden determinarse en función de consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a mejorar, si el derivado se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.
[0190] En otra modalidad útil para entender la invención, se proporcionan conjugados de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un resto no proteico que puede calentarse selectivamente por exposición a radiación. En una modalidad, la fracción no proteica es un nanotubo de carbono (Kam et al.,Proc. Natl Acad Sci. EUA, vol.102, pp.11600-11605, 2005). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan a las células comunes, pero que calientan la fracción no proteica a una temperatura a la que se destruyen las células proximales al resto anticuerpo-no proteico.
[0191] En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo que incluye los polipéptidos de región variable de cadena pesada aislados o polipéptidos de región variable de cadena ligera aislados. Los polipéptidos aislados de la región variable de la cadena pesada comprenden las regiones H1, H2 y H3 con las SEC ID No: 1-3, respectivamente. Los polipéptidos aislados de la región variable de la cadena ligera comprenden las regiones L1, L2 y L3 con SEC ID No: 4-6, respectivamente.
[0193] El anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo de la invención tiene una mayor afinidad de unión a Axl bajo una condición en el microentorno tumoral que bajo una condición en un microentorno no tumoral. En una modalidad, la condición en el microentorno tumoral y la condición en un microentorno no tumoral son ambos pH. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl de la invención pueden así unirse selectivamente a Axl a un pH de aproximadamente 5-6.8 pero tendrán una menor afinidad de unión a Axl a un pH de 7.2-7.8 encontrado en un ambiente fisiológico normal. Como se muestra en los Ejemplos 3-4, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl tienen una mayor afinidad de unión a pH 6.0 que a pH 7.4.
[0195] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos tienen una constante de disociación (Kd) con Axl bajo una condición en el tumor micronentorno de aproximadamente ≦ 1 μM, ≦ 100 nM, ≦ 10 nM, ≦ 1 nM, ≦ 0,1 nM, ≦ 0,01 nM o ≦ 0,001 nM (por ejemplo, 10−8 M o menos, o de 10−8M a 10−13M, o de 10−9 a 10−13 m). En una modalidad, la relación de la Kd del anticuerpo o fragmento de anticuerpo con Axl a un valor de la condición en el microentorno tumoral a la Kd a un valor diferente de la misma condición en el micronambiente no tumoral es por lo menos aproximadamente 1.5:1, por lo menos aproximadamente 2:1, por lo menos aproximadamente 3:1, por lo menos aproximadamente 4:1, por lo menos aproximadamente 5:1, por lo menos aproximadamente 6:1, por lo menos aproximadamente 7:1, por lo menos aproximadamente 8:1, a por lo menos aproximadamente 9:1, por lo menos aproximadamente 10:1, por lo menos aproximadamente 20:1, por lo menos aproximadamente 30:1, por lo menos aproximadamente 50:1, por lo menos aproximadamente 70:1, o por lo menos aproximadamente 100:1.
[0197] En una modalidad útil para entender la invención, Kd se mide mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno utilizando el siguiente ensayo. La afinidad de unión de la solución de los Fab para el antígeno se mide al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (<125>I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y luego capturar el antígeno unido con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al.,J. Mol. Biol.293: 865-881
[0199] (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) se revisten durante la noche con 5 μg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6), y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc # 269620), el antígeno [<125>I] 100 pM o 26 pM se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, de acuerdo con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al.,Cancer Res.57: 4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba luego durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación en la sala. temperatura (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0.1% (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 μl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20% de la unión máxima se eligen para uso en ensayos de unión competitiva.
[0201] De acuerdo con otra modalidad útil para entender la invención, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado en aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, a 5 μg/ml (<~>0.2 μM) antes de la inyección a un caudal de 5 μl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1M para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con un 0.05% de polisorbato 20 (TWEEN-20™) surfactante (PBST) a 25°C a un caudal de aproximadamente 25 μl/min. Las tasas de asociación (k<on>) y las tasas de disociación (k<off>) se calculan utilizando un modelo de enlace de Langmuir uno a uno simple (BIACORE® Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensores de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación k<off>/k<on>. Véase, por ejemplo, Chen et al.,J. Mol. Biol.293: 865-881 (1999). Si la velocidad de activación supera los 106 M<−1>s<−1>mediante el ensayo de resonancia de plasmón de superficie anterior, la velocidad de activación puede determinarse utilizando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo antigénico 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según se mide en un espectrómetro, como un espectrofómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
[0203] Los anticuerpos anti-Axl pueden ser un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, se emplea un fragmento de anticuerpo anti-Axl, por ejemplo, un Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un fragmento de F(ab’)2 y se formaron anticuerpos multiespecíficos. a partir de fragmentos de anticuerpos. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto u otra clase de anticuerpos o isotipo como se define en el presente documento. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, ver Hudson et al.Nat. Med., Vol.9, pp.129-134, 2003. Para una revisión de los fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), páginas 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes estadounidenses Nos.5,571,894 y 5.587.458. Para una discusión de los fragmentos de Fab y F(ab’)2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de salvamento y que tienen una vida media in vivo incrementada, véase la patente estadounidense Nº 5,869,046.
[0204] Los diacuerpos de la invención pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, el documento EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al.,Nat. Med.9: 129-134 (2003); y Hollinger et al.,Proc. Natl Acad Sci.EUA, vol.90, pp.6444-6448, 1993 para ejemplos de diacuerpos. Ejemplos de triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al.,Nat. Med.,Vol.9, pp.129-134, 2003.
[0205] Los fragmentos de anticuerpos pueden prepararse mediante diversas técnicas, que incluyen, entre otras, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por parte de células hospedadoras recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), como se describe en el presente documento.
[0206] En algunas modalidades útiles para entender la invención, los anticuerpos anti-Axl pueden ser anticuerpos quiméricos. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense Nº 4,816,567; y Morrison et al.,Proc. Natl Acad Sci.EUA, vol.81, pp.6851-6855, 1984). En un ejemplo, el anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo de “cambio de clase” en el que la clase o subclase del anticuerpo se ha cambiado en relación con la clase o subclase del anticuerpo principal. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
[0207] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano de este tipo se humaniza para reducir la inmunogenicidad para los seres humanos, al tiempo que conserva la especificidad y la afinidad del anticuerpo parental no humano. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las CDR (o partes de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también puede comprender opcionalmente por lo menos una porción de una región constante humana. Algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado están sustituidos con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de CDR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
[0208] Los anticuerpos humanizados y los métodos para hacerlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson,Front. Biosci., Vol.13, pp.1619-1633, 2008, y se describen con más detalle, por ejemplo, en Riechmann et al.,Nature, vol.332, pp.323-329, 1988; Queen et al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA, vol.86, pp.10029-10033, 1989; Patentes estadounidenses Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 y 7,087,409; Kashmiri et al.,Methods, vol.36, pp.25-34, 2005 (que describe el injerto SDR (a-CDR)); Padlan,Mol. Immunol.,Vol.28, pp. 489-498, 1991 (que describe “repavimentación”); Dall'Acqua et al.,Methods, vol.36, pp.43-60, 2005 (que describe “FR shuffling”); y Osbourn et al.,Methods, vol.36, pp.61-68, 2005 y Klimka et al., Br.J. Cancer, vol.83, pp.252-260, 2000 (que describe el enfoque de “selección guiada” para el barajado de FR).
[0209] Las regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, entre otras, las regiones marco seleccionadas usando el método de “mejor ajuste” (ver, por ejemplo, Sims et al.J. Immunol., Vol.151, p.2296, 1993); regiones marco derivadas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al.Proc. Natl Acad Sci. EUA, vol.89, p.4285, 1992; y Presta et al.J. Immunol., Vol.151, p.2623, 1993); regiones de marco humano maduras (mutadas somáticamente) o regiones de marco de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci.,Vol. 13, pp.1619-1633, 2008); y regiones marco derivadas de la selección de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al.,J. Biol. Chem.,Vol.272, pp.10678-10684, 1997 y Rosok et al.,J. Biol. Chem.,Vol.271, pp.22611-22618, 1996).
[0210] En algunas modalidades útiles para entender la invención, los anticuerpos anti-Axl son multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para por lo menos dos sitios diferentes. Una de las especificidades de unión es para Axl y la otra para otro antígeno. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de Axl. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan Axl. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.
[0211] Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadenas de cadenas ligeras y cadenas pesadas de inmunoglobulinas que tienen diferentes especificidades (ver Milstein y Cuello,Nature, vol.305, pp.537-540, 1983), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. vol.10, pp.3655-3659, 1991), y la ingeniería de “perilla en el orificio” (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No.5,731,168). También se pueden producir anticuerpos multiespecíficos mediante la ingeniería de los efectos de la dirección electrostática para la fabricación de moléculas heterodiméricas Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 4,676,980, y Brennan et al.,Science, vol.229, pp.81-83, 1985); usar cierres de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny et al.,J. Immunol., vol.148, pp.1547-1553, 1992); el uso de la tecnología “diacuerpo” para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al.,Proc. Natl Acad Sci.EUA, vol.90, pp.6444-6448, 1993); y el uso de dímeros Fv de una sola cadena (scFv) (ver, por ejemplo, Gruber et al.,J. Immunol.,Vol.152, pp.5368-5374, 1994); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al.J. Immunol.,Vol.147, pp.60-69, 1991.
[0212] Los anticuerpos diseñados con tres o más sitios de unión a antígenos funcionales, que incluyen “Anticuerpos Pulposos”, también se incluyen aquí (ver, por ejemplo US 2006/0025576A1).
[0213] El anticuerpo o fragmento de anticuerpo también puede incluir un “Fab de doble acción” o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a Axl así como otro antígeno diferente (ver, US 2008/0069820, por ejemplo).
[0214] Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, que se describen en detalle en el documento US 2016/0017040.
[0215] Las propiedades físicas/químicas y/o las actividades biológicas de los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden probar y medir mediante diversos ensayos conocidos en la técnica. Algunos de estos ensayos se describen en la Patente Estadounidense No.8,853,369.
[0216] B. Inmunoconjugados
[0217] En otro aspecto, la invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-Axl aquí conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, proteínas toxinas, toxinas enzimáticamente activas de bacterias, hongos, de origen vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o isótopos radiactivos.
[0218] En una modalidad, el inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, que incluyen, entre otros, un maitansinoide (véase las patentes estadounidenses Nos.5,208,020, 5,416,064 y la patente europea EP 0425235 B1); una auristatina tal como las fracciones de fármacos de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véase la patente estadounidense Nos. 6,635,483 y 5,780,588, y 7,498,298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (ver patentes estadounidenses Nos.
[0219] 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 y 5,877,296; Hinman et al.,Cancer Res.,Vol. 53, pp.3336-3342, 1993; y Lode et al.,Cancer Res., vol.58, pp.2925-2928, 1998); una antraciclina como la daunomicina o la doxorubicina (ver Kratz et al.,Current Med. Chem., Vol.13, pp.477-523, 2006; Jeffrey et al.,Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol.16, pp.358-362, 2006; Torgov et al.,Bioconj. Chem., Vol.16, pp.717-721, 2005; Nagy et al.,Proc. Natl Acad Sci. EUA, vol.97, pp.829-834, 2000; Dubowchik et al.,Bioorg. Y med. Chem. Letters, vol.12, vol.1529-1532, 2002; King et al.,J. Med. Chem., Vol.45, pp.4336-4343, 2002; y la patente estadounidense Nº 6,630,579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel y CC1065.
[0220] En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una etiqueta de giro para imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagen de resonancia magnética, resonancia magnética), como yodo-123 de nuevo, los conjugados de yodo y citotóxico se pueden producir con yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o
[0221] conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico agentes de acoplamiento de proteínas como el N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesters (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (como el suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como el glutaraldehído), compuestos bis-azido (como el bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como el bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como el tolueno 2,6-diisocianato), y Compuestos de flúor bisactivos (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como se describe en Vitetta et al., Science, vol.238, pp.1098-, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al.,Cancer Res., Vol.52, pp.127-131, 1992; patente estadounidense 5,208,020) pueden ser utilizados.
[0222] Los inmunoconjugados aquí expresamente contemplan, pero no se limitan a, conjugados preparados con reactivos reticulantes que incluyen, entre otros, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB. , SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) disponibles comercialmente (por ejemplo, , de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Illinois, EE. UU.).
[0223] Un ADC ejemplar comprende un anticuerpo (Ab) que se dirige a una célula tumoral, un resto de fármaco (D) y un resto enlazador (L) que une Ab a D. En algunas modalidades útiles para entender la invención, el anticuerpo está unido al resto enlazador (L) a través de uno o más residuos de aminoácidos, como lisina y/o cisteína.
[0224] Un ADC ejemplar tiene Fórmula I como Ab-(L-D)<p>, donde p es de 1 a aproximadamente 20. El número de fracciones de fármaco que pueden conjugarse con un anticuerpo está limitado por el número de residuos de cisteína libres. En algunas útiles para entender la invención modalidades, los residuos de cisteína libres se introducen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo mediante los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de ADC de Fórmula I incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisteína diseñados por ingeniería genética (Lyon et al.,Methods in Enzym., Vol.502, pp.123-138, 2012). En algunas modalidades útiles para entender la invención, uno o más residuos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin el uso de ingeniería, en cuyo caso los residuos de cisteína libres existentes se pueden usar para conjugar el anticuerpo a un fármaco. Alternativamente, un anticuerpo se expone a condiciones reductoras antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más residuos de cisteína libres.
[0225] a) Enlazadores Ejemplares
[0226] Un “Enlazador” (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para enlazar uno o más fracciones, tales como fracciones de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un inmunoconjugado como un ADC de la Fórmula I. En algunas modalidades útiles para entender la invención, los ADC pueden prepararse utilizando un enlazador que tiene funcionalidades reactivas para unirse covalentemente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, una cisteína tiol de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un enlazador o un intermediario de fármaco-enlazador para hacer un ADC.
[0227] En un aspecto, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. Las funcionalidades reactivas de ejemplo no limitativas incluyen maleimida, haloacetamidas, α-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianos y Véase, por ejemplo, el método de conjugación en la página 766 de Klussman, et al,Bioconjugate Chemistry, vol.15, pp.765-773, 2004.
[0228] En algunas modalidades útiles para entender la invención, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los ejemplos de tales grupos electrofílicos incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo de aldehído y cetona. En algunas modalidades útiles para entender la invención, un heteroátomo de la funcionalidad reactiva del enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente a una unidad de anticuerpo. Las funcionalidades reactivas de ejemplo no limitativas incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidracida.
[0229] Un enlazador puede comprender uno o más componentes del enlazador. Los componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproilo (“MC”), maleimidopropanoilo (“MP”), valina-citrulina (“val-cit” o “vc”), alaninafenilalanina (“ala-phe”), p-aminobenziloxicarbonilo (un “PAB”), 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo (“SPP”) y 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (“MCC”). En la técnica se conocen diversos componentes enlazadores, algunos de los cuales se describen a continuación.
[0230] Un enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación de un medicamento. Los enlazadores escindibles ejemplares no limitativos incluyen enlazadores ácidos lábiles (por ejemplo, que comprenden hidrazona), enlazadores sensibles a la proteasa (por ejemplo, sensibles a la peptidasa), enlazadores fotolabiles o enlazadores que contienen disulfuro (Chari et al.,Cancer Research, vol.52, pp .127-131, 1992; Patente Estadounidense No.5,208,020).
[0231] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, un enlazador tiene la siguiente Fórmula II como — A<a>—W<w>—Y<y>—, en donde A es una “unidad de estiramiento”, y a es un número entero de 0 a 1; W es una “unidad de aminoácidos”, y w es un número entero de 0 a 12; Y es una “unidad espaciadora”, e y es 0, 1 o 2. Un ADC que comprende el enlazador de Fórmula II tiene la Fórmula I (A): Ab-(A<a>-W<w>-Y<y>-D) p, en donde Ab, D y p se definen como anteriormente para la Fórmula I. Los enlazadores ejemplares son descrito en la patente estadounidense No.7,498,298.
[0232] En algunas modalidades útiles para entender la invención, un componente enlazador comprende una “unidad de estiramiento” (A) que une un anticuerpo a otro componente enlazador o a un resto de fármaco. Las unidades de camillas ejemplares no limitativas se muestran a continuación (donde la línea ondulada indica sitios de unión covalente a un anticuerpo, fármaco o componentes enlazadores adicionales):
[0235]
[0238] En algunas modalidades útiles para entender la invención, un componente enlazador comprende una “unidad de aminoácido” (W). La unidad de aminoácidos permite la escisión del enlazador por una proteasa, facilitando así la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a proteasas intracelulares, tales como enzimas lisosomales (Doronina et al., Nat. Biotechnol., Vol.21, pp.778-784, 2003). Las unidades de aminoácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Los dipéptidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalanina-lisina (fk o phe-lys); fenilalanina-homolisina (phe-homolys); y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Los ejemplos de tripéptidos incluyen, pero no se limitan a, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Una unidad de aminoácidos puede comprender residuos de aminoácidos que se producen de forma natural y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos no naturales, tales como citrulina. Las unidades de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse para la escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
[0240] Típicamente, los enlazadores de tipo péptido pueden prepararse formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis en fase líquida (por ejemplo, E. Schroder y K. Lübke (1965) “The Peptides”, volumen 1, pp 76-136, Academic Press).
[0242] En algunas modalidades útiles para entender la invención, un componente enlazador comprende una “unidad espaciadora” (Y) que une el anticuerpo a un resto de fármaco, ya sea directamente oa través de una unidad de camilla y/o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser “autoinmolativa” o “no autoinmolativa”. Una unidad espaciadora “no autoinmolativa” es aquella en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al resto del fármaco tras la escisión del ADC. Los ejemplos de unidades espaciadoras no autoinmolativas incluyen, pero no se limitan a, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora glicina-glicina. En algunos casos, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina por una proteasa asociada a células tumorales da como resultado la liberación de un resto de glicina-glicina-fármaco de la fracción del ADC. La fracción de glicina-glicina-fármaco puede someterse a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, dividiendo así la unidad espaciadora de glicina-glicina de la fracción de fármaco.
[0244] Una unidad espaciadora “autoinmolativa” permite la liberación del grupo farmacológico. En ciertas modalidades útiles para entender la invención, una unidad espaciadora de un enlazador comprende una unidad p-aminobencilo. En algunos de tales casos, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido a través de un enlace amida, y se forma un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el medicamento (Hamann et al.Expert Opin. Ther. Patents, vol.15, pp.1087-1103, 2005). En otros casos, la unidad espaciadora comprende paminobenciloxicarbonilo (PAB). En algunas modalidades útiles para entender la invención, un ADC que comprende un enlazador autoinmolativo tiene la estructura:
[0247]
[0250] en donde Q es C<1>-C<8>alquilo,-O-(C<1>-C<8>alquilo),-halógeno, nitro o-ciano; m es un número entero de 0 a 4; X puede ser una o más unidades espaciadoras adicionales o puede estar ausente; y p va desde 1 hasta aproximadamente 20. En algunos casos, p varía de 1 a 10, de 1 a 7, de 1 a 5 o de 1 a 4. Las unidades espaciadoras X ejemplares no limitativas incluyen:
[0253]
[0256] en donde R<1>y R<2>se seleccionan independientemente de H y C<1>-C<6>alquilo. Por ejemplo, R<1>y R<2>son cada uno:-CH3.
[0257] Otros ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Patente estadounidense No. 7,375,078; Hay et al.,Bioorg. Med. Chem. Lett., Vol.9, p. 2237-, 1999) y orto o paraaminobencilacetales. En algunos casos, se pueden usar espaciadores que se someten a una ciclación con la hidrólisis del enlace amida, como las amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al.,Chemistry Biology, vol.2, pp.223-, 1995), sistemas de anillo biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al.,J. Amer. Chem. Soc.,Vol.94, p.5815-, 1972) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al,J. Org. Chem., Vol.55, p.5867, 1990). El enlace de un fármaco al carbono α de un residuo de glicina es otro ejemplo de un espaciador autoinmolativo que puede ser útil en ADCs (Kingsbury et al.,J. Med. Chem.,Vol.27, p.1447, 1984).
[0258] En algunas modalidades útiles para entender la invención, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un grupo farmacológico a un anticuerpo a través de un grupo enlazador multifuncional de ramificación (Sun et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol.12, pp.2213-2215, 2002; Sun et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry, vol.11, pp.1761-1768, 2003). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo porta solo un grupo reactivo de cisteína tiol, una multitud de fracciones de fármacos pueden unirse a través de un enlazador dendrítico.
[0259] Los enlazadores ejemplares no limitativos se muestran a continuación en el contexto de un ADC de Fórmula I:
[0260]
[0262] en donde R<1>y R<2>se seleccionan independientemente de H y C<1>-C<6>alquilo. Por ejemplo, R<1>y R<2>son cada uno:-CH<3>.
[0264]
[0266] en donde n es 0 a 12. En algunos casos, n es 2 a 10 o n es 4 a 8.
[0267] Otros ADCs ejemplares no limitativos incluyen las estructuras:
[0268]
[0271] cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alquilo; y n es 1 a 12.
[0272] En algunas modalidades útiles para entender la invención, un enlazador está sustituido con grupos que modulan la solubilidad y/o la reactividad. Como ejemplo no limitativo, un sustituyente cargado como el sulfonato (-SO<3-)>o el amonio puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo enlazador y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo enlazador con el anticuerpo y/o la fracción del fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermediario enlazador-anticuerpo) con D, o DL (intermedio del enlazador de la droga) con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC. En algunos casos, una porción del enlazador está acoplada al anticuerpo y una porción del enlazador está acoplada al fármaco, y luego la Ab-(porción enlazadora)<a>está acoplada al fármaco (porción enlazadora)<b>para formar el ADC de Fórmula I.
[0273] Los compuestos incluyen, pero no se limitan a, ADCs preparados con los siguientes reactivos enlazadores: bismaleimido-trioxietilenglicol (BMPEO), N-(β-maleimidopropiloxi)-N-hidroxi éster de succinimida (BMPS), éster de N-(εmaleimidocaproyiloxi) succinimida (EMCS), éster de N-[γ-maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS), 1,6-hexano-bisvinilsulfona (HBVS), succinimidil 4-(N)-éster maleimidometil) ciclohexano-1-carboxi (6-amidocaproato) (LC-SMCC), éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), 4-(4-N-maleimidofenil) hidrazida de ácido butírico (MPBH), succinimidil 3 CE)-(bromoacetamido) propionato (SBAP), succinimidil yodoacetato (SIA), succinimidil (4-yodoacetil) aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), N-succinimidi propionato dil-4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP), succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), succinimidil 4-(p-maleimidofenil) butirato (SMPB), succinimidil 6-((beta-maleimidopropionamido) hexanoato] (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y succinimidil-(4-vinilsulfulfona)) benzoato (SVSB), e incluyendo reactivos de bis-maleimida:ditiobismaleimidoetano (DTME), 1,4-bismaleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE), BM (PEG) 2 (ver imagen abajo) y BM (PEG) 3 (mostrado abajo); derivados bifuncionales de imidoésteres (como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como el tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor activos (como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). En algunos casos, los reactivos de bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a un resto de fármaco que contiene tiol, un enlazador o un intermediario enlazador-fármaco. Otros grupos funcionales que son reactivos con los grupos tiol incluyen, pero no se limitan a, yodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
[0274] Ciertos reactivos enlazadores útiles pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colorado), o sintetizado de acuerdo con los procedimientos descritos en la técnica; por ejemplo, en Toki et al.,J. Org. Chem., Vol.67, pp.1866-1872, 2002; Dubowchik, et al.,Tetrahedron Letters, vol.38, pp.5257-60, 1997; Walker,J. Org. Chem., Vol.60, pp.5352-5355, 1995; Frisch et al.,Bioconjugate Chem., Vol.7, pp.180-186, 1995; Patente estadounidense Nº 6,214,345; WO 02/088172; US2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
[0275] El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, el documento WO94/11026.
[0276] b) Fracciones de Fármacos Ejemplares
[0277] 1) Maitansina y Maitansinoides
[0278] En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de maitansinoides. Los maitansinoides son derivados de la maitansina y son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. Maytansine se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata (Patente estadounidense No. 3,896,111). Posteriormente, se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres del maitansinol C-3 (Patente Estadounidense No. 4,151,042). Los maitansinoides sintéticos se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533.
[0279] Las fracciones de fármaco maitansinoide son fracciones de fármaco atractivos en conjugados de anticuerpofármaco porque son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química o derivación de productos de fermentación, (ii) susceptibles de derivación con grupos funcionales adecuados para conjugación a través de no disulfuro enlazadores a anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) efectivas contra una variedad de líneas de células tumorales.
[0280] Ciertos maitansinoides adecuados para uso como fracciones de fármaco maitansinoide son conocidos en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos o producirse usando técnicas de ingeniería genética (véase, por ejemplo, Yu et al.,PNAS, vol.99, pp.7968-7973, 2002). Los maitansinoides también pueden prepararse sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
[0281] Los ejemplos de fracciones de fármaco maitansinoide incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tales como: decloro C-19 (Patente Estadounidense No.4256,746) (preparado, por ejemplo, mediante reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2) ; C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) /−C-19-decloro (Patentes estadounidenses Nos. 4,361,650 y 4,307,016) (preparadas, por ejemplo, por desmetilación usandoStreptomycesoActinomyceso decloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /− decloro (Patente estadounidense No. 4,294,757) (preparados, por ejemplo, por acilación utilizando cloruros de acilo), y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones del anillo aromático.
[0282] Las fracciones de fármaco maitansinoide ejemplares también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (Patente Estadounidense No. 4,424,219) (preparada, por ejemplo, mediante la reacción de maitansinol con H<2>S o P<2>S<5>); C-14 Alcoximetilo (demetoxi/CH<2>OR) (Patente Estadounidense No. 4,331,598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH<2>OH o CH<2>OAc) (Patente Estadounidense No.4,450,254) (preparado, por ejemplo, de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (Patente Estadounidense No. 4,364,866) (preparada, por ejemplo, por la conversión de maitansinol porStreptomyces); C-15-metoxi (patentes estadounidenses Nos 4,313,946 y 4,315,929) (por ejemplo, aisladas de Trewia nudlflora); C-18-N-desmetilo (Patentes estadounidenses Nos. 4,362,663 y 4,322,348) (preparada, por ejemplo, por la desmetilación de maitansinol porStreptomyces); y 4,5-desoxi (Patente Estadounidense No.4.371.533) (preparada, por ejemplo, mediante la reducción con tricloruro de titanio/LAH del maitansinol).
[0283] Muchas posiciones sobre los compuestos de maitansinoides son útiles como la posición de enlace. Por ejemplo, un enlace éster puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. En algunas modalidades útiles para entender la invención, la reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. Por ejemplo, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
[0285] Los grupos farmacológicos de maitansinoides incluyen aquellos que tienen la estructura:
[0288]
[0291] en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre de la fracción de fármaco maitansinoide a un enlazador de un ADC. Cada R puede ser independientemente H o un C<1>-C<6>alquilo. La cadena de alquileno que une el grupo amida al átomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2 o 3 (patente estadounidense No.633,410; patente estadounidense No.5,208,020; Chari et al.Cancer Res., Vol.52, pp.127-131, 1992; Liu et al.,Proc. Nall Acad Sci. EUA, vol.93, pp.8618-8623, 1996).
[0293] Todos los estereoisómeros de la fracción de fármaco maitansinoide se contemplan para el ADC, es decir, cualquier combinación de configuraciones R y S en los carbonos quirales (Patente Estadounidense No. 7,276,497; Patente Estadounidense No. 6,913,748; Patente Estadounidense No.6,441,163; Patente Estadounidense No. 633,410 (RE39151); Patente Estadounidense No. 5,208,020; Widdison et al (2006)J. Med. Chem.49:4392-4408. En algunas modalidades útiles para entender la invención, la fracción de fármaco maitansinoide tiene la siguiente estereoquímica:
[0296]
[0299] Modalidades ejemplares de fracciones de fármaco maitansinoide incluyen, pero no se limitan a, DM1; DM3; y DM4, teniendo las estructuras:
[0300]
[0303] en donde la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre del fármaco a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco.
[0305] Los conjugados de anticuerpo-fármaco ejemplares en los que DM1 está enlazado a través de un enlazador BMPEO a un grupo tiol del anticuerpo tienen la estructura y la abreviatura:
[0306]
[0309] en donde Ab es el anticuerpo; n es 0, 1 o 2; y p es de 1 a aproximadamente 20. En algunos casos, p es 1 a 10, p es 1 a 7, p es 1 a 5, o p es 1 a 4.
[0310] Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, los métodos para hacer los mismos y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5,208,020 y 5,416,064; US 2005/0276812 A1; y Patente Europea EP 0425235 B1. Ver también Liu et al.,Proc. Natl Acad Sci. EUA, vol.93, pp.8618-8623, 1996; y Chari et al.,Cancer Research, vol.52, pp.127-131, 1992.
[0311] En algunas modalidades útiles para entender la invención, los conjugados anticuerpo-maitansinoide pueden prepararse uniendo químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No.5,208,020. En algunos casos, el ADC con un promedio de 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha demostrado ser eficaz para mejorar la citotoxicidad de las células objetivo sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo. En algunos casos, se espera que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumente la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpos desnudos.
[0312] Los grupos de enlace ejemplares para hacer conjugados anticuerpo-maitansinoide incluyen, por ejemplo, los descritos en el presente documento y los descritos en la patente estadounidense No.5,208,020; Patente EP 0425235 B1; Chari et al.,Cancer Research, vol.52, pp.127-131, 1992; US 2005/0276812 A1; y US 2005/016993 A1.
[0313] (2) Auristatinas y Dolastatinas
[0314] Las fracciones de fármacos incluyen dolastatinas, auristatinas, y análogos y derivados de las mismas (Patente estadounidense No.5,635,483; Patente estadounidense No.5,780,588; Patente estadounidense No.5,767,237; Patente estadounidense No.6,124,431). Las auristatinas son derivados del compuesto de molusco marino dolastatin-10. Si bien no pretende limitarse a ninguna teoría en particular, se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob.Agents and Chemother., Vol.45, pp.3580-3584, 2001) y tienen agente contra el cáncer (Patente Estadounidense No. 5.663.149) y actividad antifúngica (Pettit et al. al.,Antimicrob. Agents Chemother., Vol.42, pp.2961-2965, 1998). La fracción de fármaco dolastatina/auristatina se puede unir al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) de la fracción de fármaco peptídico (documento WO 02/088172; Doronina et al.,Nature Biotechnology,vol.21, pp .778-784, 2003; Francisco et al.,Blood, vol.102, pp.1458-1465, 2003).
[0315] La auristatina ejemplar incluye el extremo N enlazado las fracciones de fármacos de monometilauristatina DE y DF, descritos en la patente estadounidense No.7,498,298 y la patente estadounidense No.7,659,241:
[0316]
[0318] en donde la línea ondulada de D<E>y D<F>indica el sitio de unión covalente a un anticuerpo o componente vinculador de anticuerpo, e independientemente en cada ubicación:
[0319] R<2>se selecciona de H y C<1>-C<8>alquilo;
[0320] R<3>se selecciona de H, C<1>-C<8>alquilo, C<3>-C<8>carbociclo, arilo, C<1>-C<8>alquilo-arilo, C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>carbociclo), C<3>-C<8>heterociclo y C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>heterociclo);
[0321] R<4>se selecciona de H, C<1>-C<8>alquilo, C<3>-C<8>carbociclo, arilo, C<1>-C<8>alquilo-arilo, C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>carbociclo), C<3>-C<8>heterociclo y C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>heterociclo);
[0322] R<5>se selecciona de H y metilo;
[0323] o R<4>y R<5>en conjunto forman un anillo carbocíclico y tienen la fórmula —(CR<a>R<b>)<n>— en donde R<a y>R<b>son independientemente seleccionados de H, C<1>-C<8>alquilo y C<3>-C<8>carbociclo y n se selecciona de 2, 3, 4, 5 y 6; R<6>se selecciona de H y C<1>-C<8>alquilo;
[0324] R<7>se selecciona de H, C<1>-C<8>alquilo, C<3>-C<8>carbociclo, arilo, C<1>-C<8>alquilo-arilo, C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>carbociclo), C<3>-C<8>heterociclo y C<1>-C<8>alquilo-(C<3>-C<8>heterociclo);
[0325] cada R<8>es independientemente seleccionado de H, OH, C<1>-C<8>alquilo, C<3>-C<8>carbociclo y O—(C<1>-C<8>alquilo); R<9>se selecciona de H y C<1>-C<8>alquilo;
[0326] R<10>se selecciona de arilo o C<3>-C<8>heterociclo;
[0327] Z es O, S, NH, o NR<12>, en donde R<12 es>C<1>-C<8>alquilo;
[0328] R<11>se selecciona de H, C<1>-C<20>alquilo, arilo, C<3>-C<8>heterociclo, —(R<13>O)<m>—R<14>, o —(R<13>O)<m>—CH(R<15>)<2>; m es un entero que varía de 1-1000;
[0329] R<13>es C<2>-C<8>alquilo;
[0330] R<14>es H o C<1>-C<8>alquilo;
[0331] cada ocurrencia de e es independientemente H, COOH, —(CH<2>)<n>—N(R<16>)<2>, —(CH<2>)<n>—SO<3>H, o —(CH<2>)<n>— SO<3>—C<1>-C<8>alquilo;
[0332] cada ocurrencia de e es independientemente H, C<1>-C<8>alquilo, o —(CH<2>)<n>—COOH;
[0333] R<18>se selecciona de —C(R<8>)<2>—C(R<8>)<2>-arilo, —C(R<8>)<2>—C(R<8>)<2>—(C<3>-C<8>heterociclo), y —C(R<8>)<2>—C(R<8>)<2>—(C<3>-C<8>carbociclo); y
[0334] n es un entero que varía de 0 a 6.
[0335] En una modalidad útil para entender la invención, R<3>, R<4 y>R<7>son independientemente isopropilo o sec-butilo y R<5 es>—H o metilo o R<3 y>R<4>son cada uno isopropilo, R<5>es —H, y R<7>es sec-butilo.
[0336] En otro ejemplo, R<2 y>R<6>son cada uno metilo, y R<9>es —H.
[0337] En todavía otro caso, cada ocurrencia de R<8>es —OCH<3>.
[0338] Por ejemplo, R<3 y>R<4>son cada uno isopropilo, R<2 y>R<6>son cada uno metilo, R<5>es —H, R<7>es sec-butilo, cada ocurrencia de R<8>es —OCH<3>, y R<9>es —H.
[0339] En un caso, Z es —O— o —NH—.
[0340] En otro caso, R<10>es arilo.
[0341] En otro ejemplo, R<10>es -fenilo.
[0342] Por ejemplo, cuando Z es
R<11>es —H, metilo o t-butilo.
[0343] En un caso, cuando Z es —NH, R<11>es —CH(R<15>)<2>, en donde R<15>es —(CH<2>)<n>—N(R<16>)<2>, y R<16>es —C<1>-C<8>alquilo o —(CH<2>)<n>—COOH.
[0344] En otro caso, cuando Z es —NH, R<11>es —CH(R<15>)<2>, en donde R<15>es —(CH<2>)<n>—SO<3>H.
[0345] Una auristatina ejemplar de la fórmula DE es MMAE, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco:
[0348]
[0351] Una modalidad de auristatina ejemplar de la fórmula D<E>es MMAF, en donde la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco:
[0354]
[0356] Otros ejemplos incluyen compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de fenilalanina carboxilo en el extremo C del pentacéptido auristatina de la fracción del fármaco (documento WO 2007/008848) y compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de fenilalanina en la cadena lateral en el extremo C del pentapéptido auristatina fármaco parte (WO 2007/008)).
[0357] Ejemplos no limitativos de ADCs de Fórmula I que comprenden MMAF y varios componentes enlazadores incluyen además Ab-MC-PAB-MMAF y Ab-PAB-MMAF. Se ha demostrado que los nmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador que no es escindible proteolíticamente poseen una actividad comparable a la de inmunoconjugados que comprenden MMAF unido a un anticuerpo por un enlazador escindible proteolíticamente (Doronina et al., Bioconjugate Chem., vol.17, pp.114-124, 2006). Se cree que la liberación del fármaco se efectúa por la degradación del anticuerpo en la célula.
[0358] Típicamente, las fracciones de fármacos basados en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Dichos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con un método de síntesis en fase líquida (ver, por ejemplo, E. Schröder y K. Lübke, “The Peptides”, volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). Las fracciones de fármaco auristatina/dolastatina pueden, prepararse de acuerdo con los métodos de: Patente estadounidense No.7,498,298; Patente estadounidense No.
[0359] 5,635,483; Patente estadounidense No.5,780,588; Pettit et al.,J. Am. Chem. Soc., Vol.111, pp.5463-5465, 1998; Pettit et al.,Anti-Cancer Drug Design, vol.13, pp.243-277, 1998; Pettit et al.,Synthesis, vol.6, pp.719-725, 1996; Pettit et al.,J. Chem. Soc.Perkin Trans. vol.15, pp.859-863, 1996; y Doronina,Nat. Biotechnol., Vol.21, pp.778-784, 2003.
[0360] En algunos casos, las fracciones de fármacos auristatina/dolastatina de fórmulas D<E>, tales como MMAE y D<E>, tales como MMAF, y los intermedios de enlazadores de fármacos y sus derivados, tales como MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, y MC-vc-PAB-MMAE, puede prepararse utilizando los métodos descritos en la patente estadounidense No.7,498,298; Doronina et al.,Bioconjugate Chem., Vol.17, pp.114-124, 2006; y Doronina et al.,Nat. Biotech., Vol.21, pp.778-784, 2003 y luego se conjugan con un anticuerpo de interés.
[0361] (3) Caliqueamicina
[0362] En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos caliqueamicina, y sus análogos, son capaces de producir roturas de ADN de doble cadena en sub-picomolar. concentraciones (Hinman et al.,Cancer Research, vol.53, pp.3336-3342, 1993; Lode et al.,Cancer Research, vol.58, pp.2925-2928, 1998). La caliqueamicina tiene sitios de acción intracelular pero, en ciertos casos, no atraviesa fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos puede mejorar enormemente sus efectos citotóxicos. Los métodos ejemplares no limitantes de preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco con un resto de fármaco de caliqueamicina se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5,712,374; Patente estadounidense No.5,714,586; Patente estadounidense No.5,739,116; y la patente estadounidense No.5,767,285.
[0363] (4) Pirrolobenzodiazepinas
[0364] En algunas modalidades, un ADC comprende una pirrolobenzodiazepina (PBD). En algunas modalidades útiles para entender la invención, los dímeros de PDB reconocen y se unen a secuencias de ADN específicas. El producto natural antramicina, una PBD, se informó por primera vez en 1965 (Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc., Vol.87, pp.5793-5795, 1965; Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc., Vol.87, pp.5791-5793, 1965). Desde entonces, se han reportado varios PBD, tanto de origen natural como análogos (Thurston et al., Chem. Rev. vol.1994, pp.433-4651994, incluidos los dímeros del andamio PBD tricíclico (Patente Estadounidense No. 6,884,799; Patente Estadounidense No.
[0365] 7,049,311; Patente Estadounidense No. 7,067,511; Patente Estadounidense No. 7,265,105; Patente Estadounidense No. 7,511,032; Patente Estadounidense No. 7,528,126; Patente Estadounidense No. 7,557,099). Sin pretender estar limitado por ninguna teoría particular, se cree que la estructura del dímero imparte la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN de forma B, lo que lleva a un ajuste perfecto en el sitio de unión (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, pp.3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., Vol.19, pp.230-237, 1986). Se ha demostrado que los compuestos de PBD diméricos que tienen sustituyentes C2 arilo son útiles como agentes citotóxicos (Hartley et al Cancer Res., Vol.70, pp.6849-6858, 2010; Antonow, J. Med. Chem.vol.53, pp.2927-2941, 2010; Howard et al., Bioorganic and Med. Chem. Letters, vol.19, pp.6463-6466, 2009).
[0366] Los dímeros de PBD se han conjugado con anticuerpos y se ha demostrado que el ADC resultante tiene propiedades anticancerígenas. Los sitios de enlace ejemplares no limitativos en el dímero de PBD incluyen el anillo pirrolo de cinco miembros, la atadura entre las unidades de PBD y el grupo de imina N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431 US 2011/0256157; WO 2011/130598).
[0367] Los componentes de dímero PBD ejemplares no limitativos de ADC son de Fórmula A:
[0370]
[0373] y sus sales y solvatos, en donde:
[0374] la línea ondulada indica el sitio de conexión covalente al enlazador;
[0375] las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3;
[0376] R<2>es independientemente seleccionado de H, OH, ═O, ═CH<2>, CN, R, OR, ═CH—R<D>, ═C(R<D>)<2>, O—SO<2>—R, CO<2>R y COR, y opcionalmente seleccionado además de halo o dihalo, en donde R<D>es independientemente seleccionado de R, CO<2>R, COR, CHO, CO<2>H, y halo;
[0377] R<6 y>R<9>son independientemente seleccionados de H, R, OH, OR, SH, SR, NH<2>, NHR, NRR′, NO<2>, Me<3>Sn y halo;
[0378] R<7>es independientemente seleccionado de H, R, OH, OR, SH, SR, NH<2>, NHR, NRR′, NO<2>, Me<3>Sn y halo; Q es independientemente seleccionado de O, S y NH;
[0379] R<11>es ya sea H, o R o, donde Q es O, SO<3>M, donde M es un catión metálico;
[0380] R y R′ son cada uno independientemente seleccionados de grupos C<1-8>alquilo opcionalmente sustituido, C<1-12>alquilo, C<3-8>heterociclilo, C<3-20>heterociclo, y C<5-20>arilo, y opcionalmente en relación con el grupo NRR′, R y R′ junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido;
[0381] R<12>, R<16>, R<19 y>R<17>son como se define para R<2>, R<6>, R<9 y>R<7>respectivamente;
[0382] R″ es un grupo C<3-12>alquileno, cuya cadena puede ser interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, cuyos anillos están opcionalmente sustituidos; y
[0383] X y X′ son independientemente seleccionados de O, S y N(H).
[0384] En algunas modalidades útiles para entender la invención, R y R′ son cada uno independientemente seleccionados de grupos C<1-12>alquilo opcionalmente sustituido, C<3-20>heterociclo, y C<5-20>arilo, y opcionalmente en relación con el grupo NRR′, R y R′ junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido. En algunos casos, R<9 y>R<19>son H. En algunos casos, R<6>y R<16>son H.
[0385] En algunas modalidades útiles para entender la invención, R<7>y R<17>son ambos OR<7A>, donde R<7A>es opcionalmente sustituido C<1-4>alquilo. En algunos casos, R<7A>es Me o R<7A>es Ch<2>F, donde F es un grupo fenilo. En algunos casos, X es O. En algunos casos, R<11>es H. En algunos casos, hay un doble enlace entre C2 y C3 en cada unidad monomérica.
[0386] En algunas modalidades útiles para entender la invención, R<2>y R<12>son independientemente seleccionados de H y R, R<2>y R<12>son independientemente R, R<2>y R<12>son independientemente C<5-20>arilo opcionalmente sustituido o C<5-7>arilo o C<8-10>arilo, R<2>y R<12>son independientemente opcionalmente sustituido fenilo, tienilo, naftilo, piridilo, quinolinilo, o isoquinolinilo, R<2 y>R<12>son independientemente seleccionados de ═O, ═CH<2>, ═CH—R<D>, y ═C(R<D>)<2>, o R<2>y R<12>son cada uno ═CH<2>, R<2>y R<12>son cada uno H, R<2>y R<12>son cada uno ═O, R<2>y R<12>son cada uno ═CF<2>, R<2>y/o R<12>son independientemente ═C(R<D>)<2>, o R<2>y/o R<12>son independientemente ═CH—R<D>.
[0387] En algunas modalidades útiles para entender la invención, cuando R<2>y/o R<12>es ═CH—R<D>, cada grupo puede tener independientemente cualquier configuración mostrada a continuación:
[0390]
[0392] En algunos casos, un ═CH—RD tiene la configuración (I). En algunos casos, R″ es un grupo C3 alquileno grupo o un grupo C5 alquileno.
[0393] Los enlazadores de PBD dímero-val-cit-PAB-Ab y el PBD dímero-Phe-Lys-PAB-Ab son proteasas escindibles, mientras que el enlazador de PBD dímero-maleimida-acetal es ácido-lábil.
[0394] Los dímeros de PBD y los ADC que comprenden dímeros de PBD pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598.
[0395] (5) Antraciclinas
[0396] En algunas modalidades, un ADC puede comprender antraciclina. Las antraciclinas son compuestos antibióticos que exhiben actividad citotóxica. Si bien no pretende vincularse a ninguna teoría en particular, los estudios han indicado que las antraciclinas pueden actuar para destruir las células mediante varios mecanismos diferentes, entre ellos: 1) la intercalación de las moléculas del fármaco en el ADN de la célula, inhibiendo así el ácido nucleico dependiente del ADN síntesis; 2) la producción por el fármaco de radicales libres que luego reaccionan con las macromoléculas celulares para causar daño a las células, y/o 3) interacciones de las moléculas del fármaco con la membrana celular (ver, por ejemplo, C. Peterson et al., “Transport and Storage of Anthracycline in Experimental Systems And Human Leukemia”enAnthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur,“Free Radical Damage”id. en pp.97-102). Debido a su potencial citotóxico, las antraciclinas se han utilizado en el tratamiento de numerosos cánceres como la leucemia, el carcinoma de mama, el carcinoma de pulmón, el adenocarcinoma de ovario y los sarcomas (véase, por ejemplo, P. H-Wiernik, enAnthracycline: Current Status and New Developmentsp 11).
[0397] Las antraciclinas ejemplares no limitativas incluyen doxorubicina, epirubicina, idarubicina, daunomicina, nemorubicina y derivados de las mismas. Se han preparado y estudiado inmunoconjugados y profármacos de daunorubicina y doxorubicina (Kratz et al.,Current Med. Chem., Vol.13, pp.477-523, 2006; Jeffrey et al.,Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol.16, pp.358-362.1996; Torgov et al.,Bioconj. Chem., Vol.16, pp.717-721, 2005; Nagy et al.,Proc. Natl Acad Sci. EUA, vol.97, pp.829-834, 2000; Dubowchik et al.,Bioorg. Med. Chem. Letters, vol.12, pp.1529-1532, 2002; King et al.,J. Med. Chem., Vol.45, pp.4336-4343, 2002; EP 0328147; Patente estadounidense No.
[0398] 6,630,579). El conjugado anticuerpo-fármaco BR96-doxorubicina reacciona específicamente con el antígeno asociado al tumor Lewis-Y y se ha evaluado en estudios de fase I y II (Saleh et al.,J. Clin. Oncology, vol.18, pp.2282-2292, 2000; Ajani et al.,Cancer Jour., Vol.6, pp.78-81, 2000; Tolcher et al.,J. Clin. Oncology, vol.17, pp.478-484, 1999).
[0399] PNU-159682 es un potente metabolito (o derivado) de la nemorubicina (Quintieri et al.,Clinical Cancer Research, vol.11, pp.1608-1617, 2005). La nemorubicina es un análogo semisintético de la doxorrubicina con un grupo 2-metoximorfolino en el glucósido amino de la doxorubicina y se encuentra en evaluación clínica (Grandi et al.Cancer Treat. Rev. vol.17, pp.133-138, 1990; Ripamonti et al.Brit. J. Cancer, vol.65, pp.703-707, 1992), incluidos los ensayos de fase II/III para el carcinoma hepatocelular (Sun et al.,Proceedings of the American Society for Clinical Oncology, vol.22, Abs1448, 2003; Quintieri ,Proceedings of the American Association of Cancer Research, vol.44: 1st Ed, Abs 4649, 2003; Pacciarini et al.,Jour. Clin. Oncology, vol.24, p.14116, 2006).
[0400] Las antraciclinas, incluida la PNU-159682, pueden conjugarse con anticuerpos a través de varios sitios de enlace y una variedad de enlazadores (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124), incluidos los enlazadores descritos en el presente documento.
[0401] El enlazador de maleuida acetal-Ab de PNU-159682 es lábil a los ácidos, mientras que los enlazadores de PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador-Ab, y PNU-159682-Los espaciadores de val-cit-PAB (R1R2)-Ab son proteasas escindibles.
[0402] En ciertas modalidades, un inmunoconjugado puede comprender un átomo altamente radiactivo. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>e isótopos radiactivos de Lu.
[0403] La radio u otras etiquetas pueden incorporarse en el inmunoconjugado de formas conocidas. Por ejemplo, un péptido puede ser biosintetizado o sintetizado químicamente usando precursores de aminoácidos adecuados que comprenden, por ejemplo, uno o más átomos de flúor-19 en lugar de uno o más hidrógenos. En algunas modalidades útiles para entender la invención, los marcadores tales como Tc<99>, I<123>, Re<186>, Re<188>e In<111>pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el anticuerpo. En algunos casos, el itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina del anticuerpo. En algunos casos, el método IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biofis Res. Commun., Vol.80, pp.49-57, 1978) se puede utilizar para incorporar yodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) describe ciertos otros métodos.
[0404] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, un inmunoconjugado puede comprender un anticuerpo conjugado con una enzima activadora de profármacos. En algunas de tales modalidades, una enzima activadora de profármacos convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO 81/01145) en un fármaco activo, como un fármaco anticanceroso. Dichos inmunoconjugados son útiles, en algunas modalidades, en la terapia con profármacos mediados por enzimas dependientes de anticuerpos (“ADEPT”). Las enzimas que pueden conjugarse con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fosfatasas alcalinas, que son útiles para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas, que son útiles para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, que es útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termólisis, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como las catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, que son útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas que dividen los carbohidratos, tales como β-galactosidasa y neuraminidasa, que son útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; β-lactamasa, que es útil para convertir fármacos derivados de β-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa y penicilina G amidasa, que son útiles para convertir fármacos derivados en sus aminos nitrógenos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. En algunas modalidades, las enzimas pueden unirse covalentemente a anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Neuberger et al.,Nature, vol.312, pp.604-608, 1984.
[0405] c) Carga de Fármacos
[0406] La carga de fármaco está representada por p, el número promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fracciones de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una variedad de grupos farmacológicos, de 1 a 20. El número promedio de fracciones de fármaco por uso de anticuerpos en la preparación de ADC a partir de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneos en los que p es un cierto valor de ADC con otras cargas de fármaco se puede lograr por medios como HPLC de fase inversa o electroforesis.
[0407] Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es una cisteína tiol, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos cisteína tiol, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un enlazador. En ciertas modalidades útiles para entender la invención, mayor carga de fármaco, p. p> 5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados anticuerpo-fármaco. En ciertos casos, la carga promedio de fármaco para un ADC varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. De hecho, se ha demostrado que para ciertos ADC, la proporción óptima de fracciones de fármaco por anticuerpo puede ser inferior a 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 (Patente Estadounidense No.7,498,298).
[0408] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, menos del máximo teórico de fracciones de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el intermediario de enlace del fármaco o el reactivo de enlace, como se explica a continuación. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que pueden estar unidos a un resto de fármaco; De hecho, la mayoría de los residuos de cisteína tiol en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En ciertos casos, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones de reducción parcial o total, para generar grupos reactivos de cisteína tiol. En ciertas modalidades, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleofílicos reactivos tales como lisina o cisteína.
[0409] La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC se puede controlar de diferentes maneras, y por ejemplo, (i) limitando el exceso molar del intermediario de enlace del fármaco o reactivo enlazador en relación con el anticuerpo, (ii) limitando la reacción de conjugación tiempo o temperatura, y (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación del tiol con cisteína.
[0410] Debe entenderse que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un reactivo intermedio o enlazador de fármaco, el producto resultante es una mezcla de ADC con una distribución de uno o más fracciones de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de medicamentos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA dual, que es específico para el anticuerpo y específico para el medicamento. Los ADC individuales pueden identificarse en la mezcla por espectroscopia de masas y separarse por HPLC, por ej. cromatografía de interacción hidrófoba (véase, por ejemplo, McDonagh et al.,Prot. Engr. Design & Selection, vol.19, pp.
[0411] 299-307, 2006; Hamblett et al.,Clin. Cancer Res., Vol.10, pp.7063-7070, 2004). En ciertos casos, un ADC homogéneo con un solo valor de carga puede aislarse de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
[0412] d) Ciertos Métodos de Preparación de Inmunoconjugados
[0413] Un inmunoconjugado que es un ADC de Fórmula I puede prepararse por varias vías que emplean reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la materia, que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente para formar Ab-L a través de un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido de reacción con un grupo nucleófilo de un anticuerpo. Los métodos ejemplares para preparar un ADC de Fórmula I a través de la última ruta se describen en las Patentes Estadounidenses Nos.7,498,298.
[0414] Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina N-terminales, (ii) grupos amina de cadena lateral, p. lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, v.g. cisteína y (iv) azúcar hidroxilo o grupos amino donde el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en fracciones enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; y (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros de cadena reducible, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfina (TCEP), de modo que el anticuerpo se reduzca total o parcialmente. Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos mediante la modificación de los residuos de lisina, por ejemplo, haciendo reaccionar los residuos de lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos también pueden introducirse en un anticuerpo introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos variantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativos).
[0415] Los conjugados anticuerpo-fármaco también pueden producirse por reacción entre un grupo electrófilo en un anticuerpo, tal como un grupo carbonilo aldehído o cetona, con un grupo nucleófilo en un reactivo enlazador o fármaco. Los grupos nucleófilos útiles en un reactivo enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. En un ejemplo, un anticuerpo se modifica para introducir fracciones electrófilos que son capaces de reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo enlazante o fármaco. En otro ejemplo, los azúcares de los anticuerpos glicosilados se pueden oxidar, por ejemplo con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o fracciones de fármaco. Los grupos básicos de imina Schiff resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces amina estables. En una modalidad útil para entender la invención, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con galactosa oxidasa o meta-periodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehído y cetona) en el anticuerpo que puede reaccionar con grupos apropiados en el medicamento (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra modalidad útil para entender la invención, los anticuerpos que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con el metaperiodato de sodio, lo que resulta en la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh,Bioconjugate Chem., Vol.3, pp.138-146, 1992; Patente estadounidense No.5,362,852). Dicho aldehído se puede hacer reaccionar con un resto de fármaco o un nucleófilo enlazador.
[0416] Los grupos nucleófilos ejemplares en un grupo farmacológico incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidracida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en grupos enlazantes y enlaces enlazantes Reactivos que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehídos, cetonas, carboxilo y maleimida.
[0417] Los reactivos de entrecruzamiento ejemplares no limitativos que se pueden usar para preparar ADC se describen aquí en la sección titulada “Enlazadores Ejemplares”. En la técnica se conocen métodos para usar dichos reactivos reticulantes para unir dos fracciones, que incluyen un resto proteico y un resto químico. En algunas modalidades útiles para entender la invención, una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y un agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. Una molécula de ADN recombinante puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y porciones citotóxicas del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
[0418] En otra modalidad más útil para entender la invención, un anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (como estreptavidina) para su utilización en la orientación previa del tumor en donde el conjugado de anticuerporeceptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de limpieza y luego administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un fármaco o radionucleótido).
[0419] C. Formulaciones Farmacéuticas
[0420] Los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos tienen actividad destructora de células. Esta actividad de destrucción celular se extiende a múltiples tipos diferentes de líneas celulares. Además, estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, una vez conjugados con un agente citotóxico, pueden reducir el tamaño del tumor y pueden mostrar una toxicidad reducida. Vea los ejemplos 3 y 6-9 de esta aplicación. Así, los anticuerpos anti-Axl, fragmentos o inmunoconjugados de los mismos pueden ser útiles para tratar enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de Axl. Los anticuerpos, fragmentos o inmunoconjugados se pueden usar solos o en combinación con cualquier agente adecuado u otros tratamientos convencionales.
[0421] El anticuerpo anti-Axl o el fragmento de anticuerpo puede usarse para tratar enfermedades hiperproliferativas asociadas con la expresión, sobreexpresión o activación de Axl y/o Gas6. No hay ninguna limitación particular sobre los tipos de cáncer o tejido que pueden tratarse, aparte del requisito para la expresión de Axl. Los ejemplos incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, tumores de células gliales como glioblastoma y neurofibromatosis, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, sarcomas, cánceres hematológicos (leucemias), astrocitomas y diversos tipos de cabeza y cáncer de cuello. Los cánceres más preferibles son glioma, cáncer gástrico, pulmonar, pancreático, de mama, próstata, renal, hepático y endometrial.
[0422] Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl son activadores potenciales de la respuesta inmune innata y, por lo tanto, pueden usarse en el tratamiento de trastornos inmunitarios humanos, como la sepsis. El anticuerpo anti-Axl o el fragmento de anticuerpo también se pueden usar como adyuvantes para la inmunización, tal como para vacunas y como agentes anti-infección contra, por ejemplo, bacterias, virus y parásitos.
[0423] El anticuerpo anti-Axl o el fragmento de anticuerpo se pueden usar para proteger, prevenir o tratar enfermedades trombóticas como la trombosis venosa y arterial y la aterotrombosis. El anticuerpo anti-Axl o el fragmento de anticuerpo también se puede usar para proteger, prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares, así como para prevenir o inhibir la entrada de virus como los virus Lassa y Ebola y para tratar infecciones virales.
[0424] En los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo monoclonal anti-Axl, el fragmento de anticuerpo o el inmunoconjugado monoclonal anti-Axl pueden administrarse de manera consistente con las metodologías convencionales asociadas con el tratamiento de la enfermedad o trastorno para el cual se busca el tratamiento. De acuerdo con la divulgación en el presente documento, se administra una cantidad eficaz del anticuerpo, fragmento de anticuerpo o inmunoconjugado a un sujeto que necesita dicho tratamiento durante un tiempo y en condiciones suficientes para prevenir o tratar la enfermedad o trastorno. Por lo tanto, un aspecto útil para entender la invención de la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad asociada con la expresión de Axl que comprende administrar a un sujeto que lo necesite con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o inmunoconjugado.
[0425] Para la administración, el anticuerpo monoclonal anti-Axl, el fragmento de anticuerpo o el inmunoconjugado se pueden formular como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica que incluye anticuerpo monoclonal anti-Axl, fragmento de anticuerpo o conjugado anticuerpo-fármaco puede formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticas. En tales métodos, la molécula terapéutica se combina típicamente con una mezcla, solución o composición que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0426] Un portador farmacéuticamente aceptable es un material que puede ser tolerado por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, 19 ed.1995)) Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservadors, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en las superficies de los viales. etc.
[0427] La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración, la dosis y el régimen dependen naturalmente de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente, etc. Un experto en la materia puede tener en cuenta estas consideraciones para formular composiciones farmacéuticas adecuadas. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular y similares.
[0428] Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, por adición, por ejemplo de Agua esterilizada o salina fisiológica, permite la constitución de soluciones inyectables.
[0429] En algunas modalidades útiles para entender la invención, los agentes de tonicidad, a veces conocidos como “estabilizantes” están presentes para ajustar o mantener la tonicidad de un líquido en una composición. Cuando se usan con biomoléculas grandes y cargadas, como proteínas y anticuerpos, a menudo se denominan “estabilizantes” porque pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que disminuye el potencial de interacciones inter e intramoleculares. Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en cualquier cantidad de 0,1% a 25% en peso, preferiblemente 1 a 5% de la composición farmacéutica. Los agentes de tonicidad preferidos incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, preferiblemente alcoholes trihídricos o de azúcar superior, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.
[0430] Los excipientes adicionales incluyen agentes que pueden servir como uno o más de los siguientes: (1) agentes de carga, (2) potenciadores de la solubilidad, (3) estabilizantes y (4) y agentes que evitan la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Tales excipientes pueden incluir: alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc .; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitol (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, α-monotioglicerol y tio sulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina u otras inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos (por ejemplo, xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa); trisacáridos como la rafinosa y polisacáridos como la dextrina o dextrano.
[0431] Se pueden emplear tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como “agentes humectantes”) para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por agitación, lo que también permite que la formulación se exponga al estrés de la superficie de cizallamiento sin causar desnaturalización de la proteína terapéutica activa o anticuerpo. Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un rango de concentración de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
[0432] Los surfactantes no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles PLURONIC®, TRITON®, monoeteres de polioxietilen sorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, éster de ácido graso de sacarosa, metil celulosa y carboximetil celulosa. Los detergentes aniónicos que se pueden usar incluyen laurilsulfato de sodio, sulfóxido de sodio de dioctilo y sulfonato de sodio de dioctilo. Los detergentes catiónicos incluyen cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio
[0433] Las dosis utilizadas para la administración pueden adaptarse en función de diversos parámetros, y en particular en función del modo de administración utilizado, de la patología relevante o, alternativamente, de la duración deseada del tratamiento. Para preparar composiciones farmacéuticas, una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede disolverse o dispersarse en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
[0434] Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una capacidad de jeringación fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos.
[0435] Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en un agua adecuadamente mezclada con un surfactante. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.
[0436] Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede formularse en una composición en forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
[0437] El portador también puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede ser provocada por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0438] Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con uno o más de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución del mismo filtrada previamente estéril.
[0439] También se contempla la preparación de más soluciones altamente concentradas para inyección directa, en las que se prevé que el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como disolvente dé como resultado una penetración extremadamente rápida, suministrando altas concentraciones de los agentes activos a una pequeña área del tumor.
[0440] Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármacos y similares.
[0441] Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente líquido primero debe ser isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y agregarse a 1000 ml de líquido hipodermoclítico o inyectarse en el lugar propuesto para la infusión (consulte, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 15ª edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Una cierta variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis adecuada para el sujeto individual.
[0442] Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden formularse dentro de una mezcla terapéutica para administrar de aproximadamente 0,0001 a 10,0 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 5 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 1 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso de aproximadamente 10 miligramos por dosis. También se pueden administrar dosis múltiples en rangos de tiempo seleccionados.
[0443] Además de los compuestos formulados para administración parenteral, como la inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación prolongada; y cualquier otra forma actualmente utilizada.
[0444] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, el uso de liposomas y/o nanopartículas se contempla para la introducción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en células hospedadoras. La formación y el uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos por los expertos en la técnica.
[0445] Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga de polímeros intracelulares, estas partículas ultrafinas (con un tamaño de alrededor de 0.1 μm) se diseñan generalmente utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos están contempladas para su uso y dichas partículas pueden fabricarse fácilmente.
[0446] Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 μm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con diámetros en el rango de 200 a 500 Å, que contienen una solución acuosa en el núcleo. El físico Las características de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.
[0447] Las formulaciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables más opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadors (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenol, butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; Contraiones formadores de sal, como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, Complejos de Zn-proteinas); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG).
[0448] Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos insterstitiales tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neutras solubles. (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble en humanos, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertos ejemplos de sHASEGP y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patentes estadounidenses 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glicosaminoglicanasas adicionales, como las condroitinasas.
[0449] Las formulaciones de anticuerpos liofilizados ejemplares se describen en las patentes estadounidenses Nos.
[0450] 6,267,958. Las formulaciones de anticuerpos acuosos incluyen las descritas en las patentes estadounidenses Nos.
[0451] 6.171.586 y WO2006/044908, estas últimas formulaciones incluyen un tampón de acetato de histidina.
[0452] La formulación de este documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando. Preferiblemente, los ingredientes con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí se pueden combinar en una sola formulación. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar un antagonista de EGFR (como erlotinib), un agente anti-angiogénico (como un antagonista de VEGF que puede ser un anticuerpo anti-VEGF) o un agente quimioterapéutico (como un agente taxoide o un platino) además del anticuerpo anti-Axl, fragmento de anticuerpo o inmunoconjugado de la presente invención. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
[0453] Los ingredientes activos pueden encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial. Por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina: microcápsulas y poli (metacrilato de metilo) microcápsulas, respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en Se pueden emplear macroemulsiones. Tales técnicas se describen enRemington’s Pharmaceutical Sciences16ª Edición, Osol, A. Ed. (1980).
[0454] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, cuyas matrices pueden estar en forma de artículos conformados, por ejemplo. Películas, o microcápsulas.
[0455] Las formulaciones que se usan para la administraciónin vivoson generalmente estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
[0456] D. Métodos Terapéuticos y Composiciones
[0457] Cualquiera de los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos proporcionados en el presente documento se pueden usar en métodos terapéuticos. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo para uso como medicamento. En otros aspectos, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo para usar en el tratamiento del cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de páncreas, cerebro, riñón, ovario, estómago, leucemia, etc.). se proporciona endometrio uterino, colon, próstata, tiroides, hígado, osteosarcoma y/o melanoma). En ciertas modalidades útiles para entender la invención, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo es para uso en un método de tratamiento. En ciertos casos, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo es para uso en un método para tratar a un individuo que tiene cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo es para usar en un método para tratar a un individuo que tiene un trastorno inmunitario (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, virus del Ébola, virus de Marburg) o diabetes, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Axl. En uno de tales casos, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otros casos, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Axl es para usar en la inhibición de la angiogénesis, inhibición de la proliferación celular, inhibición de la función inmune, inhibición de la secreción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), que inhibe la vasculatura tumoral (por ejemplo, intratumoral vasculatura o vasculatura asociada a tumor) y/o inhibición de la función estromal del tumor.
[0459] En ciertas modalidades útiles para entender la invención, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Axl para usar en un método para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmune, inhibir la secreción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibir la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada a tumor) y/o inhibición de la función estromal tumoral en un individuo que comprende administrar al individuo un eficaz del anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmune, inhibir la secreción inflamatoria de citoquinas (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibe el desarrollo de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada a tumores) y/o inhibe la función estromal del tumor. Un “individuo” es preferiblemente un ser humano.
[0461] En un aspecto adicional útil para entender la invención, un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo es para uso en la fabricación o preparación de un medicamento. En un caso, el medicamento es para el tratamiento del cáncer (tal como, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de páncreas, cerebro, riñón, ovario, estómago, leucemia, endometrio uterino, colon, próstata, tiroides, hígado, osteosarcoma y/o melanoma). En un caso adicional, el medicamento es para uso en un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz del medicamento. En una modalidad adicional, el medicamento es para uso en un método para tratar un trastorno inmune (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, virus del Ébola, virus de Marburg) o diabetes, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo. En uno de tales casos, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En un caso adicional, el medicamento es para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmune, inhibir secreción inflamatoria de citoquinas (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibición de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada a tumores) y/o inhibición de la función del estroma tumoral. En un caso adicional, el medicamento es para uso en un método para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmune, inhibir la secreción inflamatoria de citoquinas (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibir la vasculatura del tumor (por ejemplo, vasculatura intratumoral o tumor vasculatura asociada), y/o inhibición de la función estromal del tumor en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del medicamento para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la función inmune, inducir la sección de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores) , inhibir el desarrollo de la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada a tumor) y/o inhibir la función estromal del tumor. Un “individuo” puede ser un humano.
[0463] En un aspecto adicional útil para entender la invención, un método para tratar un cáncer comprende administrar a un individuo que tiene cáncer una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo. En uno de tales casos, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un “individuo” puede ser un humano.
[0465] En un aspecto adicional útil para entender la invención, un método para tratar un trastorno inmunitario (por ejemplo, un trastorno autoinmune), un trastorno cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis, hipertensión, trombosis), una enfermedad infecciosa (por ejemplo, virus del Ébola, virus de Marburg) o diabetes. En una de tales modalidades, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, como se describe a continuación. Un “individuo” puede ser un humano.
[0467] En un aspecto adicional útil para entender la invención, se proporciona un método para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, inhibir la función inmune, inhibir la secreción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibir la vasculatura tumoral (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada a tumores) , y/o inhibiendo la función estromal del tumor en un individuo. En un caso, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-Axl o fragmento de anticuerpo para inhibir la angiogénesis, inhibir la proliferación celular, promover la función inmune, inducir la sección de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, de macrófagos asociados a tumores), inhibir desarrollo de la vasculatura del tumor (por ejemplo, vasculatura intratumoral o vasculatura asociada al tumor) y/o inhibe la función estromal del tumor. En un caso, un “individuo” es un humano.
[0468] En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos proporcionados en el presente documento. En una modalidad útil para entender la invención, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad útil para entender la invención, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-Axl o fragmentos de anticuerpos y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
[0469] En una modalidad útil para entender la invención, en todos y cada uno de los tratamientos descritos anteriormente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden usar solos, como inmunoconjugados o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo puede coadministrarse con por lo menos un agente terapéutico adicional. Un agente terapéutico adicional es un agente antiangiogénico. En ciertos casos, un agente terapéutico adicional es un antagonista de VEGF (como, un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo bevacizumab), un antagonista de EGFR (como, erlotinib), un agente quimioterapéutico y/o un agente citostático, un taxoide (por ejemplo, paclitaxel) y/o un agente de platino (por ejemplo, carboplatino) o agentes que mejoran la inmunidad o el sistema inmunológico del paciente.
[0470] Dichas terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (cuando se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o del fragmento del anticuerpo puede ocurrir antes, simultáneamente y/o A continuación, administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos también se pueden usar en combinación con radioterapia.
[0471] En una modalidad útil para entender la invención, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden formularse, administrarse y administrarse de manera compatible con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración. , y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo no necesita ser, pero está formulado opcionalmente con uno o más agentes que se usan actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se describen en el presente documento, o aproximadamente entre el 1 y el 99% de las dosis descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y mediante cualquier ruta que se determine empírica/clínicamente como apropiada.
[0472] En una modalidad útil para entender la invención, para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, la gravedad y el curso de la enfermedad, ya sea que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se administre con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en un momento o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 μg/kg a 40 mg/kg de anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser una dosis inicial candidata para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o Por infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 μg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendrá hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, v.g. cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de forma tal que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo o fragmento de anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguida de una o más dosis más bajas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
[0473] Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo utilizando un fragmento de anticuerpo o un inmunoconjugado en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-Axl.
[0474] Mejorar la función inmune del huésped para combatir tumores es un tema de creciente interés. Los métodos convencionales incluyen (i) aumento de APC, como (a) inyección en el tumor de ADN que codifica aloantígenos MHC extraños, o (b) transfectación de células tumorales biopsiadas con genes que aumentan la probabilidad de reconocimiento de antígenos inmunitarios (por ejemplo, citoquinas inmunoestimuladoras, GM-CSF, moléculas coestimuladoras B7.1, B7.2) del tumor, (iii) inmunoterapia celular adoptiva o tratamiento con células T activadas específicas del tumor. La inmunoterapia celular adoptiva incluye el aislamiento de los linfocitos T del huésped que se infiltran en el tumor y la expansión de la población in vitro, como la estimulación por IL-2 o tumor o ambos. Además, las células T aisladas que son disfuncionales también pueden activarse mediante la aplicaciónin vitrode los anticuerpos anti-PD-L1. Las células T que se activan de este modo se pueden volver a registrar en el hospedero. Uno o más de estos métodos se pueden usar en combinación con la administración del anticuerpo, fragmento de anticuerpo o inmunoconjugado.
[0475] Las terapias tradicionales para el cáncer incluyen lo siguiente: (i) radioterapia (por ejemplo, radioterapia, radioterapia, irradiación) o el uso de radiación ionizante para eliminar las células cancerosas y reducir el tamaño de los tumores. La radioterapia puede administrarse externamente mediante radioterapia de haz externo (EBRT) o internamente mediante braquiterapia; (ii) quimioterapia, o la aplicación de un fármaco citotóxico que generalmente afecta a las células que se dividen rápidamente; (iii) terapias dirigidas, o agentes que afectan específicamente a las proteínas desreguladas de las células cancerosas (por ejemplo, inhibidores de la tirasa quirosina imatinib, gefitinib; anticuerpos monoclonales, terapia fotodinámica); (iv) inmunoterapia, o mejora de la respuesta inmune del huésped (por ejemplo, vacuna); (v) terapia hormonal o bloqueo de la hormona (por ejemplo, cuando el tumor es sensible a la hormona), (vi) inhibidor de la angiogénesis o bloqueo de la formación y el crecimiento de los vasos sanguíneos, y (vii) cuidados paliativos o tratamiento dirigido a mejorar la calidad de Cuidados para reducir el dolor, náuseas, vómitos, diarrea y hemorragia. Los medicamentos para el dolor, como la morfina y la oxicodona, los antieméticos como el ondansetrón y el aprepitant, pueden permitir regímenes de tratamiento más agresivos.
[0476] En el tratamiento del cáncer, cualquiera de los tratamientos convencionales descritos anteriormente para el tratamiento de la inmunidad contra el cáncer puede realizarse, antes, después o simultáneamente con la administración de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl. Además, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-Axl pueden administrarse antes, posteriormente o simultáneamente con tratamientos convencionales contra el cáncer, como la administración de anticuerpos de unión a tumores (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales conjugados con toxina) y/o la administración de agentes quimioterapéuticos.
[0477] Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitativos, de las cápsulas de gelatina blanda de la presente divulgación. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la variedad de condiciones y parámetros que normalmente se encuentran en el campo, y que son obvias para los expertos en la técnica, están dentro del alcance de la divulgación.
[0478] EJEMPLOS
[0479] Ejemplo 1: Anticuerpo condicionalmente activo contra Axl
[0480] Axl es una tirasa quirosina transmembrana con un dominio extracelular accesible por el anticuerpo condicionalmente activo. Esta proteína de la superficie celular está altamente expresada en los tejidos del carcinoma de tiroides y sobreexpresada en muchos otros tipos de cáncer, como los trastornos mieloproliferativos, las células del carcinoma de próstata o el cáncer de mama. Se desarrolló aquí un anticuerpo condicionalmente activo para el dominio extracelular de la proteína Axl.
[0481] Se seleccionó un anticuerpo de tipo salvaje para Axl como el anticuerpo de plantilla (con una región variable de cadena pesada de 063-hum10F10-HC en la FIG.1A y una región variable de cadena ligera de 063-hum10F10-HC en la FIG. 1B). El ADN que codifica el anticuerpo de tipo salvaje se desarrolló para generar una biblioteca de anticuerpos mutantes mediante el uso de la Evolución Posicional Comprensiva (CPE), un método por el cual cada posición en el anticuerpo de plantilla se aleatoriza una por una. Cada anticuerpo mutante en la biblioteca tiene una sola mutación puntual. Los anticuerpos mutantes en la biblioteca se generaron mediante la selección simultánea de la afinidad de unión selectiva a Axl a pH 6,0 sobre pH 7,4 según lo determinado por ELISA.
[0482] Simultáneamente, el nivel de expresión de los anticuerpos mutantes también se optimizó para fines de campos más altos en un proceso de fabricación. La selección se realizó en suero usando una etiqueta FLAG porque había anticuerpos humanos en el suero que podrían causar falsos positivos para la selección. El tampón de selección era un tampón de carbonato (tampón de Krebs con un timbre-tampón estándar pero diferente de PBS). Se encontró que los anticuerpos condicionalmente activos generados tienen una mayor afinidad por el Axl a pH 6.0, pero una menor afinidad por el Axl a pH 7.4, ambos en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje. Algunos de los anticuerpos mutantes seleccionados (scFv) se representaron en la Figura 2 con su mayor actividad a un pH de 6.0 que a un pH de 7.4, mientras que sus relaciones de actividad entre un pH de 6.0 y un pH de 7.4 fueron por lo menos 11 veces (Figura 3).
[0483] Además, todos estos anticuerpos condicionalmente activos tienen altos niveles de expresión como se muestra en la Tabla 4 a continuación, con la columna “Clon” que muestra los anticuerpos y el nivel de expresión “mg/ml” se muestra en la segunda columna.
[0484] Los clones de estos anticuerpos se enviaron a un proveedor de servicios con un nivel de expresión solicitado (“cantidad ordenada”, niveles de expresión esperados). Sin embargo, los niveles de expresión reales de estos anticuerpos (“cantidad administrada”) fueron muy altos y excedieron los niveles de expresión esperados.
[0485] Tabla 4. Anticuerpos condicionalmente actives con altos niveles de expresión
[0488]
[0491] Los anticuerpos condicionalmente activos no mostraron agregación en un tampón como se demuestra en la FIG. 4, utilizando el anticuerpo BAP063.9-13-1 como ejemplo. El anticuerpo BAP063.9-13-1 se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En la Figura 4, solo se detectó un pico, lo que demuestra poca o ninguna agregación del anticuerpo.
[0492] Los anticuerpos condicionalmente activos también se analizaron utilizando resonancia de plasmón de superficie (SPR) para medir sus tasas de activación y desactivación con respecto a Axl. Se sabe que el ensayo SPR mide los índices de activación y desactivación de los anticuerpos condicionalmente activos. El ensayo de SPR se realizó en presencia de bicarbonato. La tasa de activación y desactivación in vivo (en animales y humanos) de los anticuerpos condicionalmente activos es una característica muy importante para los anticuerpos condicionalmente activos.
[0493] Se observó que los anticuerpos condicionalmente activos tienen mayor afinidad de unión a pH 6.0 y menor afinidad de unión a pH 7.4, en comparación con el control negativo (BAP06310F10 que tiene afinidad de unión similar a pH 6.0 y pH 7.4) (FIG.5). Además, elevar la temperatura de la temperatura ambiente a 60°C no altera significativamente los resultados del ensayo ELISA (FIG.5). El ensayo ELISA también mostró que estos anticuerpos condicionalmente activos eran altamente selectivos a un pH de 6.0 en comparación con un pH de 7.4 (las Figuras 6A-6B muestran un anticuerpo como ejemplo).
[0494] Los anticuerpos biológicos condicionalmente activos se resumen en la Tabla 5. Dos de los anticuerpos se expresaron como scFv (BAP063.9-13.3 y BAP063.9-48.3). La incubación de los anticuerpos a 60°C durante una hora no cambió las afinidades de la mayoría de los anticuerpos (“Termoestabilidad”).
[0495] Tabla 5. Resumen de los anticuerpos anti-Axl condicionalmente activos
[0498]
[0501] Ejemplo 2: Afinidad de unión dependiente del pH de los anticuerpos anti-Axl
[0502] Algunos de los anticuerpos anti-Axl de la presente invención se probaron en tampones a diferentes niveles de pH. Un tipo de tampón fue un tampón KREBS con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) presente. El tampón KREBS se tituló para tener un pH en el rango de 5-7.4. La afinidad de unión de los anticuerpos con Axl se midió utilizando un ensayo ELISA (OD450) y los resultados se presentan en la FIG.7. Los dos anticuerpos de control (BAP063-3831 y BAP063-3818) no fueron condicionalmente activos ya que tienen una afinidad de unión que no se vio afectada significativamente por el cambio en los pH. Por otro lado, los anticuerpos anti-Axl de la presente invención son condicionalmente activos ya que su afinidad de unión con Axl dependía del pH (FIG.7).
[0503] Ejemplo 3: Matanza de células por los anticuerpos anti-Axl
[0504] Las actividades de destrucción celular de los anticuerpos anti-Axl de la presente invención se probaron utilizando células A549. Los resultados se muestran en las Figuras 8A-8E. Las actividades de destrucción celular se midieron a dos niveles de pH: 6,0 y 7,4, que representan un pH en el microentorno tumoral y un pH fisiológico normal, respectivamente. El porcentaje de destrucción celular a diversas concentraciones de anticuerpos se muestra en las FIGS.8A-8E.
[0505] Las dos pruebas dieron resultados consistentes de destrucción celular. El control negativo (WT anti-Axl humanizado) mostró una actividad de destrucción celular similar a pH 6.0 y pH 7.4 para las células A549 (FIG.8A). En contraste, los anticuerpos anti-Axl de la presente invención mostraron una actividad de destrucción celular significativamente mayor a pH 6.0 en comparación con la actividad de destrucción celular a pH 7.4, especialmente a bajas concentraciones de anticuerpos en las que los anticuerpos no saturaron las células A549 (Fig.8B-8E).
[0506] Ejemplo 4: Afinidad de unión a cino-Axl por los anticuerpos anti-Axl
[0507] La afinidad de unión a cyno-Axl por los anticuerpos anti-Axl de la presente invención se midió y comparó con la afinidad de unión de Axl humana (hAxl) en dos tampones diferentes a pH de 6.0 y 7.4. Los resultados se muestran en las Figuras 9A-9D. El cyno-Axl es una proteína Axl de un primate no humano, es decir, el mono macaco cynomolgus.
[0508] El control (BA-3831-WT) mostró una afinidad de unión similar a Axl (hAxl) humano y Axl cynoomolgus (cyno-Axl) a pH 6.0 y 7.4 en los dos tampones (FIG.9A). Los anticuerpos anti-Axl de la presente invención mostraron perfiles de afinidad de unión similares para hAxl y cyno-Axl en uno de los dos tampones, es decir, una menor afinidad de unión a cyno-Axl a pH 7.4, en comparación con la afinidad de unión a cyno-Axl a pH 6.0 (Figs.9B-9D). La diferencia entre las afinidades de unión a pH 6.0 y pH 7.0 en el otro tampón no fue significativa.
[0509] Ejemplo 5: Citotoxicidad de anticuerpos anti-Axl conjugados con duomicina
[0510] La duomicina es citotóxica ya que inhibe el crecimiento celular al detener la síntesis de proteínas. Uno de los anticuerpos anti-Axl de la presente invención, BAP063.94007, se conjugó con duomicina. Se usaron dos controles en esta prueba, BAP063 hum WT y B12 (un anticuerpo anti-B12), ambos también fueron conjugados con duomicina.
[0511] Se trataron varias líneas celulares con los tres anticuerpos conjugados con duomicina (BAP063.9 4007, BAP063 hum WT y B12) a pH 6,0 y 7,4 (Figuras 10A-10H). El anticuerpo conjugado con duomicina BAP063.94007 de la presente invención mostró una citotoxicidad significativamente más alta para las líneas celulares DU145 (células de cáncer de próstata), MDA-MD-231 (células de cáncer de mama), PL45 (células de cáncer pancreático) y A549 (células de adenocarcinoma) a pH 6.0 en comparación con la citotoxicidad para las mismas células a pH 7.4.
[0512] Ejemplo 6: Anticuerpos anti-Axl conjugados para modelar toxina
[0513] El anticuerpo anti-Axl de la presente invención se conjugó con un modelo de toxina (por ejemplo, gemcitabina) para producir un conjugado anticuerpo-fármaco condicionalmente activo (CAB-Axl-ADC). El CAB-Axl-ADC se probó primero para confirmar que la actividad de destrucción condicional de células no se alteró por el proceso de conjugación del fármaco. Esta prueba mostró que el CAB-Axl-ADC destruyó significativamente más células a pH 6.0 que a pH 7.4 (FIG.11).
[0514] Luego se inyectó el CAB-Axl-ADC en ratones con tumores de xenoinjerto MiaPaCa2 en una dosis de 1 mg/kg dos veces por semana durante 3 semanas. Se utilizaron varios controles en este estudio, incluido el CAB desnudo (anticuerpo anti-Axl sin conjugación), el vehículo, la toxina sola (gemcitable no conjugada), el ADC de control, un ADC anti-Axl de afinidad (AM ADC). El estudio mostró que el CAB-Axl-ADC (CAB ADC) y el ADC de AM proporcionaron una reducción significativamente mayor en el tamaño del tumor, en comparación con los controles (FIG. 12). El anticuerpo anti-Axl no conjugado no redujo el tamaño de los tumores. Este estudio demostró que el anticuerpo anti-Axl conjugado con toxina es tan efectivo para reducir el tamaño del tumor como un anticuerpo de afinidad.
[0515] Ejemplo 7: Concentraciones séricas de conjugados de fármacos de anticuerpos anti-Axl en monos macacos cynomolgus
[0516] Un conjugado de fármaco (duomicina) del anticuerpo anti-Axl (CAB-ADC) de la presente invención se inyectó en monos macacos cynomolgus machos y hembras en tres dosis: 0.1, 1 y 10 mg/kg. Se usó anticuerpo anti-Axl desnudo como control. El conjugado de afinidad de anticuerpo conjugado de drogas (AM-ADC) también se utilizó como control. Las concentraciones séricas del anticuerpo se midieron durante un período de una semana (168 horas, ver Figuras 13A-13B). El CAB-ADC persistió en el suero de mono durante más tiempo que el control AM-ADC (FIG.13B). No hubo diferencias significativas entre los monos machos y hembras (FIG.13A-13B).
[0517] Ejemplo 8: Toxicidad de los conjugados de fármaco de anticuerpo anti-Axl en monos macacos cynomolgusLa toxicidad del CAB-ADC de la presente invención probado en monos macacos cynomolgus. La aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) se han utilizado como indicadores de la toxicidad hepática de los medicamentos por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Los niveles séricos de AST y ALT se midieron tanto en el mono macho como en el hembra (Fig.14A-14B). El vehículo (PBS) no causó alteración del nivel de AST o ALT en el suero, mientras que el conjugado de fármaco de anticuerpo (AM) mostró niveles muy altos de AST y ALT a los 3 días después de la dosis de 10 mg/kg. El CAB-ADC mostró niveles significativamente reducidos de AST y ALT, en comparación con el control de AM. Esto indicó que los conjugados de fármaco de anticuerpo anti-Axl de la presente invención habían reducido significativamente la toxicidad hepática en relación con el conjugado de fármaco de anticuerpo conjugado AM.
[0518] También se encontró que el conjugado farmacológico de anticuerpo anti-Axl de la presente invención causa menos inflamación en los monos (FIG.15). Se recogieron los recuentos de linfocitos en la sangre de los monos después de las inyecciones de CAB, AM y PBS. En comparación con la AM que causó una inflamación significativa, el conjugado farmacológico del anticuerpo anti-Axl de la presente invención (CAB-ADC) causó solo una inflamación leve en los monos.
[0519] Ejemplo 9: Experimentos in vivo en ratones
[0520] A los ratones se les implantó una de 2 líneas celulares tumorales (LCLC103H o DU145) que se convertirían en tumores. Se midió el tamaño del tumor después del tratamiento con el fármaco antitumoral monometil auristatina E (MMAE). Para los ratones que recibieron LCLC103H, los ratones se trataron con una dosis única de vehículo (como control negativo), ADC MMAE conjugado con anticuerpo anti-Axl CAB (CAB Axl-MMAE), o ADCC MCCE conjugado con anticuerpo anti-Axl no CAB (no-CAB Axl-MMAE), FIG.16A. Los tumores en ratones tratados con ADC se redujeron mientras que los tumores en ratones tratados con vehículo continuaron creciendo.
[0521] Además, los ratones que recibieron DU145 se trataron con vehículo (control negativo) o CAB anti-Axl conjugado con anticuerpo MMAE ADC (CAB Axl-MMAE) a dos niveles diferentes. Concentración (6 mg/kg y 10 mg/kg). El volumen del tumor se midió con el tiempo. Los tumores continuaron creciendo en el grupo de control negativo (vehículo) mientras que el crecimiento del tumor disminuyó en los ratones tratados con los ADC (FIG.16B).
[0522] El (los) solicitante(s) no tiene(n) intención de dedicar ninguna de las modalidades descritas al público.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la proteína Axl, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que incluye tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que incluye tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera, en donde
la región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias SEC ID NOS: 11-13, y
la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias SEC ID NOS: 7-10; y
el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una relación de afinidad de unión a la proteína Axl a un valor de pH de 5,0 a 6,8 en un microambiente tumoral y una afinidad de unión a la proteína Axl a un valor diferente de pH de 7,2 a 7,8 en un microambiente no tumoral de al menos 1,5:1.
2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias de SEC ID NOS: 11-13, y la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de ADN seleccionada entre las secuencias de SEC ID NOS: 9-10.
3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una relación de la afinidad de unión a la proteína Axl a un valor de pH de 5,0 a 6,8 en el microambiente tumoral y la afinidad de unión a la proteína Axl a un valor diferente de pH de 7,2 a 7,8 en un microambiente no tumoral de al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 20:1, al menos 30:1, al menos 50:1, al menos 70:1 o al menos 100:1.
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el valor de pH para el microambiente tumoral es 6,0 y el valor de pH para el microambiente no tumoral es 7,4.
5. Un inmunoconjugado caracterizado porque comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el inmunoconjugado comprende al menos un agente seleccionado entre un agente quimioterapéutico, un átomo radiactivo, un agente citostático y un agente citotóxico.
7. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el al menos un agente se selecciona entre maitansinoides, auristatinas, dolastatinas, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepinas y antraciclinas.
8. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende:
el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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