ES3068105T3

ES3068105T3 - Anticuerpo anti-CTLA-4 y uso del mismo

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Publication number: ES3068105T3
Application number: ES19958033T
Authority: ES
Inventors: Hitoshi Katada; Kanako Tatsumi; Yutaka Matsuda; Shun Shimizu; Masaki Kamimura; Yasunori Komori; Yuji Hori; Tomoyuki Igawa; Hiroki Kawauchi; Hiroaki Susumu
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2026-05-27
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: PL4082570T3; JP7624493B2; CN115942956A; FI4082570T3; UA128549C2; BR112022011723A2; KR20220119433A; JPWO2021131021A1; AU2019479791B2; JP2025061475A; KR20240035914A; CN120757649A; PH12022551580A1; CO2022010422A2; JP2024010057A; WO2021131021A1; CR20220357A; CA3162444C; IL294226A; HRP20260650T1

Abstract

La presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 y métodos para su producción y uso. Asimismo, proporciona un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo anti-CTLA-4 y células huésped que contienen dicho ácido nucleico. Además, proporciona un polipéptido que incluye una región Fc variante y métodos para su producción y uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpo anti-CTLA-4 y uso del mismo

[0003] Campo técnico

[0004] La presente descripción se refiere en general a anticuerpos anti-CTLA-4 y métodos de usar los anticuerpos.

[0005] Antecedentes técnicos

[0006] Las células que mutaron debido a mutaciones génicas y demás en organismos vivos se siguen y eliminan por el sistema de vigilancia inmunológica. Sin embargo, la persistencia de respuestas inmunitarias excesivas puede volverse dañino también para el ser, tal como daño a tejidos normales por autoinmunidad. Por tanto, el sistema inmunitario cuenta con un mecanismo de retroalimentación negativa (puntos de control inmunitarios) para suprimir respuestas inmunitarias una vez activadas (véase, por ejemplo, NPL 1). Se considera que los puntos de control inmunitarios desempeñan un papel importante en mantener homeostasis en el sistema inmunitario. Por otra parte, se revela que algunos tumores utilizan puntos de control inmunitarios para escape inmunológico. Actualmente, estudios sobre la función inmunosupresora mediante moléculas de punto de control inmunitario principal, antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4), muerte celular programada 1 (PD-1) y ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1), se persiguen mucho.

[0007] CTLA-4 es una glucoproteína que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas, cuyo gen se clonó de una genoteca de ADNc de clones de células T destructoras derivados de ratones en 1987 (véase, por ejemplo, NPL 2). Se sabe que la respuesta inmunitaria de células T se suprime mediante CTLA-4. Se describió en 1996 que se había observado un efecto de regresión tumoral administrando un anticuerpo anti-CTLA-4 a ratones portadores de cáncer basado en la idea de que el fomento de la activación de células T al suprimir la función de CTLA-4 produce regresión de cáncer (véase, por ejemplo, NPL 3). La evaluación de la eficacia de anticuerpos anti-CTLA-4 en seres humanos se ha realizado desde 2000, y un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 humano (ipilimumab) fue aprobado por la Agencia de Alimentos y Fármacos de los EE UU (FDA) como el primer anticuerpo terapéutico inmunoestimulador del mundo en 2011. También se produjeron muchos anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 diferentes de ipilimumab (véase, por ejemplo, PTL 1, 2, 3, 4 y 12) y su desarrollo como medicamentos se realiza, también en terapias de combinación (véase, por ejemplo, PTL 13). Tales fármacos que inhiben puntos de control inmunitarios para cancelar el mecanismo inmunosupresor, aumentando de esta manera la inmunorreactividad se llaman inhibidores de puntos de control inmunitarios.

[0008] Por otra parte, se ha sabido anteriormente que hay algunas células que tienen una función inmunosupresora entre células T, y se identificaron como células T positivas para CD25 y CD4 en 1995 y nombraron células T reguladoras (véase, por ejemplo, NPL 4). En 2003, se identificó el gen Foxp3, que es un gen maestro que se expresa específicamente en células T reguladoras y regula su desarrollo y función. Foxp3 regula la expresión de varios genes asociados a respuesta inmunitaria como un factor de transcripción. Particularmente, Foxp3 está implicado en la expresión constitutiva de CTLA-4 en células T reguladoras, y se piensa que desempeña un papel importante en la función inmunosupresora por células T reguladoras (véase, por ejemplo, NPL 5).

[0009] La infiltración de células T reguladoras en tejidos tumorales se considera que produce atenuación o inhibición del mecanismo de vigilancia inmunitaria contra el tumor. En efecto, se ha revelado que hay células T reguladoras aumentadas en muchos carcinomas humanos (véase, por ejemplo, NPL 6), y se ha descrito que la infiltración local de células T reguladoras en tumor puede convertirse en un factor pronóstico malo para un paciente de cáncer. Por el contrario, si las células T reguladoras se pueden eliminar de o disminuir en tejidos tumorales, se espera que produzcan inmunidad antitumoral aumentada. Actualmente, el desarrollo de inmunoterapia de cáncer que se dirige a células T reguladoras progresa vigorosamente.

[0010] La administración de un anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab (véase, por ejemplo, NPL 12), aumenta la inmunidad antitumoral, pero se ha descrito que produce enfermedades autoinmunitarias porque sistémicamente aumenta la inmunorreactividad. En un cierto ensayo clínico, se observaron sucesos adversos en el 60% de los pacientes a los que se administró ipilimumab, y muchos de ellos fueron enfermedades autoinmunitarias asociadas con la piel o el aparato digestivo. También en otro ensayo clínico, se ha descrito que aproximadamente la mitad de los pacientes a los que se administró ipilimumab desarrollaron enfermedades autoinmunitarias similares. Para suprimir tales efectos secundarios, en algunos casos, se administra un agente inmunosupresor a un paciente al que se ha administrado ipilimumab. Se desea el desarrollo de un nuevo fármaco que pueda mantener respuestas inmunitarias antitumorales mientras suprime tales efectos secundarios de los inhibidores de puntos de control inmunitarios.

[0011] Las funciones efectoras citotóxicas de los anticuerpos IgG, actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) atraen atención como medios prometedores para obtener efectos antitumorales por anticuerpos (véase, por ejemplo, NPL 7 y 8). Estas funciones efectoras están inducidas por la unión de la región Fc de anticuerpos IgG a receptores de anticuerpos (FcγR) presentes en la superficie de células efectoras tal como células citolíticas naturales y macrófagos o a varios componentes del complemento y también se ha mostrado que estas interacciones son relevantes en inhibición de puntos de control (véase, por ejemplo, NPL 13). Se han realizado muchos estudios en variantes de la región Fc hasta ahora, y se han obtenido variantes que tienen varias propiedades tal como actividad de unión a FcγR mayor que el salvaje (véase, por ejemplo, PTL 5 y 6, y NPL 9 y 10). Además, se ha descrito que la región Fc de anticuerpos se une a FcγR en una proporción de 1:1 y reconoce FcγR asimétricamente en las bisagras inferiores y regiones CH2 (véase, por ejemplo, NPL 11). Basado en esto, también se han descrito métodos de optimizar la interacción con FcγR introduciendo diferentes alteraciones en dos cadenas polipeptídicas que constituyen la región Fc de un anticuerpo y produciendo variantes de la región Fc asimétricas (véase, por ejemplo, PTL 7, 8, 9 y 10). Es deseable que cuando se administra un anticuerpo terapéutico a un organismo vivo, su antígeno diana se exprese específicamente solo en los sitios de lesión. Sin embargo, en muchos casos el mismo antígeno se expresa también en sitios de no lesión, tejidos normales, y puede producir efectos secundarios que son indeseables en términos de terapia. Por ejemplo, aunque un anticuerpo contra un antígeno tumoral puede ejercer actividad citotóxica contra células tumorales por ADCC y demás, cuando el mismo antígeno se expresa en tejidos normales también, el anticuerpo también puede dañar células normales. Para resolver el problema anterior, se ha desarrollado una tecnología que se enfoca en el fenómeno que una gran cantidad de un compuesto particular está presente en un tejido diana (por ejemplo, un tejido tumoral) y crea una molécula de unión a antígeno cuya actividad de unión a antígeno cambia dependiendo de la concentración del compuesto (véase, por ejemplo, PTL 11).

[0012] Lista de citas

[0013] [Bibliografía de patentes]

[0014] [PTL 1] WO 2000/037504

[0015] [PTL 2] WO 2001/014424

[0016] [PTL 3] WO 2012/120125

[0017] [PTL 4] WO 2016/196237

[0018] [PTL 5] WO 2000/042072

[0019] [PTL 6] WO 2006/019447

[0020] [PTL 7] WO 2012/058768

[0021] [PTL 8] WO 2012/125850

[0022] [PTL 9] WO 2013/002362

[0023] [PTL 10] WO 2014/104165

[0024] [PTL 11] WO 2013/180200

[0025] [PTL 12] US 2019/0241662

[0026] [PTL 13] WO 2018/223182

[0027] [Bibliografía no de patentes]

[0028] [NPL 1] Pardoll, Nat Rev Cancer (2012) 12: 252-264

[0029] [NPL 2] Brunetet al.,Nature (1987) 328: 267-270

[0030] [NPL 3] Leachet al.,Science (1996) 271: 1734-1736

[0031] [NPL 4] Sakaguchiet al.,J Immunol (1995) 155: 1151-1164

[0032] [NPL 5] Takahashiet al.,J Exp Med (2000) 192: 303-310

[0033] [NPL 6] Nishikawa & Sakaguchi, Int J Cancer (2010) 127: 759-767

[0034] [NPL 7] Clyneset al.,Proc Natl Acad Sci U S A (1998) 95: 652-656

[0035] [NPL 8] Clyneset al.,Nat Med (2000) 6: 443-446

[0036] [NPL 9] Lazaret al.,Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103: 4005-4010

[0037] [NPL 10] Chuet al.,Mol Immunol (2008) 45: 3926-3933

[0038] [NPL 11] Radaevet al.,J Biol Chem (2001) 276: 16469-16477

[0039] [NPL 12] Ramagopalet al.,Proc Natl Acad Sci U S A (2017) 114: 4223-4232

[0040] [NPL 13] Chenet al.,Front Immunol (2019) 10: 00292

[0041] Compendio de la invención

[0042] [Problema técnico]

[0043] La descripción proporciona anticuerpos anti-CTLA-4 y métodos de usar los anticuerpos. También se divulgan anticuerpos que comprenden una región Fc variante y métodos de producir los anticuerpos. La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones.

[0044] [Solución al problema]

[0045] Más específicamente, la presente invención proporciona [1] a [7] siguientes.

[0046] [1] Un anticuerpo anti-CTLA-4, que comprende:

[0047] (1) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 83 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 97; (2) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 86 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 134; (3) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 136 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 95; (4) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146;

[0048] (5) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146;

[0049] (6) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147;

[0050] (7) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147;

[0051] (8) una primera región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146 y una segunda región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146; o

[0052] (9) una primera región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147 y una segunda región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147.

[0053] [2] Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de [1].

[0054] [3] Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de [2].

[0055] [4] Un método para producir un anticuerpo en donde el método comprende cultivar la célula huésped de [3] de modo que se produzca el anticuerpo.

[0056] [5] Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de [1] y un soporte farmacéuticamente aceptable.

[0057] [6] La formulación farmacéutica de [5] para uso en tratar un tumor.

[0058] [7] La formulación farmacéutica para uso de [6], en donde el tumor es cáncer de mama o cáncer de hígado.

[0059] Breve descripción de los dibujos

[0060] La figura 1 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 ABAM004 a CTLA-4, actividad de unión que depende de la concentración de ATP, ADP o AMP como se describe en el ejemplo 1-9.

[0061] La figura 2 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 ABAM004 a células que expresan CTLA-4, actividad de unión que depende de la concentración de AMP como se describe en el ejemplo 1-10.

[0062] La figura 3 muestra la actividad ADCC del anticuerpo anti-CTLA-4 ABAM004 a células que expresan CTLA-4 en presencia y ausencia de AMP como se describe en el ejemplo 1-11.

[0063] La figura 4 muestra la actividad de unión del fragmento Fab de ABAM004 y AMP como se describe en el ejemplo 2-13. En la figura, la cadena pesada del anticuerpo se indica en negro, la cadena ligera en gris, y AMP en un modelo de barras y esferas. Los residuos de aminoácidos que forman interacción con AMP se indican en un modelo de barras. Las líneas discontinuas y sus valores indican la distancia (Å) entre cada residuo de aminoácido y AMP.

[0064] La figura 5 muestra el modo de unión del fragmento Fab de ABAM004, AMP y CTLA4 humano (hCTLA4) como se describe en el ejemplo 2-14. En la figura, la cadena pesada del anticuerpo se indica en negro, la cadena ligera en gris, hCTLA4 en blanco, y AMP en un modelo de barras y esferas. Los residuos de aminoácidos de hCTLA4 que comprenden uno o más átomos no hidrógeno localizados en una distancia de 4,2 Å de cualquier parte del anticuerpo o AMP se toman como un epítopo y se indican en un modelo de barras.

[0065] La figura 6 muestra el mapeo del epítopo del fragmento Fab de ABAM004 en la secuencia de aminoácidos de hCTLA4 como se describe en el ejemplo 2-14. En la figura, los residuos de aminoácidos indicados en negro son los de hCTLA4 que comprenden uno o más átomos no hidrógeno localizados en una distancia de 4,2 Å de cualquier parte de ABAM004 o AMP en la estructura cristalina. Los residuos de aminoácidos indicados en gris muestran residuos cuyo modelo no se construyó porque estaban desordenados en la estructura cristalina.

[0066] La figura 7 es una figura superpuesta de estructuras del anticuerpo y AMP extraídas de estructuras cristalinas del fragmento Fab de ABAM004 solo, un complejo del fragmento Fab de ABAM004 y AMP y un complejo ternario del fragmento Fab de ABAM004, AMP y CTLA4, como se describe en el ejemplo 2-15. En la figura, la cadena pesada del anticuerpo se indica en negro, la cadena ligera en gris, y AMP en un modelo de barras y esferas. La estructura del fragmento Fab de ABAM004 solo está indicada por la línea delgada, la estructura del complejo binario con AMP por la línea de espesor medio, y la estructura del complejo ternario por la línea gruesa.

[0067] La figura 8 muestra la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 ABAM004 y su variante, 04H0150/04L0072, a CTLA-4, actividad de unión que depende de la concentración de ATP, ADP o AMP como se describe en el ejemplo 3-2. Como notaciones en la figura, WT y H150L072 indican ABAM004 y 04H0150/04L0072, respectivamente.

[0068] La figura 9 muestra la actividad de neutralización del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1077 contra CTLA-4, actividad de neutralización que depende de la concentración de ATP como se describe en el ejemplo 3-6.

[0069] La figura 10 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 mNS-mFa55 (anticuerpo control) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular FM3A, como se describe en el ejemplo 3-7-4. El anticuerpo se administró a 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo n = 4.

[0070] La figura 11 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1208-mFa55 (anticuerpo interruptor) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular FM3A, como se describe en el ejemplo 3-7-4. El anticuerpo se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo n = 4.

[0071] La figura 12 muestra los cambios en la proporción de células Treg efectoras en un tumor cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 mNS-mFa55 (anticuerpo control) o SW1208-mFa55 (anticuerpo interruptor) se administró en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular FM3A, como se describe en el ejemplo 3-7-7. El anticuerpo mNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 100 mg/kg a través de la vena de la cola, y SW1208-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg a través de la vena de la cola. El tumor se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en Treg efectoras se evaluó por análisis FACS, El eje longitudinal es la proporción de células Treg efectoras (CD4<+>FoxP3<+>KLRG1<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0072] La figura 13 muestra los cambios en la proporción de células T cooperadoras activadas en el bazo cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 mNS-mFa55 (anticuerpo control) o SW1208-mFa55 (anticuerpo interruptor) se administró en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular FM3A, como se describe en el ejemplo 3-7-8. El anticuerpo mNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 100 mg/kg a través de la vena de la cola, y SW1208-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg a través de la vena de la cola. El bazo se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en T cooperadoras activadas se evaluó por análisis FACS, El eje longitudinal es la proporción de células T cooperadoras activadas (CD4<+>FoxP3<->ICOS<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0073] La figura 14 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1208-mFa55 (anticuerpo interruptor) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 4-3-5. El anticuerpo se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 100 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo n = 4.

[0074] La figura 15 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 mNS-mFa55 (anticuerpo control) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 4-3-5. El anticuerpo se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo n = 4.

[0075] La figura 16 muestra los cambios en la proporción de células Treg efectoras en un tumor cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 hNS-mFa55 (anticuerpo control) o SW1389-mFa55 (anticuerpo interruptor) se administró en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 4-3-8. hNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg, y SW1389-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg a través de la vena de la cola. El tumor se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en Treg efectoras se evaluó por análisis FACS. El eje longitudinal es la proporción de células Treg efectoras (CD4<+>FoxP3<+>CCR7<bajo>KLRG1<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0076] La figura 17 muestra los cambios en la proporción de células T cooperadoras activadas en el bazo cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 hNS-mFa55 (anticuerpo control) o SW1389-mFa55 (anticuerpo interruptor) se administró en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 4-3-9. hNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg, y SW1389-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg a través de la vena de la cola. El bazo se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en T cooperadoras activadas se evaluó por análisis FACS. El eje longitudinal es la proporción de células T cooperadoras activadas (CD4<+>FoxP3<->ICOS<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0077] La figura 18 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1610-mFa55 (anticuerpo interruptor) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 5-4-5. El anticuerpo se administró a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, y 3 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo, n = 5.

[0078] La figura 19 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1612-mFa55 (anticuerpo interruptor) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 5-4-5. El anticuerpo se administró a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, y 3 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo, n = 5.

[0079] La figura 20 muestra el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CTLA-4 SW1615-mFa55 (anticuerpo interruptor) en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 5-4-5. El anticuerpo se administró a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, y 3 mg/kg a través de la vena de la cola. Cada punto representa el volumen tumoral medio de un grupo, n = 5.

[0080] La figura 21 muestra los cambios en la proporción de células Treg efectoras en un tumor cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, o SW1615-mFa55 (todos los cuales son anticuerpos interruptores) se administraron en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 5-4-8. SW1610-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, SW1612-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, SW1615-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg, y el anticuerpo control negativo KLH-mFa55 se administró a 400 mg/kg, a través de la vena de la cola. El tumor se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en Treg efectoras se evaluó por análisis FACS. El eje longitudinal es la proporción de células Treg efectoras (CD4<+>FoxP3<+>CCR7<bajo>KLRG1<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0081] La figura 22 muestra los cambios en la proporción de células T cooperadoras activadas en el bazo cuando el anticuerpo anti-CTLA-4 SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, o SW1615-mFa55 (todos los cuales son anticuerpos interruptores) se administraron en un modelo de ratón trasplantado con la línea celular Hepa1-6/hGPC3, como se describe en el ejemplo 5-4-9. SW1610-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, SW1612-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, SW1615-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg, y el anticuerpo control negativo KLH-mFa55 se administró a 400 mg/kg, a través de la vena de la cola. El bazo se recogió seis días después de la administración, y el aumento o disminución en T cooperadoras activadas se evaluó por análisis FACS. El eje longitudinal es la proporción de células T cooperadoras activadas (CD4<+>FoxP3<->ICOS<+>) respecto a CD45<+>. Se muestra el valor medio de n = 3.

[0082] La figura 23 muestra una comparación de la actividad ADCCin vitrode anticuerpos que tienen varias regiones constantes alteradas con unión aumentada a FcγR, como se describe en el ejemplo 6-2. Como notaciones en la figura, IgG1 representa MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT, GASDALIE representa MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT, ART6 representa MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT, y ART8 representa MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-H1443/MDX10D1L-k0MT. Aquí, IgG1 es un anticuerpo que tiene una región constante control, GASDALIE es un anticuerpo que tiene una región constante descrita en una referencia del estado de la técnica, y ART6 y ART8 son anticuerpos que tienen una región constante alterada producidos en el ejemplo 6-1.

[0083] La figura 24 muestra una comparación de la actividad ADCPin vitrode anticuerpos que tienen varias regiones constantes alteradas con unión aumentada a FcγR, como se describe en el ejemplo 6-3. Como notaciones en la figura, IgG1 representa MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT, GASDALIE representa MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT, ART6 representa MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT, y ART8 representa MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-H1443/MDX10D1L-k0MT. Aquí, IgG1 es un anticuerpo que tiene una región constante control, GASDALIE es un anticuerpo que tiene una región constante descrita en una referencia del estado de la técnica, y ART6 y ART8 son anticuerpos que tienen una región constante alterada producidos en el ejemplo 6-1.

[0084] La figura 25 muestra la actividad ADCCin vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1389-ART6 que tiene una región constante alterada con unión aumentada a FcγR, como se describe en el ejemplo 6-4.

[0085] La figura 26 muestra la actividad ADCCin vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1610-ART6 que tiene una región constante alterada con unión aumentada a FcγR, como se describe en el ejemplo 6-4.

[0086] La figura 27 muestra la actividad ADCCin vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1612-ART6 que tiene una región constante alterada con unión aumentada a FcγR, como se describe en el ejemplo 6-4.

[0087] La figura 28 muestra la actividad neutralizante del anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1389 contra CTLA4 (la actividad para cancelar la señal de CTLA4 que actúa de una manera inhibidora contra la activación de células efectoras), como se describe en el ejemplo 6-5.

[0088] La figura 29 muestra la actividad neutralizante del anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1610 contra CTLA4 (la actividad para cancelar la señal de CTLA4 que actúa de una manera inhibidora contra la activación de células efectoras), como se describe en el ejemplo 6-5.

[0089] La figura 30 muestra la actividad neutralizante del anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1612 contra CTLA4 (la actividad para cancelar la señal de CTLA4 que actúa de una manera inhibidora contra la activación de células efectoras), como se describe en el ejemplo 6-5.

[0090] La figura 31 muestra la actividad neutralizante del anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1615 contra CTLA4 (la actividad para cancelar la señal de CTLA4 que actúa de una manera inhibidora contra la activación de células efectoras), como se describe en el ejemplo 6-5.

[0091] La figura 32 muestra la actividad citotóxicain vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1389-ART5+ACT1 contra células T reguladoras positivas para CTLA4, como se describe en el ejemplo 6-6.

[0092] La figura 33 muestra la actividad citotóxicain vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1389-ART6+ACT1 contra células T reguladoras positivas para CTLA4, como se describe en el ejemplo 6-6.

[0093] La figura 34 muestra la actividad citotóxicain vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1610-ART5+ACT1 contra células T reguladoras positivas para CTLA4, como se describe en el ejemplo 6-6.

[0094] La figura 35 muestra la actividad citotóxicain vitrodel anticuerpo interruptor anti-CTLA4 SW1610-ART6+ACT1 contra células T reguladoras positivas para CTLA4, como se describe en el ejemplo 6-6.

[0095] Descripción de formas de realización

[0096] Las técnicas y procedimientos descritos o referenciados en el presente documento en general los entiende bien y comúnmente emplean usando metodología convencional los expertos en la materia, tal como, por ejemplo, las metodologías muy utilizadas descritas en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel,et al.,eds., (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mulliset al.,eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganet al.,eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (VT. DeVitaet al.,eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

[0097] 1. Definiciones

[0098] A menos que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Singletonet al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y.

[0099] 1992), proporcionan a un experto en la materia una guía general a muchos de los términos usados en la presente solicitud.

[0100] Para fines de interpretar la presente especificación, las siguientes definiciones aplican y cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluyen el plural y viceversa. Se debe entender que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir formas de realización particulares solo, y no se pretende que sea limitante.

[0101] Un “marco humano aceptor” para los fines en el presente documento es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos del marco de un dominio variable de cadena ligera (VL) o marco de un dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define posteriormente. Un marco humano aceptor “derivado de” un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos del mismo, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas formas de realización, el número de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas formas de realización, el marco humano aceptor VL es idéntico en secuencia a la secuencia marco de inmunoglobulina humana VL o secuencia marco consenso humana.

[0102] “Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que inmunoglobulina secretada unida a receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana que porta antígeno y posteriormente destruir la célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcγRIII solo, mientras los monocitos expresan FcγRI, FcγRII, y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCCin vitro, tal como el descrito en la patente en EE UU No.5.500.362 o 5.821.337, o la patente en EE UU No.6.737.056 (Presta). Alternativamente, o además, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede evaluarin vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clyneset al. PNAS (USA)95: 652-656 (1998). La “actividad citotóxica” incluye, por ejemplo, actividad de citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC) como se ha mencionado anteriormente, actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) como se menciona posteriormente, y actividad citotóxica mediada por células T. Actividad CDC significa la actividad citotóxica por el sistema del complemento. Por otra parte, actividad ADCC significa la actividad en que un anticuerpo se une a un antígeno presente en la superficie celular de una célula diana y una célula efectora se une además al anticuerpo, y mediante ello la célula efectora daña la célula diana. Si un anticuerpo de interés tiene actividad ADCC y si un anticuerpo de interés tiene actividad CDC se puede medir por métodos conocidos (por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Capítulo 7, Immunologic studies in humans, editado por Coliganet al.(1993)).

[0103] “Actividad neutralizante” se refiere a la actividad de un anticuerpo para inhibir alguna actividad biológica uniéndose a una molécula implicada en la actividad biológica. En algunas formas de realización, la actividad biológica se presenta por la unión entre un ligando y un receptor. En ciertas formas de realización, un anticuerpo inhibe la unión entre un ligando y un receptor uniéndose al ligando o al receptor. Los anticuerpos que tienen tal actividad neutralizante se llaman anticuerpos neutralizantes. La actividad neutralizante de una cierta sustancia de prueba se puede medir comparando la actividad biológica en presencia de un ligando entre condiciones en presencia y ausencia de la sustancia de prueba.

[0104] El término “fagocitosis celular dependiente de anticuerpo” o “ADCP” significa el proceso en el que o todo o parte de una célula recubierta por un anticuerpo se incorpora en células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a una región Fc de inmunoglobulina.

[0105] El término “actividad de unión” se refiere a la potencia de la suma total de interacciones no covalentes entre uno o más sitios de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). En el presente documento, “actividad de unión” no está estrictamente limitado a una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). Por ejemplo, cuando miembros de un par de unión reflejan una interacción 1:1 monovalente, la actividad de unión se refiere a la afinidad de unión intrínseca (“afinidad”). Cuando un miembro de un par de unión es capaz de unión tanto monovalente como multivalente, la actividad de unión es la suma de cada potencia de unión. La actividad de unión de una molécula X a su compañero Y en general se puede representar como la constante de disociación (KD) o “cantidad de unión de analito por cantidad unidad de ligando”. La actividad de unión se puede medir por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Se describen a continuación formas de realización ilustrativas y ejemplares específicas para medir la actividad de unión.

[0106] Un anticuerpo “madurado por afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), comparado con un anticuerpo parental que no posee tales alteraciones, tales alteraciones producen una mejora en la afinidad del anticuerpo por un antígeno.

[0107] Los términos “anticuerpo anti-CTLA-4” y “un anticuerpo que se une a CTLA-4” se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a CTLA-4 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como un agente diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a CTLA-4. En una forma de realización, el nivel de unión de un anticuerpo anti-CTLA-4 a una proteína no CTLA-4 no relacionada es menor de aproximadamente el 10% de unión del anticuerpo a CTLA-4 medido, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas formas de realización, un anticuerpo que se une a CTLA-4 tiene una constante de disociación (KD) de 1 μM o menor, 100 nM o menor, 10 nM o menor, 1 nM o menor, 0,1 nM o menor, 0,01 nM o menor, o 0,001 nM o menor (por ejemplo, 10<-8>M o menor, por ejemplo, de 10<-8>M a 10<-13>M, por ejemplo, de 10<-9>M a 10<-13>M). En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 se une a un epítopo de CTLA-4 que está conservado entre CTLA-4 de diferentes especies.

[0108] El término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

[0109] Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

[0110] Un “anticuerpo que se une al mismo epítopo” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en, por ejemplo, el 50% o más, y/o, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en, por ejemplo, el 50% o más. Un ensayo se competición ejemplar se proporciona en el presente documento.

[0111] “Enfermedad autoinmunitaria” se refiere a una enfermedad no maligna o trastorno que surge de y dirigida contra los propios tejidos de un individuo. Las enfermedades autoinmunitarias en el presente documento específicamente excluyen enfermedades o afecciones malignas o cancerosas, especialmente excluyen linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas y leucemia mieloblástica crónica. Los ejemplos de trastornos o enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no están limitados a, respuestas inflamatorias tal como enfermedades inflamatorias de la piel incluyendo psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); esclerodermia sistémica y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad intestinal inflamatoria (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); síndrome de dificultad respiratoria (incluyendo síndrome de dificultad respiratoria del adulto; SDRA); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; afecciones alérgicas tal como as eczema y asma y otras afecciones que implican infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico (LES) (incluyendo, pero no limitado a nefritis lúpica, lupus cutáneo); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; tiroiditis de Hashimoto; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjogren; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas por citoquinas y linfocitos T típicamente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que implican diapédesis de leucocitos; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesión de múltiples órganos; anemia hemolítica (incluyendo, pero no limitada a, crioglobulinemia o anemia de Coombs positive); miastenia grave; enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolípido; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide bulloso; pénfigos; poliendocrinopatías autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; síndrome del hombre rígido; enfermedad de Behcet; arteritis de células gigantes; nefritis de complejo inmunitario; nefropatía de IgA; nefropatías de IgM; purpura trombocitopénica inmunitaria (ITP) o trombocitopenia autoinmunitaria.

[0113] Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por crecimiento/proliferación celular sin regular. Los ejemplos de cáncer incluyen cáncer de mama y cáncer de hígado.

[0115] El término “citotoxicidad celular dependiente del complemento” o “CDC” significa un mecanismo para inducir muerte celular en que el dominio efector Fc de un anticuerpo unido a una diana activa una serie de reacciones enzimáticas, produciendo la formación de agujeros en la membrana de la célula diana. Típicamente, el complejo antígenoanticuerpo formado en la célula diana se une a y activa el componente del complemento C1q, que a su vez activa la cascada del complemento y produce la muerte de la célula diana. Además, la activación del complemento también puede producir el depósito de componentes del complemento en la superficie de la célula diana, que lleva a la unión a receptores del complemento (por ejemplo, CR3) en leucocitos y mediante ello fomenta ADCC.

[0117] Un “agente quimioterapéutico” se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tal como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN (marca registrada)); sulfonatos de alquilo tal como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilol melaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL (marca registrada)); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecano (HYCAMTIN (marca registrada)), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR (marca registrada)), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptofcina 1 y criptofcina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tal como clorambucilo, clornafacina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimustina; antibióticos tal como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma1I y calicheamicina omegal1 (véase, por ejemplo, Nicolaouet al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl.,33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor oral de integrina alfa-4; dinemicina, incluyendo dinemicina A; esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carubicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN (marca registrada)), morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma doxorubicina HCl (DOXIL (marca registrada)), doxorubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET (marca registrada)), doxorubicina liposomal peglilada (CAELYX (marca registrada)), y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tal como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR (marca registrada)), tegafur (UFTORAL (marca registrada)), capecitabina (XELODA (marca registrada)), una epotilona, y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-suprarrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido folínico; aceglatona; aldofosfamide glucósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatrexato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides tal como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK (marca registrada) complejo de polisacáridos (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE (marca registrada), FILDESIN (marca registrada)); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL (marca registrada)), formulación de nanopartículas manipuladas de albumina de paclitaxel (ABRAXANE<TM>), y docetaxel (TAXOTERE (marca registrada)); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tal como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo ELOXATIN (marca registrada)), y carboplatino; vincas, que previenen la polimerización de tubulina de formar microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBAN (marca registrada)), vincristina (ONCOVIN (marca registrada)), vindesina (ELDISINE (marca registrada), FILDESIN (marca registrada)), y vinorelbina (NAVELBINE (marca registrada)); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN (marca registrada)); bisfosfonatos tal como clodronato (por ejemplo, BONEFOS (marca registrada) u OSTAC (marca registrada)), etidronato (DIDROCAL (marca registrada)), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA (marca registrada)), alendronato (FOSAMAX (marca registrada)), pamidronato (AREDIA (marca registrada)), tiludronato (SKELID (marca registrada)), o risedronato (ACTONEL (marca registrada)); troxacitabina (un análogo de citosina nucleosídico 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación celular anómalas, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tal como vacuna THERATOPE (marca registrada) y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN (marca registrada), vacuna LEUVECTIN (marca registrada), y vacuna VAXID (marca registrada); inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN (marca registrada)); rmRH (por ejemplo, ABARELIX (marca registrada)); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT (marca registrada), Pfizer); perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteosoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE (marca registrada)); CCI-779; tipifarnib (R11577); sorafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE (marca registrada)); pixantrona; inhibidores de EGFR (véase la definición posteriormente); inhibidores de tirosina quinasas (véase la definición posteriormente); inhibidores de serina-treonina quinasas tal como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE (marca registrada)); inhibidores de farnesiltransferasa tal como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR<TM>); y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, tal como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN<TM>) combinado con y 5-FU y leucovorina.

[0119] El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en que una porción de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.

[0121] La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman α, δ, ε, γ, y μ, respectivamente.

[0123] El término “agente citotóxico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o causa muerte celular o destrucción. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no están limitados a, isótopos radioactivos (por ejemplo,<211>At,<131>I,<125>I,<90>Y,<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<212>Pb e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, epotósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tal como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tal como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los varios agentes quimioterapéuticos divulgados anteriormente.

[0125] “Células efectoras” se refiere a leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En ciertas formas de realización, las células expresan al menos FcγRIII y realizan función(es) efectora(s) ADCC. Los ejemplos de leucocitos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP), células citolíticas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas, y neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre. En ciertas formas de realización, las células efectoras pueden ser células efectoras humanas.

[0126] “Funciones efectoras” se refiere a esas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP); disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.

[0127] El término “epítopo” incluye cualquier determinante capaz de unirse a un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno que se une a un anticuerpo que se dirige al antígeno, e incluye aminoácidos específicos que entran en contacto directamente con el anticuerpo. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tal como aminoácidos, cadenas laterales glucídicas, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. En general, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular preferentemente reconocen un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

[0128] El término “receptor de Fc” o “FcR” se refiere a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR nativo humano. En algunas formas de realización, un FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (o receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas con ayuste alternativo de esos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase, por ejemplo, Daeron,Annu. Rev. Immunol.15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol9: 457-492 (1991); Capelet al., Immunomethods4: 25-34 (1994); y de Haaset al., J. Lab. Clin. Med.126: 330-341 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento.

[0129] El término “receptor de Fc” o “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol.117: 587 (1976); y Kimet al., J. Immunol.24: 249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de inmunoglobulinas. Se conocen métodos de medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward.,Immunol. Today18(12): 592-598 (1997); Ghetieet al., Nature Biotechnology,15(7): 637-640 (1997); Hintonet al., J. Biol. Chem.279(8): 6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hintonet al.)).

[0130] La unión a FcRn humanoin vivoy la semivida en suero de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano se puede ensayar, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran anticuerpos con una región Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. Véase también, por ejemplo, Shieldset al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).

[0131] El término “región Fc” en el presente documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. En una forma de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humano se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina (Lys447) o glicina-lisina (Gly446-Lys447) C-terminal de la región Fc puede o puede no estar presente. A menos que se especifique otra cosa en el presente documento, la numeración de residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es según el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0132] El término “anticuerpo que comprende la región Fc” se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) o glicina-lisina C-terminales (residuos 446-447) de la región Fc se pueden eliminar, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o por manipulación recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Según esto, una composición que comprende un anticuerpo que tienen una región Fc según esta invención puede comprender un anticuerpo con G446-K447, con G446 y sin K447, con todo G446-K447 eliminado, o una mezcla de los tres tipos de anticuerpos descritos anteriormente.

[0133] El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (Véase, por ejemplo, Kindtet al., Kuby Immunology,6ª ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, se pueden aislar anticuerpos que se unen a un antígeno particular usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una genoteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolanoet al., J. Immunol.150: 880-887 (1993); Clarksonet al., Nature352: 624-628 (1991).

[0134] “Marco” o “FR” se refiere a residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable en general consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Según esto, las secuencias HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)- FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0135] Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo entero” se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

[0136] Una “región Fc funcional” posee una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” ejemplares incluyen unión a C1q; CDC; unión al receptor de Fc: ADCC; fagocitosis; disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras en general requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar usando varios ensayos como se divulga, por ejemplo, en las definiciones en el presente documento.

[0137] Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Un “marco consenso humano” es un marco que representa los residuos de aminoácidos que se dan más comúnmente en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominios variables. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,Quinta Edición, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. En una forma de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo κI como en Kabatet al., anteriormente. En una forma de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabatet al., anteriormente.

[0138] Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas formas de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todo o sustancialmente todos de las HVR (por ejemplo, CDR) corresponde a esos de un anticuerpo no humano, y todo o sustancialmente todos de las FR corresponde a esas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.

[0139] El término “región hipervariable” o “HVR” como se usa en el presente documento se refiere a cada una de las regiones del dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en secuencia (“regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”) y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”) y/o contienen los residuos de contacto con el antígeno (“contactos de antígeno”). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen: (a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J.Mol. Biol.196: 901-917 (1987));

[0140] (b) CDR que se producen en los residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), y 95-102 (H3) (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991));

[0141] (c) contactos de antígeno que se producen en los residuos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), y 93-101 (H3) (MacCallumet al., J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); y

[0142] (d) combinaciones de (a), (b), y/o (c) incluyendo residuos de aminoácidos HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), y 94-102 (H3).

[0143] A menos que se indique otra cosa, los residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se numeran en el presente documento según Kabatet al., anteriormente.

[0144] Un “inmunoconjugado” es un anticuerpo conjugado a una o más molécula(s) heteróloga(s), incluyendo, pero no limitado a, un agente citotóxico.

[0145] Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas formas de realización, un anticuerpo se purifica a más del 95% o 99% de pureza determinado por, por ejemplo, electroforética (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Para una revisión de métodos para evaluar la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatmanet al., J. Chromatogr B848: 79-87 (2007).

[0146] Un ácido nucleico “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. “Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo” se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesada y ligera (o fragmentos de las mismas), incluyendo tal(es) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y tal(es) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

[0147] El término “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.

[0148] Los términos “célula huésped”, “línea celular huésped”, y “cultivo celular huésped” se usan de forma intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin consideración al número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula parental, sino que puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se cribó o seleccionó en la célula originalmente transformada se incluyen en el presente documento.

[0149] El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. Al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere producción del anticuerpo por un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar según la presente invención se pueden hacer por una variedad de técnicas incluyendo, pero no limitadas a, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que tienen todo o parte de los loci de inmunoglobulinas humanas, tales métodos y otros métodos ejemplares para hacer anticuerpos monoclonales se describen en el presente documento.

[0150] Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una fracción heteróloga (por ejemplo, una fracción citotóxica) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

[0151] “Anticuerpos nativos” se refiere a moléculas de inmunoglobulinas naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestos de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio de la cadena pesada variable o dominio variable de la cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Similarmente, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio de la cadena ligera variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio de cadena ligera constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (κ) y lambda (λ), basado en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

[0152] Una “región Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos no A y A); región Fc IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc IgG4 humana de secuencia nativa, así como variantes naturales de las mismas.

[0153] Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación (alteración) de aminoácido, preferiblemente una o más sustitución(es) de aminoácido. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido comparada con una región Fc de secuencia nativa o la región Fc de un anticuerpo parental, por ejemplo, desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del anticuerpo parental. La región Fc variante en el presente documento preferiblemente posee al menos aproximadamente el 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un anticuerpo parental, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de homología con la misma, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de homología con la misma.

[0154] “Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias en introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que están dentro de las capacidades en la técnica, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como BALST, BLAST-2, ALIGN, software Megalign (DNASTAR), o GENETYX (marca registrada) (Genetyx Co., Ltd.). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para alcanzar alineamiento máximo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

[0155] El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los EE UU, Washington D.C, 20559, donde se registró con el Número de registro de derechos de autor de EE UU TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc. San Franciso Sur, California, o se puede compilar del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia son ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0156] En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con, o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

[0157] 100 veces la fracción X/Y

[0158] donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A menos que específicamente se indique otra cosa, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.

[0159] El término “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.

[0160] Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tal como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). El individuo o sujeto puede ser un humano.

[0161] Un “soporte farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un principio activo, que es no tóxico para un sujeto. Un soporte farmacéuticamente aceptable incluye, pero no está limitado a, un tampón, excipiente, estabilizante, o conservante.

[0162] Una “cantidad eficaz” de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0163] El término “prospecto” se usa para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en embalajes comerciales de productos terapéuticos, que pueden contener información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias respecto al uso de tales productos terapéuticos.

[0164] El término “CTLA-4”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CTLA-4 nativo de cualquier fuente vertebrada, incluyendo mamíferos tal como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique otra cosa. El término abarca CTLA-4 sin procesar “de longitud completa”, así como cualquier forma de CTLA-4 que resulta del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de CTLA-4, por ejemplo, variantes de ayuste o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de un CTLA-4 humano ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 214, la secuencia de aminoácidos de un CTLA-4 de ratón se muestra en SEQ ID NO: 247, la secuencia de aminoácidos de un CTLA-4 de mono se muestra en SEQ ID NO: 248, y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA-4 humano se muestra en SEQ ID NO: 28. En el presente documento, CTLA-4 también se puede describir como CTLA4.

[0165] El término “células T reguladoras (Treg)” se refiere a una subpoblación de células T que regulan el sistema inmunitario, mantienen la tolerancia a autoantígenos, y suprimen enfermedades autoinmunitarias. Estas células generalmente suprimen o disminuyen la inducción y proliferación de células T efectoras. Las células Treg mejor entendidas son las que expresan CD4, CD25 y Foxp3 (células Treg CD4<+>CD25<+>). Estas Treg son diferentes de las células T cooperadoras. Se usan varios métodos diferentes para identificar y seguir células Treg. Cuando se definen por la expresión de CD4 y CD25 (células CD4<+>CD25<+>), las células Treg constituyen aproximadamente del 5% hasta aproximadamente el 10% de la subpoblación de células T CD4<+>maduras en ratones y humanos, mientras de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2% de Treg se pueden medir en sangre completa. La identificación y seguimiento se puede realizar midiendo además la expresión de Foxp3 (células CD4<+>CD25<+>Foxp3<+>). Además, como otro marcador, la ausencia o bajo nivel de expresión de CD127 se puede usar en combinación con la presencia de CD4 y CD25. Las células Treg también expresan altos niveles de CTLA-4 y GITR. También se pueden identificar Treg por los métodos descritos en los ejemplos posteriores.

[0166] El término “sustancialmente similar”, “sustancialmente igual” o “sustancialmente el mismo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la presente invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador), de modo que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poca o ninguna significancia biológica y/o estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de KD).

[0167] Como se usa en el presente documento, “tratamiento” (y variaciones gramaticales del mismo tal como “tratar” o “tratando”) se refiere a intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que se trata, y se puede realizar para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no están limitados a, prevenir la aparición o recaída de una enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir metástasis, disminuir la tasa de evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la presente invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar la evolución de una enfermedad.

[0168] El término “tumor” se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. Los términos “cáncer”, “canceroso”, “trastorno proliferativo celular”, “trastorno proliferativo” y “tumor” no son mutuamente excluyentes como se denomina en el presente documento. El término “tejido tumoral” significa un tejido que comprende al menos una célula tumoral. El tejido tumoral habitualmente está compuesto de una población de células tumorales que forman la entidad principal del tumor (parénquima) y tejidos conjuntivos y vasos sanguíneos que existen entre estas células y apoyan el tumor (“estroma”). La distinción entre los dos es clara en algunos casos, mientras en otros están entremezclados. Los tejidos tumorales pueden estar infiltrados por células inmunitarias y similares. Por otra parte, un “tejido no tumoral” significa un tejido diferente de un tejido(s) tumoral(es) en un organismo vivo. Los tejidos sanos/normales que no están en un estado de enfermedad son ejemplos típicos de tejidos no tumorales.

[0169] II. Composiciones y métodos

[0170] En un aspecto, la presente divulgación se basa, en parte, en anticuerpos anti-CTLA-4 y usos de los mismos. En ciertas formas de realización, se proporcionan anticuerpos que se unen a CTLA-4. Los anticuerpos de la presente invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento del cáncer.

[0171] A. Anticuerpos anti-CTLA-4 ejemplares

[0172] En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a CTLA-4. En ciertas formas de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención tiene actividad de unión a CTLA-4 dependiente de la concentración de un compuesto que contiene adenosina. En algunas formas de realización, la actividad de unión a CTLA-4 es mayor en presencia de compuesto que contiene adenosina comparada con esa en ausencia del compuesto que contiene adenosina. En otra forma de realización, la actividad de unión a CTLA-4 es mayor en presencia de alta concentración de un compuesto que contiene adenosina comparado con esa en presencia de baja concentración del compuesto que contiene adenosina. La diferencia de actividad de unión a CTLA-4 puede ser, por ejemplo, dos veces o más, 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 50 veces o más, 100 veces o más, 200 veces o más, 300 veces o más, 500 veces o más, 1 x 10<3>veces o más, 2 x 10<3>veces o más, 3 x 10<3>veces o más, 5 x 10<3>veces o más, 1 x 10<4>veces o más, 2 x 10<4>veces o más, 3 x 10<4>veces o más, 5 x 10<4>veces o más, o 1 x 10<5>veces o más.

[0173] En algunas formas de realización, la actividad de unión de un anticuerpo anti-CTLA-4 puede estar representada por un valor KD (constante de disociación). En una forma de realización adicional, el valor KD del anticuerpo anti-CTLA-4 en presencia de un compuesto que contiene adenosina es menor que ese en ausencia del compuesto que contiene adenosina. Alternativamente, en otra forma de realización, el valor KD del anticuerpo anti-CTLA-4 en presencia de una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina es menor que ese en presencia de una baja concentración del compuesto que contiene adenosina. La diferencia en los valores KD de anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento puede ser, por ejemplo, dos veces o más, 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 50 veces o más, 100 veces o más, 200 veces o más, 300 veces o más, 500 veces o más, 1 x 10<3>veces o más, 2 x 10<3>veces o más, 3 x 10<3>veces o más, 5 x 10<3>veces o más, 1 x 10<4>veces o más, 2 x 10<4>veces o más, 3 x 10<4>veces o más, 5 x 10<4>veces o más, o 1 x 10<5>veces o más. Los valores KD de los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en el presente documento en presencia de un compuesto que contiene adenosina o en presencia de una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina pueden ser, por ejemplo, 9 x 10<-7>M o menos, 8 x 10<-7>M o menos, 7 x 10<-7>M o menos, 6 x 10<-7>M o menos, 5 x 10<-7>M o menos, 4 x 10<-7>M o menos, 3 x 10<-7>M o menos, 2 x 10<-7>M o menos, 1 x 10<-7>M o menos, 9 x 10<-8>M o menos, 8 x 10<-8>M o menos, 7 x 10<-8>M o menos, 6 x 10<-8>M o menos, 5 x 10<-8>M o menos, 4 x 10<-8>M o menos, 3 x 10<-8>M o menos, 2 x 10<-8>M o menos, 1 x 10<-8>M o menos, 9 x 10<-9>M o menos, 8 x 10<-9>M o menos, 7 x 10<-9>M o menos, 6 x 10<-9>M o menos, 5 x 10<-9>M o menos, 4 x 10<-9>M o menos, 3 x 10<-9>M o menos, 2 x 10<-9>M o menos, 1 x 10<-9>M o menos, o 9 x 10<-10>M o menos, 8 x 10<-10>M o menos, 7 x 10<-10>M o menos, 6 x 10<-10>M o menos, 5 x 10<-10>M o menos, 4 x 10<-10>M o menos, 3 x 10<-10>M o menos, 2 x 10<-10>M o menos, 1 x 10<-10>M o menos. Los valores KD de los anticuerpos anti-CTLA-4 en ausencia de un compuesto que contiene adenosina o en presencia de una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina pueden ser, por ejemplo, 1 x 10<-8>M o más, 2 x 10<-8>M o más, 3 x 10<-8>M o más, 4 x 10<-8>M o más, 5 x 10<-8>M o más, 6 x 10<-8>M o más, 7 x 10<-8>M o más, 8 x 10<-8>M o más, 9 x 10<-8>M o más, 1 x 10<-7>M o más, 2 x 10<-7>M o más, 3 x 10<-7>M o más, 4 x 10<-7>M o más, 5 x 10<-7>M o más, 6 x 10<-7>M o más, 7 x 10<-7>M o más, 8 x 10<-7>M o más, 9 x 10<-7>M o más, 1 x 10<-6>M o más, 2 x 10<-6>M o más, 3 x 10<-6>M o más, 4 x 10<-6>M o más, 5 x 10<-6>M o más, 6 x 10<-6>M o más, 7 x 10<-6>M o más, 8 x 10<-6>M o más, o 9 x 10<-6>M o más.

[0175] En otra forma de realización, la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 puede estar representada por un valor kd (contante de velocidad de disociación) en lugar de un valor KD.

[0177] En otra forma de realización, la actividad de unión del anticuerpo anti-CTLA-4 puede estar representada por la cantidad de unión de CTLA-4 por cantidad unidad del anticuerpo. Por ejemplo, en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, la cantidad de unión de un anticuerpo inmovilizado en un chip sensor y la cantidad de unión de un antígeno unido adicionalmente al mismo se miden cada una como unidad de resonancia (UR). El valor obtenido dividiendo la cantidad de unión del antígeno por la cantidad de unión del anticuerpo se puede definir como la cantidad de unión de antígeno por cantidad unidad del anticuerpo. Los métodos específicos para medir y calcular tales cantidades de unión se describen en los ejemplos posteriormente. En algunas formas de realización, la cantidad de unión de CTLA-4 en presencia de un compuesto que contiene adenosina es mayor que esa en ausencia del compuesto que contiene adenosina. Alternativamente, en otra forma de realización, la cantidad de unión de CTLA-4 en presencia de una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina es mayor que esa en presencia de una baja concentración del compuesto que contiene adenosina. Por ejemplo, la diferencia en la cantidad de unión de CTLA-4 puede ser, por ejemplo, dos veces o más, 3 veces o más, 5 veces o más, 10 veces o más, 20 veces o más, 30 veces o más, 50 veces o más, 100 veces o más, 200 veces o más, 300 veces o más, 500 veces o más, 1 x 10<3>veces o más, 2 x 10<3>veces o más, 3 x 10<3>veces o más, 5 x 10<3>veces o más, 1 x 10<4>veces o más, 2 x 10<4>veces o más, 3 x 10<4>veces o más, 5 x 10<4>veces o más, o 1 x 10<5>veces o más. El valor de la cantidad de unión de CTLA-4 en presencia de un compuesto que contiene adenosina o en presencia de una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina puede ser, por ejemplo, 0,01 o más, 0,02 o más, 0,03 o más, 0,04 o más, 0,05 o más, 0,06 o más, 0,07 o más, 0,08 o más, 0,09 o más, 0,1 o más, 0,2 o más, 0,3 o más, 0,4 o más, 0,5 o más, 0,6 o más, 0,7 o más, 0,8 o más, 0,9 o más, o 1 o más. El valor de la cantidad de unión de CTLA-4 en ausencia de un compuesto que contiene adenosina o en presencia de una baja concentración del compuesto que contiene adenosina puede ser, por ejemplo, 0,5 o menos, 0,4 o menos, 0,3 o menos, 0,2 o menos, 0,1 o menos, 0,09 o menos, 0,08 o menos, 0,07 o menos, 0,06 o menos, 0,05 o menos, 0,04 o menos, 0,03 o menos, 0,02 o menos, 0,01 o menos, 0,009 o menos, 0,008 o menos, 0,007 o menos, 0,006 o menos, 0,005 o menos, 0,004 o menos, 0,003 o menos, 0,002 o menos, o 0,001 o menos.

[0179] En algunas formas de realización, los valores KD, valores kd, valores de cantidad de unión y demás descritos en el presente documento se miden o calculan realizando un ensayo de resonancia en plasmón de superficie a 25ºC o 37ºC (véase, por ejemplo, el ejemplo 3 en el presente documento).

[0181] Se puede seleccionar cualquier concentración de un compuesto que contiene adenosina siempre que se detecte una diferencia en la actividad de unión de un anticuerpo anti-CTLA-4. En ciertas formas de realización, una alta concentración puede incluir, por ejemplo, 1 nM o mayor que 1 nM, 3 nM o mayor que 3 nM, 10 nM o mayor que 10 nM, 30 nM o mayor que 30 nM, 100 nM o mayor que 100 nM, 300 nM o mayor que 300 nM, 1 μM o mayor que 1 μM, 3 μM o mayor que 3 μM, 10 μM o mayor que 10 μM, 30 μM o mayor que 30 μM, 100 μM o mayor que 100 μM, 300 μM o mayor que 300 μM, 1 mM o mayor que 1 mM, 3 mM o mayor que 3 mM, 10 mM o mayor que 10 mM, 30 mM o mayor que 30 mM, 100 mM o mayor que 100 mM, 300 mM o mayor que 300 mM, y 1 M o mayor que 1 M. Alternativamente, la alta concentración aquí puede ser una cantidad suficiente a la que el respectivo anticuerpo anti-CTLA-4 muestra máxima actividad de unión. En otra forma de realización, 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM o una cantidad suficiente a la que el respectivo anticuerpo anti-CTLA-4 muestra máxima actividad de unión se puede seleccionar como la alta concentración aquí. En ciertas formas de realización, una baja concentración puede incluir, por ejemplo, 1 mM o menor que 1 mM, 300 μM o menor que 300 μM, 100 μM o menor que 100 μM, 30 μM o menor que 30 μM, 10 μM o menor que 10 μM, 3 μM o menor que 3 μM, 1 μM o menor que 1 μM, 300 nM o menor que 300 nM, 100 nM o menor que 100 nM, 30 nM o menor que 30 nM, 10 nM o menor que 10 nM, 3 nM o menor que 3 nM, 1 nM o menor que 1 nM, 300 pM o menor que 300 pM, 100 pM o menor que 100 pM, 30 pM o menor que 30 pM, 10 pM o menor que 10 pM, 3 pM o menor que 3 pM, y 1 pM o menor que 1 pM. Alternativamente, la baja concentración aquí puede ser una concentración a la que el respectivo anticuerpo anti-CTLA-4 muestra actividad de unión mínima. El caso donde la concentración sustancial es cero (en ausencia de un compuesto que contiene adenosina) también se puede seleccionar como una forma de realización de baja concentración. En una forma de realización 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, la concentración a la que el respectivo anticuerpo anti-CTLA-4 muestra actividad de unión mínima, o la ausencia de un compuesto de adenosina se puede seleccionar como la menor concentración aquí. En otra forma de realización, los siguientes valores se pueden seleccionar como la proporción de alta concentración respecto a baja concentración: por ejemplo, 3 veces o más, 10 veces o más, 30 veces o más, 100 veces o más, 300 veces o más, 1 x 10<3>veces o más, 3 x 10<3>veces o más, 1 x 10<4>veces o más, 3 x 10<4>veces o más, 1 x 10<5>veces o más, 3 x 10<5>veces o más, 1 x 10<6>veces o más, 3 x 10<6>veces o más, 1 x 10<7>veces o más, 3 x 10<7>veces o más, 1 x 10<8>veces o más, 3 x 10<8>veces o más, 1 x 10<9>veces o más, 3 x 10<9>veces o más, 1 x 10<10>veces o más, 3 x 10<10>veces o más, 1 x 10<11>veces o más, 3 x 10<11>veces o más, o 1 x 10<12>veces o más.

[0183] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención tienen actividad de unión también a compuestos que contienen adenosina. La cantidad de unión de un compuesto que contiene adenosina por cantidad unidad de un anticuerpo anti-CTLA-4 se puede calcular usando el método anteriormente mencionado y usar como la actividad de unión del anticuerpo al compuesto que contiene adenosina. Los métodos específicos para medir y calcular tales cantidades de unión se describen en los ejemplos posteriores. El valor de la cantidad de unión de un compuesto que contiene adenosina por cantidad unidad de un anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención puede ser, por ejemplo, 0,0001 o más, 0,0002 o más, 0,0003 o más, 0,0004 o más, 0,0005 o más, 0,0006 o más, 0,0007 o más, 0,0008 o más, 0,0009 o más, 0,001 o más, 0,002 o más, 0,003 o más, 0,004 o más, 0,005 o más, 0,006 o más, 0,007 o más, 0,008 o más, 0,009 o más, o 0,01 o más.

[0185] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención forman un complejo ternario con un compuesto que contiene adenosina y CTLA-4. En una forma de realización, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a un compuesto que contiene adenosina a través de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-CTLA-4 tiene un motivo de unión para un compuesto que contiene adenosina. El motivo de unión para un compuesto que contiene adenosina puede estar compuesto de, por ejemplo, al menos un aminoácido presente en las posiciones 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b, y 100c según la numeración de Kabat. En una forma de realización adicional, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a un compuesto que contiene adenosina, por ejemplo, a través de al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en las posiciones 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b, y 100c según la numeración de Kabat. En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en el presente documento tienen al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr en la posición 33, Ser en la posición 52, Ser en la posición 52a, Arg en la posición 53, Tyr en la posición 56, Tyr en la posición 58, Tyr en la posición 95, Gly en la posición 96, Met en la posición 100a, Leu en la posición 100b, y Trp en la posición 100c, según la numeración de Kabat. CTLA-4 se puede además unirse al complejo formado por la unión de un anticuerpo anti-CTLA-4 y un compuesto que contiene adenosina. Además, el compuesto que contiene adenosina puede estar presente en la interfaz donde el anticuerpo anti-CTLA-4 y CTLA-4 interaccionan y puede unirse a ambos. Se puede confirmar por técnicas tal como análisis de estructura cristalina descrita posteriormente que el anticuerpo anti-CTLA-4 forma un complejo ternario con un compuesto que contiene adenosina y CTLA-4 (véase los ejemplos).

[0186] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención se unen a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en aminoácidos en la posición 3 (Met), posición 33 (Glu), posición 35 (Arg), posición 53 (Thr), posición 97 (Glu), posición 99 (Met), posición 100 (Tyr), posición 101 (Pro), posición 102 (Pro), posición 103 (Pro), posición 104 (Tyr), posición 105 (Tyr), y posición 106 (Leu) de CTLA-4 humano (dominio extracelular; SEQ ID NO: 28). Estos aminoácidos pueden constituir un epítopo del anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención. En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA de la presente invención se unen a la región del aminoácido en posición 97 (Glu) al aminoácido en posición 106 (Leu) de CTLA-4 humano (dominio extracelular; SEQ ID NO: 28). En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA de la presente invención se unen a la región del aminoácido en posición 99 (Met) al aminoácido en posición 106 (Leu) de CTLA-4 humano (dominio extracelular; SEQ ID NO: 28).

[0188] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención compiten con ABAM004 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 11; HVR-H1, SEQ ID NO: 100; HVR-H2, SEQ ID NO: 101; HVR-H3, SEQ ID NO: 102; HVR-L1, SEQ ID NO: 113; HVR-L2, SEQ ID NO: 114; HVR-L3, SEQ ID NO: 115) por unión a CTLA-4. En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención se unen al mismo epítopo que ABAM004. Cuando hay un exceso de anticuerpos anti-CTLA-4, la unión de ABAM004 a CTLA-4 se puede reducir en, por ejemplo, el 10% o más, el 15% o más, el 20% o más, el 25% o más, el 30% o más, el 35% o más, el 40% o más, el 45% o más, el 50% o más, el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, o el 95% o más. Se proporcionan ensayos competitivos ejemplares en el presente documento.

[0190] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención muestran actividad citotóxica contra células que expresan CTLA-4. Cuando CTLA-4 se expresa en la superficie de una célula diana y un anticuerpo anti-CTLA-4 se une a ella, la célula se puede dañar. El daño a la célula puede estar causado por células efectoras unidas al anticuerpo, tal como actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), o puede estar causado por complementos unidos al anticuerpo, tal como actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Alternativamente, el daño puede estar causado por un agente citotóxico (por ejemplo, un radioisótopo o agente quimioterapéutico) conjugado al anticuerpo, tal como un inmunoconjugado. La citotoxicidad aquí puede incluir los efectos de inducir muerte celular, suprimir proliferación celular, y alterar funciones celulares. Cuando un anticuerpo anti-CTLA-4 está presente en una cantidad suficiente, puede producir daño a, por ejemplo, el 10% o más, el 15% o más, el 20% o más, el 25% o más, el 30% o más, el 35% o más, el 40% o más, el 45% o más, el 50% o más, el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, o el 95% o más de las células que expresan CTLA-4. La medida de tal actividad citotóxica se puede realizar comparándola a la medida en ausencia del anticuerpo o en presencia de un anticuerpo control negativo. Se proporcionan ensayos de citotoxicidad ejemplares en el presente documento. En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención muestran actividad neutralizante contra CTLA-4. Se sabe que CTLA-4 funciona interaccionando con su ligando, CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2). En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 inhiben la interacción de CTLA-4 con CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2). Cuando un anticuerpo anti-CTLA-4 está presente en una cantidad suficiente, puede inhibir la interacción de CTLA-4 con CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2) en, por ejemplo, el 10% o más, el 15% o más, el 20% o más, el 25% o más, el 30% o más, el 35% o más, el 40% o más, el 45% o más, el 50% o más, el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, o el 95% o más. La medida de tal actividad inhibidora se puede realizar comparándola a la medida en ausencia del anticuerpo o en presencia de un anticuerpo control negativo. Se proporcionan métodos específicos de medir la actividad neutralizante en el presente documento.

[0191] En otra forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención se unen a CTLA-4 derivado de múltiples especies animales. Las especies animales ejemplares pueden incluir mamíferos, por ejemplo, humanos, monos, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, cerdos, ganado, cabras, caballos, ovejas, camellos, perros y gatos. En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 se unen a CTLA-4 derivado de humanos y no humanos (por ejemplo, monos, ratones y ratas). La secuencia de aminoácidos de CTLA-4 humano se muestra en SEQ ID NO: 214, la secuencia de aminoácidos de CTLA-4 simio se muestra en SEQ ID NO: 247, y la secuencia de aminoácidos de CTLA-4 murino se muestra en SEQ ID NO: 248. Las secuencias de aminoácidos de CTLA-4 derivado de otras especies animales también puede determinar apropiadamente por métodos que conocen los expertos en la materia.

[0192] En ciertas formas de realización, los compuestos que contienen adenosina en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, adenosina (ADO), adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenosina monofosfato cíclico (AMPc), desoxiadenosina (dADO), desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxiadenosina difosfato (dADP), desoxiadenosina monofosfato (dAMP), y adenosina (γ-tio) trifosfato (ATPγS).

[0193] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225. El anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225.

[0194] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228. El anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228.

[0195] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228.

[0196] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 224; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 225; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 226; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 227; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 228.

[0197] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[0198] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.

[0199] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.

[0200] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.

[0201] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[0202] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.

[0203] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.

[0204] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[0205] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0206] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0207] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153.

[0208] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153.

[0209] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[0210] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0211] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0212] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0213] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0214] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0215] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0216] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0217] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0218] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En una forma de realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0219] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0220] En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102.

[0221] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VH seleccionadas de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias HVR de VL seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0222] En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133.

[0223] En ciertas formas de realización ilustrativas, uno cualquiera o más aminoácidos de un anticuerpo anti-CTLA-4 proporcionado anteriormente se sustituyen en las siguientes posiciones HVR:

[0224] - en HVR-H1 (SEQ ID NO: 223): posición 2

[0225] - en HVR-H2 (SEQ ID NO: 224): posiciones 4, 5, 7, 13, y 16

[0226] - en HVR-H3 (SEQ ID NO: 225): posición 3

[0227] - en HVR-L1 (SEQ ID NO: 226): posiciones 1, 3, 6, 11, 12, y 14

[0228] - en HVR-L2 (SEQ ID NO: 227): posiciones 1, 3, 4, y 7

[0229] - en HVR-L3 (SEQ ID NO: 228): posiciones 1 y 10.

[0230] En ciertas formas de realización ilustrativas, las sustituciones son sustituciones conservadoras, como se proporciona en el presente documento. En ciertas formas de realización ilustrativas, una cualquiera o más de las siguientes sustituciones se puede hacer en cualquier combinación:

[0231] - en HVR-H1 (SEQ ID NO: 100): H2A, R, o K

[0232] - en HVR-H2 (SEQ ID NO: 101): S4T; R5Q; G7H; D13E o R; K16R

[0233] - en HVR-H3 (SEQ ID NO: 102): K3A

[0234] - en HVR-L1 (SEQ ID NO: 113): T1D, Q, o E; T3P; D6G; N11T; Y12W; S14H

[0235] - en HVR-L2 (SEQ ID NO: 114): E1F o Y; S3I; K4S; S7E o K

[0236] - en HVR-L3 (SEQ ID NO: 115): A1Q; M10T

[0237] Todas las posibles combinaciones de las sustituciones anteriores están abarcadas por las secuencias consenso de SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 227, y 228 para HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3, respectivamente.

[0238] En cualquiera de las formas de realización anteriores, un anticuerpo anti-CTLA-4 está humanizado. En una forma de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento comprende HVR como en cualquiera de las formas de realización anteriores, y además comprende un marco aceptor humano, por ejemplo, un marco de inmunoglobulina humano o un marco consenso humano. En otra forma de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 comprende HVR como en cualquiera de las formas de realización anteriores, y además comprende una VH o VL que comprende una secuencia FR. En una forma de realización adicional, un anticuerpo anti-CTLA-4 comprende secuencia(s) FR del dominio variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera como sigue: para un dominio variable de cadena pesada, FR1 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 229 a 232, FR2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 233, FR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 234, y FR4 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 235; y para un dominio variable de cadena ligera, FR1 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 236 a 238, FR2 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 240 a 241, FR3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 242 a 244 y FR4 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 245 a 246.

[0239] En otro aspecto, un anticuerpo anti-CTLA-4 comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En ciertas formas de realización, una secuencia VH que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones relativa a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a CTLA-4. En ciertas formas de realización, un total de 1 a 10, a 11, a 12, a 13, a 14 o a 15 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 10. En ciertas formas de realización, se producen sustituciones, inserciones o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende la secuencia VH en SEQ ID NO: 10, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una forma de realización particular, la secuencia VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no están limitadas a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación.

[0241] En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En ciertas formas de realización, una secuencia VL que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones relativa a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a CTLA-4. En ciertas formas de realización, un total de 1 a 10, a 11, a 12, a 13, a 14 o a 15 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 11. En ciertas formas de realización, se producen sustituciones, inserciones o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende la secuencia VL en SEQ ID NO: 11, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En el presente documento se divulga una VL que comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no están limitadas a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación.

[0243] En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149. En ciertas formas de realización, una secuencia VL que tiene al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones relativa a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a CTLA-4. En ciertas formas de realización, un total de 1 a 10, a 11, a 12, a 13, a 14 o a 15 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 149. En ciertas formas de realización, se producen sustituciones, inserciones o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende la secuencia VL en SEQ ID NO: 149, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En el presente documento se divulga una VL que comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130, (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no están limitadas a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación.

[0245] En otro aspecto, en el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las formas de realización proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las formas de realización proporcionadas anteriormente. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En el presente documento se divulga un anticuerpo ilustrativo que comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 97, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 134, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 95, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 146, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 146, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 147, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 147, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Se divulga un anticuerpo ilustrativo que comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 136 y SEQ ID NO: 149, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4 heterotetramérico, en donde el anticuerpo comprende al menos dos regiones variables diferentes seleccionadas de regiones variables que comprenden las secuencias VH y VL proporcionadas anteriormente. Un anticuerpo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 146, respectivamente, y las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 146, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Un anticuerpo alternativo de la invención comprende las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 147, respectivamente, y las secuencias VH y VL en SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 147, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no están limitadas a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera a ácido piroglutámico por piroglutamilación.

[0247] Cuando el aminoácido en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo anti-CTLA-4 proporcionado en el presente documento es glutamina, este aminoácido se puede sustituir con glutamato. Cuando el aminoácido en el extremo N de la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo anti-CTLA-4 proporcionado en el presente documento es glutamato, este aminoácido se puede sustituir con glutamina.

[0249] En un aspecto adicional, en el presente documento se divulga un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-CTLA-4 proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, se divulga un anticuerpo que se une al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos enumerados en la tabla 4, tabla 9, tabla 14 y tabla 19. En ciertas formas de realización, se divulga un anticuerpo que se une a un epítopo en un fragmento de CTLA-4 que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos en la posición 3 (Met), posición 33 (Glu), posición 35 (Arg), posición 53 (Thr), posición 97 (Glu), posición 99 (Met), posición 100 (Tyr), posición 101 (Pro), posición 102 (Pro), posición 103 (Pro), posición 104 (Tyr), posición 105 (Tyr), y posición 106 (Leu) de SEQ ID NO: 28. Se divulga un anticuerpo que se une a un epítopo en un fragmento de CTLA-4 que consiste en los aminoácidos de posición 97 (Glu) a posición 106 (Leu) de SEQ ID NO: 28. Se divulga un anticuerpo que se une a un epítopo en un fragmento de CTLA-4 que consiste en los aminoácidos de posición 99 (Met) a posición 106 (Leu) de SEQ ID NO: 28.

[0251] En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-CTLA-4 según cualquiera de las formas de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una forma de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fv, Fab, Fab’, scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab’)<2>. En otra forma de realización, el anticuerpo en un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto, u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.

[0252] En un aspecto adicional, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención comprenden una región Fc. En un aspecto adicional, los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención comprenden regiones constantes. Las regiones constantes pueden ser regiones constantes de cadena pesada (incluyendo regiones Fc), regiones constantes de cadena ligera, o ambas. En algunas formas de realización, la región Fc es la de una secuencia nativa. Las regiones constantes de cadena pesada ejemplares derivadas de anticuerpos nativos pueden incluir, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada tal como IgG1 humana (SEQ ID NO: 249), IgG2 humana (SEQ ID NO: 250), IgG3 humana (SEQ ID NO: 251), e IgG4 humana (SEQ ID NO: 252). Además, otras regiones constantes de cadena pesada ejemplares pueden incluir regiones constantes de cadena pesada de SEQ ID NO: 82 y 158. Las regiones constantes de cadena ligera derivadas de anticuerpos nativos pueden incluir, por ejemplo, regiones constantes de cadena ligera tal como la cadena κ humana (SEQ ID NO: 33, 63 y 159) y cadena λ humana (SEQ ID NO: 53 y 87).

[0254] En otra forma de realización, la región Fc es una región Fc variante producida añadiendo alteraciones de aminoácidos a la región Fc de una secuencia nativa. En ciertas formas de realización, la región Fc variante tiene actividad de unión aumentada a al menos un receptor de Fcγ seleccionado del grupo que consiste en FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, y FcγRIIIa, comparado con la región Fc de una secuencia nativa. En formas de realización adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión aumentada a FcγRIIa y FcγRIIIa, comparado con la región Fc de una secuencia nativa. Los ejemplos de regiones constante de cadena pesada que comprenden tal región Fc variante incluyen, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada enumeradas en las tablas 26 a 30 y las regiones constantes de cadena pesada de SEQ ID NO: 31, 32, 41 a 46, 65, 66, 81, 207, 239, 253 a 271, 276, 277 y 278.

[0256] La región Fc de una secuencia nativa habitualmente está compuesta como un homodímero que consiste en dos cadenas polipeptídicas idénticas. En ciertas formas de realización, la región Fc variante puede ser un homodímero compuesto de cadenas polipeptídicas con la misma secuencia, o un heterodímero compuesto de cadenas polipeptídicas con diferentes secuencias entre sí. Similarmente, las regiones constantes de cadena pesada que comprenden la región Fc pueden ser un homodímero compuesto de cadenas polipeptídicas con la misma secuencia, o un heterodímero compuesto de cadenas polipeptídicas con diferentes secuencias entre sí. Los ejemplos de regiones constantes de cadena pesada heterodiméricas incluyen, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 31 y 23; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 43 y 44; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 45 y 46; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 254 y 256; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 257 y 258; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 259 y 260; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 261 y 263; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 262 y 264; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 265 y 267; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 266 y 268; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 269 y 270; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 271 y 81; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 65 y 66; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 239 y 207; las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 259 y 276; y las regiones constantes de cadena pesada que comprenden las cadenas polipeptídicas de SEQ ID NO: 64 y 278.

[0258] En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-CTLA-4 según cualquiera de los ejemplos y formas de realización anteriores puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, descritas en las secciones 1-7 siguientes:

[0260] 1. Actividad de unión del anticuerpo

[0262] En ciertos ejemplos, la actividad de unión de un anticuerpo proporcionado en el presente documento es una constante de disociación (KD) de 10 μM o menos, 1 μM o menos, 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,01 nM o menos, o 0,001 nM o menos (por ejemplo, 10<-8>M o menos, por ejemplo, de 10<-8>M a 10<-13>M, por ejemplo, de 10<-9>M a 10<-13>M).

[0264] La actividad de unión de un anticuerpo se mide por un ensayo de unión de antígeno radiomarcado (RIA). En un ejemplo, un RIA se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, la afinidad de unión en solución de los Fab por antígenos se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (<125>I) en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol.293: 865-881(1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas multipocillo MICROTITER (marca registrada) (Thermo Scientific) durante la noche con 5 μg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Capped Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquea con seroalbúmina bovina al 2% (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan [<125>I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Prestaet al., Cancer Res.57: 4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba después durante la noche; sin embargo, la incubación puede seguir durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después de ello, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). La solución después se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato-20 (TWEEN-20 (marca registrada)) al 0,1% en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 μl/pocillo de centelleante (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos que o igual al 20% de la unión máxima se eligen para uso en ensayos competitivos.

[0266] En un ejemplo, la actividad de unión de un anticuerpo se mide usando un ensayo de captura de ligando usando ensayo de resonancia de plasmón de superficie como principio de medida, por ejemplo, con un BIACORE (marcada registrada) T200 o un BIACORE (marcada registrada) 4000 (GE Healthcare, Upsala, Suecia). Se usa el software de control BIACORE (marcada registrada) para operación del dispositivo. En un ejemplo, se usa un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare, Upsala, Suecia) según instrucciones del suministrador, y un chip sensor recubierto con carboximetil dextrano (GE Healthcare, Upsala, Suecia) se inmoviliza con una molécula para capturar el ligando, por ejemplo, anticuerpo anti-etiqueta, anticuerpo anti-IgG, y proteína A. Una molécula para capturar el ligando se diluye con solución de acetato de sodio 10 mM a un pH apropiado e inyecta a una velocidad de flujo y tiempo de inyección apropiados. El ensayo de actividad de unión se realiza usando un tampón que contiene polisorbato 20 (también denominado TWEEN (marca registrada)-20) al 0,05% como tampón de ensayo, a una velocidad de flujo de 10 a 30 μl/minuto, y a una temperatura de ensayo de preferiblemente 25ºC o 37ºC. Cuando el ensayo se realiza permitiendo que una molécula para capturar el ligando capture un anticuerpo como ligando, la dilución en serie del antígeno o receptor de Fc preparada con tampón de ensayo (analito) se inyecta después de que la cantidad diana del anticuerpo se capture inyectando el anticuerpo. Cuando el ensayo se realiza permitiendo que una molécula para capturar el ligando capture antígeno o receptor de Fc como ligando, la dilución en serie del anticuerpo preparada con tampón de ensayo (analito) se inyecta después de que la cantidad diana del antígeno o receptor de Fc se captura inyectando el antígeno o receptor de Fc.

[0268] En un ejemplo, los resultados del ensayo se analizan usando software de evaluación BIACORE (marcada registrada). Los parámetros cinéticos se calculan ajustando simultáneamente los sensorgramas de unión y disociación usando el modelo de unión 1:1, y la velocidad de unión (kon o ka), velocidad de disociación (koff o kd), y constante de disociación en equilibrio (KD) se pueden calcular. Cuando la actividad de unión es débil, especialmente cuando la disociación es rápida y es difícil calcular los parámetros cinéticos, la constante de disociación en equilibrio (KD) se puede calcular usando el modelo de estado estacionario. Como otro parámetro de actividad de unión, la “cantidad de unión de un analito por cantidad unidad de un ligando” se puede calcular dividiendo la cantidad de unión del analito a una concentración específica (UR) por la cantidad de ligando capturado (UR).

[0269] 2. Fragmentos de anticuerpos

[0270] En ciertas formas de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)<2>, Fv, y scFv, y otros fragmentos descritos posteriormente. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase, Hudsonet al., Nat. Med.9: 129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp.

[0271] 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes en EE UU No. 5.571.894 y 5.587.458. Para discusión de fragmentos Fab y F(ab’)<2>que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor salvaje y que tienen semividain vivoaumentada, véase la patente en EE UU No.5.869.046.

[0272] Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, documentos EP 404.097, WO 1993/01161; Hudsonet al., Nat. Med.9: 129-134 (2003); y Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al., Nat. Med.9: 129-134 (2003).

[0273] Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente en EE UU No.6.248.516 B1).

[0274] Los fragmentos de anticuerpo se pueden hacer por varias técnicas, incluyendo, pero no limitadas a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huéspedes recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), como se describe en el presente documento.

[0275] 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados

[0276] En ciertas formas de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos en la patente en EE UU No.4.816.567; y Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de “clase cambiada” en el que la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

[0277] En ciertas formas de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad a humanos, mientras retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo parental no humano. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, CDR, (o porciones de las mismas) derivan de un anticuerpo no humano, y las FR (o porciones de las mismas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. Algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado se pueden sustituir con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que derivan los residuos HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

[0278] Se revisan anticuerpo humanizados y métodos de hacerlos, por ejemplo, en Almagro y Fransson,Front. Biosci.13: 1619-1633 (2008), y se describen, además, por ejemplo, en Riechmannet al., Nature332: 323-329 (1988); Queenet al., Proc. Natl Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989); patentes en EE UU No. 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiriet al., Methods36: 25-34 (2005) (describe injerto de regiones determinantes de especificidad (SDR)); Padlan,Mol. Immunol.28: 489-498 (1991) (describe "remodelación"); Dall'Acquaet al., Methods36: 43-60 (2005) (describe "intercambio de FR "); y Osbournet al., Methods36: 61-68 (2005) y Klimkaet al., Br. J. Cancer,83: 252-260 (2000) (describen el enfoque de “selección guiada” a intercambio de FR).

[0279] Las regiones marco humanas que se pueden usar para humanización incluyen, pero no están limitadas a: regiones marco seleccionadas usando el método de “mejor ajuste” (véase, por ejemplo, Simset al., J. Immunol.151: 2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 4285 (1992); y Prestaet al., J. Immunol.,151: 2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (somáticamente mutadas) o regiones marco de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson,Front. Biosci.13: 1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas de cribar genotecas de FR (véase, por ejemplo, Bacaet al., J. Biol. Chem.272: 10678-10684 (1997) y Rosoket al., J. Biol. Chem.271: 22611-22618 (1996)).

[0280] 4. Anticuerpo humanos

[0281] En ciertas formas de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varios métodos conocidos en la técnica. Se describen anticuerpos humanos en general en van Dijk y van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-374 (2001) y Lonberg,Curr. Opin. Immunol.20: 450-459 (2008).

[0282] Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición antigénica. Tales animales típicamente contienen todo o una porción de los loci de inmunoglobulinas humanas, que sustituyen los loci de inmunoglobulinas endógenas, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulinas endógenas en general se han inactivado. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg,Nat. Biotech.23: 1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE<TM>; la patente en EE UU No. 5.770.429 que describe la tecnología HuMab (marca registrada); la patente en EE UU No.

[0283] 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE (marca registrada), y la publicación de solicitud de patente en EE UU No. US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse (marca registrada)). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales se pueden además modificar, por ejemplo, combinando con una región constante humana diferente.

[0284] También se pueden hacer anticuerpos humanos por métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, KozborJ. Immunol.,133: 3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerneret al., J. Immunol.,147: 86 (1991)). También se describen anticuerpos humanos generados a través de tecnología de hibridoma de células B en Liet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103: 3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente en EE UU No.7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni,Xiandai Mianyixue,26(4): 265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). También se describe tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) en Vollmers y Brandlein,Histology and Histopathology,20(3): 927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3): 185-191 (2005).

[0285] También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable de clones Fv de genotecas de presentación en fagos humanas. Tales secuencias de dominio variable se pueden después combinar con un dominio constante humano deseado. Se describen técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de genotecas de anticuerpos a continuación.

[0286] 5. Anticuerpos derivados de genotecas

[0287] Los anticuerpos divulgados en el presente documento se pueden aislar cribando genotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad o actividades deseada(s). Por ejemplo, se conocen una variedad de métodos en la técnica para generar genotecas de presentación en fagos y cribar tales genotecas para anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboomet al.,enMethods in Molecular Biology178: 1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y además se describen, por ejemplo, en McCaffertyet al., Nature348: 552-554; Clacksonet al., Nature352: 624-628 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, enMethods in Molecular Biology248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuet al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA101(34): 12467-12472 (2004); y Leeet al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132 (2004). En ciertos métodos de presentación en fagos, repertorios de genes VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinan aleatoriamente en genotecas de fagos, que se pueden después cribar para fago de unión a antígeno como se describe en Winteret al., Ann. Rev. Immunol.,12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las genotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio no expuesto se puede clonar (por ejemplo, de humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como describen Griffithset al., EMBO J,12: 725-734 (1993). Por último, también se pueden hacer genotecas no expuestas sintéticamente clonando segmentos de genes V sin reorganizar de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 muy variables y lograr reorganizaciónin vitro,como describen Hoogenboom y Winter,J.Mol. Biol.,227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen genotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente en EE UU No. 5.750.373, y las publicaciones de patente en EE UU No. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

[0288] Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de genotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en el presente documento.

[0289] 6. Anticuerpos multiespecíficos

[0290] En ciertas formas de realización, un anticuerpo divulgado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas formas de realización, una de las especificidades de unión es para CTLA-4 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de CTLA-4. También se pueden utilizar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos a células que expresan CTLA-4. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.

[0291] Las técnicas para hacer anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no están limitadas a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas que tienen diferentes especificidades (véase, Milstein y Cuello,Nature305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, y Trauneckeret al., EMBO J.10:3655 (1991)), e ingeniería "knob-in-hole" (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.731.168). También se pueden hacer anticuerpos multiespecíficos manipulando efectos de direccionamiento electrostático para hacer moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No.4.676.980, y Brennanet al., Science,229: 81 (1985)); usar cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelnyet al., J. Immunol.,148(5): 1547-1553 (1992)); usar tecnología de "diacuerpo" para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90: 6444-6448 (1993)); y usar dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruberet al., J. Immunol.,152: 5368 (1994)); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tuttet al., J. Immunol.147: 60 (1991).

[0292] También se incluyen en el presente documento anticuerpos manipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo “anticuerpos pulpo” (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

[0293] El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un “Fab de acción dual” o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a CTLA-4, así como otro antígeno diferente (véase, documento US 2008/0069820, por ejemplo).

[0294] 7. Variantes de anticuerpo

[0295] En ciertos ejemplos, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se puede hacer para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

[0296] a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

[0297] En ciertos ejemplos, en el presente documento se divulgan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución pueden incluir las HVR y FR. Se muestran sustituciones conservadoras en la tabla 1 bajo el encabezamiento “sustituciones preferidas”. Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezamiento “sustituciones ejemplares” y como se describe además posteriormente en referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se pueden introducir en un anticuerpo de interés y los productos cribar para una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorada.

[0298] Tabla 1

[0300]

[0301]

[0304] Los aminoácidos se pueden clasificar en grupos según sus propiedades comunes de cadena lateral:

[0306] (1) Hidrofóbicos: norleucina, metionina (Met), alanina (Ala), valina (Val), leucina Leu), e isoleucina (Ile);

[0307] (2) Neutros e hidrofílicos; cisteína (Cys), serina (ser), treonina (Thr), asparragina (Asn), y glutamina (Gln);

[0308] (3) Ácidos: aspartato (Asp) y glutamato (Glu);

[0309] (4) Básicos: histidina (His), lisina (Lys), y arginina (Arg);

[0310] (5) Residuos que influyen la orientación de la cadena: glicina (Gly) y prolina (Pro); y

[0311] (6) Aromáticos: triptófano (Trp), tirosina (Tyr), y fenilalanina (Phe).

[0313] Sustitución no conservadora se refiere a la sustitución de un miembro de una de estas clases con uno de otra clase.

[0314] Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) relativo al anticuerpo parental y/o habrán retenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo parental. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación en fagos tal como se describe en el presente documento. Brevemente, uno o más residuos HVR se mutan y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y criban para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

[0316] Se pueden hacer alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones se pueden hacer en “puntos calientes” de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury,Methods Mol. Biol.207: 179-196 (2008)), y/o residuos en contacto con el antígeno, ensayándose la VH o VL variante resultante para afinidad de unión. Se ha descrito maduración por afinidad construyendo y reseleccionando de genotecas secundarias, por ejemplo, en Hoogenboomet al.,enMethods in Molecular Biology178: 1-37 (O'Brienet al.,ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). En algunas formas de realización de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, intercambio de cadenas, o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Se crea después una genoteca secundaria. La genoteca se criba después para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos cada vez) se aleatorizan. Los residuos HVR implicados en unión a antígeno se pueden identificar específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. Con frecuencia CDR-H3 y CDR-L3 en particular son objetivos.

[0318] Las sustituciones, inserciones o deleciones se pueden producir en una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden hacer alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras proporcionadas en el presente documento) en las HVR que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Tales alteraciones pueden, por ejemplo, estar fuera de los residuos de contacto con el antígeno en las HVR. En ciertas formas de realización de las secuencias VH y VL variantes ilustrativas proporcionadas anteriormente, cada HVR o está inalterada, o contiene no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

[0320] Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser objetivo para mutagénesis se llama “mutagénesis por barrido de alanina” como describen Cunningham y Wells (1989)Science,244: 1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tal como arg, asp, his, lys y glu) se identifican y sustituyen por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno está afectada. Se pueden introducir sustituciones adicionales en las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o además, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo se puede analizar para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser objetivo o eliminarse como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

[0321] Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en plasma del anticuerpo al extremo N o C del anticuerpo.

[0322] b) Variantes de glucosilación

[0323] En ciertos ejemplos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir el nivel al que el anticuerpo está glucosilado. La adición o deleción de sitios de glucosilación a un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o eliminan uno o más sitios de glucosilación.

[0324] Donde el anticuerpo comprende una región Fc, el hidrato de carbono unido al mismo se puede alterar. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que en general está unido por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al., TIBTECH15: 26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios hidratos de carbono, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa unida a GlcNAc en el “tallo” de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos ejemplos, se pueden hacer modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la presente invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas. En un ejemplo, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura glucídica que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser del 1% al 80%, del 1% al 65% o del 20% al 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad media de fucosa en la cadena de azúcar en Asn297 relativa a la suma total de todas las glucoestructuras unidas a Asn97 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alta manosa) medido por espectroscopía de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparragina localizado en aproximadamente la posición 297 de la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede estar localizada aproximadamente /- 3 aminoácidos antes o después de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en anticuerpos. Tales variantes de fucosilación tienen función ADCC mejorada. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patente en EE UU No. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas a anticuerpo “desfucosilado” o “deficiente en fucosa” incluyen: documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazakiet al., J. Mol. Biol.336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet al., Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripkaet al., Arch. Biochem. Biophys.249: 533-545 (1986); Solicitud de patente en EE UU No US 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento WO 2004/056312 A1, Adamset al.,especialmente en el ejemplo 11), y líneas celulares manipuladas, tal como células CHO inactivadas en el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa,FUT8,(véase, por ejemplo, Yamane-Ohnukiet al., Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Yet al., Biotechnol. Bioeng.,94(4): 680-688 (2006); y documento WO 2003/085107).

[0325] Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bifurcados, por ejemplo, en el que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo está bifurcado por GlcNAc. Tales variantes de anticuerpos tienen fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Los ejemplos de tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairetet al.);patente en EE UU No.6.602.684 (Umanaet al.);y documento US 2005/0123546 (Umanaet al.).También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Tales variantes de anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Tales variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.);WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0326] c) Variantes de la región Fc

[0327] En ciertos ejemplos, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de esta manera una variante de región Fc. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

[0328] La presente invención contempla una variante de los anticuerpos de la invención que posee alguna, pero no todas las funciones efectoras, que lo hace un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, pero ciertas funciones efectoras (tal como complemento y ADCC) son innecesarias o dañinas. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/eliminación de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para asegurar que el anticuerpo carece de unión a FcγRI (por tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero retiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcγRIII solo, mientras monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 64 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol.9: 457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente en EE. UU. No.5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I.et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) y Hellstrom, Iet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82: 14991502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann, M.et al., J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACT1<TM>para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96 (marca registrada) (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células citolíticas naturales (NK). Alternativamente, o además, se puede evaluar la actividad ADCC de la molécula de interésin vivo,por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clyneset al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA95: 652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods202: 163 (1996); Cragg, M. S.et al., Blood101: 1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie,Blood103: 2738-2743 (2004)). También se pueden realizar unión a FcRn y determinaciones de depuración/semividain vivousando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B.et al., Intl. Immunol.18(12): 1759-1769 (2006)).

[0329] Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen esos con sustitución de uno o más residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente en EE. UU. No.6.737.056). Tales mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297, y 327, incluyendo el llamado mutante Fc “DANA” con sustituciones de los residuos 265 y 297 a alanina (patente en EE. UU. No.7.332.581).

[0330] Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión aumentada o disminuida a los FcR (véase, por ejemplo, patente en EE. UU. No. 6.737.056, documento WO 2004/056312, y Shieldset al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)).

[0331] En ciertos ejemplos, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de residuos).

[0332] En algunos ejemplos se hacen alteraciones en la región Fc que producen unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterada (es decir, o aumentada o disminuida), por ejemplo, como se describe en la patente en EE UU No.6.194.551, documento WO 99/51642, e Idusogieet al., J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

[0333] Anticuerpos con semividas aumentadas y unión aumentada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia materna de las IgG al feto (Guyeret al., J. Immunol.117: 587 (1976); y Kimet al., J. Immunol.24: 249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hintonet al.).Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que aumentan la unión de la región Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen esas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente en EE UU No.7.371.826).

[0334] Véase también Duncan & Winter,Nature322: 738-740 (1988); patente en EE UU No.5.648.260; patente en EE UU No.5.624.821; y documento WO 94/29351 respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

[0335] d) Variantes de anticuerpos manipulados con cisteína

[0336] En ciertos ejemplos, puede ser deseable crear anticuerpos manipulados con cisteína, por ejemplo, “tioAcm”, en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En ejemplos particulares, los residuos sustituidos están en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos se colocan en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otras fracciones, tal como fracciones de fármacos, o fracciones enlazadoras de fármacos, para crear un inmunoconjugado, como se describe después en el presente documento. Se puede sustituir con cisteína uno cualquiera o más de los siguientes residuos: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos manipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente en EE UU No.7.521.541.

[0337] e) Derivados de anticuerpos

[0338] En ciertos ejemplos, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede además modificar para que contenga fracciones no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Las fracciones adecuadas para derivación del anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, polímeros solubles en agua.

[0339] Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (bien homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, y mezclas de los mismos. Polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o sin ramificar. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si más de un polímero está unido, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para derivación se puede determinar basado en consideraciones que incluyen, pero no están limitadas a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

[0340] En otro ejemplo, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y fracción no proteinácea que se pueden calentar selectivamente por exposición a radicación. En un ejemplo, la fracción no proteinácea es un nanotubo de carbono (Kamet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no está limitada a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan la fracción no proteinácea a una temperatura a la que células próximas al anticuerpo-fracción no proteinácea se destruyen.

[0341] B. Métodos y composiciones recombinantes

[0342] Los anticuerpos se pueden producir usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en la patente en EE UU No. 4.816.567. En una forma de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-CTLA-4 como se definen en las reivindicaciones. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la invención. En una forma de realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una forma de realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico definido por las reivindicaciones. En una tal forma de realización, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una forma de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp2/0). En una forma de realización, se proporciona un método de hacer un anticuerpo anti-CTLA-4 como se define en las reivindicaciones, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-CTLA-4, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de la célula huésped). La invención proporciona un método de producir un anticuerpo, como se define por las reivindicaciones, en donde el método comprende cultivar la célula huésped de modo que se produzca el anticuerpo. Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-CTLA-4, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para clonación adicional y/o expresión en una célula huésped. Tal ácido nucleico se puede aislar fácilmente y secuenciar usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).

[0343] Las células huéspedes apropiadas para clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular cuando la glucosilación y función efectoras de Fc no son necesarias. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523 (véase también Charlton,Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli). Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

[0344] Además de procariotas, microbios eucariotas tal como hongos filamentosos o levaduras son adecuados para huéspedes de clonación o expresión para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras cuyas rutas de glucosilación se han “humanizado” dando la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véase, Gerngross,Nat. Biotech.22: 1409-1414 (2004), y Liet al., Nat. Biotech.24: 210-215 (2006).

[0345] Las células huéspedes adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado también derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, particularmente para transfección de células deSpodoptera frugiperda.

[0346] También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.959.177, 6040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas.

[0347] También se pueden usar células de vertebrados como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 descritas, por ejemplo, en Grahamet al., J. Gen Virol.36: 59 (1977)); células de riñón de hámster recién nacido (BHK); células de sertoli de ratón (células TM4 descritas, por ejemplo, en Mather,Biol. Reprod.23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células hepáticas humanas (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI descritas, por ejemplo, en Matheret al., Annals N.Y. Acad. Sci.383: 44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares de mamífero huéspedes útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR<->(Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tal como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huéspedes de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos véase, por ejemplo, Yazaki y Wu,Methods in Molecular Biology, Vol.248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255268 (2003).

[0348] Los anticuerpos policlonales preferiblemente se generan en animales por inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) múltiples del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster sulfosuccinimida de meleimidobenzoilo (conjugación mediante residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico SOCl<2>, o R<1>N=C=NR, donde R y R<1>son diferentes grupos alquilo.

[0349] Se inmunizan animales (habitualmente mamíferos no humanos) frente al antígeno, conjugados inmunógenos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después a los animales se les da una dosis de recuerdo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después los animales se sangran, y se ensaya el título del anticuerpo en suero. Los animales reciben recuerdos hasta que el título alcanza una meseta. Preferiblemente, el animal recibe recuerdo con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o mediante un reactivo de entrecruzamiento diferente. También se pueden preparar conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Además, agentes de agregación tal como alumbre se usan adecuadamente para potenciar la respuesta inmunitaria.

[0350] Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto para posibles mutaciones naturales y/o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter de anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

[0351] Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer usando el método del hibridoma primero descrito por Kohleret al., Nature 256 (5517): 495-497 (1975). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe anteriormente para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente se unen a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.

[0352] El agente inmunizante típicamente incluye la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. En general, o se usan linfocitos de sangre periférica (LSP) si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. Los linfocitos después se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp.59-103).

[0353] Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente, células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales, sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que son sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

[0354] Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son las que se fusiona eficazmente, soportan producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, son preferidas líneas celulares de mieloma murinas, tal como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE UU, y células SP-2 (y derivadas de las mismas, por ejemplo, X63-Ag8-653) disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, EE UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozboret al., J.Immunol.

[0355] 133(6): 3001-3005 (1984); Brodeuret al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, pp.51-63 (1987)).

[0356] El medio de cultivo en que las células de hibridoma crecen se ensaya para producción de anticuerpos monoclonales frente al antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de uniónin vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede determinar por el análisis de Scatchard de Munson, Anal. Biochem. 107(1): 220-239 (1980).

[0357] Después de identificar células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos estándar (Goding, anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivarin vivocomo tumores en un mamífero.

[0358] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tal como, por ejemplo, proteína A-Sepharosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. Se pueden producir anticuerpos inmunizando un animal huésped apropiado frente a un antígeno. El antígeno puede ser un polipéptido que comprende CTLA-4 de longitud completa. El antígeno puede ser un polipéptido que comprende CTLA-4 soluble. El antígeno puede ser un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos desde la posición 97 (Glu) a la posición 106 (Leu) de CTLA-4 humano (dominio extracelular, SEQ ID NO: 28). El antígeno puede ser un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos desde la posición 99 (Met) a la posición 106 (Leu) de CTLA-4 humano (dominio extracelular, SEQ ID NO: 28). También se divulgan anticuerpos producidos inmunizando un animal frente al antígeno. Los anticuerpos pueden incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, descritas en “Anticuerpos anti-CTLA-4 ejemplares” anteriormente.

[0359] C. Ensayos

[0360] Los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento pueden identificar, cribar o caracterizar para sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por varios ensayos conocidos en la técnica.

[0361] 1. Ensayos de unión y otros ensayos

[0362] En un aspecto, un anticuerpo de la presente invención se ensaya para su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por métodos conocidos tal como ELISA, inmunotransferencia, ensayo de resonancia de plasmón de superficie, etc. En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en la tabla 4, tabla, tabla 14 y tabla 19) para unión a CTLA-4. En ciertos ejemplos, si tal anticuerpo competidor existe excesivamente, la unión de un anticuerpo de referencia a CTLA-4 se previene (por ejemplo, reduce) en al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, o más. En algunos ejemplos, la unión se previene al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o más. En ciertos ejemplos, tal anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une a anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en la tabla 4, tabla 9, tabla 14 y tabla 19). Los métodos detallados ejemplares para mapear un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," enMethods in Molecular Biologyvol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).

[0363] En un ensayo de competición ejemplar, CTLA-4 inmovilizado se incuba en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a CTLA-4 y un segundo anticuerpo sin marcar que se ensaya su capacidad para competir con el primer anticuerpo para unión a CTLA-4. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, CTLA-4 inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo sin marcar. Después de incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a CTLA-4, el exceso de anticuerpo sin unir se elimina, y la cantidad de marcador asociado con CTLA-4 inmovilizado se mide. Si la cantidad de marcador asociado con CTLA-4 inmovilizado se reduce sustancialmente en la muestra de prueba relativa a la muestra control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primero para unión a CTLA-4. Véase Harlow y Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manualc.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[0364] 2. Ensayos de actividad

[0365] En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-CTLA-4 que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, actividad inhibidora de proliferación celular, actividad citotóxica (por ejemplo, actividad ADCC/CDC y actividad ADCP), actividad inmunoestimuladora, actividad inhibidora anti-CTLA-4. También se proporcionan anticuerpos que tienen tal actividad biológicain vivoy/oin vitro.

[0366] El anticuerpo de la presente invención se ensaya para tal actividad biológica.

[0367] En ciertas formas de realización, un anticuerpo de la presente invención como se define por las reivindicaciones se ensaya para su capacidad para inhibir crecimiento o proliferación celularin vitro. Los ensayos para inhibición del crecimiento o proliferación celular se conocen bien en la técnica. Ciertos ensayos para proliferación celular, ejemplificados por los ensayos de “destrucción celular” descritos en el presente documento, miden viabilidad celular. Uno de tales ensayos es el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, que está comercialmente disponible de Promega (Madison, WI). Ese ensayo determina el número de células viables en cultivo basado en la cuantificación de ATP presente, que es una indicación de células metabólicamente activas. Véase Crouchet al.(1993)J. Immunol. Meth.160: 81-88, patente en EE UU No.6602677. El ensayo se puede realizar en formato de 96 o 384 pocillos, haciéndolo accesible a cribado de alto rendimiento (HTS) automatizado. Véase, Creeet al.(1995)AntiCancer Drugs6: 398-404. El procedimiento de ensayo implica añadir un único reactivo (reactivo CellTiter-Glo (marca registrada)) directamente a células cultivadas. Esto produce lisis celular y generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, que es directamente proporcional al número de células viables presentes en cultivo. Se pueden registrar datos por un luminómetro o un dispositivo de imagenología cámara CCD. El resultado de luminiscencia se expresa como unidades lumínicas relativas (ULR).

[0368] Otro ensayo para la proliferación celular es el ensayo “MTT”, un ensayo colorimétrico que mide la oxidación de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a formazán por reductasa mitocondrial. Como el ensayo CellTiter-Glo™, este ensayo indica el número de células metabólicamente activas presentes en un cultivo celular. Véase, por ejemplo, Mosmann (1983)J. Immunol. Meth.65: 55-63, y Zhanget al.(2005)Cancer Res.65: 3877-3882.

[0369] Las células para uso en cualquiera de los ensayosin vitroanteriores incluyen células o líneas celulares que expresan CTLA-4 de forma natural o que se han manipulado para expresar CTLA-4. Tales células también incluyen líneas celulares que expresan CTLA-4 y líneas celulares que normalmente no expresan CTLA-4, pero se han transfectado con ácido nucleico que codifica CTLA-4.

[0370] En un aspecto, se ensaya la capacidad de un anticuerpo anti-CTLA-4 para inhibir crecimiento o proliferación celularin vivo. En ciertos ejemplos, se ensaya la capacidad de un anticuerpo anti-CTLA-4 para inhibir crecimiento tumoralin vivo. Se pueden usar sistemas modeloin vivo, tal como modelos de xenoinjerto, para tal ensayo. En un sistema de xenoinjerto ejemplar, se introducen células tumorales humanas en un animal no humano adecuadamente inmunocomprometido, por ejemplo, un ratón “desnudo” atímico. Se puede administrar un anticuerpo de la presente invención al animal. La capacidad del anticuerpo para inhibir o disminuir el crecimiento tumoral se mide. En ciertos ejemplos del sistema de xenoinjerto anterior, las células tumorales humanas son células tumorales de un paciente humano. Tales modelos de xenoinjerto están comercialmente disponibles de Oncontest GmbH (Frieberg, Alemania). En ciertos ejemplos, las células tumorales humanas se introducen en un animal no humano adecuadamente inmunocomprometido por inyección subcutánea o por trasplante en un sitio adecuado, tal como una almohadilla grasa mamaria.

[0371] Se entiende que cualquiera de los ensayos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado como se divulga en el presente documento en lugar de o además de un anticuerpo anti-CTLA-4.

[0372] Un ensayo típico para medir la actividad ADCC de un anticuerpo terapéutico se basa en el ensayo de liberación de<51>Cr y comprende las siguientes etapas: marcar células diana con [<51>Cr]Na<2>CrO<4>; opsonizar las células diana que expresan un antígeno en su superficie celular con un anticuerpo; combinar las células diana radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una proporción adecuada en una placa de microtitulación en presencia o ausencia de un anticuerpo de prueba; incubar la mezcla celular preferiblemente durante 16 horas a 18 horas, preferiblemente a 37ºC; recoger el sobrenadante; y analizar la radioactividad en la muestra de sobrenadante. Después, se determina la citotoxicidad del anticuerpo de prueba, por ejemplo, por la siguiente ecuación: tasa de citotoxicidad específica (%) = (radioactividad en presencia de anticuerpo – radioactividad en ausencia de anticuerpo)/(radioactividad máxima – radioactividad en ausencia de anticuerpo) x 100. Se puede producir un gráfico cambiando la proporción de células diana a células efectoras o la concentración de anticuerpo.

[0373] Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de citotoxidad dependiente del complemento (CDC) como se describe en, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al.,J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Brevemente, varias concentraciones de una variante de polipéptido y un complemento humano se diluyen con tampón. Se diluyen células que expresan un antígeno al que se une la variante de polipéptido hasta una densidad de aproximadamente 1 x 10<6>células/ml. Una mezcla de la variante de polipéptido, complemento humano diluido, y células que expresan antígeno se añade a una placa de cultivo de 96 pocillos de fondo plano e incuba a 37ºC y CO<2>al 5% durante 2 horas para fomentar lisis celular mediada por complemento. Después, se añaden 50 μl de azul alamar (Accumed International) a cada pocillo y se incuba a 37ºC durante la noche. Se mide la absorbancia usando un fluorómetro con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados se representan en unidades de fluorescencia relativas (UFR). Se pueden calcular las concentraciones de la muestra a partir una curva patrón, y se describe el porcentaje de actividad comparado al polipéptido no variante para la variante de polipéptido de interés.

[0374] Un método de ensayo ejemplar para la actividad ADCP puede comprender lo siguiente: recubrir biopartículas diana, tal comoE. colimarcada con FITC (Molecular Probes) oStaphylococcus aureus-FITC, con un anticuerpo de prueba; formar partículas opsonizadas; añadir las partículas opsonizadas anteriores a células efectoras THP-1 (línea celular monocítica, disponible de ATCC) en una proporción de 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1, o 100:1 para inducir fagocitosis mediada por FcγR; preferiblemente incubar las células yE. coli-FITC/anticuerpo a 37ºC durante 1,5 horas; después de la incubación, añadir azul de tripán a las células (preferiblemente a temperatura ambiente durante de dos a tres minutos) para extinguir la fluorescencia de las bacterias que no se han incorporado en las células y se han unido al exterior de la superficie celular; transferir las células a tampón FACS (por ejemplo, BSA al 0,1% y azida sódica al 0,1% en PBS) para ensayar la fluorescencia de las células THP-1 usando FACS (por ejemplo, BD FACS Calibur). Para ensayar el nivel de ADCP, el portal preferiblemente se ajusta en las células THP-1 y se mide la intensidad de fluorescencia mediana. En la forma de realización más preferida, el ensayo de ACDP se realiza usandoE. coli-FITC en un medio (control);E. coli-FITC y células THP-1 (usado como actividad ACDP independiente de FcγR); yE. coli-FITC, células THP-1, y un anticuerpo de prueba (usado como actividad ACDP dependiente de FcγR).

[0375] La actividad citotóxica por un anticuerpo habitualmente implica la unión del anticuerpo a la superficie celular. Si un antígeno se expresa en la superficie de la célula diana se puede confirmar adecuadamente por métodos que conocen los expertos en la materia, tal como FACS.

[0376] La activación de la inmunidad se puede detectar usando respuestas inmunitarias celulares o humorales como indicadores. La activación de la inmunidad específicamente incluye nivel de expresión aumentado de citoquinas (por ejemplo, IL-6, G-CSF, IL-12, TNFα, e IFNγ) o sus receptores, proliferación fomentada de células inmunitarias (por ejemplo, células B, células T, células NK, macrófagos, y monocitos), estado de activación elevado, funciones elevadas, y actividad citotóxica aumentada. Especialmente, la activación de células T se puede detectar midiendo expresiones elevadas de marcadores de activación tal como CD25, CD69, e ICOS. Por ejemplo, se sabe que pacientes a los que se administró un anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab, tienen células T ICOS<+>CD4<+>aumentadas en sangre periférica después de la administración, y se considera que esto es un efecto de activación del estado inmunitario sistémico por administración de un anticuerpo anti-CTLA-4 (Cancer Immunol. Res. (2013) 1(4): 229-234).

[0377] La activación de células T requiere no solo estimulación a través de un receptor de antígeno (TCR), sino también estimulación auxiliar a través de CD28. Cuando CD28 en la superficie de una célula T se une a B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86) en la superficie de una célula presentadora de antígeno, la señal auxiliar se transmite a la célula T y entonces la célula T se activa. Por otra parte, CTLA-4 se expresa en la superficie de células T activadas. Puesto que CTLA-4 se une a CD80 y CD86 con afinidad más fuerte que la de CD28, interacciona con CD80 y CD86 en preferencia a CD28, produciendo la supresión de la activación de células T.

[0378] Basado en tal mecanismo de acción, la actividad inhibidora contra CTLA-4 se puede medir como la actividad de inhibir la unión de CTLA-4 a CD80 o CD86. En un ejemplo, un ensayo para medir la actividad inhibidora contra CTLA-4 comprende las siguientes etapas: dejar que una proteína CTLA-4 purificada se una a un soporte tal como una placa de microtitulación o perlas magnéticas; añadir un anticuerpo de prueba y CD80 o CD86 soluble marcado; lavar los componentes sin unir; y cuantificar el CD80 o CD86 marcado unido. Si el anticuerpo de prueba da reacción cruzada con CD28 o no se puede confirmar realizando un ensayo similar en el que se usa CD28 en lugar de CTLA-4. Además, en otro ejemplo, también se puede usar un ensayo funcional que detecta la activación de células T como se describe anteriormente para medir la actividad inhibidora contra CTLA-4. Por ejemplo, cuando un anticuerpo de prueba que tiene actividad inhibidora de CTLA-4 se añade a un sistema en el que la activación de células T se mide estimulando una población de células T con células que expresan CD80 o CD86, la activación de células aumenta más.

[0379] D. Inmunoconjugados

[0380] En el presente documento también se divulgan inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-CTLA-4 del presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tal como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores de crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), o isotopos radioactivos.

[0381] En un ejemplo, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo, pero no limitado a un maitansinoide (véase las patentes en EE UU NO.5.208.020, 5.416.064, y la patente europea EP 0425235 B1); una auristatina tal como fracciones de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véase las patentes en EE UU No.4.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véase las patentes en EE UU No. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinmanet al., Cancer Res.53: 3336-3342 (1993); y Lodeet al., Cancer Res.58: 2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (véase Kratzet al., Current Med. Chem.13: 477-523 (2006); Jeffreyet al., Bioorganic & Med. Chem. Letters16: 358-362 (2006); Torgovet al., Bioconj. Chem.16: 717-721 (2005); Nagyet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97: 829-834 (2000); Dubowchiket al., Bioorg. & Med. Chem. Letters12: 1529-1532 (2002); Kinget al., J. Med. Chem.45: 4336-4343 (2002); y patente en EE UU No. 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

[0382] En otro ejemplo, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero no limitado a, cadena A de la difteria, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas diantina, proteínas dePhytolacca americana(PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor demomordiba charantia, curcina, crotina, inhibidor desaponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos.

[0383] En otro ejemplo, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Están disponibles una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen<211>At,<131>I,<125>I,<90>Y,<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<212>Pb e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, Tc-99m o<123>I, o un marcador de espín para imagenología de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imagenología de resonancia magnética, IRM), tal como yodo-123 otra vez, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

[0384] Los conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico se pueden hacer usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tal como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bisactivos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina ricina se puede preparar como se describe en Vitettaet al., Science238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocinatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador cortable” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un enlazador lábil a ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chariet al., Cancer Res.52: 127-131 (1992); patente en EE U No.5.208.020).

[0385] Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento expresamente contemplan, pero no están limitados a, tales conjugados preparados con reactivos de entrecruzamiento incluyendo, pero no limitados a BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE UU).

[0386] E. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección

[0387] En ciertos ejemplos, cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de CTLA-4 en una muestra biológica. El término “detectar” como se usa en el presente documento abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertos ejemplos, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como suero, sangre completa, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, esputo, líquido oral, líquido cerebral, líquido amniótico, fluido ascítico, leche, calostro, secreción mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lacrimal, jugo gástrico, líquido sinovial, fluido ascítico, fluido ocular, y moco.

[0388] En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto ilustrativo adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de CTLA-4 en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-CTLA-4 como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-CTLA-4 a CTLA-4, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-CTLA-4 y CTLA-4. Tal método puede ser un métodoin vitrooin vivo. En un ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 se usa para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-CTLA-4, por ejemplo, donde CTLA-4 es un biomarcador para selección de pacientes.

[0389] Un anticuerpo de la presente invención se puede usar en, por ejemplo, comprobar el estado de respuesta inmunitaria y diagnosticar disfunción del sistema inmunitario.

[0390] En ciertos ejemplos, se proporcionan anticuerpos anti-CTLA-4 marcados. Los marcadores incluyen, pero no están limitados a, marcadores o fracciones que se detectan directamente (tal como marcadores fluorescentes, cromóforos, densos a los electrones, quimioluminiscentes, y radioactivos), así como fracciones, tal como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, mediante una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, los radioisótopos<32>P,<14>C,<125>I,<3>H y<131>I, fluoróforos tal como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente en EE UU No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacinedionas, peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, heterocíclico oxidasas tal como uricasa y xantina oxidasa, las acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.

[0391] F. Formulaciones farmacéuticas

[0392] La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención como se define por las reivindicaciones y un soporte farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-CTLA-4 como se describen en el presente documento se preparan mezclando tal anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con una o más soportes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los soportes farmacéuticamente aceptables son en general no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no están limitados a: tampones tal como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tal como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tal como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glucina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tal como polietilenglicol (PEG). Los soportes farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento además incluyen agentes de dispersión de fármacos intersticiales tal como glucoproteínas de hialuronidasa activas neutras solubles (sHASEPG), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tal como rHuPH20 (HYLENEX (marca registrada), Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEPG ejemplares y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente en EE UU No. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEPG se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tal como condroitinasas.

[0393] Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizados ejemplares en la patente en EE UU No. 6.267.958. Las formulaciones acuosas de anticuerpos incluyen las descritas en la patente en EE UU No.6.171.586 y el documento WO 2006/044908, las últimas formulaciones incluyen un tampón histidina-acetato.

[0394] La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferiblemente esos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.

[0395] Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan enRemington's Pharmaceutical Sciences16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

[0396] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas, o microcápsulas.

[0397] Las formulaciones que se van a usar para administraciónin vivoson en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0398] La invención proporciona la formulación farmacéutica de la invención como se define por las reivindicaciones para uso en tratar un tumor que preferiblemente es cáncer de mama o cáncer de hígado.

[0400] G. Métodos y composiciones terapéuticos

[0402] Cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento se puede usar en métodos terapéuticos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los anticuerpos, formulaciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia o para diagnóstico.

[0404] En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 como se define por las reivindicaciones para uso en tratar un tumor. En ciertas formas de realización, se proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en un método de tratamiento. En ciertas formas de realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en un método de tratar un individuo que tiene un tumor que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CTLA-4. En tal ejemplo, el método además comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe posteriormente. En formas de realización adicionales, se divulga un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en dañar células. En ciertas formas de realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en un método de dañar células en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CTLA-4 para dañar células. En formas de realización adicionales, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en activación inmunitaria. En ciertas formas de realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-CTLA-4 para uso en un método de activar la inmunidad en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CTLA-4 para activar la inmunidad. Un “individuo” según cualquiera de las formas de realización anteriores es preferiblemente un humano.

[0406] En algunas formas de realización, el tumor es un tumor sólido. En un tumor sólido, las células tumorales habitualmente proliferan para formar una población, y el tejido tumoral está formado principalmente por estas células. Además, los tejidos tumorales en organismos vivos con frecuencia están infiltrados por células inmunitarias tal como linfocitos, que también constituyen parte de tejidos tumorales. En algunas formas de realización, los tejidos tumorales están infiltrados con células inmunitarias, particularmente células T reguladoras (Treg). En una forma de realización, el daño a las células se provoca por actividad ADCC, actividad CDC, o actividad ADCP. En una forma de realización, se dañan células que expresan CTLA-4 en su superficie celular. En otra forma de realización, las células que se van a dañar con células Treg. En ciertas formas de realización, se dañan células Treg que se han infiltrado en tejidos tumorales. En una forma de realización, la inmunidad se activa por daño a células Treg (se cancela la inmunosupresión por células Treg). En formas de realización adicionales, se activa la inmunidad (particularmente inmunidad antitumoral) en tejidos tumorales. En algunas formas de realización, la activación de la inmunidad es activación de células T.

[0408] En aspectos adicionales, el grado de efecto como un medicamento producido por el anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención varía según el tejido en un individuo. En ciertas formas de realización, ese grado de efecto cambia dependiendo de la concentración de un compuesto que contiene adenosina en el tejido. En formas de realización adicionales, el efecto aumenta en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina comparado con un tejido con una baja concentración del compuesto que contiene adenosina. Los tejidos con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina incluyen, por ejemplo, tejidos tumorales. Los tejidos con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina incluyen, por ejemplo, tejidos no tumorales tal como tejidos normales. En algunas formas de realización, la inmunidad se activa más fuertemente en un tejido tumoral que en un tejido no tumoral. Tales diferencias en respuesta no necesitan observarse para todas las dosis de los anticuerpos anti-CTLA-4, sino que necesitan solo observarse para un intervalo particular de dosis. En otra forma de realización, la inmunidad se activa a una dosis menor en un tejido tumoral que en un tejido no tumoral. Además, en otra forma de realización, se observa un efecto terapéutico a una menor dosis que esa a la que se observa un efecto secundario. En ciertas formas de realización, el efecto terapéutico es la expresión de un efecto antitumoral (por ejemplo, regresión tumoral e inducción de muerte celular o inhibición de crecimiento en células tumorales), y el efecto secundario es el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria (incluyendo daño a tejidos normales debido a respuestas inmunitarias excesivas).

[0410] En un aspecto adicional, el grado de efecto como un medicamento producido por el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento varía según si tiene o no actividad de unión a CTLA-4 que es dependiente de un compuesto que contiene adenosina (es decir, cambia según la concentración de un compuesto que contiene adenosina). En una forma de realización, los anticuerpos anti-CTLA-4 divulgados en el presente documento son anticuerpos cuya actividad de unión a CTLA-4 aumenta según sube la concentración de un compuesto que contiene adenosina. En algunas formas de realización, un anticuerpo anti-CTLA-4 control es un anticuerpo que no tiene actividad de unión a CTLA-4 dependiente de la concentración de un compuesto que contiene adenosina. En ciertas formas de realización, el anticuerpo que no tiene actividad de unión a CTLA-4 dependiente de la concentración de un compuesto que contiene adenosina significa un anticuerpo en que la diferencia en la actividad de unión a CTLA-4 entre en presencia y en ausencia del compuesto es, por ejemplo, menos de dos veces, menos de 1,8 veces, menos de 1,5 veces, menos de 1,3 veces, menos de 1,2 veces, o menos de 1,1 veces. Es deseable que el anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención y el anticuerpo anti-CTLA-4 control tengan actividad de unión a CTLA-4 sustancialmente equivalente entre sí en presencia de una cantidad suficiente de un compuesto que contiene adenosina.

[0412] En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control se diferencian en el efecto como un medicamento producido por cada anticuerpo. En ciertas formas de realización, se diferencian en el efecto como medicamento en un tejido con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina. Los tejidos con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina incluyen, por ejemplo, tejidos no tumorales tal como tejidos normales. Los anticuerpos anti-CTLA-4 también se pueden proporcionar como una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo. En algunas formas de realización, en un tejido con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento muestra un bajo nivel de activación de inmunidad comparado con el anticuerpo anti-CTLA-4 control. En algunas formas de realización, en un tejido con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina, las dosis del anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento requeridas para activar inmunidad son altas comparadas con el anticuerpo anti-CTLA-4 control. En algunas formas de realización, en un tejido con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento tiene un nivel bajo de efecto secundario comparado con el anticuerpo anti-CTLA-4 control. En algunas formas de realización, en un tejido con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina, las dosis del anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento a las que se observa el efecto secundario son altas comparadas con el anticuerpo anti-CTLA-4 control. Tales diferencias en respuesta no necesitan observarse en todos los tejidos (por ejemplo, todos los tejidos con una baja concentración de un compuesto que contiene adenosina) sino que solo necesitan observarse en algunos tejidos. En algunas formas de realización, el efecto secundario es una enfermedad autoinmunitaria (incluyendo daño a tejidos normales debido a respuestas inmunitarias excesivas).

[0413] En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control producen cada uno un efecto sustancialmente equivalente como un medicamento. En ciertas formas de realización, producen un efecto sustancialmente equivalente como un medicamento en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina. Los tejidos con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina incluyen, por ejemplo, tejidos tumorales. Los anticuerpos anti-CTLA-4 también se pueden proporcionar como formulaciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo. En algunas formas de realización, en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control muestran un nivel sustancialmente equivalente de activación de inmunidad. En algunas formas de realización, en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control son sustancialmente equivalentes en las dosis requeridas para activar inmunidad. En algunas formas de realización, en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control tienen un nivel sustancialmente equivalente de efecto terapéutico. En algunas formas de realización, en un tejido con una alta concentración de un compuesto que contiene adenosina, el anticuerpo anti-CTLA-4 divulgado en el presente documento y el anticuerpo anti-CTLA-4 control son sustancialmente equivalentes en la dosis a la que se observa el efecto terapéutico. En ciertas formas de realización, el efecto terapéutico es la expresión de un efecto antitumoral (por ejemplo, regresión tumoral e inducción de muerte celular o inhibición de crecimiento en células tumorales).

[0415] En ciertas formas de realización, el tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama y cáncer de hígado.

[0417] En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-CTLA-4 en la fabricación o preparación de un medicamento. El medicamento es para el tratamiento de un tumor. En una forma de realización adicional, el medicamento es para uso en un método de tratar un tumor que comprende administrar a un individuo que tiene un tumor una cantidad eficaz del medicamento. En tal ejemplo, el método además comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe posteriormente. En una forma de realización adicional, el medicamento es para dañar células. En una forma de realización adicional, el medicamento es para uso en un método de dañar células en un individuo que comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz del medicamento para dañar células. En una forma de realización adicional, el medicamento es para activar inmunidad. En una forma de realización adicional, el medicamento es para uso en un método de activar inmunidad en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para activar inmunidad. Un “individuo” según cualquiera de las formas de realización anteriores puede ser un humano.

[0419] En un aspecto ilustrativo adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar un tumor. En una forma de realización, el método comprende administrar a un individuo que tiene tal tumor una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CTLA-4. En tal ejemplo, el método además comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe posteriormente. Un “individuo” según cualquiera de las formas de realización anteriores puede ser un humano.

[0421] En un aspecto ilustrativo adicional, la presente divulgación proporciona un método para dañar células en un individuo. En una forma de realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo antiCTLA-4 para dañar células. En un aspecto ilustrativo adicional, la presente divulgación proporciona un método para activar inmunidad en un individuo. En una forma de realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CTLA-4 para activar inmunidad. En una forma de realización, un “individuo” es un humano.

[0423] En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una forma de realización, la formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento y un soporte farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica de la invención comprende el anticuerpo de la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica de la invención para uso en tratar un tumor. En una forma de realización, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica de la invención para uso en dañar células. En una forma de realización, se proporciona una formulación farmacéutica de la invención para uso en activar inmunidad. Una formulación farmacéutica divulgada en el presente documento puede comprender cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe posteriormente.

[0425] En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica (por ejemplo, para uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriormente mencionados), que comprende mezclar cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 proporcionados en el presente documento con un soporte farmacéuticamente aceptable. En un ejemplo, el método para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica además comprende añadir al menos un agente terapéutico adicional al medicamento o formulación farmacéutica.

[0427] Los anticuerpos de la presente invención como se definen por las reivindicaciones se pueden usar solos o en combinación con otros agentes de terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención como se define por las reivindicaciones se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En ciertas formas de realización, un agente terapéutico adicional es un inhibidor de punto de control inmunitario, inhibidor de EGFR, inhibidor de HER2, o agente quimioterapéutico. El inhibidor de punto de control inmunitario puede incluir, por ejemplo, un inhibidor anti-CTLA-4, inhibidor anti-PD-1, inhibidor anti-PD-L1, inhibidor anti-PD-L2, inhibidor anti-TIM-3, inhibidor anti-LAG-3, inhibidor anti-TIGIT, inhibidor anti-BTLA, e inhibidor anti-VISTA. Un inhibidor anti-CTLA-4 puede incluir, por ejemplo, ipilimumab y tremelimumab. Un inhibidor anti-PD-1 puede incluir, por ejemplo, nivolumab y pembrolizumab. Un inhibidor anti-PD-L1 puede incluir, por ejemplo, atezolizumab, durvalumab, y avelumab. Un inhibidor anti-PD-L2 puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-PD-L2. Un inhibidor anti-TIM-3 puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-TIM-3. Un inhibidor anti-LAG-3 puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-LAG-3. Un inhibidor anti-TIGIT puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-TIGIT. Un inhibidor anti-BTLA puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-BTLA. Un inhibidor anti-VISTA puede incluir, por ejemplo, anticuerpo inhibidor anti-VISTA. Un inhibidor de EGFR puede incluir, por ejemplo, cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, necitumumab, y zalutumumab. Un inhibidor de HER2 puede incluir, por ejemplo, trastuzumab, trastuzumab emtansina, y pertuzumab.

[0428] Tales terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la presente invención como se define por las reivindicaciones se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional o agentes. En un ejemplo, la administración del anticuerpo anti-CTLA-4 y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis días, entre sí. Los anticuerpos de la presente invención como se definen por las reivindicaciones también se pueden usar en combinación con terapia de radiación.

[0430] Un anticuerpo de la presente invención como se define por las reivindicaciones (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar, e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tal como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan varios planes de dosificación incluyendo, pero no limitados a, administración única o múltiples en varios puntos de tiempo, administración en embolada, e infusión de pulso.

[0432] Los anticuerpos de la presente invención como se definen por las reivindicaciones se formularían, dosificarían, y administrarían de una manera consistente con buena práctica médica. Factores para considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el plan de administración y otros factores que conocen los médicos. El anticuerpo no necesita formularse, pero opcionalmente está con uno o más agentes actualmente usados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. En general estos se usan a las mismas dosis y con rutas de administración descritas en el presente documento, o aproximadamente del 1 al 99% de las dosis descritas en el presente documento, o en cualquier dosis y por cualquier ruta que se determine empírica/clínicamente que es apropiada.

[0433] Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la presente invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de trastorno que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosis candidata inicial para administración al paciente, sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar desde aproximadamente 1 μg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de las condiciones, el tratamiento en general se sostendría hasta que se produzca una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo estará en el intervalo desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se puede administrar al paciente. Tales dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba desde aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de mayor carga inicial, seguida por una o más dosis menores. La evolución de esta terapia se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

[0434] Se entiende que cualquiera de las formulaciones anteriores o métodos terapéuticos se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado como se divulga en el presente documento en lugar de o además de un anticuerpo anti-CTLA-4. H. Artículos de manufactura

[0435] En otro aspecto ilustrativo, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un envase y una etiqueta o un prospecto asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV (intravenosa), etc. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. En envase contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un ingrediente activo en la composición es un anticuerpo divulgado en el presente documento. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la presente invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico o terapéutico adicional de otra forma. El artículo de manufactura puede además comprender un prospecto que indica que la composición se puede usar para tratar una afección particular. Alternativamente, o además, el artículo de manufactura puede además comprender un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada en fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

[0436] Los artículos de manufactura anteriores pueden incluir un inmunoconjugado de la presente invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-CTLA-4.

[0437] <Anticuerpos que comprenden una región Fc variante>

[0438] En un aspecto, se proporcionan anticuerpos que comprenden una región Fc variante. En algunos aspectos, los anticuerpos son proteínas de fusión de Fc. En ciertas formas de realización, las regiones Fc variantes comprenden al menos una alteración de residuo de aminoácido (por ejemplo, sustitución) comparado con la secuencia correspondiente en la región Fc de una secuencia nativa o una secuencia variante de referencia (en el presente documento se pueden denominar colectivamente la región Fc “parental”). La región Fc de una secuencia nativa habitualmente está compuesta como un homodímero que consiste en dos cadenas polipeptídicas idénticas. Las alteraciones de aminoácidos en las regiones Fc variantes en la presente invención se pueden introducir en cualquiera de las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc parental, o en ambas de las dos cadenas polipeptídicas.

[0439] En algunos aspectos, se proporcionan regiones Fc variantes cuya función se ha modificado comparada con la región Fc parental. En ciertos aspectos, las regiones Fc variantes tienen actividad de unión aumentada al receptor de Fcγ comparada con la región Fc parental. En ciertas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen actividad de unión aumentada a al menos un receptor de Fcγ seleccionado del grupo que consiste en FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, y FcγRIIIa, comparada a la región Fc parental. En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen actividad de unión aumentada a FcγRIIa. En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen actividad de unión aumentada a FcγRIIIa. En formas de realización adicionales, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen actividad de unión aumentada a FcγRIIa y FcγRIIIa.

[0440] En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácido en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 234, 235, 236, 298, 330, 332 y 334 según la numeración EU. Alternativamente, alteraciones de aminoácidos tal como las descritas en los documentos WO 2013/002362 y WO 2014/104165 se pueden usar similarmente en la presente invención.

[0441] En ciertas formas de realización, la actividad de unión de la región Fc parental y las regiones Fc variantes pueden representarse por un valor KD (constante de disociación). En una forma de realización, el valor de la proporción de [valor KD de la región Fc parental para FcγRIIa]/[valor KD de una región Fc variante para FcγRIIa] es, por ejemplo, 1,5 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más. En formas de realización adicionales, FcγRIIa puede ser FcγRIIa R o FcγRIIa H, o también puede ser ambos. En una forma de realización, el valor de la proporción de [valor KD de la región Fc parental para FcγRIIIa]/[valor KD de una región Fc variante para FcγRIIIa] es, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más, 100 o más, 200 o más, 300 o más, 500 o más, 1 x 10<3>o más, 2 x 10<3>o más, 3 x 10<3>o más, o 5 x 10<3>o más. En formas de realización adicionales, FcγRIIIa puede ser FcγRIIIa F o FcγRIIIa V, o también puede ser ambos.

[0442] En una forma de realización, los valores KD de las regiones Fc variantes para FcγRIIa son, por ejemplo, 1,0 x 10<-6>M o menos, 5,0 x 10<-7>M o menos, 3,0 x 10<-7>M o menos, 2,0 x 10<-7>M o menos, 1,0 x 10<-7>M o menos, 5,0 x 10<-8>M o menos, 3,0 x 10<-8>M o menos, 2,0 x 10<-8>M o menos, 1,0 x 10<-8>M o menos, 5,0 x 10<-9>M o menos, 3,0 x 10<-9>M o menos, 2,0 x 10<-9>M o menos, o 1,0 x 10<-9>M o menos. En formas de realización adicionales, FcγRIIa puede ser FcγRIIa R o FcγRIIa H, o también puede ser ambos. En una forma de realización, los valores KD de las regiones Fc variantes para FcγRIIIa son, por ejemplo, 1,0 x 10<-6>M o menos, 5,0 x 10<-7>M o menos, 3,0 x 10<-7>M o menos, 2,0 x 10<-7>M o menos, 1,0 x 10<-7>M o menos, 5,0 x 10<-8>M o menos, 3,0 x 10<-8>M o menos, 2,0 x 10<-8>M o menos, 1,0 x 10<-8>M o menos, 5,0 x 10<-9>M o menos, 3,0 x 10<-9>M o menos, 2,0 x 10<-9>M o menos, 1,0 x 10<-9>M o menos, 5,0 x 10<-10>M o menos, 3,0 x 10<-10>M o menos, 2,0 x 10<-10>M o menos, o 1,0 x 10<-10>M o menos. En formas de realización adicionales, FcγRIIIa puede ser FcγRIIIa F o FcγRIIIa V, o también puede ser ambos.

[0443] En otra forma de realización, la actividad de unión de las regiones Fc parental y variante se puede representar por un valor kd (constante de velocidad de disociación) en lugar de un valor KD.

[0444] La actividad de unión de las regiones Fc parental y variante se puede representar por la cantidad de unión a un receptor de Fcγ por cantidad unidad de la región Fc. Por ejemplo, en un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, la cantidad de unión de una región Fc inmovilizada en un chip sensor y la cantidad de unión de un receptor de Fcγ unido adicionalmente al mismo se miden como una unidad de resonancia (UR). El valor obtenido al dividir la cantidad de unión del receptor de Fcγ por la cantidad de unión de la región Fc se puede definir como la cantidad de unión del receptor de Fcγ por cantidad unidad de la región Fc. Los métodos específicos para medir y calcular tales cantidades de unión se describen en los ejemplos posteriores. En algunas formas de realización, el valor de la proporción [cantidad de unión de una región Fc variante a FcγRIIa]/[cantidad de unión de la región Fc parental a FcγRIIa] es, por ejemplo, 1,5 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más. En algunas formas de realización, el valor de la proporción [cantidad de unión de una región Fc variante a FcγRIIIa]/[cantidad de unión de la región Fc parental a FcγRIIIa] es, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más, 100 o más, 200 o más, 300 o más, 500 o más, 1 x 10<3>o más, 2 x 10<3>o más, 3 x 10<3>o más, o 5 x 10<3>o más.

[0445] En ciertas formas de realización, los valores KD, valores kd, valores de cantidad de unión y demás descritos en el presente documento y se miden o calculan realizando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie a 25ºC o 37ºC (véase, por ejemplo, el ejemplo 6 en el presente documento).

[0446] En ciertos aspectos, la región Fc variante en la presente invención tiene selectividad mejorada entre receptores de Fcγ activadores o inhibidores comparada con la región Fc parental. En otras palabras, la actividad de unión de la región Fc variante en la presente invención a un receptor de Fcγ activador está muy aumentada que esa a un receptor de Fcγ inhibidor, comparado con la región Fc parental. En ciertas formas de realización, el receptor de Fcγ activador es al menos un receptor de Fcγ seleccionado del grupo que consiste en FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIa F y FcγRIIIa V, y el receptor de Fcγ inhibidor es FcγRIIb. En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen selectividad mejorada entre FcγRIIa y FcγRIIb. En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen selectividad mejorada entre FcγRIIIa y FcγRIIb. En formas de realización adicionales, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen selectividad mejorada entre FcγRIIa y FcγRIIb y entre FcγRIIIa y FcγRIIb.

[0447] En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 236, 239, 268, 270 y 326 según la numeración EU. Alternativamente, alteraciones de aminoácidos tal como las descritas en los documentos WO 2013/002362 y WO 2014/104165 se pueden usar similarmente en la presente invención.

[0448] En ciertas formas de realización, la actividad de unión de la región Fc parental y las regiones Fc variantes pueden representarse por un valor KD (constante de disociación). La actividad de unión a FcγRIIa y FcγRIIIa son como se describe anteriormente. En una forma de realización, el valor de la proporción de [valor KD de la región Fc parental para FcγRIIb]/[valor KD de una región Fc variante para FcγRIIb] es, por ejemplo, 10 o menos, 5 o menos, 3 o menos, 2 o menos, 1 o menos, 0,5 o menos, 0,3 o menos, 0,2 o menos, o 0,1 o menos. En otra forma de realización, la actividad de unión de las regiones Fc parental y variante se puede representar por un valor kd (constante de velocidad de disociación) en lugar de un valor KD.

[0449] En otra forma de realización, la actividad de unión de las regiones Fc parental y variante se puede representar por la cantidad de unión anteriormente mencionada a un receptor de Fcγ por cantidad unidad de la región Fc. En algunas formas de realización, el valor de la proporción de [cantidad de unión de una región Fc variante para FcγRIIb]/[cantidad de unión de la región Fc parental para FcγRIIb] es, por ejemplo, 10 o menos, 5 o menos, 3 o menos, 2 o menos, 1 o menos, 0,5 o menos, 0,3 o menos, 0,2 o menos, o 0,1 o menos. En algunas formas de realización, la cantidad de unión de la región Fc variante a FcγRIIb es, por ejemplo, 0,5 o menos, 0,3 o menos, 0,2 o menos, 0,1 o menos, 0,05 o menos, 0,03 o menos, 0,02 o menos, 0,01 o menos, 0,005 o menos, 0,003 o menos, 0,002 o menos, o 0,001 o menos.

[0450] En ciertos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención tienen estabilidad mejorada comparada con la región Fc parental. En ciertos ejemplos, la estabilidad es estabilidad termodinámica. La estabilidad termodinámica de un polipéptido se puede juzgar, por ejemplo, usando el valor Tm como un indicador. Los valores Tm se pueden medir usando técnicas que conocen los expertos en la materia, tal como dicroísmo circular (CD), calorimetría diferencial de barrido (DSC), y fluorimetría diferencial de barrido (DSF). En un ejemplo, en la región Fc variante en la presente invención, el valor Tm de la región CH2 aumenta en 0,1 grados o más, 0,2 grados o más, 0,3 grados o más, 0,4 grados o más, 0,5 grados o más, 1 grado o más, 2 grados o más, 3 grados o más, 4 grados o más, 5 grados o más, o 10 grados o más, comparada a esa en la región Fc parental.

[0451] En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 250 y 307 según la numeración EU. Alternativamente, alteraciones de aminoácidos tal como las descritas en el documento WO 2013/118858 se pueden usar similarmente.

[0452] En ciertos aspectos, la región Fc variante está compuesta de dos cadenas polipeptídicas con diferentes secuencias entre sí. En un aspecto adicional, en la región Fc variante, la heterodimerización entre un primer polipéptido y un segundo polipéptido se ha fomentado. Cuando se produce una proteína heterodimérica usando un método recombinante, es preferible que cadenas de péptido diferentes entre sí se asocien preferentemente para formar un heterodímero, más que cadenas polipeptídicas idénticas se asocien para formar un homodímero. Si la heterodimerización en una región Fc variante se fomenta o no se puede juzgar, por ejemplo, separando homodímeros y heterodímeros de las regiones Fc variantes producidas por una técnica tal como cromatografía y determinando la proporción de cada componente.

[0453] En algunas formas de realización, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 349, 356, 366, 368, 407, y 439 según la numeración EU. Alternativamente, alteraciones de aminoácidos descritas en los documentos WO 2006/106905 y WO 1996/27011 se pueden usar similarmente en la presente invención.

[0454] En ciertos aspectos, la región variante en la presente invención tiene actividad de unión aumentada a FcRn a pH ácido. En algunos ejemplos, el pH ácido significa pH de 4,0 a 6,5. En ejemplos adicionales, el pH ácido es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en pH 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, y 6,5. En ciertos ejemplos, el pH ácido es pH 5,8.

[0455] En algunos ejemplos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 428, 434, 436, 438 y 440 según la numeración EU. Alternativamente, alteraciones de aminoácidos descritas en el documento WO 2016/125495 se pueden usar similarmente.

[0456] En un aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende al menos una alteración de aminoácidos en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368, 407, 428, 434, 436, 438, 439 y 440 según la numeración EU.

[0457] En ciertos aspectos, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 y 334 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, y 326 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 307, 326 y 334 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0458] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 332 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 332 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental.

[0459] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 356 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 356 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental.

[0460] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 366 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental.

[0461] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 349 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 349 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental.

[0462] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 332 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 332 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0463] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 330 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 330 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0464] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 439 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 439 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0465] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además alteraciones de aminoácidos en las posiciones 366, 368 y 407 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además alteraciones de aminoácidos en las posiciones 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0466] En otro aspecto, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 356 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende además una alteración de aminoácido en la posición 356 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0467] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 349, 356, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En un aspecto adicional, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 307, 326, 334, 356, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0468] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 356, y 439 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 y 356 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334, y 439 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0469] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0470] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, y 439 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 y 356 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, y 439 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0471] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0472] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, y 439 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 y 356 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, y 439 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0473] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0474] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0475] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0476] En algunos aspectos, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368, y 407 según la numeración EU. En aspectos adicionales, la región Fc variante en la presente invención comprende alteraciones de aminoácidos en (i) las posiciones 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349 y 366 según la numeración EU en el primer polipéptido de la región Fc parental, y (ii) posiciones 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 y 407 según la numeración EU en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0477] En formas de realización adicionales, las regiones Fc variantes en la presente invención comprenden al menos una alteración de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (i) Tyr o Phe en la posición 234, Gln en la posición 235, Trp en la posición 236, Met en la posición 239, Val en la posición 250, Asp en la posición 268, Glu en la posición 270, Ala en la posición 298, Pro en la posición 307, Asp en la posición 326, Glu en la posición 332, Cys en la posición 349, Lys en la posición 356, y Trp en la posición 366, según la numeración EU, en el primer polipéptido de la región Fc parental; y (ii) Ala en la posición 236, Val en la posición 250, Glu en la posición 270, , Ala en la posición 298, Pro en la posición 307, Asp en la posición 326, Met o Lys en la posición 330, Asp o Glu en la posición 332,Glu en la posición 334, Cys en la posición 356, Ser en la posición 366, Ala en la posición 368, Val en la posición 407, y Glu en la posición 439, según la numeración EU, en el segundo polipéptido de la región Fc parental.

[0478] En aspectos adicionales, las regiones Fc variantes en la presente invención además comprenden cualquiera de las alteraciones de aminoácidos (a) a (d) siguientes:

[0479] (a) Ala en la posición 434 según la numeración EU;

[0480] (b) Ala en la posición 434, Thr en la posición 436, Arg en la posición 438, y Glu en la posición 440, según la numeración EU;

[0481] (c) Leu en la posición 428, Ala en la posición 434, Thr en la posición 436, Arg en la posición 438, y Glu en la posición 440, según la numeración EU; y

[0482] (d) Leu en la posición 428, Ala en la posición 434, Arg en la posición 438, y Glu en la posición 440, según la numeración EU.

[0483] Se divulgan anticuerpos que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 43 a 46, 65, 66, 81, 207, 239, 253 a 271, 276, 277 y 278.

[0484] “Receptores de Fcγ” (en el presente documento denominados receptores de Fcγ, FcγR o FcgR) se refiere a receptores que se pueden unir a la región Fc de anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y prácticamente significa cualquier miembro de la familia de proteínas codificadas por los genes de receptores de Fcγ. En humanos, esta familia incluye FcγRI (CD64) incluyendo las isoformas FcγRIa, FcγRIb y FcγRIc; FcγRII (CD32) incluyendo las isoformas FcγRIIa (incluyendo los alotipos H131 (tipo H) y R131 (Tipo R)), FcγRIIb (incluyendo FcγRIIb-1 y FcγRIIb-2), y FcγRIIc; y FcγRIII (CD16) incluyendo las isoformas FcγRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158), y FcγRIIIb (incluyendo los alotipos FcγRIIIb-NA1 y FcγRIIIb-NA2), y cualquier FcγR humano, isoformas o alotipos de FcγR aun por descubrir, pero no está limitado a los mismos. Se han descrito FcγRIIb1 y FcγRIIb2 como variantes de ayuste de FcγRIIb humano. Además, se ha descrito una variante de ayuste nombrada FcγRIIb3 (J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385). Además de estas variantes de ayuste, FcyRIIb humano incluye todas las variantes de ayuste registradas en NCBI, que son NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, y NP_003992.3. Además, FcyRIIb humano incluye cada polimorfismo genético previamente descrito, así como FcyRIIb (Arthritis Rheum.48: 3242-3252 (2003); Konoet al.,Hum. Mol. Genet.14: 2881-2892 (2005); y Kyogojuet al.,Arthriti Rheum.46: 1242-1254 (2002)), y cada polimorfismo genético que se describa en el futuro.

[0485] En FcγRIIa, hay dos alotipos, uno donde el aminoácido en la posición 131 de FcγRIIa es histidina (tipo H) y el otro donde el aminoácido en la posición 131 está sustituido con arginina (tipo R) (Warrmerdam, J. Exp. Med.172: 19-25 (1990)).

[0486] El FcγR incluye FcγR derivados de humano, de ratón, rata, conejo y mono, pero no está limitado a los mismos, y puede derivar de cualquier organismo. Los FcγR de ratón incluyen FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) y FcγRIII-2 (CD16-2), y cualquier FcγR de ratón o isoformas de ratón, pero no está limitado a los mismos.

[0487] La secuencia de aminoácidos de FcγRI humano se muestran en SEQ ID NO: 131 (NP_000557.1); la secuencia de aminoácidos de FcγRIIa humano se muestra en SEQ ID NO: 132 (AAH20823.1), SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 150; la secuencia de aminoácidos de FcγRIIb se muestra en SEQ ID NO: 151 (AAI46679.1), SEQ ID NO: 169 o SEQ ID NO: 172; la secuencia de aminoácidos de FcγRIIIa human se muestra en SEQ ID NO: 174 (AAH33678.1), SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176 o SEQ ID NO: 177; y la secuencia de aminoácidos de FcγRIIIb humano se muestra en SEQ ID NO: 178 (AAI28563.1).

[0488] A diferencia del receptor de Fcγ que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas, FcRn humano es estructuralmente similar a polipéptidos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, mostrando del 22% al 29% de identidad de secuencia a moléculas de MHC de clase I (Ghetieet al.,Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn se expresa como un heterodímeto que consiste en una cadena β soluble o cadena ligera (β2 microglobulina) acomplejada con una cadena α transmembrana o cadena pesada. como MHC, la cadena α de FcRn comprende tres dominios extracelulares (α1, α2, y α3) y su corto dominio citoplásmico ancla la proteína a la superficie celular. Los dominios α1 y α2 interaccionan con el dominio de unión a FcRn de la región Fc del anticuerpo (Raghavanet al.,Immunity (1994) 1: 303-315). La secuencia de aminoácidos de FcRn humano se muestra en SEQ ID NO: 179 (NP_004098.1), y la secuencia de aminoácidos de β2 microglobulina se muestra en SEQ ID NO: 180.

[0489] Una “región Fc parental” como se usa en el presente documento se refiere a una región Fc antes de la introducción de alteración(es) de aminoácidos descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, la región Fc parental es una región Fc de una secuencia nativa (o una región Fc de un anticuerpo nativo). Un anticuerpo incluye, por ejemplo, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), e IgM. Un anticuerpo puede derivar de humano o mono (por ejemplo, cinomolgo, macaco rhesus, tití, chimpancé, o babuino). Un anticuerpo nativo puede incluir mutaciones naturales. Se describen una pluralidad de secuencias de alotipos de IgG debido a polimorfismo genético en “Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, y cualquiera de ellas se puede usar en la presente invención. En particular, para IgG1 humana, la secuencia de aminoácidos en las posiciones 356 a 358 (numeración EU) puede ser DEL o EEM. En ciertas formas de realización, la región Fc parental es una región Fc derivada de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 249), IgG2 humana (SEQ ID NO: 250), IgG3 humana (SEQ ID NO: 251), o IgG4 humana (SEQ ID NO: 252). En otra forma de realización, la región Fc parental es una región Fc derivada de una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 82 o SEQ ID NO: 158. En formas de realización adicionales, la región Fc parental puede ser una región Fc producida añadiendo alteración(es) de aminoácidos diferentes de la(s) alteración(es) de aminoácidos descritas en el presente documento a una región Fc de secuencia nativa (una región Fc de secuencia variante de referencia). Una región Fc de una secuencia nativa en general está constituida como un homodímero que consiste en dos cadenas polipeptídicas idénticas.

[0490] Además, se pueden combinar alteraciones de aminoácidos realizadas para otro(s) fin(es) en una región Fc variante descrita en el presente documento. Por ejemplo, sustituciones de aminoácidos que mejoran la actividad de unión a FcRn (Hintonet al., J. Immunol.176(1): 346-356 (2006); Dall'Acquaet al., J. Biol. Chem.281(33): 23514-23524 (2006); Petkovaet al., Intl. Immunol.18(12): 1759-1769 (2006); Zalevskyet al., Nat. Biotechnol.28(2): 157-159 (2010); documentos WO 2006/019447; WO 2006/053301; y WO 2009/086320), y sustituciones de aminoácidos para mejorar la heterogeneidad o estabilidad de anticuerpos (documento WO 2009/041613) se pueden añadir. Alternativamente, polipéptidos con la propiedad de fomentar depuración de antígeno, que se describen en los documentos WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 o WO 2013/180201, polipéptidos con la propiedad de unión específica a un tejido diana, que se describen en el documento WO 2013/180200, polipéptidos con la propiedad de unión repetida a una pluralidad de moléculas de antígeno, que se describen en los documentos WO 2009/125825, WO 2012/073992 o WO 2013/047752, se pueden combinar con una región Fc variante descrita en el presente documento. Alternativamente, con el objetivo de conferir capacidad de unión a otros antígenos, las alteraciones de aminoácidos divulgadas en los documentos EP1752471 y EP1772465 se pueden combinar en CH3 de una región Fc variante descrita en el presente documento. Alternativamente, con el objetico de aumentar la retención en plasma, alteraciones de aminoácidos que disminuyen el pI de la región constante (documento WO 2012/016227) se pueden combinar en una región Fc variante descrita en el presente documento. Alternativamente, con el objetico de fomentar la absorción en células, alteraciones de aminoácidos que aumentan el pI de la región constante (documento WO 2014/145159) se pueden combinar en una región Fc variante descrita en el presente documento. Alternativamente, con el objetivo de fomentar la eliminación de una molécula diana del plasma, alteraciones de aminoácidos que aumentan el pI de la región constante (documento WO 2016/125495) se pueden combinar en una región Fc variante descrita en el presente documento. En un ejemplo, tal alteración puede incluir, por ejemplo, sustitución en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en posiciones 311, 343, 384, 399, 400, y 413 según la numeración EU. En un ejemplo adicional, tal sustitución puede ser una sustitución de un aminoácido con Lys o Arg en cada posición.

[0491] Además, también se pueden usar técnicas de producción de anticuerpo heterodimerizado que usan asociación de CH1 y CL de anticuerpo, y asociación de VH y VL, que se describen en el documento WO 2011/028952.

[0492] Como con el método descrito en los documentos WO 2008/119353 y WO 2011/131746, también es posible usar la técnica de producir anticuerpos heterodimerizados produciendo dos tipos de anticuerpos heterodimerizados de antemano, incubar los anticuerpos en condiciones reductoras para disociarlos, y dejarlos asociarse de nuevo.

[0493] Además, como con el método descrito en el documento WO 2012/058768, es posible usar la técnica de producir anticuerpos heterodimerizados añadiendo alteraciones a los dominios CH2 y CH3.

[0494] Cuando se expresan simultáneamente dos polipéptidos que comprenden una región Fc variante que tiene diferentes secuencias de aminoácidos, con el fin de producir polipéptidos que comprenden regiones Fc variantes heterólogas, polipéptidos que comprenden regiones Fc variantes homólogas también se producen habitualmente como impurezas. En tales casos, los polipéptidos que comprenden regiones Fc variantes heterólogas se pueden obtener eficazmente separándolos y purificándolos de polipéptidos que comprenden regiones Fc variantes homólogas usando tecnologías conocidas. Se ha descrito un método para separar y purificar eficazmente anticuerpos heterodimerizados de anticuerpos homodimerizados usando cromatografía de intercambio iónico, introduciendo alteraciones de aminoácidos en las regiones variables de los dos tipos de cadenas pesadas de anticuerpos para crear una diferencia en puntos isoeléctricos entre los anticuerpos homodimerizados y los anticuerpos heterodimerizados (documento WO 2007/114325). Se ha descrito otro método para purificar anticuerpos heterodimerizados usando cromatografía de proteína A, construyendo un anticuerpo heterodimerizado que comprende dos tipos de cadenas pesadas derivadas de IgG2a de ratón que se une a proteína A e IgG2b de rata que no se une a proteína A (documentos WO 1998/050431 y WO 1995/033844).

[0495] Además, un anticuerpo heterodimerizado se puede purificar eficazmente usando cromatografía de proteína A, sustituyendo residuos de aminoácidos en las posiciones 435 y 436 (numeración EU), que están localizados en el sitio de unión a proteína A de una cadena pesada de anticuerpo, con aminoácidos tales como Tyr o His, para dar afinidades de unión a proteína A diferentes.

[0496] En la presente invención, alteración de aminoácidos significa cualquiera de sustitución, deleción, adición, inserción, y modificación, o una combinación de las mismas. En la presente invención, alteración de aminoácidos se puede reformular como mutación de aminoácidos.

[0497] El número de alteraciones de aminoácidos introducidas en una región Fc no está limitado. En ciertas formas de realización puede ser 1, 2 o menos, 3 o menos, 4 o menos, 5 o menos, 6 o menos, 8 o menos, 10 o menos, 12 o menos, 14 o menos, 16 o menos, 18 o menos, o 20 o menos.

[0498] En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante. En aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona métodos de producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante cuya función se ha modificado. En algunos aspectos, los anticuerpos son proteínas de fusión de Fc. En ciertas formas de realización, esos métodos comprenden introducir al menos una alteración de aminoácidos en la región Fc parental. En ciertas formas de realización, esos métodos comprenden: (i) proporcionar un anticuerpo/anticuerpos que comprende la región Fc parental; y (ii) introducir al menos una alteración de aminoácidos en la región Fc parental. En ciertas formas de realización, esos métodos pueden además comprender (iii) medir la función del anticuerpo/anticuerpos que comprende la región Fc variante. Una región Fc nativa habitualmente está compuesta de dos cadenas polipeptídicas idénticas. Se pueden introducir alteraciones de aminoácidos a la región Fc parental en cualquiera de las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc parental, o en ambas de las dos cadenas polipeptídicas.

[0499] En una forma de realización, el método de producir el anticuerpo/anticuerpos que comprende la región Fc variante comprende: (i) proporcionar uno o más ácidos nucleicos que codifican anticuerpos que comprenden la región Fc parental; (ii) introducir al menos una mutación en la región(es) que codifican la región Fc parental en los ácidos nucleicos; (iii) introducir los ácidos nucleicos producid en (ii) en una célula huésped; y (iv) cultivar la célula huésped descrita en (iii) de modo que se exprese el anticuerpo/anticuerpos que comprende la región Fc variante. En ciertas formas de realización, los métodos anteriores además comprenden (v) recoger el anticuerpo/anticuerpos que comprende la región Fc variante del cultivo de la célula huésped descrito en (iv).

[0500] En ciertas formas de realización, los ácidos nucleicos producidos en (ii) se pueden incluir en uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión).

[0501] En algunas formas de realización, las alteraciones de aminoácidos usadas en los métodos de producción divulgados en el presente documento se seleccionan de cualquier alteración individual seleccionada de entre alteraciones de aminoácidos que pueden estar comprendidas en las regiones Fc variantes mencionadas anteriormente, combinaciones de las alteraciones individuales, o las alteraciones combinadas enumeradas en las tablas 26 a 30. Una región Fc se puede obtener reeluyendo la fracción adsorbida en la columna de proteína A después de digerir parcialmente anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o tal usando una proteasa tal como pepsina. La proteasa no está particularmente limitada siempre que pueda digerir un anticuerpo de longitud completa de modo que se produzcan Fab y F(ab’)2 de una manera restrictiva ajustando apropiadamente las condiciones de reacción de la enzima tal como pH, y los ejemplos incluyen pepsina y papaína.

[0502] Los anticuerpos definidos por las reivindicaciones que comprenden una región Fc variante de la presente invención se pueden producir por otros métodos conocidos en la técnica además de los métodos de producción mencionados anteriormente. También se divulgan anticuerpos que comprenden una región Fc variante producidos por los métodos de producción descritos en el presente documento.

[0503] Los métodos de ensayo descritos en el presente documento o varios métodos de medida conocidos en la técnica se pueden usar para identificar o cribar las regiones Fc variantes proporcionadas en el presente documento, o para aclarar sus propiedades físicas o químicas o actividades biológicas.

[0504] Los ensayos para determinar la actividad de unión de un anticuerpo que contiene una región Fc variante hacia uno o más miembros de la familia FcR se describen en el presente documento o conocen de otra manera en la técnica. Tales ensayos de unión incluyen, pero no están limitados a ensayo de resonancia de plasmón de superficie, cribado por ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada (ALPHA), ELISA y separación celular activada por fluorescencia (FACS) (Lazaret al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA (2006) 103(11): 4005-4010).

[0505] En una forma de realización, la actividad de unión del anticuerpo que comprende una región Fc variante a miembros de la familia FcR se puede medir usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie. Por ejemplo, varios FcR se someten a interacción como analitos con un anticuerpo que comprende una región Fc variante inmovilizado o capturado en un chip sensor usando métodos y reactivos conocidos (por ejemplo, proteína A, proteína L, proteína A/G, proteína G, anticuerpos anti-cadena λ, anticuerpos anti-cadena κ, péptidos antigénicos, y proteínas antigénicas). Alternativamente, los FcR se pueden inmovilizar o capturar en un chip sensor, y un anticuerpo que comprende una región Fc variante se puede usar como analito. Como resultado de tales interacciones, se obtienen sensorgramas de unión y analizándolos, se pueden calcular los valores de la constante de disociación (KD) de tales uniones. Además, la diferencia en el valor de unidad de resonancia (UR) en sensorgramas antes y después de someterse a interacción con un FcR (es decir, la cantidad de unión del FcR) se puede usar como un indicador de la actividad de unión de un anticuerpo que comprende una región Fc variante al FcR. Además, el valor corregido obtenido dividiendo la cantidad de unión anteriormente mencionada del FcR por la diferencia en el valor de UR en los sensorgramas antes y después de que el anticuerpo que comprende una región Fc variante se inmovilice o capture en el chip sensor (es decir, la cantidad de unión del anticuerpo que comprende una región Fc variante) (es decir, el valor de corrección es la cantidad de unión del FcR por cantidad unidad del anticuerpo que comprende una región Fc variante) se puede usar como un indicador de la actividad de unión.

[0506] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que comprende una región Fc variante. Las formulaciones farmacéuticas anteriores además comprenden soportes farmacéuticamente aceptables.

[0507] Ejemplos

[0508] Lo siguiente muestra ejemplos de métodos y composiciones de la presente invención. Se entenderá que otros varios ejemplos se pueden llevar a cabo en vista de las descripciones generales mencionadas anteriormente.

[0509] [Ejemplo 0] Concepto de un anticuerpo interruptor que ejerce actividad citotóxica dependiente de anticuerpo contra marcadores de superficie celular de células T reguladoras solo en microentornos cancerosos

[0510] Se pensaba que ipilimumab ejercía su efecto antitumoral inhibiendo la supresión de activación de células T efectoras por CTLA4 expresado en la superficie de células T efectoras; sin embargo, recientemente se describió que la actividad citotóxica dependiente de anticuerpo (actividad ADCC) contra células T que expresan CTLA4 era importante, y se ha encontrado que la eliminación de células T reguladoras en tumores y la actividad ADCC son mecanismos de acción importantes del efecto antitumoral de anticuerpos anti-CTLA4.

[0511] Además, se sabe que la actividad ADCC por anticuerpos IgG1 es un resultado de la inducción de actividad citotóxica debida a la unión de la región constante de anticuerpos a FcγR de células NK y macrófagos, y los anticuerpos con una región constante modificada para aumentar tal unión inducen una actividad citotóxica más fuerte, ejerciendo un efecto antitumoral.

[0512] Por otra parte, se ha descrito que la eliminación de células T reguladoras en el cuerpo entero produce una reacción sistémica de tipo enfermedad autoinmunitaria, y se considera que la regulación del equilibrio entre la actividad citotóxica para ejercer un efecto antitumoral y la respuesta sistémica es muy importante.

[0513] Más específicamente, se espera que un anticuerpo ejerza una actividad citotóxica más potente y sea capaz de suprimir las respuestas sistémicas cuando el anticuerpo puede unirse fuertemente a células T reguladoras o células T agotadas en el microentorno canceroso, ejercer un efecto antitumoral potente eliminando las células T reguladoras o células T agotadas por actividad citotóxica, y limitar la respuesta solo al microentorno canceroso. Los anticuerpos con tal mecanismo de acción se tienen todavía que describir. Por tanto, realmente generamos y verificamos anticuerpos (anticuerpos interruptores contra CTLA4) que actúan contra CTLA4 solo localmente en un tumor y comprenden una región constante con unión aumentada a FcγR expresado(s) en células NK y macrófagos.

[0514] [Ejemplo 1] Adquisición de anticuerpos que se unen a antígenos en presencia de ATP o un metabolito del mismo de una genoteca sin exposición y una genoteca de anticuerpos de diseño racional usando la técnica de presentación en fagos

[0515] (1-1) Preparación de antígenos para obtener anticuerpos que se unen al antígeno en presencia de una molécula pequeña

[0516] Se prepararon región extracelular de CTLA4 de ratón (mCTLA4), región extracelular de CTLA4 humana (hCTLA4), y Abatacept biotinilados como antígenos. Específicamente, con respecto a la región extracelular de hCTLA4, el gen de hCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 1) en el que se fusionaron etiqueta His y etiqueta BAP al extremo C de la región extracelular de hCTLA4 se sintetizó e insertó en un plásmido de expresión animal. La proteína antígeno se expresó y purificó usando el siguiente método. El plásmido preparado se introdujo por el método de lipofección en la línea FreeStyle 293-F derivada de células de riñón embrionario humano (Invitrogen), que se habían sembrado en una botella después de la suspensión en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a una densidad celular de 1,33 x 10<6>células/ml. Tres horas después de la introducción del plásmido, se añadió biotina a una concentración final de 100 μM, cultivó en un incubador con CO<2>(37ºC, CO<2>al 8%, 125 rpm) durante 4 días, y el antígeno se purificó por un método conocido para los expertos en la materia a partir del sobrenadante del cultivo. La absorbancia de la solución de antígeno purificado a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro. La concentración del antígeno purificado se calculó del valor medido obtenido usando el coeficiente de extinción molar calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). Por otra parte, mCTLA4-His (Sino Biologics Inc. 50503-MO8H, No. de registro NP_033973.2), en el que la etiqueta His se fusionó a la región extracelular de mCTLA4 y Abatacept (Alfresa Corporation), en que la región constante de IgG1 humana se fusionó a hCTLA4, se biotinilaron por el método de acoplamiento de amina (PIERCE, No. de catálogo 21329).

[0517] (1-2) Adquisición de anticuerpos que se unen a CTLA4 de ratón en presencia de moléculas pequeñas de una genoteca de anticuerpos humanos no expuestos por adsorción a perlas

[0518] Se construyó una genoteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos consistente en múltiples fagos que presentan dominios Fab de secuencias de anticuerpos humanos diferentes entre sí según un método conocido para los expertos en la materia usando, como molde, ARN poliA preparados de CMSP humanas, ARN poliA humanos comercialmente disponibles, y demás.

[0519] De la genoteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos no expuestos construida, se cribaron anticuerpos cuya actividad de unión a la región extracelular de CTLA4 de ratón (mCTLA4) cambia en presencia y ausencia de una molécula pequeña. Más específicamente, se recogieron fagos que presentan anticuerpos que muestran actividad de unión a mCTLA4 capturado en perlas en presencia de una molécula pequeña. Los fagos se recuperaron del eluato de fagos eluido de las perlas en ausencia de la molécula pequeña. En este método de adquisición, se usó mCTLA4 marcado con biotina (mCTLA4-His-biotina) como el antígeno.

[0520] Los fagos producidos deE. colique porta el fagémido construido para la presentación en fagos se purificaron por el método general. Después, se obtuvo una solución de genoteca de fagos dializada frente a TBS. Se realizó adsorción usando el antígeno inmovilizado en perlas magnéticas. Se usaron perlas recubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads recubiertas con NeutrAvidin) o perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabedas M-280 estreptavidina) como las perlas magnéticas.

[0521] Para obtener eficazmente un anticuerpo interruptor de molécula pequeña dependiente de molécula pequeña que puede actuar como un interruptor en tejidos cancerosos, se llevó a cabo adsorción con referencia al método mostrado en la bibliografía de patente anterior WO 2013/180200. Este método de adsorción enriquece anticuerpos que se unen a un antígeno en presencia de adenosina 5’-trifosfato (ATP) y metabolitos de ATP, pero no se unen al antígeno en ausencia de ATP.

[0522] (1-3) Evaluación de la actividad de unión en presencia y ausencia de una molécula pequeña por ELISA de fagos De las colonias individuales deE. coliobtenidas en (1-2), se recuperó un sobrenadante de cultivo que contiene fago según un método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). Los sobrenadantes de cultivo recuperados usando NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL) se ultrafiltraron. Se aplicaron 100 μl de cada sobrenadante de cultivo a cada pocillo de NucleoFast 96 y centrifugaron a 4.500 g durante 45 minutos para eliminar el flujo no adsorbido. Se añadieron 100 μl de H<2>O y de nuevo se lavó por centrifugación a 4.500 g durante 30 minutos. Después se añadieron 100 μl de TBS, y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual la solución de fagos contenida en los sobrenadantes se recuperó.

[0523] Los fagos purificados a los que se añadió TBS se sometieron a ELISA mediante el siguiente procedimiento. Una placa de microtitulación StreptaWell 96 (Roche) se recubrió durante la noche con 100 μl de TBS que contenía mCTLA4-Hisbiotina. Después de lavar cada pocillo con TBST para eliminar mCTLA4-His-biotina sin unir a la placa, los pocillos se bloquearon con 250 μl de leche desnatada al 2%-TBS durante 1 hora o más. Después de eliminar la leche desnatada al 2%-TBS, los fagos purificados preparados se añadieron a cada pocillo, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, permitiendo de esta manera que los fagos presentadores de anticuerpos se unieran a mCTLA4-His-biotina presente en cada pocillo en ausencia o presencia de ATP. Después de lavar cada pocillo con TBST o ATP/TBST, un anticuerpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS o ATP/TBS se añadió a los mismos y la placa se incubó durante 1 hora. Después de lavar con TBST o ATP/TBST, la reacción de desarrollo de color de la solución en cada pocillo al que se añadió solución única de TMB (ZYMED) se paró por la adición de ácido sulfúrico, y después el desarrollo del color se midió por la absorbancia a 450 nm. Como resultado, se confirmaron múltiples anticuerpos que se unían a mCTLA4 solo en presencia de ATP. Los resultados del ELISA de fagos se muestran en la tabla 2. Aquí, se determinó que los clones que tiene una absorbancia mayor de 0,2 en presencia de ATP eran positivos, y se determinó que los clones que tienen una proporción de absorbancia mayor de 2 en presencia/ausencia de ATP como clones que tienen una capacidad de unión a antígeno dependiente de ATP (clones interruptores). En este ejemplo, se puede usar SM como una abreviatura para molécula pequeña/molécula de bajo peso molecular tal como ATP.

[0524] Tabla 2

[0526]

[0528] (1-4) Adquisición de anticuerpos que se unen a un antígeno en presencia de una molécula pequeña de una genoteca de diseño racional usando ATP o un metabolito del mismo

[0529] De la genoteca de presentación en fagos de anticuerpos de diseño racional construida en la bibliografía de patente anterior WO 2015/083764, se obtuvieron anticuerpos que muestran actividad de unión a antígeno en la condición de presencia de ATP o un metabolito de ATP (por ejemplo, ADP, AMP, adenosina (ADO), etc.). Para la adquisición de anticuerpos, se recogieron fagos que presentan anticuerpos que muestran capacidad de unión al antígeno capturado en las perlas en presencia de ATP o un metabolito de ATP, y después los fagos se recuperaron del eluato eluido de las perlas en la condición de ausencia de ATP o el metabolito de ATP.

[0530] Los fagos se produjeron por un método general deE. colique porta el fagémido construido para la presentación en fagos. Se obtuvo una solución de genoteca de fagos diluyendo con TBS una población de fagos precipitados añadiendo NaCl 2,5 M/PEG al 10% a la solución cultivada deE. colien la que se produjeron los fagos. A continuación, se añadió BSA a la solución de genoteca de fagos para tener una concentración final del 4%. Se hizo adsorción usando el antígeno inmovilizado en las perlas magnéticas. Se usaron perlas recubiertas con NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads recubiertas con NeutrAvidin) o perlas recubiertas con estreptavidina (Dynabedas M-280 estreptavidina) como las perlas magnéticas. Se usó Abatacept biotinilado (Abatacept-biotina) como el antígeno.

[0531] Para obtener eficazmente un anticuerpo interruptor de molécula pequeña dependiente de molécula pequeña que puede actuar como un interruptor en tejidos cancerosos, se llevó a cabo adsorción para enriquecer anticuerpos que se unen a un antígeno en presencia de adenosina 5’-trifosfato (ATP) y metabolitos de ATP, y no unen al antígeno en ausencia de ATP o el metabolito de ATP, con referencia al método mostrado en la bibliografía de patentes anterior WO 2015/083674.

[0532] (1-5) Evaluación de la actividad de unión en presencia y ausencia de ATP, o un metabolito del mismo, por ELISA de fagos

[0533] De las colonias individuales deE. coliobtenidas por el método anterior, un sobrenadante de cultivo que contiene fago se recuperó según un método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). El sobrenadante de cultivo recuperado se ultrafiltó usando NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL). El flujo no adsorbido se eliminó por centrifugación (4.500 g, 45 minutos) de NucleoFast 96 con 100 μl de sobrenadante de cultivo añadido a cada pocillo. Se añadieron 100 μl de H<2>O a NucleoFast 96 a cada pocillo se lavó de nuevo por centrifugación (4.500 g, 30 minutos). Por último, se añadieron 100 μl de TBS, y la solución de fago contenida en el sobrenadante de cada pocillo de NucleoFast 96 que se había dejado reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos se recuperó.

[0534] Se añadió TBS o TBS que contenía ATP o un metabolito del mismo (SM/TBS) a los fagos purificados, y los fagos se sometieron a ELISA mediante el siguiente procedimiento. Una placa de microtitulación StreptaWell 96 (Roche) se recubrió durante la noche con 100 μl de TBS que contenía antígeno marcado con biotina (Abatacept-biotina) preparado en el ejemplo 1-1. Después de eliminar Abatacept-biotina lavando cada pocillo de la placa con TBST, los pocillos se bloquearon con 250 μl de leche desnatada al 2%-TBS durante 1 hora o más. Después de eliminar la leche desnatada al 2%-TBS, los fagos purificados preparados se añadieron a cada pocillo, y la placa se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora, permitiendo de esta manera que los fagos presentadores de anticuerpo se unieran a Abatacept-biotina presente en cada pocillo en ausencia o presencia de ATP, o un metabolito del mismo. Después de lavar cada pocillo con TBST o TBST que contenía ATP o el metabolito del mismo (SM/TBST), un anticuerpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluido con TBS o SM/TBS se añadió a los mismos y la placa se incubó durante 1 hora. Después de lavar con TBST o SM/TBST, la reacción de desarrollo de color de la solución en cada pocillo al que se añadió solución única de TMB (ZYMED) se paró por la adición de ácido sulfúrico, y después el desarrollo del color se midió por la absorbancia a 450 nm. Como resultado, se confirmaron una pluralidad de anticuerpos cuya actividad de unión a Abatacept cambia en presencia y ausencia de ATP o el metabolito del mismo. Los resultados del ELISA de fagos se muestran en la tabla 3. Aquí, se determinó que los clones que tienen una proporción S/N de absorbancia mayor de 2 en presencia/ausencia de ATP o el metabolito del mismo eran clones que tienen una capacidad de unión a antígeno dependiente de ATP o el metabolito del mismo (clones interruptores).

[0535] Tabla 3

[0537]

[0539] (1-6) Análisis de secuencia de anticuerpos interruptores cuya actividad de unión a antígeno cambia dependiendo de la presencia o ausencia de ATP y sus metabolitos

[0540] Las secuencias de nucleótidos de genes amplificados usando los cebadores específicos lacPF (SEQ ID NO: 2) y G1seqR (SEQ ID NO: 3) de los clones determinados que tienen actividad de unión a antígeno en condiciones de presencia de ATP y sus metabolitos como resultado de ELISA de fago se analizaron. Como resultado del análisis, se obtuvieron los clones ABADh11-4_020, ABADh11-4_086, ABADh12-4_014, ABADh12-5_001, ABADh12-5_046, y ABADh5-5_041 que se juzgó que tenían actividad de unión a abatacept marcado con biotina en presencia de ATP y sus metabolitos. Los nombres de los clones se reasignaron como ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, y ABAM006, respectivamente (tabla 4).

[0541] Tabla 4

[0543]

[0544] (1-7) Expresión y purificación de anticuerpos interruptores cuya actividad de unión a antígeno cambia dependiendo de la presencia y ausencia de ATP y sus metabolitos

[0545] Los genes que codifican las regiones variables de ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, y ABAM006, obtenidos de la genoteca de fagos de diseño racional humana se insertaron en el plásmido de expresión animal IgG1 humana/lambda. Los anticuerpos se expresaron usando el siguiente método. El plásmido preparado se introdujo por el método de lipofección en la línea FreeStyle 293-F derivada de células de riñón embrionario humano (Invitrogen), que se habían suspendido en medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a una densidad celular de 1,33 x 10<6>células/ml, y sembró a 3 ml/pocillo en cada pocillo de placas de 6 pocillos. Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante del cultivo cultivado en un incubador con CO<2>(37ºC, CO<2>al 8%, 90 rpm) durante 4 días usando rProteína A Sepharosa™ Fast Flow (Amersham Biosciences) por un método que conocen los expertos en la materia. La absorbancia de las soluciones de anticuerpo purificado a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro. De los valores de medida obtenidos, la concentración de los anticuerpos purificados se calculó usando el coeficiente de extinción molar calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[0546] (1-8) Evaluación de la actividad de unión de los anticuerpos obtenidos contra hCTLA4 en presencia y ausencia de AMP por ELISA de IgG

[0547] Los seis anticuerpos obtenidos de ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, y ABAM006 se sometieron a ELISA de IgG. Los tampones mostrados en la tabla 5 se prepararon apropiadamente. Se usó CTLA4 humana marcada con biotina (hCTLA4-His-biotina) como el antígeno.

[0548] Tabla 5

[0550]

[0552] Primero, una placa de microtitulación StreptaWell 96 (Roche) se recubrió con 100 μl de TBS que contenía hCTLA4-His-biotina durante 1 hora o más. Después de lavar cada pocillo de la placa con tampón de lavado para eliminar hCTLA4-His-biotina sin unir a la placa, los pocillos se bloquearon con 250 μl de tampón de bloqueo durante 1 hora o más. A cada pocillo del que se eliminó el tampón de bloqueo, se añadieron 100 μl de cada una de IgG purificada preparada a 2,5 μg/ml en tampón de muestra que contenía AMP a una concentración final de 1 mM, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, permitiendo de esta manera a cada IgG unirse a hCTLA4-His-biotina presente en cada pocillo. Después de lavar con tampón de lavado que contenía AMP a una concentración final de 1 mM, una placa a la que se había añadido anticuerpo anti-IgG humana conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluido con tampón de muestra a cada pocillo se incubó durante 1 hora. Después de lavar con tampón de lavado que contenía cada molécula pequeña, la reacción de desarrollo de color de la solución en cada pocillo al que se añadió solución individual TMB (ZYMED) se paró por la adición de ácido sulfúrico, y después del desarrollo del color se midió por la absorbancia a 450 nm. Se usaron los tampones que contenían las composiciones mostradas en la tabla 5 como tampones.

[0553] Los resultados medidos se muestran en la tabla 6. Los pocillos con valores desbordantes se asumieron que eran 5,00. Los resultados mostraron que en todos los clones de ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, y ABAM006, la absorbancia en ausencia de AMP era significativamente menor que esa en presencia de AMP. De este resultado, se confirmó que todos los clones de ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005, y ABAM006 tienen la propiedad de cambiar la unión al antígeno dependiendo de la presencia o ausencia de moléculas pequeñas. Tabla 6

[0555]

[0557] (1-9) Evaluación del efecto de ATP y sus metabolitos en la unión a CTLA4 humano por resonancia de plasmón de superficie

[0558] ABAM004 se evaluó adicionalmente como anticuerpo interruptor contra CTLA4.

[0559] La interacción de la reacción antígeno-anticuerpo entre ABAM004 y hCTLA4-His-BAP se analizó usando Biacore T200 (GE Healthcare). Se dejó capturar ABAM004 por el chip sensor CM5 (GE Healthcare) en el que se había inmovilizado proteína A/G (Pierce) en una cantidad apropiada por el método de acoplamiento de amina, y se dejó interaccionar con el antígeno hCTLA4-His-BAP preparado en el ejemplo 1-1. Se usó TBS como el tampón de carrera, y se usó glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) como la solución de regeneración.

[0560] Después de capturar ABAM0041 μg/ml suspendido en TBS, una solución que contenía hCTLA4-His-BAP 500 nM y 10 concentraciones de ATP, ADP o AMP diluidos en una proporción común de 4 a 4000 μM, y MgCl<2>2 mM, se inyectó en cada célula de flujo a una velocidad de flujo de 10 μl/min durante 3 minutos. Estos 3 minutos se usaron como la fase de unión de hCTLA4-His-BAP. Después de completar la fase de unión, la inyección se cambió al tampón de carrera durante 2 minutos, que se usaron como la fase de disociación de hCTLA4-His-BAP. Después de completar la fase de disociación, se inyectó la solución de regeneración a una velocidad de flujo de 30 μl/min durante 30 segundos. Lo anterior se tomó como el ciclo de medida de la actividad de unión de ABAM004. La cantidad de unión de hCTLA-4-His-BAP que interaccionó con ABAM004 en la fase de unión se corrigió para la cantidad de anticuerpo capturado. Se usaron el software de evaluación de Biacore T200 versión 2.0 y Microsoft Excel 2013 (Microsoft) para analizar y representar los datos.

[0561] La figura 1 muestra la cantidad de unión de ABAM004 y hCTLA4-His-BAP en presencia de ATP y sus metabolitos obtenida por esta medida.

[0562] Como se muestra en la figura 1, se confirmó que ABAM004 tiene la propiedad de unirse a hCTLA4 usando no solo ATP, sino también metabolitos de ATP como interruptor. Además, se mostró que el anticuerpo tiene la actividad de unión más fuerte especialmente en presencia de AMP.

[0563] (1-10) Evaluación de unión de anticuerpo a células que expresan CTLA-4 humano

[0564] Se usó un citómetro de flujo para evaluar cómo la interacción antígeno-anticuerpo entre ABAM004 y CTLA4 humano cambia en presencia y ausencia de AMP. Se prepararon células CHO que expresan establemente CTLA humano (células hCTLA4-CHO) a una concentración apropiada. En este momento, se usó PBS que contenía BSA al 0,1% (Tampón de FACS) para la suspensión. Se añadió anticuerpo a 100 μl de la solución celular a una concentración final de 10 mg/ml y después se añadió AMP a una concentración final de 0, 0,4, 4, 40, 200 y 1000 μM, y se dejó reposar a 4ºC durante 30 minutos. Después de eso, la línea celular se lavó con tampón de lavado, que es el tampón de FACS que contiene AMP a una concentración final de 0, 0,4, 4, 40, 200 y 1000 μM, y después se añadió anticuerpo secundario marcado con FITC (F(ab’2) de cabra anti-IgG humana de ratón ads-FITC, Beckman, 732598) y se dejó reposar de nuevo a 4ºC durante 30 minutos en la oscuridad. Después de realizar otra vez la operación de lavado, se hicieron medidas y análisis usando un citómetro de flujo (FACS CyAn™ ADP). Los resultados se muestran en la figura 2.

[0565] Los resultados anteriores muestran que ABAM004 demostró actividad de unión a células que expresan hCTLA4 dependiente de la concentración de AMP, y mostró actividad de unión dependiente de la concentración de AMP no solo a antígenos solubles, sino también a antígenos de tipo membrana.

[0566] (1-11) Actividad ADCC de un anticuerpo de prueba usando células mononucleares de sangre periférica como células efectoras

[0567] La actividad ADCC dependiente de la concentración de anticuerpo de un anticuerpo que se une a un antígeno de una manera dependiente de ATP se midió según el siguiente método. En este momento, la actividad ADCC del anticuerpo de prueba se midió como sigue usando células mononucleares de sangre periférica humanas (denominadas en adelante CMSP humanas) como células efectoras.

[0568] Primero, se preparó una solución de CMSP humanas. Se recogieron 50 ml de sangre periférica de voluntarios sanos (hombres adultos) usando una jeringa que ya contenía 200 μl de solución de heparina (inyección de heparina Novo 5000 unidades, Novo Nordisk) 1000 unidades/ml. La sangre periférica diluida 2 veces con PBS(-) se dividió en 4 alícuotas, y añadió a tubos de separación de linfocitos Leucosep (Greiner Bio-One) que se habían centrifugado después de preinyectar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS. Los tubos de separación en los que la sangre periférica se alicuoteó se centrifugaron a 2150 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, y después las fracciones de células mononucleares se separaron. Después de lavar las células contenidas en las fracciones una vez con RPMI-1640 (Nacalai Tesque) que contenía SBF al 10% (en delante denominado SBF al 10%/RPMI), las células se suspendieron en SBF al 10%/RPMI a una densidad celular de 1 x 10<7>células/ml. La suspensión celular se usó como solución de CMSP humana para experimentos posteriores.

[0569] A continuación, como células diana, células hCTLA4-CHO, preparadas expresando a la fuerza la región extracelular de CTLA4 humano en células CHO, se suspendieron y prepararon en SBF al 10%/RPMI de modo que fueran 2 x 10<5>células/ml. Además, se usó AMP (Sigma) diluido a 4 mM usando RPMI como la solución de AMP para pruebas posteriores.

[0570] La actividad ADCC se evaluó por liberación de LDH (lactato deshidrogenasa). Primero, 50 μl de solución de anticuerpo preparada a cada concentración (0, 0,04, 0,4, 4 y 40 μg/ml) se añadió a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U, a la que 50 μl de cada una de las células diana se sembraron (1 x 10<4>células/pocillo). Además, se añadieron 50 μl de la solución de AMP a cada pocillo, y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 50 μl (5 x 10<5>células/pocillo) de solución de CMSP humana a cada pocillo, y la placa se centrifugó y después dejó reposar a 37ºC durante 4 horas, en un incubador de dióxido de carbono al 5%. Después de completar la reacción, se recogieron 100 μl del sobrenadante de cultivo y transfirieron a una placa de 96 pocillos para medida, y después se mezclaron catalizador (C) y solución colorante (D) asociadas al kit de detección de LDH (TaKaRa) a 1:45, y se añadieron 100 μl de esta mezcla. Después de dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos, se añadieron 50 μl de HCl 1 N para parar la reacción. Se midió la absorbancia a 492 nm y la actividad ADCC se midió por la liberación de LDH. La actividad ADCC se determinó basada en la siguiente fórmula.

[0571] Actividad ADCC (%) = {(A-D) – (C-D)} x 100/{(B-D) – (C-D)}

[0572] En la fórmula anterior, A representa el valor medio de actividad LDH (DO 492 nm) en los pocillos a los que se añadió anticuerpo de prueba. B representa el valor medio de actividad LDH (DO 492 nm) en los pocillos a los que se añadió 10 μl de solución acuosa de Triton-X al 20% después de la reacción. C representa el valor medio de actividad LDH (DO 492 nm) en los pocillos a los que se añadió 150 μl de SBF al 10%/RPMI, o 100 μl de SBF al 10%/RPMI y 50 μl de solución de AMP a células diana. D representa el valor medio de actividad LDH (DO 492 nm) en los pocillos que contienen solo SBF al 10%/RPMI. La prueba se llevó a cabo en duplicados, y el valor medio de la actividad ADCC (%) en la prueba que refleja la actividad ADCC del anticuerpo de prueba se calculó. Los resultados se muestran en la figura 3.

[0573] De los resultados anteriores, se mostró que el anticuerpo ABAM004 tiene actividad de unión a antígeno en presencia de AMP y tiene la capacidad de destruir células diana ejerciendo actividad ADCC.

[0574] [Ejemplo 2] Análisis de la estructura cristalina de un anticuerpo anti-CTLA4 que tiene propiedades de unión dependientes de ATP

[0575] (2-1) Análisis de la estructura cristalina por rayos X de anticuerpo de unión anti-CTLA4 ABAM004 que usa AMP como interruptor

[0576] Para el anticuerpo de unión a hCTLA4 ABAM004, que usa AMP como interruptor y se obtuvo de la genoteca en el ejemplo 1, se analizaron las estructuras cristalinas del fragmento Fab de ABAM004 solo, un complejo del fragmento Fab de ABAM004 y AMP, y un complejo del fragmento Fab de ABAM004, AMP y el dominio extracelular de hCTLA4. (2-2) Preparación del anticuerpo de longitud completa ABAM004 para cristalización

[0577] La preparación y purificación del anticuerpo de longitud completa ABAM004 para cristalización se llevaron a cabo por un método conocido para los expertos en la materia.

[0578] (2-3) Preparación del fragmento Fab para análisis de estructura cristalina del fragmento Fab de ABAM004

[0579] El fragmento Fab de ABAM004 se preparó por el método convencional de digestión de restricción con rLys-C (Promega, número de catálogo V1671), seguido por carga en una columna de proteína A (MabSelect SuRe, GE Healthcare), columna de intercambio catiónico (HiTrap SP HP, GE Healthcare), y columna de filtración en gel (Superdex2016/60, GE Healthcare) para eliminar fragmentos Fc. Las fracciones que contienen fragmentos Fab se juntaron y almacenaron a -80ºC.

[0580] (2-4) Generación de cristales del fragmento Fab de ABAM004

[0581] El fragmento Fab de ABAM004 para cristalización purificado por el método de 2-3 se concentró a aproximadamente 13 mg/ml y cristalizó a 20ºC por la técnica de difusión de vapor en gota sentada. La solución de depósito consistía en MES 0,1 M, pH 6,5, polietilenglicol 4000 al 25% p/v. Los cristales resultantes se sumergieron en una solución de MES 0,08 M, pH 6,5, polietilenglicol 4000 al 20% p/v y etilenglicol al 20%.

[0582] (2-5) Recogida de los datos de difracción de rayos X de cristales del fragmento Fab de ABAM004 y determinación de la estructura

[0583] Los datos de difracción de rayos X se midieron por BL-17A de la instalación de radiación, Photon Factory, de la Organización de Investigación de Acelerador de Alta Energía. Durante la medida, los cristales se mantuvieron constantemente congelados bajo una corriente de nitrógeno a -178ºC, y se recogieron un total de 360 imágenes de difracción de rayos X usando el detector Quantum 270 CCD (ADSC) conectado a la línea de haz, mientras se rotaban los cristales 0,5º cada vez. La determinación de los parámetros celulares, indexación de las manchas de difracción, y procesamiento de los datos de difracción de las imágenes de difracción se hicieron usando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst.43: 186-190 (2010)), paquete XDS (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) y Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)), y por último se obtuvieron datos de intensidad de difracción hasta una resolución de 1,70 Å. La estadística de los datos cristalográficos se muestra en la tabla 7.

[0584] La estructura se determinó por el método de sustitución molecular usando el programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). El modelo de búsqueda del fragmento Fab se derivó de la estructura cristalina de Fab publicada (código PDB: 4NKI). El modelo se construyó con el programa Coot (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) y refinó con el programa Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-467 (2011)). El factor de fiabilidad cristalográfica (R) de los datos de intensidad de difracción de 52,92-1,70 Å fue 16,92% y el valor R libre fue el 21,22%. La estadística de los datos de refinamiento se muestra en la tabla 7.

[0585] Tabla 7

[0587]

[0589] a: R<fusión>= ∑hk1 ∑j│Ij(hk1) - <I(hk1)> │ ∑hk1∑j│Ij(hk1)│, donde Ij(hk1) y <I(hk1)> son respectivamente intensidad de medida j e intensidad de reflexión media que tienen el exponencial hk1.

[0590] b: factores R = ∑hk1│F<calc>(hk1)│ - │F<obs>(hk1)│/∑hk1│F<obs>(hk1)│, aquí F<obs>y F<calc>son respectivamente amplitudes observada y calculada de factores estructurales.

[0591] c: R<libre>se calcula del 5% de reflexiones aleatoriamente no usadas

[0592] (2-6) Preparación del fragmento Fab de ABAM004 de anticuerpo de longitud completa para análisis de estructura cristalina de un complejo del fragmento Fab de ABAM004 y AMP, y un complejo del fragmento Fab de ABAM004, AMP y hCTLA4

[0593] El fragmento Fab de ABAM004 se preparó por el método convencional de gestión con restricción con papaína (Roche Diagnostics, No. de catálogo 1047825), seguido por carga en una columna de proteína A (MabSelect SuRe, GE Healthcare), columna de intercambio catiónico (HiTrap SP HP, GE Healthcare), y columna de filtración en gel (Superdex2016/60, GE Healthcare) para eliminar fragmentos Fc. Las fracciones que contienen fragmentos Fab se juntaron y almacenaron a -80ºC.

[0594] (2-7) Generación de cristales de un complejo del fragmento Fab de ABAM004 y AMP

[0595] El fragmento Fab de ABAM004 para cristalización purificado por el método de 2-6 se concentró a aproximadamente 13 mg/ml, al que se añadió AMP para hacer la concentración final de 2 mM, y se realizó la cristalización a 20ºC por la técnica de difusión de vapor en gota sentada. La solución de depósito consistía en tampón Morpheus 20,1 M, pH 7,5, MPD_P1K_P3350 al 37,5% p/v, ácidos carboxílicos Morpheus al 10% (Morpheus, Molecular Dimensions).

[0596] (2-8) Recogida de los datos de difracción de rayos X de cristales de un complejo del fragmento Fab de ABAM004 y AMP y determinación de la estructura

[0597] Los datos de difracción de rayos X se midieron por BL-1A de la instalación de radiación, Photon Factory, de la Organización de Investigación de Acelerador de Alta Energía. Durante la medida, los cristales se mantuvieron constantemente congelados bajo una corriente de nitrógeno a -178ºC, y se recogieron 720 imágenes de difracción de rayos X usando el detector Pilatus 2M (DECTRIS) conectado a la línea de haz, mientras se rotaban los cristales 0,25º cada vez. La determinación de los parámetros celulares, indexación de las manchas de difracción, y procesamiento de los datos de difracción de las imágenes de difracción se hicieron usando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst.43: 186-190 (2010)), paquete XDS (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) y Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)), y por último se obtuvieron datos de intensidad de difracción hasta una resolución de 1,70 Å. La estadística de los datos cristalográficos se muestra en la tabla 7.

[0598] La estructura se determinó por el método de sustitución molecular usando el programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). El modelo de búsqueda del fragmento Fab se derivó de la estructura cristalina de Fab publicada (código PDB: 4NKI). El modelo se construyó con el programa Coot (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) y refinó con el programa Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-467 (2011)). El factor de fiabilidad cristalográfica (R) de los datos de intensidad de difracción de 47,33-2,89 Å fue 19,97% y el valor R libre fue el 25,62%. La estadística de refinamiento estructural se muestra en la tabla 7.

[0599] (2-9) Preparación del dominio extracelular de hCTLA4

[0600] Se preparó el dominio extracelular de hCTLA4 por el método convencional de digestión con restricción de abatacept por endoproteinasa Lys-C (Roche, número de catálogo 11047825001), seguido por carga en una columna de proteína A (MabSelect SuRe, GE Healthcare), y columna de filtración en gel (Superdex2016/60, GE Healthcare) para eliminar fragmentos Fc. Las fracciones que contienen el dominio extracelular de hCTLA4 se juntaron y almacenaron a -80ºC. (2-10) Preparación de un complejo del fragmento Fab de ABAM004, AMP y el dominio extracelular de hCTLA4 El dominio extracelular de hCTLA4 purificado por el método de 2-9 se mezcló con el fragmento Fab de ABAM004 purificado por el método de 2-6 en una proporción molar 1,5:1, y se añadió AMP al mismo para hacer la concentración final de 2 mM. El complejo se purificó por cromatografía de filtración en gel (Superdex20010/300, GE Healthcare) usando una columna equilibrada con HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, AMP 2 mM.

[0601] (2-11) Generación de cristales de un complejo del fragmento Fab de ABAM004, AMP y el dominio extracelular de hCTLA4

[0602] El complejo purificado se concentró a aproximadamente 8 mg/ml y se cristalizó a 20ºC por la técnica de difusión de vapor en gota sentada combinada con el método de siembra. La solución de depósito consistía en tampón Morpheus 10,1 M, pH 7,5, M1K3350 al 37,5% p/v, halógenos al 10% (Morpheus, Molecular Dimensions).

[0603] (2-12) Recogida de los datos de difracción de rayos X de cristales de un complejo del fragmento Fab de ABAM004, AMP y el dominio extracelular de hCTLA4 y determinación de la estructura

[0604] Los datos de difracción de rayos X se midieron con BL32XU de Spring-8. Durante la medida, los cristales se mantuvieron constantemente congelados bajo una corriente de nitrógeno a -178ºC, y se recogieron un total de 180 imágenes de difracción de rayos X usando el detector MX-225HS CCD (RAYONIX) conectado a la línea de haz, mientras se rotaban los cristales 1,0º cada vez. La determinación de los parámetros celulares, indexación de las manchas de difracción, y procesamiento de los datos de difracción de las imágenes de difracción se hicieron usando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst.43: 186-190 (2010)), paquete XDS (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) y Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)), y por último se obtuvieron datos de intensidad de difracción hasta una resolución de 1,70 Å. La estadística de los datos cristalográficos se muestra en la tabla 7.

[0605] La estructura se determinó por el método de sustitución molecular usando el programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). El modelo de búsqueda del fragmento Fab se derivó de la estructura cristalina de Fab publicada (código PDB: 4NKI), y el modelo de búsqueda del dominio extracelular de hCTLA4 derivó de la estructura cristalina de CTLA4 huamano publicada (código PDB: 3OSK, J. Biol. Chem. 286: 6685-6696 (2011)). El modelo se construyó con el programa Coot (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) y refinó con el programa Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-467 (2011)). El factor de fiabilidad cristalográfica (R) de los datos de intensidad de difracción de 52,81-3,09 Å fue 23,49% y el valor R libre fue el 31,02%. La estadística de refinamiento estructural se muestra en la tabla 7.

[0606] (2-13) Identificación del sitio de interacción entre ABAM004 y AMP

[0607] La estructura cristalina reveló que AMP principalmente es reconocido por la cadena pesada del anticuerpo.

[0608] La fracción de anillo de adenina de AMP es reconocida por CDR1 y CDR3 de la cadena pesada, y la fracción ribosa y fracción del grupo fosfato son reconocidas por CDR1 y CDR2.

[0609] Específicamente, como se muestra en la figura 4, la fracción de anillo de adenina de AMP es reconocida por las cadenas laterales de T33 perteneciente a la CDR1 de la cadena pesada e Y95, L100B, y W100C pertenecientes a CDR3, y las cadenas principales de G96 y M100A del anticuerpo. En particular, se encontró que los oxígenos carbonilo en las cadenas principales de G96 y M100A forman enlaces de hidrógeno con N en la posición 6 de AMP, el grupo NH amida de la cadena principal de W100C forma un enlace de hidrógeno con N en la posición 1, y las cadenas laterales de Y95, L100B, y W100C forman una interacción usando los electrones pi de la fracción de anillo de adenina, de modo que el anticuerpo reconoce fuertemente la fracción de anillo de adenina. La fracción ribosa es reconocida por cada una de las cadenas laterales de T33 perteneciente a la CDR1 de la cadena pesada, e Y56 e Y58 pertenecientes a la CDR2 mediante interacción de van der Waals y mediante la interacción de los electrones pi de Y56. Además, la fracción de grupo fosfato es reconocida por cada una de las cadenas laterales de T33 perteneciente a la CDR1 de la cadena pesada y S52, S52A, y R53 pertenecientes a la CDR2 y la cadena principal de S52A. En particular, se piensa que los enlaces de hidrógeno formados por la cadena lateral de T33 y el grupo NH amida de la cadena principal de S52A con la fracción del grupo fosfato y la interacción de van der Waals por S52 y R53 desempeñan un papel importante en reconocer la fracción de grupo fosfato. La numeración de los residuos de aminoácidos de Fab se basa en el esquema de numeración de Kabat.

[0610] (2-14) Identificación de los epítopos de ABAM004

[0611] En las figuras 5 y 6, los epítopos de la región de contacto del Fab de ABAM004 se mapean en la estructura cristalina de hCTLA4 y en la secuencia de aminoácidos, respectivamente. Los epítopos contienen residuos de aminoácidos de hCTLA4 que contienen uno o más átomos de hidrógeno localizados en 4,2 Å de cualquier porción del Fab de ABAM004 o AMP en la estructura cristalina.

[0612] Estaba claro de la estructura cristalina que al menos M3, E33, R35, T53, E97, M99, Y100, P101, P102, P103, Y104, Y105, y L106 del antígeno son reconocidos por las CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, y CDR1 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo, y AMP. En particular, el bucle consistente en M99 a Y104 del antígeno es fuertemente reconocido por el anticuerpo en una manera sepultada en el bucle de CDR del anticuerpo, y se considera que el bucle desempeña un papel principal en el reconocimiento de antígeno por el anticuerpo.

[0613] (2-15) Mecanismo de unión a antígeno dependiente de AMP

[0614] La región variable del anticuerpo se extrajo de la estructura cristalina del Fab de ABAM004 solo, la estructura cristalina del complejo del Fab de ABAM004 y AMP, y la estructura cristalina del complejo ternario consistente en el Fab de ABAM004, AMP y CTLA4, y la figura 7 es una figura superpuesta de las regiones variables extraídas que se centra alrededor de la cadena pesada. Para la unión a antígeno dependiente de AMP, no solo la interacción directa entre AMP y CTLA4 mostrada en el ejemplo 2-14, sino también el cambio estructural del anticuerpo asociado con unión a AMP se considera que es importante.

[0615] Como se muestra en la figura 7, al comparar la estructura cristalina del anticuerpo solo con la estructura cristalina del anticuerpo al que se une AMP, se reveló que las estructuras en bucle de la CDR3 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera, así como el ángulo de torsión entre la cadena pesada y la cadena ligera en la región variable del anticuerpo también cambiaban. Además, comparando la estructura cristalina del anticuerpo al que se une AMP y la estructura cristalina del complejo ternario consistente en el anticuerpo, AMP y CTLA4, también se reconoce que las estructuras de CDR3 de la cadena pesada y la CDR1 de la cadena ligera cambiaron adicionalmente por unión de antígeno, mostrando cambios estructurales dependientes de antígeno. Por otra parte, puesto que no hay cambio en la estructura en bucle de CDR3 de la cadena ligera y el ángulo de torsión entre la cadena pesada y la cadena ligera, se piensa que la unión de AMP puede haber cambiado la estructura del anticuerpo a un estado cercano a la estructura en el momento de la unión a antígeno. Por tanto, se piensa que los cambios estructurales asociados con la unión de AMP son necesarios para formar una estructura apropiada para la unión de antígeno, y desempeñan un papel importante en la unión de antígeno dependiente de AMP.

[0616] [Ejemplo 3] Generación de anticuerpos de CTLA4 alterados y evaluación de sus actividades

[0617] (3-1) Generación de variantes del anticuerpo ABAM004 con actividad aumentada de unión a CTLA4

[0618] La secuencia de aminoácidos de ABAM004 (VH SEQ ID NO: 10, VL SEQ ID NO: 11) obtenida de la genoteca de fagos de diseño racional humana descrita en el ejemplo 1 se alteró para reducir la actividad de unión a CTLA4 de dicha secuencia en ausencia de análogos de ATP, para aumentar la actividad de unión a CTLA4 humano en presencia de análogos de ATP, y para aumentar la unión a ATP y análogos de ATP. Con el fin de lograr esto, se generaron variantes con mutaciones puntuales en residuos que se espera están implicados en las uniones basado en la estructura cocristalina de ABAM004 y AMP y la estructura cocristalina de ABAM004, AMP y CTLA4 humano obtenidas por el método descrito en el ejemplo 2. Además, también se generaron variantes en las que cada aminoácido contenido en las CDR se sustituyó con Ala o Pro. Las variantes de mutación puntual se midieron por Biacore T200 o Biacore 4000 (GE Healthcare) para actividad de unión de CTLA4 humano (Abatacept y hCTLA4-His-BAP) en ausencia de ATP y en presencia de ATP, ADP o AMP, para cribar mutaciones que aumentan esta actividad de unión. Se prepararon variantes combinando mutaciones que aumentaban la actividad de unión, y el valor KD se calculó por Biacore. Como resultado, se aclaró que introducir sustituciones de H32A y S52aT en la cadena pesada de ABAM004 y T24D, T26P y E50F en la cadena ligera (según la numeración de Kabat) aumentó la propiedad de unión de ABAM004. La variante se denomina 04H0150/04L0072 (VH SEQ ID NO: 47, VL SEQ ID NO: 48).

[0619] (3-2) Medida del efecto de ATP y sus metabolitos en la, actividad de unión a CTLA4 humano de ABAM004 y 04H0150/04L0072 por resonancia de plasmón de superficie

[0620] Primero, se creó un chip para medida en Biacore T200. La temperatura de Biacore T200 se ajustó a 25ºC y la velocidad de flujo se ajustó a 10 μl/min. Se usó HBS-EP+ como el tampón de carrera. se añadió una mezcla de volúmenes iguales de NHS (N-hidroxisuccinimida) y EDC (N-etil-N’-(dimetilaminopropil)carbodiimida) al chip sensor CM5 (GE Healthcare) a una velocidad de flujo de 10 μl/min durante 10 minutos para activar las células de flujo. A continuación, se añadió proteína A/G 25 μg/ml (Pierce) suspendida en acetato de sodio 10 mM pH 4,0 y se dejó unir a 10 μl/min durante 30 minutos. Los grupos activos en exceso en las células de flujo se bloquearon después añadiendo etanolamina-HCl 1 M a 10 μl/min durante 10 minutos.

[0622] A continuación, se midió el efecto de ATP y sus metabolitos en la unión del anticuerpo diana a CTLA4 humano. La temperatura establecida era 25ºC, y se usó TBS como el tampón de carrera. Se usó glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) como la solución de regeneración. Después de dejar capturar el anticuerpo suspendido de TBS, cada célula de flujo se inyectó con una solución de TBS que contenía hCTLA4-His-BAP 500 nM, 10 concentraciones de ATP, ADP o AMP diluidos en una proporción común de 4 a 4000 μM, y MgCl<2>2 mM a una velocidad de flujo de 10 μl/min durante 3 minutos. Estos 3 minutos se usaron como la fase de unión de hCTLA4-His-BAP. Después de completar la fase de unión, la inyección se cambió al tampón de carrera durante 2 minutos, que se usaron como la fase de disociación. Después de completar la fase de disociación, se inyectó la solución de regeneración a una velocidad de flujo de 30 μl/min durante 30 segundos, y lo anterior se tomó como el ciclo de medida de la actividad de unión. La cantidad de unión de hCTLA4-His-BAP que interaccionó con ABAM004 o 04H0150/04L0072 en la fase de unión se corrigió para la cantidad de anticuerpo capturado. Los resultados se muestran en la figura 8. Además, en la medida de unión de ABAM004 o 04H0150/04L0072, la concentración de la molécula pequeña en la fase de unión se mantuvo a 62,5 μM o 1 mM, y se usaron 8 concentraciones de hCTLA4-His-BAP diluidas a una proporción común de 2 a 2000 nM en la fase de unión. Los valores KD obtenidos del análisis de la cantidad de unión de hCTLA4-His-BAP se muestran en la tabla 8. Se usaron el software de evaluación de Biacore T200 versión 2.0 y Microsoft Excel 2013 (Microsoft) para analizar y representar los datos. Se usó un modelo de afinidad de estado estacionario para calcular el valor KD.

[0623] Tabla 8

[0625]

[0627] SM representa la molécula pequeña (ATP, ADP o AMP) usada en cada ensayo.

[0629] (3-3) Aumento de la capacidad de unión introduciendo alteraciones exhaustivas

[0631] Con el fin de generar mejores anticuerpos anti-CTLA4, se introdujeron exhaustivamente alteraciones de aminoácidos en 04H0150/04L0072, que son regiones variables de anticuerpo anti-CTLA4 humano preparado en el ejemplo 3-1. Variantes en que la sustitución de aminoácidos se realizó a cada 18 aminoácidos excepto cisteína en todas las CDR de 04H0150 y 04L0072 se generaron por métodos conocidos por los expertos en la materia tal como PCR. Las medidas de aproximadamente 1200 variantes generadas para unión de CTLA4 humano se realizaron usando Biacore 4000. Se inmovilizó proteína A/G (Thermo Fisher Scientific) en un chip sensor de serie S CM5 (GE Healthcare), y los anticuerpos se capturaron en el chip haciendo interaccionar el sobrenadante del cultivo que contenía la variante de anticuerpo. A continuación, una solución de CTLA4 humano a la que se añadió una molécula pequeña (ATP, ADP o AMP) o una solución de CTLA4 humano a la que no se añadió una molécula pequeña se dejó interaccionar con el anticuerpo para evaluar la capacidad de unión del anticuerpo a CTLA4 humano en presencia o ausencia de la molécula pequeña. El ensayo se realizó a 25ºC usando solución salina tamponada con Tris, PS20 al 0,02% como tampón de carrera.

[0633] Las alteraciones que aumentaron la unión a CTLA4 humano en presencia de una molécula pequeña y las alteraciones que redujeron la unión a CTLA4 humano en ausencia de la molécula pequeña, alteraciones que se encontraron usando el método anterior, se combinaron para generar anticuerpos anti-CTLA4 humano que muestran mejores perfiles. Al gen de la cadena pesada del anticuerpo 04H0150-G1m (SEQ ID NO: 209), que tiene 04H0150 como la región variable de la cadena pesada y G1m (SEQ ID NO: 82) en que la Gly y Lys C-terminales de IgG1 humana se han eliminado como la región constante de la cadena pesada, alteraciones encontradas por la introducción de alteraciones exhaustivas y alteraciones a la región marco se combinaron para preparar genes de cadena pesada de anticuerpo. Al gen de la cadena ligera del anticuerpo 04L0072-lam1 SEQ ID NO: 208), que tiene 04L0072 como la región variable de la cadena ligera y la cadena λ humana lam1 (SEQ ID NO: 87) como la región constante de la cadena ligera, las alteraciones encontradas se combinaron para generar genes de cadena ligera de anticuerpo. Además, también se generó una variante en que la región marco de la región variable de la cadena ligera y la región constante se sustituyeron con la secuencia de la cadena κ humana. Por comparación, el gen para la cadena pesada de anticuerpo MDX10D1H-G1m (SEQ ID NO: 210) que tiene la región variable de la cadena pesada MDX10D1H (SEQ ID NO: 154) y el gen de la cadena ligera de anticuerpo MDX10D1L-k0MT (SEQ ID NO: 211) que tiene la región variable de la cadena ligera MDX10D1L (SEQ ID NO: 155) del anticuerpo anti-CTLA4 humano existente descrito en el documento WO 0114424 se generaron. Los anticuerpos se expresaron y purificaron por un método que conocen los expertos en la materia combinando estos genes para generar anticuerpos anti-CTLA4 de interés. La tabla 9 enumera las SEQ ID NO de las regiones variables de cadena pesada, regiones variables de cadena ligera, regiones constantes de cadena pesada, regiones constantes de cadena ligera, y regiones hipervariables de los anticuerpos generados.

[0634] Los anticuerpos en el presente documento se nombran según la siguiente regla: (región variable de la cadena pesada)-(región constante de la cadena pesada)/(región variable de la cadena ligera)-(región constante de la cadena ligera). Por ejemplo, significa que si el nombre del anticuerpo es 04H0150-G1m/04L0072-lam1, la región variable de la cadena pesada de este anticuerpo es 04H0150, la región constante de la cadena pesada es G1m, la región variable de la cadena ligera es 04L0072, y la región constante de la cadena ligera es lam1.

[0635] Secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas, cadenas ligeras, y sus regiones hipervariables (indicadas por SEQ ID NO:).

[0636] [Tabla 9]

[0638]

[0640] Se usó Biacore T200 para medir la unión de los anticuerpos generados a CTLA4 humano. Se usó ACES 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl<2>2 mM, Tween 20 al 0,05% con ATP añadido a la concentración deseada como el tampón de carrera, y el ensayo se realizó a 37ºC. Primero, se inmovilizó proteína G (CALBIOCHEM) en un chip sensor serie S CM3 (GE Healthcare), y los anticuerpos se capturaron haciendo interaccionar una solución de anticuerpo preparada en un tampón de carrera sin ATP con el chip. A continuación, por interacción con una solución de CTLA4 humano preparada en tampón de carrera que contenía ATP a la concentración deseada, o solución de CTLA4 humano preparada en un tampón de carrera que no contenía ATP, se evaluó la capacidad de unión del anticuerpo a CTLA4 humano en presencia o ausencia de ATP. Los chips se regeneraron con NaOH 25 mM y glicina-HCl 10 mM (pH 1,5), y el ensayo se realizó capturando repetidamente anticuerpos. La constante de disociación de cada anticuerpo para CTLA4 se calculó usando el software de evaluación Biacore T2002.0. Específicamente, la constante de velocidad de unión ka (l/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s) se calcularon por ajuste global de los sensorgramas obtenidos por la medida, usando una modelo de unión de Langmuir 1:1. La constante de disociación KD (mol/l) se calculó de esos valores. Alternativamente, la constante de disociación KD (mol/l) se calculó por el modelo de estado estacionario. Además, la cantidad de unión de CTLA4 por cantidad unidad de anticuerpo se calculó corrigiendo la cantidad de CTLA4 unida calculada del sensorgrama obtenido por el ensayo con la cantidad de anticuerpo capturado en la superficie del chip. La tabla 10 muestra los resultados de estos ensayos.

[0641] Análisis de unión de anticuerpo alterado a CTLA4 humano

[0642] [Tabla 10]

[0643]

[0644] El valor de “Unión a CTLA4 humano” en la tabla indica la cantidad de unión de CTLA4 humano por cantidad unidad de anticuerpo cuando CTLA4 humano se dejó interaccionar a 1000 nM en cada una de las condiciones de concentración de ATP enumeradas, y “KD para CTLA4 humano (M)” indica la constante de disociación para CTLA4 humano en cada condición de concentración de ATP. Los valores KD marcados con un * en la tabla se calcularon usando el modelo de estado estacionario. Se mostró que todas las variantes preparadas usando 04H0150-G1m/04L0072-lam1 como el anticuerpo parental tenían unión aumentada en presencia de ATP en comparación con 04H0150-G1m/04L0072-lam1. Además, como 04H0150-G1m/04L0072-lam1 y estas variantes tuvieron una cantidad de unión mayor en la condición cuando ATP estaba presente a 10 μM que a 1 μM; y la cantidad de unión en presencia de 100 μM fue aún mayor, se observó unión a CTLA4 humano de una manera dependiente de la concentración de ATP. Por otra parte, el MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT comparativo no mostró tal unión dependiente de la concentración de ATP a CTLA4 humano. Aunque 04H1077-G1m/04L1305-k0MT en el que la región marco y constante de la cadena ligera de 04H1077-G1m/04L1086-lam1 se sustituyeron con cadena κ humana tuvo unión aumentada a CTLA4 humano en ausencia de ATP comparado con 04H1077-G1m/04L1086-lam1, la unión dependiente de la concentración de ATP también aumentó. Estos resultados mostraron que la propiedad de unión a CTLA4 humano de una manera dependiente de ATP se mantiene incluso cuando la secuencia se sustituyó con secuencia de cadena κ humana. Entre los anticuerpos generados aquí, 04H1077-G1m/04L1066-lam1, 04H1077-G1m/04L1305-k0MT, y 04H1207-G1m/04L1086-lam1 mostraron casi la misma actividad de unión que el anticuerpo anti-CTLA4 humano existente MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT en la condición cuando ATP estaba presente a 100 μM, y 04H1208-G1m/04L1407-k0MT mostró actividad de unión más fuerte que MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT en la condición cuando ATP estaba presente a 10 μM o más.

[0645] A continuación, entre los anticuerpos preparados en la tabla 10, se evaluó la unión de 04H1077-G1m/04L1086-lam1 y 04H1208-G1m/04L1407-k0MT a CTLA4 de ratón. Para comparación, se generaron el gen para la cadena pesada hUH02-G1d (SEQ ID NO: 212) que tiene la región variable de la cadena pesada hUH02 (SEQ ID NO: 156) del anticuerpo anti-CTAL4 de ratón y el gen para la cadena ligera de anticuerpo hUL01-k0 (SEQ ID NO: 213) que tiene la región variable de la cadena ligera hUL01 (SEQ ID NO: 157), y el anticuerpo se expresó, purificó y usó. Se realizó un ensayo usando Biacore T200 en las mismas condiciones que la medida de unión a CTLA4 humano, excepto por usar CTLA4 de ratón como muestra (Tabla 11). Se preparó CTLA4 de ratón como sigue.

[0646] El gen de una región extracelular de CTLA4 de ratón unido a una etiqueta His (mCTLA4-His) (SEQ ID NO: 49) se sintetizó e insertó en un plásmido de expresión animal. El plásmido preparado se introdujo por el método de lipofección en la línea FreeStyle 293-F derivada de células de riñón embrionario humano (Invitrogen), que se había sembrado en una botella después de suspensión en el medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a una densidad celular de 1,33 x 10<6>células/ml. La absorbancia de la solución de antígeno purificado a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro. De los valores medidos obtenidos, la concentración del antígeno purificado se calculó usando el coeficiente de extinción molar calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[0647] Análisis de unión de anticuerpos alterados a CTLA4 de ratón

[0648] Tabla 11

[0650]

[0652] N.D.; Extremadament4e débil para detectar unión

[0653] El valor de “Unión a CTLA4 de ratón” en la tabla indica la cantidad de unión de CTLA4 de ratón por cantidad unidad de anticuerpo cuando CTLA4 de ratón se dejó interaccionar a 1000 nM en cada una de las condiciones de concentración de ATP enumeradas, y “KD para CTLA4 de ratón (M)” indica la constante de disociación para CTLA4 de ratón en cada condición de concentración de ATP. Se mostró que hUH02-G1d/hUL01-k0 se une a CTLA4 de ratón al mismo nivel independientemente de la concentración de ATP, mientras se mostró que tanto 04H1077-G1m/04L1086-lam1 como 04H1208-G1m/04L1407-k0MT se unen a CTLA4 de ratón de una manera dependiente de la concentración de ATP. Comparado a la capacidad de unión a CTLA4 humano mostrada en la tabla 10, la capacidad de unión de 04H1077-G1m/04L1086-lam1 a CTLA4 de ratón era aproximadamente 5 veces más débil comparado a la capacidad de unión a CTLA4 humano, y la capacidad de unión de 04H1208-G1m/04L1407-k0MT a CTLA4 de ratón era dos veces más débil comparado a la capacidad de unión a CTLA4 humano, en presencia de ATP 100 μM.

[0654] (3-4) Generación de un anticuerpo control anti-mCTLA4 y anticuerpos interruptores anti-mCTLA4

[0655] Se generaron un anticuerpo control anti-mCTLA4 (hUH02-mFa55/hUL01-mk1, abreviatura: mNS-mFa55) e interruptores anti-CTLA4 (04H1077-mFa55/04L1086-m10r, abreviatura: SW1077-mFa55; y 04H1208-mFa55/04L1407s-mk1, abreviatura: SW1208-mFa55). En el anticuerpo mNS-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada hUH02 (SEQ ID NO: 16) y la región variable de la cadena ligera hUL01 (SEQ ID NO: 17), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0656] En el anticuerpo SW1077-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada 04H1077 (SEQ ID NO: 20) y la región variable de la cadena ligera 04L1086 (SEQ ID NO: 21), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje m10r (SEQ ID NO: 22). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0657] En el anticuerpo SW1208-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada 04H1208 (SEQ ID NO: 23) y la región variable de la cadena ligera 04L1407s (SEQ ID NO: 24), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0658] (3-6) Evaluación de la actividad neutralizante de un anticuerpo interruptor de CTLA4

[0659] La actividad neutralizante de un anticuerpo interruptor anti-CTLA4 (SW1077-mFa55) preparado en el ejemplo 3-4 se evaluó por el método ELISA competitivo. mCTLA4-Fc (SEQ ID NO: 25) en que la región constante humana se unió a mCTLA4 se diluyó a 5 μg/ml (55 nM) con NaHCO<3>0,1 M, NaN<3>al 0,05% para preparar una solución de mCTLA4-Fc. Se añadieron 100 μl de cada una de la solución de mCTLA4-Fc preparada a una placa de 96 pocillos, y la placa se dejó reposar a 4ºC durante la noche para inmovilizar mCTLA4-Fc en la superficie de la placa. Después de lavar 3 veces con TBS, Tween 20 al 0,1%, se añadieron 250 μl de solución de BSA diluida al 2% con TBS a cada pocillo para realizar bloqueo de la superficie de la placa. Después de eso, la placa se lavó 3 veces. mCD86-Fc-His (Sino Biologics Inc.50068-M03H, número de registro NP_062261.3) en que la región constante humana y etiqueta His se fusionaron a CD86 de ratón diluido con TBS a la concentración final de 55 nM, solución de anticuerpo SW1077-mFa55 diluido a una concentración final de 6,25, 1,56, 0,390, 0,097, 0,0061 y 0 μg/ml, y solución de ATP diluida a una concentración final de 0, 1, 10 y 100 μM se mezclaron cada uno para tener un total de 100 μl, la mezcla se añadió a cada pocillo, y la placa se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora. Cada pocillo después se lavó 3 veces con TBS, Tween 20 al 0,1%, preparado para contener la misma concentración de ATP que la solución añadida a cada pocillo. Se añadieron 100 μl de Acm-HRP-Direct anti-etiqueta-His (MBL Life Sciences) diluido 10000 veces con tampón de bloqueo para contener la misma concentración de ATP que la solución añadida a cada pocillo, a cada pocillo, y la placa se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora. Cada pocillo después se lavó 3 veces con TBS, Tween 20 al 0,1%, preparado para contener la misma concentración de ATP que la solución añadida a cada pocillo. Se añadieron 100 μl de solución TMB a cada pocillo, y la placa se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora. Se añadieron 50 μl de H<2>SO<4>1 M a cada pocillo para parar la reacción, y la absorbancia a 450 nm se detectó con un lector de microplaca de absorbancia (Wako Sunrise). El valor de absorbancia de pocillos sin anticuerpo en la misma condición de concentración de ATP se tomó como la tasa de unión de mCTLA4-mCD86 del 100% y se evaluó cuanto se redujo la tasa de unión por la adición del anticuerpo. Los resultados se muestran en la figura 9.

[0660] De estos resultados, se mostró que la actividad neutralizante del anticuerpo SW1077 contra la interacción mCTLA4-mCD86 se hace más fuerte según aumenta la concentración de ATP en el ensayo. Estos resultados conformaron que el anticuerpo SW1077 tiene actividad neutralizante dependiente de ATP.

[0661] (3-7) Eficacia de un anticuerpo interruptor anti-CTLA4 en modelo de ratón trasplantado con células tumorales singénicas, aumento/disminución de células T reguladoras (Treg) en tumor, y cambio de marcador de respuesta sistémica en bazo

[0662] (3-7-1) Preparación de línea celular y modelo de ratón trasplantado con línea tumoral singénica

[0663] Las células usadas fueron la línea de cáncer de mama de ratón células FM3A compradas de RIKEN. Las células FM3A se mantuvieron y pasaron en medio RPMI 1640 (Sigma) que contenía suero bovino (Thermo Fisher Scientific) al 10%. Como ratones, se usaron ratones C3H/HeN (7 semanas de edad, hembras) comprados de Charles River Laboratories, Japón. Las células FM3A se trasplantaron bajo la piel abdominal de ratones, y se determinó que el modelo estaba establecido cuando el volumen del tumor trasplantado fue desde aproximadamente 150 mm<3>a aproximadamente 300 mm<3>.

[0664] El volumen del tumor trasplantado se calculó por la siguiente fórmula

[0665] Volumen tumoral = diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto/2

[0666] (3-7-2) Preparación de fármacos para administración

[0667] Los fármacos que se van a administrar al modelo trasplantado con células FM3A eran el anticuerpo control anti-CTLA4 de ratón (mNS-mFa55) y el anticuerpo interruptor anti-CTLA4 de ratón (SW1208-mFa55) preparados en el ejemplo 3-4. Usando tampón His (His-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0), se preparó mNS-mFa55 para ser 0,0005 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,5 mg/ml, y 5 mg/ml, y se preparó SW1208-mFa55 para ser 0,005 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,5 mg/ml, 5 mg/ml, y 25 mg/ml, respectivamente.

[0668] (3-7-3) Administración de fármacos para medir el efeto antitumoral

[0669] El 9º día después del trasplante, mNS-mFa55 se administró a ratones a dosis de 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, y 100 mg/kg, y SW1208-mFa55 se administró a dosis de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg y 500 mg/kg, respectivamente. Las soluciones preparadas para administración se administraron a una dosis de 20 ml/kg a través de la vena de la cola.

[0670] La tabla 12 muestra los detalles del tratamiento con fármacos cuando se mide el efecto antitumoral.

[0671] Medida del efecto antitumoral en modelo trasplantado con células FM3A.

[0672] Tabla 12

[0674]

[0676] (3-7-4) Evaluación del efecto antitumoral

[0677] El efecto antitumoral se evaluó por el volumen tumoral calculado por la fórmula descrita en (3-7-1).

[0678] El valor de la tasa de inhibición del crecimiento tumoral (TGI: inhibición del crecimiento tumoral) se calculó por la siguiente fórmula.

[0679] TGI (%) = (1 – (volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de administración inicial)/(volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de administración inicial)) x 100.

[0680] Como resultado, se mostró una eficacia de fármaco de TGI = 60% o más el 13<er>día después de la administración para mNS-mFa55 a dosis de 0,1 mg/kg o más y para SW1208-mFa55 a dosis de 1 mg/kg o más (Figuras 10 y 11).

[0681] (3-7-5) Administración de fármacos para evaluación de células Treg en tumor y verificación de efectos sistémicos en bazo

[0682] El 7º día después del trasplante, el anticuerpo control anti-CTLA4 de ratón (mNS-mFa55) se administró a través de la vena de la cola a dosis de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 100 mg/kg, y el anticuerpo interruptor anti-CTLA4 de ratón (SW1208-mFa55) se administró a través de la vena de la cola a dosis de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, y 500 mg/kg. La tabla 13 muestra los detalles del tratamiento con fármacos y verificación de efectos sistémicos en el bazo.

[0683] Verificación de efectos intratumorales y sistémicos en modelo trasplantado con células FM3A (mNS-mFa55 y SW1208-mFa55)

[0684] [Tabla 13]

[0685]

[0687] (3-7-6) Extirpación de tumor y bazo de ratones modelo trasplantados con células FM3A

[0688] El 6º día después de la administración del anticuerpo, los ratones se sacrificaron con anestesia, y el tumor y bazo se extirparon. Del bazo extirpado, se preparó una suspensión celular usando medio RPMI-1640 (SIGMS) que contenía SBF (SIGMA) al 10%, y después se hemolizó usando el kit de lisado de eritrocitos de ratón (R&D) para preparar células de bazo. Los tumores extirpados se trituraron usando el kit de disociación de tumores, ratón (Milteny). Tanto las células de bazo como los tumores triturados se hicieron reaccionar con los siguientes anticuerpos, y las fracciones de células inmunitarias presentes se analizaron por análisis de FACS: anticuerpo CD45 (BD, clon: 30-F11), anticuerpo anti-CD3 (BD, clon: 145-2C11), anticuerpo anti-CD4 (BD, clon: RM4-5), anticuerpo anti-FoxP3 (eBioscience, clon: FJK-16s)), anticuerpo anti-ICOS (eBioscience, clon: 7E17G9), anticuerpo anti-KLRG1 (Biolegend, clon: 2F1/KLRG1). El análisis de FACS se realizó mediante BD LSR Fortessa X-20 (BD).

[0689] (3-7-7) Evaluación de Treg tumorales en modelo trasplantado con células FM3A

[0690] Se evaluaron cambios en células Treg efectoras (CD4<+>Foxp3<+>KLRG1<+>) en el tumor después de la administración del anticuerpo control anti-CTLA4 de ratón (mNS-mFa55) o el anticuerpo interruptor anti-CTLA4 de ratón (SW1208-mFa55). Como resultados, tanto mNS-mFa55 como SW1208-mFa55 redujeron la proporción de células Treg efectoras a menos del 0,2% de las células CD45 positivas a dosis de 1 mg/kg y más (Fig.12).

[0691] (3-7-8) Evaluación de los efectos sistémicos en el bazo en modelo trasplantado con células FM3A

[0692] Se evaluaron cambios en células T cooperadoras activadas (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) en el bazo después de la administración de mNS-mFa55 o SW1208-mFa55 por análisis de FACS. Como resultado, la proporción de células T cooperadoras activadas respecto a células CD45 positivas en el bazo aumentó significativamente cuando se administró mNS-mFa55, pero no hubo aumento significativo en la proporción de células T cooperadoras activadas respecto a células CD45 positivas en el bazo incluso cuando la dosis de SW1208-mFa55 aumentó (Fig. 13). Se confirmó que mientras el anticuerpo interruptor mostró la misma eficacia que el anticuerpo control, no provocó respuesta en tejidos diferentes del tumor, y el concepto de mostrar actividad solo localmente en el tumor se demostróin vivoen ratón.

[0693] [Ejemplo 4] Generación de anticuerpos de CTLA4 alterados y evaluación de sus actividades

[0694] Se llevó a cabo alteración adicional y evaluación de anticuerpos interruptores anti-CTLA generados en el ejemplo 3. (4-1) Aumento de la capacidad de unión a CTLA4 por alteraciones de unión aumentada a ATP

[0695] De los resultados del análisis estructural realizado en el ejemplo 2-1, se mostró que CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo interacciona con el grupo fosfato de AMP. Se consideró que cuando la molécula pequeña era ATP, el grupo γ-fosfato podría causar impedimento estérico a la CDR2 de la cadena pesada. Después, los aminoácidos en esta región se sustituyeron para examinar el aumento de la capacidad de unión a ATP. Específicamente, se generaron 04H1389-G1m/04L1086-lam1 y 04H1382-G1m/04L1086-lam1 introduciendo las alteraciones de R53Q y G55H en las regiones variables de la cadena pesada de 04H1207-G1m/04L1086-lam1 y 04H1208-Glm/04L1086-lam1 generados en el ejemplo 3. Además, se generó 04H1389-G1m/04L1305-k0MT sustituyendo la cadena ligera de 04H1389-G1m/04L1086-lam1 con la secuencia de la cadena κ humana. La tabla 14 enumera las SEQ ID NO de las regiones variables de la cadena pesada, regiones variables de la cadena ligera, regiones constantes de la cadena pesada, regiones constantes de la cadena ligera y regiones hipervariables de estos anticuerpos.

[0696] Secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas, cadenas ligeras y sus regiones hipervariables (indicadas por SEQ ID NO).

[0697] [Tabla 14]

[0698]

[0701] Se usó Biacore T200 para evaluar la unión de las variantes generadas a ATP y a CTLA4 humano. El ensayo de unión a ATP se realizó a 37ºC usando ACES 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl<2>2 mM, Tween 20 al 0,05% como el tampón de carrera. Primero, se inmovilizó proteína A Sure (GE Healthcare) en un chip sensor serie S CM3 (GE Healthcare), y los anticuerpos se capturaron en el chip haciendo interaccionar una solución de anticuerpo preparada en un tampón de carrera. A continuación, la capacidad de unión al anticuerpo se evaluó por interacción con una solución de ATP preparada en el tampón de carrera. Los chips se regeneraron con NaOH 25 mM y glicina-HCl 10 mM (pH 1,5), y el ensayo se realizó capturando repetidamente anticuerpos. Para la cantidad de unión de cada anticuerpo a ATP, la cantidad de unión de ATP por cantidad unidad de anticuerpos se calculó corrigiendo la cantidad de unión cuando se inyectó ATP a una concentración de 100 nM con la cantidad de anticuerpo capturado en la superficie del chip. La unión de CTLA4 humano se midió usando Biacore T200 por el método descrito en el ejemplo 3-3. La tabla 15 muestra los resultados de estas medidas.

[0703] Análisis de unión a ATP y CTLA4 humano

[0705] [Tabla 15]

[0706]

[0709]  04H1389-G1m/04L1086-lam1 y 04H1382-G1m/04L1086-lam1 tenían capacidad de unión aumentada a ATP comparado con los anticuerpos parentales 04H1207-G1m/04L1086-lam1 y 04H1208-G1m/04L1086-lam1 para los que no se introdujo R53Q/G55S. La capacidad de unión de 04H1389-G1m/04L1086-lam1 y 04H1382-G1m/04L1086-lam1 a CTLA4 humano aumentó aproximadamente 10 veces en presencia de ATP 10 μM comparado con los anticuerpos parentales 04H1207-G1m/04L1086-lam1 y 04H1208-G1lm/04L1086-lam1 para los que no se introdujo R53Q/G55S. La comparación de las cantidades de unión mostró que la capacidad de unirse a CTLA4 humano a menores concentraciones de ATP aumentó. También se mostró que 04H1389-G1m/04L1305-k0MT, en el que la cadena ligera de 04H1389-G1m/04L1086-lam1 se sustituyó con la secuencia de la cadena κ humana, tenía una capacidad de unión a ATP y una capacidad de unión a CTLA4 humano dependiente de ATP equivalente a 04H1389-G1m/04L1086-lam1. (4-2) Generación de anticuerpo control anti-CTLA4 humano y anticuerpo interruptor anti-CTLA4, y evaluación de su capacidad de unión

[0710] Se generaron un anticuerpo control anti-CTLA4 humano (MDX10D1H-mFa55/MDX10D1L-mk1, abreviatura: hNS-mFa55) y un anticuerpo interruptor anti-CTLA4 (04H1389-mFa55/04L1305-mk1, abreviatura: SW1389-mFa55). En el anticuerpo hNS-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada MDX10D1H (SEQ ID NO: 26) y la región variable de la cadena ligera MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0711] En el anticuerpo SW1389-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada 04H1389 (SEQ ID NO: 29) y la región variable de la cadena ligera 04L1305 SEQ ID NO: 30), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0712] Se evaluó la unión de hNS-mFa55 y SW1389-mFa55 generados a CTLA4 humano. Se usó ACES 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl<2>2 mM, Tween 20 al 0,05% con ATP añadido a la concentración deseada como el tampón de carrera, y el ensayo se realizó a 37ºC. Primero, se inmovilizó anti-IgG de ratón en conejo (Thermo Fisher Scientific) en un chip sensor serie S CM5 (GE Healthcare), y el anticuerpo se capturó en chip haciendo interaccionar una solución de anticuerpo preparada en un tampón de carrera sin ATP. A continuación, se evaluó la capacidad de unión de anticuerpo a CTLA4 humano en presencia o ausencia de ATP por interacción con una solución de CTLA4 humano preparada en tampón de carrera con ATP añadido a la concentración deseada, o solución de CTLA4 humano preparada en un tampón de carrera sin ATP. Los chips se regeneraron con NaOH 25 mM y glicina-HCl 10 mM (pH 1,5), y el ensayo se realizó capturando repetidamente anticuerpos. La constante de disociación de cada anticuerpo para CTLA4 se calculó usando el software de evaluación Biacore T2002.0. Específicamente, la constante de velocidad de unión ka (l/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s) se calcularon por ajuste global de los sensorgramas obtenidos por la medida, usando una modelo de unión de Langmuir 1:1, y la constante de disociación KD (mol/l) se calculó de esos valores. La tabla 16 muestra los resultados de estos ensayos.

[0713] Análisis de unión de variantes con regiones constantes de ratón a CTLA4 humano

[0714] Tabla 16

[0716]

[0718] Se confirmó que ambos anticuerpos generados usando las regiones constantes de ratón se unen a CTLA4 humano. También se mostró que SW1389-mFa55 se une a CTLA4 humano de una manera dependiente de ATP, similar a 04H1389-G1m/04L1305-k0MT generado usando la misma región variable y región constante humana mostrado en la tabla 15.

[0719] (4-3) Eficacia de cada uno del anticuerpo interruptor anti-CTLA4 y anticuerpo no interruptor anti-CTLA4 en un modelo trasplantado de células tumorales singénicas usando ratón transgénico de CD3 humano, con inserción de CTLA4 humano, aumento/disminución de células Treg en tumor, y cambio en marcador de respuesta sistémica en el bazo (4-3-1) Línea celular

[0720] Se usaron células Hepa1-6/hGPC3. Esta línea celular se obtuvo comprando línea de cáncer de hígado de ratón células Hepa1-6 de la ATCC, expresando constitutivamente el gen de glipicano 3 humano (hGPC3, SEQ ID NO: 181) por transfección y realizando clonación. Las células Hepa1-6/hGPC3 se mantuvieron y pasaron en medio D-MEM (alta glucosa) (SIGMA) que contenía SBF (SIGMA) al 10% y GENETECIN (Gibco) 600 μg/ml.

[0721] (4-3-2) Preparación de modelo de ratón trasplantado con línea tumoral singénica

[0722] Un ratón con EDG sustituido por CD3 humano, CTLA4 KI humano (ratón EDG sustituido con hCD3 hCTLA4 KI), que es un híbrido de un ratón con secuencias CTLA4 humanas introducidas (Blood (2005) 106 (9): 3127-3133) y un ratón con EDG sustituido con CD3 humano generado internamente (Sci Rep (2017) 7: 45839), se usó. Las células Hepa1-6/hGPC3 se trasplantaron por vía subcutánea en el ratón EDG sustituido con hCD3 hCTLA4 KI, y se determinó que el modelo estaba establecido cuando el volumen medio de los tumores trasplantados alcanzó de aproximadamente 200 mm<3>a aproximadamente 400 mm<3>.

[0723] El volumen del tumor trasplantado se calculó por la siguiente fórmula

[0724] Volumen tumoral = diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto/2

[0725] (4-3-3) Preparación de fármacos para administración

[0726] Como los fármacos que se van a administrar al modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3, el anticuerpo interruptor anti-CTLA4 (SW1389-mFa55) y el anticuerpo control anti-CTLA4 humano (hNS-mFa55) preparados en el ejemplo 4-2 se prepararon a concentraciones de 0,01, 0,1, 1, 5, 10, y 20 mg/ml y 0,01, 0,1, 1, y 3 mg/ml, respectivamente usando tampón His (NaCl 150 mM/Tampón His-HCl 20 mM, pH 6,0).

[0727] (4-3-4) Administración de fármaco para medir el efecto antitumoral

[0728] El 7º día después del trasplante, SW1389-mFa55 se administró a ratones a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 100 mg/kg, y hNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg, a través de la vena de la cola. La tabla 17 muestra los detalles del tratamiento con fármaco en medir el efecto antitumoral

[0729] Medida del efecto antitumoral en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3

[0730] Tabla 17

[0732]

[0734] (4-3-5) Evaluación del efecto antitumoral

[0735] El efecto antitumoral se evaluó por el volumen tumoral calculado por la fórmula descrita en (4-3-2). Se usó JMP 11.2.1 (SAS Institute Inc.) para análisis estadístico.

[0736] El valor TGI (inhibición del crecimiento tumoral) se calculó por la siguiente fórmula.

[0737] TGI (%) = (1 – (volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de administración inicial)/(volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de administración inicial)) x 100.

[0738] Como resultado, tanto hNS-mFa55 como SW1389-mFa55 mostraron una eficacia de fármaco de TGI = 60 o más el 18º día después de la administración a dosis de 1 mg/kg o más (figuras 14 y 15).

[0739] (4-3-6) Administración de fármaco para evaluación de células Treg en tumor y verificación de efectos sistémicos en bazo

[0740] El 7º día después del trasplante, SW1389-mFa55 se administró a ratones a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, y 500 mg/kg a través de la vena de la cola y hNS-mFa55 se administró a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg, a través de la vena de la cola. La tabla 18 muestra los detalles del tratamiento con fármaco para evaluación de células Treg en el tumor y verificación de efectos sistémicos en el bazo.

[0741] Verificación de efectos intratumorales y sistémicos en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3 (hNS-mFa55 y SW1389-mFa55).

[0742] Tabla 18

[0744]

[0746] (4-3-7) Extirpación de tumor y bazo de ratones modelo trasplantados con células Hepa1-6/hGPC3

[0747] El 6º día después de la administración del anticuerpo, los ratones se sacrificaron con anestesia, y los tumores y bazos se extirparon. De los bazos extirpados, se preparó una suspensión celular usando medio RPMI-1640 (SIGMA) que contenía SBF (SIGMA) al 10%, y después se hemolizó usando el kit de lisado de eritrocitos de ratón (R&D) para preparar células de bazo. Los tumores extirpados se trituraron usando el kit de disociación de tumores, ratón (Milteny). Tanto las células de bazo como los tumores triturados se hicieron reaccionar con los siguientes anticuerpos, y las fracciones de células inmunitarias presentes se analizaron por análisis de FACS: anticuerpo CD45 (BD, clon: 30-F11), anticuerpo anti-CD3 (BD, clon: UCHT1), anticuerpo anti-CD4 (BD, clon: RM4-5), anticuerpo anti-FoxP3 (eBioscience, clon: FJK-16s), anticuerpo anti-ICOS (eBioscience, clon: 7E17G9), anticuerpo anti-CCR7 (Biolegend, clon: 4B12), anticuerpo anti-KLRG1 (Biolegend, clon: 2F1/KLRG1). El análisis de FACS se realizó mediante BD LSR Fortessa X-20 (BD).

[0748] (4-3-8) Evaluación de Treg tumorales en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3

[0749] Se evaluaron cambios en células Treg efectoras (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<bajo>KLRG1<+>) en el tumor después de la administración de SW1389-mFa55 o hNS-mFa55. Como resultado, tanto hNS-mFa55 como SW1389-mFa55 redujeron la proporción de células Treg efectoras a menos del 0,2% de las células CD45 positivas a dosis de 1 mg/kg y más (Fig.16).

[0750] (4-3-9) Evaluación de los efectos sistémicos en el bazo en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3 Se evaluaron cambios en células T cooperadoras activadas (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) en el bazo después de la administración de hNS-mFa55 o SW1389-mFa55 por análisis de FACS. Como resultado, la proporción de células T cooperadoras activadas respecto a células CD45 positivas en el bazo aumentó significativamente cuando se administró hNS-mFa55, pero no hubo aumento significativo en la proporción de células T cooperadoras activadas respecto a células CD45 positivas en el bazo cuando se administró SW1389-mFa55, incluso cuando la dosis de administración aumentó (Fig. 17). Esto confirmó que el anticuerpo interruptor mostró la misma eficacia que el anticuerpo control, pero no provocó respuesta en tejidos diferentes del tumor. Por tanto, el concepto de mostrar actividad solo localmente en el tumor se demostróin vivoen ratones CTLA4 KI humano.

[0751] (4-4) Generación de un anticuerpo control anti-CTLA4 y un anticuerpo interruptor anti-CTLA4 para prueba de toxicidad de macaco cangrejero

[0752] Se generaron un anticuerpo control anti-CTLA4 (MDX10D1H-Kn125/MDX10D1L-k0MT//MDX10D1H-H1076/MDX10D1L-k0MT, abreviatura: NS-ART1) y un anticuerpo interruptor anti-CTLA4 (04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-H1076/04L1305-k0MT, abreviatura: SW1389-ART1). En el anticuerpo NS-ART1, se usaron la región variable de la cadena pesada MDX10D1H (SEQ ID NO: 26) y la región variable de la cadena ligera MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de cadena pesada humana Kn125 (SEQ ID NO: 31) y la región constante de la cadena pesada humana H1076 (SEQ ID NO: 32) descritas en la bibliografía de patente anterior WO 2013/002362, y la región constante de la cadena ligera humana k0MT (SEQ ID NO: 33). En este momento, una región constante de la cadena pesada humana a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0753] En el anticuerpo SW1389-ART1, se usaron la región variable de la cadena pesada 04H1389 (SEQ ID NO: 29) y la región variable de la cadena ligera 04L1305 (SEQ ID NO: 30), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de cadena pesada humana Kn125 (SEQ ID NO: 31) y la región constante de la cadena pesada humana H1076 (SEQ ID NO: 32) y la región constante de la cadena ligera humana k0MT (SEQ ID NO: 33). En este momento, una región constante de la cadena pesada humana a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia. Los anticuerpos heterodimerizados (anticuerpos que tienen dos polipéptidos de cadena pesada diferentes y/o dos polipéptidos de cadena ligera diferentes) se nombran en el presente documento según la siguiente regla: (primera región variable de la cadena pesada)-(primera región constante de la cadena pesada)/(primera región variable de la cadena ligera)-(primera región constante de la cadena ligera)//(segunda región variable de la cadena pesada)-(segunda región constante de la cadena pesada)/(segunda región variable de la cadena ligera)-(segunda región constante de la cadena ligera). Por ejemplo, si el nombre del anticuerpo es 04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-H1076/04L1305-k0MT, significa que en este anticuerpo, la primera región variable de la cadena pesada es 04H1389, la primera región constante de la cadena pesada es Kn125, la primera región variable de la cadena ligera es 04L1305, la primera región constante de la cadena ligera es k0MT, la segunda región variable de la cadena pesada es 04H1389, la segunda región constante de la cadena pesada es H1076, la segunda región variable de la cadena ligera es 04L1305, y la segunda región constante de la cadena ligera es k0MT.

[0754] (4-5) Implementación de la prueba de toxicidad de macaco cangrejero

[0755] Con el fin de evaluar y comparar la toxicidad incluyendo la respuesta sistémica, el anticuerpo NS-ART1 o el anticuerpo SW1389-ART1 preparados en el ejemplo 4-4 se administraron a macacos cangrejeros macho (3 casos cada uno) a 60 mg/kg, una vez a la semana, durante un total de 5 veces. La administración se realizó lentamente por vía intravenosa usando una bomba de jeringa, y se realizaron observación del estado general, medida del peso corporal, sangre/química analítica de sangre, prueba de médula ósea, examen patológico, y medida de la concentración de fármaco en plasma.

[0756] La aparición de anticuerpos anti-fármaco se observó durante el periodo de administración para ambos anticuerpos, pero la exposición se mantuvo hasta el final del periodo de administración. La administración del anticuerpo NS-ART1 produjo cambios sistémicos de tipo enfermedad autoinmunitaria tal como aparición de autoanticuerpos, cambios inflamatorios (vasculitis, infiltración de células inflamatorias), cambios anémicos, y activación de células T, mientras los cambios anteriores no se observaron con la administración del anticuerpo SW1389-ART1. Estos resultados indican que el anticuerpo SW1389-ART1 tiene toxicidad reducidain vivo.

[0757] [Ejemplo 5] Generación de anticuerpos de CTLA4 alterados y evaluación de sus actividades

[0758] Se llevaron a cabo alteración y evaluación adicionales de los anticuerpos interruptores anti-CTLA4 preparados en el ejemplo 4.

[0759] (5-1) Optimización de anticuerpos por introducción de alteraciones exhaustivas y sustitución de marcos

[0760] Se introdujeron alteraciones de aminoácidos exhaustivamente en las CDR de 04H1389-G1m/04L1086-lam1, y las alteraciones con mejores perfiles se exploraron. La introducción exhaustiva y evaluación de alteraciones de aminoácidos se realizaron usando el método descrito en el ejemplo 3-3. Se generaron variantes en que una combinación de alteraciones descubierta en el presente documento se introdujo y las regiones marco se sustituyeron. La tabla 19 enumera las SEQ ID NO de las regiones variables de cadena pesada, regiones variables de cadena ligera, regiones constantes de cadena pesada, regiones constantes de cadena ligera, y regiones hipervariables de los anticuerpos. Las cadenas ligeras 04L1594-lam1, 04L1581-lam1, 04L1610-lam1, 04L1612-lam1, y 04L1610-lam1 en la tabla 19 se introdujeron con alteraciones en las CDR y marco comparadas con la cadena ligera de anticuerpo parental 04L1086-lam1, y tienen regiones marco y constantes de las secuencias de la línea germinal de la cadena λ humana. Además, 04L1615-k0MT, 04L1616-k0MT, y 04L1617-k0MT tienen alteraciones introducidas en las CDR de 04L1086-lam1 y tienen las regiones marco y constante de las secuencias de la cadena κ humana. La región variable de la cadena pesada 04H1389v373 es una introducida con alteraciones en las CDR de la región variable de la cadena pesada 04H1389 del anticuerpo parental. Las regiones variables de la cadena pesada 04H1637, 04H1643, 04H1654, 04H1656, 04H1642, y 04H1735 tienen alteraciones introducidas en las CDR de 04H1389, así como sustituciones de las secuencias marco con esas de una línea germinal diferente.

[0761] Secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas, cadenas ligeras, y sus regiones hipervariables (indicadas por SEQ ID NO).

[0762] [Tabla 19]

[0763]

[0765] La actividad de unión de las variantes generadas a CTLA4 humano se evaluó por el método descrito en el ejemplo 3-3 (tabla 20).

[0766] Análisis de la unión de CTLA4 humano

[0767] [Tabla 20]

[0770]

[0771] * El valor KD se determinó por el modelo del estado estacionario.

[0772] Los valores KD en la tabla marcados con * se calcularon usando el modelo del estado estacionario. Se mostró que todas las variantes preparadas usando 04H1389-G1m/04L1086-lam1 como el anticuerpo parental se unían a CTLA4 humano de una manera dependiente de ATP y tienen capacidad de unión más fuerte que el anticuerpo parental con una KD de 3,7 x 10<-8>M en la condición cuando ATP está presente a 10 μM. También se mostró que todos estos anticuerpos tienen capacidad de unión más fuerte que el anticuerpo anti-CTLA4 humano existente MDX10D1H-G1m/MDX10D1l-k0MT en la condición cuando ATP está presente a 10 μM.

[0773] La capacidad de unión de las variantes generadas a CTLA4 humano en presencia de ADP o AMP se evaluó por Biacore T200 y comparó con la capacidad de unión en presencia de ATP. La capacidad de unión a CTLA4 humano en presencia de ADP o AMP se midió usando el método descrito en el ejemplo 3-3, como en la evaluación de la capacidad de unión en presencia de ATP, pero usando ADP o AMP en lugar de ATP (Tabla 21).

[0774] Evaluación de la dependencia de ATP, ADP y AMP

[0775] [Tabla 21]

[0776]

[0777] El anticuerpo contra CTLA4 humano existente MDX10D1H-G1m/MDX10D1l-k0MT mostró parámetros cinéticos similares independientemente del tipo y presencia de moléculas pequeñas, mientras todos los anticuerpos anti-CTLA4 dependientes de ATP se unieron a CTLA4 humano no solo en presencia de ATP, sino también en presencia de ADP o AMP, y la capacidad de unión en presencia de estas moléculas pequeñas era mayor que en ausencia de las moléculas pequeñas mostrado en la tabla 20. Por tanto, se mostró que estos anticuerpos son anticuerpos que se unen a CTLA4 de una manera dependiente de ATP, ADP y AMP. Estos anticuerpos tenían la mayor capacidad de unión en presencia de ATP, seguido por la mayor capacidad de unión en presencia de ADP, y la menor capacidad de unión en presencia de AMP. En todos los casos, la capacidad de unión en presencia de ADP fue aproximadamente 3 veces más fuerte que la capacidad de unión en presencia de AMP, y la capacidad de unión en presencia de ATP fue aproximadamente 5 veces más fuerte que la capacidad de unión en presencia de AMP. El valor ka era similar en presencia de cualquiera de las moléculas pequeñas, pero había una diferencia en valor kd. Como la disociación en presencia de ADP era más rápida que en presencia de ATP, y además la disociación en presencia de AMP era más rápida que en presencia de ADP, se mostró que la diferencia en valor KD dependiente del tipo de molécula pequeña se debía a la diferencia en la velocidad de disociación.

[0778] A continuación, se evaluó la capacidad de unión de algunas variantes a CTLA4 de ratón y CTLA4 de macaco cangrejero. La actividad de unión a CTLA4 humano, CTLA4 de ratón y CTLA4 de macaco cangrejero se evaluó usando Biacore T200 por el método descrito en el ejemplo 3-3 (tabla 22). Se preparó CTLA4 de macaco cangrejero por el siguiente método.

[0779] El gen de CyCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 50), que es una fusión de la etiqueta His y etiqueta BAG al extremo C de la región extracelular de CTLA4 de macaco cangrejero, se sintetizó e insertó en un plásmido de expresión animal. El plásmido preparado se introdujo por el método de lipofección en la línea FreeStyle 293-F derivada de células de riñón embrionario humano (Invitrogen), que se había sembrado en una botella después de suspensión en el medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) a una densidad celular de 1,33 x 10<6>células/ml. Tres horas después de la transfección del plásmido, se añadió biotina a una concentración final de 100 μM, las células se cultivaron en un incubador de CO<2>(37ºC, CO<2>al 8%, 125 rpm) durante 4 días, y el antígeno se purificó por un método que conocen los expertos en la materia del sobrenadante de cultivo de cada muestra. La absorbancia de las soluciones de antígeno purificado a 280 nm se midió usando un espectrofotómetro. De los valores medidos obtenidos, la concentración del antígeno purificado se calculó usando el coeficiente de extinción molar calculado por el método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[0780] Análisis de la unión de CTLA4 humano, de ratón, y macaco cangrejero

[0781] [Tabla 22]

[0782]

[0783] Se mostró que todos los seis anticuerpos anti-CTLA4 dependientes de molécula pequeña evaluados se unieron no solo a CTLA4 humano, sino también a CTLA4 de ratón y a CTLA4 de macaco cangrejero de una manera dependiente de ATP.

[0784] (5-2) Generación de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 alterados y un anticuerpo control negativo

[0785] Se generaron anticuerpos interruptores anti-CTLA4 alterados (04H1654-mFa55m2P1/04L1610-m10r//04H1656-mFa55m2N1/04L1610-m10r, abreviatura: SW1610-mFa55; 04H1654-mFa55m2P1/04L1612-m10r//04H1656-mFa55m2N1/04L1612-m10r, abreviatura: SW1612-mFa55; y 04H1389-mFa55/04L1615-mk1, abreviatura: SW1615-mFa55), y un anticuerpo control negativo (IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1, abreviatura: KLH-mFa55).

[0786] En el anticuerpo SW1615-mFa55, se usaron la región variable de la cadena pesada 04H1389 (SEQ ID NO: 29) y la región variable de la cadena ligera 04L1615 (SEQ ID NO: 34), y para las regiones constantes, se usaron la región constante de la cadena pesada de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18) y la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19). En este momento, una región constante de la cadena pesada de ratón a la que se añadieron alteraciones para aumentar la unión al receptor de Fcγ se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0787] En el anticuerpo SW1610-mFa55, como las regiones constantes, una región variable de la cadena pesada 04H1654 (SEQ ID NO: 35) se unió a la región constante de la cadena ligera de ratón mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36), la otra región variable de la cadena pesada 04H1656 (SEQ ID NO: 37) se unió a la región constante de la cadena ligera de ratón mFa55m2N1 (SEQ ID NO: 38), y para la región variable de la cadena ligera 04L1610 (SEQ ID NO: 39), la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje m10r (SEQ ID NO: 22) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0788] En el anticuerpo SW1612-mFa55, como las regiones constantes, una región variable de la cadena pesada 04H1654 (SEQ ID NO: 35) se unió a la región constante de la cadena ligera de ratón mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36), la otra región variable de la cadena pesada 04H1656 (SEQ ID NO: 37) se unió a la región constante de la cadena ligera de ratón mFa55m2N1 (SEQ ID NO: 38), y para la región variable de la cadena ligera 04L1612 (SEQ ID NO: 40), la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje m10r (SEQ ID NO: 22) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0789] En el anticuerpo control negativo, como las regiones constantes, una región variable de la cadena pesada IC17Hdk (SEQ ID NO: 51) se unió a la región constante de la cadena ligera de ratón mFa55 (SEQ ID NO: 18), y para la región variable de la cadena ligera IC17L (SEQ ID NO: 52), la región constante de la cadena ligera de ratón salvaje mk1 (SEQ ID NO: 19) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido por los expertos en la materia.

[0790] (5-3) Evaluación de la capacidad de unión de anticuerpos que tienen una región constante de ratón a CTLA4 humano La capacidad de anticuerpos anti-CTLA4 que tienen una región constante de ratón para unirse a un antígeno se evaluó por el método descrito en el ejemplo 4-2 (Tabla 23). Se mostró que todos estos anticuerpos que tienen una región constante de ratón tienen la misma capacidad de unión dependiente de ATP a CTLA4 humano que los anticuerpos mostrados en la tabla 22 que tienen la misma región variable, pero tienen una región constante humana.

[0791] Análisis de unión de variantes con regiones constantes de ratón a CTLA4 humano

[0792] Tabla 23

[0794]

[0796] (5-4) Eficacia de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 en un modelo trasplantado de células tumorales singénicas usando ratón transgénico de CD3 humano, con inserción de CTLA4 humano, aumento/disminución de células Treg en tumor, y cambio en marcador de respuesta sistémica en el bazo

[0797] (5-4-1) Línea celular

[0798] Se usaron células Hepa1-6/hGPC3. Esta línea celular se obtuvo comprando línea de cáncer de hígado de ratón células Hepa1-6 de la ATCC, expresando constitutivamente el gen de glipicano 3 humano (hGPC3, SEQ ID NO: 181) por transfección y realizando clonación. Las células Hepa1-6/hGPC3 se mantuvieron y pasaron en medio D-MEM (alta glucosa) (SIGMA) que contenía SBF (SIGMA) al 10% y G4180,6 mg/ml (Nacalai Tesque).

[0799] (5-4-2) Preparación de modelo de ratón trasplantado con línea tumoral singénica

[0800] Un ratón con EDG sustituido con CD3 humano, CTLA4 KI humano (ratón EDG sustituido con hCD3 hCTLA4 KI), que es un híbrido de un ratón con secuencias CTLA4 humanas introducidas (Blood (2005) 106 (9): 3127-3133) y un ratón con EDG sustituido con CD3 humano generado internamente (Sci Rep (2017) 7: 45839), se usó. Las células Hepa1-6/hGPC3 se trasplantaron por vía subcutánea en el ratón EDG sustituido con hCD3 hCTLA4 KI, y se determinó que el modelo estaba establecido cuando el volumen medio de los tumores trasplantados alcanzó de aproximadamente 200 mm<3>a aproximadamente 400 mm<3>.

[0801] El volumen del tumor trasplantado se calculó por la siguiente fórmula

[0802] Volumen tumoral = diámetro largo x diámetro corto x diámetro corto/2

[0803] (5-4-3) Preparación de fármacos para administración

[0804] Los fármacos que se van a administrar al modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3, fueron anticuerpos interruptores anti-CTLA4 (SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, SW1615-mFa55) preparados en el ejemplo 5-2. Los fármacos para administración se prepararon usando tampón His (NaCl 150 mM/Tampón His-HCl 20 mM, pH 6,0) de modo que fueran 0,03 mg/ml, 0,1 mg/ml y 0,3 mg/ml.

[0805] (5-4-4) Administración de fármaco para medir el efecto antitumoral

[0806] El 8º día después del trasplante, se administraron tres muestras de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 a ratones a 0,3 mg/kg, 1 mg/kg y 3 mg/kg, respectivamente, a través de la vena de la cola. La tabla 24 muestra los detalles del tratamiento con fármaco en medir el efecto antitumoral

[0807] Medida del efecto antitumoral en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3 (anticuerpos interruptores anti-CTLA4)

[0808] Tabla 24

[0810]

[0812] (5-4-5) Evaluación del efecto antitumoral

[0813] El efecto antitumoral se evaluó por el volumen tumoral calculado por la fórmula descrita en (5-4-2).

[0814] El valor TGI (inhibición del crecimiento tumoral) se calculó por la siguiente fórmula.

[0815] TGI (%) = (1 – (volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo de interés en el tiempo de administración inicial)/(volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de medida - volumen tumoral medio en el grupo control en el tiempo de administración inicial)) x 100.

[0816] Como resultado, SW1610-mFa55 y SW1612-mFa55 mostraron una eficacia de fármaco de TGI = 60% o más el día 16 después de la administración a dosis de 1 mg/kg o más y SW1615-mFa55 a dosis de 3 mg/kg o más (figuras 18 a 20).

[0817] (5-4-6) Administración de fármaco para el trasplante de células Treg en tumor y verificación de efectos sistémicos en bazo

[0818] El 10º día después del trasplante, SW1610-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, SW1612-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg, y SW1615-mFa55 se administró a 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg y 400 mg/kg a ratones a través de la vena de la cola. Además, para el grupo control, el anticuerpo control negativo IC17Hdh-mFa55/IV17L-mk1 (abreviatura: KLH-mFa55) se administró a 400 mg/kg a través de la vena de la cola. La tabla 25 muestra los detalles del tratamiento con fármaco para evaluación de células Treg en el tumor y verificación de efectos sistémicos en el bazo.

[0819] Verificación de efectos intratumorales y sistémicos en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3 (anticuerpos interruptores anti-CTLA4).

[0820] Tabla 25

[0822]

[0824] (5-4-7) Extirpación de tumores y bazos de ratones modelo trasplantados con células Hepa1-6/hGPC3

[0825] El 6º día después de la administración del anticuerpo, los ratones se sacrificaron con anestesia, y los tumores y bazos se extirparon. De los bazos extirpados, se preparó una suspensión celular usando medio RPMI-1640 (SIGMA) que contenía SBF (SIGMA) al 10%, y después se hemolizó usando el kit de lisado de eritrocitos de ratón (R&D) para preparar células de bazo. Los tumores extirpados se trituraron usando el kit de disociación de tumores, ratón (Milteny). Tanto las células de bazo como los tumores triturados se hicieron reaccionar con los siguientes anticuerpos, y las fracciones de células inmunitarias presentes se analizaron por análisis de FACS: anticuerpo CD45 (BD, clon: 30-F11), anticuerpo anti-CD3 (BD, clon: UCHT1), anticuerpo anti-CD4 (BD, clon: RM4-5), anticuerpo anti-FoxP3 (eBioscience, clon: FJK-16s), anticuerpo anti-ICOS (eBioscience, clon: 7E17G9), anticuerpo anti-CCR7 (Biolegend, clon: 4B12), anticuerpo anti-KLRG1 (Biolegend, clon: 2F1/KLRG1). El análisis de FACS se realizó mediante BD LSR Fortessa X-20 (BD).

[0826] (5-4-8) Evaluación de Treg tumorales en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3

[0827] Se evaluaron cambios en células Treg efectoras (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<bajo>KLRG1<+>) en los tumores después de la administración de los anticuerpos interruptores anti-CTLA4. Como resultado, SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, y SW1615-mFa55 redujeron la proporción de células Treg efectoras a menos del 0,2% de las células CD45 positivas en todas las dosis administradas (Fig.21).

[0828] (5-4-9) Evaluación de los efectos sistémicos en el bazo en modelo trasplantado con células Hepa1-6/hGPC3 Se evaluaron cambios en células T cooperadoras activadas (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) en el bazo después de la administración de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 por análisis de FACS. Como resultado, la proporción de células T cooperadoras activadas respecto a células CD45 positivas en el bazo no aumentó significativamente a 50 mg/kg de dosis evaluadas para SW1610-mFa55 y SW1612-mFa55 y a 200 mg/kg o menos de las dosis evaluadas para SW1615-mFa55. Se realizó una prueba de Dunnett en el grupo administrado con KLH-mFa55 usando JMP 11.2.1 (SAS Institute Inc.) para la prueba de significancia (Fig.22). Esto confirmó que mientras todos los anticuerpos interruptores mostraron eficacia, no provocaron respuestas en tejidos diferentes del tumor, y que tenían la propiedad de mostrar actividad solo localmente en el tumor.

[0829] [Ejemplo 6] Generación de Fc variante capaz de aumentar la actividad ADCC/ADCP

[0830] Con el fin de generar anticuerpos con ADCC y ADCP aumentadas, que son funciones efectoras citotóxicas, se investigó la preparación de variantes de la región Fc con capacidad de unión aumentada a FcγR activadores FcγRIIIa y FcγRIIa.

[0831] (6-1) Generación y evaluación de variantes con capacidad de unión aumentada a FcγR

[0832] Se generó un anticuerpo heterodimerizado, 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1, que tiene las regiones constantes de la cadena pesada Kn125 y H1076 con capacidad de unión aumentada a FcγR descrito en el documento WO 2013/002362, y tiene 04H1637 como la región variable de la cadena pesada y 04L1610-lam1 como la cadena ligera. Específicamente, se generó el gen para la cadena pesada del anticuerpo 04H1637-Kn125 (SEQ ID NO: 162), que comprende 04H1637 (SEQ ID NO: 138) como la única región variable de la cadena pesada, y tiene L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D272E/S298A introducidas en G1d (SEQ ID NO: 158) con Gly y Lys en el extremo C de la región constante de la cadena pesada de IgG1 human eliminadas, y también tiene las alteraciones Y349C/T366W en la región CH3 que fomenta la heterodimerización. Similarmente, se generó el gen para la cadena pesada de anticuerpo 04H1637-H1076 (SEQ ID NO: 163), que comprende 04H1637 (SEQ ID NO: 138) como la otra región variable de la cadena pesada, y tiene D270E/K326D/A330M/K334E introducidas en la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana G1d (SEQ ID NO: 158), y también tiene las alteraciones D356C/T366S/L368A/Y407V en la región CH3 que fomenta la heterodimerización. Usando 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) como la cadena ligera del anticuerpo, se generó el heterodímero 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1 por un método conocido para los expertos en la materia. Se generaron los genes de cadenas pesadas de anticuerpo 04H1637-Kn462 (SEQ ID NO: 164), 04H1637-H1441 (SEQ ID NO: 165), 04H1637-H1445 (SEQ ID NO: 166), 04H1637-Kn461 (SEQ ID NO: 167), y 04H1637-H1443 (SEQ ID NO: 168), que, además de L235Q, G236W, S239M, H268D, D270E, S298A, K326D, y K334E, tienen alteraciones introducidas en la región CH2 L234F y A330K descritas en el documento WO 2013/002362 como alteraciones que cambian la unión a los FcγR; G236A, I332E, e I332D descritas en Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527 y el documento WO 2004/029207; y T250V y T307P descritas en el documento WO 2013/118858 como alteraciones para mejorar la estabilidad, en combinación. Además, se generó el gen para la cadena pesada de anticuerpo 04H1654-KT462 (SEQ ID NO: 182), que tiene Gly y Lys en el extremo C de IgG1 humana (IGHG1*03) eliminadas, tiene las mismas alteraciones que Kn462 en la región CH2, tiene la alteración E356K que fomenta la heterodimerización como se describe en el documento WO 2006/106905 en la región CH3, y comprende 04H1654 (SEQ ID NO: 140) como la única región variable de cadena pesada. Similarmente, se generó el gen para la cadena pesada de anticuerpo 04H1656-HT441 (SEQ ID NO: 170), que tiene Gly y Lys en el extremo C de IgG1 humana (IGHG1*03) eliminadas, tiene las mismas alteraciones que H1441 en la región CH2, tiene la alteración K439E que fomenta heterodimerización como se describe en el documento WO 2006/106905 en la región CH3, y comprende 04H1656 (SEQ ID NO: 141) como la región variable de la cadena pesada. Similarmente, se generaron los genes de 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171), 04H1654-KT461 (SEQ ID NO: 183), y 04H1656-HT443 (SEQ ID NO: 173). Además, se investigó una combinación de alteraciones para mejorar la cinética en sangre de los anticuerpos descritos en Mabs, 2017, 9, 844-853. Específicamente, se generó el gen para 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184), que tiene N434A/Y436T/Q438R/S440E introducidas en la región CH3 de 04H1654-KT462 (SEQ ID NO: 182), que es una combinación de alteraciones que aumentan la unión a FcRn humano en condiciones ácidas y alteraciones que reducen la unión al factor reumatoide. Similarmente, se generó el gen para 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185), que tiene N434A/Y436T/Q438R/S440E introducidas en 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171). Similarmente, se generaron la cadena pesada de anticuerpo 04H1654-KT481 (SEQ ID NO: 186) y la cadena pesada de anticuerpo 04H1656-HT498 (SEQ ID NO: 187) introduciendo las mismas alteraciones en 04H1654-KT461 y 04H1656-HT443, respectivamente. Combinando estas cadenas pesadas y usando 04L1610-lam1 o 04L1612-lam1 (SEQ ID NO: 188) como la cadena ligera, se generaron los anticuerpos heterodimerizados deseados.

[0834] Los dominios extracelulares de FcγR se prepararon por el siguiente método. Primero, los genes de los dominios extracelulares de FcγR se sintetizaron por un método conocido por los expertos en la materia. En este momento, la secuencia de cada FcγR se preparó basado en la información registrada en NCBI. Específicamente, FcγRI se preparó basado en la secuencia del número de registro de NCBI NM_00566.3, FcγRIIa se preparó basado en la secuencia del número de registro de NCBI NM_001136219.1, FcγRIIb se preparó basado en la secuencia del número de registro de NCBI NM_004001.3, FcγRIIIa se preparó basado en la secuencia del número de registro de NCBI NM_001127593.1 y se añadió una etiqueta His al extremo C. El sitio polimórfico de FcγRIIa se preparó con referencia a J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25, y el sitio polimórfico de FcγRIIIa se preparó con referencia a J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070. Se prepararon vectores de expresión insertando los fragmentos génicos obtenidos en vectores de expresión animales. Los vectores de expresión preparados se introdujeron transitoriamente en células FreeStyle293 derivadas de células de riñón embrionario humano (Invitrogen) para expresar las proteínas de interés. Después de recoger los sobrenadantes de cultivo, se pasaron a través de filtro de 0,22 μm y purificaron en las siguientes cuatro etapas, en principio. La primera etapa era una cromatografía en columna de intercambio catiónico (SP Sepharosa FF), la segunda etapa era cromatografía en columna de afinidad para la etiqueta His (HisTrap HP), la tercera etapa era cromatografía de columna de filtración en gel (Superdex200), y la cuarta etapa era filtración aséptica. Sin embargo, para FcγRI, cromatografía en columna de intercambio aniónico usando Q sepharosa FF se realizó en la primera etapa. La concentración de la proteína purificada se calculó midiendo la absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro y usando el coeficiente de extinción molar calculado del valor obtenido por un método tal como PACE (Protein Science, 1995, 4, 2411-2423). Se preparó FcRn por el método descrito en el documento WO 2010/107110.

[0836] La interacción entre los anticuerpos generados y los FcγR humanos se analizó por el siguiente método usando Biacore T200. Se usó fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05% (pH 7,4) como el tampón de carrera, y el ensayo se realizó a 25ºC. Para los chips sensores, se usaron chips de la serie S SA (GE Healthcare) sobre los que se inmovilizó CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific). Los anticuerpos de interés se capturaron en estos chips y cada FcγR diluido en el tampón de carrera se dejó interaccionar con ellos. Los chips se regeneraron con glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) y NaOH 25 mM, y el ensayo se realizó capturando anticuerpos repetidamente. Las constantes de disociación KD (mol/l) para FcγR de cada anticuerpo se calcularon usando software de evaluación de Biacore T2002.0, usando el modelo de unión de Langmuir 1:1 para FcγRIa y FcγRIIIa y el modelo de afinidad de estado estacionario para FcγRIIa. Para FcγRIIb, la cantidad de unión de FcγRIIb por cantidad unidad de anticuerpo se calculó corrigiendo la cantidad de unión de FcγRIIb obtenida del sensorgrama obtenido por la medida con la cantidad de anticuerpo capturado en la superficie del chip.

[0837] La interacción entre los anticuerpos generados y FcRn humano se analizó por el siguiente método usando Biacore T200. Se usó fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05% (pH 6,0) como el tampón de carrera, y el ensayo se realizó a 25ºC. Para el chip sensor, se usaron chips de la serie S SA (GE Healthcare) sobre los que se inmovilizó CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific). Los anticuerpos de interés se capturaron en estos chips y FcRn diluido en el tampón de carrera se dejó interaccionar con ellos. Los chips se regeneraron con glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) y NaOH 25 mM, y el ensayo se realizó capturando anticuerpos repetidamente. La constante de disociación para FcRn de cada anticuerpo se calculó usando el modelo del estado estacionario, usando software de evaluación de Biacore T2002.0.

[0838] La tabla 26 muestra estos resultados de medida.

[0839] Análisis de unión de variantes de la región Fc a FcγR y FcRn humanos

[0840] [Tabla 26]

[0841]

[0842] Los valores de "KD para hFcRn (M)" y "KD para hFcγR (M)" en la tabla indican las constantes de disociación para hFcRn y cada FcγR, respectivamente, y la "cantidad de unión" muestra la cantidad de unión de FcγRIIb por cantidad unidad de anticuerpo cuando FcγRIIb se dejó interaccionar a 1000 nM. "Valor relativo a KD entre G1m y hFcRn" y "Valor relativo a KD entre G1m y hFcγR" son valores obtenidos dividiendo el valor KD de 04H1637-G1m/04L1610-lam1 para hFcRn y para cada FcγR por el valor KD de cada variante, respectivamente. "Cantidad de unión relativa" indica el valor obtenido al dividir la cantidad de unión de cada variante a FcγRIIb por la cantidad de unión de 04H1637-G1m/04L1610-lam1. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de anticuerpo 04H1637-G1m y la cadena ligera de anticuerpo 04L1610-lam1 se muestran en SEQ ID NO: 160 y 161, respectivamente. Se mostró que todos los anticuerpos heterodimerizados generados tenían unión aumentada a FcγRIIa y FcγRIIIa en comparación con 04H1637-G1m/04L1610-lam1 que tiene la región constante de IgG1 humana nativa. Además, se mostró que todos 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1441/04L1610-lam1, 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1445/04L1610-lam1, y 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-H1443/04L1610-lam1 tenían unión aumentada a FcγRIIa comparados con 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1 que tiene la variante de región Fc descrita en el documento WO 2013/002362. Se mostró que la capacidad de unión de 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1445/04L1610-lam1 a FcγRIIIa era equivalente a 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1 y se mostró que la capacidad de unión de 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-H1443/04L1610-lam1 a FcγRIIIa estaba aumentada comparada a 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1. Similarmente, se mostró que 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1 y 04H1654-KT462/04L1612-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1 que tienen diferentes alteraciones para heterodimerización en la región constante y la región CH3 de IGHG1*03 tenían un perfil de unión a FcyR comparable a 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1445/04L1610-lam1, y se mostró que 04H1654-KT461/04L1610-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1 y 04H1654-KT461/04L1612-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1 tenían un perfil de unión a FcyR comparable a 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-H1443/04L1610-lam1. Además, se mostró que 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1, 04H1654-KT481/04L1610-lam1//04H1656-HT498/04L1610-lam1, 04H1654-KT473/04L1612-lam1//04H1656-HT482/04L1612-lam1, y 04H1654-KT481/04L1612-lam1//04H1656-HT498/04L1612-lam1 introducidos con alteraciones para mejorar la cinética en sangre tenían capacidad de unión mejorada a FcRn humano y capacidad de unión comparable a FcγR comparados con las de los anticuerpos antes de la introducción de las alteraciones para mejorar la cinética en sangre.

[0844] Además, se generó el gen 04H1656-HT451 (SEQ ID NO: 272), en el que N434A/Y436T/Q438R/S440E se introdujo en 04H1656-HT441, que es una combinación de alteraciones para aumentar la unión de FcRn humano en condiciones ácidas y alteraciones que reducen la unión a factor reumatoide. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de anticuerpo HT451 se muestra en SEQ ID NO: 276. Se generó un anticuerpo heterodimerizado combinando 04H1654-KT473 y 04H1656-HT451 y usando 04L1610-lam1 como la cadena ligera de anticuerpo. La tabla 27 muestra los resultados del análisis de interacción de los anticuerpos generados con FcRn humano y con FcγR humanos.

[0845] Análisis de unión de variantes de la región Fc a FcγR y FcRn humanos

[0847] [Tabla 27]

[0848]

[0849] Se mostró que los anticuerpos heterodimerizados generados 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1 y 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1 tenían ambos unión aumentada a los FcγR activadores FcγRIIa y FcγRIIIa, comparado con 04H1656-G1m/04L1610-lam1 que tiene la región constante de IgG1 humana nativa. Además, la unión a FcγRIIb, que es un FcyR inhibidor, se mantuvo al mismo nivel que 04H1656-G1m/04L1610-lam1 en ambos de estos anticuerpos. Se mostró que 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1, en el que N434A/Y436T/Q438R/S440E se introdujo en 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1, tenía capacidad de unión aumentada a FcRn humano comparado con esa antes de la introducción de las alteraciones.

[0851] A continuación, las variantes de unión aumentada a FcγR generadas usando las diferentes alteraciones para heterodimerización descritas en Nat. Biotechnol., 1998, 16, 677-681 se evaluaron para su actividad de unión a FcRn y FcγR humanos. Se generaron los genes de cadenas pesadas de anticuerpo 04H1389-Ks462 (SEQ ID NO: 191) y 04H1389-Km462 (SEQ ID NO: 199), que comprenden 04H1389 (SEQ ID NO: 136) como una región variable de cadena pesada, y tienen una región constante de cadena pesada que tiene las mismas alteraciones que KT462 introducidas en la región CH2 de la región constante con Gly y Lys en el extremo C de IgG1 humana (IGHG1*03) eliminadas, y además tiene en la región CH3, T366W introducida como una alteración para heterodimerización para 04H1389-Ks462, y Y349C/T366W usadas como alteraciones para heterodimerización para 04H1389-Km462. Además, se generaron los genes para cadenas pesadas de anticuerpo 04H1389-Hs445 (SEQ ID NO: 192) y 04H1389-Hm445 (SEQ ID NO: 200), que tienen las mismas alteraciones que HT445 introducidas en la región CH2, y además tienen en la región CH3, T366S/L368A/Y407V introducidas como alteraciones para heterodimerización para 04H1389-Hs445, y E356C/T366S/L368A/Y407V usadas como alteraciones para heterodimerización para 04H1389-Hm445. Similarmente, se generaron 04H1389-Ks461 (SEQ ID NO: 193), 04H1389-Km461 (SEQ ID NO: 201), 04H1389-Hs443 (SEQ ID NO: 194), y 04H1389-Hm443 (SEQ ID NO: 202), que tienen las mismas alteraciones que KT461 y HT443 en la región CH2. Además, se generaron genes para cadenas pesadas de anticuerpo 04H1389-Ks473 (SEQ ID NO: 195), 04H1389-Hs482 (SEQ ID NO: 196), 04H1389-Ks481 (SEQ ID NO: 197), 04H1389-Hs498 (SEQ ID NO: 198), 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203), 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204), 04H1389-Km481 (SEQ ID NO: 205), y 04H1389-Hm498 (SEQ ID NO: 206), que tienen las alteraciones N434A/Y436T/Q438R/S440E que mejoran la cinética en sangre introducidas en las regiones constantes de la cadena pesada de los anticuerpo anteriores Ks462, Hs445, Ks461, Hs443, Km462, Hm445, Km461, y Hm443, y tienen 04H389 como una región variable. Se usó 04L1615-k0MT (SEQ ID NO: 190) como la cadena ligera, y se generaron heterodímeros de interés. Por comparación, se generó el homodímero 04H1389-G1m/04L16150k0MT que tiene 04H1389-G1m (SEQ ID NO: 189). La interacción entre los anticuerpos generados y FcγR humanos se analizó usando Biacore T200. Se usó fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05% (pH 7,4) como el tampón de carrera, y el ensayo se realizó a 25ºC. Para el chip sensor, se usaron chips de la serie S SA (GE Healthcare) sobre los que se inmovilizó CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate (Thermo Fisher Scientific). Los anticuerpos de interés se capturaron en estos chips y cada FcγR diluido en el tampón de carrera se dejó interaccionar con ellos. Los chips se regeneraron con glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) y NaOH 25 mM, y el ensayo se realizó capturando anticuerpos repetidamente. Las constantes de disociación KD (mol/l) para FcγR de cada anticuerpo se calcularon usando software de evaluación de Biacore T200 2.0, y usando el modelo de unión de Langmuir 1:1 para FcγRIa y FcγRIIIa y el modelo de afinidad de estado estacionario para FcγRIIa. Para FcγRIIb, la cantidad de unión de FcγRIIb por cantidad unidad de anticuerpo se calculó corrigiendo la cantidad de unión de FcγRIIb obtenida del sensorgrama obtenido por la medida con la cantidad de anticuerpo capturado en la superficie del chip. Para la medida de unión a FcRn, se usó fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, Tween20 al 0,05% (pH 6,0) como el tampón de carrera, y la constante de disociación KD (mol/l) se calculó por modelo de estado estacionario (Tabla 28). De las constantes de disociación para FcγRIIIa en la tabla 28, los valores indicados por el “*” son valores calculados por el modelo de afinidad del estado estacionario.

[0853] Análisis de la unión de variantes de la región Fc a FcγR y FcRn humanos

[0855] [Tabla 28]

[0856]

[0857] Todos los anticuerpos heterodimerizados generados aquí tenían actividad de unión aumentada a FcγRIIa y FcγRIIIa en comparación a 04H1389-G1m/04L1615-k0MT. Además, todos de 04H1389-Ks473/04L1615-k0MT//04H1389-Hs482/04L1615-k0MT, 04H1389-Ks481/04L1615-k0MT//04H1389-Hs498/04L1615-k0MT, 04H1389-Km473/04L1615-k0MT//04H1389-Hm482/04L1615-k0MT, y 04H1389-Km481/04L1615-k0M//04H1389-Hm498/04L1615-k0MT, que tenían alteraciones introducidas para mejorar la cinética en sangre de los anticuerpos tenían actividad de unión aumentada a FcRn humano en comparación con el anticuerpo parental antes de la introducción de las alteraciones, para la actividad de unión a FcγR, tenían el mismo perfil de unión que el anticuerpo parental.

[0858] Además, se generó el gen para 04H1389-Hm441 (SEQ ID NO: 273), que comprende 04H1389 (SEQ ID NO: 136) como la región variable de la cadena pesada, tiene las mismas alteraciones que HT441 introducidas en la región CH2 de la cadena pesada, y tiene Y349C/366W usadas como alteraciones para heterodimerización en la región CH3. En contraste, se generó 04H1389-Hm451 (SEQ ID NO: 274), con N434A/Y436T/Q438R/S440E introducidas, que es una combinación de alteraciones que aumentan la unión a FcRn humano en condiciones ácidas y alteraciones que reducen la unión al factor reumatoide. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de anticuerpo Hm441 y Hm451 se muestran en SEQ ID NO: 277 y 278, respectivamente. Se generaron anticuerpos heterodimerizados usando 04H1389- Km473, 04H1389-Hm451 o 04H1389-Hm482 como la cadena pesada del anticuerpo y 04L1305-k0MT como la cadena ligera del anticuerpo. La tabla 29 muestra los resultados del análisis de interacción de los anticuerpos generados con FcRn humano y FcγR humanos.

[0859] Análisis de la unión de variantes de la región Fc a FcγR y FcRn humanos

[0860] [Tabla 29]

[0861]

[0864]  Se mostró que ambos anticuerpos heterodimerizados generados 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT y 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT tenían unión aumentada a los FcγR activadores FcγRIIa y FcγRIIIa comparados con 04H1389-G1m/04L1305-k0MT que tiene una región constante de IgG1 humana nativa. También se mostró que ambos de estos anticuerpos tenían capacidad de unión aumentada a FcRn humano en comparación con 04H1389-G1m/04L1305-k0MT.

[0865] A continuación, las variantes de región constante con unión aumentada a FcγR encontrados aquí se compararon con variantes de unión aumentada a FcγR existente. Se generaron los genes para cadenas pesadas de anticuerpos MDX10D1H-Kn125 (SEQ ID NO: 217), MDX10D1H-H1076 (SEQ ID NO: 218), MDX10D1H-Kn462 (SEQ ID NO: 219), MDX10D1H-H1445 (SEQ ID NO: 220), MDX10D1H-Kn461 (SEQ ID NO: 221), y MDX10D1H-H1443 (SEQ ID NO: 222), que comprenden MDX10D1H (SEQ ID NO: 154) como la región variable de la cadena pesada, y las regiones constantes de la cadena pesada enumeradas en la tabla 26, y el gen para MDX10D1H-G1m (SEQ ID NO: 210) que comprende la región CH2 de IgG1 humana nativa. Se generó el gen para la cadena pesada de anticuerpo MDX10D1H-GASDIE (SEQ ID NO: 215), que tiene las alteraciones has G236A/S239D/I332E en la región CH2 como se describe en Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517-2527 como una variante con unión aumentada a FcγRIIa. Además, también se generó el para la cadena pesada de anticuerpo MDX10D1H-GASDALIE (SEQ ID NO: 216), que tiene G236A/S239D/A330L/I332E en la región CH2 como se describe en J. Struct. Biol., 2016, 194, 78-89 como una variante con unión aumentada a FcγRIIIa. MDX10D1L-kOMT (SEQ ID NO: 211) se usó como la cadena ligera de anticuerpo, y se generaron los anticuerpos de interés. La actividad de unión de estos anticuerpos a FcγR humanos se midió por el método anteriormente descrito usando CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin Conjugate (Tabla 30).

[0866] Análisis de la unión de variantes de la región Fc a FcγR humanos

[0867] [Tabla 30]

[0868]

[0869] El valor "KD para hFcγR (M)" en la tabla indica la constante de disociación para cada uno de los FcγR enumerados, y la "Cantidad de unión" indica la cantidad de unión de FcγRIIb por cantidad unidad de anticuerpo cuando FcγRIIb se dejó interaccionar a 1000 mM. El "Valor relativo a KD entre G1m y hFcγR" indica el valor obtenido dividiendo el valor KD de MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT para cada FcγR por el valor KD de cada variante, y la "Cantidad de unión relativa" indica el valor obtenido dividiendo la cantidad de unión de cada variante a FcγRIIb por la cantidad de unión de MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT.

[0870] Los heterodímeros generados, MDX10D1H-Kn125/MDX10D1H-H1076/MDX10D1L-k0MT, MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT, y MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-H1443/MDX10D1L-k0MT tenían todos unión aumentada a FcγRIIIa comparados con anticuerpos de unión aumentada a FcγR existentes MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT y MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT. También se mostró que MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT tenía unión aumentada aproximadamente 2 veces a FcγRIIaH en comparación con el anticuerpo aumentado a FcγRIIa existente MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT.

[0871] (6-2) Evaluación de actividad ADCCin vitrode varios anticuerpos que tienen regiones constantes alteradas Se usó el bioensayo indicador de ADCC de hFcγRIIIaV, Core Kit (Promega) para ensayo de la actividad ADCCin vitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadieron 25 μl de células hCTLA4-CHO con concentración preparada de 2 x 10<6>/ml usando el medio como células diana, y el tampón de ensayo (RPMI1640 al 90%, SBF al 10%) se usó como medio. A continuación, se añadieron 25 μl de cada solución de anticuerpo diluido con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0, 0,001, 0,01, 0,1 y 1 μg/ml. Por último, se añadieron 25 μl de células Jurkat que expresan hFcγRIIIaV (incluidas en el kit) preparadas a 6 x 10<6>/ml con el medio como la solución de células efectoras, de modo que las soluciones se mezclaron a un total de 75 μl. La placa se dejó reposar a 37ºC durante la noche en un incubador con CO<2>al 5%. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 75 μl de reactivo Bio-Glo a cada pocillo. El sistema de ensayo de luciferasa Bio-glo (tampón y sustrato) se usó como el reactivo Bio-Glo. La luminiscencia de cada pocillo se midió después con un lector de placas. El valor obtenido dividiendo el valor de luminiscencia de cada pocillo por el valor de luminiscencia de pocillos sin anticuerpo se definió como las veces de inducción, que se usó como un índice para evaluar la ADCC de cada anticuerpo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 23. En la figura, la inducción en veces se representa como unidades de luminiscencia relativas (ULR).

[0872] Los resultados mostraron que la actividad ADCC de anticuerpos que tienen una Fc alterada frente a células hCTLA4-CHO es más fuerte que la de la región constante de IgG1 humana salvaje.

[0873] (6-3) Evaluación de actividad ADCPin vitrode varios anticuerpos que tienen regiones constantes alteradas Se usó el bioensayo indicador de ADCP de hFcγRIIaH, Core Kit (Promega) para ensayo de la actividad ADCCin vitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadieron 25 μl de células hCTLA4-CHO con concentración preparada de 1 x 10<6>/ml usando el medio como células diana, y el tampón de ensayo (suero bajo en IgG al 4% en RPMI1640) se usó como medio. A continuación, se añadieron 25 μl de cada solución de anticuerpo diluido con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0, 0,001, 0,01, 0,1 y 1 μg/ml. Por último, se añadieron 25 μl de células Jurkat que expresan hFcγRIIaH incluidas en el kit como la solución de células efectoras, de modo que las soluciones se mezclaron a un total de 75 μl. La placa se dejó reposar a 37ºC durante la noche en un incubador con CO<2>al 5%. La densidad de la solución celular de células Jurkat que expresan hFcγRIIaH era 8,25 x 10<5>/ml. La placa se dejó después reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 75 μl de reactivo Bio-Glo a cada pocillo. El sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (tampón y sustrato) se usó como el reactivo Bio-Glo. La luminiscencia de cada pocillo se midió después con un lector de placas. El valor obtenido dividiendo el valor de luminiscencia de cada pocillo por el valor de luminiscencia de pocillos sin anticuerpo se definió como las veces de inducción, que se usó como un índice para evaluar la ADCP de cada anticuerpo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 24. En la figura, la inducción en veces se representa como unidades de luminiscencia relativas (ULR).

[0874] Los resultados mostraron que la actividad ADCP de anticuerpos que tienen una Fc alterada frente a células hCTLA4-CHO es más fuerte que la de la región constante de IgG1 humana salvaje.

[0875] (6-4) Evaluación de actividad ADCCin vitrode anticuerpos interruptores anti-CTLA4 que tienen una Fc alterada Se generaron anticuerpos interruptores anti-CTLA4 con una Fc alterada (04H1654-Kn462/04L1610-lam1//04H1656-H1445/04L1610-lam1, abreviatura: SW1610-ART6; 04H1654-Kn462/04L1612-lam1//04H1656-H1445/04L1612-lam1, abreviatura: SW1612-ART6; y 04H1389-Kn462/04L1305-k0MT//04H1389-H1445/04L1305-k0MT, abreviatura: SW1389-ART6).

[0876] En el anticuerpo SW1610-ART6, una región variable de cadena pesada 04H1654 (SEQ ID NO: 35) se unió a la región constante de cadena pesada humana Kn462 (SEQ ID NO: 43), la otra región variable de cadena pesada 04H1656 (SEQ ID NO: 37) se unió a la región constante de cadena pesada humana H1445 (SEQ ID NO: 44) como región constante, y la región variable de la cadena ligera 04L1610 (SEQ ID NO: 39), la región constante de cadena ligera humana lam1 (SEQ ID NO: 53) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0877] En el anticuerpo SW1612-ART6, una región variable de cadena pesada 04H1654 (SEQ ID NO: 35) se unió a la región constante de cadena pesada humana Kn462 (SEQ ID NO: 43), la otra región variable de cadena pesada 04H1656 (SEQ ID NO: 37) se unió a la región constante de cadena pesada humana H1445 (SEQ ID NO: 44) como región constante, y la región variable de la cadena ligera 04L1612 (SEQ ID NO: 40), la región constante de cadena ligera humana lam1 (SEQ ID NO: 53) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0878] En el anticuerpo SW1389-ART6, dos regiones variables de cadena pesada 04H1389 (SEQ ID NO: 29) se unieron respectivamente a la región constante de cadena pesada humana Kn462 (SEQ ID NO: 43), y la región constante de cadena pesada humana H1445 (SEQ ID NO: 44) como región constante, y además para la región variable de la cadena ligera 04L1305 (SEQ ID NO: 30), la región constante de cadena ligera humana K0MT (SEQ ID NO: 33) se usó. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0879] Se usó el bioensayo indicador de ADCC de hFcγRIIIaV, Core Kit (Promega) para ensayo de la actividad ADCCin vitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadieron 12,5 μl de células hCTLA4-CHO con concentración preparada de 2 x 10<6>/ml por el medio como células diana, y el tampón de ensayo (suero bajo en IgG al 4% en RPMI1640) se usó como medio. A continuación, se añadieron secuencialmente soluciones de ATP diluidas con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0 y 100 μM, y soluciones de anticuerpo SW1389-ART6, SW1610-ART6, y SW1612-ART6 diluidas con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0, 0,001, 0,01, 0,1 y 1 μg/ml se añadieron secuencialmente. Por último, se añadieron 25 μl de células Jurkat que expresan hFcγRIIIaV (incluidas en el kit) preparadas a 3 x 10<6>/ml con el medio como la solución de células efectoras, y las soluciones se mezclaron a un total de 75 μl. La placa se dejó reposar a 37ºC durante 6 horas en un incubador con CO<2>al 5%. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 75 μl de reactivo Bio-Glo a cada pocillo. El sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (tampón y sustrato) se usó como el reactivo Bio-Glo. La luminiscencia de cada pocillo se midió después con un lector de placas. El valor obtenido dividiendo el valor de luminiscencia de cada pocillo por el valor de luminiscencia de pocillos sin anticuerpo se definió como las veces de inducción, que se usó como un índice para evaluar la ADCC de cada anticuerpo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 25 (SW1389-ART6), figura 26 (SW1610-ART6) y figura 27 (SW1612-ART6). En las figuras, la inducción en veces se representa como unidades de luminiscencia relativas (ULR).

[0880] De estos resultados, se confirmó que la actividad ADCC de los anticuerpos interruptores anti-CTLA4 que tienen una Fc alterada contra células hCTLA4-CHO se diferencia entre la presencia y ausencia de ATP, y que hubo citotoxicidad dependiente de ATP contra células hCTLA4-CHO.

[0881] (6-5) Evaluación de la actividad neutralizantein vitrode anticuerpos interruptores anti-CTLA4

[0882] Como anticuerpos interruptores anti-CTLA4 alterados, se produjeron anticuerpos humanos que tienen regiones variables de SW1389, SW1610, SW1612 y SW1615.

[0883] Para el anticuerpo SW1389, se usó 04H1389 (SEQ ID NO: 29) como la región variable de la cadena pesada y se usó 04L1305 (SEQ ID NO: 30) como la región variable de cadena ligera. Después de unir las regiones variables a las regiones constantes humanas, el anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0884] Para el anticuerpo SW1610, se usaron 04H1654 (SEQ ID NO: 35) y 04H1656 (SEQ ID NO: 37) como la región variable de cadena pesada, y se usó 04L1610 (SEQ ID NO: 39) como la región variable de cadena ligera. Después de unir las regiones variables a las regiones constantes humanas, el anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0885] Para el anticuerpo SW1612, se usaron 04H1654 (SEQ ID NO: 35) y 04H1656 (SEQ ID NO: 37) como la región variable de cadena pesada, y se usó 04L1612 (SEQ ID NO: 40) como la región variable de cadena ligera. Después de unir las regiones variables a las regiones constantes humanas, el anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0886] Para el anticuerpo SW1615, se usó 04H1389 (SEQ ID NO: 29) como la región variable de la cadena pesada y se usó 04L1615 (SEQ ID NO: 34) como la región variable de cadena ligera. Después de unir las regiones variables a las regiones constantes humanas, el anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0887] Se usó el Bioensayo de bloqueo de CTLA-4 (Promega) para medir la actividad neutralizantein vitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadieron 12,5 μl de células aAPC-Raji asociadas al kit con concentración preparada a 1 x 10<6>/ml por el medio como células diana, y se usó tampón de ensayo (SBF al 10% en RPMI1640) como medio. A continuación, se añadieron secuencialmente soluciones de ATP diluidas con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0 y 100 μM, y después soluciones de anticuerpo que tienen regiones variables de SW1389, SW1610, SW1612 y SW1615 diluidas con tampón de ensayo de modo que la concentración final fuera 0, 0,001, 0,01, 0,1 y 1 μg/ml. Por último, se añadieron 25 μl de células IL-2-Luc2-CTLA4-Jurkat (incluidas en el kit) preparadas a 2 x 10<6>/ml con el medio como la solución de células efectoras, de modo que la solución se mezcló a un total de 75 μl. La placa se dejó reposar a 37ºC durante la noche en un incubador con CO<2>al 5%. La placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y se añadieron 75 μl de reactivo Bio-Glo a cada pocillo. El sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo (tampón y sustrato) se usó como el reactivo Bio-Glo. La luminiscencia de cada pocillo se midió después con un lector de placas. El valor obtenido dividiendo el valor de luminiscencia de cada pocillo por el valor de luminiscencia de pocillos sin anticuerpo se definió como las veces de inducción, que se usó como un índice para evaluar la ADCC de cada anticuerpo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 28 (SW1389), figura 29 (SW1610), figura 30 (SW1612) y figura 31 (SW1615). En las figuras, la inducción en veces se representa como unidades de luminiscencia relativas (ULR).

[0888] De estos resultados, se confirmó que la actividad neutralizante de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 contra células que expresan hCTLA4 era diferente entre la presencia y ausencia de ATP, y que hubo actividad neutralizante dependiente de ATP.

[0889] (6-6) Evaluación de actividad citotóxicain vitrode anticuerpos interruptores anti-CTLA4 contra células T reguladoras CTLA4-positivas

[0890] Se generaron anticuerpos interruptores anti-CTLA4 con Fc alterada (04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1, abreviatura: SW1610-ART5+ACT1; 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1, abreviatura: SW1610-ART6+ACT1; 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT, abreviatura: SW1389-ART5+ACT1; 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT, abreviatura: SW1389-ART6+ACT1).

[0891] Para el anticuerpo SW1610-ART5+ACT1, se usó 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) como una cadena pesada, se usó 04H1656-HT451 (SEQ ID NO: 272) como la otra cadena pesada, y se usó 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) como la cadena ligera. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0892] Para el anticuerpo SW1610-ART6+ACT1, se usó 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) como una cadena pesada, se usó 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185) como la otra cadena pesada, y se usó 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) como la cadena ligera. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia.

[0893] Para el anticuerpo SW1389-ART5+ACT1 se usó 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) como una cadena pesada, se usó 04H1389-Hm451 (SEQ ID NO: 274) como la otra cadena pesada, y se usó 04L1305-k0MT (SEQ ID NO: 275) como la cadena ligera. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia. Para el anticuerpo SW1389-ART6+ACT1 se usó 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) como una cadena pesada, se usó 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204) como la otra cadena pesada, y se usó 04L1305-k0MT (SEQ ID NO: 275) como la cadena ligera. El anticuerpo se expresó y purificó por un método conocido para los expertos en la materia. La actividad citotóxicain vitrode los anticuerpos interruptores anti-CTLA4 con una Fc alterada contra células T reguladoras CTLA4-positivas (CD3<+>CD4<+>CD25<+>CD45RA<->CTLA4<+>) generados se evaluó. Primero, CMSP humanas (CTL CMSP criconservadas humanas, CTL) se congelaron-descongelaron y suspendieron en interleuquina 2 (IL-2) 50 U/ml/RPMI/SBF al 10% de modo que la densidad celular fuera 2 x 10<6>células/ml, y cultivaron a 37ºC durante 4 días en un incubador con CO<2>al 5%. Después de 4 días, las células se recogieron y lavaron dos veces con RPMI/SBF al 10% y después sembraron a 100 μl en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (8 x 10<5>células/pocillo o 5 x 10<5>células/pocillo), y se añadieron 25 μl de una solución KLH-G1m ajustada con RPMI/SBF al 10% a 8 mg/ml a cada pocillo. Después, se añadieron 25 μl de solución de cada anticuerpo preparada a cada concentración (0, 2,4, 8, 24 y 80 μg/ml, o 0, 0,8, 8, 80 y 800 μg/ml) en RPMI/SBF al 10% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos con fondo en U. Además, se añadieron 50 μl de una solución de ATP ajustada a 0 o 400 μM en RPMI/SBF al 10%, la mezcla se suspendió bien, y después se dejó reposar a 37ºC durante 6 horas en un incubador con CO<2>(se añadieron 5 μl de una solución de ATP ajustada a 0 o 400 μM cada 2 horas dos veces en total). Después de 6 horas, las CMSP se recogieron, lavaron dos veces con solución de enjuague auto MACS (Milteny), hicieron reaccionar con los siguientes anticuerpos, y las fracciones de células inmunitarias presentes se analizaron por análisis de FACS: reactivo para determinar la viabilidad (Biolegend, Zombie Aqua), anticuerpo anti-CD3 (BD, clon: UCHT1), anticuerpo anti-CD4 (BD, clon: RPA-T4), anticuerpo anti-CD8 (BD, clon: SK1), anticuerpo anti-CD45RA (Biolegend, clon: HI100), anticuerpo anti-CD25 (BD, clon: 2A3), anticuerpo anti-CD16 (Biolegend, clon: 3G8), anticuerpo anti-CD56 (Biolegend, clon: HCD56), anticuerpo anti-CTLA4 (Biolegend, clon: BNI3). El análisis de FACS se realizó por BD LSR Fortessa X-20 (BD). La proporción de células T reguladoras CTLA4-positivas en células viables a cada concentración de anticuerpo se calculó, y el valor relativo, con el calor de una concentración de anticuerpo de 0 tomado como el 100%, se definió como la tasa de supervivencia (%) de células T reguladoras CTLA4-positivas, y esto se usó como un índice cuando se evalúa la actividad citotóxica de cada anticuerpo. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 32 (SW1389-ART5+ACT1), figura 33 (SW1389-ART6+ACT1), figura 34 (SW1610-ART5+ACT1) y figura 35 (SW1610-ART6+ACT1).

[0894] De estos resultados, se confirmó que la actividad citotóxica de anticuerpos interruptores anti-CTLA4 con una Fc alterada contra células T reguladoras CTLA4-positivas era diferente entre la presencia y ausencia de ATP, y que hubo una actividad citotóxica dependiente de ATP contra células T reguladoras CTLA4-positivas.

[0895] [Aplicabilidad industrial]

[0896] Los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente divulgación, y métodos que los usan se pueden utilizar en el desarrollo, producción, provisión, uso y demás de fármacos con pocos efectos secundarios ya que los anticuerpos de la presente divulgación, mientras tienen actividad activadora de células inmunitarias, actividad citotóxica, y/o actividad antitumoral, tienen un bajo efecto en tejidos no tumorales tal como tejidos normales. Además, polipéptidos que contienen la región Fc variante de la presente divulgación y los métodos para producir y usar los mismos se pueden utilizar en el desarrollo, producción, provisión, uso y demás de tales fármacos.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CTLA-4, que comprende:

(1) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 83 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 97; (2) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 86 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

134;

(3) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 136 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

95;

(4) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

146;

(5) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

146;

(6) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

147;

(7) una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO:

147;

(8) una primera región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146 y una segunda región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 146; o (9) una primera región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 140 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147 y una segunda región variable que comprende una secuencia VH como se muestra en SEQ ID NO: 141 y una secuencia VL como se muestra en SEQ ID NO: 147.

2. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.

4. Un método de producir un anticuerpo, en donde el método comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 3 de modo que se produzca el anticuerpo.

5. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

6. La formulación farmacéutica de la reivindicación 5 para uso en tratar un tumor.

7. La formulación farmacéutica para uso de la reivindicación 6, en donde el tumor es cáncer de mama o cáncer de hígado.