RS67736B1 - Anti axl antitela, fragmenti antitela i njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe - Google Patents

Anti axl antitela, fragmenti antitela i njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS67736B1
RS67736B1 RS20260153A RSP20260153A RS67736B1 RS 67736 B1 RS67736 B1 RS 67736B1 RS 20260153 A RS20260153 A RS 20260153A RS P20260153 A RSP20260153 A RS P20260153A RS 67736 B1 RS67736 B1 RS 67736B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
axl
antibodies
vol
cancer
Prior art date
Application number
RS20260153A
Other languages
English (en)
Inventor
Jay M Short
Hwai Wen Chang
Gerhard Frey
Original Assignee
Bioatla Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioatla Inc filed Critical Bioatla Inc
Publication of RS67736B1 publication Critical patent/RS67736B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] OBLAST PRONALASKA
[0005] Ovaj pronalazak se odnosi na anti-Axl antitela ili fragmente antitela, imunokonjugate i farmaceutske kompozicije koje sadrže takva antitela, fragmente antitela i imunokonjugate. Bilo kakve reference u opisu na metode lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u metodu lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom.
[0007] POZADINA PRONALASKA
[0009] Axl protein (takođe poznat kao Ark, UFO, Tyro‐7) je receptor tirozin kinaze u Tyro‐3 porodici kinaza. Tyro‐3 receptor kinaze karakteriše kombinacija dva domena slična imunoglobinu i dvostrukih ponavljanja fibronektina tipa III u ekstracelularnom regionu i citoplazmatskog kinaznog domena. Ligandi za Tyro‐3 receptor kinaze su Gas6 (6 specifičan za zaustavljanje rasta) i protein S, dva proteina zavisna od vitamina K koji pokazuju 43% identiteta aminokiselinskih sekvenci i dele slične strukture domena. Svaki protein ima N-terminalni GIa domen koji sadrži 11 ostataka g-karboksiglutaminske kiseline, nakon čega slede četiri modula slična epidermalnom faktoru rasta (EGF), i C-terminalnu strukturu sličnu globlinu koji vezuje polne hormone (SHBG) koja se sastoji od dva tandemska laminin G domena. SHBG domen je i neophodan i dovoljan za vezivanje i aktivaciju Tiro-3 receptor kinaze, dok se GIa domen vezuje za negativno naelektrisane membranske fosfolipide i igra važnu ulogu u fagocitozi apoptotičnih ćelija posredovanoj Tiro-3 kinazom.
[0010] Aktivacija Axl-a dovodi do signalizacije putem PI‐3-kinaze/Akt (Franke et al., Oncogene, vol.
[0011] 22, pp.8983‐8998, 2003) i drugih glavnih puteva poput Ras/Erk i β-katenina/TCF (Goruppi et al., Mol. Cell.Biol., vol. 21, pp. 902‐915, 2001). Axl je slabo ekspresovan u nizu normalnih tkiva, uključujući mozak, srce, skeletne mišiće, kapsule organa i vezivno tkivo nekoliko drugih organa, kao i u monocitima, ali ne i u limfocitima. Fosforilacija Akt-a indukovana Axl-om opisana je u preživljavanju fibroblasta (Goruppi et al., Mol. Cell. Biol., vol.17, pp.4442‐44531997), endotelnih ćelija (Hasanbasic et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, vol.287, H1207-H1213, 2004), ćelija vaskularnih glatkih mišića (Melaragno et al., J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 37, pp. 881‐887, 2004) i neurona (Allen et al., Mol. Endocrinol., vol. 13, pp. 191‐201, 1999). Štaviše, Axl igra ulogu u ćelijskoj adheziji i hemotaksi, jer životinje sa Axl isključenim genom pokazuju oštećenu stabilizaciju agregata trombocita i formiranje tromba kao rezultat smanjene aktivacije integrina IIb3 trombocita.
[0012] [0004] Disregulacija Axl-a ili njegovog liganda Gas6 je implicirana u patogenezi raznih vrsta raka kod ljudi. Axl [0004] Disregulacija Axl-a ili njegovog liganda Gas6 je implicirana u patogenezi raznih vrsta raka kod ljudi. Prekomerna ekspresija Axl-a je pokazana kod različitih vrsta raka, npr. dojka (Meric et al., Clin. Cancer Res., vol.8, str.361–367, 2002; Berclaz et al., Ann. Oncol., vol.12, str.819–824, 2001), debelo crevo (Chen et al., Int. J. Cancer, vol. 83, str. 579–584, 1999; Craven et al., Int. J. Cancer, vol.
[0013] 60, str. 791–797, 1995), prostata (Jacob et al., Cancer Detect. Prey., vol. 23, str.325–332, 1999), pluća (Wimmel et al., Eur J Cancer, vol. 37, str. 2264–2274, 2001), želudac (Wu et al., Anticancer Res., vol.
[0014] 22, str. 1071–1078, 2002), jajnika (Sun et al., Oncology, vol. 66, str. 450–457, 2004), endometrijuma (Sun et al., Ann. Oncol., vol. 14, str. 898–906, 2003), bubrega (Chung et al., DNK Cell Biol., vol. 22, str.533–540, 2003), hepatocelularnog (Tsou et al., Genomics, vol.50, str.331–340, 1998), štitne žlezde (Ito et al., Thyroid, vol. 12, str.971–975, 2002; Ito et al., Thyroid, vol. 9, str.563–567, 1999), a štaviše i kod hronične mijeloidne leukemije (Jansen i dr., Onkogen, vol.6, str.2113–2120, 1991; Braunger i dr., Onkogen, vol.14, str.2619–26311997; O’Brajan i dr., Mol. Cell. Biol., vol.11, str.5016–5031, 1991), akutna mijeloidna leukemija (Rohlitc i dr., Leukemija, vol. 13, str. 1352–1358, 1999), osteosarkom (Nakano i dr., J. Biol. Hem., vol. 270, str. 5702–5705, 2003), melanom (van Ginkel i dr., Kancer Res., vol.64, str.128–134, 2004), i u skvamoznim ćelijama glave i vrata karcinom (Green et al., Br J. Cancer., vol. 94, str.1446‐5, 2006).
[0015] Nedavno je, profilisanjem fosfotirozinske signalizacije, aktivirani Axl otkriven u oko 5% primarnih tumora NSCLC (Rikova et al, Cell, vol. 131, pp. 1190‐1203, 2007). Ekspresija Axl je indukovana ciljanim hemoterapijskim lekovima, a ekspresija Axl indukovana lekovima daje otpornost na hemoterapiju kod akutne mijeloidne leukemije (Hong et al, Cancer Letters, vol. 268, pp. 314‐324, 2008), kao i otpornost na imatinib i lapatinib/herceptin kod gastrointestinalnih stromalnih tumora (Mehadevan, et al, Oncogene, vol. 26, pp. 3909‐3919, 2007) i raka dojke (Liu et al, Cancer Research, vol. 281, pp.6871‐6878, 2009).
[0016] Štaviše, identifikovano je da je Axl povezan sa metastazama tumora jer je Axl pojačano izražen u agresivnim ćelijskim linijama raka dojke u poređenju sa neinvazivnim ćelijama. In vitro, utvrđeno je da je aktivnostb Axl neophodna za migraciju i invaziju, a ova aktivnost može inhibirati tretmanom antitelima (WO 04/008147). Slično tome, ukidanje aktivnosti Axl in vivo, bilo putem ekspresije dominantno negativne verzije Axl (Vajkoczy, P., et al., Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., vol. 103, pp.
[0017] 5799‐5804, 2005) ili putem siRNA posredovane regulacije Axl (Holland et al., Cancer Res., vol. 65, pp.9294‐9303, 2005), sprečilo je rast potkožnih i ortotopskih ćelija u eksperimentima sa ksenograftom miševa. Strategije za ciljanje Axl-a i lekova usmerenih na Axl za lečenje raka opisane su u Zhu C. et al., Mol. Cancer, 18(1): strana 153 (2019).
[0018] [0007] Shodno tome, opisana su monoklonska antitela protiv Axl-a za upotrebu u lečenju raka. Za Na primer, publikacije koje se odnose na anti-Axl antitela uključuju WO 2009/063965, WO 2009/062690, WO 2010/130751, WO 2011/014457, WO 2011/159980, WO 2016/005593, US 2014/0227283 i američki patent br. 8,853,369. US 2014/0227283 otkriva monoklonska anti-Axl antitela i njihovu upotrebu u dijagnostičkim i terapijskim metodama. WO 2009/062690 i WO 2009/062690 otkrivaju antitela koja se vezuju za ekstracelularni domen Axl proteina i mogu bar delimično inhibirati Axl aktivnost. WO 2011/159980 otkriva anti-Axl antitela koja se vezuju za ljudski Axl sa afinitetom ≤ 600 pM.
[0019] Metode i kompozicije za vezivanje ciljanog agensa (MDTA) za mikrometu zavisno od sredine pod jednim skupom reakcionih uslova bolje nego pod drugim skupom reakcionih uslova kao što je pH, generalno su opisane u WO 2003/105757. US2005/0260711 otkriva metod regulisanja interakcije pH-senzitivnih proteina uključivanjem neprirodnih aminokiselina u protein kao što je antitelo. US2014/0235482 otkriva polipeptide koji imaju aglikozilovani Fc domen antitela i poboljšavaju ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) zavisnu od antitela. WO 2016/033331 otkriva uslovno aktivne himerne antigenske receptore (CARs) i metod generisanja CARs iz proteina divljeg tipa. Američki patent 2015/266974 otkriva antitela sa pH-zavisnim vezivanjem za svoj antigen kod kojih je afinitet za vezivanje antigena pri fiziološkom pH (pH 7.4) veći nego pri endozomalnom pH (od 6.0 ili 5.5), tako da se pH-zavisna antitela preferencijalno disociraju od antigena u endozomu. Američki patent 2012/108455 otkriva metod za evoluciju, selekciju ili proizvodnju uslovno aktivnih terapeutskih proteina kao što su anti-EGFR i anti-CTLA4 antitela. KunikV. i dr., PloS Computational Biology, 8(2): stranica e10022388 (2012) otkriva paratomski strukturni pristup za identifikaciju regiona vezivanja antigena (ABRs).
[0020] Ova monoklonska anti-Axl antitela će se vezati za Axl na bilo kom mestu na telu pacijenta sa sličnim afinitetom, uključujući i mesta tumora koje treba da leče. Očekuje se da vezivanje takvih antitela za Axl u netumorskim sredinama ima negativan uticaj na normalno funkcionisanje Axl u tim sredinama i stoga može izazvati značajne neželjene efekte. Ovaj pronalazak pruža uslovno aktivna anti-Axl antitela i fragmente antitela koji imaju veći afinitet vezivanja za Axl u tumorskom mikrookruženju u poređenju sa njihovim afinitetom vezivanja za Axl u netumorskom okruženju. Očekuje se da anti-Axl antitela i fragmenti antitela ovog pronalaska imaju uporedivu ili veću efikasnost protiv raka sa smanjenim neželjenim efektima, u poređenju sa monoklonskim anti-Axl antitelima poznatim u struci. Ovo takođe može omogućiti primenu većih doza anti-Axl antitela i fragmenata antitela ili češći tretman, čime se pruža efikasnija terapijska opcija.
[0022] KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
[0024] U jednom aspektu, ovaj pronalazak pruža anti-Axl antitelo ili fragment antitela koji uključuje varijabilni region teškog lanca koji ima tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji ima tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca. Varijabilni region teškog lanca je kodiran DNK sekvencom odabranom iz sekvenci SEQ ID NOS: 11-13, a varijabilni region lakog lanca je kodiran DNK sekvencom odabranom iz SEQ ID NOS: 7-10, i antitelo ili fragment antitela ima odnos afiniteta vezivanja za Axl protein pri vrednosti pH od 5.0 do 6.8 u tumorskom mikrookruženju i afinitet vezivanja za Axl protein pri različitoj vrednosti pH od 7.2 do 7.8 u netumorskom mikrookruženju od najmanje 1.5:1.
[0025] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak pruža imunokonjugat koji uključuje antitelo ili fragment antitela ovog pronalaska, opciono konjugovan sa sredstvom izabranim iz hemoterapeutskog sredstva, radioaktivnog atoma, citostatika i citotoksičnog agensa.
[0026] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak pruža farmaceutski sastav koji uključuje antitelo ili fragment antitela, ili imunokonjugat ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0028] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030]
[0032] Slike 1A-1B prikazuju poravnanja sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i varijabilnih regiona lakog lanca, respektivno, anti-Axl antitela ovog pronalaska.
[0033] Slika 2 prikazuje vezivanje (OD450) različitih uslovno aktivnih antitela ovog pronalaska za ekstracelularni domen Axl-a pri pH 6.0 i pH 7.4. Ova uslovno aktivna antitela su bila aktivnija pri pH 6.0 nego pri pH 7.4.
[0034] Slika 3 prikazuje selektivnost različitih uslovno aktivnih antitela ovog pronalaska na ekstracelularni domen Axl-a. Selektivnost je merena kao odnos afiniteta vezivanja za partnera za vezivanje pri pH 6.0 i afiniteta vezivanja za istog partnera za vezivanje pri pH 7.4.
[0035] Slika 4 prikazuje rezultate hromatografije isključivanja po veličini, što ukazuje da se uslovno aktivna antitela ovog pronalaska ne agregiraju, kao što je opisano u Primeru 1.
[0036] Slika 5 prikazuje termostabilnost uslovno aktivnih antitela ovog pronalaska pre i posle toplotnog šoka, mereno ELISA testom, kao što je opisano u Primeru 1.
[0037] Slike 6A-6B prikazuju selektivnost uslovno aktivnih antitela ovog pronalaska, mereno SPR testom u Primeru 1.
[0038] Slika 7 prikazuje profile vezivanja zavisne od pH vrednosti za vezivanje anti-Axl antitela ovog pronalaska za Axl u KREBS puferu.
[0039] Slike 8A-8E prikazuju rezultate druge studije ubijanja ćelija korišćenjem ćelija A549, gde su anti-Axl antitela ovog pronalaska korišćena za ubijanje ćelija pri pH 6.0 i pH 7.4 i pri različitim koncentracijama antitela.
[0040] Slike 9A-9D prikazuju afinitet vezivanja za ljudski Axl i Axl cinomolgusa za anti-Axl antitela ovog pronalaska u različitim puferima i pri različitim nivoima pH.
[0041] Slike 10A‑10H prikazuju ubijanje ćelija različitih ćelijskih linija na različitim nivoima pH pomoću anti-Axl antitela ovog pronalaska koja su konjugovana sa duomicinom.
[0042] Slika 11 prikazuje uništavanje ćelija A549 na različitim nivoima pH pomoću anti-Axl antitela ovog pronalaska koja su bila konjugovana sa gemcitabinom.
[0043] Slika 12 prikazuje efekte na zapreminu tumora kod ksenograftiranih miševa sa duomicinkonjugovanim anti-Axl antitelom ovog pronalaska.
[0044] Slike 13A-13B prikazuju detektovano prisustvo duomicin-konjugovanog anti-Axl antitela ovog pronalaska u krvi cinomolgus majmuna tokom vremena nakon injekcije konjugata.
[0045] Slika 14A prikazuje detektovano prisustvo aspartat transaminaze (AST) u krvi cinomolgus majmuna tokom vremena počevši neposredno pre injekcije (pre (D-3)) do 3 dana nakon injekcije (posle (D-3)) konjugata.
[0046] Slika 1 Slika 14B prikazuje detektovano prisustvo alanin-aspartat transaminaze (ALT) u krvi cinomolgus majmuna tokom vremena, počevši neposredno pre injekcije (pre (D-3)) do 3 dana nakon injekcije (posle (D-3)) konjugata.
[0047] Slika 15 prikazuje broj limfocita tokom vremena u krvi cinomolgus majmuna nakon injekcije konjugata.
[0048] Slike 16A-16B prikazuju in vivo tretman miševa koji su primali LCLC103H i DU145, respektivno.
[0050] DEFINICIJE
[0052] Radi lakšeg razumevanja primera datih ovde, ovde su definisani određeni često korišćeni termini.
[0053] U vezi sa izmerenom količinom, termin „približno“, kako se ovde koristi, odnosi se na normalnu varijaciju u toj izmerenoj količini koju bi očekivao stručnjak koji vrši merenje i pokazuje nivo pažnje srazmeran cilju merenja i preciznosti korišćene merne opreme. Osim ako nije drugačije naznačeno, „oko“ se odnosi na varijaciju od /- 10% date vrednosti.
[0054] Termin „afinitet“, kako se ovde koristi, odnosi se na jačinu ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova para vezivanja (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y generalno se može predstaviti konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim metodama poznatim u struci, uključujući one opisane ovde. Specifična ilustrativna i primerna oličenja za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
[0055] Termin „zreo afinitet“, kada se koristi u vezi sa antitelom, odnosi se na antitelo ili fragment antitela sa jednom ili više promena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVRs), u poređenju sa matičnim antitelom ili fragmentom antitela koji ne poseduje takve promene, pri čemu takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela ili fragmenta antitela za antigen.
[0056] Termin „aminokiselina“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koje organsko jedinjenje koje sadrži amino grupu (--NH<2>) i karboksilnu grupu (--COOH); poželjno ili kao slobodne grupe ili alternativno nakon kondenzacije kao deo peptidnih veza. „Dvadeset prirodno kodiranih alfaaminokiselina koje formiraju polipeptide“ su poznate u struci i odnose se na: alanin (ala ili A), arginin (arg ili R), asparagin (asn ili N), asparaginsku kiselinu (asp ili D), cistein (cys ili C), glutaminsku kiselinu (glu ili E), glutamin (gin ili Q), glicin (gly ili G), histidin (his ili H), izoleucin (ile ili I), leucin (leu ili L), lizin (lys ili K), metionin (met ili M), fenilalanin (phe ili F), prolin (pro ili P), serin (ser ili S), treonin (thr ili T), triptofan (tip ili W), tirozin (tyr ili Y) i valin (val ili V).
[0057] Termin „antiangiogeni agens“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje koje blokira ili donekle ometa razvoj krvnih sudova. Antiangiogeni agens može, na primer, biti mali molekul ili antitelo koje se vezuje za faktor rasta ili receptor faktora rasta koji je uključen u promociju angiogeneze. U jednom izvođenju, antiangiogeni agens je antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), kao što je bevacizumab (AVASTIN®).
[0058] Termin „fragment antitela“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul koji nije intaktno antitelo, a koji sadrži deo intaktnog antitela koji se vezuje za antigen za koji se intaktno antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)<2>; diatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv). Ovi fragmenti antitela, koji zadržavaju izvesnu sposobnost selektivnog vezivanja za antigen (npr. polipeptidni antigen) antitela iz kojeg su izvedeni, mogu se napraviti korišćenjem dobro poznatih metoda u struci (videti, npr., Harlou i Lejn, supra).
[0059] Termin „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na intaktne molekule imunoglobulina. Antitela ili fragmenti antitela mogu se koristiti za izolovanje preparativnih količina antigena imunoafinitetnom hromatografijom. Različite druge upotrebe takvih antitela ili fragmenata antitela su za dijagnostikovanje i/ili određivanje stadijuma bolesti (npr. neoplazije) i za terapeutsku primenu za lečenje bolesti, kao što su na primer: neoplazija, autoimune bolesti, SIDA, kardiovaskularne bolesti, infekcije i slično. Himerna, ljudska, humanizovana ili potpuno ljudska antitela ili fragmenti antitela su posebno korisni za primenu kod ljudskih pacijenata.
[0060] Fab fragment se sastoji od monovalentnog fragmenta molekula antitela koji vezuje antigen i može se proizvesti varenjem celog molekula antitela enzimom papain, da bi se dobio fragment koji se sastoji od intaktnog lakog lanca i dela teškog lanca.
[0061] Fab’ fragment molekula antitela može se dobiti tretiranjem celog molekula antitela pepsinom, nakon čega sledi redukcija, da bi se dobio molekul koji se sastoji od intaktnog lakog lanca i dela teškog lanca. Po molekulu antitela tretiranom na ovaj način dobijaju se dva Fab’ fragmenta.
[0062] (Fab’)2 fragment antitela može se dobiti tretiranjem celog molekula antitela enzimom pepsinom, bez naknadne redukcije. (Fab’)2 fragment je dimer dva Fab’ fragmenta, koji su povezani dvema disulfidnim vezama.
[0063] Fv fragment je definisan kao genetski modifikovani fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca izražen kao dva lanca.
[0064] [0026] Termini „anti-Axl antitelo“, fragment anti-Axl antitela i „antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za Axl“, kako se ovde koriste, odnose se na antitelo ili fragment antitela koji je sposoban da se veže za Axl sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo ili fragment antitela koristan kao dijagnostičko i/ili terapeutsko sredstvo u ciljanju Axl. U jednom izvođenju, stepen vezivanja anti-Axl antitela ili fragmenta antitela za nepovezani, ne-Axl protein je manji od oko 10% vezivanja antitela ili fragmenta antitela za Axl, mereno, npr. radioimunološkim testom (RIA). U određenim izvođenju, antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za Axl ima konstantu disocijacije (Kd) od ≦1 μM, ≦100 nM, ≦10 nM, ≦1 nM, ≦0.1 nM, ≦0.01 nM ili ≦0.001 nM (npr.10<‐8>M ili manje, ili od 10<‐8>M do 10<‐13>M, ili od 10<‐9>M do 10<‐13>M). U određenim izvođenjima, anti-Axl antitelo ili fragment antitela vezuje se za epitop Axl koji je konzerviran među Axl iz različitih vrsta.
[0065] Termin „angiogeni poremećaj“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju disregulaciju angiogeneze, uključujući i ne-neoplastična i neoplastična stanja. Neoplastična stanja uključuju, ali nisu ograničena na ona opisana u nastavku (videti, npr., „Rak“). Ne-neoplastični poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, neželjenu ili abnormalnu hipertrofiju, artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijazu, psorijatične plakove, sarkoidozu, aterosklerozu, aterosklerotske plakove, dijabetičke i druge proliferativne retinopatije, uključujući retinopatiju nedonoščadi, retrolentalnu fibroplaziju, neovaskularni glaukom, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, dijabetički makularni edem, neovaskularizaciju rožnjače, neovaskularizaciju grafta rožnjače, odbacivanje grafta rožnjače, retinalnu/horoidalnu neovaskularizaciju, neovaskularizaciju ugla (rubeoza), očnu neovaskularnu bolest, vaskularnu restenozu, arteriovenske malformacije (AVM), meningiom, hemangiom, angiofibrom, hiperplazije štitne žlezde (uključujući Grejvsovu bolest), transplantaciju rožnjače i drugih tkiva, hroničnu upalu, upalu pluća, akutno povredu pluća/ARDS, sepsu, primarnu plućnu hipertenziju, maligne plućne izlive, cerebralni edem (npr. povezan sa akutnim moždanim udarom/zatvorenom povredom glave/traumom), sinovijalnu upalu, formiranje panusa u Reumatoidni artritis, osifikujući miozitis, hipertropno formiranje kostiju, osteoartritis (OA), refraktorni ascites, policistična bolest jajnika, endometrioza, bolesti tečnosti trećeg razmaka (pankreatitis, sindrom kompartmenta, opekotine, bolest creva), fibroidi materice, prevremeni porođaj, hronična upala kao što je IBD (Kronova bolest i ulcerozni kolitis), odbacivanje bubrežnog alografta, inflamatorna bolest creva, nefrotski sindrom, neželjeni ili abnormalni rast tkivne mase (nekancerogeni), hemofilni zglobovi, hipertrofični ožiljci, inhibicija rasta dlake, Osler-Veberov sindrom, piogeni granulom retrolentalne fibroplazije, skleroderma, trahom, vaskularne adhezije, sinovitis, dermatitis, preeklampsija, ascites, perikardijalni izliv (kao što je onaj povezan sa perikarditisom) i pleuralni izliv.
[0066] Termin „angiogeneza“, kako se ovde koristi, odnosi se na sve procese koji uključuju Axl i doprinose rastu novih krvnih sudova iz već postojećih krvnih sudova, posebno, ali ne ograničavajući se na nove krvne sudove koji snabdevaju tumor. Ovi procesi uključuju višestruke ćelijske događaje kao što su proliferacija, preživljavanje, migracija i nicanje vaskularnih endotelnih ćelija, privlačenje i migracija pericita, kao i formiranje bazalne membrane za stabilizaciju krvnih sudova, perfuziju krvnih sudova ili lučenje angiogenih faktora od strane stromalnih ili neoplastičnih ćelija, i biće stimulisani ili posredovani nekatalitičkim ili katalitičkim aktivnostima Axl-a, poželjno uključujući Axl fosforilaciju i/ili Axlposredovanu transdukciju signala.
[0067] Termin „Axl“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni Axl iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Termin obuhvata „punodužni“, neobrađeni Axl, kao i bilo koji oblik Axl-a koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno prisutne varijante Axl-a, npr. splajs varijante ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca ljudskog Axl-a je dobro poznata u struci i dostupna je iz javnih baza podataka kao što je GenBank.
[0068] Termin „aktivacija Axl“, kako se ovde koristi, odnosi se na aktivaciju ili fosforilaciju Axl receptora. Generalno, aktivacija Axl rezultira prenosom signala (npr. onom izazvanom intracelularnim kinaznim domenom Axl receptora koji fosforiluje tirozinske ostatke u Axl ili supstratnom polipeptidu). Aktivacija Axl može biti posredovana vezivanjem Axl liganda (Gas6) za Axl receptor od interesa. Vezivanje Gas6 za Axl može aktivirati kinazni domen Axl i time dovesti do fosforilacije tirozinskih ostataka u Axl i/ili fosforilacije tirozinskih ostataka u dodatnim supstratnim polipeptidima.
[0069] Termin „Axl-posredovana antiapoptoza“, kako se ovde koristi, odnosi se na sve procese koji uključuju Axl i koji sprečavaju ljudske ćelije, poželjno, ali ne ograničavajući se na ljudske ćelije raka od programirane ćelijske smrti (apoptoze). Konkretno, odnosi se na procese koji sprečavaju ljudske ćelije, poželjno, ali ne ograničavajući se na ljudske ćelije raka, od indukcije apoptoze putem povlačenja faktora rasta, hipoksije, izlaganja hemoterapeutskim sredstvima ili zračenju, ili pokretanja signalizacije posredovane Fas/Apo‐1 receptorom, a stimulisani su ili posredovani nekatalitičkim ili katalitičkim aktivnostima Axl-a, poželjno uključujući Axl fosforilaciju i/ili Axl-posredovanu transdukciju signala.
[0070] Termin „vezivanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na interakciju varijabilnog regiona ili Fv antitela sa antigenom, pri čemu interakcija zavisi od prisustva određene strukture (npr. antigenske determinante ili epitopa) na antigenu. Na primer, varijabilni region antitela ili Fv prepoznaje i vezuje se za specifičnu proteinsku strukturu a ne za proteine generalno. Kako se ovde koristi, termin „specifično vezivanje“ ili „ vezivanje specifično “ znači da se varijabilni region antitela ili Fv vezuje ili povezuje sa određenim antigenom češće, brže, sa većim trajanjem i/ili sa većim afinitetom sa njim nego sa drugim proteinima. Na primer, varijabilni region antitela ili Fv se specifično vezuje za svoj antigen sa većim afinitetom, avidnošću, lakše i/ili sa većim trajanjem nego što se vezuje za druge antigene. Na drugi primer, varijabilni region antitela ili Fv se vezuje za protein ćelijske površine (antigen) sa značajno većim afinitetom nego što se vezuje za srodne proteine ili druge proteine ćelijske površine ili za antigene koje obično prepoznaju polireaktivna prirodna antitela (tj. prirodna antitela za koja se zna da vezuju razne antigene koji se prirodno nalaze kod ljudi). Međutim, „specifično vezivanje“ ne zahteva nužno ekskluzivno vezivanje ili nedetektabilno vezivanje drugog antigena, to se podrazumeva pod terminom „selektivno vezivanje“. U jednom primeru, „specifično vezivanje“ varijabilnog regiona antitela ili Fv (ili drugog vezujućeg regiona) vezuje se za antigen, znači da se varijabilni region antitela ili Fv vezuje za antigen sa ravnotežnom konstantom (KD) od 100 nM ili manje, kao što je 50 nM ili manje, na primer 20 nM ili manje, kao što je 15 nM ili manje, ili 10 nM ili manje, ili 5 nM ili manje, 2 nM ili manje, ili 1 nM ili manje.
[0071] [0033] Termini „rak“ i „kancerozan“, kako se ovde koriste, odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje je tipično okarakterisano neregulisanim rastom/proliferacijom ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom (npr. Hodžkinov i ne-Hodžkinov limfom), blastom, sarkom i leukemiju. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju skvamozni karcinom, rak pluća malih ćelija, nesitnoćelijski karcinom pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni karcinom, gastrointestinalni karcinom, rak pankreasa, gliom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačnih žlezda, rak bubrega, rak jetre, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, karcinom jetre, leukemiju i druge limfoproliferativne poremećaje, i razne vrste raka glave i vrata.
[0072] Termini „poremećaj ćelijske proliferacije“ i „proliferativni poremećaj“, kako se ovde koriste, odnose se na poremećaje koji su povezani sa određenim stepenom abnormalne ćelijske proliferacije. U jednom izvođenju, poremećaj ćelijske proliferacije je rak.
[0073] Termin „hemoterapeutsko sredstvo“, kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje korisno u lečenju raka. Primeri hemoterapeutskih sredstava uključuju alkilujuća sredstva kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CYTOXAN®); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilen-nefosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); delta‐9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta‐lapahon; lapahol; kolhicini; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN®), CPT‐11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC‐1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinska kiselina; tenipozid; kriptoficini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW‐2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktinin; spongistatin; azotni senf kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrozoureje kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su enedijnski antibiotici (npr. kaliheamicin, posebno kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omega11 (videti, npr., Nicolaou et al., Angew.Chem. Intl.Ed.Engl., 33:183-186 (1994)); CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoproteinski enedijnski antibiotički hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMICIN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin, injekcija lipozoma doksorubicin hidrohlorida (DOKSIL®), lipozomalni doksorubicin TLC D‐99 (MIOCET®), peglilovani lipozomalni doksorubicin (CAELIX®) i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tuberkulidin, ubenimeks, zinostatin, zorobicin; antimetaboliti kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabin (XELODA®), epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreks-at, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan,
[0076] 1
[0077] testolakton; antiadrenali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; nadoknađivači folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elformitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® olisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Judžin, Oregon); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2’,2’-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T‐2 toksin, verakurin A, roridin A i angidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepa; taksoid, npr. paklitaksel (TAXOL®), formulacija paklitaksela sa nanočesticama dobijenim albuminom (ABRAXANETM) i docetaksel (TAXOTERE®); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; sredstva na bazi platine kao što su cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN®) i karboplatin; vinkas, koji sprečava polimerizaciju tubulina od formiranja mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN®), vinkristin (ONCOVIN®), vindezin (ELDI-SINE®, FILDESIN®) i vinorelbin (NAVELBINE®); etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novan-tron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMF®); retinoidi kao što je retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonati kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE‐58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®) ili rizedronat (ACTONEL®); troksacitabin (analog citozina 1,3-dioksolan nukleozida); antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima impliciranim u aberantnu ćelijsku proliferaciju, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao što je THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LUR-TOTECAN®); rmRH (npr. ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU‐11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifozin, COX‐2 inhibitor (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI‐779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl‐2 inhibitor kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; EGFR inhibitori (videti definiciju ispod); inhibitori tirozin kinaze (videti definiciju ispod); inhibitori serin-treonin kinaze kao što je rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®); inhibitori farneziltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARA-SARTM); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom; i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATIN™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom.
[0078] [0036] Hemoterapeutski agensi, kako su ovde definisani, uključuju „antihormonske agense“ ili „endokrine terapeutike“ koji deluju tako što regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu podstaći rast raka. Oni mogu biti sami hormoni, uključujući, ali ne ograničavajući se na: antiestrogene sa mešovitim agonističkim/antagonističkim profilom, uključujući tamoksifen (NOLVADEX®), 4-hidroksitamoksifen, toremifen (FARESTON®), idoksifen, droloksifen, raloksifen (EVISTA®), trioksifen, keoksifen i selektivne modulatore estrogenskih receptora (SERM) kao što je SERM3; čiste antiestrogene bez agonističkih svojstava, kao što su fulvestrant (FASLODEX®) i EM800 (takva sredstva mogu blokirati dimerizaciju estrogenskih receptora (ER), inhibirati vezivanje za DNK, povećati promet ER i/ili suzbiti nivoe ER); inhibitori aromataze, uključujući steroidne inhibitore aromataze kao što su formestan i eksemestan (AROMASIN®), i nesteroidne inhibitore aromataze kao što su anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) i aminoglutetimid, i drugi inhibitori aromataze uključuju vorozol (RIVISOR®), megestrol acetat (MEGASE®), fadrozol i 4(5)-imidazole; agonisti hormona koji oslobađa lutenizujućeg hormona, uključujući leuprolid (LUPRON® i ELIGARD®), goserelin, buserelin i tripterelin; polni steroidi, uključujući progestine kao što su megestrol acetat i medroksiprogesteron acetat, estrogene kao što su dietilstilbestrol i premarin, i androgene/retinoide kao što su fluoksimesteron, sva transretionska kiselina i fenretinid; onapriston; antiprogesteroni; regulatori receptora estrogena (ERDs); anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid i bikalutamid; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od navedenih; kao i kombinacije dva ili više navedenih.
[0079] Termin „himerno“ antitelo, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca izveden iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
[0080] Termin „klasa“ antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>i IgA<2>. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, δ, ε, γ i μ, respektivno.
[0081] Termini „uslovno aktivno antitelo“ i „uslovno aktivni fragment antitela“, kako se ovde koriste, odnose se na antitelo ili fragment antitela koji je aktivniji pri određenoj vrednosti stanja u tumorskom mikrookruženju u poređenju sa drugačijom vrednošću istog stanja u mikrookruženju bez tumora. U poređenju sa uslovima u mikrookruženju bez tumora, uslovi u mikrookruženju tumora mogu uključivati niži pH, veću koncentraciju laktata i/ili piruvata, hipoksiju, nižu koncentraciju glukoze i nešto višu temperaturu. Na primer, u jednom otelotvorenju, uslovno aktivno antitelo ili fragment antitela može biti praktično neaktivan na normalnoj telesnoj temperaturi, ali aktivan na višoj temperaturi koja se može naći u tumorskom mikrookruženju. U još jednom izvođenju, uslovno aktivno antitelo ili fragment antitela može biti manje aktivan u normalnoj oksigenisanoj krvi nego u manje oksigenisanom okruženju koje može postojati u tumorskom mikrookruženju. Postoje i drugi uslovi u mikrookruženju tumora poznati stručnjaku u ovoj oblasti koji se takođe mogu odabrati za upotrebu kao uslov koji može pokrenuti anti-Axl antitela ili fragmente antitela da imaju različite aktivnosti pri različitim vrednostima tog uslova.
[0082] [0040] Termin „konstitutivni“, kako se ovde koristi, kao na primer primenjen na Axl aktivnost, odnosi se na kontinuiranu signalnu aktivnost receptor kinaze koja ne zavisi od prisustva liganda ili drugih aktivirajućih molekula. U zavisnosti od prirode receptor kinaze, sva aktivnost može biti konstitutivna ili aktivnost receptora može biti dalje aktivirana vezivanjem drugih molekula (npr. liganda). Ćelijski događaji koji dovode do aktivacije receptor kinaze su dobro poznati među stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, aktivacija može uključivati oligomerizaciju, npr. dimerizaciju, trimerizaciju itd., u komplekse receptora višeg reda. Kompleksi mogu obuhvatiti jednu vrstu proteina, tj. homomerni kompleks. Alternativno, kompleksi mogu da sadrže najmanje dve različite vrste proteina, tj. heteromerni kompleks. Formiranje kompleksa može biti uzrokovano, na primer, prekomernom ekspresijom normalnih ili mutantnih oblika receptora na površini ćelije. Formiranje kompleksa može biti uzrokovano i specifičnom mutacijom ili mutacijama u receptoru.
[0083] Termin „citostatički agens“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili kompoziciju koja zaustavlja rast ćelije bilo in vitro ili in vivo. Dakle, citostatički agens može biti onaj koji značajno smanjuje procenat ćelija u S-fazi. Dalji primeri citostatičkih agenasa uključuju agense koji blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa indukovanjem zastoja u G0/G1 ili zastoja u M-fazi. Humanizovano anti-Her2 antitelo trastuzumab (HERCEPTIN®) je primer citostatskog agensa koji indukuje zastoj u G0/G1. Klasični blokatori M-faze uključuju vinkas (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Određeni agensi koji zaustavljaju G1 takođe se prelivaju u zaustavljanje S-faze, na primer, agensi za alkiliranje DNK kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Više informacija možete pronaći u knjizi Mendelson i Izrael, ur., Molekularna osnova raka, poglavlje 1, pod nazivom „Regulacija ćelijskog ciklusa, onkogeni i antineoplastični lekovi“ od Murakamija i dr. (V.B. Sonders, Filadelfija, 1995), npr., str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv raka, oba izvedena iz tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), izveden iz evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču sklapanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.
[0084] Termin „citotoksični agens“, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re186, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante; i razni antitumorski ili antikancerogeni agensi opisani u nastavku.
[0085] Termin „dijatela“, kako se ovde koristi, odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, koji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (V<H>) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (V<L>) u istom polipeptidnom lancu (V<H>-V<L>). Korišćenjem linkera koji je prekratak
[0088] 1
[0089] da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta za vezivanje antigena.
[0090] Termin „efektorske funkcije“, kako se ovde koristi, odnosi se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement zavisnu citotoksičnost (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenje regulacije receptora na površini ćelija (npr. receptora B ćelija); i aktivaciju B ćelija.
[0091] Termin „efikasna količina“ sredstva, kako se ovde koristi, npr. farmaceutska formulacija, odnosi se na količinu efikasnu, u dozama i tokom neophodnih vremenskih perioda, da bi se postigao željeni terapeutski ili profilaktički rezultat.
[0092] Termin „Fc region“, kako se ovde koristi, koristi se za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje Fc regione nativne sekvence i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca ljudskog IgG proteže se od Cys226, ili od Pro230, do karboksil-terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali i ne mora biti prisutan. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa EU sistemom numeracije, takođe nazvanim EU indeks, kako je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Javna zdravstvena služba, Nacionalni instituti za zdravlje, Betezda, Merilend, 1991.
[0093] Termin „okvir“ ili „FR“, kako se ovde koristi, odnosi se na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR ili H1-3 u teškom lancu i L1-3 u lakom lancu). FR varijabilnog domena se generalno sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećem sekvenci u V<H>(ili V<L>): FR1-H1(L1)‐FR2-H2(L2)‐FR3-H3(L3)‐FR4.
[0094] Termin „antitelo pune dužine“, „intaktno antitelo“ ili „celo antitelo“ odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilni region koji vezuje antigen (V<H>ili V<L>), kao i konstantni domen lakog lanca (CL) i konstantne domene teškog lanca, CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni prirodne sekvence (npr. konstantni domeni ljudske prirodne sekvence) ili njihove varijante aminokiselinske sekvence. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela pune dužine mogu se svrstati u različite „klase“. Postoji pet glavnih klasa antitela pune dužine: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti na „podklase“ (izotipove), npr. IgG<1>, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
[0095] [0049] Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“, kako se ovde koriste, koriste se naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarno transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje, bez obzira na broj pasaža. Potomstvo možda nije potpuno identično po sadržaju nukleinskih kiselina matičnoj ćeliji, ali može sadržati mutacije. Mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je skrinirano ili selektovano u originalno transformisanoj ćeliji je ovde uključeno.
[0096] Termin „ljudsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na ono koje poseduje aminokiselinska sekvenca koja odgovara antitelu proizvedenom od strane čoveka ili ljudske ćelije ili izvedenom iz neljudskog izvora koji koristi repertoare ljudskih antitela ili druge sekvence koje kodiraju ljudska antitela. Ova definicija ljudskog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji vezuju antigene koji nisu ljudi.
[0097] Termin „ljudski konsenzusni okvir“, kako se ovde koristi, je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u selekciji sekvenci V<L>ili V<H>okvira ljudskog imunoglobulina. Generalno, selekcija sekvenci V<L>ili V<H>ljudskog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, FifthEdition, NIH Publikacija 91‐3242, Bethesda Md. (1991), vol. 1‐3. U jednom otelotvorenju, za V<L>, podgrupa je podgrupa kapa I kao u Kabat et al., supra. U jednom otelotvorenju, za V<H>, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat et al., supra.
[0098] Termin „humanizovano“ antitelo, kako se ovde koristi, odnosi se na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz neljudskih HVRs i aminokiselinske ostatke iz ljudskih FRs. U određenim izvođenjima, humanizovano antitelo će obuhvatiti suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVRs (npr. CDRs) odgovaraju onima iz neljudskog antitela, a svi ili suštinski svi FRs odgovaraju onima iz ljudskog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz ljudskog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. neljudsko antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.
[0099] Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, prirodna antitela sa četiri lanca sadrže šest HVRs; tri u V<H>(H1, H2, H3) i tri u V<L>(L1, L2, L3). HVRs generalno sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz „regiona koji određuju komplementarnost“ (CDRs), pri čemu ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvence i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji javljaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia i Lesk, J. Mol.Biol., vol.196, pp.901-9171987) Primeri CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35B H1, 50-65 H2 i 95-102 H3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje. Služba javnog zdravlja, Nacionalni instituti za zdravlje, Betezda, Merilend 1991). Sa izuzetkom CDR1 u V<H>, CDRs generalno obuhvataju aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDRs takođe obuhvataju „ostatke koji određuju specifičnost“ ili „SDRs“, što su ostaci koji kontaktiraju antigen. SDRs se nalaze unutar regiona CDRs koji se nazivaju skraćeno CDRs ili α-CDRs. Primeri α-CDR-a (α-CDR-L1, α-CDR-L2, α-CDR-L3, α-CDR-H1, α-CDR-H2 i α-CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35B H1, 50-58 H2 i 95-102 H3. (Vidi Almagro i Franson, Front. Biosci., vol. 13, str. 1619–1633, 2008). Osim ako nije
[0102] 1
[0103] drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabatu i dr., supra.
[0104] Termin „imunokonjugat“, kako se ovde koristi, je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali ne ograničavajući se na citotoksični agens.
[0105] Termin „pojedinac“ ili „subjekat“, kako se ovde koristi, odnosi se na sisara. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i neljudske primate kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim izvođenjima, pojedinac ili subjekt je čovek.
[0106] Termin „inhibicija rasta ili proliferacije ćelija“, kako se ovde koristi, znači smanjenje rasta ili proliferacije ćelije za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100%, i uključuje indukovanje ćelijske smrti.
[0107] Termin „izolovano“ antitelo, kako se ovde koristi, je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim izvođenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografskim (npr. jonskom izmenom ili HPLC sa obrnutom fazom). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, videti, npr., Flatman et al., J. Chromatogr. B, vol. 848, str. 79–87, 2007.
[0108] Termin „izolovana“ nukleinska kiselina, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina obuhvata molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0109] Termin „izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-Axl antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takav(e) molekul(e) nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takav(e) molekul(e) nukleinske kiseline prisutan(e) na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
[0110] Termin „nezavisan od liganda“, kako se ovde koristi, na primer, primenjen na aktivnost signalizacije receptora, odnosi se na aktivnost signalizacije koja ne zavisi od prisustva liganda. Receptor koji ima ligand-nezavisnu kinaznu aktivnost ne mora nužno sprečiti vezivanje liganda za taj receptor da bi se proizvela dodatna aktivacija kinazne aktivnosti.
[0111] Termin „metastaze“, kako se ovde koristi, odnosi se na sve procese koji uključuju Axl i koji podržavaju ćelije raka da se rasprše iz primarnog tumora, prodru u limfne i/ili krvne sudove, cirkulišu kroz krvotok i rastu u udaljenom fokusu (metastaze) u normalnim tkivima drugde u telu. Konkretno, odnosi se na ćelijske događaje tumorskih ćelija kao što su proliferacija, migracija, nezavisnost od sidrenja, izbegavanje apoptoze ili lučenje angiogenih faktora, koji su u osnovi metastaza i stimulisani su ili posredovani nekatalitičkim ili katalitičkim aktivnostima Axl-a, poželjno uključujući Axl fosforilaciju i/ili Axl-posredovanu signalnu transdukciju.
[0114] 1
[0115] Termin „mikrookruženje“, kako se ovde koristi, označava bilo koji deo ili region tkiva ili tela koji ima stalne ili vremenske, fizičke ili hemijske razlike od drugih regiona tkiva ili regiona tela. Za tumore, termin „mikrookruženje tumora“, kako se ovde koristi, odnosi se na okruženje u kojem tumor postoji, što je nećelijsko područje unutar tumora i područje direktno izvan tumorskog tkiva, ali se ne odnosi na intracelularni odeljak same ćelije raka. Tumor i mikrookruženje tumora su usko povezani i stalno interaguju. Tumor može da promeni svoje mikrookruženje, a mikrookruženje može uticati na to kako tumor raste i širi se. Tipično, mikrookruženje tumora ima nizak pH u opsegu od 5.8 do 7.0, češće u opsegu od 6.2 do 6.8, najčešće u opsegu od 6.4-6.8. S druge strane, normalan fiziološki pH je tipično u opsegu od 7.2-7.8. Takođe je poznato da tumorsko mikrookruženje ima nižu koncentraciju glukoze i drugih hranljivih materija, ali veću koncentraciju mlečne kiseline, u poređenju sa krvnom plazmom. Štaviše, tumorsko mikrookruženje može imati temperaturu koja je 0.3 do 1 °C viša od normalne fiziološke temperature. Tumorsko mikrookruženje je razmatrano u Gillies et al., "MRI of the Tumor Microenvironment," Journal of Magnetic Resonance Imaging, vol. 16, pp. 430‐450, 2002. Termin „netumorsko mikrookruženje“ odnosi se na mikrookruženje na mestu koje nije tumor.
[0116] Termin „monoklonalno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, osim mogućih varijantnih antitela, npr. koja sadrže prirodno nastale mutacije ili nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, pri čemu su takve varijante generalno prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonalnih antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo u preparatu monoklonalnih antitela usmereno je protiv jedne determinante na antigenu. Dakle, modifikator „monoklonalno“ ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hibridomsku metodu, metode rekombinantne DNK, metode fagnog prikaza i metode koje koriste transgene životinje koje sadrže sve ili deo lokusa ljudskih imunoglobulina, a takve metode i druge primerne metode za pravljenje monoklonalnih antitela opisane su ovde.
[0117] Termin „golo antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radioaktivnom oznakom. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0118] Termin „nativna antitela“, kako se ovde koristi, odnosi se na prirodno prisutne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150,000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koja su disulfidnim vezama. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (V<H>), koji se naziva i varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, nakon čega slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (V<L>), koji se naziva i varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, nakon čega sledi konstantni
[0121] 1
[0122] laki (C<L>) domen. Laki lanac antitela može se dodeliti jednom od dva tipa, nazvanim kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njegovog konstantnog domena.
[0123] Termin „uputstvo za upotrebu“, kako se ovde koristi, odnosi se na uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
[0124] Termin „procenat (%) identiteta aminokiselinskih sekvenci“ u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu, kako se ovde koristi, definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identiteta aminokiselinskih sekvenci može se postići na različite načine koji su u okviru stručnosti u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST‐2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju. Međutim, za potrebe ovog teksta, vrednosti % identiteta aminokiselinskih sekvenci generišu se pomoću programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Autor programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 je Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u Kancelariji za autorska prava SAD, Vašington, D.C., 20559, gde je registrovan pod brojem registracije autorskih prava u SAD TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od strane Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može kompajlirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba kompajlirati za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci podešava program ALIGN-2 i ne menjaju se.
[0125] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje aminokiselinskih sekvenci, % identiteta aminokiselinskih sekvenci date aminokiselinskih sekvenci A u odnosu na, sa ili protiv date aminokiselinskih sekvenci B (što se alternativno može formulisati kao data aminokiselinski sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identiteta aminokiselinskih sekvenci u odnosu na, sa ili protiv date aminokiselinskih sekvenci B) izračunava se na sledeći način:
[0128]
[0130] gde je X broj aminokiselinskih ostataka koje je program za poravnanje sekvenci ALIGN-2 ocenio kao identične u poravnanju A i B tog programa, a gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba razumeti da tamo gde dužina aminokiselinskih sekvenci A nije jednaka dužini aminokiselinskih sekvenci B, % identiteta aminokiselinskih sekvenci A i B neće biti jednak % identiteta aminokiselinskih sekvenci B i A. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve vrednosti % identiteta aminokiselinskih sekvenci koje se ovde koriste dobijaju se kao što je opisano u neposredno prethodnom pasusu korišćenjem računarskog programa ALIGN-2.
[0133] 1
[0134] Termin „farmaceutska formulacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude efikasna i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta kome bi formulacija bila primenjena.
[0135] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, odnosi se na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za subjekta. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijent, stabilizator ili konzervans.
[0136] Termini „prečišćen“ i „izolovan“ koji se ovde koriste odnose se na antitelo prema pronalasku ili na nukleotidnu sekvencu, gde je naznačeni molekul prisutan u suštinskom odsustvu drugih bioloških makromolekula istog tipa. Termin „prečišćeno“, kako se ovde koristi, poželjno znači da je prisutno najmanje 75% težine, poželjnije najmanje 85% težine, još poželjnije najmanje 95% težine, a najpoželjnije najmanje 98% težine bioloških makromolekula istog tipa. „Izolovani“ molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je u suštini slobodan od drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju polipeptid; međutim, molekul može da sadrži neke dodatne baze ili delove koji ne utiču štetno na osnovne karakteristike sastava.
[0137] Termin „rekombinantno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo (npr. himerno, humanizovano ili ljudsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) koje ekspresuje rekombinantna ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Primeri „ćelija domaćina“ za proizvodnju rekombinantnih antitela uključuju: (1) ćelije sisara, na primer, jajnik kineskog hrčka (CHO), COS, ćelije mijeloma (uključujući Y0 i NS0 ćelije), bubreg mladunčeta hrčka (BHK), Hela i Vero ćelije; (2) ćelije insekata, na primer, sf9, sf21 i Tn5; (3) biljne ćelije, na primer biljke koje pripadaju rodu Nicotiana (npr. Nicotiana tabacum); (4) ćelije kvasca, na primer, one koje pripadaju rodu Saccharomyces (npr. Saccharomyces cerevisiae) ili rodu Aspergillus (npr. Aspergillus niger); (5) bakterijske ćelije, na primer ćelije Escherichia coli ili ćelije Bacillus subtilis, itd.
[0138] Termin „terapeutski efikasna količina“ antitela ili fragmenta antitela ovog pronalaska označava dovoljnu količinu antitela ili fragmenta antitela za lečenje bolesti, uz razuman odnos koristi i rizika koji se primenjuje na bilo koji medicinski tretman. Međutim, biće shvaćeno da će ukupnu dnevnu upotrebu antitela ili fragmenata antitela i kompozicija ovog pronalaska odrediti medicinskom procenom, lekar koji leči pacijenta u okviru zdravog razuma. Specifični terapeutski efikasan nivo doze za svakog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i težinu poremećaja; aktivnost specifičnog antitela ili fragmenta antitela koji se koristi; specifičan sastav koji se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, način primene i brzinu izlučivanja specifičnog antitela ili fragmenta antitela koji se koristi; trajanje lečenja; lekove koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim antitelom koje se koristi; i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci. Na primer, dobro je poznato stručnjacima u ovoj oblasti da se započnu doze jedinjenja na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje željenog terapeutskog efekta i da se doza postepeno povećava dok se ne postigne željeni efekat.
[0141] 1
[0142] Termin „jednolančani Fv“ („scFv“) kako se ovde koristi je kovalentno povezani V<H>::V<L>heterodimer koji se obično ekspresuje iz fuzije gena koja uključuje V<H>i V<L>kodirajuće gene povezane linkerom koji kodira peptid. „dsFv“ je V<H>::V<L>heterodimer stabilizovan disulfidnom vezom. Dvovalentni i multivalentni fragmenti antitela mogu se formirati spontano povezivanjem monovalentnih scFvs, ili mogu biti generisani spajanjem monovalentnih scFvs pomoću peptidnog linkera, kao što je dvovalentni sc(Fv)2.
[0143] Termin „tretman“, „lečiti“ ili „lečenje“, kako se ovde koristi, odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se izvoditi ili za profilaksu ili tokom toka kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovne pojave bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kojih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje brzine progresije bolesti, poboljšanje ili palijaciju bolesnog stanja i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti antitela ovog pronalaska se koriste za odlaganje razvoja bolesti ili za usporavanje progresije bolesti.
[0144] Termin „tumor“, kako se ovde koristi, odnosi se na sav rast i proliferaciju neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i sve prekancerozne i kancerogene ćelije i tkiva. Termini „rak“, „kancerozan“, „poremećaj proliferacije ćelija“, „proliferativni poremećaj“ i „tumor“ se međusobno ne isključuju kako se ovde navodi.
[0145] Termin „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (V<H>i V<L>, respektivno) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri konzervisana okvirna regiona (FRs) i tri hipervarijabilna regiona (HVRs). (Vidi, npr., Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izdanje, W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007).) Jedan V<H>ili V<L>domen može biti dovoljan da pruži specifičnost vezivanja antigena. Štaviše, antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za određeni antigen mogu se izolovati korišćenjem V<H>ili V<L>domena iz antitela koje se vezuje za antigen kako bi se skrinirala biblioteka komplementarnih V<L>ili V<H>domena, respektivno. Videti, npr., Portolano et al., J. Immunol., vol. 150, str. 880–887, 1993; Clarkson et al., Nature, vol.352, str.624–628, 1991.
[0146] Termin „vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban za razmnožavanje druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Termin uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „ekspresioni vektori“.
[0148] DETALjAN OPIS
[0150] Mora se napomenuti da, kako se ovde koristi, jednina „jedan“, „neki“ i „taj/ta/to“ uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Štaviše, termini „jedan“ (ili „neki“), „jedan ili
[0153] 2
[0154] više“ i „najmanje jedan“ mogu se ovde koristiti naizmenično. Termini „koji obuhvata“, „uključujući“, „koji ima“ i „konstruisan od“ takođe se mogu koristiti naizmenično.
[0155] Osim ako nije drugačije naznačeno, svi brojevi koji izražavaju količine sastojaka, svojstva kao što su molekulska težina, procenat, odnos, uslovi reakcije i tako dalje, a koji se koriste u specifikaciji, treba shvatiti kao da su u svim slučajevima modifikovani terminom „oko“, bez obzira na to da li je termin „oko“ prisutan ili ne. Shodno tome, osim ako nije drugačije naznačeno, numerički parametri navedeni u specifikaciji su aproksimacije koje mogu varirati u zavisnosti od željenih svojstava koja se žele postići ovim otkrićem. Najmanje, svaki numerički parametar treba barem tumačiti u svetlu broja prijavljenih značajnih cifara i primenom uobičajenih tehnika zaokruživanja. Uprkos tome što su numerički opsezi i parametri koji određuju širok obim otkrića aproksimacije, numeričke vrednosti navedene u specifičnim primerima su prijavljene što je preciznije moguće. Međutim, svaka numerička vrednost inherentno sadrži određene greške koje nužno proizilaze iz standardne devijacije pronađene u njihovim odgovarajućim merenjima testiranja.
[0156] Treba razumeti da svaka komponenta, jedinjenje, supstituent ili parametar otkriveni ovde treba da se tumači kao otkriveni za upotrebu sami ili u kombinaciji sa jednom ili više od svake druge komponente, jedinjenja, supstituenta ili parametra otkrivenih ovde.
[0157] Takođe treba razumeti da svaka količina/vrednost ili raspon količina/vrednosti za svaku komponentu, jedinjenje, supstituent ili parametar otkriven ovde treba da se tumači kao da je takođe otkriven u kombinaciji sa svakom količinom/vrednošću ili rasponom količina/vrednosti otkrivenih za bilo koju drugu komponentu(e), jedinjenje(a), supstituent(e) ili parametar(i) otkriveni ovde i da je bilo koja kombinacija količina/vrednosti ili opsega količina/vrednosti za dve ili više komponente(a), jedinjenja(a), supstituenta(a) ili parametara otkrivenih ovde takođe otkrivena u kombinaciji jedni sa drugima za potrebe ovog opisa.
[0158] Dalje se razume da svaka donja granica svakog opsega otkrivenog ovde treba tumačiti kao otkrivenu u kombinaciji sa svakom gornjom granicom svakog opsega otkrivenog ovde za istu komponentu, jedinjenja, supstituent ili parametar. Stoga, otkrivanje dva opsega treba tumačiti kao otkrivanje četiri opsega izvedena kombinovanjem svake donje granice svakog opsega sa svakom gornjom granicom svakog opsega. Otkrivanje tri opsega treba tumačiti kao otkrivanje devet opsega izvedenih kombinovanjem svake donje granice svakog opsega sa svakom gornjom granicom svakog opsega, itd. Štaviše, specifične količine/vrednosti komponente, jedinjenja, supstituenta ili parametra otkrivene u opisu ili primeru treba tumačiti kao otkrivanje ili donje ili gornje granice opsega i stoga se mogu kombinovati sa bilo kojom drugom donjom ili gornjom granicom opsega ili specifičnom količinom/vrednošću za istu komponentu, jedinjenje, supstituent ili parametar otkrivenim na drugom mestu u prijavi da bi se formirao opseg za tu komponentu, jedinjenje, supstituent ili parametar.
[0160] A. Regioni anti-Axl antitela ili fragmenata antitela
[0161] U jednom aspektu, ovaj pronalazak pruža antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za ljudski Axl protein. Antitelo ili fragment antitela sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje tri regiona koji određuju komplementarnost: H1, H2 i H3 sekvence, i varijabilni region lakog lanca koji uključuje tri regiona koji određuju komplementarnost: L1, L2 i L3, gde je
[0162] varijabilni region teškog lanca kodiran DNK sekvencom odabranom iz sekvenci SEQ ID NOS: 11-13, i
[0163] varijabilni region lakog lanca kodiran je DNK sekvencom odabranom iz SEQ ID NOS: 7-10.
[0164] Poravnanje varijabilnih regiona teškog lanca prikazano je na slici 1A, gde su regioni koji određuju komplementarnost: H1, H2 i H3 uokvireni.
[0165] Poravnanje varijabilnih regiona lakog lanca prikazano je na slici 1B, gde su regioni koji određuju komplementarnost: L1, L2 i L3 uokvireni.
[0166] Izolovani polipeptidi varijabilnog regiona teškog lanca i izolovani polipeptidi varijabilnog regiona lakog lanca identifikovani su iz matičnog antitela korišćenjem metode objavljene u američkom patentu br. 8,709,755. Varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca matičnog antitela (063-hum10F10) su takođe poravnati na slikama 1A-1B kako bi se pokazale mutacije u izolovanim polipeptidima varijabilnog regiona teškog lanca i izolovanim polipeptidima varijabilnog regiona lakog lanca.
[0167] DNK koja kodira antitelo divljeg tipa evoluirala je da bi se generisala biblioteka mutantnih antitela korišćenjem Sveobuhvatne pozicione evolucije (CPE), gde je svaka pozicija u šablonskom antitelu randomizovana jedna po jedna. Svako mutantno antitelo u biblioteci ima samo jednu tačkastu mutaciju. Mutantna antitela u biblioteci su generisana istovremenim skriningom za selektivni afinitet vezivanja za Axl pri pH 6.0 iznad pH 7.4 pomoću ELISA. Korišćena su dva razblaženja mutantnih antitela: razblaženja 1:3 i 1:9. Mutantna antitela koja imaju odnos afiniteta vezivanja od najmanje 1.5 pri pH 6.0 prema pH 7.4 pri razblaženju 1:3 ili 1:9 su odabrana kao uslovno aktivna antitela, sa mutacijama u jednoj tački naznačenim u svakom od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (Tabele 1 i 2).
[0168] Tabela 1: Uslovno aktivni varijabilni regioni teškog lanca anti-Axl antitela
[0171]
[0172] nasava
[0174]
[0176] Tabela 2: Uslovno aktivni varijabilni regioni lakog lanca anti-Axl antitela
[0177]
[0180] 2
[0181]
[0184] U drugom aspektu korisnom za razumevanje pronalaska, varijabilni regioni teškog lanca su prikazani na Slici 1A, a varijabilni regioni lakog lanca su prikazani na Slici 1B. Neki varijabilni regioni teškog lanca su kodirani DNK sekvencama sa SEQ ID NOS: 11-13. Neki varijabilni regioni lakog lanca su kodirani DNK sekvencama sa SEQ ID NOS: 7-10. Ovi varijabilni regioni teškog i lakog lanca mogu se specifično vezati za Axl. Utvrđeno je da antitela koja sadrže jedan od ovih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imaju veći afinitet vezivanja za Axl pri pH vrednosti koja se nalazi u tumorskom mikrookruženju nego pri pH vrednosti u mikrookruženju koje nije tumorsko.
[0185] U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, ovaj pronalazak takođe uključuje varijante varijabilnih regiona teškog i lakog lanca predstavljenih na Slikama 1A-1B i kodiranih DNK sekvencama sa SEQ ID NOS: 9-13 koje se mogu specifično vezati za Axl. Da bi se izvele ove varijante, utvrđeno je da regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) varijabilnih regiona teškog lanca (H1-H3) i CDRs varijabilnih regiona lakog lanca (L1-L3) treba da ostanu netaknuti.
[0186] Prilikom izvođenja ovih varijanti, vodi se postupkom opisanim ovde. Varijante ovih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela ili fragmenta antitela. Bilo koja kombinacija delecije(a), insercije(a) i supstitucije(a) može se napraviti da bi se dobila konačna konstrukcija, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje barem jednu od željenih karakteristika, npr. vezivanje antigena.
[0188] Varijante supstitucije, insercije i delecije
[0190] Date su varijante antitela ili fragmenata antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDRs i okvirne regione (FRs). Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 3 pod naslovom „konzervativne supstitucije“. Suštinskije promene su date u Tabeli 3 pod naslovom „primerne supstitucije“, i kao što je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu se uvesti u antitelo ili fragment antitela od interesa, a proizvodi se mogu skrinirati na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena ili smanjena imunogenost.
[0191] Tabela 3: Supstitucije aminokiselina
[0194]
[0197] Aminokiseline se mogu grupisati prema zajedničkim svojstvima bočnih lanaca:
[0198] (1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
[0199] (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
[0200] (3) kisele: Asp, Glu;
[0201] (4) bazne: His, Lys, Arg;
[0202] (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
[0203] (6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
[0204] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0205] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili ljudskog antitela). Generalno,
[0208] 2
[0209] rezultujuća varijanta(e) odabrana(e) za dalja istraživanja imaće modifikacije (npr. poboljšanja) određenih bioloških svojstava (npr. povećan afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će u suštini zadržati određena biološka svojstva matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je antitelo sa afinitetom, koje se može pogodno generisati, npr., korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja zasnovanih na fagnom prikazu, kao što su one opisane ovde. Ukratko, jedan ili više CDR ostataka su mutirani i varijanta antitela se prikazuje na fagu i skrinira na određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
[0210] Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u CDRs, npr. da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu se napraviti u CDR „vrućim tačkama“, tj. ostacima kodiranim kodonima koji podležu mutacijama sa visokom frekvencijom tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol., vol. 207, str. 179‐196, 2008), i/ili SDRs (a-CDRs), pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr., kod Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology, vol.178, str.1‐37, 2001). U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje sazrevanja afiniteta, raznolikost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje bilo kojom od različitih metoda (npr. PCR sklona greškama, mešanje lanca ili mutageneza usmerena oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim skrinira da bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Druga metoda za uvođenje raznolikosti uključuje pristupe usmerene na CDR, u kojima se nekoliko CDR ostataka (npr.4-6 ostataka istovremeno) randomizuje. CDR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu se specifično identifikovati, npr. korišćenjem mutageneze ili modeliranja skeniranjem alanina. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
[0211] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, supstitucije, insercije ili delecije mogu se desiti unutar jednog ili više HVRs, sve dok takve promene značajno ne smanjuju sposobnost antitela ili fragmenta antitela da se veže za antigen. Na primer, konzervativne promene (npr. konzervativne supstitucije kao što je ovde dato) koje značajno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu se napraviti u CDRs. Takve promene mogu biti van „vrućih tačaka“ ili SDRs CDRs. U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, od varijanti V<H>i V<L>sekvenci koje su gore date, svaki CDR je ili nepromenjen ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
[0212] Koristan metod za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“, kako su opisali Kaningem i Vels, Science, vol. 244, str.
[0213] 1081–1085, 1989. U ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) kako bi se utvrdilo da li je interakcija antitela ili fragmenta antitela sa antigenom pogođena. Dalje supstitucije mogu se uvesti na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristal struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela ili fragmenta antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante mogu biti skrinirane da bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0216] 2
[0217] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencne insercije jedne ili više aminokiselinske sekvence. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge insercijske varijante antitela uključuju fuziju sa N- ili C-terminalom antitela na enzim (npr. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava serumski poluživot antitela.
[0218] Razmatraju se modifikacije aminokiselinske sekvence antitela opisanih ovde. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Poznato je da kada se humanizovano antitelo proizvodi jednostavnim kalemljenjem samo CDRs VH i VL antitela izvedenog iz neljudske životinje u FRs V<H>i V<L>ljudskog antitela, aktivnost vezivanja antigena je smanjena u poređenju sa aktivnošću vezivanja antigena originalnog antitela izvedenog iz neljudske životinje. Smatra se da je nekoliko aminokiselinskih ostataka VH i VL neljudskog antitela, ne samo u CDRs već i u FRs, direktno ili indirektno povezano sa aktivnošću vezivanja antigena. Stoga, supstitucija ovih aminokiselinskih ostataka različitim aminokiselinskim ostacima izvedenim iz FRs VH i VL ljudskog antitela smanjila bi aktivnost vezivanja. Da bi se rešio problem, kod antitela kalemljenih sa ljudskim CDRs, moraju se pokušati identifikovati, među aminokiselinskim sekvencama FR VH i VL ljudskih antitela, aminokiselinski ostatak koji je direktno povezan sa vezivanjem za antitelo, ili koji interaguje sa aminokiselinskim ostatkom CDR, ili koji održava trodimenzionalnu strukturu antitela i koji je direktno povezan sa vezivanjem za antigen. Smanjena aktivnost vezivanja antigena mogla bi se povećati zamenom identifikovanih aminokiselina ostacima aminokiselina originalnog antitela izvedenog iz životinje koja nije čovek.
[0219] Prilikom izmena u amino sekvencama, može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Značaj hidropatskog indeksa aminokiselina u davanju interaktivne biološke funkcije proteinu je generalno shvaćen u struci. Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi rezultujućeg proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, antitelima, antigenima i slično. Svakoj aminokiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njihove hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja, a to su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (‐3.5); aspartat (‐3.5); asparagin (‐3.5); lizin (‐3.9); i arginin (‐4.5).
[0220] Dve aminokiselinske sekvence su „suštinski homologne“ ili „suštinski slične“ kada je više od 80%, poželjno više od 85%, poželjno više od 90% aminokiselina identično, ili je više od oko 90%, poželjno više od 95%, slično (funkcionalno identično) duž cele dužine kraće sekvence. Poželjno je da se slične ili homologne sekvence identifikuju poravnanjem koristeći, na primer, GCG (Genetics ComputerGroup, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.) program za naslagivanje ili bilo koji od algoritama za poređenje sekvenci kao što su BLAST, FASTA, itd.
[0221] Poznato je u struci da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili rezultat, a da se i dalje dobije protein sa sličnom biološkom aktivnošću, tj. i dalje se dobija biološki funkcionalno ekvivalentan protein.
[0224] 2
[0225] Kao što je gore navedeno, supstitucije aminokiselina se generalno zasnivaju na relativnoj sličnosti supstituenata bočnih lanaca aminokiselina, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično. Primeri supstitucija koje uzimaju u obzir različite od gore navedenih karakteristika dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin.
[0226] Varijante Fc regiona
[0227] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u Fc region antitela, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu ljudskog Fc regiona (npr. Fc region ljudskog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koja sadrži modifikaciju aminokiselina (npr. supstituciju) na jednoj ili više pozicija aminokiselina.
[0228] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, varijanta antitela može posedovati neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluživot antitela in vivo važan, ali su određene efektorske funkcije (kao što je ADCC) nepotrebne ili štetne. Mogu se sprovesti in vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti kako bi se potvrdilo smanjenje/smanjenje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, mogu se sprovesti testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) kako bi se osiguralo da antitelo nema vezivanje za FcγR (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC-a, NK ćelije, ekspresuju samo FcγRIII, dok monociti ekspresuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 5 na stranici 464 od Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol., vol. 9, str. 457-492, 1991. Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u američkom patentu br. 5,500,362 (videti takođe, npr. Hellstrom et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, vol. 83, str. 7059-7063, 1986) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, vol. 82, str. 1499-1502, 1985; američkom patentu br. 5,821,337 (videti takođe Bruggemann et al., J. Exp. Med., vol.166, str.1351-1361, 1987). Alternativno, mogu se koristiti metode neradioaktivnih analiza (videti, na primer, ACTITM test neradioaktivne citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, Kalifornija; i CytoTox 96® test neradioaktivne citotoksičnosti (Promega, Medison, Viskonsin). Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodnih ubica (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, vol. 95, str. 652–656, 1998. Testovi vezivanja C1q mogu se takođe sprovesti da bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da se veže za C1q i stoga nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, vol. 202, pp. 163‐171, 1996; Cragg, M. S. et al., Blood, vol. 101, pp. 1045‐1052, 2003; i Cragg, M. S, i M. J. Glennie, Blood, vol. 103, pp. 2738‐2743, 2004). Vezivanje FcRn i određivanje klirensa/poluživota in vivo takođe se mogu izvršiti korišćenjem metoda poznatih u struci (videti, npr., Petkova, S. B. et al., Int’l. Immunol., vol.18, pp.1759‐1769, 2006).
[0231] 2
[0232] Antitela sa smanjenim efektorske funkcije uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (američki patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (američki patent br.7,332,581).
[0233] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr., američki patent br. 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields et al., J. Biol. Chem., tom 9, str. 6591-6604, 2001).
[0234] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
[0235] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, u Fc regionu se vrše izmene koje rezultiraju izmenjenim (tj. poboljšanim ili smanjenim) vezivanjem C1q i/ili citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), npr. kao što je opisano u američkom patentu br. 6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al. J. Immunol., vol.164, str.4178–4184, 2000.
[0236] Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgGs na fetus (Guyer et al., J. Immunol., vol. 117, str. 587–593, 1976 i Kim et al., J. Immunol., vol.24, str.249, 1994), opisana su u US2005/0014934. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (američki patent br. 7,371,826). Videti takođe Duncan & Winter, Nature, vol.322, str.738-740, 1988; američki patent br.5,648,260; američki patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se odnosi na druge primere varijanti Fc regiona.
[0237] Varijante antitela konstruisanih cisteinom
[0238] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, može biti poželjno kreirati antitela konstruisana cisteinom, npr. „tioMAb“, u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani ostacima cisteina. Konkretno, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se time pozicioniraju na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi linkera-leka, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je dalje opisano ovde. Bilo koji jedan ili više sledećih ostataka mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabat numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i 5400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela konstruisana cisteinom mogu se generisati kao što je opisano, npr., u američkom patentu br.7,521,541.
[0239] Derivati antitela
[0240] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, antitelo ili fragment antitela može se dalje modifikovati tako da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u struci i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela ili fragmenta antitela uključuju, ali nisu ograničeni
[0243] 2
[0244] na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli‐1,3-dioksolan, poli‐1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliaminokiseline (bilo homopolimere ili slučajne kopolimere) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere propilpropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo ili fragment antitela može varirati, a ako je vezano više od jednog polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na, posebna svojstva ili funkcije antitela ili fragmenta antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat koristiti u terapiji pod definisanim uslovima itd.
[0245] U drugom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, obezbeđeni su konjugati antitela ili fragmenta antitela i neproteinskog dela koji se mogu selektivno zagrejati izlaganjem zračenju. U jednom izvođenju, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.102, pp.
[0246] 11600‐11605, 2005). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničeno na, talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj ćelije proksimalno od neproteinskog dela antitela bivaju ubijene.
[0247] U drugom aspektu, ovaj pronalazak pruža anti-Axl antitelo ili fragment antitela koji uključuje izolovane polipeptide varijabilnog regiona teškog lanca ili izolovane polipeptide varijabilnog regiona lakog lanca. Izolovani polipeptidi varijabilnog regiona teškog lanca obuhvataju H1, H2 i H3 regione sa SEQ ID NOS: 1-3 respektivno. Izolovani polipeptidi varijabilnog regiona lakog lanca obuhvataju L1, L2 i L3 regione sa SEQ ID NOS: 4-6 respektivno.
[0248] Antitelo ili fragment antitela protiv Axl izuma ima veći afinitet vezivanja za Axl pod uslovima u tumorskom mikrookruženju nego pod uslovima u netumorskom mikrookruženju. U jednom izvođenju, uslovi u tumorskom mikrookruženju i uslovi u netumorskom mikrookruženju su oba pH. Antitela ili fragmenti antitela protiv Axl izuma stoga se mogu selektivno vezati za Axl pri pH od oko 5-6.8, ali će imati niži afinitet vezivanja za Axl pri pH od 7.2-7.8 koji se sreće u normalnom fiziološkom okruženju. Kao što je prikazano u primerima 3-4, antitela ili fragmenti antitela protiv Axl imaju veći afinitet vezivanja pri pH 6.0 nego pri pH 7.4.
[0249] [0117] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitela ili fragmenti antitela imaju konstantu disocijacije (Kd) sa Axl pod uslovima u mikrookruženju tumora od oko ≦1 μM, ≦100 nM, ≦10 nM, ≦1 nM, ≦0,1 nM, ≦0,01 nM ili ≦0,001 nM (npr.10<‐8>M ili manje, ili od 10<‐8>M do 10<‐13>M, ili od 10<‐9>M do 10<‐13>M). U jednom otelotvorenju, odnos Kd antitela ili fragmenta antitela sa Axl pri vrednosti u tumorskom mikrookruženju i Kd pri drugoj vrednosti u istom stanju u netumorskom mikrookruženju je najmanje oko 1,5:1, najmanje oko 2:1, najmanje oko 3:1, najmanje oko 4:1, najmanje oko 5:1, najmanje oko 6:1, najmanje oko 7:1, najmanje oko 8:1, najmanje oko 9:1, najmanje oko 10:1, najmanje oko 20:1, najmanje oko 30:1, najmanje oko 50:1, najmanje oko 70:1 ili najmanje oko 100:1.
[0250] U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, Kd se meri radioaktivno obeleženim testom vezivanja antigena (RIA) koji se izvodi sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovim antigenom korišćenjem sledećeg testa. Afinitet vezivanja Fabs u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pločom obloženom anti-Fab antitelom (videti, npr., Chen et al., J. Mol. Biol.293:865‐881
[0251] (1999)). Da bi se utvrdili uslovi za analizu, MICROTITER® višestruke ploče (Thermo Scientific) se preko noći premažu sa 5 μg/ml antitela za hvatanje protiv Fab (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9.6), a zatim blokiraju sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23 °C). U neadsorbentnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se meša sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da se nastavi duže (npr. oko 65 sati) kako bi se osiguralo da se postigne ravnoteža. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja i ploča se ispira osam puta sa 0.1% polisorbata 20 (TWEEN‐20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl/baneru scintilanta (MICROSCINT‐20™; Packard), a ploče se broje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja biraju se za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
[0252] Prema drugom izvo]enju korisnom za razumevanje pronalaska, Kd se meri korišćenjem testova površinske plazmonske rezonancije koristeći BIACORE®‐2000 ili BIACORE®‐3000 (BIACORE, Inc., Piscataway, N.J.) na 25°C sa imobilizovanim antigenskim CM5 čipovima na oko 10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)‐karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10 mM natrijum acetata, pH 4.8, do 5 μg/ml (~0.2 μM) pre ubrizgavanja brzinom protoka od 5 μl/minut da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spregnutog proteina. Nakon injekcije antigena, ubrizgava se 1 M etanolamin da bi se blokirale nereagovane grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0.05% polisorbat 20 (TWEEN‐20™) surfaktantnom aktivnom supstancom (PBST) na 25°C, brzinom protoka od približno 25 μl/min. Brzine asocijacije (k<on>) i brzine disocijacije (k<off>) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir-ovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) istovremenim uklapanjem senzograma asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnotežne disocijacije (Kd) izračunava se kao odnos k<off>/k<on>Videti, npr., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865‐881 (1999). Ako brzina reakcije prelazi 10<6>M<‐1>s<‐1>gore navedenim testom površinske plazmonske rezonancije, onda se brzina može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije
[0255] 1
[0256] fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg od 16 nm) na 25°C 20 nM antiantigenskog antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena mereno u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-AMINCO™ serije 8000 (ThermoSpectronic) sa kivetom za mešanje.
[0257] Anti-Axl antitela mogu biti himerna, humanizovana ili ljudska antitela. U jednom otelotvorenju, koristi se fragment anti-Axl antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, dijatelo, tritelo, tetratelo ili F(ab’)<2>fragment i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. U drugom izvođenju, antitelo je antitelo pune dužine, npr. intaktno IgG antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al. Nat. Med, vol. 9, str. 129-134, 2003. Za pregled scFv fragmenata, videti, npr. Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rozenburg i Mur ur., (Springer-Verlag, Njujork), str.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i američke patente br. 5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab’)<2>fragmentima koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuju za receptore za spasavanje i imaju produženo vreme poluraspada in vivo, videti američki patent br.5,869,046.
[0258] Dijatela pronalaska mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, vol. 90, str.6444–6448, 1993 za primere dijatela. Primeri trijatela i tetratela su takođe opisani u Hudson et al., Nat. Med, vol.9, str.129–134, 2003.
[0259] Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju od strane rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
[0260] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitela mogu biti himerna antitela. Određena himerna antitela su opisana, npr., u U.S.P. No. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, vol. 81, str. 6851–6855, 1984). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži neljudski varijabilni region (npr. varijabilni region izveden iz miša, pacova, hrčka, zeca ili neljudskog primata, kao što je majmun) i ljudski konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo sa „promenjenom klasom“ u kome je klasa ili podklasa antitela promenjena u odnosu na klasu ili podklasu matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji vezuju antigen.
[0261] U određenim iyvo]enjima korisnim za razumevanje pronalaska, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, takvo neljudsko antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta matičnog neljudskog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su CDRs (ili njihovi delovi) izvedeni iz neljudskog antitela, a FRs (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci ljudskih antitela. Humanizovano antitelo može opciono takođe da sadrži barem deo ljudskog konstantnog regiona. Neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz neljudskog antitela (npr. antitela iz kog su izvedeni CDR ostaci), npr. da bi se obnovila ili poboljšala specifičnost ili afinitet antitela.
[0264] 2
[0265] Humanizovana antitela i metode njihovog pravljenja su pregledani, npr., u Almagro i Fransson, Front.Biosci., [0126] Humanizovana antitela i metode njihovog pravljenja su pregledane, npr., u Almagro i Fransson, Front.Biosci., vol.13, str. 1619-1633, 2008, i dalje su opisane, npr., u Riechmann et al., Nature, vol. 332, str.323-329, 1988; Queen et al., Proc. Nat’lAcad.Sci. USA, vol.86, str.10029-10033, 1989; U.S.Pat. Nos.5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods, vol.
[0266] 36, str.25–34, 2005 (opisuje kalemljenje SDR (a-CDR); Padlan, Mol. Immunol., vol.28, str.489–498, 1991 (opisuje „resurfejsing“); Dall’Acqua et al., Methods, vol. 36, str. 43–60, 2005 (opisuje „FR shuffling“); i Osbourn et al., Methods, vol. 36, str. 61–68, 2005 i Klimka et al., Br. J. Cancer, vol. 83, str. 252–260, 2000 (opisuje pristup „vođene selekcije“ za FR shuffling).
[0267] Ljudski okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane korišćenjem metode „najboljeg poklapanja“ (videti, npr., Sims et al. J. Immunol., vol.151, str.2296, 1993); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence ljudskih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.89, str.4285, 1992; i Presta et al. J. Immunol., vol.151, str.2623, 1993); okvirne regione zrele ljudske (somatski mutirane) strukture ili okvirne regione ljudske germinativne linije (videti, npr., Almagro i Fransson, Front. Biosci., vol. 13, str. 1619‐1633, 2008); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca et al., J. Biol. Chem., vol. 272, pp. 10678‐10684, 1997 i Rosok et al., J. Biol. Chem., vol.271, pp.22611‐22618, 1996).
[0268] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitela su multispecifična, npr. bispecifična antitela. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. Jedna od specifičnosti vezivanja je za Axl, a druga je za drugi antigen. Bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa Axl. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje ekspresuju Axl. Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela.
[0269] Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva para teškog i lakog lanca imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (videti Milštajn i Kuelo, Nature, vol.305, str.537–540, 1983), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J. vol.
[0270] 10, pp. 3655–3659, 1991), i inženjering „dugme u rupi“ (videti, npr., američki patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu se takođe napraviti inženjeringom efekata elektrostatičkog upravljanja za stvaranje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanjem dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., američki patent br.4,676,980, i Brennan et al., Science, vol.229, pp.
[0271] 81–83, 1985); korišćenje leucinskih rajsferšlusa za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr., Kostelny et al., J. Immunol., vol. 148, str. 1547‐1553, 1992); korišćenje „dijatelo“ tehnologije za pravljenje bispecifičnih fragmenata antitela (videti, npr., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, str.6444‐6448, 1993); i korišćenje jednolančanih Fv (scFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., vol. 152, str.5368‐5374, 1994); i pripremanje trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr., u Tutt et al. J. Immunol., vol.147, str.60–69, 1991.
[0272] Inženjerska antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta za vezivanje antigena, uključujući „antitela hobotnice“, takođe su ovde uključena (videti, npr. US 2006/0025576A1).
[0273] Antitelo ili fragment antitela može takođe da sadrži „Fab dvostrukog dejstva“ ili „DAF“ koji sadrži mesto za vezivanje antigena koje se vezuje za Axl, kao i za drugi, različiti antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
[0274] Anti-Axl antitela ili fragmenti antitela mogu se proizvesti korišćenjem rekombinantnih metoda i kompozicija, koje su detaljno opisane u US 2016/0017040.
[0275] Fizička/hemijska svojstva i/ili biološke aktivnosti anti-Axl antitela ili fragmenata antitela ovog pronalaska mogu se testirati i meriti različitim testovima poznatim u struci. Neki od ovih testova su opisani u američkom patentu br.8,853,369.
[0276] B. Imunokonjugati
[0277] U drugom aspektu, pronalazak takođe pruža imunokonjugate koji sadrže anti-Axl antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi koji inhibiraju rast, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotopi.
[0278] U jednom izvođenju, imunokonjugat je konjugat antitela i leka (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, majtanzinoid (videti američke patente br. 5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin kao što su monometilauristatin lekovi DE i DF (MMAE i MMAF) (videti američke patente br. 5,635,483 i 5,780,588 i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti američke patente br.
[0279] 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296; Hinman i dr., Cancer Res., vol. 53, str. 3336–3342, 1993; i Lode i dr., Cancer Res., vol. 58, str. 2925–2928, 1998); antraciklin kao što su daunomicin ili doksorubicin (videti Krac i dr., Current Med. Chem., vol. 13, str.
[0280] 477–523, 2006; Džefri i dr., Bioorganic& Med. Chem. Letters, vol.16, str.358–362, 2006; Torgov i dr., Bioconj. Chem., vol.16, str.717–721, 2005; Nađ i dr., Proc. Natl.Acad.Sci. USA, vol.97, str.829–834, 2000; Dubovčik i dr., Bioorg.& Med. Chem. Letters, vol.12, vol.1529–1532, 2002; King i dr., J. Med. Chem., vol. 45, str. 4336–4343, 2002; i američki patent br. 6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; i CC1065.
[0281] U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži antitelo kako je ovde opisano, konjugovano sa radioaktivnim atomom da bi se formirao radiokonjugat. Različiti radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spinsku oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetna rezonanca, MRI), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili [0137] Konjugati antitela i citotoksičnog sredstva mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT),
[0284] 4
[0285] bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što su glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(pazidobenzoil)heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen). Na primer, imunotoksin ricina može se pripremiti kao što je opisano u Viteta i dr., Science, vol.238, str.1098-, 1987.1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti WO94/11026. Linker može biti „cepljivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti linker labilan u kiselini, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res., vol.52, pp.127‐131, 1992; U.S. Pat. No.5,208,020).
[0286] Imunokonjugati ovde izričito predviđaju, ali nisu ograničeni na, konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsnu vezu, uključujući, ali nisu ograničeni na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Illinois, SAD).
[0287] Primer ADC sadrži antitelo (Ab) koje cilja tumorsku ćeliju, deo leka (D) i deo linkera (L) koji vezuje Ab za D. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, antitelo je vezano za deo linkera (L) preko jednog ili više aminokiselinskih ostataka, kao što su lizin i/ili cistein.
[0288] Primerni ADC ima Formulu I kao Ab‐(L-D)p, gde je p od 1 do oko 20. Broj jedinica leka koje se mogu konjugovati sa antitelom ograničen je brojem slobodnih cisteinskih ostataka. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, slobodni cisteinski ostaci se uvode u aminokiselinska niz antitela metodama opisanim ovde. Primerni ADC Formule I uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja imaju 1, 2, 3 ili 4 inženjerski modifikovane cisteinske aminokiseline (Lyon et al., Methods in Enzym., vol.502, pp.123‐138, 2012). U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, jedan ili više slobodnih cisteinskih ostataka su već prisutni u antitelu, bez upotrebe inženjeringa, u kom slučaju postojeći slobodni cisteinski ostaci mogu biti korišćeni za konjugaciju antitela sa lekom. Alternativno, antitelo je izloženo redukcionim uslovima pre konjugacije antitela kako bi se generisao jedan ili više slobodnih cisteinskih ostataka.
[0290] а) Primeri Linkera
[0292] [0141] „Linker“ (L) je bifunkcionalni ili multifunkcionalni deo koji se može koristiti za povezivanje jednog ili više delova, kao što su delovi leka (D), sa antitelom (Ab) da bi se formirao imunokonjugat kao što je ADC Formule I. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, ADC-ovi se mogu pripremiti korišćenjem linkera koji ima reaktivne funkcionalnosti za kovalentno vezivanje za lek i za antitelo. Na primer, cistein tiol antitela (Ab) može formirati vezu sa reaktivnom funkcionalnom grupom linkera ili međuproizvodom lek-linker da bi se napravio ADC.
[0293] U jednom aspektu, linker ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa slobodnim cisteinom prisutnim na antitelu da bi se formirala kovalentna veza. Neograničavajući primeri takvih reaktivnih funkcionalnosti uključuju maleimid, haloacetamide, α-haloacetil, aktivirane estre kao što su sukcinimidni estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, tetrafluorofenil estri, anhidridi, kiselinski hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati. Videti, npr., metod konjugacije na strani 766 od Klusmana i dr., Biokonjugatna hemija, vol.15, str.765-773, 2004.
[0294] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, linker ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa elektrofilnom grupom prisutnom na antitelu. Primeri takvih elektrofilnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, aldehidne i ketonske karbonilne grupe. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, heteroatom reaktivne funkcionalnosti linkera može reagovati sa elektrofilnom grupom na antitelu i formirati kovalentnu vezu sa jedinicom antitela. Neograničavajući primeri takvih reaktivnih funkcionalnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid.
[0295] Linker može da sadrži jednu ili više komponenti linkera. Primeri komponenti linkera uključuju 6-maleimidoka-proil („MC“), maleimidopropanoil („MP“), valin-citrulin („val-cit“ ili „vc“), alaninfenilalanin („ala-phe“), p-amino-benziloksikarbonil („PAB“), N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat („SPP“) i 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilat
Različite komponente linkera su poznate u struci, od kojih su neke opisane u nastavku.
[0296] Linker može biti „cepljivi linker“, što olakšava oslobađanje leka. Neograničavajući primeri cepavih linkera uključuju linkere labilne u kiselini (npr. one koji sadrže hidrazon), linkere osetljive na proteazu (npr. osetljive na peptidazu), fotolabilne linkere ili linkere koji sadrže disulfide (Chari et al., Cancer Research, vol.52, str.127-131, 1992; američki patent br.5,208,020).
[0297] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, linker ima sledeću formulu II kao -A<a>-W<w>-Y<y>-, gde je A „jedinica za rastezanje“, a a je ceo broj od 0 do 1; W je „jedinica aminokiseline“, a w je ceo broj od 0 do 12; Y je „razdvojena jedinica“, a y je 0, 1 ili 2. ADC koji sadrži linker Formule II ima Formulu I(A): A<b>‐(A<a>‐W<w>‐Y<y>‐D)<p>, gde su Ab, D i p definisani kao gore za Formulu I. Primeri linkera su opisani u američkom patentu br.7,498,298.
[0298] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, komponenta linkera sadrži „jedinicu za rastezanje“ (A) koja povezuje antitelo sa drugom komponentom linkera ili sa delom leka. Neograničavajući primeri jedinica za rastezanje su prikazani ispod (gde talasasta linija označava mesta kovalentnog vezivanja za antitelo, lek ili dodatne komponente linkera):
[0301]
[0302] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, komponenta linkera sadrži „jedinicu aminokiseline“ (W). Jedinica aminokiseline omogućava cepanje linkera proteazom, čime se olakšava oslobađanje leka iz imunokonjugata nakon izlaganja intracelularnim proteazama, kao što su lizozomalni enzimi (Doronina et al., Nat. Biotechnol., vol. 21, pp. 778-784, 2003). Primeri jedinica aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide i pentapeptide. Primeri dipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, valin-citrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe); fenilalanin-lizin (fk ili phe-lys); fenilalanin-homolizin (phe-homolys); i N-metil-valin-citrulin (Me-valcit). Primeri tripeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, glicin-valin-citrulin (gli-val-cit) i glicin-glicinglicin (gli-gli-gli-gli). Jedinica aminokiseline može da sadrži ostatke aminokiselina koji se javljaju prirodno i/ili manje aminokiseline i/ili analoge aminokiselina koje se ne javljaju prirodno, kao što je citrulin. Jedinice aminokiselina mogu biti dizajnirane i optimizovane za enzimsko razlaganje određenim enzimom, na primer, proteazom povezanom sa tumorom, katepsinom B, C i D, ili plazmin proteazom.
[0303] Tipično, linkeri peptidnog tipa mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, prema metodi sinteze u tečnoj fazi (npr., E. Šroder i K. Libke (1965) „Peptidi“, tom 1, str. 76‐136, Akademik Pres).
[0304] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, komponenta linkera sadrži „razdvojenu jedinicu“ (Y) koja povezuje antitelo sa delom leka, direktno ili preko jedinice za istezanje i/ili jedinice aminokiseline. Razdvojena jedinica može biti „samozagnjetajuća“ ili „nezagnjetajuća“. „Nezagnjetajuća“ razdvojena jedinica je ona u kojoj deo ili cela razdvojena jedinica ostaje vezana za deo leka nakon cepanja ADC-a. Primeri nezagnjetajućih razdvojenih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, razdvojenu jedinicu glicina i razdvojenu jedinicu glicin-glicin. U nekim slučajevima, enzimsko cepanje ADC-a koji sadrži razdvojenu jedinicu glicin-glicin proteazom povezanom sa ćelijama tumora rezultira oslobađanjem delića glicin-glicin-lek iz ostatka ADC. Deo glicin-glicin-lek može biti podvrgnut koraku hidrolize u tumorskoj ćeliji, čime se odvaja glicin-glicin razmakna jedinica od dela leka.
[0305] „Samozaštitna“ razmakna jedinica omogućava oslobađanje dela leka. U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, razmakna jedinica linkera sadrži p-aminobenzil jedinicu. U nekim takvim slučajevima, p-aminobenzil alkohol je vezan za aminokiselinu preko amidne veze, a karbamat, metilkarbamat ili karbonat se formira između benzil alkohola i leka (Hamann et al. Expert Opin. Ther.Patents, vol. 15, pp. 1087‐1103, 2005). U drugim slučajevima, razmakna jedinica sadrži paminobenziloksikarbonil (PAB). U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, ADC koji sadrži samozaštitnu vezu ima strukturu:
[0308]
[0309] gde je Q -C<1>-C<8>alkil, -O-(C<1>-C<8>alkil), -halogen, -nitro ili -cijano; m je ceo broj u rasponu od 0 do 4; X može biti jedna ili više dodatnih razmaknih jedinica ili može biti odsutan; i p se kreće od 1 do oko 20. U nekim slučajevima, p se kreće od 1 do 10, od 1 do 7, od 1 do 5 ili od 1 do 4. Neograničavajući primeri X razmaknih jedinica uključuju:
[0312]
[0314] gde su R<1>i R<2>nezavisno izabrani iz H i C<1>-C<6>alkila. Na primer, R<1>i R<2>su svaki -CH<3>.
[0315] Drugi primeri samospaljivajućih razmaknica uključuju, ali nisu ograničeni na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi, kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (američki patent br. 7,375,078; Hej i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett., vol. 9, str. 2237-, 1999) i orto- ili para-aminobenzilacetali. U nekim slučajevima, mogu se koristiti razmaknice koje podležu ciklizaciji nakon hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4- aminobuterne kiseline (Rodrigues et al., Chemistry Biology, vol.2, pp.223‐, 1995), odgovarajuće supstituisani biciklo [2.2.1] i biciklo [2.2.2] prstenasti sistemi (Storm et al., J. Amer. Chem. Soc., vol.94, p.5815‐, 1972) i amidi 2-aminofenil-propionske kiseline (Amsberry et al, J. Org. Chem., vol. 55, p. 5867, 1990). Vezivanje leka za α-ugljenik glicinskog ostatka je još jedan primer samospajajućeg razmaknog elementa koji može biti koristan u ADC-ima (Kingsbury et al., J. Med. Chem., vol.27, str.1447, 1984).
[0316] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, linker L može biti linker dendritskog tipa za kovalentno vezivanje više od jednog dela leka za antitelo preko granastog, multifunkcionalnog dela linkera (Sun et al. Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters, vol.12, str.2213–2215, 2002; Sun et al., Bioorganic& Medicinal Chemistry, vol.11, str.1761–1768, 2003). Dendritski linkeri mogu povećati molarni odnos leka i antitela, tj. opterećenje, što je povezano sa jačinom ADC-a. Dakle, tamo gde antitelo nosi samo jednu reaktivnu cistein tiolnu grupu, mnoštvo lekova može biti vezano preko dendritskog linkera.
[0317] Neograničavajući primeri linkera su prikazani u nastavku u kontekstu ADC formule I:
[0318]
[0320] gde su R<1>i R<2>nezavisno izabrani iz H i C<1>-C<6>alkila. Na primer, R<1>i R<2>su svaki -CH<3>.
[0322]
[0324] gde je n od 0 do 12. U nekim slučajevima, n je od 2 do 10 ili n je od 4 do 8.
[0325] Dalji neograničavajući primeri ADC-ova uključuju strukture:
[0326]
[0329] ili
[0332]
[0335] Y je:
[0338]
[0340] svaki R je nezavisno H ili C<1>-C<6>alkil; i n je od 1 do 12.
[0341] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, linker je supstituisan grupama koje moduliraju rastvorljivost i/ili reaktivnost. Kao neograničavajući primer, naelektrisani supstituent kao što je sulfonat (-SO<3>-) ili amonijum može povećati rastvorljivost reagensa linkera u vodi i olakšati reakciju spajanja reagensa linkera sa antitelom i/ili delom leka, ili olakšati reakciju spajanja Ab-L (intermedijar antitela-linkera) sa D, ili D-L (intermedijar leka-linkera) sa Ab, u zavisnosti od sintetičkog puta koji se koristi za pripremu ADC-a. U nekim slučajevima, deo linkera je povezan sa antitelom, a deo linkera je povezan sa lekom, a zatim se Ab‐(deo linkera)<a>vezuje sa lekom‐(deo linkera)<b>da bi se formirao ADC formule I.
[0344] 4
[0345] Jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena na, ADC pripremljene sa sledećim reagensima linkera: bis-maleimido-trioksietilen glikol (BMPEO), N‐(β-maleimidopropiloksi)‐N-hidroksi sukcinimid estar (BMPS), N‐(ε-maleimidokaproil-oksi) sukcinimid estar (EMCS), N‐[γmaleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS), 1,6-heksan-bis-vinilsulfon (HBVS), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan‐1-karboksi‐(6-amidokaproat) (LC-SMCC), m-maleimidoben- zoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), 4‐(4-N-maleimidofenil)buterna kiselina hidrazid (MPBH), sukcinimidil 3‐(bro-moacetamido)propionat (SBAP), sukcinimidil jodoacetat (SIA), sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat (SIAB), N‐sukcinimidil‐3‐(2-piridilditio) propionat (SPDP), N-sukcinimidil-4‐(2-piridiltio)pentanoat (SPP), sukcinimidil 4‐(N-maleimidometil)cikloheksan‐1-karboksilat (SMCC), sukcinimidil 4‐(p-maleimidofenil)butirat (SMPB), sukcinimidil‐6‐[(betamaleimidopropionamido)heksanoat] (SMPH), iminotiolan (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB, i sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat (SVSB), i uključujući bis-maleimidne reagense: ditiobismaleimidoetan (DTME), 1,4-bismaleimidobutan (BMB), 1,4 bisma-leimidil-2,3-dihidroksibutan (BMDB), bismaleimidoheksan (BMH), bismaleimidoetan (BMOE), BM(PEG)<2>(prikazano ispod) i BM(PEG)<3>(prikazano ispod); bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(pazidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizo-cijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). U nekim slučajevima, bis-maleimidni reagensi omogućavaju vezivanje tiolne grupe cisteina u antitelu za deo leka koji sadrži tiol, linker ili međuproizvod linker-lek. Druge funkcionalne grupe koje su reaktivne sa tiolnim grupama uključuju, ali nisu ograničene na, jodoacetamid, bromoacetamid, vinil piridin, disulfid, piridil disulfid, izocijanat i izotiocijanat.
[0346] Određeni korisni linkerski reagensi mogu se dobiti iz različitih komercijalnih izvora, kao što su Pierce Biotechnology, Inc. (Rokford, Ilinois), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Kolorado), ili sintetizovati u skladu sa postupcima opisanim u struci; na primer, u Toki et al., J. Org. Chem., vol. 67, str.1866-1872, 2002; Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, vol.38, str.5257-60, 1997; Walker, J. Org. Chem., vol.60, str.5352-5355, 1995; Frisch et al., Bioconjugate Chem., vol.7, str.180-186, 1995; U.S. Pat. No.6,214,345; WO 02/088172; US2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; i WO 04/032828.
[0347] 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina obeležena ugljenikom-14 (MX-DTPA) je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti, npr., WO94/11026.
[0349] b) Primeri lekova
[0351] 1) Majtanzin i majtanzinoidi
[0352] U nekim izvođenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula majtanzinoida. Majtanzinoidi su derivati majtanzinoida i mitototski inhibitori koji deluju inhibiranjem polimerizacije tubulina. Majtanzin je prvi put izolovan iz istočnoafričkog žbuna Maytenus serrata (američki patent br. 3,896,111). Naknadno je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode majtanzinoide, kao što su majtanzinol i C-3 majtanzinol estri (američki patent br.4,151,042). Sintetički majtanzinoidi su otkriveni, na primer, u američkim patentima br. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; i 4.371.533.
[0353] Majtanzinoidne komponente lekova su atraktivne komponente lekova u konjugatima antitela i lekova jer su: (i) relativno pristupačne za pripremu fermentacijom ili hemijskom modifikacijom ili derivatizacijom proizvoda fermentacije, (ii) podložni derivatizaciji sa funkcionalnim grupama pogodnim za konjugaciju preko nedisulfidnih linkera sa antitelima, (iii) stabilni u plazmi i (iv) efikasni protiv različitih ćelijskih linija tumora.
[0354] Određeni majtanzinoidi pogodni za upotrebu kao lekovi majtanzinoida poznati su u struci i mogu se izolovati iz prirodnih izvora prema poznatim metodama ili proizvesti korišćenjem tehnika genetskog inženjeringa (videti, npr., Ju i dr., PNAS, vol.99, str.7968‐7973, 2002). Majtanzinoidi se takođe mogu sintetički pripremiti prema poznatim metodama.
[0355] Primeri majtansinoidnih lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji imaju modifikovani aromatični prsten, kao što su: C‐19-dehloro (američki patent br. 4,256,746) (pripremljen, na primer, redukcijom ansamitocina P2 litijum aluminijum hidridom); C‐20-hidroksi (ili C‐20-demetil)+/-C‐19-dehloro (američki patenti br.4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen, na primer, demetilacijom korišćenjem Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinacijom korišćenjem LAH); i C‐20-demetoksi, C‐20-aciloksi (-OCOR), /-dehloro (američki patent br.4,294,757) (pripremljen, na primer, acilacijom korišćenjem acil hlorida),i one koje imaju modifikacije na drugim položajima aromatičnog prstena.
[0356] Primeri majtanzinoidnih lekova takođe uključuju one koji imaju modifikacije kao što su: C‐9-SH (američki patent br.4,424,219) (pripremljen, na primer, reakcijom majtanzinola sa H<2>S ili P<2>S<5>); C-14-alkoksimetil(demetoksi-l/CH<2>OR) (američki patent br. 4,331,598); C‐14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH<2>OH ili CH<2>OAc) (američki patent br. 4,450,254) (pripremljen, na primer, iz Nocardia); C‐15-hidroksi/aciloksi (američki patent br.4,364,866) (pripremljen, na primer, konverzijom majtanzinola pomoću Streptomyces); C‐15-metoksi (američki patenti br. 4,313,946 i 4,315,929) (na primer, izolovan iz Trewia nudlflora); C‐18-N-demetil (američki patenti br. 4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen, na primer, demetilacijom majtanzinola pomoću Streptomyces); i 4,5-deoksi (američki patent br.4,371,533) (pripremljen, na primer, redukcijom majtanzinola titanijum trihloridom/LAH).
[0357] [0165] Mnogi položaji na jedinjenjima majtanzinoida su korisni kao položaji za vezu. Na primer, estarska veza može se formirati reakcijom sa hidroksilnom grupom korišćenjem konvencionalnih tehnika kuplovanja. U nekim ostvarenjima korisnim za razumevanje pronalaska, reakcija se može odvijati na C-3 položaju koji ima hidroksilnu grupu, na C-14 položaju modifikovanom hidroksimetilom, na C-15 položaju modifikovanom hidroksilnom grupom i na C-20 položaju koji ima hidroksilnu grupu. Na primer, veza se formira na C-3 položaju majtanzinola ili analoga majtanzinola.
[0358] Delovi leka majtanzinoida uključuju one koji imaju strukturu:
[0361]
[0363] gde talasasta linija označava kovalentno vezivanje atoma sumpora majtansinoidnog dela leka za linker ADC. Svaki R može nezavisno biti H ili C<1>-C<6>alkil. Alkilenski lanac koji vezuje amidnu grupu za atom sumpora može biti metanil, etanil ili propil, tj. m je 1, 2 ili 3 (američki patent br. 633,410; američki patent br. 5,208,020; Chari et al., Cancer Res., vol. 52, str. 127-131, 1992; Liu et al., Proc. Nail. Acad. Sci. USA, vol.93, str.8618-8623, 1996).
[0364] Svi stereoizomeri majtanzinoidnog dela leka su razmatrani za ADC, tj. bilo koja kombinacija R i S konfiguracija na hiralnim ugljenicima (američki patent br.7,276,497; američki patent br.6,913,748; američki patent br. 6,441,163; američki patent br. 633,410 (RE39151); američki patent br. 5,208,020; Widdison et al (2006) J. Med. Chem.49:4392-4408). U nekim otelotvorenjima korisnim za razumevanje pronalaska, majtanzinoidni deo leka ima sledeću stereohemiju:
[0367]
[0369] Primeri realizacije majtanzinoidnih delova leka uključuju, ali nisu ograničeni na, DM1; DM3; i DM4, koji imaju strukture:
[0372] 4
[0373]
[0376] gde talasasta linija označava kovalentno vezivanje atoma sumpora leka za linker (L) konjugata antitelolek.
[0377] Primeri konjugata antitelo-lek gde je DM1 povezan preko BMPEO linkera za tiolnu grupu antitela imaju strukturu i skraćenicu:
[0378]
[0380] gde je Ab antitelo; n je 0, 1 ili 2; i p je od 1 do oko 20. U nekim slučajevima, p je od 1 do 10, p je od 1 do 7, p je od 1 do 5 ili p je od 1 do 4.
[0381] Imunokonjugati koji sadrže majtanzinoide, postupci za njihovu proizvodnju i njihova terapeutska upotreba su otkriveni, na primer, u američkim patentima br. 5,208,020 i 5,416,064; US 2005/0276812 A1; i evropskom patentu EP 0425235B1. Videti takođe Liu et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol. 93, str.8618‐8623, 1996; i Čari i dr., CancerResearch, vol.52, str.127–131, 1992.
[0382] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, konjugati antitela i majtanzinoida mogu se pripremiti hemijskim povezivanjem antitela sa molekulom majtanzinoida bez značajnog smanjenja biološke aktivnosti bilo antitela ili molekula majtanzinoida. Videti, npr., američki patent br.
[0383] 5,208,020. U nekim slučajevima, ADC sa prosečno 3–4 molekula majtanzinoida konjugovanih po molekulu antitela pokazao je efikasnost u povećanju citotoksičnosti ciljnih ćelija bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela. U nekim slučajevima, očekuje se da čak i jedan molekul toksina/antitela poveća citotoksičnost u odnosu na upotrebu golog antitela.
[0384] Primerne grupe za povezivanje za pravljenje konjugata antitela i majtanzinoida uključuju, na primer, one opisane ovde i one otkrivene u američkom patentu br. Br. 5,208,020; EP patent 0425235 B1; Čari i dr., Istraživanje raka, vol.52, str.127–131, 1992; SAD 2005/0276812 A1; i SAD 2005/016993 A1.
[0386] (2) Auristatini i dolastatini
[0388] Lekovi obuhvataju dolastatine, auristatine i njihove analoge i derivate (američki patent br.
[0389] 5,635,483; američki patent br.5,780,588; američki patent br.5,767,237; američki patent br.6,124,431). Auristatini su derivati jedinjenja dolastatina‐10 iz morskih mekušaca. Iako ne nameravamo da se vežemo za bilo koju posebnu teoriju, pokazano je da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP i deobu jedra i ćelija (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother., vol. 45, pp.
[0392] 4
[0393] 3580‐3584, 2001) i imaju antikancerogeno (američki patent br.5,663,149) i antifungalno dejstvo (Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother., vol.42, pp.2961‐2965, 1998). Dolastatin/auristatin lek može biti vezan za antitelo preko N (amino) terminala ili C (karboksil) terminala peptidnog leka (WO 02/088172; Doronina et al., Nature Biotechnology, vol.21, str.778-784, 2003; Francisco et al., Blood, vol.102, str.
[0394] 1458-1465, 2003).
[0395] Primeri auristatina uključuju monometilauristatin lekove D<E>i D<F>povezane sa N-terminalom, objavljene u američkim patentima br.7,498,298 i 7,659,241:
[0398]
[0401] gde talasasta linija D<E>i D<F>označava mesto kovalentnog vezivanja za antitelo ili komponentu antitelalinkera, i nezavisno na svakoj lokaciji:
[0402] R<2>je izabran iz H i C<1>-C<8>alkila;
[0403] R<3>je izabran iz H, C<1>-C<8>alkila, C<3>-C<8>karbocikla, arila, C<1>-C<8>alkil-arila, C<1>-C<8>alkil-(C<3>-C<8>karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8 alkil-(C3-C8 heterocikla);
[0404] R<4>je izabran iz H, C<1>-C<8>alkila, C<3>-C<8>karbocikla, arila, C<1>-C<8>alkil-arila, C<1>-C<8>alkil-(C<3>-C<8>karbocikla), C<3>-C<8>heterocikla i C1-C<8>alkil-(C<3>-C<8>heterocikla);
[0405] R<5>je izabran iz H i metila;
[0406] ili R<4>i R<5>zajedno formiraju karbociklični prsten i imaju formulu -(CR<a>R<b>)n- gde su R<a>i R<b>nezavisno izabrani iz H, C<1>-C<8>alkila i C<3>-C<8>karbocikla, a n je izabrano iz 2, 3, 4, 5 i 6;
[0407] R<6>je izabran iz H i C<1>-C<8>alkila;
[0408] R<7>je izabran iz H, C<1>-C<8>alkila, C<3>-C<8>karbocikla, arila, C<1>-C<8>alkil-arila, C<1>-C<8>alkil-(C<3>-C<8>karbocikla), C<3>-C<8>heterocikla i C<1>-C<8>alkil-(C<3>-C<8>heterocikla);
[0409] svaki R<8>je nezavisno izabran iz H, OH, C<1>-C<8>alkila, C<3>-C<8>karbocikla i O-(C<1>-C<8>alkila);
[0410] R<9>je izabran iz H i C<1>-C<8>alkila;
[0411] R<10>je izabran iz arila ili C<3>-C<8>heterocikla;
[0412] Z je O, S, NH ili NR<12>, gde je R<12>C<1>-C<8>alkil;
[0413] R<11>je izabran iz H, C<1>-C<20>alkila, arila, C<3>-C<8>heterocikla, -(R<13>O)<m>-R<14>ili - (R<13>O)<m>-CH(R<15>)<2>;
[0414] m je ceo broj u rasponu od 1 do 1000;
[0415] R<13>je C<2>-C<8>alkil;
[0416] R<14>je H ili C<1>-C<8>alkil;
[0419] 4
[0420] svako pojavljivanje e je nezavisno H, COOH, -(CH<2>)<n>-N(R<16>)<2>, -(CH<2>)<n>-SO<3>H ili -(CH<2>)n-SO3-C<1>-C<8>alkil;
[0421] svako pojavljivanje e je nezavisno H, C<1>-C<8>alkil ili -(CH2)<n>-COOH;
[0422] R<18>je izabran iz ‐C(R<8>)<2>‐C(R<8>)<2>-aril, ‐C(R<8>)<2>‐C(R<8>)<2>‐(C<3>‐C<8>heterocikl) i ‐C(R<8>)<2>‐C(R<8>)<2>‐(C<3>‐C<8>karbocikl); i
[0423] n je ceo broj u rasponu od 0 do 6.
[0424] U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, R<3>, R<4>i R<7>su nezavisno izopropil ili sek-butil
[0425] i R<5>je -H ili metil, ili su R<3>i R<4>svaki izopropil, R<5>je -H, a R<7>je sec-butil.
[0426] U drugom slučaju, R<2>i R<6>su svaki metil, a R<9>je -H.
[0427] U još jednom slučaju, svako pojavljivanje R<8>je -OCH<3>.
[0428] Na primer, R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<2>i R<6>su svaki metil, R<5>je -H, R<7>je sec-butil, svako pojavljivanje R<8>je -OCH<3>, a R<9>je -H.
[0429] U jednom slučaju, Z je -O- ili -NH-.
[0430] U drugom slučaju, R<10>je aril.
[0431] U drugom primeru, R<10>je -fenil.
[0432] Na primer, kada je Z -O-, R<11>je -H, metil ili t-butil.
[0433] U jednom slučaju, kada je Z -NH, R<11>je -CH(R<15>)<2>, gde je R<15>-(CH<2>)<n>-N(R<16>)<2>, a R<16>je -C<1>-C<8>alkil ili -(CH<2>)<n>-COOH.
[0434] U drugom slučaju, kada je Z -NH, R<11>je -CH(R<15>)<2>, gde je R<15>-(CH<2>)n-SO<3>H.
[0435] Primer auristatina ima formulu D<E>, a to je MMAE, gde talasasta linija označava kovalentno vezivanje za linker (L) konjugata antitela i leka:
[0438]
[0441] Primer auristatinskog otelotvorenja formule D<E>je MMAF, gde talasasta linija označava kovalentno vezivanje za linker (L) konjugata antitela i leka:
[0444]
[0446] Drugi primeri uključuju monometilvalinska jedinjenja koja imaju fenilalanin karboksi modifikacije na C-terminusu pentapeptid auristatinskog dela leka (WO 2007/008848) i monometilvalinska jedinjenja koja imaju fenilalanin bočne modifikacije lanca na C-terminusu pentapeptid auristatinskog dela leka (WO 2007/008603).
[0449] 4
[0450] Neograničavajući primeri ADCs Formule I koji sadrže MMAF i različite komponente linkera dalje uključuju Ab-MC-PAB-MMAF i Ab-PAB-MMAF. Pokazano je da imunokonjugati koji sadrže MMAF vezan za antitelo pomoću linkera koji se ne može proteolitički cepati poseduju aktivnost uporedivu sa imunokonjugatima koji sadrže MMAF vezan za antitelo pomoću proteolitički cepativog linkera (Doronina et al., Bioconjugate Chem., vol.17, pp.114‐124, 2006). Veruje se da oslobađanje leka postiže razgradnja antitela u ćeliji.
[0451] Tipično, lekovi na bazi peptida mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili peptidnih fragmenata. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, metodom sinteze u tečnoj fazi (videti, npr., E. Šreder i K. Libke, „Peptidi“, tom 1, str. 76-136, 1965, Academic Press). Lekovi auristatin/dolastatin mogu se pripremiti prema metodama: američkog patenta br. 7,498,298; američkog patenta br. 5,635,483; američkog patenta br. 5,780,588; Petit i dr., J.Am.Chem.Soc., tom...111, str.5463–5465, 1998; Petit i dr., Anti-kancer lek Dizajn, vol.13, str.243– 277, 1998; Petit i dr., Sinteza, vol. 6, str. 719–725, 1996; Petit i dr., J. Chem.Soc.Perkin Trans. vol.15, str. 859–863, 1996; i Doronina, Nac. Biotehnologija, vol.21, str.778–784, 2003.
[0452] U nekim slučajevima, auristatin/dolastatin lekoviti delovi formula D<E>kao što su MMAE i D<E>, kao što je MMAF, i međuproizvodi za vezivanje lekova i njihovi derivati, kao što su MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF i MC-vc-PAB-MMAE, mogu se pripremiti korišćenjem metoda opisanih u američkom patentu br. 7,498,298; Doronina et al., Bioconjugate Chem., vol.17, str.114-124, 2006; i Doronina et al., Nat. Biotech., vol.21, str.778-784, 2003, a zatim konjugovati sa antitelom od interesa.
[0454] (3) Kaliheamicin
[0456] U nekim izvođenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula kaliheamicina. Porodica antibiotika kaliheamicina i njihovi analozi sposobni su da proizvode dvolančane prekide DNKi pri subpikomolarnim koncentracijama (Hinman i dr., Cancer Research, vol.
[0457] 53, str.3336–3342, 1993; Lode i dr.,Cancer Research, vol.58, str.2925–2928, 1998). Kaliheamicin ima intracelularna mesta delovanja, ali, u određenim slučajevima, ne prelazi lako plazma membranu. Stoga, ćelijski unos ovih agenasa putem internalizacije posredovane antitelima može značajno pojačati njihove citotoksične efekte. Neograničavajući primerni metodi pripreme konjugata antitelo-lek sa delom kaliheamicina kao leka opisani su, na primer, u američkom patentu br. 5,712,374; američkom patentu br.5,714,586; američkom patentu br.5,739,116; i američkom patentu br.5,767,285.
[0459] (4) Pirolobenzodiazepini
[0461] U nekim izvođenjima, ADC sadrži pirolobenzodiazepin (PBD). U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, PDB dimeri prepoznaju i vezuju se za specifične DNK sekvence. Prirodni proizvod antramicina, PBD, prvi put je objavljen 1965. godine (Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc., vol. 87, pp.5793‐5795, 1965; Leimgruber et al., J. Am. Chem. Soc., vol.87, pp.5791‐5793, 1965). Od
[0464] 4
[0465] tada, objavljen je niz PBD-ova, kako prirodnih tako i analognih (Thurston et al., Chem. Rev. vol.1994, pp. 433‐4651994, uključujući dimere triciklične PBD skele (američki patent br. 6,884,799; američki patent br. 7,049,311; američki patent br. 7,067,511; američki patent br. 7,265,105; američki patent br.
[0466] 7,511,032; američki patent br. 7,528,126; američki patent br. 7,557,099). Bez namere da se vežemo za bilo koju posebnu teoriju, veruje se da struktura dimera daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa manji žleb DNK B-oblika, što dovodi do čvrstog prianjanja na mestu vezivanja (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, Njujork, str. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., vol. 19, str. 230-237, 1986). Dimerna PBD jedinjenja koja nose C2 aril supstituente pokazala su se korisnim kao citotoksični agensi (Hartley et al. Cancer Res., vol. 70, str. 6849-6858, 2010; Antonow, J. Med. Chem. vol.53, str.2927-2941, 2010; Howard et al., Bioorganic and Med. Chem. Letters, vol.19, str.6463-6466, 2009).
[0467] PBD dimeri su konjugovani sa antitelima i rezultujući Dokazano je da ADC ima antikancerogena svojstva. Neograničavajući primeri mesta vezivanja na PBD dimeru uključuju petočlani pirolo prsten, vezu između PBD jedinica i N10-C11 iminsku grupu (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
[0468] Neograničavajući primeri PBD dimernih komponenti ADCs su formule A:
[0471]
[0474] i njihove soli i solvati, gde:
[0475] talasasta linija označava kovalentno mesto vezivanja za linker;
[0476] isprekidane linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3;
[0477] R<2>je nezavisno izabran iz H, OH, =O, =CH<2>, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)<2>, O-SO<2>‐R, CO<2>R i COR, i opciono dalje izabran iz halo ili dihalo, gde je R<D>nezavisno izabran iz R, CO<2>R, COR, CHO, CO<2>H i halo;
[0478] R<6>i R<9>su nezavisno izabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH<2>, NHR, NRR’, NO<2>, Me<3>Sn i halo;
[0479] R<7>je nezavisno izabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH<2>, NHR, NRR’, NO<2>, Me<3>Sn i halo;
[0480] Q je nezavisno izabran iz O, S i NH;
[0481] R<11>je ili H, ili R ili, gde je Q O, SO<3>M, gde je M metalni katjon;
[0482] R i R’ su svaki nezavisno izabrani iz opciono supstituisanih C<1>-<8>alkil, C<1-12>alkil, C<3-8>heterociklil, C<3-20>heterocikla i C<5-20>aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR’, R i R’ zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten; R<12>, R<16>, R<19>i R<17>su kao što je definisano za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>respektivno;
[0483] R" je C<3-12>alkilenska grupa, čiji lanac može biti prekinut jednim ili više heteroatoma, npr. O,S, N(H), NMe i/ili aromatičnim prstenovima, npr. benzenom ili piridinom, koji su opciono supstituisani; i X i X' su nezavisno izabrani iz O, S i N(H).
[0486] 4
[0487] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, R i R’ su svaki nezavisno izabrani iz opciono supstituisanih C<1-12>alkil, C<3-20>heterocikla i C<5-20>aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR’, R i R’ zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju opciono supstituisanu 4-, 5-, 6- ili 7-članu grupu heterociklični prsten. U nekim slučajevima, R<9>i R<19>su H. U nekim slučajevima, R<6>i R<16>su H.
[0488] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, R<7>i R<17>su oba OR<7A>, gde je R<7A>opciono supstituisani C<1-4>alkil. U nekim slučajevima, R<7A>je Me, ili R<7A>je Ch<2>Ph, gde je Ph fenil grupa. U nekim slučajevima, X je O. U nekim slučajevima, R<11>je H. U nekim slučajevima, postoji dvostruka veza između C2 i C3 u svakoj monomernoj jedinici.
[0489] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, R<2>i R<12>su nezavisno izabrani iz H i R, R<2>i R<12>su nezavisno R, R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani C<5-20>aril ili C<5-7>aril ili<C8-10>aril, R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani fenil, tienil, naftil, piridil, hinolinil, izohinolinil, R<2>i R<12>su nezavisno izabrani iz =O, =CH<2>, =CH-R<D>i =C(R<D>)<2>, R<2>i R<12>su svaki =CH<2>, R<2>i R<12>su svaki H, R<2>i R<12>su svaki =O, R<2>i R<12>su svaki =CF<2>, R<2>i/ili R<12>su nezavisno =C(R<D>)<2>, ili R<2>i/ili R<12>su nezavisno =CH-R<D>.
[0490] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, kada je R<2>i/ili R<12>=CH-R<D>, svaka grupa može nezavisno imati bilo koju od konfiguracija prikazanih ispod:
[0493]
[0495] U nekim slučajevima, =CH-R<D>je u konfiguraciji (I). U nekim slučajevima, R" je C<3>alkilenska grupa ili C<5>alkilenska grupa.
[0496] Linkeri PBD dimer-val-cit-PAB-Ab i PBD dimer-Phe-Lys-PAB-Ab se mogu cepati proteazom, dok je linker PBD dimer-maleimid-acetal labilan u kiselinskom okruženju.
[0497] PBDs dimeri i ADC-i koji sadrže PBD dimere mogu se pripremiti prema metodama poznatim u struci. Videti, npr., WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598.
[0499] (5) Antraciklini
[0501] [0201] U nekim izvođenjima, ADC može da sadrži antraciklin. Antraciklini su antibiotska jedinjenja koja pokazuju citotoksičnu aktivnost. Iako ne nameravamo da se vežemo za bilo koju posebnu teoriju, studije su pokazale da antraciklini mogu delovati tako što ubijaju ćelije nizom različitih mehanizama, uključujući: 1) interkalaciju molekula leka u DNK ćelije, čime se inhibira sinteza nukleinskih kiselina zavisna od DNK; 2) proizvodnja slobodnih radikala od strane leka koji zatim reaguju sa ćelijskim makromolekulima i izazivaju oštećenje ćelija, i/ili 3) interakcije molekula leka sa ćelijskom membranom (videti, npr., C. Peterson et al., „Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia“ u Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N. R. Bachur, „Free Radical Damage“ ibid. na str. 97‐102). Zbog svog citotoksičnog potencijala, antraciklini su korišćeni u lečenju brojnih karcinoma kao što su leukemija, karcinom dojke, karcinom pluća, adenokarcinom jajnika i sarkomi (videti, npr., P. H-Wiernik, u Anthracycline: Current Status And New Razvoj, str.11).
[0502] Neograničavajući primeri antraciklina uključuju doksorubicin, epirubicin, idarubicin, daunomicin, nemorubicin i njihove derivate. Imunokonjugati i prolekovi daunorubicina i doksorubicina su pripremljeni i proučavani (Kratz et al., Current Med. Chem., vol.13, str.477‐523, 2006; Jeffrei et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol. 136, 136, 136, 19, 9. 717-721, Natl., 2000 Chem. Letters, vol.
[0503] 12, str. 1529–1532, 2002; King et al., J. Med. Chem., vol. 45, str. 4336–4343, 2002; EP 0328147; U.S. Pat. No. 6,630,579). Konjugat antitela i leka BR96-doksorubicin specifično reaguje sa antigenom povezanim sa tumorom, a njegova reakcija je procenjena u studijama faze I i II (Saleh et al., J. Clin. Oncology, vol. 18, str. 2282–2292, 2000; Ajani et al., Cancer Jour., vol. 6, str. 78–81, 2000; Tolcher et al., J. Clin. Oncology, vol.17, str.478–484, 1999).
[0504] PNU‐159682 je snažan metabolit (ili derivat) nemorubicina (Quintieri et al., Clinical Cancer Research, vol. 11, str. 1608‐1617, 2005). Nemorubicin je polusintetički analog doksorubicina sa 2-metoksimorfolino grupom na glikozid amino doksorubicina i bio je pod kliničkom procenom (Grandi et al. Cancer Treat. Rev. vol.17, pp. 133‐138, 1990; Ripamonti et al. Brit. J. Cancer, vol. 65, pp. 703-707, 1992), uključujući ispitivanja faze II/III za hepatocelularni karcinom (Sun et al., Proceedings of the American Society for Clinical Oncology, vol. 22, Abs1448, 2003; Quintieri, Proceedings of the American Association of Cancer Research, vol.44:1st Ed, Abs 4649, 2003; Pacciarini et al., Jour. Clin. Oncology, vol.24, p.14116, 2006).
[0505] Antraciklini, uključujući PNU‐159682, mogu biti konjugovani sa antitelima preko nekoliko mesta vezivanja i različitih linkera (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124), uključujući linkere opisane ovde.
[0506] Linker PNU‐159682 maleimid acetal-Ab je labilan u kiselinskom okruženju, dok su linkeri PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU‐159682-val-cit-PAB-spacer-Ab i PNU‐159682-val-cit-PAB-spacer(R<1>R<2>)‐Ab mogu se cepati proteazom.
[0507] U određenim realizacijama, imunokonjugat može da sadrži visoko radioaktivni atom. Različiti radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu.
[0508] Radio- ili druge oznake mogu se ugraditi u imunokonjugat na poznate načine. Na primer, peptid se može biosintetizovati ili hemijski sintetizovati korišćenjem odgovarajućih prekursora aminokiselina koji sadrže, na primer, jedan ili više atoma fluora-19 umesto jednog ili više vodonika. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, oznake kao što su Tc<99>, I<123>, Re<186>, Re<188>i In<111>mogu
[0511] 1
[0512] se vezati preko ostatka cisteina u antitelu. U nekim slučajevima, itrijum-90 se može vezati preko ostatka lizina antitela. U nekim slučajevima, metoda IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.80, pp.49‐57, 1978) može se koristiti za ugradnju joda‐123. „Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy“ (Chatal, CRC Press 1989) opisuje određene druge metode.
[0513] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, imunokonjugat može da sadrži antitelo konjugovano sa enzimom koji aktivira prolek. U nekim takvim ostvarenjima, enzim koji aktivira prolek pretvara prolek (npr. peptidil hemoterapeutsko sredstvo, videti WO 81/01145) u aktivni lek, kao što je lek protiv raka. Takvi imunokonjugati su korisni, u nekim ostvarenjima, u terapiji prolekovima zavisnoj od antitela i posredovanoj enzimima („ADEPT“). Enzimi koji mogu biti konjugovani sa antitelom uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalne fosfataze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfate u slobodne lekove; arilsulfataze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfate u slobodne lekove; citozin deaminazu, koja je korisna za pretvaranje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv raka, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su seratija proteaza, termoliza, subtilizin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što su katepsini B i L), koji su korisni za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže D-aminokiselinski supstituente; enzime koji cepaju ugljene hidrate kao što su β-galaktozidaza i neuraminidaza, koji su korisni za pretvaranje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; β-laktamaza, koja je korisna za pretvaranje lekova derivatizovanih β-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza i penicilin G amidaza, koje su korisne za pretvaranje lekova derivatizovanih na njihovim aminskim azotima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. U nekim izvođenjima, enzimi mogu biti kovalentno vezani za antitela tehnikama rekombinantne DNK koje su dobro poznate u struci. Videti, npr., Neuberger et al., Nature, vol.312, str.604-608, 1984.
[0515] c) Punjenje lekom
[0517] Punjenje lekom je predstavljeno sa p, prosečnim brojem delova leka po antitelu u molekulu Formule I. Punjenje lekom može se kretati od 1 do 20 jedinica leka (D) po antitelu. ADCs Formule I uključuju kolekcije antitela konjugovanih sa nizom jedinica leka, od 1 do 20. Prosečan broj jedinica leka po upotrebi antitela u pripremi ADCs iz reakcija konjugacije može se okarakterisati konvencionalnim sredstvima kao što su masena spektroskopija, ELISA test i HPLC. Kvantitativna raspodela ADCs u smislu p takođe se može odrediti. U nekim slučajevima, razdvajanje, prečišćavanje i karakterizacija homogenih ADC gde je p određena vrednost iz ADCs sa drugim punjenjima lekom može se postići sredstvima kao što su HPLC sa obrnutom fazom ili elektroforeza.
[0518] Za neke konjugate antitela i leka, p može biti ograničen brojem mesta vezivanja na antitelu. Na primer, gde je veza cistein tiol, antitelo može imati samo jednu ili više cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se linker može vezati. U određenim ostvarenjima, korisnim za razumevanje pronalaska, veće opterećenje lekom, npr. p>5, može izazvati
[0521] 2
[0522] agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske permeabilnosti određenih konjugata antitela i leka. U određenim slučajevima, prosečno opterećenje lekom za ADC kreće se od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; ili od oko 3 do oko 5. Zaista, pokazano je da za određene ADCs, optimalni odnos delova leka po antitelu može biti manji od 8, i može biti oko 2 do oko 5 (američki patent br.7,498,298).
[0523] U određenim ostvarenjima korisnim za razumevanje pronalaska, manje od teorijskog maksimuma delova leka je konjugovano sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može da sadrži, na primer, ostatke lizina koji ne reaguju sa međuproizvodom lek-linker ili reagensom linkera, kao što je objašnjeno u nastavku. Generalno, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiolnih grupa koje mogu biti povezane sa delom leka; zapravo, većina cistein tiolnih ostataka u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U određenim slučajevima, antitelo se može redukovati redukcionim sredstvom, kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima, da bi se generisale reaktivne cistein tiolne grupe. U određenim slučajevima, antitelo se podvrgava uslovima denaturisanja da bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.
[0524] Punjenje (odnos lek/antitelo) ADC može se kontrolisati na različite načine, i na primer,: (i) ograničavanjem molarnog viška lek-linker intermedijera ili linker reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanjem vremena reakcije konjugacije ili temperature, i (iii) delimičnim ili ograničavajućim reduktivnim uslovima za modifikaciju cistein tiola.
[0525] Treba razumeti da kada više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa lek-linker intermedijerom ili linker reagensom, onda je rezultujući proizvod smeša ADC sa distribucijom jednog ili više delova leka vezanih za antitelo. Prosečan broj lekova po antitelu može se izračunati iz smeše pomoću dvostrukog ELISA testa antitela, koji je specifičan za antitelo i specifičan za lek. Pojedinačni ADCs mogu se identifikovati u smeši masenom spektroskopijom i razdvojiti HPLC-om, npr. hidrofobna interakciona hromatografija (videti, npr., McDonagh et al., Prot. Engr. Design & Selection, vol. 19, str. 299–307, 2006; Hamblett et al., Clin. Cancer Res., vol. 10, str. 7063–7070, 2004). U određenim slučajevima, homogeni ADCs sa jednom vrednošću punjenja može se izolovati iz smeše za konjugaciju pomoću elektroforeze ili hromatografije.
[0527] d) Određene metode pripreme imunokonjugata
[0529] Imunokonjugat koji je ADC Formule I može se pripremiti na nekoliko načina koristeći reakcije organske hemije, uslove i reagense poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući: (1) reakciju nukleofilne grupe antitela sa dvovalentnim linkernim reagensom da bi se formiralo Ab-L preko kovalentne veze, nakon čega sledi reakcija sa delom leka D; i (2) reakcija nukleofilne grupe dela leka sa dvovalentnim linkerskim reagensom, da bi se formirao D-L, putem kovalentne veze, nakon čega sledi reakcija sa nukleofilnom grupom antitela. Primeri metoda za pripremu ADC Formule I putem potonjeg puta opisani su u američkom patentu br.7,498,298.
[0530] Nukleofilne grupe na antitelima uključuju, ali nisu ograničene na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe bočnog lanca, npr. lizin, (iii) tiolne grupe bočnog lanca, npr. cistein, i (iv) hidroksilne ili amino grupe šećera gde je antitelo glikozilovane. Amin, tiol i hidroksil grupe su nukleofilne i sposobne su da reaguju i formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na linkerskim delovima i linkerskim reagensima, uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformijati i kiselinski halidi; (ii) alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; i (iii) aldehidi, ketoni, karboksilne i maleimidne grupe. Određena antitela imaju reducibilne međulančane disulfide, tj. cisteinske mostove. Antitela mogu biti učinjena reaktivnim za konjugaciju sa linkerskim reagensima tretmanom redukcionim sredstvom kao što je DTT (ditiotreitol) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), tako da je antitelo potpuno ili delimično redukovano. Svaki cisteinski most će tako formirati, teoretski, dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela modifikacijom lizinskih ostataka, npr. reakcijom lizinskih ostataka sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što rezultira konvertacijom amina u tiol. Reaktivne tiolne grupe se takođe mogu uvesti u antitelo uvođenjem jednog, dva, tri, četiri ili više cisteinskih ostataka (npr. pripremom varijanti antitela koja sadrže jedan ili više nenativnih cisteinskih aminokiselinskih ostataka).
[0531] Konjugati antitela i leka mogu se takođe proizvesti reakcijom između elektrofilne grupe na antitelu, kao što je aldehidna ili ketonska karbonilna grupa, sa nukleofilnom grupom na linkerskom reagensu ili leku. Korisne nukleofilne grupe na linkerskom reagensu uključuju, ali nisu ograničene na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. U jednom primeru, antitelo je modifikovano da bi se uveli elektrofilni delovi koji su sposobni da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na linkerskom reagensu ili leku. U drugom primeru, šećeri glikozilovanih antitela mogu biti oksidovani, npr. sa periodatnim oksidacionim reagensima, da bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu reagovati sa amin grupom linkerskih reagensa ili delova leka. Dobijene iminske Šifove bazne grupe mogu formirati stabilnu vezu ili se mogu redukovati, npr. borohidridnim reagensima da bi se formirale stabilne aminske veze. U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, reakcija ugljenohidratnog dela glikoziliranog antitela sa galaktoza oksidazom ili natrijum meta-perjodatom može dati karbonilne (aldehidne i ketonske) grupe u antitelu koje mogu da reaguju sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Biokonjugatne tehnike). U drugom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, antitela koja sadrže N-terminalne ostatke serina ili treonina mogu da reaguju sa natrijum meta-perjodatom, što rezultira proizvodnjom aldehida umesto prve aminokiseline (Geogegan i Stroh, Biokonjugatna hemija, vol. 3, str. 138–146, 1992; američki patent br. 5,362,852). Takav aldehid može reagovati sa delom leka ili linkerskim nukleofilom.
[0532] Primeri nukleofilnih grupa na delu leka uključuju, ali nisu ograničeni na: aminske, tiolne, hidroksilne, hidrazidne, oksimske, hidrazinske, tiosemikarbazonske, hidrazin karboksilatne i arilhidrazidne grupe sposobne da reaguju i formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na linkerskim delovima i linkerskim reagensima, uključujući: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformijati i kiselinski halidi; (ii) alkil i benzil halidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehide, ketone, karboksilne i maleimidne grupe.
[0535] 4
[0536] Neograničavajući primeri reagensa za umrežavanje koji se mogu koristiti za pripremu ADCs opisani su ovde u odeljku pod nazivom „Primeri linkera“. Metode korišćenja takvih reagensa za umrežavanje za povezivanje dva dela, uključujući proteinski deo i hemijski deo, poznate su u struci. U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje Pronalazak, fuzioni protein koji sadrži antitelo i citotoksični agens može se napraviti, npr., rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Molekul rekombinantne DNK može da sadrži regione koji kodiraju antitelo i citotoksične delove konjugata koji su ili jedan pored drugog ili odvojeni regionom koji kodira linker peptid koji ne uništava željena svojstva konjugata.
[0537] U još jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, antitelo može biti konjugovano sa „receptorom“ (kao što je streptavidin) za upotrebu u prethodnom ciljanju tumora, gde se konjugat antitelo-receptor primenjuje na pacijenta, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću sredstva za čišćenje, a zatim primena „liganda“ (npr. avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. lekom ili radionukleotidom).
[0538] C. Farmaceutske formulacije
[0539] Anti-Axl antitela ili fragmenti antitela imaju aktivnost ubijanja ćelija. Ova aktivnost ubijanja ćelija proteže se na više različitih tipova ćelijskih linija. Dalje, ova antitela ili fragmenti antitela, jednom konjugovani sa citotoksičnim sredstvom, mogu smanjiti veličinu tumora i mogu pokazati smanjenu toksičnost. Videti primere 3 i 6-9 ove prijave. Dakle, anti-Axl antitela, fragmenti ili imunokonjugati istih mogu biti korisni za lečenje proliferativnih bolesti povezanih sa ekspresijom Axl. Antitela, fragmenti ili imunokonjugati mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa bilo kojim odgovarajućim sredstvom ili drugim konvencionalnim tretmanima.
[0540] Anti-Axl antitelo ili fragment antitela može se koristiti za lečenje hiperproliferativnih bolesti povezanih sa ekspresijom, prekomernom ekspresijom ili aktivacijom Axl i/ili Gas6. Ne postoje posebna ograničenja u pogledu vrsta raka ili tkiva koji se mogu lečiti osim zahteva za ekspresijom Axl. Primeri uključuju skvamozni ćelijski karcinom, rak pluća malih ćelija, rak pluća nemalih ćelija, rak želuca, rak pankreasa, tumore glijalnih ćelija kao što su glioblastom i neurofibromatoza, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, melanom, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma, karcinom pljuvačnih žlezda, rak bubrega, rak bubrega, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, karcinom jetre, sarkome, hematološke karcinome (leukemije), astrocitome i različite vrste raka glave i vrata. Poželjniji karcinomi su gliom, rak želuca, pluća, pankreasa, dojke, prostate, bubrega, jetre i endometrijuma.
[0541] Anti-Axl antitela ili fragmenti antitela su potencijalni aktivatori urođenog imunog odgovora i stoga mogu se koristiti u lečenju poremećaja ljudskog imuniteta, kao što je sepsa. Anti-Axl antitelo ili fragment antitela može se takođe koristiti kao adjuvans za imunizaciju, kao što su vakcine i kao antiinfekcioni agensi protiv, na primer, bakterija, virusa i parazita.
[0542] [0223] Anti-Axl antitelo ili fragment antitela može se koristiti za zaštitu od, sprečavanje ili lečenje trombotičnih bolesti kao što su venska i arterijska tromboza i aterotromboza. Anti-Axl antitelo ili fragment antitela može se takođe koristiti za zaštitu od, sprečavanje ili lečenje kardiovaskularnih bolesti, kao i za sprečavanje ili inhibiranje ulaska virusa kao što su Lasa i Ebola virusi i za lečenje virusnih infekcija.
[0543] U metodama lečenja opisanim ovde, anti-Axl monoklonalno antitelo, fragment antitela ili anti-Axl monoklonalni imunokonjugat može se isporučiti na način koji je u skladu sa konvencionalnim metodologijama povezanim sa lečenjem bolesti ili poremećaja za koji se traži lečenje. U skladu sa ovde navedenim otkrićem, efikasna količina antitela, fragmenta antitela ili imunokonjugata se primenjuje na subjekta kome je potreban takav tretman, tokom vremena i pod uslovima dovoljnim da spreče ili leče bolest ili poremećaj. Stoga, aspekt koristan za razumevanje pronalaska odnosi se na metod za lečenje bolesti povezane sa ekspresijom Axl, koji obuhvata primenu subjektu kome je potreban terapeutski efikasne količine antitela, fragmenta antitela ili imunokonjugata.
[0544] Za primenu, monoklonsko antitelo protiv Axl, fragment antitela ili imunokonjugat mogu se formulisati kao farmaceutski sastav. Farmaceutski sastav koji uključuje monoklonsko antitelo protiv Axl, fragment antitela ili konjugat antitela i leka može se formulisati prema poznatim metodama za pripremu farmaceutskih sastava. U takvim metodama, terapeutski molekul se obično kombinuje sa smešom, rastvorom ili sastavom koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0545] Farmaceutski prihvatljiv nosač je materijal koji pacijent primalac može da toleriše. Sterilni fosfatno puferovani fiziološki rastvor je jedan primer farmaceutski prihvatljivog nosača. Drugi pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači su dobro poznati stručnjacima u struci. (Vidi, npr., Gennaro (ur.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19. izdanje, 1995)) Formulacije mogu dalje da sadrže jedan ili više ekscipijenata, konzervansa, solubilizatora, puferskih sredstava, albumina za sprečavanje gubitka proteina na površinama bočica itd.
[0546] Oblik farmaceutskih kompozicija, način primene, doza i režim prirodno zavise od stanja koje se leči, težine bolesti, starosti, težine i pola pacijenta itd. Ova razmatranja može uzeti u obzir stručnjak za formulisanje pogodnih farmaceutskih kompozicija. Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se formulisati za lokalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravenoznu, intramuskularnu, potkožnu ili intraokularnu primenu i slično.
[0547] Poželjno je da farmaceutske kompozicije sadrže nosače koji su farmaceutski prihvatljivi za formulacija koja se može ubrizgavati. To mogu biti posebno izotonični, sterilni, fiziološki rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično ili smeše takvih soli), ili suvi, posebno liofilizovani sastavi koji nakon dodavanja, na primer, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, omogućavaju stvaranje injekcionih rastvora.
[0548] [0229] U nekim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, sredstva za toničnost, ponekad poznata kao „stabilizatori“, su prisutna da bi podesila ili održala toničnost tečnosti u sastavu. Kada se koriste sa velikim, naelektrisanim biomolekulima kao što su proteini i antitela, često se nazivaju „stabilizatorima“ jer mogu da interaguju sa naelektrisanim grupama bočnih lanaca aminokiselina, čime se smanjuje potencijal za inter- i intra-molekularne interakcije. Sredstva za toničnost mogu biti prisutna u bilo kojoj količini od 0,1% do 25% težinskih, poželjno 1 do 5% farmaceutskog sastava. Poželjna sredstva za toničnost uključuju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.
[0549] Dodatna pomoćna sredstva uključuju sredstva koja mogu služiti kao jedno ili više od sledećeg: (1) sredstva za povećanje zapremine, (2) sredstva za poboljšanje rastvorljivosti, (3) stabilizatori i (4) sredstva koja sprečavaju denaturaciju ili prianjanje na zid posude. Takva pomoćna sredstva mogu uključivati: polihidrične šećerne alkohole (navedene gore); aminokiseline kao što su alanin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, lizin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd.; organski šećeri ili šećerni alkoholi kao što su saharoza, laktoza, laktitol, trehaloza, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, ribitol, mioinizitoza, mioinizitol, galaktoza, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr. inozitol), polietilen glikol; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; proteini male molekulske težine kao što su ljudski serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; monosaharidi (npr. ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza); disaharidi (npr. laktoza, maltoza, saharoza); trisaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što su dekstrin ili dekstran.
[0550] Nejonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao „sredstva za vlaženje“) mogu se koristiti da pomognu u rastvaranju terapeutskog sredstva, kao i da zaštite terapeutski protein od agregacije izazvane agitacijom, što takođe omogućava da formulacija bude izložena površinskom naprezanju smicanjem bez izazivanja denaturacije aktivnog terapeutskog proteina ili antitela. Nejonski surfaktanti mogu biti prisutni u opsegu koncentracija od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, poželjno od oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.
[0551] Pogodni nejonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 40, 60, 65, 80, itd.), polioksamere (184, 188, itd.), PLURONIC® poliole, TRITON®, polioksietilen sorbitan monoetere (TWEEN®‐20, TWEEN®‐80, itd.), lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, polioksietilen hidrogenizovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, estar masne kiseline saharoze, metil celulozu i karboksimetil celulozu. Anjonski deterdženti koji se mogu koristiti uključuju natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti uključuju benzalkonijum hlorid ili benzetonijum hlorid.
[0552] Doze koje se koriste za primenu mogu se prilagoditi u zavisnosti od različitih parametara, a posebno u zavisnosti od načina primene, relevantne patologije ili, alternativno, željenog trajanja lečenja. Da bi se pripremili farmaceutski sastavi, efikasna količina antitela ili fragmenta antitela može se rastvoriti ili dispergovati u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenoj sredini.
[0553] Farmaceutski oblici pogodni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje kikirikija ili vodeni propilen glikol; i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i tečan u meri u kojoj se lako može koristiti špricem. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.
[0554] Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi pogodno pomešanoj sa surfaktantnim sredstvom. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama, kao i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava rast mikroorganizama.
[0555] Antitelo ili fragment antitela može se formulisati u sastav u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli dobijene adicijom kiselina (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksidi, i organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.
[0556] Nosač takođe može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), odgovarajuće smeše istih i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjnije uključiti izotonična sredstva, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići upotrebom u kompozicijama sredstava koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0557] Sterilne injekcione rastvore pripremaju se uključivanjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili više drugih sastojaka navedenih gore, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz onih navedenih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjne metode pripreme su tehnike vakuumskog sušenja i liofilizacije koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0558] Takođe se razmatra priprema više koncentrovanih ili visoko koncentrovanih rastvora za direktnu injekciju, gde se predviđa da će upotreba dimetil sulfoksida (DMSO) kao rastvarača rezultirati izuzetno brzom penetracijom, isporučujući visoke koncentracije aktivnih agenasa maloj površini tumora.
[0559] Nakon formulacije, rastvori će se primenjivati na način kompatibilan sa formulacijom doze i u količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim oblicima doze, kao što je vrsta rastvora za injekcije opisanih gore, ali se mogu koristiti i kapsule za oslobađanje leka i slično.
[0560] [0241] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba da bude odgovarajuće puferovan ako je potrebno, a tečni razblaživač prvo izotoničan sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi posebni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intramuskularnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu. U vezi sa tim, sterilni vodeni medijum koji se može koristiti biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i ili dodata u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrizgana na predloženo mesto infuzije (videti na primer, „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, 15. izdanje, stranice 1035– 1038 i 1570–1580). Izvesne varijacije u doziranju će nužno doći u zavisnosti od stanja subjekta koji se leči. Osoba odgovorna za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta.
[0561] Antitela ili fragmenti antitela mogu biti formulisani u terapijskoj smeši da bi se isporučilo oko 0.0001 do 10.0 miligrama, ili oko 0.001 do 5 miligrama, ili oko 0.001 do 1 miligram, ili oko 0.001 do 0.1 miligram, ili oko 0.1 do 1.0 ili čak oko 10 miligrama po dozi. Višestruke doze se takođe mogu primenjivati u odabranim vremenskim intervalima.
[0562] Pored jedinjenja formulisanih za parenteralnu primenu, kao što su intravenska ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste supstance za oralnu primenu; kapsule sa vremenskim oslobađanjem; i bilo koji drugi oblik koji se trenutno koristi.
[0563] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, predviđa se upotreba lipozoma i/ili nanočestica za unošenje antitela ili fragmenata antitela u ćelije domaćina. Formiranje i upotreba lipozoma i/ili nanočestica su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0564] Nanokapsule generalno mogu da zarobe jedinjenja na stabilan i reproducibilan način. Da bi se izbegli neželjeni efekti usled intracelularnog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0.1 μm) su generalno dizajnirane korišćenjem polimera sposobnih da se razgrade in vivo. Biorazgradive polialkil-cijanoakrilatne nanočestice koje ispunjavaju ove zahteve se razmatraju za upotrebu, a takve čestice se mogu lako napraviti.
[0565] Lipozomi se formiraju od fosfolipida koji su dispergovani u vodenoj sredini i spontano formiraju višeslojne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe nazvane višeslojne vezikule (MLVs)). MLVs generalno imaju prečnike od 25 nm do 4 μm. Sonikacija MLVs rezultira formiranjem malih jednoslojnih vezikula (SUVs) sa prečnikom u opsegu od 200 do 500 Å, koje sadrže vodeni rastvor u jezgru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske jačine i prisustva dvovalentnih katjona.
[0566] [0247] Farmaceutske formulacije koje sadrže anti-Axl antitelo ili fragment antitela, kao što je ovde opisano, pripremaju se mešanjem takvog antitela ili fragmenta antitela željenog stepena čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju, ali nisu ograničeni na: pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktade-cildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajoni koji formiraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonski surfaktanti kao što je polietilen glikol (PEG).
[0567] Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju intersticijalna sredstva za disperziju lekova kao što su rastvorljivi neutralno-aktivni hijaluronidazni glikoproteini (sHASEGP), na primer, ljudska rastvorljiva PH-20 hijaluronidaza glikoproteini, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Određeni primerni sHASEGPs i metodi upotrebe, uključujući rHuPH20, opisani su u američkim patentnim publikacijama br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza kao što su hondroitinaze.
[0568] Primerne liofilizovane formulacije antitela opisane su u američkom patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u američkom patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove poslednje formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
[0569] Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kako je potrebno za određenu indikaciju koja se leči. Poželjno je da se sastojci sa komplementarnim aktivnostima koji ne utiču negativno jedni na druge mogu kombinovati u jednu formulaciju. Na primer, može biti poželjno da se pored anti-Axl antitela, fragmenta antitela ili imunokonjugata ovog pronalaska obezbedi EGFR antagonist (kao što je erlotinib), antiangiogeno sredstvo (kao što je VEGF antagonist koji može biti anti-VEGF antitelo) ili hemoterapeutsko sredstvo (kao što je taksoid ili platinasti agens). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
[0570] Aktivni sastojci mogu biti inkapsulirani u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom. Na primer, mogu se koristiti hidroksimetilceluloza ili želatinske mikrokapsule i poli(metilmetacilatne) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su opisane u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).
[0571] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo ili fragment antitela, a koje matrice mogu biti u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula.
[0572] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu su generalno sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr., filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0574] D. Terapeutske metode i kompozicije
[0576] [0254] Bilo koje od anti-Axl antitela ili fragmenata antitela koji su ovde dati može se koristiti u terapijskim metodama. U jednom aspektu, obezbeđeno je anti-Axl antitelo ili fragment antitela za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je anti-Axl antitelo ili fragment antitela za upotrebu u lečenju raka (npr. raka dojke, nesitnoćelijskog raka pluća, raka pankreasa, raka mozga, raka pankreasa, mozga, bubrega, jajnika, želuca, leukemije, endometrijuma materice, debelog creva, prostate, štitne žlezde, jetre, osteosarkoma i/ili melanoma). U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitelo ili fragment antitela je namenjen za upotrebu u metodu lečenja. U određenim slučajevima, anti-Axl antitelo ili fragment antitela je namenjen za upotrebu u metodu lečenja osobe koja ima rak, koji obuhvata davanje osobi efikasne količine anti-Axl antitela ili fragmenta antitela. U određenim slučajevima, anti-Axl antitelo ili fragment antitela je namenjen za upotrebu u metodu lečenja osobe koja ima imuni poremećaj (npr. autoimuni poremećaj), kardiovaskularni poremećaj (npr. aterosklerozu, hipertenziju, trombozu), infektivnu bolest (npr. virus ebole, virus Marburg) ili dijabetes, koji obuhvata davanje osobi efikasne količine anti-Axl antitela ili fragmenta antitela. U jednom takvom slučaju, metod dalje obuhvata davanje osobi efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr., kao što je opisano u nastavku. U drugim slučajevima, anti-Axl antitelo ili fragment antitela se koristi za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju imune funkcije, inhibiciju sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora.
[0577] U određenim izvođenjima korisnim za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitelo ili fragment antitela je za upotrebu u metodu inhibicije angiogeneze, inhibicije ćelijske proliferacije, inhibicije imunološke funkcije, inhibicije sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibicije vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibicije funkcije strome tumora kod pojedinca, što obuhvata davanje pojedincu efikasne doze anti-Axl antitela ili fragmenta antitela za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju imunološke funkcije, inhibiciju sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju razvoja vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora. „Pojedinac“ je poželjno čovek.
[0578] U daljem aspektu korisnom za razumevanje pronalaska, anti-Axl antitelo ili fragment antitela je za upotrebu u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom slučaju, lek je namenjen za lečenje raka (kao što su rak dojke, nesitnoćelijski rak pluća, rak pankreasa, rak mozga, rak pankreasa, mozga, bubrega, jajnika, želuca, leukemije, endometrijuma materice, debelog creva, prostate, štitne žlezde, jetre, osteosarkoma i/ili melanoma). U daljem slučaju, lek je namenjen za upotrebu u postupku lečenja raka koji obuhvata davanje osobi koja ima rak efikasne količine leka. Lek je namenjen za upotrebu u postupku lečenja imunog poremećaja (npr. autoimunog poremećaja), kardiovaskularnog poremećaja (npr. ateroskleroze, hipertenzije, tromboze), zarazne bolesti (npr. virusa ebole, virusa Marburg) ili dijabetesa, koji obuhvata davanje osobi efikasne količine anti-Axl antitelo ili fragment antitela. U jednom takvom slučaju, metod dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr., kao što je opisano u nastavku. U daljem slučaju, lek je za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju imune funkcije, inhibiciju sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora.
[0581] 1
[0582] U daljem slučaju, lek je namenjen za upotrebu u postupku inhibicije angiogeneze, inhibicije ćelijske proliferacije, inhibicije imunološke funkcije, inhibicije sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibicije vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibicije funkcije strome tumora kod pojedinca, što obuhvata davanje pojedincu količine leka efikasne za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, promociju imunološke funkcije, indukovanje sekcije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju razvoja vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora. „Pojedinac“ može biti čovek.
[0583] U daljem aspektu korisnom za razumevanje pronalaska, postupak za lečenje raka obuhvata davanje pojedincu koji ima rak efikasne količine anti-Axl antitela ili fragmenta antitela. U jednom takvom slučaju, metod dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac“ može biti čovek.
[0584] U daljem aspektu korisnom za razumevanje pronalaska, pronalazak pruža metod za lečenje imunog poremećaja (npr. autoimunog poremećaja), kardiovaskularnog poremećaja (npr. ateroskleroze, hipertenzije, tromboze), zarazne bolesti (npr. virusa ebole, virusa Marburg) ili dijabetesa. U jednom takvom izvođenju, metod dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac“ može biti čovek.
[0585] U daljem aspektu korisnom za razumevanje pronalaska, obezbeđen je metod za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, inhibiciju imune funkcije, inhibiciju sekrecije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora kod pojedinca. U jednom slučaju, metod obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-Axl antitela ili fragmenta antitela za inhibiciju angiogeneze, inhibiciju ćelijske proliferacije, promociju imune funkcije, indukovanje sekcije inflamatornih citokina (npr. iz makrofaga povezanih sa tumorom), inhibiciju razvoja vaskulature tumora (npr. intratumoralne vaskulature ili vaskulature povezane sa tumorom) i/ili inhibiciju funkcije strome tumora. U jednom slučaju, „pojedinac“ je čovek.
[0586] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od anti-Axl antitela ili fragmenata antitela koji su ovde dati. U jednom izvođenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od anti-Axl antitela ili fragmenata antitela datih ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od anti-Axl antitela ili fragmenata antitela i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo, npr., kao što je opisano u nastavku.
[0587] U izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, u svakom gore opisanom tretmanu, antitela ili fragmenti antitela mogu se koristiti sami, kao imunokonjugati ili u kombinaciji sa drugim sredstvima u terapiji. Na primer, antitelo se može ko-administrirati sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom. Dodatno terapeutsko sredstvo je antiangiogeno sredstvo. U određenim slučajevima, dodatni terapeutski agens je antagonist VEGF (kao što je anti-VEGF antitelo, na primer bevacizumab), antagonist EGFR (kao što je erlotinib), hemoterapeutski agens i/ili acitostatski agens, taksoid (npr.
[0590] 2
[0591] paklitaksel) i/ili platinski agens (npr. karboplatin), ili agens koji pojačava imunitet ili imuni sistem pacijenta.
[0592] Takve kombinovane terapije navedene gore obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojenu primenu, u kom slučaju, primena antitela ili fragmenta antitela može se desiti pre, istovremeno i/ili nakon primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa. Antitela ili fragmenti antitela takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa radioterapijom.
[0593] U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, antitela ili fragmenti antitela mogu se formulisati, dozirati i primenjivati na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji treba razmotriti u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto primene agensa, način primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ili fragment antitela ne mora biti, ali jeste, opciono formulisan sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje dotičnog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antitela ili fragmenta antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja i drugih faktora o kojima se gore govorilo. Generalno se koriste u istim dozama i načinima primene kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doza opisanih ovde, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim putem koji je empirijski/klinički utvrđen kao odgovarajući.
[0594] U jednom izvođenju korisnom za razumevanje pronalaska, za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela ili fragmenta antitela (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih Dodatna terapijska sredstva) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela ili fragmenta antitela, težine i toka bolesti, da li se antitelo ili fragment antitela primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo ili fragment antitela, i diskrecionog prava lekara. Antitelo ili fragment antitela se pogodno primenjuje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 40 mg/kg antitela ili fragmenta antitela može biti početna kandidat doza za primenu pacijentu, bilo, na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje bi generalno bilo održivo dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela ili fragmenta antitela). Može se primeniti početna veća udarna doza, nakon čega sledi jedna ili više nižih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi režimi doziranja. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
[0595] Razume se da se bilo koja od gore navedenih formulacija ili terapijskih metoda može sprovesti korišćenjem fragmenta antitela ili imunokonjugata umesto ili pored anti-Axl antitela.
[0596] [0266] Pojačavanje imunološke funkcije domaćina u borbi protiv tumora je predmet sve većeg interesovanja. Konvencionalne metode uključuju (i) poboljšanje APK, kao što je (a) injekcija u tumor DNK koja kodira strane MHC aloantigene, ili (b) transfekcija biopsiranih tumorskih ćelija genima koji povećavaju verovatnoću prepoznavanja imunog antigena (npr. imunostimulatorni citokini, GM-CSF, kostimulatorni molekuli B7.1, B7.2) tumora, (iii) adoptivna ćelijska imunoterapija, ili tretman aktiviranim tumor-specifičnim T-ćelijama. Adoptivna ćelijska imunoterapija uključuje izolovanje tumor-infiltrirajućih T-limfocita domaćina, proširivanje populacije in vitro, kao što je stimulacija pomoću IL-2 ili tumora ili oba. Pored toga, izolovane T-ćelije koje su disfunkcionalne takođe mogu biti aktivirane in vitro primenom anti-PD-L1 antitela. T-ćelije koje su tako aktivirane mogu se zatim ponovo dati domaćinu. Jedna ili više ovih metoda mogu se koristiti u kombinaciji sa primenom antitela, fragmenta antitela ili imunokonjugata.
[0597] Tradicionalne terapije za rak uključuju sledeće: (i) radioterapiju (npr. radioterapiju, rendgensku terapiju, zračenje) ili upotrebu jonizujućeg zračenja za ubijanje ćelija raka i smanjenje tumora. Radioterapija se može primenjivati ili spolja putem spoljašnje radioterapije (EBRT) ili interno putem brahiterapije; (ii) hemoterapiju ili primenu citotoksičnih lekova koji generalno utiču na brzo deleće ćelije; (iii) ciljane terapije ili sredstva koja specifično utiču na deregulisane proteine ćelija raka (npr. inhibitori tirozin kinaze imatinib, gefitinib; monoklonska antitela, fotodinamička terapija); (iv) imunoterapiju ili poboljšanje imunog odgovora domaćina (npr. vakcina); (v) hormonska terapija ili blokada hormona (npr. kada je tumor osetljiv na hormone), (vi) inhibitor angiogeneze ili blokada formiranja i rasta krvnih sudova i (vii) palijativna nega ili lečenje usmereno na poboljšanje kvaliteta nege radi smanjenja bola, mučnine, povraćanja, dijareje i hemoragije. Lekovi protiv bolova kao što su morfin i oksikodon, antiemetici kao što su ondansetron i aprepitant, mogu omogućiti agresivnije režime lečenja.
[0598] U lečenju raka, bilo koji od prethodno opisanih konvencionalnih tretmana za lečenje imuniteta na rak može se sprovesti, pre, nakon ili istovremeno sa primenom anti-Axl antitela ili fragmenata antitela. Pored toga, anti-Axl antitela ili fragmenti antitela mogu se primenjivati pre, nakon ili istovremeno sa konvencionalnim tretmanima raka, kao što je primena antitela koja se vezuju za tumor (npr. monoklonalna antitela, monoklonska antitela konjugovana sa toksinom) i/ili primena hemoterapeutskih sredstava.
[0599] Sledeći primeri su ilustrativni, ali ne ograničavajući, mekih želatinskih kapsula ovog otkrića. Druge pogodne modifikacije i adaptacije različitih uslova i parametara koji se obično sreću u ovoj oblasti, a koji su očigledni stručnjacima u ovoj oblasti, spadaju u obim ovog otkrića.
[0601] PRIMERI
[0602] Primer 1: Uslovno aktivno antitelo na Axl
[0603] Axl je transmembranska tirozin kinaza sa ekstracelularnim domenom dostupnim uslovno aktivnom antitelu. Ovaj protein ćelijske površine je visoko ekspresovan u tkivima karcinoma štitne žlezde i prekomerno ekspresovan u mnogim drugim vrstama raka kao što su mijeloproliferativni poremećaji, ćelije karcinoma prostate ili rak dojke. Ovde je razvijeno uslovno aktivno antitelo na ekstracelularni domen Axl proteina.
[0606] 4
[0607] Antitelo divljeg tipa na Axl je odabrano kao matrično antitelo (sa varijabilnim regionom teškog lanca 063-hum10F10-HC na slici 1A i varijabilnim regionom lakog lanca 063-hum10F10-HC na slici 1B). DNK koja kodira antitelo divljeg tipa je evoluirana da bi se generisala biblioteka mutantnih antitela korišćenjem Sveobuhvatne pozicione evolucije (CPE), metode kojom se svaka pozicija u matričnom antitelu randomizuje jedna po jedna. Svako mutantno antitelo u biblioteci ima samo jednu tačkastu mutaciju. Mutantna antitela u biblioteci su generisana istovremenim skriningom za selektivni afinitet vezivanja za Axl pri pH 6.0 iznad pH 7.4, određen ELISA testom.
[0608] Istovremeno, nivo ekspresije mutantnih antitela je takođe optimizovan za potrebe viših polja u proizvodnom procesu. Skrining je obavljen u serumu korišćenjem FLAG oznake jer su u serumu postojala ljudska antitela koja bi mogla izazvati lažno pozitivne rezultate skrininga. Pufer za skrining je bio karbonatni pufer (Krebsov pufer sa Ringerom - standardni pufer, ali drugačiji od PBS-a). Utvrđeno je da generisana uslovno aktivna antitela imaju veći afinitet prema Axl pri pH 6.0, ali niži afinitet prema Axl pri pH 7.4, oba u poređenju sa antitelom divljeg tipa. Neka od odabranih mutantnih antitela (scFv) su predstavljena na slici 2 sa svojom većom aktivnošću pri pH 6.0 nego pri pH 7.4, dok su njihovi odnosi aktivnosti između pH 6.0 i pH 7.4 bili najmanje 11 puta veći (slika 3).
[0609] Dalje, sva ova uslovno aktivna antitela imaju visoke nivoe ekspresije kao što je prikazano u Tabeli 4 ispod, gde kolona „Klon“ prikazuje antitela, a nivo ekspresije „mg/ml“ je prikazan u drugoj koloni.
[0610] Klonovi ovih antitela poslati su dobavljaču usluga sa zahtevanim nivoom ekspresije („naručena količina“, očekivani nivoi ekspresije). Međutim, stvarni nivoi ekspresije ovih antitela („isporučena količina“) bili su veoma visoki i premašili su očekivane nivoe ekspresije.
[0611] Tabela 4. Uslovno aktivna antitela sa visokim nivoima ekspresije
[0614]
[0615] Uslovno aktivna antitela nisu pokazala agregaciju u puferu kao što je prikazano na Slici 4, koristeći antitelo BAP063.9‐13‐1 kao primer. Antitelo BAP063.9‐13‐1 je analizirano pomoću hromatografije isključivanja po veličini. Na Slici 4, detektovan je samo jedan vrh, što pokazuje malu ili nikakvu agregaciju antitela.
[0616] Uslovno aktivna antitela su takođe testirana korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) da bi se izmerile njihove brzine uključivanja i isključivanja na Axl. Poznato je da SPR test meri brzine uključivanja i isključivanja za uslovno aktivna antitela. SPR test je izveden u prisustvu bikarbonata. Brzina uključivanja i isključivanja in vivo (kod životinja i ljudi) uslovno aktivnih antitela je veoma važna karakteristika za uslovno aktivna antitela.
[0617] Primećeno je da uslovno aktivna antitela imaju veći afinitet vezivanja pri pH 6.0 i niži afinitet vezivanja pri pH 7.4, u poređenju sa negativnom kontrolom (BAP06310F10 koji ima sličan afinitet vezivanja i pri pH 6.0 i pri pH 7.4) (Slika 5). Pored toga, podizanje temperature sa sobne temperature na 60 °C ne menja značajno rezultate ELISA testa (Slika 5). ELISA test je takođe pokazao da su ova uslovno aktivna antitela bila visoko selektivna pri pH 6.0 u poređenju sa pH 7.4 (Slike 6A-6B prikazuju jedno antitelo kao primer).
[0618] Uslovno aktivna biološka antitela su sumirana u Tabeli 5. Dva od antitela su eksprimirana kao scFv (BAP063.9-13.3 i BAP063.9-48.3). Inkubacija antitela na 60 °C tokom jednog sata nije promenila afinitet većine antitela („termostabilnost“).
[0619]
[0620]
[0621] Primer 2: Afinitet vezivanja anti-Axl antitela zavisan od pH vrednosti
[0623] Neka od anti-Axl antitela ovog pronalaska testirana su u puferima na različitim pH nivoima. Jedna vrsta pufera bio je KREBS pufer sa 1% prisutnim goveđim serumskim albuminom (BSA). KREBS pufer je titriran da bi imao pH u opsegu od 5-7.4. Afinitet vezivanja antitela sa Axl je meren pomoću ELISA testa (OD<450>) i rezultati su prikazani na slici 7. Dva kontrolna antitela (BAP063-3831 i BAP063-3818) nisu bila uslovno aktivna jer imaju afinitet vezivanja koji nije bio značajno pogođen promenom pH vrednosti. S druge strane, anti-Axl antitela ovog pronalaska su uslovno aktivna jer je njihov afinitet vezivanja sa Axl zavisio od pH vrednosti (slika 7).
[0625] Primer 3: Uništavanje ćelija anti-Axl antitelima
[0627] Aktivnost uništavanja ćelija anti-Axl antitelima ovog pronalaska testirana je korišćenjem A549 ćelija. Rezultati su prikazani na slikama 8A-8E. Aktivnost uništavanja ćelija merena je na dva pH nivoa: 6.0 i 7.4, što predstavlja pH u mikrookruženju tumora i normalan fiziološki pH, respektivno. Procenat uništavanja ćelija pri različitim koncentracijama antitela prikazan je na slikama 8A-8E.
[0628] Dva testa su dala konzistentne rezultate uništavanja ćelija. Negativna kontrola (humanizovani WT sa anti-Axl antitelima) pokazala je sličnu aktivnost uništavanja ćelija pri pH 6.0 i pH 7.4 za A549 ćelije (slika 8A). Nasuprot tome, anti-Axl antitela ovog pronalaska pokazala su značajno veću aktivnost ubijanja ćelija pri pH 6.0 u poređenju sa aktivnošću ubijanja ćelija pri pH 7.4, posebno pri niskim koncentracijama antitela pri kojima antitela nisu zasićila A549 ćelije (slike 8B‐8E).
[0630] Primer 4: Afinitet vezivanja za cyno-Axl od strane anti-Axl antitela
[0632] Afinitet vezivanja za cyno-Axl od strane anti-Axl antitela ovog pronalaska je izmeren i upoređen sa afinitetom vezivanja ljudskog Axl (hAxl) u dva različita pufera pri pH vrednostima od 6.0 i 7.4. Rezultati su prikazani na slikama 9A-9D. Cyno-Axl je Axl protein iz neljudskog primata, naime, majmuna cynomolgus macaque.
[0633] Kontrola (BA-3831-WT) je pokazala sličan afinitet vezivanja i za ljudski Axl (hAxl) i za cynomolgus Axl (cyno-Axl) pri pH vrednostima 6.0 i 7.4 u dva pufera (slika 9A). Anti-Axl antitela ovog pronalaska pokazala su slične profile afiniteta vezivanja za hAxl i cyno-Axl u jednom od dva pufera, tj. niži afinitet vezivanja za cyno-Axl pri pH 7.,4, u poređenju sa afinitetom vezivanja za cyno-Axl pri pH 6.0 (slike 9B-9D). Razlika između afiniteta vezivanja pri pH 6.0 i pH 7.0 u drugom puferu nije bila značajna.
[0635] Primer 5: Citotoksičnost anti-Axl antitela konjugovanih sa duomicinom
[0636] Duomicin je citotoksičan jer inhibira rast ćelija zaustavljanjem sinteze proteina. Jedno od anti-Axl antitela ovog pronalaska, BAP063.9 4007, je konjugovano sa duomicinom. U ovom testu su korišćene dve kontrole, BAP063 humWT i B12 (anti-B12 antitelo), oba su takođe bila konjugovana sa duomicinom.
[0637] Nekoliko ćelijskih linija je tretirano sa tri antitela konjugovana sa duomicinom (BAP063.94007, BAP063 hum WT i B12) pri pH vrednostima 6.0 i 7.4 (slike 10A‐10H). Antitelo BAP063.9 4007 konjugovano sa duomicinom ovog pronalaska pokazalo je značajno veću citotoksičnost prema ćelijskim linijama DU145 (ćelije raka prostate), MDA-MD‐231 (ćelije raka dojke), PL45 (ćelije raka pankreasa) i A549 (ćelije adenokarcinoma) pri pH 6.0 u poređenju sa citotoksičnošću prema istim ćelijama pri pH 7.4.
[0639] Primer 6: Anti-Axl antitela konjugovana sa model toksinom
[0641] Anti-Axl antitelo ovog pronalaska je konjugovano sa model toksinom (npr. gemcitabinom) da bi se proizveo uslovno aktivni konjugat antitela i leka (CAB-Axl-ADC). CAB-Axl-ADC je prvo testiran da bi se potvrdilo da uslovna aktivnost ubijanja ćelija nije izmenjena procesom konjugacije leka. Ovaj test je pokazao da je CAB-Axl-ADC ubio značajno više ćelija pri pH 6.0 nego pri pH 7.4 (Slika 11).
[0642] CAB-Axl-ADC je zatim ubrizgan miševima sa MiaPaCa2 ksenograftnim tumorima u dozi od 1 mg/kg dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. U ovoj studiji je korišćeno nekoliko kontrola, uključujući goli CAB (anti-Axl antitelo bez konjugacije), nosač, sam toksin (nekonjugovani gemcitabilni), kontrolni ADC, afinitetno podudarni anti-Axl ADC (AM ADC). Studija je pokazala da su CAB-Axl-ADC (CAB ADC) i AM ADC obezbedili značajno veće smanjenje veličine tumora, u poređenju sa kontrolama (Slika 12). Nekonjugovano anti-Axl antitelo nije smanjilo veličinu tumora. Ova studija je pokazala da je anti-Axl antitelo konjugovano sa toksinom jednako efikasno u smanjenju veličine tumora kao i afinitetno podudarno antitelo.
[0644] Primer 7: Serumske koncentracije konjugata anti-Axl antitela i leka kod majmuna cinomolgus makakija
[0646] Konjugat leka (duomicin) anti-Axl antitela (CAB-ADC) ovog pronalaska je ubrizgan mužjacima i ženkama majmuna cinomolgus makakija u tri doze: 0.1, 1 i 10 mg/kg. Golo anti-Axl antitelo je korišćeno kao kontrola. Konjugat antitela i leka sa afinitetom (AM-ADC) je takođe korišćen kao kontrola. Serumske koncentracije antitela su merene tokom perioda od jedne nedelje (168 sati, videti slike 13A-13B). CAB-ADC je opstao u serumu majmuna duže nego AM-ADC kontrola (slika 13B). Nije bilo značajne razlike između mužjaka i ženki majmuna (slike 13A-13B).
[0648] Primer 8: Toksičnost konjugata anti-Axl antitela i leka kod majmuna cinomolgus makakije
[0649] Toksičnost CAB-ADC ovog pronalaska testirana je na majmunima cinomolgus makakije. Aspartat transaminaza (AST) i alanin transaminaza (ALT) korišćene su kao indikatori toksičnosti lekova za jetru od strane Američke agencije za hranu i lekove (FDA). Nivoi AST i ALT u serumu mereni su i kod mužjaka i kod ženki majmuna (slike 14A-14B). Nosač (PBS) nije izazvao promenu nivoa AST ili ALT u serumu, dok je odgovarajući konjugat antitela i leka (AM) pokazao veoma visoke nivoe AST i ALT 3 dana nakon doze od 10 mg/kg. CAB-ADC je pokazao značajno smanjene nivoe AST i ALT u poređenju sa kontrolom AM. Ovo je ukazivalo da su konjugati anti-Axl antitela i leka ovog pronalaska imali značajno smanjenu toksičnost za jetru u odnosu na odgovarajući konjugat antitela i leka AM.
[0650] Utvrđeno je da konjugat leka i antitela protiv Axl ovog pronalaska takođe izaziva manje upale kod majmuna (Sl.15). Prikupljen je broj limfocita u krvi majmuna nakon injekcija CAB, AM i PBS. U poređenju sa AM koji je izazvao značajnu upalu, konjugat leka i antitela protiv Axl ovog pronalaska (CAB-ADC) izazvao je samo blagu upalu kod majmuna.
[0652] Primer 9: Eksperimenti in vivo na miševima
[0654] Miševima je implantirana jedna od 2 linije tumorskih ćelija (LCLC103H ili DU145) koje bi se razvile u tumore. Merena je veličina tumora nakon tretmana antitumorskim lekom monometil auristatinE (MMAE). Za miševe koji su primali LCLC103H, miševi su tretirani jednom dozom nosača (kao negativna kontrola), CAB anti-Axl antitelom konjugovanim MMAE ADC (CAB Axl-MMAE) ili MMAE ADCC konjugovanim ne-CAB anti-Axl antitelom (non-CAB Axl-MMAE), slika 16A. Tumori kod miševa tretiranih ADC su se smanjivali, dok su tumori kod miševa tretiranih nosačem nastavili da rastu.
[0655] Dalje, miševi koji su primali DU145 tretirani su nosačem (negativna kontrola) ili CAB anti-Axl antitelom konjugovanim MMAE ADC (CAB Axl-MMAE) u dve različite koncentracije (6 mg/kg i 10 mg/kg). Zapremina tumora je merena tokom vremena. Tumori su nastavili da rastu u negativnoj kontrolnoj grupi (nosač), dok se rast tumora usporio kod miševa tretiranih ADC-ima (slika 16B).
[0656] Podnosilac(i) zahteva nemaju nameru da javno objave bilo koja prikazana izvođenja.

Claims (8)

1. Patentni zahtevi
1. Antitelo ili fragment antitela koje se specifično vezuje na Axl protein, pomenuto antitelo ili fragment antitela koji obuhvata promenljivi region teškog lanca koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca i promenljivi region lakog lanca koji obuhvata ti regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca, pri čemu
promenljivi region teškog lanca jeste kodiran sekvencom DNK izabranom iz sekvenci SEK ID BR: 11‑13,
i
promenljivi region lakog lanca jeste kodiran sekvencom DNK izabranom iz sekvenci SEK ID BR: 7‑10; i
antitelo il fragment antitela ima odnos afiniteta vezivanja na Axl protein pri vrednosti pH od 5,0 do 6,8 u tumoroznom mikookruženju i afiniteta vezivanja na Axl protein pri različitoj vrednosti pH od 7,2 do 7,8 u netumoroznom mikrookruženju od najmanje 1,5:1.
2. Atitelo ili fragment antitela iz patentnog zahteva 1, pri čemu promenljivi region teškog lanca jeste kodiran sekvencom DNK izabranom iz sekvenci SEK ID BR: 11-13, i promenljivi region lakog lanca je kodiran sekvencom DNK izabranom iz sekvenci SEK ID BR: 9‑10.
3. Antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu antitelo ili fragment antitela ima odnos afiniteta vezivanja na Axl protein na vrednosti pH od 5,0 do 6,8 u tumoroznom mikrookruženju i afinitet vezivanja na Axl protein pri različitoj vrednosti pH od 7,2 do 7,8 u netumoroznom mikrookruženju od najmanje 2:1, najmanje 3:1, najmanje 4:1, najmanje 5:1, najmanje 6:1, najmanje 7:1, najmanje 8:1, najmanje 9:1, najmanje 10:1, najmanje 20:1, najmanje 30:1, najmanje 50:1, najmanje 70:1, ili najmanje 100:1.
4. Antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu pH vrednost za tumorozno mikrookruženje jeste 6,0 i pH vrednost za netumorozno mikrookruženje jeste 7,4.
5. Imunokonjugat koji obuhvata antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4.
6. Imunokonjugat iz patentnog tahteva 5, pri čemu taj imunokonjugat obuhvata barem jedan agens izabran iz hemoterapijskog agensa, radioaktivni atom, citostatični agens i citotoksični agens.
7. Imunokonjugat iz patentnog zahteva 6, pri čemu najmanje jedan agens jeste izabran iz majtansinoida, auristatina, dolstatina, kaliheamicina, auristatina, dolastatina, kaliheamicina, pirolobenzodiazepina, i antraciklina.
8. Farmaceutska supstanca koja obuhvata:
antitelo ili fragment antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, ili imunokonjugat iz bilo kog od patentnih zahteva 5-7; i
farmaceutski prihvatljiv nosač.
RS20260153A 2016-04-15 2017-04-13 Anti axl antitela, fragmenti antitela i njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe RS67736B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662323036P 2016-04-15 2016-04-15
EP17783115.3A EP3443012B1 (en) 2016-04-15 2017-04-13 Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
PCT/US2017/027372 WO2017180842A1 (en) 2016-04-15 2017-04-13 Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67736B1 true RS67736B1 (sr) 2026-03-31

Family

ID=60042774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260153A RS67736B1 (sr) 2016-04-15 2017-04-13 Anti axl antitela, fragmenti antitela i njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe

Country Status (17)

Country Link
US (3) US11149088B2 (sr)
EP (2) EP4656204A3 (sr)
JP (5) JP6735355B2 (sr)
KR (5) KR102459684B1 (sr)
CN (1) CN109563164A (sr)
AU (4) AU2017248644B2 (sr)
CA (1) CA3021086C (sr)
ES (1) ES3061236T3 (sr)
HR (1) HRP20260216T1 (sr)
IL (1) IL262173B (sr)
MX (3) MX395074B (sr)
PL (1) PL3443012T3 (sr)
RS (1) RS67736B1 (sr)
SG (1) SG11201808994YA (sr)
SM (1) SMT202600033T1 (sr)
TW (3) TWI844893B (sr)
WO (1) WO2017180842A1 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11542332B2 (en) * 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
EP4656204A3 (en) * 2016-04-15 2026-06-03 BioAtla, Inc. Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
EP4122958A1 (en) 2016-05-13 2023-01-25 BioAtla, Inc. Anti-ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
MX2019002199A (es) 2016-08-31 2019-05-16 Bioatla Llc Polipeptidos condicionalmente activos y métodos para generarlos.
SG10202107808SA (en) 2017-01-18 2021-08-30 F1 Oncology Inc Chimeric antigen receptors against axl or ror2 and methods of use thereof
CN107759691B (zh) * 2017-12-04 2018-09-25 杭州尚健生物技术有限公司 一种特异性结合axl的单克隆抗体
CN110483639A (zh) 2018-05-15 2019-11-22 复旦大学 靶向axl的抗体及抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN110540592B (zh) * 2018-05-29 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 结合axl蛋白的抗体及其应用
CN112513081A (zh) 2018-06-14 2021-03-16 生物蛋白有限公司 多重特异性抗体构建体
CN112823166B (zh) * 2018-09-07 2025-01-24 生物蛋白有限公司 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
MX2021005048A (es) 2018-10-31 2021-09-08 Bioatla Inc Anticuerpos anti-ctla4, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos.
EP3946453A4 (en) * 2019-03-29 2022-12-07 Celldex Therapeutics, Inc. ANTI-AXL ANTIBODIES AND THEIR METHODS OF USE
WO2021013746A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Genmab A/S Axl antibody-drug conjugates for use in treating cancer
MX2023005571A (es) * 2020-11-12 2023-07-31 Bioatla Inc Metodos de tratamiento de canceres que expresan axl con anticuerpos anti-axl, fragmentos de anticuerpos y sus inmunoconjugados.
AU2021451307A1 (en) * 2021-06-16 2024-02-01 Shanghai Sinobay Biotechnology Co., Ltd. Antibody targeting axl protein and antigen binding fragment thereof, preparation method therefor and use thereof
CN116348497B (zh) * 2023-01-05 2023-11-17 浙江时迈药业有限公司 针对axl的抗体及其用途
GEAP202616877A (en) * 2023-06-06 2026-03-25 Biocad Joint Stock Co Monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to axl, and use thereof
WO2025198961A1 (en) * 2024-03-19 2025-09-25 BioAtla, Inc Methods and pharmaceutical composition for the treatment of adenoid cystic carcinoma

Family Cites Families (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Anthracycline immunoconjugates, their production and pharmaceutical compositions containing them
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
EP0731106B1 (en) 1993-10-01 2004-11-17 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin derivatives
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
AU749623B2 (en) 1998-03-26 2002-06-27 Astellas Pharma Inc. Sustained release preparations
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
ES2260570T3 (es) 1998-08-27 2006-11-01 Spirogen Limited Pirrolobenziodiazepinas dimericas.
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
US20050123536A1 (en) 2001-11-20 2005-06-09 Che-Leung Law Treatment of immunological disorders using anti-dc30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
AU2003256266A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-31 Genencor International, Inc. Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
ES2369542T3 (es) 2002-07-31 2011-12-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa.
EP1542723B1 (en) 2002-08-16 2011-02-23 ImmunoGen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ATE421967T1 (de) 2003-03-31 2009-02-15 Council Scient Ind Res Nichtvernetzende pyrroloä2,1-cüä1, 4übenzodiazepine als potentielle antitumor- agentien und ihre herstellung
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
AU2004284075A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
EP1723152B1 (en) 2004-03-09 2015-02-11 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines
US20050260711A1 (en) * 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
NZ551180A (en) 2004-06-01 2009-10-30 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
ES2708763T3 (es) 2005-07-07 2019-04-11 Seattle Genetics Inc Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
DK1813614T3 (da) 2006-01-25 2012-01-23 Sanofi Sa Cytotoksiske midler, der omfatter nye tomaymycinderivater
ZA200900545B (en) 2006-07-18 2010-03-31 Sanofi Aventis Antagonist antibody against EPHA2 for the treatment of cancer
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
PT2019104E (pt) 2007-07-19 2013-12-03 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina e sua utilização terapêutica
BRPI0820073A2 (pt) 2007-11-12 2015-06-23 U3 Pharma Gmbh Anticorpos anti-axl
CN101918452A (zh) 2007-11-15 2010-12-15 中外制药株式会社 与Anexelekto结合的单克隆抗体及其利用
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2240495B1 (en) 2008-02-01 2015-07-15 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
AU2009270988A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
MX355507B (es) 2009-03-09 2018-04-19 Bioatla Llc Proteinas mirac.
AR076564A1 (es) 2009-05-11 2011-06-22 U3 Pharma Gmbh Anticuerpos humanizados de axl(receptor de tirosina quinasa)
DE102009022019A1 (de) 2009-05-15 2010-11-18 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung mit einem die Lage eines mechanischen Bewegteils erfassenden Positionsgebers
CN102549016B (zh) * 2009-06-30 2015-05-06 研究发展基金会 免疫球蛋白fc多肽
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
NZ602220A (en) * 2010-03-11 2014-10-31 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with ph dependent antigen binding
PT2528625E (pt) 2010-04-15 2013-10-17 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
CN103080136B (zh) 2010-06-18 2015-08-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗Axl抗体及使用方法
KR20130096731A (ko) * 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
AU2012273955A1 (en) 2011-06-22 2014-01-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Anti-Axl antibodies and uses thereof
MX2015010777A (es) 2013-03-14 2016-04-25 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-b7-h4.
GB201410825D0 (en) 2014-06-18 2014-07-30 Bergenbio As Anti-axl antibodies
DK3169706T3 (da) * 2014-07-11 2020-03-09 Genmab As Antistoffer, der binder axl
DK3186284T3 (da) 2014-08-28 2022-05-09 Bioatla Inc Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler
US11111288B2 (en) * 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US10513699B2 (en) 2014-09-03 2019-12-24 Bioatla, Llc Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts
US11111505B2 (en) * 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
CN108884460B (zh) 2016-03-19 2023-04-28 埃克苏马生物技术公司 淋巴细胞转导及其扩增调节的方法与组合物
EP4656204A3 (en) 2016-04-15 2026-06-03 BioAtla, Inc. Anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates and uses thereof
MX2019002199A (es) * 2016-08-31 2019-05-16 Bioatla Llc Polipeptidos condicionalmente activos y métodos para generarlos.
SG10202107808SA (en) * 2017-01-18 2021-08-30 F1 Oncology Inc Chimeric antigen receptors against axl or ror2 and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2026017554A (ja) 2026-02-04
CA3021086A1 (en) 2017-10-19
TW202423988A (zh) 2024-06-16
KR20200087875A (ko) 2020-07-21
KR102459684B1 (ko) 2022-10-26
JP2020180152A (ja) 2020-11-05
EP4656204A2 (en) 2025-12-03
KR20210110740A (ko) 2021-09-08
ES3061236T3 (en) 2026-03-31
SG11201808994YA (en) 2018-11-29
TW201833138A (zh) 2018-09-16
AU2020200324B2 (en) 2022-02-24
JP7456658B2 (ja) 2024-03-27
KR20230162730A (ko) 2023-11-28
JP7759130B2 (ja) 2025-10-23
JP6735355B2 (ja) 2020-08-05
TWI917874B (zh) 2026-03-11
AU2025205498A1 (en) 2025-08-14
EP3443012C0 (en) 2025-11-19
CA3021086C (en) 2023-10-17
AU2020200324A1 (en) 2020-02-06
AU2017248644A1 (en) 2018-10-25
US11897959B2 (en) 2024-02-13
MX2022006461A (es) 2022-09-09
US20240199746A1 (en) 2024-06-20
TW202246348A (zh) 2022-12-01
JP2023011607A (ja) 2023-01-24
US20190177417A1 (en) 2019-06-13
MX2018012418A (es) 2019-07-10
US11149088B2 (en) 2021-10-19
WO2017180842A1 (en) 2017-10-19
EP3443012A1 (en) 2019-02-20
JP2019513784A (ja) 2019-05-30
MX395074B (es) 2025-03-24
CN109563164A (zh) 2019-04-02
EP3443012A4 (en) 2019-09-11
TWI771297B (zh) 2022-07-21
KR20180126079A (ko) 2018-11-26
AU2022203222A1 (en) 2022-06-02
IL262173B (en) 2021-06-30
US20210403577A1 (en) 2021-12-30
TWI844893B (zh) 2024-06-11
MX2022010487A (es) 2022-09-21
SMT202600033T1 (it) 2026-03-09
IL262173A (en) 2018-11-29
KR102697688B1 (ko) 2024-08-21
EP4656204A3 (en) 2026-06-03
AU2017248644B2 (en) 2019-10-31
JP7161783B2 (ja) 2022-10-27
KR102606938B1 (ko) 2023-11-29
HRP20260216T1 (hr) 2026-03-27
JP2024088638A (ja) 2024-07-02
KR20220141910A (ko) 2022-10-20
PL3443012T3 (pl) 2026-04-20
AU2022203222B2 (en) 2025-05-15
EP3443012B1 (en) 2025-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
IL262173B (en) Antibodies, antibody fragments and their immunomodules against axl and their uses
IL263481A (en) Antibodies against c5 and their uses
IL267070A (en) Antibodies against ox40 and their uses
PL3347379T3 (pl) Przeciwciała anty-tigit, przeciwciała anty-pvrig i ich połączenia
SMT202500438T1 (it) Anticorpi anti-pacap umanizzati e loro utilizzi
SMT202200432T1 (it) Anticorpi, frammenti anticorpali anti-ror2, loro immunoconiugati e loro usi
IL265689A (en) Antibodies against il-33 and their use
HUE073284T2 (hu) Anti-CD3 antitest és az antitestet tartalmazó molekula
GB201506409D0 (en) Humanized anti-axl antibodies and their conjugates
GB201614162D0 (en) Antibodies, uses thereof and conjugates thereof
IL275264A (en) Anti-C5 antibody combinations and their uses
IL266082A (en) Anti-chikv antibodies and their use
IL264417A (en) Anti-o2 antibodies and their uses
IL266721A (en) Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
GB201609866D0 (en) Antibodies, uses thereof and conjugates thereof
GB201708105D0 (en) Antibodies, uses thereof and conjugates thereof
GB201618515D0 (en) Combinations comprising antibodies, uses and methods