RS68121B1 - Anti-ctla-4 antitelo i njegova upotreba - Google Patents

Anti-ctla-4 antitelo i njegova upotreba

Info

Publication number
RS68121B1
RS68121B1 RS20260610A RSP20260610A RS68121B1 RS 68121 B1 RS68121 B1 RS 68121B1 RS 20260610 A RS20260610 A RS 20260610A RS P20260610 A RSP20260610 A RS P20260610A RS 68121 B1 RS68121 B1 RS 68121B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
hvr
ctla
Prior art date
Application number
RS20260610A
Other languages
English (en)
Inventor
Hitoshi Katada
Kanako Tatsumi
Yutaka Matsuda
Shun Shimizu
Masaki Kamimura
Yasunori Komori
Yuji Hori
Tomoyuki Igawa
Hiroki Kawauchi
Hiroaki Susumu
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of RS68121B1 publication Critical patent/RS68121B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] [Oblast pronalaska]
[0005] Ovaj opis se generalno odnosi na anti-CTLA-4 antitela i postupke korišćenja antitela.
[0007] [Stanje tehnike]
[0009] Ćelije koje su mutirale usled genskih mutacija i slično u živim organizmima prati i eliminiše sistem imunološkog nadzora. Međutim, perzistentnost prekomernih imunih odgovora može postati štetna i za samog sebe, kao što je oštećenje normalnih tkiva autoimunitetom. Stoga je imuni sistem opremljen mehanizmom negativne povratne sprege (imunološke kontrolne tačke) za suzbijanje imunih odgovora nakon što se aktiviraju (videti, na primer, NPL 1). Smatra se da imunološke kontrolne tačke igraju važnu ulogu u održavanju homeostaze u imunom sistemu. S druge strane, otkriva se da pojedini tumori koriste imunološke kontrolne tačke za imunološki beg. Trenutno se široko sprovode studije o imunosupresivnoj funkciji putem glavnih molekula imunološke kontrolne tačke, citotoksičnog antigena 4 povezanog sa T-limfocitima (CTLA-4), programirane ćelijske smrti 1 (PD-1) i liganda programirane ćelijske smrti 1 (PD-L1).
[0011] CTLA-4 je glikoprotein koji pripada superfamiliji imunoglobulina, čiji je gen kloniran iz cDNK biblioteke klonova T ćelija ubica izvedenih iz miševa 1987. godine (videti, na primer, NPL 2). Poznato je da se imuni odgovor T ćelija suzbija putem CTLA-4. Godine 1996. objavljeno je da je primećen efekat regresije tumora davanjem anti-CTLA-4 antitela miševima sa rakom, na osnovu ideje da promocija aktivacije T ćelija suzbijanjem funkcije CTLA-4 dovodi do regresije raka (videti, na primer, NPL 3). Evaluacija efikasnosti anti-CTLA-4 antitela kod ljudi sprovodi se od 2000. godine, a monoklonsko antitelo protiv humanog CTLA-4 (ipilimumab) je odobrila Američka agencija za hranu i lekove (FDA) kao prvo imunostimulatorno terapijsko antitelo na svetu 2011. godine. Takođe su proizvedena mnoga monoklonska antitela protiv CTLA-4, osim ipilimumaba (videti, na primer, PTL 1, 2, 3, 4 i 12), a njihov razvoj kao lekova se sprovodi, takođe u kombinovanim terapijama (videti, na primer, PTL 13). Takvi lekovi koji inhibiraju imunološke kontrolne tačke kako bi poništili imunosupresivni mehanizam, čime se poboljšava imunoreaktivnost, nazivaju se inhibitori imunoloških kontrolnih tačaka.
[0013] S druge strane, od ranije je bilo poznato da postoje neke ćelije koje imaju imunosupresivnu funkciju među T ćelijama, i one su identifikovane kao T ćelije pozitivne na CD25 i CD41995. godine i nazvane regulatorne T ćelije (videti, na primer, NPL 4). Godine 2003, identifikovan je gen Foxp3, koji je glavni gen koji se specifično eksprimuje u regulatornim T ćelijama i reguliše njihov razvoj i funkciju. Foxp3 reguliše ekspresiju različitih gena povezanih sa imunološkim odgovorom kao transkripcioni faktor. Posebno, Foxp3 je uključen u konstitutivnu ekspresiju CTLA-4 u regulatornim T ćelijama i smatra se da igra važnu ulogu u imunosupresivnoj funkciji regulatornih T ćelija (videti, na primer, NPL 5).
[0015] Smatra se da infiltracija regulatornih T ćelija u tumorska tkiva dovodi do slabljenja ili inhibicije mehanizma imunološkog nadzora protiv tumora. Zaista, otkriveno je da postoji povećan broj regulatornih T ćelija u mnogim karcinomima kod ljudi (videti, na primer, NPL 6), i objavljeno je da lokalna infiltracija regulatornih T ćelija u tumor može postati loš prognostički faktor kod pacijenta obolelog od raka. Nasuprot tome, ako se regulatorne T ćelije mogu ukloniti iz tumorskih tkiva ili smanjiti njihov broj u njima, očekuje se da će to dovesti do poboljšanog antitumorskog imuniteta. Trenutno, razvoj imunoterapije raka usmerene na regulatorne T ćelije snažno napreduje.
[0016] Primena anti-CTLA-4 antitela, ipilimumaba (videti, na primer, NPL 12), pojačava antitumorski imunitet, ali je prijavljeno da izaziva autoimune bolesti jer sistemski pojačava imunoreaktivnost. U jednom kliničkom ispitivanju, neželjeni događaji su primećeni kod 60% pacijenata kojima je davan ipilimumab, a mnogi od njih bile su autoimune bolesti povezane sa kožom ili gastrointestinalnim traktom. Takođe, u drugom kliničkom ispitivanju, prijavljeno je da je oko polovina pacijenata kojima je primenjen ipilimumab razvila slične autoimune bolesti. Da bi se suzbili takvi neželjeni efekti, u nekim slučajevima, pacijentu kome je primenjen ipilimumab se primenjuje imunosupresivno sredstvo. Željen je razvoj novog leka koji može održati antitumorski imuni odgovor dok istovremeno suzbija takve neželjene efekte inhibitora imunoloških kontrolnih tačaka.
[0018] Citotoksične efektorske funkcije IgG antitela, aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) i aktivnost ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP), privlače pažnju kao obećavajuća sredstva za postizanje antitumorskih efekata pomoću antitela (videti, na primer, NPL 7 i 8). Ove efektorske funkcije su indukovane vezivanjem Fc regiona IgG antitela za receptore antitela (FcγR) prisutne na površini efektorskih ćelija kao što su prirodne ćelije ubice i makrofagi ili za različite komponente komplementa, a pokazalo se da su ove interakcije takođe relevantne u inhibiciji kontrolnih tačaka (videti, na primer, NPL 13). Do sada je sprovedeno mnogo studija na varijantama Fc regiona, a dobijene su varijante koje imaju različita svojstva kao što je aktivnost vezivanja FcγR veća od divljeg tipa (videti, na primer, PTL 5 i 6, i NPL 9 i 10). Štaviše, objavljeno je da se Fc region antitela vezuje za FcγR u odnosu 1:1 i da prepoznaje FcγR asimetrično u donjim šarkama i CH2 regionima (videti, na primer, NPL 11). Na osnovu ovoga, objavljene su i metode optimizacije interakcije sa FcγR uvođenjem različitih promena u dva polipeptidna lanca koji čine Fc region antitela i proizvodnjom asimetričnih varijanti Fc regiona (videti, na primer, PTL 7, 8, 9 i 10).
[0020] Poželjno je da kada se terapeutsko antitelo administrira živom organizmu, njegov ciljni antigen se specifično eksprimuje samo na mestima lezije. Međutim, u mnogim slučajevima, isti antigen se eksprimuje i na mestima koja nisu lezija, normalnim tkivima, i može izazvati neželjene efekte koji su nepoželjni u smislu terapije. Na primer, iako antitelo protiv tumorskog antigena može da ispolji citotoksičnu aktivnost protiv tumorskih ćelija putem ADCC i slično, kada se isti antigen eksprimuje i u normalnim tkivima, antitelo može takođe oštetiti normalne ćelije. Da bi se rešio gore navedeni problem, razvijena je tehnologija koja se fokusira na fenomen da je velika količina određenog jedinjenja prisutna u ciljnom tkivu (na primer, tumorskom tkivu) i stvara molekul koji vezuje antigen čija se aktivnost vezivanja antigena menja u zavisnosti od koncentracije jedinjenja (videti, na primer, PTL 11).
[0022] [Spisak referenci]
[0024] [Patentna literatura]
[0026] [PTL 1] WO 2000/037504
[0028] [PTL 1] WO 2000/037504
[0030] [PTL 2] WO 2001/014424
[0031] [PTL 3] WO 2012/120125
[0032] [PTL 4] WO 2016/196237
[0033] [PTL 5] WO 2000/042072
[0034] [PTL 6] WO 2006/019447
[0035] [PTL 7] WO 2012/058768
[0036] [PTL 8] WO 2012/125850
[0037] [PTL 9] WO 2013/002362
[0038] [PTL 10] WO 2014/104165
[0039] [PTL 11] WO 2013/180200
[0040] [PTL 12] US 2019/0241662
[0041] [PTL 13] WO 2018/223182
[0042] [Nepatentna literatura]
[0043] [NPL 1] Pardoll, Nat Rev Cancer (2012) 12: 252‑264
[0044] [NPL 2] Brunet et al., Nature (1987) 328: 267‑270
[0045] [NPL 3] Leach et al., Science (1996) 271: 1734‑1736
[0046] [NPL 4] Sakaguchi et al., J Immunol (1995) 155: 1151‑1164 [NPL 5] Takahashi et al., J Exp Med (2000) 192: 303‑310 [NPL 6] Nishikawa & Sakaguchi, Int J Cancer (2010) 127: 759‑767 [NPL 7] Clynes et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1998) 95: 652‑656 [NPL 8] Clynes et al., Nat Med (2000) 6: 443‑446
[0047] [NPL 9] Lazar et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103: 4005‑4010
[0049] [NPL 10] Chu et al., Mol Immunol (2008) 45: 3926‑3933
[0051] [NPL 11] Radaev et al., J Biol Chem (2001) 276: 16469‑16477
[0053] [NPL 12] Ramagopal et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2017) 114: 4223‑4232
[0055] [NPL 13] Chen et al., Front Immunol (2019) 10: 00292
[0057] [Suština pronalaska]
[0059] [Tehnički problem]
[0061] Opis obezbeđuje anti-CTLA-4 antitela i postupke korišćenja antitela. Takođe su stavljena na uvid javnosti antitela koja sadrže varijantni Fc region i postupke proizvodnje antitela. Pronalazak je naveden u priloženom skupu patentnihzahteva.
[0063] [Rešenje problema]
[0065] Konkretnije, predmetni pronalazak obezbeđuje [1] do [7] u nastavku.
[0067] [1] Anti-CTLA-4 antitelo, koje sadrži:
[0069] (1) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 83 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 97;
[0070] (2) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 86 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 134;
[0071] (3) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 136 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 95;
[0072] (4) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146;
[0073] (5) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146;
[0074] (6) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147;
[0075] (7) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147;
[0076] (8) prvi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146 i drugi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146; ili
[0077] (9) prvi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147 i drugi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147.
[0079] [2] Izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo iz [1].
[0081] [3] Ćeliju domaćina, koja sadrži nukleinsku kiselinu iz [2].
[0083] [4] Postupak proizvodnje antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivaciju ćelije domaćina iz [3] tako da se proizvede antitelo.
[0085] [5] Farmaceutsku formulaciju, koja sadrži antitelo iz [1] i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0087] [6] Farmaceutsku formulaciju prema [5] za upotrebu u lečenju tumora.
[0089] [7] Farmaceutsku formulaciju za upotrebu prema [6], pri čemu je tumor rak dojke ili rak jetre.
[0091] [Kratak opis crteža]
[0093] Slika 1 prikazuje aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela ABAM004 za CTLA-4, pri čemu aktivnost vezivanja zavisi od koncentracije ATP, ADP ili AMP, kao što je opisano u Primeru 1-9.
[0095] Slika 2 prikazuje aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela ABAM004 za ćelije, koje eksprimuju CTLA-4, pri čemu aktivnost vezivanja zavisi od koncentracije AMP, kao što je opisano u Primeru 1-10.
[0096] Slika 3 prikazuje ADCC aktivnost anti-CTLA-4 antitela ABAM004 na ćelije, koje eksprimuju CTLA-4 u prisustvu i odsustvu AMP kao što je opisano u Primeru 1-11.
[0098] Slika 4 prikazuje način vezivanja Fab fragmenta ABAM004 i AMP, kao što je opisano u Primeru 2-13. Na slici je teški lanac antitela označen crnom bojom, laki lanac sivom, a AMP u modelu loptice i štapića. Ostaci amino-kiselina koji formiraju interakciju sa AMP su označeni u modelu štapića. Isprekidane linije i njihove vrednosti označavaju rastojanje (Å) između svakog ostatka amino-kiseline i AMP.
[0100] Slika 5 prikazuje način vezivanja Fab fragmenta ABAM004, AMP i humanog CTLA4 (hCTLA4) kao što je opisano u Primeru 2-14. Na slici je teški lanac antitela označen crnom bojom, laki lanac sivom bojom, hCTLA4 belom, a AMP u modelu loptice i štapića. Ostaci amino-kiselina hCTLA4 koji sadrže jedan ili više atoma koji nisu vodonik, a nalaze se na udaljenosti od 4,2 Å od bilo kog dela antitela ili AMP, uzeti su kao epitop i označeni u modelu štapića.
[0102] Slika 6 prikazuje mapiranje epitopa Fab fragmenta ABAM004 u sekvenci amino-kiselina hCTLA4 kao što je opisano u Primeru 2-14. Na slici, ostaci amino-kiselina označeni crnom bojom su oni hCTLA4 koji sadrže jedan ili više atoma koji nisu vodonik, a nalaze se na udaljenosti od 4,2 Å od bilo kog dela ABAM004 ili AMP u kristalnoj strukturi. Ostaci amino-kiselina označeni sivom bojom prikazuju ostatke čiji model nije konstruisan, jer su imali poremećaje u kristalnoj strukturi.
[0104] Slika 7 je preklopljena slika struktura antitela i AMP ekstrahovanih iz kristalnih struktura samog ABAM004 Fab fragmenta, kompleksa ABAM004 Fab fragmenta i AMP, i ternarnog kompleksa ABAM004 Fab fragmenta, AMP i CTLA4, kao što je opisano u Primeru 2-15. Na slici je teški lanac antitela označen crnom bojom, laki lanac sivom, a AMP u modelu loptice i štapića. Struktura samog ABAM004 Fab fragmenta je označena tankom linijom, struktura binarnog kompleksa sa AMP srednje debelom linijom, a struktura ternarnog kompleksa debelom linijom.
[0106] Slika 8 prikazuje aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela ABAM004 i njegove varijante, 04H0150/04L0072, za CTLA-4, pri čemu aktivnost vezivanja zavisi od koncentracije ATP, ADP ili AMP kao što je opisano u Primeru 3-2. Kao oznake na slici, WT i H150L072 označavaju ABAM004 i 04H0150/04L0072, redom.
[0108] Slika 9 prikazuje neutrališuću aktivnost anti-CTLA-4 antitela SW1077 protiv CTLA-4, čija neutrališuća aktivnost zavisi od koncentracije ATP kao što je opisano u Primeru 3-6.
[0109] Slika 10 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela mNS-mFa55 (kontrolno antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija FM3A, kao što je opisano u Primeru 3-7-4. Antitelo je davano u dozama od 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 4.
[0111] Slika 11 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela SW1208-mFa55 (prekidačko antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija FM3A, kao što je opisano u Primeru 3-7-4. Antitelo je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 4.
[0113] Slika 12 prikazuje promene u odnosu efektorskih Treg ćelija u tumoru kada je anti-CTLA-4 antitelo mNS-mFa55 (kontrolno antitelo) ili SW1208-mFa55 (prekidačko antitelo) primenjeno u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija FM3A, kao što je opisano u Primeru 3-7-7. mNS-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 100 mg/kg preko repne vene, a SW1208-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene. Tumor je prikupljen šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje efektorskih Treg ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos efektorskih Treg ćelija (CD4<+>FoxP3<+>KLRG1<+>) do CD45<+>ćelija. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0115] Slika 13 prikazuje promene u odnosu aktiviranih pomoćnih T ćelija u slezini kada je anti-CTLA-4 antitelo mNS-mFa55 (kontrolno antitelo) ili SW1208-mFa55 (prekidačko antitelo) primenjeno u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija FM3A, kao što je opisano u Primeru 3-7-8. mNS-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 100 mg/kg preko repne vene, a SW1208-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene. Slezina je sakupljena šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje aktiviranih pomoćnih T ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos aktiviranih pomoćnih T ćelija (CD4<+>Foxp3<->IKOS<+>) do CD45<+>ćelija. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0117] Slika 14 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela SW1389-mFa55 (prekidačko antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 4-3-5. Antitelo je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 100 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 4.
[0119] Slika 15 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela hNS-mFa55 (kontrolno antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 4-3-5. Antitelo je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 4.
[0121] Slika 16 prikazuje promene u odnosu efektorskih Treg ćelija u tumoru kada je anti-CTLA-4 antitelo hNS-mFa55 (kontrolno antitelo) ili SW1389-mFa55 (prekidačko antitelo) primenjeno u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 4-3-8. hNS-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg, a SW1389-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene. Tumor je prikupljen šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje efektorskih Treg ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos efektorskih Treg ćelija (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<low>KLRG1<+>) do CD45<+>ćelije. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0123] Slika 17 prikazuje promene u odnosu aktiviranih pomoćnih T ćelija u slezini kada je anti-CTLA-4 antitelo hNS-mFa55 (kontrolno antitelo) ili SW1389-mFa55 (prekidačko antitelo) primenjeno u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 4-3-9. hNS-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg, a SW1389-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene. Slezina je sakupljena šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje aktiviranih pomoćnih T ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos aktiviranih pomoćnih T ćelija (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) do CD45<+>ćelije. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0125] Slika 18 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela SW1610-mFa55 (prekidačko antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 5-4-5. Antitelo je davano u dozama od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg i 3 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 5.
[0127] Slika 19 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela SW1612-mFa55 (prekidačko antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 5-4-5. Antitelo je davano u dozama od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg i 3 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 5.
[0129] Slika 20 prikazuje antitumorski efekat anti-CTLA-4 antitela SW1615-mFa55 (prekidačko antitelo) u modelu miša kome je transplantirana ćelijska linija Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 5-4-5. Antitelo je davano u dozama od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg i 3 mg/kg preko repne vene. Svaka tačka predstavlja srednju zapreminu tumora grupe, n = 5.
[0131] Slika 21 prikazuje promene u odnosu efektorskih Treg ćelija u tumoru kada je anti-CTLA-4 antitelo SW1610-mFa55, SW1612-mFa55 ili SW1615-mFa55 (koja su sva prekidačka antitela) primenjeno u modelu miša sa transplantiranom ćelijskom linijom Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 5-4-8. SW1610-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, SW1612-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, SW1615-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg i 400 mg/kg, a negativno kontrolno antitelo KLH-mFa55 je davano u dozama od 400 mg/kg preko repne vene. Tumor je prikupljen šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje efektorskih Treg ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos efektorskih Treg ćelija (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<low>KLRG1<+>) do CD45<+>ćelija. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0133] Slika 22 prikazuje promene u odnosu aktiviranih pomoćnih T ćelija u slezini kada je anti-CTLA-4 antitelo SW1610-mFa55, SW1612-mFa55 ili SW1615-mFa55 (koja su sva prekidačka antitela) primenjeno u modelu miša sa transplantiranom ćelijskom linijom Hepa1-6/hGPC3, kao što je opisano u Primeru 5-4-9. SW1610-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, SW1612-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, SW1615-mFa55 je davano u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg i 400 mg/kg, a negativno kontrolno antitelo KLH-mFa55 je primenjeno u dozama od 400 mg/kg preko repne vene. Slezina je sakupljena šest dana nakon primene, a povećanje ili smanjenje aktiviranih pomoćnih T ćelija je procenjeno FACS analizom. Uzdužna osa je odnos aktiviranih pomoćnih T ćelija (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) do CD45<+>ćelija. Prikazana je srednja vrednost od n = 3.
[0135] Slika 23 prikazuje poređenje in vitro ADCC aktivnosti antitela koja imaju različite izmenjene konstantne regione sa poboljšanim vezivanjem za FcγR, kao što je opisano u Primeru 6-2. Kao oznake na slici, IgG1 predstavlja MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT, GASDALIE predstavlja MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT, ART6 predstavlja MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT, a ART8 predstavlja MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-H1443/MDX10D1L-k0MT. Ovde je IgG1 antitelo koje ima kontrolni konstantni region, GASDALIE je antitelo koje ima konstantni region opisan u referenci iz prethodne tehnike, a ART6 i ART8 su antitela koja imaju izmenjeni konstantni region proizveden u Primeru 6-1.
[0137] Slika 24 prikazuje poređenje in vitro ADCP aktivnosti antitela koja imaju različite izmenjene konstantne regione sa poboljšanim vezivanjem za FcγR, kao što je opisano u Primeru 6-3. Kao oznake na slici, IgG1 predstavlja MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT, GASDIE predstavlja MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT, ART6 predstavlja MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-H1445/MDX10D1L-k0MT, a ART8 predstavlja MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-H1443/MDX10D1L-k0MT. Ovde je IgG1 antitelo koje ima kontrolni konstantni region, GASDIE je antitelo koje ima konstantni region opisan u referenci iz prethodne tehnike, a ART6 i ART8 su antitela koja imaju izmenjeni konstantni region proizveden u Primeru 6-1.
[0138] Sl. 25 prikazuje in vitro ADCC aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1389-ART6 koje ima izmenjeni konstantni region sa poboljšanim vezivanjem za FcγR, kao što je opisano u Primeru 6-4.
[0140] Sl. 26 prikazuje in vitro ADCC aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1610-ART6 koje ima izmenjeni konstantni region sa poboljšanim vezivanjem za FcγR, kao što je opisano u Primeru 6-4.
[0142] Sl. 27 prikazuje in vitro ADCC aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1612-ART6 koje ima izmenjeni konstantni region sa poboljšanim vezivanjem za FcγR, kao što je opisano u Primeru 6-4.
[0144] Slika 28 prikazuje neutrališuću aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1389 protiv CTLA4 (aktivnost poništavanja CTLA4 signala koja deluje na inhibitorni način protiv aktivacije efektorskih ćelija), kao što je opisano u Primeru 6-5.
[0146] Slika 29 prikazuje neutrališuću aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1610 protiv CTLA4 (aktivnost poništavanja CTLA4 signala koja deluje na inhibitorni način protiv aktivacije efektorskih ćelija), kao što je opisano u Primeru 6-5.
[0148] Slika 30 prikazuje neutrališuću aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1612 protiv CTLA4 (aktivnost poništavanja CTLA4 signala koja deluje na inhibitorni način protiv aktivacije efektorskih ćelija), kao što je opisano u Primeru 6-5.
[0150] Slika 31 prikazuje neutrališuću aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1615 protiv CTLA4 (aktivnost poništavanja CTLA4 signala koja deluje na inhibitorni način protiv aktivacije efektorskih ćelija), kao što je opisano u Primeru 6-5.
[0152] Sl. 32 prikazuje in vitro citotoksičnu aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1389-ARTS+ACT1 protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4, kao što je opisano u Primeru 6-6.
[0154] Sl. 33 prikazuje in vitro citotoksičnu aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1389-ART6+ACT1 protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4, kao što je opisano u Primeru 6-6.
[0155] Sl. 34 prikazuje in vitro citotoksičnu aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1610-ARTS+ACT1 protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4, kao što je opisano u Primeru 6-6.
[0157] Sl. 35 prikazuje in vitro citotoksičnu aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela SW1610-ART6+ACT1 protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4, kao što je opisano u Primeru 6-6.
[0159] [Opis realizacija]
[0161] Tehnike i postupci opisani ili na koje se ovde pozivaju su generalno dobro razumljivi i uobičajeno se koriste konvencionalnom metodologijom od strane stručnjaka u tehnici, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
[0163] I. DEFINICIJE
[0165] Osim ako nije drugačije definisano, tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što ih obično razume stručnjak u tehnici kojoj pripada predmetni pronalazak. ingleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y.
[0166] 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y.1992), obezbeđuju stručnjaku u tehnici opšti vodič za mnoge izraze koji se koriste u ovoj prijavi.
[0168] Radi tumačenja ove specifikacije, primenjuju se sledeće definicije i, kad god je to prikladno, izrai korišćeni u jednini takođe uključuju množinu i obrnuto. Treba razumeti da je terminologija koja se ovde koristi samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i nije namenjena da bude ograničavajuća.
[0170] „Akceptorski humani okvir“ za potrebe ovde je okvir koji obuhvata sekvencu amino-kiselina okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) izvedenog iz okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzusnog okvira, kao što je definisano u nastavku. Akceptorski humani okvir „izveden iz“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzusnog okvira može obuhvatiti istu sekvenca amino-kiselina kao i njegovu, ili može sadržati promene amino-kiselinskog reda. U nekim realizacijama, broj promena aminokiselina je 10 ili manji, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim realizacijama, VL akceptorski humani okvir je identičan po sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili sekvenci humanog konsenzusnog okvira.
[0172] „Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem sekretovani imunoglobulin koji se vezuje za Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. NK ćelijama, neutrofilima i makrofagima) omogućava ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ubijaju ciljnu ćeliju citotoksinima. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimuju samo FcγRIII, dok monociti eksprimuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može se sprovesti in vitro ADCC test, kao što je onaj opisan u US Patentu br.
[0173] 5,500,362 ili 5,821,337 ili U.S. Patentu br.6,737,056 (Presta). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju PBMC i NK ćelije. Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clynes et al. PNAS (SAD) 95: 652-656 (1998).
[0175] „Citotoksična aktivnost“ obuhvata, na primer, citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od anititela (ADCC) kao što je pomeutno gore, citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) kao što je pomenuto u daljem tekstu i citotoksičnu aktivnost posredovanu T ćelijama. CDC aktivnost znači citotoksičnu aktivnost sistema komplementa. S druge strane, ADCC aktivnost znači aktivnost u kojoj se antitelo vezuje za antigen prisutan na površini ćelije ciljne ćelije, a efektorska ćelija se dalje vezuje za antitelo, i time efektorska ćelija oštećuje ciljnu ćeliju. Da li antitelo od interesa ima ADCC aktivnost i da li antitelo od interesa ima CDC aktivnost može se meriti poznatim postupcima (na primer, Current Protocols in Immunology, Chapter 7, Immunologic studies in humans, uredili Coligan et al. (1993)).
[0177] „Neutralizujuća aktivnost“ se odnosi na aktivnost antitela da inhibira neku biološku aktivnost vezivanjem za molekul uključen u biološku aktivnost. U nekim realizacijama, biološka aktivnost se postiže vezivanjem između liganda i receptora. U određenim realizacijama, antitelo inhibira vezivanje između liganda i receptora vezivanjem za ligand ili za receptor. Antitela koja imaju takvu neutralizujuću aktivnost nazivaju se neutralizujuća antitela. Neutralizujuća aktivnost određene testirane supstance može se meriti upoređivanjem biološke aktivnosti u prisustvu liganda između uslova u prisustvu i odsustvu testirane supstance.
[0179] Izraz „ćelijska fagocitoza zavisna od antitela“ ili „ADCP“ označava proces u kome se ili cela ćelija ili deo ćelije pokrivene antitelom ugrađuje u fagocitne imune ćelije (npr. makrofage, neutrofile i dendritične ćelije) koje se vezuju za Fc region imunoglobulina.
[0181] Izraz „aktivnost vezivanja“ odnosi se na jačinu ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog ili više mesta vezivanja molekula (npr. antitelo) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Ovde, „aktivnost vezivanja“ nije strogo ograničena na interakciju 1:1 između članova para vezivanja (npr. antitelo i antigen). Na primer, kada članovi para vezivanja odražavaju monovalentnu interakciju 1:1, aktivnost vezivanja se odnosi na intrinzični afinitet vezivanja („afinitet“). Kada je član para vezivanja sposoban i za monovalentno i za multivalentno vezivanje, aktivnost vezivanja je zbir svake jačine vezivanja. Aktivnost vezivanja molekula X za njegovog partnera Y generalno se može predstaviti konstantom disocijacije (KD) ili „količinom vezivanja analita po jedinici količine liganda“. Aktivnost vezivanja može se meriti uobičajenim metodama poznatim u tehnici, uključujući one opisane ovde. Specifična ilustrativne i primerne realizacije za merenje aktivnosti vezivanja opisane su u daljem tekstu.
[0183] „Antitelo sa „zrelim afinitetom“ odnosi se na antitelo sa jednom ili više promena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje ne poseduje takve promene, pri čemu takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
[0185] Izrazi „anti-CTLA-4 antitelo“ i „antitelo koje se vezuje za CTLA-4“ odnose se na antitelo koje je sposobno da se veže za CTLA-4 sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i/ili terapeutsko sredstvo u ciljanju CTLA-4. U jednoj realizaciji, stepen vezivanja anti-CTLA-4 antitela za nepovezani, ne-CTLA-4 protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za CTLA-4 mereno, npr. radioimunološkim testom (RIA). U određenim realizacijama, antitelo koje se vezuje za CTLA-4 ima konstantu disocijacije (KD) od 1 µM ili manje, 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0,1 nM ili manje, 0,01 nM ili manje, ili 0,001 nM ili manje. (npr.
[0186] 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim realizacijama, anti-CTLA-4 antitelo se vezuje za epitop CTLA-4 koji je konzerviran među CTLA-4 iz različitih vrsta.
[0188] Izraz „antitelo“ ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, sve dok pokazuju željenu aktivnost vezivanja antigena.
[0190] „Fragment antitela“ se odnosi na molekul koji nije intaktno antitelo, a koji sadrži deo intaktnog antitela koji se vezuje za antigen za koji se vezuje intaktno antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0192] „Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za, na primer, 50% ili više, i/ili referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za, na primer, 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.
[0194] „Autoimuna bolest“ se odnosi na ne-malignu bolest ili poremećaj koji nastaje iz i usmeren je protiv sopstvenih tkiva pojedinca. Autoimune bolesti ovde posebno isključuju maligne ili kancerogene bolesti ili stanja, posebno isključujući B ćelijski limfom, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (HLL), leukemiju dlakavih ćelija i hroničnu mijeloblastnu leukemiju. Primeri autoimunih bolesti ili poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, inflamatorne reakcije kao što su inflamatorne bolesti kože, uključujući psorijazu i dermatitis (npr. atopijski dermatitis); sistemska skleroderma i skleroza; odgovori povezani sa inflamatornom bolešću creva (kao što su Kronova bolest i ulcerozni kolitis); sindrom respiratornog distresa (uključujući sindrom respiratornog distresa kod odraslih; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; kolitis; glomerulonefritis; alergijska stanja kao što su ekcem i astma i druga stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija i hronične inflamatorne odgovore; ateroskleroza; nedostatak adhezije leukocita; reumatoidni artritis; sistemski eritemski lupus (SLE) (uključujući, ali ne ograničavajući se na lupusni nefritis, kožni lupus); dijabetes melitus (npr. dijabetes melitus tipa I ili insulin zavisni dijabetes melitus); multipla skleroza; Rejnoov sindrom; autoimuni tiroiditis; Hašimotov tiroiditis; alergijski encefalomijelitis; Sjogrenov sindrom; dijabetes sa početkom u juvenilnoj fazi; i imuni odgovori povezani sa akutnom i odloženom preosetljivošću posredovanom citokinima i T-limfocitima koji se obično nalaze kod tuberkuloze, sarkoidoze, polimiozitisa, granulomatoze i vaskulitisa; perniciozna anemija (Adisonova bolest); bolesti koje uključuju leukocitarnu dijapedezu; inflamatorni poremećaj centralnog nervnog sistema (CNS); sindrom višestrukog oštećenja organa; hemolitička anemija (uključujući, ali ne ograničavajući se na krioglobulinemiju ili Kumbsovu pozitivnu anemiju); mijastenija gravis; bolesti posredovane antigen-antitelo kompleksom; bolest glomerularne bazalne membrane; antifosfolipidni sindrom; alergijski neuritis; Grejvsova bolest; Lambert-Itonov mijastenični sindrom; bulozni pemfigoid; pemfigus; autoimune poliendokrinopatije; Rajterova bolest; sindrom ukočene osobe; Behčetova bolest; gigantocelularni arteritis; nefritis imunih kompleksa; IgA nefropatija; IgM polineuropatije; imunska trombocitopenična purpura (ITP) ili autoimuna trombocitopenija.
[0196] Izrazi „rak“ i „kancerogeni“ odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje se obično karakteriše neregulisanim rastom/proliferacijom ćelija. Primeri raka uključuju rak dojke i rak jetre.
[0197] Izraz „komplement-zavisna citotoksičnost / citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili „CDC“ označava mehanizam za indukovanje ćelijske smrti u kome Fc efektorski domen antitela vezanog za metu aktivira niz enzimskih reakcija, što rezultira stvaranjem rupa u membrani ciljne ćelije. Obično, kompleks antigen-antitelo formiran na ciljnoj ćeliji vezuje se za i aktivira komponentu komplementa C1q, što zauzvrat aktivira kaskadu komplementa i dovodi do smrti ciljne ćelije. Štaviše, aktivacija komplementa može takođe dovesti do taloženja komponenti komplementa na površini ciljne ćelije, što dovodi do vezivanja za receptore komplementa (npr. CR3) na leukocite i time promoviše ADCC.
[0199] „Hemoterapijsko sredstvo“ se odnosi na hemijsko jedinjenje korisno u lečenju raka. Primeri hemoterapijskih sredstava uključuju alkilujuća sredstva kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CYTOXAN (registrovani zaštitni znak)); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilol melamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL (registrovani zaštitni znak)); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN (registrovani zaštitni znak)), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR (registrovani zaštitni znak)), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotni senf kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrozoureje kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimustin; antibiotike kao što su enediinski antibiotici (npr. kaliheamicin, posebno kaliheamicin gama1I i kaliheamicin omegaI1 (vidi, npr. Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183‑186 (1994)); CDP323, oralni inhibitor alfa-4 integrina; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoproteinske enediinske antibiotske hromofore), aklacinomizini, aktinomicin, antramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karubicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMYCIN (registrovani zaštitni znak)), morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, injekcija lipozoma doksorubicin HCl (DOXIL (registrovani zaštitni znak)), lipozomalni doksorubicin TLC D-99 (MYOCET (registrovani zaštitni znak)), peglilovani lipozomalni doksorubicin (CAELYX (registrovani zaštitni znak)) i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što su mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tuberkulidin, ubenimeks, zinostatin, zorobicin; antimetaboliti kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR (registrovani zaštitni znak)), tegafur (UFTORAL (registrovani zaštitni znak)), kapecitabin (XELODA (registrovani zaštitni znak)), epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenale kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; nadoknađivač folne kiseline kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatreksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtanzinoidi kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK (registrovani zaštitni znak) polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Judžin, Oregon); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikon; 2,2',2'-trihlorotrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angidin); uretan; vindezin (ELDISINE (registrovani zaštitni znak), FILDESIN (registrovani zaštitni znak)); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C“); tiotepu; taksoid, npr. paklitaksel (TAXOL (registrovani zaštitni znak)), formulaciju paklitaksela od nanočestica dobijenih pomoću albumina (ABRAXANE™), i docetaksela (TAXOTERE (registrovani zaštitni znak)); hlorambucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; sredstva platine kao što su cisplatin, oksaliplatin (npr. ELOXATIN (registrovani zaštitni znak)) i karboplatin; vinkas, koji sprečava polimerizaciju tubulina od formiranja mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN (registrovani zaštitni znak)), vinkristin (ONCOVIN (registrovani zaštitni znak)), vindezin (ELDISINE (registrovani zaštitni znak), FILDESIN (registrovani zaštitni znak)) i vinorelbin (NAVELBINE (registrovani zaštitni znak)); etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leukovorin; novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN (registrovani zaštitni znak)); bisfosfonate kao što su klodronat (na primer, BONEFOS (registrovani zaštitni znak) ili OSTAC (registrovani zaštitni znak)), etidronat (DIDROCAL (registrovani zaštitni znak)), NE-58095, zoledronsku kiselinu/zoledronat (ZOMETA (registrovani zaštitni znak)), alendronat (FOSAMAX (registrovani zaštitni znak)), pamidronat (AREDIA (registrovani zaštitni znak)), tiludronat (SKELID (registrovani zaštitni znak)) ili rizedronat (ACTONEL (registrovani zaštitni znak)); troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozidnog citozina); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima impliciranim u aberantnu ćelijsku proliferaciju, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao što su vakcina THERATOPE (registrovani zaštitni znak) i vakcine za gensku terapiju, na primer, vakcina ALLOVECTIN (registrovani zaštitni znak), vakcina LEUVECTIN (registrovani zaštitni znak) i vakcina VAXID (registrovani zaštitni znak); inhibitor topoizomeraze 1 (npr. LURTOTEKAN (registrovani zaštitni znak)); rmRH (npr. ABARELIX (registrovani zaštitni znak)); BAY439006 (sorafenib; Bajer); SU-11248 (sunitinib, SUTENT (registrovani zaštitni znak), Pfizer); perifozin, inhibitor COX-2 (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); bortezomib (VELCADE (registrovani zaštitni znak)); CCI-779; tipifarnib (R11577); sorafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE (registrovani zaštitni znak)); piksantron; EGFR inhibitore (videti definiciju ispod); inhibitore tirozin kinaze (videti definiciju ispod); inhibitore serin-treonin kinaze kao što je rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE (registrovani zaštitni znak)); inhibitore farneziltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od navedenih; kao i kombinacije dva ili više navedenih kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom; i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATIN™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom.
[0201] Izraz „himerno“ antitelo odnosi se na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca izveden iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
[0202] „Klasa“ antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, δ, ε, γ i µ, redom.
[0204] Izraz „citotoksični agens/sredstvo“, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne izotope (npr.<211>At,<131>I,<125>I,<90>Y,<186>Re,
[0205] <188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<212>Pb i radioaktivni izotopi Lu); hemoterapijska sredstva ili lekovi (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloidi (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili drugi interkalirajući agensi); sredstva za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante; i različita hemoterapijska sredstva opisana gore.
[0207] „Efektorske ćelije“ se odnose na leukocite koji eksprimuju jedan ili više FcR-ova i obavljaju efektorske funkcije. U određenim realizacijama, ćelije eksprimuju najmanje FcγRIII i obavljaju ADCC efektorsku funkciju(e). Primeri leukocita koji posreduju u ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), prirodne ćelije ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile. Efektorske ćelije mogu biti izolovane iz nativnog izvora, npr. iz krvi. U određenim realizacijama, efektorske ćelije mogu biti humane efektorske ćelije.
[0209] „Efektorske funkcije“ se odnose na biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); vezivanje za Fc receptor; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijski posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP); smanjenje regulacije receptora na površini ćelija (npr. receptor B ćelija); i aktivacija B ćelija.
[0211] Izraz „epitop“ obuhvata bilo koju determinantu koja se može vezati za antitelo. Epitop je region antigena koji se vezuje za antitelo koje cilja antigen i uključuje specifične amino-kiseline koje direktno kontaktiraju antitelo. Determinante epitopa mogu uključivati hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su amino-kiseline, bočni lanci šećera, fosforilne ili sulfonilne grupe i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen preferencijalno prepoznaju epitop na ciljnom antigenu u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0213] Izraz „Fc receptor“ ili „FcR“ odnosi se na receptor koji se vezuje za Fc region antitela. U nekim realizacijama, FcR je prirodni humani FcR. U nekim realizacijama, FcR je onaj koji se vezuje za IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore podklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike tih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivirajući receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične sekvence aminokiseline koje se prvenstveno razlikuju u svojim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptorski tirozin-bazirani aktivacioni motiv (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorni receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptorski tirozin-bazirani inhibitorni motiv (ITIM), u svom citoplazmatskom domenu. (videti, npr. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203‑234 (1997)). FcR su pregledani, na primer, u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); i kod de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.126: 330-341 (1995). Drugi FcR, uključujući i one koji će biti identifikovani u budućnosti, obuhvaćeni su ovde izrazom „FcR“.
[0215] Izraz „Fc receptor“ ili „FcR“ takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976); and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) i regulaciju homeostaze imunoglobulina. Postupci merenja vezivanja za FcRn su poznati (videti, npr. Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)).
[0217] Vezivanje za humani FcRn in vivo i serumski poluživot polipeptida sa visokim afinitetom za vezivanje humanog FcRn može se testirati, npr. kod transgenih miševa ili transfektovanih humanih ćelijskih linija koje eksprimuju humani FcRn, ili kod primata kojima se primenjuju antitela sa varijantom Fc regiona. WO 2000/42072 (Presta) opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR-ove. Videti takođe, npr. Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
[0219] Izraz „Fc region“ ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Izraz uključuje Fc regione prirodne sekvence i varijantne Fc regione. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG proteže se od Cys226, ili od Pro230, do karboksil-terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) ili glicin-lizin (Gly446-Lys447) Fc regiona može, ali i ne mora biti prisutan. Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, numerisanje amino-kiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa EU sistemom numeracije, takođe nazvanim EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0221] Izraz „antitelo koje sadrži Fc region“ odnosi se na antitelo koje sadrži Fc region. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numeracije) ili C-terminalni glicin-lizin (ostaci 446-447) Fc regiona može se ukloniti, na primer, tokom prečišćavanja antitela ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira antitelo. Shodno tome, kompozicija koja sadrži antitelo koje ima Fc region prema predmetnom pronalasku može da sadrži antitelo sa G446-K447, sa G446 i bez K447, sa svim uklonjenim G446-K447, ili smešu tri tipa antitela opisanih gore.
[0222] Izraz „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnosi se na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, redom) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri konzervisana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR) (videti, npr. Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da pruži specifičnost vezivanja antigena. Štaviše, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen za skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, redom. Videti, npr. Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[0224] „Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena se generalno sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence se generalno pojavljuju u sledećem nizu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)‑FR2-H2(L2)‑FR3-H3(L3)‑FR4.
[0226] Izrazi „antitelo pune dužine“, „intaktno antitelo“ i „celo antitelo“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela ili ima teške lance koji sadrže Fc region kako je ovde definisano.
[0228] „Funkcionalni Fc region“ poseduje „efektorsku funkciju“ Fc regiona nativne sekvence. Primeri „efektorskih funkcija“ uključuju vezivanje za C1q; CDC; vezivanje za Fc receptor; ADCC; fagocitozu; smanjenje regulacije receptora na ćelijskoj površini (npr. receptor B ćelija; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da Fc region bude kombinovan sa domenom za vezivanje (npr. varijabilni domen antitela) i može se proceniti korišćenjem različitih testova kao što je stavljeno na uvid javnosti, na primer, u definicijama ovde.
[0230] „Humano antitelo“ je ono koje poseduje sekvenca amino-kiselina koja odgovara antitelu proizvedenom od strane čoveka ili humane ćelije ili izvedenom iz nehumanog izvora koji koristi repertoar humanih antitela ili druge sekvence koje kodiraju humana antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji vezuju antigene koji nisu ljudi.
[0232] „Humani konsenzusni okvir“ je okvir koji predstavlja najčešće prisutne amino-kiselinske ostatke u selekciji sekvenci VL ili VH okvira humanog imunoglobulina. Generalno, selekcija sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. U jednoj realizaciji, za VL, podgrupa je podgrupa κI kao kod Kabat et al., supra. U jednoj realizaciji, za VH, podgrupa je podgrupa III kao kod Kabat et al., supra.
[0233] „Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži amino-kiselinske ostatke iz nehumanih HVR i amino-kiselinske ostatke iz humanih FR. U određenim realizacijama, humanizovano antitelo će obuhvatiti suštinski sve od najmanje jednog, a obično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi ili suštinski svi FR odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumano antitelo, odnosi se na antitelo koje je prošlo humanizaciju.
[0235] Izraz „hipervarijabilni region“ ili „HVR“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke koji dolaze u kontakt sa antigenom („antigenski kontakti“). Generalno, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Primeri HVR ovde uključuju:
[0237] (a) hipervarijabilne petlje koje se javljaju na amino-kiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987));
[0238] (b) CDR koji se nalaze na amino-kiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) kontakte antigena koji se javljaju na amino-kiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), i 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); i
[0239] (d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući HVR amino-kiselinske ostatke 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), i 94-102 (H3).
[0241] Osim ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat et al., supra.
[0242] „Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali ne ograničavajući se na, citotoksični agens.
[0244] „Izolovano“ antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim realizacijama, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografskim (npr. jonskom izmenom ili HPLC sa obrnutom fazom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti, npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
[0246] „Izolovana“ nukleinska kiselina odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina obuhvata molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0248] „Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo“ odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
[0250] Izraz „vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline sposoban za razmnožavanje druge nukleinske kiseline sa kojom je povezan. Izraz uključuje vektor kao samoreplicirajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „ekspresioni vektori“.
[0252] Izrazi „ćelija domaćin“, „ćelijska linija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ koriste se naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarno transformisanu ćeliju i potomstvo izvedeno iz nje, bez obzira na broj pasaža. Potomstvo možda nije potpuno identično po sadržaju nukleinskih kiselina matičnoj ćeliji, ali može sadržati mutacije. Ovde je uključeno mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je skrinirano ili selektovano u originalno transformisanoj ćeliji.
[0254] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, osim mogućih varijantnih antitela, npr. onih koja sadrže prirodno nastale mutacije ili nastaju tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, pri čemu su takve varijante generalno prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo u preparatu monoklonskih antitela usmereno je protiv jedne determinante na antigenu. Dakle, modifikator „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hibridomsku metodu, metode rekombinantne DNK, metode fagnog prikaza i metode koje koriste transgene životinje koje sadrže sve ili deo lokusa humanih imunoglobulina, a takve postupci i drugi primeri postupaka za pravljenje monoklonskih antitela opisani su ovde.
[0256] „Golo antitelo“ se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr. citotoksični deo) ili radioaktivna oznaka. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0258] „Nativna antitela“ se odnose na prirodno prisutne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se naziva i varijabilni domen teškog lanca ili varijabilni domen teškog lanca, nakon čega slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se naziva i varijabilni domen lakog lanca ili varijabilni domen lakog lanca, nakon čega sledi konstantni domen lakog lanca (CL). Laki lanac antitela može se dodeliti jednom od dva tipa, nazvanim kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu sekvence amino-kiseline njegovog konstantnog domena.
[0259] „Fc region nativne sekvence“ obuhvata sekvencu amino-kiselina identičnu amino-kiselinskom sekvenci Fc regiona koji se nalazi u prirodi. Humani Fc region nativne sekvence uključuje Fc region nativne sekvence humanog IgG1 (ne-A i A alotipovi); Fc region nativne sekvence humanog IgG2; Fc region nativne sekvence humanog IgG3; i Fc region nativne sekvence humanog IgG4, kao i njihove prirodno prisutne varijante.
[0261] „Varijantni Fc region“ obuhvata sekvencu amino-kiselina koja se razlikuje od Fc regiona nativne sekvence na osnovu najmanje jedne modifikacije (izmene) amino-kiseline, poželjno jedne ili više supstitucija amino-kiselina. Poželjno je da varijantni Fc region ima najmanje jednu supstituciju amino-kiseline u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence ili sa Fc regionom matičnog antitela, npr. od oko jedne do oko deset supstitucija amino-kiselina, a poželjno od oko jedne do oko pet supstitucija amino-kiselina u Fc regionu nativne sekvence ili u Fc regionu matičnog antitela. Varijantni Fc region ovde poželjno poseduje najmanje oko 80% homologije sa Fc regionom nativne sekvence i/ili sa Fc regionom matičnog antitela, poželjnije najmanje oko 90% homologije sa njim, a najpoželjnije najmanje oko 95% homologije sa njim.
[0263] „Procenat (%) identiteta sekvenci amino-kiselina“ u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu definisan je kao procenat amino-kiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa amino-kiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identiteta sekvenci amino-kiselina može se postići na različite načine koji su u okviru stručnosti u tehnici, na primer, korišćenjem javno dostupnih računarskih softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) softver ili GENETYX (registrovani zaštitni znak) (Genetyx Co., Ltd.). Stručnjaci u tehnici mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju.
[0265] Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 je odobren od strane kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u Kancelariji za autorska prava SAD, Vašington, 20559, gde je registrovan pod brojem registracije autorskih prava u SAD br. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od strane kompanije Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može kompajlirati iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba kompajlirati za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci podešava program ALIGN-2 i oni se ne menjaju.
[0267] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje sekvenci amino-kiselina, % identiteta sekvenci amino-kiselina date sekvence amino-kiselina A u odnosu na, sa ili naspram date sekvencu amino-kiselina B (što se alternativno može formulisati kao data amino-kiselinski sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identiteta sekvenci amino-kiselina u odnosu na, sa ili u odnosu na datu sekvencu amino-kiselina B) izračunava se na sledeći način:
[0268] 100 pomnoženo sa razlomkom X/Y
[0269] gde je X broj amino-kiselinskih ostataka koje je program za poravnanje sekvenci ALIGN-2 ocenjivao kao identične u poravnanju A i B u okviru tog programa, a gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba razumeti da tamo gde dužina sekvenci amino-kiselina A nije jednaka dužini sekvenci amino-kiselina B, % identiteta sekvenci amino-kiselina A i B neće biti jednak % identiteta sekvenci amino-kiselina B i A. Osim ako nije drugačije naznačeno, sve vrednosti % identiteta sekvenci amino-kiselina koje se ovde koriste dobijaju se kao što je opisano u neposredno prethodnom pasusu korišćenjem računarskog programa ALIGN-2.
[0271] Izraz „farmaceutska formulacija“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasno ispoljavanje biološke aktivnosti aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta kome bi formulacija bila primenjena.
[0273] „Pojedinac“ ili „subjekt“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, psi i konji), primati (npr. ljudi i nehumani primati kao što su majmuni), zečevi i glodari (npr. miševi i pacovi). Pojedinac ili subjekt može biti čovek.
[0275] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za subjekta. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
[0276] „Efektivna količina“ sredstva, npr. farmaceutske formulacije odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom neophodnih vremenskih perioda, da bi se postigao željeni terapeutski ili profilaktički rezultat.
[0278] Izraz „uputstvo za upotrebu“ koristi se za uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
[0280] Izraz „CTLA-4“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji prirodni CTLA-4 iz bilo kog kičmenjačkog izvora, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Izraz obuhvata neobrađeni CTLA-4 „pune dužne“, kao i bilo koji oblik CTLA-4 koji je rezultat obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata prirodne varijante CTLA-4, npr. varijante splajsovanja ili alelne varijante. Sekvenca amino-kiselina jednog primernog humanog CTLA-4 prikazana je u SEQ ID NO: 214, sekvenca amino-kiselina mišjeg CTLA-4 prikazana je u SEQ ID NO: 247, sekvenca amino-kiselina majmunskog CTLA-4 prikazana je u SEQ ID NO: 248, a sekvenca amino-kiselina ekstracelularnog domena humanog CTLA-4 prikazana je u SEQ ID NO: 28. Ovde se CTLA-4 može opisati i kao CTLA4.
[0282] Izraz „regulatorne T (Treg) ćelije“ odnosi se na subpopulaciju T ćelija koje regulišu imuni sistem, održavaju toleranciju na autoantigene i suzbijaju autoimune bolesti. Ove ćelije generalno suzbijaju ili smanjuju indukciju i proliferaciju efektorskih T ćelija. Najbolje shvaćene Treg ćelije su one koje eksprimuju CD4, CD25 i Foxp3 (CD4<+>CD25<+>Treg ćelije). Ove Treg ćelije se razlikuju od T ćelija pomagača. Za identifikaciju i praćenje Treg ćelija koristi se nekoliko različitih metoda. Kada su definisane ekspresijom CD4 i CD25 (CD4<+>CD25<+>ćelije), Treg ćelije čine oko 5% do oko 10% zrelih CD4 ćelija<+>Subpopulacija T ćelija kod miševa i ljudi, dok se oko 1% do oko 2% Treg može izmeriti u punoj krvi. Identifikacija i praćenje mogu se izvršiti daljim merenjem ekspresije Foxp3 (CD4<+>CD25<+>Foxp3<+>ćelije). Štaviše, kao još jedan marker, odsustvo ili nizak nivo ekspresije CD127 može se koristiti u kombinaciji sa prisustvom CD4 i CD25. Treg ćelije takođe eksprimuju visoke nivoe CTLA-4 i GITR. Treg ćelije se, takođe, mogu identifikovati metodama opisanim u primerima ispod.
[0283] Izraz „suštinski sličan“, „suštinski jednak“ ili „suštinski isti“, kako se ovde koristi, odnosi se na dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (na primer, jedne povezane sa antitelom predmetnog pronalaska, a druge povezane sa referentnim/uporednim antitelom), tako da bi stručnjak u tehnici smatrao da je razlika između dve vrednosti od malog ili nikakvog biološkog i/ili statističkog značaja u kontekstu biološke karakteristike merene navedenim vrednostima. (npr. KD vrednosti).
[0285] Kako se ovde koristi, „lečenje/tretman“ (i njegove gramatičke varijacije kao što su „lečiti/tretirati“ ili „koji leči/tretira“) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se sprovoditi ili radi profilakse ili tokom toka kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovne pojave bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kojih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje brzine progresije bolesti, ublažavanje ili palijaciju bolesnog stanja i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela predmetnog pronalaska se koriste za odlaganje razvoja bolesti ili za usporavanje progresije bolesti.
[0287] Izraz „tumor“ odnosi se na sav rast i proliferaciju neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i sve prekancerozne i kancerogene ćelije i tkiva. Izrazi „rak“, „kancerozni“, „poremećaj proliferacije ćelija“, „proliferativni poremećaj“ i „tumor“ se međusobno ne isključuju kako je ovde navedeno.
[0288] Izraz „tumorsko tkivo“ označava tkivo koje sadrži najmanje jednu tumorsku ćeliju. Tumorsko tkivo se obično sastoji od populacije tumorskih ćelija koje čine glavni entitet tumora (parenhim) i vezivnog tkiva i krvnih sudova koji postoje između ovih ćelija i podržavaju tumor („stroma“). Razlika između njih je jasna u nekim slučajevima, dok su u drugim isprepletena. Tumorska tkiva mogu biti infiltrirana imunskim ćelijama i slično. S druge strane, „netumorsko tkivo“ označava tkivo koje nije tumorsko tkivo (tkiva) u živom organizmu. Zdrava/normalna tkiva koja nisu u bolesnom stanju su uobičajeni primeri netumorskih tkiva.
[0290] II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
[0292] U jednom aspektu, ovo otkriće se delimično zasniva na anti-CTLA-4 antitelima i njihovoj upotrebi. U određenim realizacijama, obezbeđena su antitela koja se vezuju za CTLA-4. Antitela predmetnog pronalaska su korisna, npr. za dijagnostikovanje ili lečenje raka.
[0293] A. Primerna anti-CTLA-4 antitela
[0295] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za CTLA-4. U određenim realizacijama, anti-CTLA-4 antitelo predmetnog pronalaska ima aktivnost vezivanja za CTLA-4 koja zavisi od koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin. U nekim realizacijama, aktivnost vezivanja za CTLA-4 je veća u prisustvu jedinjenja koje sadrži adenozin u poređenju sa onom u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin. U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja za CTLA-4 je veća u prisustvu visoke koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin u poređenju sa onom u prisustvu niske koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin. Razlika u aktivnosti vezivanja za CTLA-4 može biti, na primer, dva puta ili više, 3 puta ili više, 5 puta ili više, 10 puta ili više, 20 puta ili više, 30 puta ili više, 50 puta ili više, 100 puta ili više, 200 puta ili više, 300 puta ili više, 500 puta ili više, 1 x 10<3>puta ili više, 2 x 10<3>puta ili više, 3 x 10<3>puta ili više, 5 x 10<3>puta ili više, 1 x 10<4>puta ili više, 2 x 10<4>puta ili više, 3 x 10<4>puta ili više, 5 x 10<4>puta ili više, ili 1 x 10<5>puta ili više.
[0297] U nekim realizacijama, aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela može biti predstavljena vrednošću KD (konstanta disocijacije). U daljoj realizaciji, vrednost KD anti-CTLA-4 antitela u prisustvu jedinjenja koje sadrži adenozin je manja nego u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin. Alternativno, u drugoj realizaciji, vrednost KD anti-CTLA-4 antitela u prisustvu visoke koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin je manja nego u prisustvu niske koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin. Razlika u vrednostima KD anti-CTLA-4 antitela opisanih ovde može biti, na primer, dva puta ili više, 3 puta ili više, 5 puta ili više, 10 puta ili više, 20 puta ili više, 30 puta ili više, 50 puta ili više, 100 puta ili više, 200 puta ili više, 300 puta ili više, 500 puta ili više, 1 x 10<3>puta ili više, 2 x 10<3>puta ili više, 3 x 10<3>puta ili više, 5 x 10<3>puta ili više, 1 x 10<4>puta ili više, 2 x 10<4>puta ili više, 3 x 10<4>puta ili više, 5 x 10<4>puta ili više, ili 1 x 10<5>puta ili više. KD vrednosti anti-CTLA-4 antitela opisanih ovde u prisustvu jedinjenja koje sadrži adenozin ili u prisustvu visoke koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin mogu biti, na primer, 9 x 10-
[0298] <7>M ili manje, 8 x 10<-7>M ili manje, 7 x 10<-7>M ili manje, 6 x 10<-7>M ili manje, 5 x 10<-7>M ili manje, 4 x 10<-7>M ili manje, 3 x 10<-7>M ili manje, 2 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-7>M ili manje, 9 x 10<-8>M ili manje, 8 x 10<-8>M ili manje, 7 x 10<-8>M ili manje, 6 x 10<-8>M ili manje, 5 x 10<-8>M ili manje, 4 x 10<-8>M ili manje, 3 x 10<-8>M ili manje, 2 x 10<-8>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, 9 x 10<-9>M ili manje, 8 x 10<-9>M ili manje, 7 x 10<-9>M ili manje, 6 x 10<-9>M ili manje, 5 x 10<-9>M ili manje, 4 x 10<-9>M ili manje, 3 x 10<-9>M ili manje, 2 x 10<-9>M ili manje, 1 x 10<-9>M ili manje, 9 x 10<-10>M ili manje, 8 x 10<-10>M ili manje, 7 x 10<-10>M ili manje, 6 x 10<-10>M ili manje, 5 x 10<-10>M ili manje, 4 x 10<-10>M ili manje, 3 x 10<-10>M ili manje, 2 x 10<-10>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje. KD vrednosti anti-CTLA-4 antitela u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin ili u prisustvu niske koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin mogu biti, na primer, 1 x 10<-8>M ili više, 2 x 10<-8>M ili više, 3 x 10<-8>M ili više, 4 x 10<-8>M ili više, 5 x 10<-8>M ili više, 6 x 10<-8>M ili više, 7 x 10<-8>M ili više 8 x 10<-8>M ili više, 9 x 10<-8>M ili više, 1 x 10<-7>M ili više, 2 x 10<-7>M ili više, 3 x 10<-7>M ili više, 4 x 10<-7>M ili više, 5 x 10<-7>M ili više, 6 x 10<-7>M ili više, 7 x 10<-7>M ili više, 8 x 10<-7>M ili više, 9 x 10<-7>M ili više, 1 x 10<-6>M ili više, 2 x 10<-6>M ili više 3 x 10<-6>M ili više, 4 x 10<-6>M ili više, 5 x 10<-6>M ili više, 6 x 10<-6>M ili više, 7 x 10<-6>M ili više, 8 x 10<-6>M ili više, ili 9 x 10<-6>M ili više.
[0300] U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela može biti predstavljena vrednošću kd (konstanta brzine disocijacije) umesto KD vrednosti.
[0302] U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja anti-CTLA-4 antitela može biti predstavljena količinom vezivanja CTLA-4 po jedinici količine antitela. Na primer, u testu površinske plazmonske rezonancije, količina vezivanja antitela imobilizovanog na senzorski čip i količina vezivanja antigena dalje vezanog za njega mere se kao rezonantna jedinica (RU). Vrednost dobijena deljenjem količine vezivanja antigena količinom vezivanja antitela može se definisati kao količina vezivanja antigena po jedinici količine antitela. Specifične metode za merenje i izračunavanje takvih količina vezivanja opisane su u primerima ispod. U nekim realizacijama, količina vezivanja CTLA-4 u prisustvu jedinjenja koje sadrži adenozin je veća nego u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin. Alternativno, u drugoj realizaciji, količina vezivanja CTLA-4 u prisustvu visoke koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin je veća nego u prisustvu niske koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin. Na primer, razlika u količini vezivanja CTLA-4 može biti dva puta ili više, 3 puta ili više, 5 puta ili više, 10 puta ili više, 20 puta ili više, 30 puta ili više, 50 puta ili više, 100 puta ili više, 200 puta ili više, 300 puta ili više, 500 puta ili više, 1 x 10<3>puta ili više, 2 x 10<3>puta ili više, 3 x 10<3>puta ili više, 5 x 10<3>puta ili više, 1 x 10<4>puta ili više, 2 x 10<4>puta ili više, 3 x 10<4>puta ili više, 5 x 10<4>puta ili više, ili 1 x 10<5>puta ili više. Vrednost količine vezivanja CTLA-4 u prisustvu jedinjenja koje sadrži adenozin ili u prisustvu visoke koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin može biti, na primer, 0,01 ili više, 0,02 ili više, 0,03 ili više, 0,04 ili više, 0,05 ili više, 0,06 ili više, 0,07 ili više, 0,08 ili više, 0,09 ili više, 0,1 ili više, 0,2 ili više, 0,3 ili više, 0,4 ili više, 0,5 ili više, 0,6 ili više, 0,7 ili više, 0,8 ili više, 0,9 ili više, ili 1 ili više. Vrednost količine vezivanja CTLA-4 u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin ili u prisustvu niske koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin može biti na primer, 0,5 ili manje, 0,4 ili manje, 0,3 ili manje, 0,2 ili manje, 0,1 ili manje, 0,09 ili manje, 0,08 ili manje, 0,07 ili manje, 0,06 ili manje, 0,05 ili manje, 0,04 ili manje, 0,03 ili manje, 0,02 ili manje, 0,01 ili manje, 0,009 ili manje, 0,008 ili manje, 0,007 ili manje, 0,006 ili manje, 0,005 ili manje, 0,004 ili manje, 0,003 ili manje, 0,002 ili manje, ili 0,001 ili manje.
[0304] U nekim realizacijama, vrednosti KD, vrednosti kd, vrednosti količine vezivanja i slično opisano ovde mere se ili izračunavaju izvođenjem testa površinske plazmonske rezonancije na 25°C ili 37°C (videti, na primer, Primer 3 ovde).
[0306] Može se odabrati bilo koja koncentracija jedinjenja koje sadrži adenozin, sve dok se detektuje razlika u aktivnosti vezivanja anti-CTLA-4 antitela. U određenim realizacijama, visoka koncentracija može da obuhvati, na primer, 1 nM ili više od 1 nM, 3 nM ili više od 3 nM, 10 nM ili više od 10 nM, 30 nM ili više od 30 nM, 100 nM ili više od 100 nM, 300 nM ili više od 300 nM, 1 µM ili više od 1 µM, 3 µM ili više od 3 µM, 10 µM ili više od 10 µM, 30 µM ili više od 30 µM, 100 µM ili više od 100 µM, 300 µM ili više od 300 µM, 1 mM ili više od 1 mM, 3 mM ili više od 3 mM, 10 mM ili više od 10 mM, 30 mM ili više od 30 mM, 100 mM ili više od 100 mM, 300 mM ili veća od 300 mM, i 1 M ili veća od 1 M. Alternativno, visoka koncentracija ovde može biti dovoljna količina pri kojoj odgovarajuće anti-CTLA-4 antitelo pokazuje maksimalnu aktivnost vezivanja. U jednoj realizaciji, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM ili dovoljna količina pri kojoj odgovarajuće anti-CTLA-4 antitelo pokazuje maksimalnu aktivnost vezivanja može se odabrati kao visoka koncentracija ovde. U određenim realizacijama, niska koncentracija može da obuhvati, na primer, 1 mM ili niže od 1 mM, 300 µM ili niže od 300 µM, 100 µM ili niže od 100 µM, 30 µM ili niže od 30 µM, 10 µM ili niže od 10 µM, 3 µM ili niže od 3 µM, 1 µM ili niže od 1 µM, 300 nM ili niže od 300 nM, 100 nM ili niže od 100 nM, 30 nM ili niže od 30 nM, 10 nM ili niže od 10 nM, 3 nM ili niže od 3 nM, 1 nM ili niže od 1 nM, 300 pM ili niže od 300 pM, 100 pM ili niže od 100 pM, 30 pM ili niže od 30 pM, 10 pM ili niže od 10 pM, 3 pM ili niže od 3 pM i 1 pM ili niže od 1 pM. Alternativno, niska koncentracija ovde može biti koncentracija pri kojoj odgovarajuće anti-CTLA-4 antitelo pokazuje minimalnu aktivnost vezivanja. Slučaj gde je u suštini koncentracija nula (u odsustvu jedinjenja koje sadrži adenozin) takođe može biti izabran kao realizacija niske koncentracije. U jednoj realizaciji, 1 mM, 100 µM, 10 µM, 1 µM, koncentracija pri kojoj odgovarajuće anti-CTLA-4 antitelo pokazuje minimalnu aktivnost vezivanja ili odsustvo jedinjenja adenozina može biti izabrano kao niža koncentracija ovde. U drugoj realizaciji, sledeće vrednosti mogu biti izabrane kao odnos visoke koncentracije i niske koncentracije: na primer, 3 puta ili više, 10 puta ili više, 30 puta ili više, 100 puta ili više, 300 puta ili više, 1 x 10<3>puta ili više, 3 x 10<3>puta ili više, 1 x 10<4>puta ili više, 3 x 10<4>puta ili više, 1 x 10<5>puta ili više, 3 x 10<5>puta ili više, 1 x 10<6>puta ili više, 3 x 10<6>puta ili više, 1 x 10<7>puta ili više, 3 x 10<7>puta ili više, 1 x 10<8>puta ili više, 3 x 10<8>puta ili više, 1 x 10<9>puta ili više, 3 x 10<9>puta ili više, 1 x 10<10>puta ili više, 3 x 10<10>puta ili više, 1 x 10<11>puta ili više, 3 x 10<11>puta ili više, ili 1 x 10<12>puta ili više.
[0308] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska imaju aktivnost vezivanja i za jedinjenja koja sadrže adenozin. Količina vezivanja jedinjenja koje sadrži adenozin po jedinici količine anti-CTLA-4 antitela može se izračunati korišćenjem gore pomenute metode i koristiti kao aktivnost vezivanja antitela za jedinjenje koje sadrži adenozin. Specifične metode za merenje i izračunavanje takvih količina vezivanja opisane su u primerima ispod. Vrednost količine vezivanja jedinjenja koje sadrži adenozin po jedinici količine anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska može biti, na primer, 0,0001 ili više, 0,0002 ili više, 0,0003 ili više, 0,0004 ili više, 0,0005 ili više, 0,0006 ili više, 0,0007 ili više, 0,0008 ili više, 0,0009 ili više, 0,001 ili više, 0,002 ili više, 0,003 ili više, 0,004 ili više, 0,005 ili više, 0,006 ili više, 0,007 ili više, 0,008 ili više, 0,009 ili više, ili 0,01 ili više.
[0310] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska formiraju ternarni kompleks sa jedinjenjem koje sadrži adenozin i CTLA-4. U jednoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo se vezuje za jedinjenje koje sadrži adenozin preko CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca. U jednoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo ima motiv vezivanja za jedinjenje koje sadrži adenozin. Motiv vezivanja za jedinjenje koje sadrži adenozin može biti sastavljen, na primer, od najmanje jedne amino-kiseline prisutne na pozicijama 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b i 100c prema Kabat numeraciji. U daljoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo se vezuje za jedinjenje koje sadrži adenozin, na primer, preko najmanje jedne amino-kiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od pozicija 33, 52, 52a, 53, 56, 58, 95, 96, 100a, 100b i 100c prema Kabat numeraciji. U određenim realizacijama, anti-CTLA4 antitela opisana ovde imaju najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od Thr na poziciji 33, Ser na poziciji 52, Ser na poziciji 52a, Arg na poziciji 53, Tyr na poziciji 56, Tyr na poziciji 58, Tyr na poziciji 95, Gly na poziciji 96, Met na poziciji 100a, Leu na poziciji 100b i Trp na poziciji 100c, prema Kabat numeraciji. CTLA-4 se može dalje vezati za kompleks formiran vezivanjem anti-CTLA-4 antitela i jedinjenja koje sadrži adenozin. Štaviše, jedinjenje koje sadrži adenozin može biti prisutno na granici gde anti-CTLA-4 antitelo i CTLA-4 interaguju i može se vezati za oba. Tehnikama kao što je analiza kristalne strukture opisana u nastavku može se potvrditi da anti-CTLA-4 antitelo formira ternarni kompleks sa jedinjenjem koje sadrži adenozin i CTLA-4 (videti primere).
[0312] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska vezuju se za najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od amino-kiselina na poziciji 3 (Met), poziciji 33 (Glu), poziciji 35 (Arg), poziciji 53 (Thr), poziciji 97 (Glu), poziciji 99 (Met), poziciji 100 (Tyr), poziciji 101 (Pro), poziciji 102 (Pro), poziciji 103 (Pro), poziciji 104 (Tyr), poziciji 105 (Tyr) i poziciji 106 (Leu) humanog CTLA-4 (ekstracelularni domen; SEQ ID NO: 28). Ove aminokiseline mogu činiti epitop anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska. U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska vezuju se za region od amino-kiseline na poziciji 97 (Glu) do amino-kiseline na poziciji 106 (Leu) humanog CTLA-4 (ekstracelularni domen; SEQ ID NO: 28). U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska vezuju se za region od amino-kiseline na poziciji 99 (Met) do amino-kiseline na poziciji 106 (Leu) humanog CTLA-4 (ekstracelularni domen; SEQ ID NO: 28).
[0314] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska se takmiče sa ABAM004 (VH, SEQ ID NO: 10; VL, SEQ ID NO: 11; HVR-H1, SEQ ID NO: 100; HVR-H2, SEQ ID NO: 101; HVR-H3, SEQ ID NO: 102; HVR-L1, SEQ ID NO: 113; HVR-L2, SEQ ID NO: 114; HVR-L3, SEQ ID NO: 115) za vezivanje za CTLA-4. U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska se vezuju za isti epitop kao i ABAM004. Kada postoji višak anti-CTLA-4 antitela, vezivanje ABAM004 za CTLA-4 može se smanjiti, na primer, za 10% ili više, 15% ili više, 20% ili više, 25% ili više, 30% ili više, 35% ili više, 40% ili više, 45% ili više, 50% ili više, 55% ili više, 60% ili više, 65% ili više, 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, ili 95% ili više. Ovde su dati primeri kompetitivnih testova.
[0315] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska pokazuju citotoksičnu aktivnost protiv ćelija koje eksprimuju CTLA-4. Kada se CTLA-4 eksprimuje na površini ciljne ćelije i anti-CTLA-4 antitelo se veže za njega, ćelija može biti oštećena. Oštećenje ćelije može biti uzrokovano efektorskim ćelijama vezanim za antitelo, kao što je aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i aktivnost ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP), ili može biti uzrokovano komplementima vezanim za antitelo, kao što je aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Alternativno, oštećenje može biti uzrokovano citotoksičnim agensom (npr. radioizotop ili hemoterapijsko sredstvo) konjugovano sa antitelom, kao što je imunokonjugat. Citotoksičnost ovde može uključivati efekte indukovanja ćelijske smrti, suzbijanja ćelijske proliferacije i oštećenja ćelijskih funkcija. Kada je anti-CTLA-4 antitelo prisutno u dovoljnoj količini, može izazvati oštećenje, na primer, 10% ili više, 15% ili više, 20% ili više, 25% ili više, 30% ili više, 35% ili više, 40% ili više, 45% ili više, 50% ili više, 55% ili više, 60% ili više, 65% ili više, 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više ili 95% ili više ćelija koje eksprimuju CTLA-4. Merenje takve citotoksične aktivnosti može se izvršiti upoređujući je sa merenjem u odsustvu antitela ili u prisustvu negativnog kontrolnog antitela. Ovde su dati primeri testova citotoksičnosti.
[0317] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska pokazuju neutrališuću aktivnost protiv CTLA-4. Poznato je da CTLA-4 funkcioniše interakcijom sa svojim ligandom, CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2). U određenim realizacijama, anti-CTLA-4 antitela inhibiraju interakciju CTLA-4 sa CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2). Kada je anti-CTLA-4 antitelo prisutno u dovoljnoj količini, ono može inhibirati interakciju CTLA-4 sa CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2) za, na primer, 10% ili više, 15% ili više, 20% ili više, 25% ili više, 30% ili više, 35% ili više, 40% ili više, 45% ili više, 50% ili više, 55% ili više, 60% ili više, 65% ili više, 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, ili 95% ili više. Merenje takve inhibitorne aktivnosti može se izvršiti upoređujući je sa merenjem u odsustvu antitela ili u prisustvu negativnog kontrolnog antitela. Ovde su date specifične metode merenja neutralizujuće aktivnosti.
[0319] U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska vezuju se za CTLA-4 izveden iz više životinjskih vrsta. Primeri životinjskih vrsta mogu uključivati sisare, na primer, ljude, majmune, miševe, pacove, hrčke, zamorce, zečeve, svinje, goveda, koze, konje, ovce, kamile, pse i mačke. U određenim realizacijama, anti-CTLA-4 antitela se vezuju za CTLA-4 izveden od ljudi i neljudi (npr. majmuni, miševi i pacovi). Sekvenca amino-kiselina humanog CTLA-4 je prikazana u SEQ ID NO: 214, sekvenca amino-kiselina majmunskog CTLA-4 je prikazana u SEQ ID NO: 247, a sekvenca amino-kiselina mišjeg CTLA-4 je prikazana u SEQ ID NO: 248. Sekvence aminokiseline CTLA-4 izvedenog iz drugih životinjskih vrsta takođe se mogu na odgovarajući način odrediti metodama poznatim stručnjacima u tehnici.
[0321] U određenim realizacijama, jedinjenja koja sadrže adenozin u predmetnom pronalasku mogu da uključuju, na primer, adenozin (ADO), adenozin trifosfat (ATP), adenozin difosfat (ADP), adenozin monofosfat (AMP), ciklični adenozin monofosfat (cAMP), dezoksiadenozin (dADO), dezoksiadenozin trifosfat (dATP), dezoksiadenozin difosfat (dADP), dezoksiadenozin monofosfat (dAMP) i adenozin (γ-tio) trifosfat (ATPγS).
[0323] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 224; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 225. Antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 224; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 225.
[0325] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 227; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 228. Antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 226; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 227; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 228.
[0327] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 223, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 224, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 225; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 226, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 227, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 228.
[0328] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 223; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 224; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 225; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 226; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 227; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 228.
[0330] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 101; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 101; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0332] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 114; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 114; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115.
[0333] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 100, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 101, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 113, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 114, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115.
[0335] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 101; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 113; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 114; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 115.
[0337] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 104; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 104; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0339] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 116; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115.
[0341] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 104, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 116, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115.
[0343] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 100; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 104; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 116; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 115.
[0344] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 106; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 106; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0346] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0347] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 105, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 106, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 122, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0349] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 105; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 106; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0351] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 108; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 108; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0352] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 153. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 121; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 123; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 153.
[0353] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 108, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 121, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 123, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 153.
[0355] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 108; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 121; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 123; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 153.
[0356] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 110; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 110; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0357] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0358] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 110, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 122, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0360] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 110; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 122; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0362] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 112; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0363] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0364] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 128, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0366] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0367] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 111; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152.
[0368] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0369] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 128, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0371] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 128; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0372] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 112; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0373] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0374] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 129, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0375] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 112; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0376] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 111; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152.
[0377] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0378] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 129, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0380] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 111; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 152; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 129; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0381] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 109; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 109; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102.
[0383] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0385] U drugom aspektu, antitelo ovog otkrića sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VH HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 107, (ii) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 109, i (iii) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 130, (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117, i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133.
[0387] Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 107; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 109; (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 102; (d) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 130; (e) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (f) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina izabrana iz SEQ ID NO: 133.
[0389] U određenim ilustrativnim realizacijama, bilo koja jedna ili više amino-kiselina anti-CTLA-4 antitela kao što je gore navedeno supstituisane su na sledećim HVR pozicijama:
[0390] ─ u HVR-H1 (SEQ ID NO: 223): pozicija 2
[0391] ─ u HVR-H2 (SEQ ID NO: 224): pozicije 4, 5, 7, 13 i 16
[0392] ─ u HVR-H3 (SEQ ID NO: 225): pozicija 3
[0393] ─ u HVR-L1 (SEQ ID NO: 226): pozicije 1, 3, 6, 11, 12 i 14
[0394] ─ u HVR-L2 (SEQ ID NO: 227): pozicije 1, 3, 4 i 7
[0395] ─ u HVR-L3 (SEQ ID NO: 228): pozicije 1 i 10
[0397] U određenim ilustrativnim realizacijama, supstitucije su konzervativne supstitucije, kao što je ovde dato. U određenim realizacijama, jedna ili više sledećih supstitucija mogu se napraviti u bilo kojoj kombinaciji:
[0399] ─ u HVR-H1 (SEQ ID NO: 100): H2A, R, ili K
[0400] ─ u HVR-H2 (SEQ ID NO: 101): S4T; R5Q; G7H; D13E ili R; K16R
[0401] ─ u HVR-H3 (SEQ ID NO: 102): K3A
[0402] ─ u HVR-L1 (SEQ ID NO: 113): T1D, Q, ili E; T3P; D6G; N11T; Y12W; S14H
[0403] ─ u HVR-L2 (SEQ ID NO: 114): E1F ili Y; S3I; K4S; S7E ili K
[0404] ─ u HVR-L3 (SEQ ID NO: 115): S1Q; M10T
[0406] Sve moguće kombinacije gore navedenih supstitucija obuhvaćene su konsenzusnim sekvencama SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 227 i 228 za HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, redom.
[0408] U bilo kojoj od gorenavedenih realizacija, anti-CTLA-4 antitelo je humanizovano. U jednoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde sadrži HVR kao u bilo kojoj od gorenavedenih realizacija, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski okvir ili humani konsenzusni okvir. U drugoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo sadrži HVR kao u bilo kojoj od gorenavedenih realizacija, i dalje sadrži VH ili VL koji sadrže FR sekvencu. U daljoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo sadrži FR sekvencu(e) varijabilnog domena teškog lanca i/ili lakog lanca na sledeći način: za varijabilni domen teškog lanca, FR1 sadrži bilo koju od sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 229 do 232, FR2 sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 233, FR3 sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 234, a FR4 sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 235; i za varijabilni domen lakog lanca, FR1 obuhvata bilo koju od sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 236 do 238, FR2 obuhvata bilo koju od sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 240 do 241, FR3 obuhvata bilo koju od sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 242 do 244, i FR4 obuhvata bilo koju od sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 245 do 246.
[0410] U drugom aspektu, anti-CTLA-4 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa amino-kiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10. U određenim realizacijama, VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CTLA-4. U određenim realizacijama, ukupno 1 do 10, do 11, do 12, do 13, do 14 ili do 15 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili obrisano u SEQ ID NO: 10. U određenim realizacijama, supstitucije, umetci ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR. (tj. u FR). Ovde je stavljeno na uvid javnosti anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 10, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnoj realizaciji, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 100, (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 101, i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 102. Posttranslacione modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, modifikaciju glutamina ili glutamata na N-terminusu teškog ili lakog lanca u piroglutaminsku kiselinu putem piroglutamilacije.
[0412] U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-CTLA-4 antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa amino-kiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11. U određenim realizacijama, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CTLA-4. U određenim realizacijama, ukupno 1 do 10, do 11, do 12, do 13, do 14 ili do 15 amino-kiselina je supstituisano, umetnuto i/ili obrisano u SEQ ID NO: 11. U određenim realizacijama, supstitucije, umetci ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR. (tj. u FR). Ovde je stavljeno na uvid javnosti anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 11, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. Ovde je stavljen na uvid javnosti VL koji sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 113; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 114; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 115. Posttranslacione modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, modifikaciju glutamina ili glutamata na N-terminusu teškog ili lakog lanca u piroglutaminsku kiselinu putem piroglutamilacije.
[0414] U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-CTLA-4 antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence sa amino-kiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 149. U određenim realizacijama, VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za CTLA-4. U određenim realizacijama, ukupno 1 do 10, do 11, do 12, do 13, do 14 ili do 15 amino-kiselina je supstituisano, umetnuto i/ili obrisano u SEQ ID NO: 149. U određenim realizacijama, supstitucije, umetci ili delecije se javljaju u regionima izvan HVR. (tj. u FR). Ovde je stavljeno na uvid javnosti anti-CTLA-4 antitelo koje sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 149, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnoj realizaciji, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 130; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 117; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 133. Posttranslacione modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, modifikaciju glutamina ili glutamata na N-terminusu teškog ili lakog lanca u piroglutaminsku kiselinu putem piroglutamilacije.
[0416] U drugom aspektu, ovde je stavljeno na uvid javnosti anti-CTLA-4 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH kao u bilo kojoj od gorenavedenih realizacija i VL kao u bilo kojoj od gorenavedenih realizacija. Ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 11, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Ovde je stavljeno na uvid javnosti ilustrativno antitelo koje sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 98 i SEQ ID NO: 99, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Antitelo pronalaska sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 83 i SEQ ID NO: 97, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 86 i SEQ ID NO: 134, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska obuhvata VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 136 i SEQ ID NO: 95, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska obuhvata VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 140 i SEQ ID NO: 146, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska obuhvata VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 141 i SEQ ID NO: 146, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska obuhvata VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 140 i SEQ ID NO: 147, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo pronalaska obuhvata VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 141 i SEQ ID NO: 147, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Opisano je ilustrativno antitelo koje sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 136 i SEQ ID NO: 149, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U daljem aspektu, ovde je stavljeno na uvid javnosti heteromerno anti-CTLA-4 antitelo, pri čemu antitelo sadrži najmanje dva različita varijabilna regiona izabrana iz varijabilnih regiona koji sadrže VH i VL sekvence date gore. Antitelo prema pronalasku sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 140 i SEQ ID NO: 146, redom, i VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 141 i SEQ ID NO: 146, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Alternativno antitelo prema pronalasku sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 140 i SEQ ID NO: 147, redom, i VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 141 i SEQ ID NO: 147, redom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. Posttranslacione modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, modifikaciju glutamina ili glutamata na N-terminusu teškog ili lakog lanca u piroglutaminsku kiselinu putem piroglutamilacije.
[0418] Kada je amino-kiselina na N-terminusu teškog lanca ili lakog lanca anti-CTLA-4 antitela koje je ovde dato glutamin, ova amino-kiselina može biti zamenjena glutaminom. Kada je amino-kiselina na N-terminusu teškog lanca ili lakog lanca anti-CTLA-4 antitela koje je ovde dato glutamat, ova amino-kiselina može biti zamenjena glutaminom.
[0420] U daljem aspektu, ovde je stavljeno na uvid javnosti antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-CTLA-4 antitelo koje je ovde dato. Na primer, u određenim realizacijama, stavljeno je na uvid javnosti antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i bilo koje od antitela navedenih u Tabeli 4, Tabeli 9, Tabeli 14 i Tabeli 19. U određenim realizacijama, stavljeno je na uvid javnosti je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta CTLA-4 koji sadrži najmanje jednu amino-kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od amino-kiselina na poziciji 3 (Met), poziciji 33 (Glu), poziciji 35 (Arg), poziciji 53 (Thr), poziciji 97 (Glu), poziciji 99 (Met), poziciji 100 (Tyr), poziciji 101 (Pro), poziciji 102 (Pro), poziciji 103 (Pro), poziciji 104 (Tyr), poziciji 105 (Tyr) i poziciji 106 (Leu) SEQ ID NO: 28. Stavljeno je na uvid javnosti je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta CTLA-4 koji se sastoji od amino-kiselina od pozicije 97 (Glu) do pozicije 106. (Leu) SEQ ID NO: 28. Stavljeno je na uvid javnosti je antitelo koje se vezuje za epitop unutar fragmenta CTLA-4 koji se sastoji od amino-kiselina od pozicije 99 (Met) do pozicije 106 (Leu) SEQ ID NO: 28.
[0422] U daljem aspektu, anti-CTLA-4 antitelo prema bilo kojoj od gorenavedenih realizacija je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednoj realizaciji, anti-CTLA-4 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab', scFv, dijabodi ili F(ab')<2>fragment. U drugoj realizaciji, antitelo je antitelo pune dužine, npr. intaktno IgG1 antitelo, intaktno IgG4 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano.
[0424] U daljem aspektu, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska sadrže Fc region. U daljem aspektu, anti-CTLA-4 antitela predmetnog pronalaska sadrže konstantne regione. Konstantni regioni mogu biti konstantni regioni teškog lanca (uključujući Fc regione), konstantni regioni lakog lanca ili oba. U nekim realizacijama, Fc region je region nativne sekvence. Primeri konstantnih regiona teškog lanca izvedeni iz nativnih antitela mogu uključivati, na primer, konstantne regione teškog lanca kao što su humani IgG1 (SEQ ID NO: 249), humani IgG2 (SEQ ID NO: 250), humani IgG3 (SEQ ID NO: 251) i humani IgG4 (SEQ ID NO: 252). Štaviše, drugi primerni konstantni regioni teškog lanca mogu uključivati konstantne regione teškog lanca SEQ ID NOs: 82 i 158. Primerni konstantni regioni lakog lanca izvedeni iz prirodnih antitela mogu uključivati, na primer, konstantne regione lakog lanca kao što su humani κ lanac (SEQ ID NOs: 33, 63 i 159) i humani λ lanac (SEQ ID NOs: 53 i 87).
[0426] U drugoj realizaciji, Fc region je varijantni Fc region proizvedena dodavanjem amino-kiselinskih promena Fc regionu nativne sekvence. U određenim realizacijama, varijantni Fc region ima poboljšanu aktivnost vezivanja za najmanje jedan Fcγ receptor izabran iz grupe koja se sastoji od FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb i FcγRIIIa, u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence. U daljim realizacijama, varijantni Fc region ima poboljšanu aktivnost vezivanja za FcγRIIa i FcγRIIIa u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence. Primeri konstantnih regiona teškog lanca koji sadrže takav varijantni Fc region uključuju, na primer, konstantne regione teškog lanca navedene u tabelama 26 do 30 i konstantne regione teškog lanca SEQ ID NOs: 31, 32, 41 do 46, 65, 66, 81, 207, 239, 253 do 271, 276, 277 i 278.
[0428] Fc region nativne sekvence je obično sastavljen kao homodimer koji se sastoji od dva identična polipeptidna lanca. U određenim realizacijama, varijantni Fc region može biti homodimer sastavljen od polipeptidnih lanaca sa istom sekvencom ili heterodimer sastavljen od polipeptidnih lanaca sa različitim sekvencama jedni od drugih. Slično tome, konstantni regioni teškog lanca koji čine Fc region mogu biti homodimer sastavljen od polipeptidnih lanaca sa istom sekvencom ili heterodimer sastavljen od polipeptidnih lanaca sa različitim sekvencama jedni od drugih. Primeri heteromernih konstantnih regiona teškog lanca uključuju, na primer, konstantne regione teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 31 i 32; konstantne regione teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 43 i 44; konstantne regione teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 45 i 46; konstantne regione teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 254 i 256; konstantne regione teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 257 i 258; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 259 i 260; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 261 i 263; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 262 i 264; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 265 i 267; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 266 i 268; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 269 i 270; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 271 i 81; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 65 i 66; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 239 i 207; konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 259 i 276; i konstantni regioni teškog lanca koji obuhvataju polipeptidne lance SEQ ID NO: 65 i 278.
[0430] U daljem aspektu, anti-CTLA-4 antitelo prema bilo kom od gorenavedenih primera i realizacija može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-7 ispod:
[0432] 1. Vezujuća aktivnost antitela
[0433] U određenim primerima, aktivnost vezivanja antitela datog ovde je konstanta disocijacije (KD) od 10 µM ili manje, 1 µM ili manje, 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0,1 nM ili manje, 0,01 nM ili manje, ili 0,001 nM ili manje. (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10-
[0434] <13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0436] Aktivnost vezivanja antitela meri se radioaktivno obeleženim testom vezivanja antigena (RIA). U jednom primeru, RIA se izvodi sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovim antigenom. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen meri se uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženog antigena, a zatim hvatanje vezanog antigena pločom obloženom anti-Fab antitelom (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999.).)). Da bi se utvrdili uslovi za test, višekomponentne ploče MICROTITER (registrovani zaštitni znak) (Thermo Scientific) su preko noći obložene sa 5 µg/ml antitela za hvatanje Fab (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirane sa 2% (w/v) goveđim serumskim albuminom u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U neadsorbentnoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigen se mešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res.57: 4593‑4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da se nastavi duže (npr. oko 65 sati) kako bi se osiguralo da se postigne ravnoteža. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja i ploča se ispira osam puta sa 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20 (registrovani zaštitni znak)) u PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 µl/ležište scintilanta (MICROSCINT-20™; Packard) se dodaje, a ploče se broje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20% maksimalnog vezivanja biraju se za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
[0438] U jednom primeru, aktivnost vezivanja antitela se meri pomoću testa hvatanja liganda koristeći test površinske plazmonske rezonancije kao princip merenja, na primer, sa BIACORE (registrovani zaštitni znak) T200 ili BIACORE (registrovani zaštitni znak) 4000 (GE Healthcare, Upsala, Švedska). Za rad uređaja koristi se BIACORE (registrovani zaštitni znak) kontrolni softver. U jednom primeru, komplet za amino kuplovanje (GE Healthcare, Upsala, Švedska) se koristi prema uputstvima dobavljača, a senzorski čip obložen karboksimetil dekstranom (GE Healthcare, Upsala, Švedska) je imobilizovan molekulom za hvatanje liganda, na primer, antimarker antitelom, anti-IgG antitelom i proteinom A. Molekul za hvatanje liganda se razblaži sa 10 mM rastvorom natrijum acetata pri odgovarajućoj pH vrednosti i ubrizgava se odgovarajućom brzinom protoka i vremenom ubrizgavanja. Test aktivnosti vezivanja se izvodi korišćenjem pufera koji sadrži 0,05% polisorbata 20 (takođe poznat kao TWEEN (registrovani zaštitni znak) -20) kao pufer za ispitivanje, pri brzini protoka od 10 do 30 µL/minut, i na temperaturi ispitivanja poželjno 25°C ili 37°C. Kada se test izvodi tako što se molekulu za hvatanje liganda dozvoljava da uhvati antitelo kao ligand, serijsko razblaženje antigena ili Fc receptora pripremljenog sa puferom za ispitivanje (analitom) se ubrizgava nakon što se ciljna količina antitela uhvati ubrizgavanjem antitela. Kada se test izvodi tako što se molekulu za hvatanje liganda dozvoljava da uhvati antigen ili Fc receptor kao ligand, serijsko razblaženje antitela pripremljenog sa puferom za ispitivanje (analitom) se ubrizgava nakon što se ciljna količina antigena ili Fc receptora uhvati ubrizgavanjem antigena ili Fc receptora.
[0440] U jednom primeru, rezultati analize se analiziraju korišćenjem BIACORE (registrovani zaštitni znak) softvera za evaluaciju. Kinetički parametri se izračunavaju istovremenim uklapanjem senzograma vezivanja i disocijacije korišćenjem modela vezivanja 1:1, a mogu se izračunati brzina vezivanja (kon ili ka), brzina disocijacije (koff ili kd) i ravnotežna konstanta disocijacije (KD). Kada je aktivnost vezivanja slaba, posebno kada je disocijacija brza i teško je izračunati kinetičke parametre, ravnotežna konstanta disocijacije (KD) može se izračunati korišćenjem modela stabilnog stanja. Kao još jedan parametar aktivnosti vezivanja, „količina vezivanja analita po jedinici količine liganda“ može se izračunati deljenjem količine vezivanja analita pri određenoj koncentraciji (RU) sa količinom zarobljenog liganda (RU).
[0442] 2. Fragmenti antitela
[0444] U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>, Fv i scFv fragmenti, kao i drugi fragmenti opisani u daljem tesktu. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003). Za pregled scFv fragmenata, videti, npr. Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185 i U.S. Patente br.
[0445] 5,571,894 i 5,587,458. Za diskusiju o Fab i F(ab')<2>fragmentima koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuju za receptor za spasavanje i imaju povećano in vivo vreme poluraspada, videti U.S. Patent br. 5,869,046.
[0447] Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Videte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su, takođe, opisana kod Hudson et al., Nat. Med.9: 129-134 (2003).
[0449] Jednodomenska antitela su fragmenti antitela koji obuhvataju ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim realizacijama, jednodomensko antitelo je humano jednodomensko antitelo (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).
[0451] Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteolitičku digestiju intaktnog antitela, kao i proizvodnju od strane rekombinantnih ćelija domaćina (npr. e. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
[0453] 3. Himerna i humanizovana antitela
[0455] U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je himerno antitelo. Određena himerna antitela su opisana, npr. u U.S. Patentu br.4,816,567 i and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851‑6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži varijabilni region koji nije humani (npr. varijabilni region izveden iz miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo sa „promenjenom klasom“ kod koga je klasa ili podklasa promenjena u odnosu na matično antitelo. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji vezuju antigen.
[0457] U određenim realizacijama, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Obično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta matičnog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, nrp. CDR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz nehumanog antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo će opciono, takođe, sadržati barem deo humanog konstantnog regiona. Neki FR ostaci u humanizovanom antitelu mogu biti supstituisani odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (npr. antitelo iz kojeg su izvedeni HVR ostaci), npr. da se obnovi ili poboljša specifičnost ili afinitet antitela.
[0459] Razmatraju se humanizovana antitela i postupci njihovog pravljenja, npr. u Almagro and Fransson, Front. Biosci.13: 1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent brs. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (opisuje kalemljenje regiona koji određuje specifičnost (SDR); Padlan, Mol. Immunol.28: 489-498 (1991) (opisuje „presvlačenje površine“); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (opisuje „FR mešanje“); i Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (opisuje pristup „vođenog izbora“ za FR mešanje).
[0461] Regioni humanog okvira koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: regione okvira odabrane korišćenjem postupka „najboljeg poklapanja“ (videti, npr. Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993)); regioni okvira izvedeni iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); and Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regioni okvira ili regioni okvira humane germinativne linije (videti, npr. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); i regioni okvira izvedeni iz skrininga FR biblioteka (videti, npr. Baca et al., J. Biol. Chem.272: 10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271: 22611-22618 (1996)).
[0463] 4. Humana antitela
[0465] U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je humano antitelo. Humana antitela mogu se proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici. Humana antitela su generalno opisana u Van Dijk and Van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-374 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).
[0467] Humana antitela mogu se pripremiti davanjem imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrahromozomalno ili nasumično integrisani u hromozome životinje. Kod takvih transgenih miševa, endogeni imunoglobulinski lokusi su generalno inaktivirani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Videti takođe, npr. U.S. Patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br. 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HuMab (registrovani zaštitni znak); U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE (registrovani zaštitni znak) i U.S. objava patenta br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VelociMouse (registrovani zaštitni znak)). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje generišu takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
[0469] Humana antitela se, takođe, mogu napraviti postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (videti, npr. ozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Generisana humana antitela preko tehnologija hibridoma humanih B ćelija su, takođe, opisana kod Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557‑3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br. 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih linija) i kod Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265‑268 (2006) (opisuje ljudsko-humane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927‑937 (2005) i u Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185‑191 (2005).
[0471] Humana antitela se, takođe, mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka faga izvedenih iz ljudi. Takve sekvence varijabilnog domena se zatim mogu kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za selekciju humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u daljem tekstu.
[0473] 5. Antitela izvedena iz biblioteke
[0474] Antitela stavljena na uvid javnosti ovde mogu se izolovati skriningom kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u tehnici je poznat niz postupala za generisanje biblioteka fagnog prikaza i skrining takvih biblioteka za antitela koja poseduju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su razmatrane, npr. u Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178: 1‑37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) I dalje opisane u npr. McCafferty et al., Nature 348: 552‑554; Clackson et al., Nature 352: 624‑628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581‑597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161‑175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299‑310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073‑1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467‑12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1‑2):119‑132 (2004).
[0475] U određenim posutpcima prikazivanja faga, repertoari VH i VL gena se odvojeno kloniraju polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) i nasumično rekombinuju u fagnim bibliotekama, koje se zatim mogu skrinirati na fage koji vezuju antigen, kao što je opisano Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433‑455 (1994). Fagi obično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora pružaju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od čoveka) da bi se obezbedio jedinstveni izvor antitela na širok spektar nesopstvenih, kao i sopstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kako je opisano od strane Griffiths et al., EMBO J, 12: 725‑734 (1993). Konačno, naivne biblioteke se, takođe, mogu napraviti sintetički kloniranjem nepreuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže slučajnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređenja in vitro, kako su opisali Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381‑388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br. 5,750,373, i US objave patenata br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
[0476] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
[0478] 6. Multispecifična antitela
[0479] U određenim realizacijama, antitelo opisano ovde je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim realizacijama, jedna od specifičnosti vezivanja je za CTLA-4, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim realizacijama, bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa CTLA-4. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimuju CTLA-4. Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela.
[0481] Tehnike za pravljenje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva para teškog i lakog lanca imunoglobulina koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, and Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), i inženjering „knob-in-hole“ (videti, npr. U.S. Patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu se takođe napraviti inženjeringom elektrostatičkih efekata upravljanja za stvaranje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent br.4,676,980 i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); korišćenje leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti, npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547‑1553 (1992)); korišćenje „diatelo“ tehnologije za pravljenje bispecifičnih fragmenata antitela (videti, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444‑6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (scFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); i pripremu trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr. u Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
[0483] Konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta za vezivanje antigena, uključujući „antitela hobotnice“, takođe su ovde uključena (videti, npr. US 2006/0025576A1).
[0485] Antitelo ili fragment ovde, takođe, uključuje „dvostruko delujući Fab“ ili „DAF“ koji sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za CTLA-4, kao i za drugi, različiti antigen (videti, US 2008/0069820, na primer).
[0487] 7. Varijante antitela
[0489] U određenim primerima, razmatraju se varijante sekvence amino-kiseline antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante sekvence amino-kiseline antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar sekvence aminokiseline antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može se napraviti da bi se dobila konačna konstrukcija, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje željene karakteristike, npr. vezivanje antigena.
[0491] a) Varijante supstitucije, umetanja i brisanja
[0493] U određenim primerima, ovde su opisane varijante antitela koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu mogu uključivati HVR i FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „preferirane supstitucije“. Suštinskije promene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primerne supstitucije“, i kao što je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama bočnih lanaca amino-kiselina. Supstitucije amino-kiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa, a proizvodi se mogu testirati na željenu aktivnost. npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.
[0495] [Tabela 1]
[0497]
[0498]
[0500] Amino-kiseline se mogu klasifikovati u grupe prema njihovim zajedničkim svojstvima bočnih lanca:
[0502] (1) Hidrofobne: norleucin, metionin (Met), alanin (Ala), valin (Val), leucin (Leu) i izoleucin (Ile);
[0503] (2) Neutralne i hidrofilne: cistein (Cys), serin (Ser), treonin (Thr), asparagin (Asn) i glutamin (Gln);
[0504] (3) Kiselie aspartat (Asp) i glutamat (Glu);
[0505] (4) Osnovne: histidin (His), lizin (Lys) i arginin (Arg);
[0506] (5) Ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: glicin (Gly) i prolin (Pro); i
[0507] (6) Aromatične: triptofan (Trp), tirozin (Tyr) i fenilalanin (Phe).
[0509] Nekonzervativna supstitucija se odnosi na zamenu člana jedne od ovih klasa članom druge klase.
[0510] Jedna vrsta supstitucione varijante podrazumeva supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuća varijanta(e) odabrana za dalja istraživanja imaće modifikacije (npr. poboljšanja) određenih bioloških svojstava (npr. povećan afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će u suštini zadržati određena biološka svojstva matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je antitelo sa zrelim afinitetom, koje se može pogodno generisati, npr. koristeći tehnike afinitetnog sazrevanja zasnovane na fagnom prikazu, kao što su one opisane ovde. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani i varijantna antitela su prikazana na fagu i skrinirana na određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
[0512] Izmene (npr. supstitucije) mogu se vršiti u HVR, npr. da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu se napraviti u „vrućim tačkama“ HVR tj. ostacima kodiranim kodonima koji podležu mutacijama sa visokom frekvencijom tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179‑196 (2008)), i/ili ostacima koji dolaze u kontakt sa antigenom, pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Opisano je sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnom selekcijom iz sekundarnih biblioteka, npr. u Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178: 1‑37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim realizacijama afinitetnog sazrevanja, raznolikost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje bilo kojom od različitih metoda (npr. PCR sklona greškama, mešanje lanca ili mutageneza usmerena oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim skrinira da bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje HVR-usmerene pristupe, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr.4-6 ostaci u datom trenutku) randomizovano. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. korišćenjem mutageneze ili modeliranja skeniranja alaninom. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
[0514] Supstitucije, insercije ili delecije mogu se javiti unutar jednog ili više HVR sve dok takve promene značajno ne smanjuju sposobnost antitela da se veže za antigen. Na primer, konzervativne promene (npr. konzervativne supstitucije kao što je ovde dato) koje značajno ne smanjuju afinitet vezivanja mogu se napraviti u HVR. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji kontaktiraju sa antigenom u HVR. U određenim realizacijama ilustrativnih varijanti VH i VL sekvenci datih gore, svaki HVR je ili nepromenjen ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri amino-kiselinske supstitucije.
[0515] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“, kako je opisano od strane Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081‑1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom amino-kiselinom (npr. alanin ili polialanin) da bi se utvrdilo da li je interakcija antitela sa antigenom pogođena. Dalje supstitucije mogu se uvesti na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo može se analizirati da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu skrinirati da bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0516] Insercije sekvence amino-kiseline uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencne insercije jedne ili više amino-kiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge insercijske varijante molekula antitela uključuju fuziju enzima (npr. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava poluživot antitela u plazmi do N- ili C-terminusa antitela.
[0518] b) Varijante glikozilacije
[0520] U određenim primerima, antitelo koje je ovde dato je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen u kojem je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili brisanje mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići promenom sekvence amino-kiselina tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0522] Tamo gde antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrat vezan za njega može biti izmenjen. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara obično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti, npr. Wright et al., TIBTECH 15: 26‑32 (1997). Oligosaharid može da sadrži različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezana za GlcNAc u „stablu“ dvoantenske oligosaharidne strukture. U nekim primerima, modifikacije oligosaharida u antitelu predmetnog pronalaska mogu se izvršiti kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0524] U jednom primeru, date su varijante antitela koje imaju ugljenohidratnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze unutar šećernog lanca na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne i strukture sa visokim sadržajem manoze) mereno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kao što je, na primer, opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi na oko pozicije 297 u Fc regionu (EU numeracija ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko /- 3 amino-kiseline uzvodno ili nizvodno od pozicije 297, tj. između pozicija 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu imati poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr. US objavu patenta US2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilirane“ ili „fukoznodeficijentne“ varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239‑1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije kojima nedostaje fukozilacija proteina (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249: 533‑545 (1986); US prijava patenta br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., posebno u Primeru 11), i ćelijske linije sa nokautom, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokautirane CHO ćelije (videti, npr. Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4): 680‑688 (2006); i WO 2003/085107).
[0526] Varijante antitela su dodatno snabdevene podeljenim oligosaharidima, npr. u kome je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela presečen pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Patent br.6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu imati poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0528] c) Varijante Fc regiona
[0530] U određenim primerima, jedna ili više modifikacija amino-kiselina mogu biti uvedene u Fc region antitela koje je ovde dato, čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijantni Fc region može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju amino-kiseline (npr. supstitucija) na jednoj ili više pozicija amino-kiselina.
[0531] Predmetni pronalazak razmatra varijantu antitela predmetnog pronalaska koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluživot antitela in vivo važan, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti da bi se potvrdilo smanjenje/smanjenje aktivnosti CDC i/ili ADCC. Na primer, testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) mogu se sprovesti da bi se osiguralo da antitelo nema vezivanje za FcγR (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimuju samo FcγRIII, dok monociti eksprimuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je sumirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457‑492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u U.S. Patent br.
[0532] 5,500,362 (vidi, npr. Hellstrom, I. et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83: 7059‑7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82: 1499‑1502 (1985); 5,821,337 (videte, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351‑1361 (1987)). Alternativno, mogu se koristiti postupci ispitivanja koji ne uključuju radioaktivnost (videti, na primer, ACT1™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, Kalifornija); i CytoTox 96 (registrovani zaštitni znak) neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, Vinskonsin). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodnih ubica (NK). Alternativno, ili dodatno, može se proceniti ADCC aktivnost molekula od interesa in vivo, npr. u životinjskom modelu kao što je onaj objavljen u Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95: 652‑656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu se, takođe, sprovesti da bi se potvrdilo da antitelo nije u stanju da se veže za C1q i stoga nema CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA za vezivanje C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101: 1045‑1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103: 2738‑2743 (2004)). Vezivanje FcRn-a i in vivo Određivanje klirensa/poluživota može se takođe izvršiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (videti, npr. Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol.18(12): 1759‑1769 (2006)).
[0534] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više amino-kiselinskih pozicija 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
[0535] Opisane su određene varijante antitela sa povećanim ili smanjenim vezivanjem za FcR (videti, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591‑6604 (2001)).
[0537] U određenim primerima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više amino-kiselinskih supstitucija koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
[0539] U nekim primerima, izmene se vrše u Fc regionu što rezultira izmenjenim (tj. bilo povećano ili smanjeno) vezivanje C1q i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), npr. kao što je opisano u US Patentu br.6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178‑4184 (2000).
[0541] Antitela sa produženim poluživotom i povećanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus ((Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976); and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), opisani su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koje povećavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434. npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
[0543] Videti, takođe, Duncan & Winter, Nature 322: 738-740 (1988); U.S. Patent No. 5,648,260; U.S. Patent No.5,624,821; i WO 94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona.
[0545] d) Varijante antitela konstruisanih cisteinom
[0547] U određenim primerima, može biti poželjno kreirati antitela sa cisteinskim inženjeringom, npr. „tioMAb“, u kojima je jedan ili više ostataka antitela supstituisano ostacima cisteina. U određenim primerima, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se time pozicioniraju na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi linkera-leka, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je dalje opisano ovde. Bilo koji jedan ili više sledećih ostataka mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabat numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela konstruisana cisteinom mogu se generisati kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
[0549] e) Derivati antitela
[0551] U određenim primerima, antitelo koje je ovde dato može biti dalje modifikovano da bi sadržalo dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrida, poliamino-kiseline (bilo homopolimere ili slučajne kopolimere) i dekstran ili poli(nvinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere polipropilen glikola, kopolimere polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
[0553] U drugom primeru, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinskog dela koji se mogu selektivno zagrejati izlaganjem zračenju. U jednom primeru, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničeno na, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj ćelije proksimalno neproteinskom delu antitela bivaju ubijene.
[0555] B. Rekombinantni postupci i kompozicije
[0557] Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr. kao što je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U jednoj realizaciji, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-CTLA-4 antitelo kako je definisano u patentnim zahtevima. Takva nukleinska kiselina može kodirati sekvencu amino-kiselina koja sadrži VL i/ili sekvencu aminokiselina koja sadrži VH antitela (npr. laki i/ili teški lanci antitela). Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo pronalaska. U daljoj realizaciji, jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljoj realizaciji, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu kako je definisano u patentnim zahtevima. U jednoj takvoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži (npr. je transformisan sa): (1) vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvenca amino-kiselina koja sadrži VL antitela i sekvenca amino-kiselina koja sadrži VH antitela, ili (2) prvim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvenca amino-kiselina koja sadrži VL antitela i drugim vektorom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira sekvenca amino-kiselina koja sadrži VH antitela. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp2/0 ćelija). U jednoj realizaciji, obezbeđen je postupak za pravljenje anti-CTLA-4 antitela kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je gore navedeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-CTLA-4 antitela, i opciono regenerisanje antitela iz ćelije domaćina (ili podloge za kulturu ćelija domaćina). Pronalazak obezbeđuje posutpak za proizvodnju antitela, kako je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina pronalaska tako da se antitelo proizvodi.
[0559] Za rekombinantnu proizvodnju anti-CTLA-4 antitela, nukleinske kiseline koja kodira antitelo, npr. kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina se može lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba (sondi) koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
[0561] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije opisane ovde. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakterijama, posebno kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu potrebne. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti, npr. U.S. Patente br.
[0562] 5,648,237, 5,789,199i 5,840,523 (Videti, takođe, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.
[0563] 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245‑254, gde se opisuje ekspresija fragmenata antitela u e. coli.). Nakon ekspresije, antitelo se može izolovati iz bakterijske ćelijske paste u rastvorljivoj frakciji i može se dalje prečistiti.
[0565] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljivice ili kvasac su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela, uključujući gljivice i sojeve kvasca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što rezultira proizvodnjom antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409‑1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech.24: 210‑215 (2006).
[0567] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju glikoziliranih antitela takođe su izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju biljne i insektane ćelije. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju spodoptera frugiperda ćelije.
[0569] Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patente br.5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 (koji opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
[0571] Ćelije kičmenjaka se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Na primer, ćelijske linije sisara koje su prilagođene za rast u suspenziji mogu biti korisne. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija sisara domaćina su linija CV1 bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija humanih embrionalnih bubrega (293 ili 293 ćelije kao što je opisano, npr. u Graham et al., J. Gen Virol.36: 59 (1977)); ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK); sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano, npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243‑251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije karcinoma grlića materice kod ljudi (HELA); ćelije bubrega pasa (MDCK); ćelije jetre pacova bivoljeg porekla (BRL 3A); ćelije pluća kod ljudi (W138); ćelije jetre kod ljudi (Hep G2); tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562); TRI ćelije, kao što je opisano, npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44‑68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije sisara domaćina uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 77: 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), str.255‑268 (2003).
[0572] Poliklonska antitela se poželjno dobijaju kod životinja višestrukim potkožnim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisno konjugovati relevantni antigen sa proteinom koji je imunogen kod vrste koja se imunizuje. npr. hemocijanin ključaonice, serumski albumin, goveđi tiroglobulin ili inhibitor sojinog tripsina korišćenjem bifunkcionalnog ili derivatizujućeg sredstva, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko ostataka cisteina), N-hidroksisukcinimid (preko ostataka lizina), glutaraldehid, jantarni anhidrid, SOCl<2>, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>su različite alkil grupe.
[0574] Životinje (obično sisari koji nisu ljudi) se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr.100 µg ili 5 µg proteina ili konjugata (za zečeve odnosno miševe) sa 3 zapremine Frojndovog kompletnog adjuvansa i ubrizgavanjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje se busteruju sa 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Frojndovom kompletnom adjuvansu potkožnom injekcijom na više mesta. Sedam do 14 dana kasnije, životinjama se uzima krv, a serum se testira na titar antitela. Životinje se busteruju dok se titar ne stabilizuje. Poželjno je da se životinja busteruje konjugatom istog antigena, ali konjugovanim sa drugim proteinom i/ili putem drugog reagensa za umrežavanje. Konjugati se, takođe, mogu pripremiti u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao proteinske fuzije. Takođe, agensi za agregaciju, kao što je stipsa, se pogodno koriste za pojačavanje imunog odgovora.
[0576] Monoklonska antitela se dobijaju iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili posttranslacionih modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Dakle, modifikator „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela kao da nije smeša diskretnih antitela.
[0577] Na primer, monoklonska antitela mogu biti napravljena korišćenjem hibridomske metode koju je prvi put opisao Kohler et al., Nature 256(5517): 495-497 (1975). U hibridomskoj metodi, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizuje se kao što je gore opisano da bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja se specifično vezuju za protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro.
[0578] Imunizacioni agens obično uključuje antigeni protein ili njegovu fuzionu varijantu. Generalno, koriste se ili periferni krvni limfociti (PBL) ako su potrebne ćelije humanog porekla, ili ćelije slezine ili limfnih čvorova ako su potrebni izvori sisara koji nisu ljudi. Limfociti se zatim fuziraju sa immortalizovanom ćelijskom linijom koristeći odgovarajući agens za fuziju, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala hibridomska ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), str.59‑103).
[0580] Imortalizovane (besmrtne) ćelijske linije su obično transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodarskog, goveđeg i humanog porekla. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene hibridomske ćelije se seju i gaje u odgovarajućoj podlozi za kultivaciju koja poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzovanih, matičnih ćelija mijeloma. Na primer, ako matičnih ćelija mijeloma nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), podloga za kultivaciju hibridoma će obično uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), što su supstance koje sprečavaju rast ćelija sa nedostatkom HGPRT.
[0582] Poželjne imortalizovane (besmrtne) ćelije mijeloma su one koje se efikasno spajaju, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, poželjne su linije mišjeg mijeloma, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miša dostupnih od Centra za distribuciju ćelija Instituta Salk, San Dijego, Kalifornija, SAD, i SP-2 ćelije (i njihovi derivati, npr. X63-Ag8-653) dostupan iz Američke kolekcije tipova kultura, Manasas, Virdžinija, SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma su, takođe, opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor et al., J. Immunol.133(6): 3001‑3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, str.51‑63 (1987)).
[0584] Podloga za kultivaciju u kojoj rastu hibridomske ćelije se testira na proizvodnju monoklonskih antitela protiv antigena. Poželjno je da se specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode hibridomske ćelije određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunološki test (RIA) ili enzimski imunosorbentni test (ELISA). Takve tehnike i testovi su poznati u tehnici. Na primer, afinitet vezivanja može se odrediti Skačardovom analizom iz Munson, Anal. Biochem.107(1): 220‑239 (1980).
[0586] Nakon što se identifikuju hibridomske ćelije koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi se mogu subklonirati postupcima ograničavajućeg razblaživanja i uzgajati standardnim metodama (Goding, supra). Pogodne podloge za kultivaciju za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 podlogu. Pored toga, hibridomske ćelije mogu biti uzgajane in vivo kao tumori kod sisara.
[0588] Monoklonska antitela koja luče subklonovi su na odgovarajući način odvojena od podloge za kultivaciju, ascitne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hidroksiapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0590] Antitela se mogu proizvesti imunizacijom odgovarajuće životinje domaćina protiv antigena. Antigen može biti polipeptid koji sadrži CTLA-4 pune dužine. Antigen može biti polipeptid koji sadrži rastvorljivi CTLA-4. Antigen može biti polipeptid koji sadrži region koji odgovara aminokiselinama od pozicije 97 (Glu) do pozicije 106 (Leu) humanog CTLA-4 (ekstracelularni domen, SEQ ID NO: 28). Antigen može biti polipeptid koji sadrži region koji odgovara amino-kiselinama od pozicije 99 (Met) do pozicije 106 (Leu) humanog CTLA-4 (ekstracelularni domen, SEQ ID NO: 28). Takođe su stavljena na uvid javnosti antitela proizvedena imunizacijom životinje protiv antigena. Antitela mogu uključivati bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u „Primernim anti-CTLA-4 antitelima“ iznad.
[0592] C. Analize
[0594] Anti-CTLA-4 antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, testirati ili okarakterisati po svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkim aktivnostima pomoću različitih testova poznatih u tehnici.
[0596] 1. Testovi vezivanja i drugi testovi
[0597] U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska se testira na svoju aktivnost vezivanja antigena, npr. poznatim postupcima kao što su ELISA, Western blot, test površinske plazmonske rezonancije, itd.
[0599] U drugom aspektu, kompetitivni testovi mogu se koristiti za identifikaciju antitela koje se takmiči sa anti-CTLA-4 antitelima opisanim ovde (na primer, anti-CTLA-4 antitela opisana u Tabeli 4, Tabeli 9, Tabeli 14 i Tabeli 19) za vezivanje za CTLA-4. U određenim primerima, ako takvo konkurentsko antitelo postoji prekomerno, vezivanje referentnog antitela za CTLA-4 je sprečeno (npr. smanjeno) najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili više. U nekim primerima, vezivanje je sprečeno najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili više. U određenim primerima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) koji se vezuje za anti-CTLA-4 antitela opisana ovde (na primer, anti-CTLA-4 antitela opisana u Tabeli 4, Tabeli 9, Tabeli 14 i Tabeli 19). Detaljni primeri metoda za mapiranje epitopa za koji se antitelo vezuju dati su u Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totova, Nju Džerzi).
[0601] U jednom primernom testu konkurencije, imobilizovani CTLA-4 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za CTLA-4 i drugo neobeleženo antitelo čija se sposobnost testira da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za CTLA-4. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani CTLA-4 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje prvog antitela za CTLA-4, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina oznake povezane sa imobilizovanim CTLA-4. Ako je količina oznake povezane sa imobilizovanim CTLA-4 značajno smanjena u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za CTLA-4. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Njujork).
[0603] 2. Testovi aktivnosti
[0605] U jednom aspektu, obezbeđeni su testovi za identifikaciju anti-CTLA-4 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, npr. inhibitorna aktivnost ćelijske proliferacije, citotoksična aktivnost (na primer, ADCC/CDC aktivnost i ADCP aktivnost), imunostimulatorna aktivnost i inhibitorna aktivnost CTLA-4. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.
[0607] Antitelo predmetnog pronalaska je testirano na takvu biološku aktivnost.
[0609] U određenim realizacijama, antitelo predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, testira se na njegovu sposobnost da inhibira rast ili proliferaciju ćelija in vitro. Testovi za inhibiciju rasta ili proliferacije ćelija su dobro poznati u tehnici. Određeni testovi za proliferaciju ćelija, ilustrovani testovima „ubijanja ćelija“ opisanim ovde, mere vitalnost ćelija. Jedan takav test je CellTiter-Glo™ Test luminescentne ćelijske vitalnosti, koji je komercijalno dostupan od kompanije Promega (Madison, Viskonsin). Taj test određuje broj vitalnih ćelija u kulturi na osnovu kvantifikacije prisutnog ATP, što je pokazatelj metabolički aktivnih ćelija. Videti Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth.160: 81‑88, US Pat. br.6602677. Test se može sprovesti u formatu sa 96 ili 384 ležišta, što ga čini pogodnim za automatizovani skrining visokog protoka (HTS). Videti Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6: 398-404. Postupak analize podrazumeva dodavanje jednog reagensa (CellTiter-Glo (registrovani zaštitni znak) direktno u kultivisane ćelije. Ovo rezultira lizom ćelija i generisanjem luminescentnog signala proizvedenog luciferaznom reakcijom. Luminescentni signal je proporcionalan količini prisutnog ATP, koja je direktno proporcionalna broju održivih ćelija prisutnih u kulturi. Podaci se mogu snimiti luminometrom ili CCD kamerom. Izlaz luminescencije se izražava kao relativne svetlosne jedinice (RLU).
[0611] Još jedan test za ćelijsku proliferaciju je „MTT“ test, kolorimetrijski test koji meri oksidaciju 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromida do formazana pomoću mitohondrijalne reduktaze. Kao i CellTiter-Glo™ test, ovaj test pokazuje broj metabolički aktivnih ćelija prisutnih u ćelijskoj kulturi. Videti, npr. Mosmann (1983) J. Immunol. Meth.65: 55‑63, i Zhang et al. (2005) Cancer Res.65: 3877‑3882.
[0613] Ćelije za upotrebu u bilo kom od gorenavedenih in vitro testova uključuju ćelije ili ćelijske linije koje prirodno eksprimuju CTLA-4 ili koje su inženjerski modifikovane da eksprimuju CTLA-4. Takve ćelije, takođe, uključuju ćelijske linije koje eksprimuju CTLA-4 i ćelijske linije koje normalno ne eksprimuju CTLA-4, ali su transfektovane nukleinskom kiselinom koja kodira CTLA-4.
[0614] U jednom aspektu, anti-CTLA-4 antitelo se testira na njegovu sposobnost da inhibira rast ili proliferaciju ćelija in vivo. U određenim primerima, anti-CTLA-4 antitelo se testira na njegovu sposobnost inhibiranja rasta tumora in vivo. In vivo modeli sistema, kao što su modeli ksenografta, mogu se koristiti za takvo testiranje. U jednom primernom sistemu ksenografta, ćelije humanog tumora se unose u odgovarajuće imunokompromitovanu životinju koja nije čovek, npr. atimični „goli“ miš. Antitelo predmetnog pronalaska može se primeniti na životinju. Meri se sposobnost antitela da inhibira ili smanji rast tumora. U određenim primerima gore navedenog sistema ksenografta, ćelije humanog tumora su ćelije tumora od humanog pacijenta. Takvi modeli ksenografta su komercijalno dostupni od Oncotest GmbH (Friberg, Nemačka). U određenim primerima, ćelije humanog tumora se unose u odgovarajuće imunokompromitovanu životinju koja nije čovek potkožnom injekcijom ili transplantacijom na odgovarajuće mesto, kao što je masno tkivo mlečne žlezde.
[0616] Razume se da se bilo koji od gorenavedenih testova može sprovesti korišćenjem imunokonjugata kao što je ovde opisano umesto ili pored anti-CTLA-4 antitela.
[0618] Tipičan test za merenje ADCC aktivnosti terapeutskog antitela zasniva se na testu oslobađanja<51>Cr i obuhvata sledeće korake: obeležavanje ciljnih ćelija sa [<51>Cr]Na<2>CrO<4>; opsonizacija ciljnih ćelija koje eksprimuju antigen na svojoj ćelijskoj površini pomoću antitela; kombinovanje opsonizovanih radioobeleženih ciljnih ćelija sa efektorskim ćelijama u odgovarajućem odnosu u mikrotitarskoj ploči u prisustvu ili odsustvu test antitela; inkubacija ćelijske smeše, poželjno od 16 do 18 sati, poželjno na 37°C; sakupljanje supernatanta; i analiza radioaktivnosti u uzorku supernatanta. Zatim se citotoksičnost test antitela određuje, na primer, sledećom jednačinom: specifična stopa citotoksičnosti (%) = (radioaktivnost u prisustvu antitela - radioaktivnost u odsustvu antitela) / (maksimalna radioaktivnost - radioaktivnost u odsustvu antitela) x 100. Grafik se može napraviti promenom odnosa ciljnih ćelija i efektorskih ćelija ili koncentracije antitela.
[0619] Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti test komplement-zavisne citotoksičnosti (CDC) kao što je opisano kod, na primer, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Ukratko, različite koncentracije polipeptidne varijante i humanog komplementa se razblažuju puferom. Ćelije koje eksprimuju antigen za koji se polipeptidna varijanta vezuje se razblažuju do gustine od oko 1 x 10<6>ćelija/ml. Smeša polipeptidne varijante, razblaženog humanog komplementa i ćelija koje eksprimuju antigen dodaje se na ploču sa 96 ležišta i ravnim dnom za kulturu tkiva i inkubira na 37°C i 5% CO<2>tokom 2 sata da bi se podstakla ćelijska liza posredovana komplementom. Zatim se u svako ležište doda 50 µl Alamar Blue (Accumed International) i inkubira na 37°C preko noći. Apsorbancija se meri pomoću fluorometra sa 96 ležišta sa ekscitacijom na 530 nm i emisijom na 590 nm. Rezultati su predstavljeni u relativnim jedinicama fluorescencije (RFU). Koncentracije uzorka mogu se izračunati iz standardne krive, a procenat aktivnosti u poređenju sa ne-varijantnim polipeptidom je prikazan za varijantu polipeptida od interesa.
[0621] Primer postupka ispitivanja ADCP aktivnosti može obuhvatiti sledeće: premazivanje ciljnih biočestica, kao što su e. coli obeleženo sa FITC (molekularne sonde) ili staphylococcus aureus-FITC, sa test antitelom; formiranje opsonizovanih čestica; dodavanje gore navedenih opsonizovanih čestica efektorskim ćelijama THP-1 (monocitna ćelijska linija, dostupna od ATCC) u odnosu 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 ili 100:1 da bi se indukovala fagocitoza posredovana FcγR; poželjno inkubacija ćelija i e. coli-FITC/antitelo na 37°C tokom 1,5 sati; nakon inkubacije, dodavanje tripan plavog u ćelije (poželjno na sobnoj temperaturi tokom dva do tri minuta) da bi se ugasila fluorescencija bakterija koje nisu inkorporirane u ćelije i koje su se pričvrstile za spoljašnju površinu ćelije; prebacivanje ćelija u FACS pufer (npr.0,1% BSA i 0,1% natrijum azida u PBS) da bi se testirala fluorescencija THP-1 ćelija korišćenjem FACS-a (npr. BD FACS Calibur). Da bi se testirao obim ADCP, kapija se poželjno postavlja na THP-1 ćelije i meri se srednji intenzitet fluorescencije. U najpoželjnijoj realizaciji, ADCP test se izvodi korišćenjem e. coli-FITC u medijumu (kontrola); e. coli-FITC i THP-1 ćelije (korišćene kao FcγR-nezavisna ADCP aktivnost); i e. coli-FITC, THP-1 ćelije i test antitelo (korišćeno kao FcγR-zavisna ADCP aktivnost).
[0623] Citotoksična aktivnost antitela obično uključuje vezivanje antitela za površinu ćelije. Da li je antigen eksprimovan na površini ciljne ćelije može se na odgovarajući način potvrditi metodama poznatim stručnjacima u tehnici, kao što je FACS.
[0625] Aktivacija imuniteta može se detektovati korišćenjem ćelijskih ili humoralnih imunih odgovora kao indikatora. Aktivacija imuniteta posebno uključuje povećan nivo ekspresije citokina (npr. IL-6, G-CSF, IL-12, TNFα i IFNγ) ili njihovih receptora, pospešivanje proliferacije imunih ćelija (npr.
[0626] B ćelije, T ćelije, NK ćelije, makrofagi i monociti), povišeno stanje aktivacije, povišene funkcije i pojačana citotoksična aktivnost. Posebno se aktivacija T ćelija može detektovati merenjem povišene ekspresije markera aktivacije kao što su CD25, CD69 i ICOS. Na primer, poznato je da pacijenti kojima je dato anti-CTLA-4 antitelo, ipilimumab, imaju povećan ICOS<+>CD4<+>T ćelije u perifernoj krvi nakon primene, i to se smatra efektom aktivacije sistemskog imunog stanja primenom anti-CTLA-4 antitela (Cancer Immunol. Res. (2013) 1(4): 229-234).
[0628] Aktivacija T ćelija zahteva ne samo stimulaciju putem antigenskog receptora (TCR), već i pomoćnu stimulaciju putem CD28. Kada se CD28 na površini T ćelije veže za B7-1 (CD80) ili B7-2 (CD86) na površini ćelije koja prezentuje antigen, pomoćni signal se prenosi do T ćelije, a zatim se T ćelija aktivira. S druge strane, CTLA-4 se eksprimuje na površini aktiviranih T ćelija. Pošto se CTLA-4 vezuje za CD80 i CD86 sa jačim afinitetom od CD28, on interaguje sa CD80 i CD86 preferirajući nego sa CD28, što rezultira supresijom aktivacije T ćelija.
[0630] Na osnovu takvog mehanizma delovanja, inhibitorna aktivnost protiv CTLA-4 može se meriti kao aktivnost inhibicije vezivanja CTLA-4 za CD80 ili CD86. U jednom primeru, test za merenje inhibitorne aktivnosti protiv CTLA-4 obuhvata sledeće korake: omogućavanje prečišćenom CTLA-4 proteinu da se veže za nosač kao što je mikrotitarska ploča ili magnetne perle; dodavanje test antitela i obeleženog rastvorljivog CD80 ili CD86; ispiranje nevezanih komponenti; i kvantifikacija vezanog obeleženog CD80 ili CD86. Da li test antitelo unakrsno reaguje sa CD28 ili ne može se potvrditi izvođenjem sličnog testa u kojem se CD28 koristi umesto CTLA-4. Štaviše, u drugom primeru, funkcionalni test koji detektuje aktivaciju T ćelija kao što je gore opisano takođe se može koristiti za merenje inhibitorne aktivnosti protiv CTLA-4. Na primer, kada se test antitelo koje ima inhibitornu aktivnost protiv CTLA-4 doda sistemu u kojem se aktivacija T ćelija meri stimulisanjem populacije T ćelija ćelijama koje eksprimuju CD80 ili CD86, aktivacija T ćelija se dodatno poboljšava.
[0632] D. Imunokonjugati
[0634] Ovde su, takođe, opisani imunokonjugati koji sadrže anti-CTLA-4 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih sredstava, kao što su hemoterapijska sredstva ili lekovi, sredstva za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
[0635] U jednom primeru, imunokonjugat je konjugat antitela i leka (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali ne ograničavajući se na, majtanzinoid (videti U.S. Patente br. 5,208,020, 5,416,064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin kao što su monometilauristatin, lekoviti delovi DE i DF (MMAE i MMAF) (videti U.S. Patente br.
[0636] 5,635,483 i 5,780,588 i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (videti U.S. Patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336‑3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res. 58: 2925‑2928 (1998)); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (videti Kratz et al., Current Med. Chem.
[0637] 13: 477‑523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358‑362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717‑721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829‑834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529‑1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.45: 4336‑4343 (2002); i U.S. Patent br.6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan kao što su docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
[0639] U drugom primeru, imunokonjugat sadrži antitelo kako je ovde opisano konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina A (od pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, aleurites fordii proteini, proteini diantina, phytolacca americana proteini (PAPI, PAPII i PAP-S), momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikoteceni.
[0641] U drugom primeru, imunokonjugat sadrži antitelo kako je ovde opisano, konjugovano sa radioaktivnim atomom da bi se formirao radiokonjugat. Za proizvodnju radiokonjugata dostupni su različiti radioaktivni izotopi. Primeri uključuju<211>At,<131>I,<125>I,<90>Y,
[0642] <186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<212>Pb i radioaktivni izotopi Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer Tc-99m ili<123>I, ili spinska oznaka za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetna rezonanca, MRI), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0643] Konjugati antitela i citotoksičnog sredstva mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za vezivanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može se pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helatnog sredstva za konjugaciju radionuklida sa antitelom. Videti WO 94/11026. Linker može biti „cepljivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020) se može koristiti.
[0645] Imunokonjugati ili ADC ovde izričito predviđaju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsnu vezu, uključujući, ali nisu ograničeni na, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. od Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., SAD).
[0647] E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detekciju
[0649] U određenim primerima, bilo koje od ovde navedenih anti-CTLA-4 antitela je korisno za detekciju prisustva CTLA-4 u biološkom uzorku. Izraz „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim primerima, biološki uzorak obuhvata ćeliju ili tkivo, kao što su serum, puna krv, plazma, uzorak biopsije, uzorak tkiva, ćelijska suspenzija, pljuvačka, sputum, oralna tečnost, cerebralna tečnost, amnionska tečnost, ascitna tečnost, mleko, kolostrum, mlečni sekret, limfna tečnost, urin, znoj, suzna tečnost, želudačni sok, sinovijalna tečnost, ascitna tečnost, očna tečnost i sluz.
[0650] U jednom primeru, dato je anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U daljem ilustrativnom aspektu, dat je postupak detekcije prisustva CTLA-4 u biološkom uzorku. Postupak obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-CTLA-4 antitelom kao što je ovde opisano pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-CTLA-4 antitela za CTLA-4, i detekciju da li se formira kompleks između anti-CTLA-4 antitela i CTLA-4. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom primeru, anti-CTLA-4 antitelo se koristi za odabir subjekata koji ispunjavaju uslove za terapiju anti-CTLA-4 antitelom, npr. gde je CTLA-4 biomarker za selekciju pacijenata.
[0652] Antitelo predmetnog pronalaska može se koristiti, na primer, za proveru statusa imunog odgovora i dijagnostikovanje disfunkcije imunog sistema.
[0654] U određenim primerima, data su obeležena anti-CTLA-4 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili grupe koje se direktno detektuju (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektron-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i grupe, kao što su enzimi ili ligandi, koje se indirektno detektuju, npr. putem enzimske reakcije ili molekularne interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H i<131>I, fluorofori kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svitaca i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br.
[0655] 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, betagalaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharidne oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, one spregnute sa enzimom koji koristi vodonik-peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spinske oznake, bakteriofagne oznake, stabilni slobodni radikali i slično.
[0657] F. Farmaceutske formulacije
[0659] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži antitelo pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske formulacije anti-CTLA-4 antitela kako je ovde opisano pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju, ali nisu ograničeni na: pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; amino-kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju intersticijalne agense za disperziju lekova kao što su rastvorljivi neutralno-aktivni hijaluronidazni glikoproteini (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 hijaluronidazni glikoproteini, kao što je rHuPH20 (HYLENEX (registrovani zaštitni znak), Baxter International, Inc.). Određeni primeri sHASEGP i postupci upotrebe, uključujući rHuPH20, opisani su u US objavama patenata br.
[0660] 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP je kombinovan sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza kao što su hondroitinaze.
[0662] Primerne formulacije liofilizovanih antitela opisane su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove poslednje formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
[0664] Ovde navedena formulacija može, takođe, da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kako je potrebno za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim dejstvima koja ne utiču negativno jedno na drugo. Takvi aktivni sastojci su na odgovarajući način prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
[0666] Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatinmikrokapsule i poli-(metilmetakrilatne) mikrokapsule, redom, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su opisane u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0668] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi ili mikrokapsule.
[0669] Formulacije koje treba koristiti za in vivo primenu su generalno sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0671] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u lečenju tumora koji je poželjno rak dojke ili rak jetre.
[0673] G. Terapeutske metode i kompozicije
[0675] Bilo koje od ovde datih anti-CTLA-4 antitela može se koristiti u terapeutskim metodama. Svaka referenca u opisu na postupke lečenja odnosi se na antitela, farmaceutske formulacije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog ili životinjskog tela terapijom ili za dijagnozu.
[0677] U jednom aspektu, obezbeđeno je anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je anti-CTLA-4 antitelo kako je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u lečenju tumora. U određenim realizacijama, obezbeđeno je anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U određenim realizacijama, ovo otkriće obezbeđuje anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u postupku lečenja osobe koja ima tumor, koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-CTLA-4 antitela. U jednom takvom primeru, postupak dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr. kao što je opisano u nastavku. U daljim realizacijama, stavljeno je na uvid javnosti anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u oštećenju ćelija. U određenim realizacijama, ovo otkriće obezbeđuje anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u postupku oštećenja ćelija kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-CTLA-4 antitela za oštećenje ćelija. U daljim realizacijama, ovo otkriće obezbeđuje anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u imunoaktivaciji. U određenim realizacijama, ovo otkriće obezbeđuje anti-CTLA-4 antitelo za upotrebu u postupku aktiviranja imuniteta kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-CTLA-4 antitela za aktiviranje imuniteta. „Pojedinac“ prema bilo kojoj od gore navedenih realizacija je poželjno čovek.
[0679] U nekim realizacijama, tumor je solidni tumor. Kod solidnog tumora, tumorske ćelije se obično razmnožavaju i formiraju populaciju, a tumorsko tkivo se uglavnom formira od ovih ćelija. Štaviše, tumorska tkiva u živim organizmima su često infiltrirana imunskim ćelijama kao što su limfociti, koji takođe čine deo tumorskih tkiva. U nekim realizacijama, tumorska tkiva su infiltrirana imunskim ćelijama, posebno regulatornim T (Treg) ćelijama. U jednoj realizaciji, oštećenje ćelija je izazvano ADCC aktivnošću, CDC aktivnošću ili ADCP aktivnošću. U jednoj realizaciji, ćelije koje eksprimuju CTLA-4 na svojoj ćelijskoj površini su oštećene. U daljoj realizaciji, ćelije koje treba oštetiti su Treg ćelije. U određenim realizacijama, Treg ćelije koje su se infiltrirale u tumorska tkiva su oštećene. U jednoj realizaciji, imunitet se aktivira oštećenjem Treg ćelija (imunosupresija Treg ćelijama je poništena). U daljim realizacijama, imunitet (posebno antitumorski imunitet) u tumorskim tkivima je aktiviran. U nekim realizacijama, aktivacija imuniteta je aktivacija T ćelija.
[0681] U daljim aspektima, stepen efekta kao leka koji proizvodi anti-CTLA-4 antitelo predmetnog pronalaska varira u zavisnosti od tkiva kod pojedinca. U određenim realizacijama, taj stepen efekta se menja u zavisnosti od koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin u tkivu. U daljim realizacijama, efekat se povećava u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin u poređenju sa tkivom sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin. Tkiva sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin uključuju, na primer, tumorska tkiva. Tkiva sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin uključuju, na primer, netumorska tkiva kao što su normalna tkiva. U nekim realizacijama, imunitet je jače aktiviran u tumorskom tkivu nego u netumorskom tkivu. Takve razlike u odgovoru ne moraju se primetiti za sve doze anti-CTLA-4 antitela, već se moraju primetiti samo za određeni raspon doza. U drugoj realizaciji, imunitet se aktivira pri nižoj dozi u tumorskom tkivu nego u netumorskom tkivu. Štaviše, u drugoj realizaciji, terapeutski efekat se primećuje pri nižoj dozi od one pri kojoj se primećuje neželjeni efekat. U određenim realizacijama, terapeutski efekat je izraz antitumorskog efekta (npr. regresija tumora i indukcija ćelijske smrti ili inhibicija rasta tumorskih ćelija), a neželjeni efekat je razvoj autoimune bolesti (uključujući oštećenje normalnih tkiva usled prekomernog imunog odgovora).
[0682] U daljem aspektu, stepen dejstva kao leka koji proizvodi anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde varira u zavisnosti od toga da li ima aktivnost vezivanja za CTLA-4 koja zavisi od jedinjenja koje sadrži adenozin (tj. menja se u skladu sa koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin). U nekim realizacijama, anti-CTLA-4 antitela opisana ovde su antitela čija se aktivnost vezivanja za CTLA-4 povećava kako se koncentracija jedinjenja koje sadrži adenozin povećava. U nekim realizacijama, kontrolno anti-CTLA-4 antitelo je antitelo koje nema aktivnost vezivanja za CTLA-4 koja zavisi od koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin. U određenim realizacijama, antitelo koje nema aktivnost vezivanja za CTLA-4 koja zavisi od koncentracije jedinjenja koje sadrži adenozin znači antitelo kod koje je razlika u aktivnosti vezivanja za CTLA-4 u prisustvu i u odsustvu jedinjenja, na primer, manja od dva puta, manja od 1,8 puta, manja od 1,5 puta, manja od 1,3 puta, manja od 1,2 puta ili manja od 1,1 puta. Poželjno je da anti-CTLA-4 antitelo predmetnog pronalaska i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo imaju aktivnost vezivanja CTLA-4 koja je suštinski ekvivalentna jedno drugom u prisustvu dovoljne količine jedinjenja koje sadrži adenozin.
[0684] U određenim aspektima, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo se razlikuju po efektu kao lek koji proizvodi svako antitelo. U određenim realizacijama, oni se razlikuju po efektu kao lek u tkivu sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin. Tkiva sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin uključuju, na primer, tkiva koja nisu tumorska, kao što su normalna tkiva. Anti-CTLA-4 antitela se takođe mogu obezbediti kao farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo. U nekim realizacijama, u tkivu sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde pokazuje nizak nivo aktivacije imuniteta u poređenju sa kontrolnim anti-CTLA-4 antitelom. U nekim realizacijama, u tkivu sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, doze anti-CTLA-4 antitela opisanog ovde potrebne za aktiviranje imuniteta su visoke u poređenju sa kontrolnim anti-CTLA-4 antitelom. U nekim realizacijama, u tkivu sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde ima nizak nivo neželjenih efekata u poređenju sa kontrolnim anti-CTLA-4 antitelom. U nekim realizacijama, u tkivu sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, doze anti-CTLA-4 antitela opisanog ovde pri kojima se primećuje neželjeni efekat su visoke u poređenju sa kontrolnim anti-CTLA-4 antitelom. Takve razlike u odgovoru ne moraju se primetiti u svim tkivima (npr. sva tkiva sa niskom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin), ali se moraju primetiti samo u nekim tkivima. U određenim realizacijama, neželjeni efekat je autoimuna bolest (uključujući oštećenje normalnih tkiva usled prekomernog imunog odgovora).
[0686] U određenim aspektima, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo proizvode suštinski ekvivalentan efekat kao lek. U određenim realizacijama, oni proizvode suštinski ekvivalentan efekat kao lek u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin. Tkiva sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin uključuju, na primer, tumorska tkiva. Anti-CTLA-4 antitela se, takođe, mogu obezbediti kao farmaceutske formulacije koje sadrže antitelo. U nekim realizacijama, u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo pokazuju suštinski ekvivalentan nivo aktivacije imuniteta. U nekim realizacijama, u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo su suštinski ekvivalentni u dozi potrebnoj za aktiviranje imuniteta. U nekim realizacijama, u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo imaju suštinski ekvivalentan nivo terapeutskog efekta. U nekim realizacijama, u tkivu sa visokom koncentracijom jedinjenja koje sadrži adenozin, anti-CTLA-4 antitelo opisano ovde i kontrolno anti-CTLA-4 antitelo su suštinski ekvivalentne u dozi pri kojoj se primećuje terapeutski efekat. U određenim realizacijama, terapeutski efekat je izraz antitumorskog efekta (npr. regresija tumora i indukcija ćelijske smrti ili inhibicija rasta tumorskih ćelija).
[0688] U određenim realizacijama, tumor je izabran iz grupe koja se sastoji od raka dojke i raka jetre.
[0689] U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje upotrebu anti-CTLA-4 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. Lek je namenjen za lečenje tumora. U daljoj realizaciji, lek je namenjen za upotrebu u postupku lečenja tumora koji obuhvata davanje pojedincu koji ima tumor efikasne količine leka. U jednom takvom primeru, postupak dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, npr. kao što je opisano u nastavku. U daljoj realizaciji, lek je za oštećenje ćelija. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u postupku oštećenja ćelija kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine leka za oštećenje ćelija. U daljoj realizaciji, lek je za aktiviranje imuniteta. U daljoj realizaciji, lek je za upotrebu u metodu aktiviranja imuniteta kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine leka za aktiviranje imuniteta. „Pojedinac“ prema bilo kojoj od gorenavedenih realizacija može biti čovek.
[0690] U daljem ilustrativnom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za lečenje tumora. U jednoj realizaciji, postupak obuhvata davanje pojedincu koji ima takav tumor efikasne količine anti-CTLA-4 antitela. U jednom takvom primeru, postupak dalje obuhvata davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva, kao što je opisano u nastavku. „Pojedinac“ prema bilo kojoj od gorenavedenih realizacija može biti čovek.
[0692] U daljem ilustrativnom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za oštećenje ćelija kod pojedinca. U jednoj realizaciji, postupak obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-CTLA-4 antitela za oštećenje ćelija. U daljem ilustrativnom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za aktiviranje imuniteta kod pojedinca. U jednoj realizaciji, postupak obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-CTLA-4 antitela za aktiviranje imuniteta. U jednoj realizaciji, „pojedinac“ je čovek.
[0694] U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-CTLA-4 antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gore navedenih terapeutskih metoda. U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od anti-CTLA-4 antitela datih ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska formulacija pronalaska sadrži antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju pronalaska za upotrebu u lečenju tumora. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju za upotrebu u oštećivanju ćelija. U jednoj realizaciji, obezbeđena je farmaceutska formulacija za upotrebu u aktiviranju imuniteta. Farmaceutska formulacija stavljena na uvid javnosti ovde može da sadrži bilo koje od anti-CTLA-4 antitela datih ovde i najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo. npr. kao što je opisano u nastavku.
[0696] U daljem aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za pripremu leka ili farmaceutske formulacije (npr. za upotrebu u bilo kojoj od gore pomenutih terapijskih metoda), koji obuhvataju mešanje bilo kog od ovde datih anti-CTLA-4 antitela sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U jednom primeru, postupak za pripremu leka ili farmaceutske formulacije dalje obuhvata dodavanje najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva leku ili farmaceutskoj formulaciji.
[0697] Antitela predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, mogu se koristiti sama ili u kombinaciji sa drugim sredstvima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, može se primenjivati zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapijskim sredstvom. U određenim realizacijama, dodatno terapijsko sredstvo je inhibitor imunološke kontrolne tačke, EGFR inhibitor, HER2 inhibitor ili hemoterapijsko sredstvo. Inhibitor imunološke kontrolne tačke može uključivati, na primer, anti-CTLA-4 inhibitor, anti-PD-1 inhibitor, anti-PD-L1 inhibitor, anti-PD-L2 inhibitor, anti-TIM-3 inhibitor, anti-LAG-3 inhibitor, anti-TIGIT inhibitor, anti-BTLA inhibitor i anti-VISTA inhibitor. Anti-CTLA-4 inhibitor može uključivati, na primer, ipilimumab i tremelimumab. Anti-PD-1 inhibitor može uključivati, na primer, nivolumab i pembrolizumab. Anti-PD-L1 inhibitor može uključivati, na primer, atezolizumab, durvalumab i avelumab. Anti-PD-L2 inhibitor može da uključuje, na primer, anti-PD-L2 inhibitorno antitelo. Anti-TIM-3 inhibitor može da uključuje, na primer, anti-TIM-3 inhibitorno antitelo. Anti-LAG-3 inhibitor može da uključuje, na primer, anti-LAG-3 inhibitorno antitelo. Anti-TIGIT inhibitor može da uključuje, na primer, anti-TIGIT inhibitorno antitelo. Anti-BTLA inhibitor može da uključuje, na primer, anti-BTLA inhibitorno antitelo. Anti-VISTA inhibitor može da uključuje, na primer, anti-VISTA inhibitorno antitelo. EGFR inhibitor može da uključuje, na primer, cetuksimab, panitumumab, nimuzumab, necitumumab i zalutumumab. HER2 inhibitor može da uključuje, na primer, trastuzumab, trastuzumab emtanzin i pertuzumab.
[0699] Takve kombinovane terapije navedene gore obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključena u istu ili odvojenu formulaciju) i odvojenu primenu, u kom slučaju, primena antitela predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, može se desiti pre, istovremeno i/ili nakon primene dodatnog terapeutskog sredstva ili sredstava. U jednom primeru, primena anti-CTLA-4 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju u roku od oko jednog meseca, ili u roku od oko jedne, dve ili tri nedelje, ili u roku od oko jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest dana od svakog. Antitela predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa radioterapijom.
[0701] Antitelo predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima (i bilo koji dodatni terapeutski agens), može se primeniti na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralnu, intrapulmonalnu i intranazalnu, i, ako je potrebno za lokalni tretman, intralezionsku primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili potkožnu primenu. Doziranje se može obaviti bilo kojim pogodnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenske ili potkožne injekcije, delimično u zavisnosti od toga da li je primena kratka ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja, uključujući, ali ne ograničavajući se na jednokratnu ili višestruku primenu tokom različitih vremenskih tačaka, bolus primenu i pulsnu infuziju.
[0703] Antitela predmetnog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, bila bi formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koje treba razmotriti u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto primene sredstva, način primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora biti, ali je opciono formulisano sa jednim ili više sredstava koja se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje dotičnog poremećaja. Efikasna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja i drugih faktora o kojima je gore bilo reči. Ova sredstva se generalno koriste u istim dozama i sa načinima primene kao što je ovde opisano, ili oko 1 do 99% doza opisanih ovde, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim putem koji je empirijski/klinički utvrđen kao odgovarajući.
[0705] Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih sredstava) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, kao i od diskrecionog prava lekara. Antitelo se pogodno primenjuje kod pacijenta odjednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0.1 mg/kg-10 mg/kg) antitela može biti početna kandidatska doza za davanje pacijentu, bilo da se, na primer, radi o jednoj ili više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. Jedna uobičajena dnevna doza može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje bi generalno bilo održivo dok se ne postigne željeno suzbijanje simptoma bolesti. Jedna primerna doza antitela bi bila u rasponu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Dakle, pacijentu se može davati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dva do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti početna veća udarna doza, nakon čega sledi jedna ili više nižih doza. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
[0707] Podrazumeva se da se bilo koja od gore navedenih formulacija ili terapijskih metoda može sprovesti korišćenjem imunokonjugata kao što je ovde opisano umesto ili pored anti-CTLA-4 antitela.
[0709] H. Proizvodi
[0711] U drugom ilustrativnom aspektu, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu gore opisanih poremećaja. Proizvod obuhvata kontejner i etiketu na njemu ili uputstvo za upotrebu povezano sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, epruvete, špriceve, kesice sa intravenskim rastvorom, itd. Kontejneri mogu biti napravljeni od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži kompoziciju koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probušiti iglom za hipodermičku injekciju). Najmanje jedan aktivni sastojak u kompoziciji je antitelo kako je ovde opisano. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuju da se kompozicija koristi za lečenje izabranog stanja. Štaviše, proizvod može da obuhvata (a) prvu posudu sa kompozicijom koja se u njoj nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo predmetnog pronalaska; i (b) drugu posudu sa kompozicijom koja se u njoj nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod može dalje da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da se kompozicije mogu koristiti za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferovani fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može da sadrži i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
[0713] Gorenavedeni proizvodi mogu da sadrže imunokonjugat predmetnog pronalaska umesto ili pored anti-CTLA-4 antitela.
[0714] < Antitela koja sadrže varijantni Fc region >
[0716] U jednom aspektu, obezbeđena su antitela koja sadrže varijantni Fc region. U nekim aspektima, antitela su Fc fuzioni proteini. U određenim realizacijama, varijantni Fc regioni sadrže najmanje jednu promenu amino-kiselinskih ostataka (npr. supstituciju) u poređenju sa odgovarajućom sekvencom u Fc regionu nativne sekvence ili referentne varijante sekvence (ovde se može zajednički nazivati „matičnim“ Fc regionom). Fc region nativne sekvence je obično sastavljen kao homodimer koji se sastoji od dva identična polipeptidna lanca. Promene amino-kiselina u varijantama Fc regiona u predmetnom pronalasku mogu se uvesti u jedan od dva polipeptidna lanca matičnog Fc regiona ili u oba polipeptidna lanca.
[0718] U nekim aspektima, obezbeđeni su varijantni Fc regioni čija je funkcija modifikovana u poređenju sa matičnim Fc regionom. U određenim aspektima, varijantni Fc regioni imaju poboljšanu aktivnost vezivanja za Fcγ receptor u poređenju sa matičnim Fc regionom. U određenim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu aktivnost vezivanja za najmanje jedan Fcγ receptor izabran iz grupe koja se sastoji od FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb i FcγRIIIa, u poređenju sa matičnim Fc regionom. U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu aktivnost vezivanja za FcγRIIa. U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu aktivnost vezivanja za FcγRIIIa. U daljim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu aktivnost vezivanja za FcγRIIa i FcγRIIIa.
[0720] U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 234, 235, 236, 298, 330, 332 i 334 prema EU numerisanju. Alternativno, promene amino-kiselina kao što su one opisane u WO 2013/002362 i WO 2014/104165 mogu se slično koristiti u predmetnom pronalasku.
[0722] U određenim realizacijama, aktivnost vezivanja matičnog Fc regiona i varijantnih Fc regiona može biti predstavljena KD (konstantom disocijacije) vrednošću. U jednoj realizaciji, vrednost odnosa [KD vrednost matičnog Fc regiona za FcγRIIa] / [KD vrednost varijante Fc regiona za FcγRIIa] je, na primer, 1,5 ili više, 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više, 5 ili više, 6 ili više, 7 ili više, 8 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 40 ili više, ili 50 ili više. U daljim realizacijama, FcγRIIa može biti FcγRIIa R ili FcγRIIa H, ili može biti oba. U jednoj realizaciji, vrednost odnosa [aktivnosti vezivanja matičnog Fc regiona za FcγRIIIa] / [aktivnosti vezivanja varijante Fc regiona za FcγRIIIa] je, na primer, 2 ili više, 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 50 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 300 ili više, 500 ili više, 1 x 10<3>ili više, 2 x 10<3>ili više, 3 x 10<3>ili više, ili 5 x 10<3>ili više. U daljim realizacijama, FcγRIIIa može biti FcγRIIIa F ili FcγRIIIa V, ili može biti oba.
[0724] U jednoj realizaciji, KD vrednosti varijantnih Fc regiona za FcγRIIa su, na primer, 1,0 x 10<-6>M ili manje, 5,0 x 10<-7>M ili manje, 3,0 x 10<-7>M ili manje, 2,0 x 10<-7>M ili manje, 1,0 x 10<-7>M ili manje, 5,0 x 10<-8>M ili manje, 3,0 x 10<-8>M ili manje, 2,0 x 10<-8>M ili manje, 1,0 x 10<-8>M ili manje, 5,0 x 10<-9>M ili manje, 3,0 x 10<-9>M ili manje, 2,0 x 10<-9>M ili manje, ili 1,0 x 10<-9>M ili manje. U daljim realizacijama, FcγRIIa može biti FcγRIIa R ili FcγRIIa H, ili može biti oba. U jednoj realizaciji, KD vrednosti varijantnih Fc regiona za FcγRIIIa su, na primer, 1,0 x 10<-6>M ili manje, 5,0 x 10-
[0725] <7>M ili manje, 3,0 x 10<-7>M ili manje, 2,0 x 10<-7>M ili manje, 1,0 x 10<-7>M ili manje, 5,0 x 10<-8>M ili manje, 3,0 x 10<-8>M ili manje, 2,0 x 10<-8>M ili manje, 1,0 x 10<-8>M ili manje, 5,0 x 10<-9>M ili manje, 3,0 x 10<-9>M ili manje, 2,0 x 10<-9>M ili manje, 1,0 x 10<-9>M ili manje, 5,0 x 10<-10>M ili manje, 3,0 x 10<-10>M ili manje, 2,0 x 10<-10>M ili manje, ili 1,0 x 10<-10>M ili manje. U daljim realizacijama, FcγRIIIa može biti FcγRIIIa F ili FcγRIIIa V, ili može biti oba.
[0727] U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja matičnih i varijantnih Fc regiona može biti predstavljena vrednošću kd (konstanta brzine disocijacije) umesto KD vrednosti.
[0729] Aktivnost vezivanja matičnih i varijantnih Fc regiona može se predstaviti količinom vezivanja za Fcγ receptor po jedinici količine Fc regiona. Na primer, u testu površinske plazmonske rezonancije, količina vezivanja Fc regiona imobilizovanog na senzorski čip i količina vezivanja Fcγ receptora dalje vezanog za njega mere se kao rezonantna jedinica (RU). Vrednost dobijena deljenjem količine vezivanja Fcγ receptora količinom vezivanja Fc regiona može se definisati kao količina vezivanja za Fcγ receptor po jedinici količine Fc regiona. Specifične metode za merenje i izračunavanje takvih količina vezivanja opisane su u primerima ispod. U nekim realizacijama, vrednost odnosa [količina vezivanja varijante Fc regiona za FcγRIIa] / [količina vezivanja matičnog Fc regiona za FcγRIIa] je, na primer, 1,5 ili više, 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više, 5 ili više, 6 ili više, 7 ili više, 8 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, ili 40 ili više, ili 50 ili više. U nekim realizacijama, vrednost odnosa [količina vezivanja varijante Fc regiona za FcγRIIIa] / [količina vezivanja matičnog Fc regiona za FcγRIIIa] je, na primer, 2 ili više, 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 30 ili više, 50 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 300 ili više, 500 ili više, 1 x 10<3>ili više, 2 x 10<3>ili više, 3 x 10<3>ili više, ili 5 x 10<3>ili više.
[0731] U određenim realizacijama, vrednosti KD, vrednosti kd, vrednosti količine vezivanja i slično, opisane ovde mere se ili izračunavaju izvođenjem testa površinske plazmonske rezonancije na 25°C ili 37°C (videti, na primer, Primer 6 ovde).
[0733] U određenim aspektima, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku ima poboljšanu selektivnost između aktivirajućih i inhibitornih Fcγ receptora u poređenju sa matičnim Fc regionom. Drugim rečima, aktivnost vezivanja varijantnog Fc regiona u predmetnom pronalasku za aktivirajući Fcγ receptor je znatno poboljšana nego za inhibitorni Fcγ receptor, u poređenju sa matičnim Fc regionom. U određenim realizacijama, aktivirajući Fcγ receptor je najmanje jedan Fcγ receptor izabran iz grupe koja se sastoji od FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIa F i FcγRIIIa V, a inhibitorni Fcγ receptor je FcγRIIb. U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu selektivnost između FcγRIIa i FcγRIIb. U nekim realizacijama, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku ima poboljšanu selektivnost između FcγRIIIa i FcγRIIb. U daljim realizacijama, varijante Fc regiona u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu selektivnost između FcγRIIa i FcγRIIb i između FcγRIIIa i FcγRIIb.
[0735] U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 236, 239, 268, 270 i 326 prema EU numeraciji. Alternativno, promene amino-kiselina opisane u WO 2013/002362 i WO 2014/104165 mogu se slično koristiti u predmetnom pronalasku.
[0737] U određenim realizacijama, aktivnost vezivanja matičnog i varijantnog Fc regiona može biti predstavljena vrednošću KD (konstanta disocijacije). Aktivnost vezivanja za FcγRIIa i FcγRIIIa je kao što je gore opisano. U jednoj realizaciji, vrednost odnosa [KD vrednost matičnog Fc regiona za FcγRIIb] / [KD vrednost varijantnog Fc regiona za FcγRIIb] je, na primer, 10 ili manje, 5 ili manje, 3 ili manje, 2 ili manje, 1 ili manje, 0,5 ili manje, 0,3 ili manje, 0,2 ili manje ili 0,1 ili manje. U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja matičnog i varijantnog Fc regiona može biti predstavljena vrednošću kd (konstanta brzine disocijacije) umesto KD vrednosti.
[0738] U drugoj realizaciji, aktivnost vezivanja matičnog i varijantnog Fc regiona može biti predstavljena gore pomenutom količinom vezivanja za Fcγ receptor po jedinici količine Fc regiona. U nekim realizacijama, vrednost odnosa [količina vezivanja varijantnog Fc regiona za FcγRIIb] / [količina vezivanja matičnog Fc regiona za FcγRIIb] je, na primer, 10 ili manje, 5 ili manje, 3 ili manje, 2 ili manje, 1 ili manje, 0,5 ili manje, 0,3 ili manje, 0,2 ili manje ili 0,1 ili manje. U nekim realizacijama, količina vezivanja varijante Fc regiona za FcγRIIb je, na primer, 0,5 ili manja, 0,3 ili manje, 0,2 ili manje, 0,1 ili manje, 0,05 ili manje, 0,03 ili manje, 0,02 ili manje, 0,01 ili manje, 0,005 ili manje, 0,003 ili manje, 0,002 ili manje, ili 0,001 ili manje.
[0740] U određenim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku imaju poboljšanu stabilnost u poređenju sa matičnim Fc regionom. U određenim primerima, stabilnost je termodinamička stabilnost. Termodinamička stabilnost polipeptida može se proceniti, na primer, korišćenjem Tm vrednosti kao indikatora. Tm vrednosti se mogu meriti korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u tehnici, kao što su cirkularni dihroizam (CD), diferencijalni skenirajući kalorimetar (DSC) i diferencijalna skenirajuća fluorimetrija (DSF). U jednom primeru, u varijanti Fc regiona u predmetnom pronalasku, Tm vrednost CH2 regiona je povećana za 0,1 stepen ili više, 0,2 stepena ili više, 0,3 stepena ili više, 0,4 stepena ili više, 0,5 stepeni ili više, 1 stepen ili više, 2 stepena ili više, 3 stepena ili više, 4 stepena ili više, 5 stepeni ili više, ili 10 stepeni ili više, u poređenju sa onim u matičnom Fc regionu.
[0742] U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 250 i 307 prema EU numeraciji. Alternativno, promene amino-kiselina opisane u WO 2013/118858 mogu se slično koristiti.
[0744] U određenim aspektima, varijantni Fc region je sastavljen od dva polipeptidna lanca sa različitim sekvencama jedna od druge. U daljem aspektu, u varijantnom Fc regionu, heterodimerizacija između prvog polipeptida i drugog polipeptida je podsticana. Kada se heterodimerni protein proizvodi korišćenjem postupka rekombinacije, poželjno je da se peptidni lanci koji se razlikuju jedni od drugih preferencijalno udružuju da bi formirali heterodimer, nego da se identični polipeptidni lanci udružuju da bi formirali homodimer. Da li je heterodimerizacija u varijantnom Fc regionu podsticana ili ne može se proceniti, na primer, odvajanjem homodimera i heterodimera iz proizvedenih varijantnih Fc regiona tehnikom kao što je hromatografija i određivanjem odnosa svake komponente.
[0746] U nekim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 349, 356, 366, 368, 407 i 439 prema EU numerisanju. Alternativno, promene amino-kiselina opisane u WO 2006/106905 i WO 1996/027011 mogu se slično koristiti u predmetnom pronalasku.
[0748] U određenim aspektima, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku ima poboljšanu aktivnost vezivanja za FcRn pod kiselim pH. U nekim primerima, kiseli pH znači pH od 4.0 do 6.5. U daljim primerima, kiseli pH je najmanje jedan izabran iz grupe koja se sastoji od pH 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, i 6.5. U određenim primerima, kiseli pH je pH 5.8.
[0750] U nekim primerima, varijantni Fc regioni sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 428, 434, 436, 438 i 440 prema EU numeraciji. Alternativno, promene amino-kiselina opisane u WO 2016/125495 mogu se slično koristiti.
[0752] U jednom aspektu, varijantni Fc region sadrži najmanje jednu promenu amino-kiseline na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368, 407, 428, 434, 436, 438, 439 i 440 prema EU numerisanju.
[0754] U određenim aspektima, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku obuhvata promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 i 334 prema EU numerisanju. U daljem aspektu, varijantni Fc region obuhvata promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307 i 326 prema EU numerisanju u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326 i 334 prema EU numerisanju u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0756] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 332 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 332 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0758] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 356 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 356 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0760] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 366 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0762] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 349 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 349 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0764] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 332 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 332 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0766] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 330 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 330 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0768] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 439 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 439 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0769] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promene aminokiselina na pozicijama 366, 368 i 407 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promene amino-kiselina na pozicijama 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0771] U drugom aspektu, varijantni Fc region u predmetnom pronalasku dalje sadrži promenu aminokiseline na poziciji 356 prema EU numeraciji. U daljem aspektu, varijantni Fc region sadrži promenu amino-kiseline na poziciji 356 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0773] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 349, 356, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljem aspektu, varijantni Fc region obuhvata promene aminokiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334, 356, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0774] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 334, 356 i 439 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 i 356 prema EU numerisanju u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 334 i 439 prema EU numerisanju u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0776] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0777] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356 i 439 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 i 356 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334 i 439 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0779] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0781] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356 i 439 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332 i 356 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334 i 439 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0783] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene aminokiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0785] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0787] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 349, 356, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 349 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 330, 332, 334, 356, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0789] U nekim aspektima, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže promene aminokiselina na pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 349, 356, 366, 368 i 407 prema EU numerisanju. U daljim aspektima, varijantni Fc regioni sadrže promene amino-kiselina na (i) pozicijama 234, 235, 236, 239, 250, 268, 270, 298, 307, 326, 332, 349 i 366 prema EU numeraciji u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona, i (ii) pozicijama 236, 250, 270, 298, 307, 326, 332, 334, 356, 366, 368 i 407 prema EU numeraciji u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0791] U daljim realizacijama, varijantni Fc regioni u predmetnom pronalasku sadrže najmanje jednu promenu amino-kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) Tyr ili Phe na poziciji 234, Gln na poziciji 235, Trp na poziciji 236, Met na poziciji 239, Val na poziciji 250, Asp na poziciji 268, Glu na poziciji 270, Ala na poziciji 298, Pro na poziciji 307, Asp na poziciji 326, Glu na poziciji 332, Cys na poziciji 349, Lys na poziciji 356 i Trp na poziciji 366, prema EU numeraciji, u prvom polipeptidu matičnog Fc regiona; i (ii) Ala na poziciji 236, Val na poziciji 250, Glu na poziciji 270, Ala na poziciji 298, Pro na poziciji 307, Asp na poziciji 326, Met ili Lys na poziciji 330, Asp ili Glu na poziciji 332, Glu na poziciji 334, Cys na poziciji 356, Ser na poziciji 366, Ala na poziciji 368, Val na poziciji 407 i Glu na poziciji 439, prema EU numeraciji, u drugom polipeptidu matičnog Fc regiona.
[0793] U daljim aspektima, varijante Fc regiona u predmetnom pronalasku dalje obuhvataju bilo koju od amino-kiselinskih promena (a) do (d) ispod:
[0794] (a) Ala na poziciji 434 prema EU numerisanju;
[0795] (b) Ala na poziciji 434, Thr na poziciji 436, Arg na poziciji 438 i Glu na poziciji 440, prema EU numerisanju;
[0796] (c) Leu na poziciji 428, Ala na poziciji 434, Thr na poziciji 436, Arg na poziciji 438 i Glu na poziciji 440, prema EU numerisanju; i
[0797] (d) Leu na poziciji 428, Ala na poziciji 434, Arg na poziciji 438 i Glu na poziciji 440, prema EU numerisanju.
[0799] Opisana su antitela koja sadrže sekvenca amino-kiselina bilo koje od SEQ ID NO: 43 do 46, 65, 66, 81, 207, 239, 253 do 271, 276, 277 i 278.
[0801] „Fcγ receptori“ (ovde se nazivaju Fcγ receptori, FcγR ili FcgR) odnose se na receptore koji se mogu vezati za Fc region monoklonskih antitela IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, i praktično označavaju bilo kog člana porodice proteina kodiranih genima Fcγ receptora. Kod ljudi, ova porodica uključuje FcγRI (CD64), uključujući izoforme FcγRIa, FcγRIb i FcγRIc; FcγRII (CD32), uključujući izoforme FcγRIIa (uključujući alotipove H131 (tip H) i R131 (tip R)), FcγRIIb (uključujući FcγRIIb-1 i FcγRIIb-2) i FcγRIIc; i FcγRIII (CD16) uključujući izoforme FcγRIIIa (uključujući alotipove V158 i F158), i FcγRIIIb (uključujući alotipove FcγRIIIb-NA1 i FcγRIIIb-NA2), i bilo koji humani FcγR, FcγR izoforme ili alotipove koji tek treba da budu otkriveni, ali nisu ograničeni na to. FcγRIIb1 i FcγRIIb2 su prijavljeni kao varijante splajsinga humanog FcγRIIb. Pored toga, prijavljena je varijanta splajsinga nazvana FcγRIIb3 (J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385). Pored ovih varijanti splajsinga, humani FcγRIIb uključuje sve varijante splajsinga registrovane u NCBI, a to su NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 i NP_003992.3. Štaviše, humani FcγRIIb uključuje svaki prethodno prijavljeni genetski polimorfizam, kao i FcγRIIb (rthritis Rheum. 48: 3242-3252 (2003); Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14: 2881-2892 (2005); i Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46: 1242-1254 (2002)), i svaki genetski polimorfizam koji će biti objavljen u budućnosti.
[0803] U FcγRIIa postoje dva alotipa, jedan gde je amino-kiselina na poziciji 131 FcγRIIa histidin (tip H) i drugi gde je amino-kiselina na poziciji 131 supstituisana argininom (tip R) (Warrmerdam, J. Exp. Med. 172: 19-25 (1990)).
[0804] FcγR obuhvata FcγR izvedene od ljudi, miševa, pacova, zečeva i majmuna, ali nije ograničen na to i može biti izveden iz bilo kog organizma. Mišji FcγR obuhvataju FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) i FcγRIII-2 (CD16-2), i bilo koje mišje FcγR ili izoforme FcγR, ali nisu ograničeni na to.
[0806] Sekvenca amino-kiselina humanog FcγRI je navedena u SEQ ID NO: 131 (NP_000557.1); sekvenca amino-kiselina humanog FcγRIIa je navedena u SEQ ID NO: 132 (AAH20823.1), SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 150; sekvenca amino-kiselina humanog FcγRIIb je navedena u SEQ ID NO: 151 (AAI46679.1), SEQ ID NO: 169 ili SEQ ID NO: 172; sekvenca amino-kiselina humanog FcγRIIIa je navedena u SEQ ID NO: 174 (AAH33678.1), SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176 ili SEQ ID NO: 177; i sekvenca amino-kiselina humanog FcγRIIIb je navedena u SEQ ID NO: 178 (AAI28563.1).
[0808] Za razliku od Fcγ receptora koji pripada superfamiliji imunoglobulina, humani FcRn je strukturno sličan polipeptidima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I, pokazujući 22% do 29% sekvencijalnog identiteta sa molekulima MHC klase I Ghetie et al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn se eksprimuje kao heterodimer koji se sastoji od rastvorljivog β lanca ili lakog lanca (β2 mikroglobulin) u kompleksu sa transmembranskim α lancem ili teškim lancem. Kao i MHC, FcRn α lanac sadrži tri ekstracelularna domena (α1, α2 i α3) i njegov kratki citoplazmatski domen učvršćuje protein na površinu ćelije. α1 i α2 domeni interaguju sa domenom za vezivanje FcRn Fc regiona antitela (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315). Sekvenca amino-kiselina humanog FcRn je navedena u SEQ ID NO: 179 (NP_004098.1), a sekvenca aminokiselina β2 mikroglobulina je navedena u SEQ ID NO: 180.
[0810] „Matični Fc region“, kako se ovde koristi, odnosi se na Fc region pre uvođenja promena aminokiselina opisanih ovde. U nekim realizacijama, roditeljski Fc region je Fc region nativne sekvence (ili Fc region nativnog antitela). Antitelo uključuje, na primer, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) i IgM. Antitelo može biti izvedeno iz humanog ili majmunskog (npr. cynomolgus, rezus makaki, marmozet, šimpanza ili babun). Nativno antitelo može da sadrži prirodno nastale mutacije. Više alotipskih sekvenci IgG usled genetskog polimorfizma opisano je u „Sequences of proteins of immunological interest“, NIH Publication No.91-3242, i bilo koja od njih može se koristiti u predmetnom pronalasku. Konkretno, za humani IgG1, sekvenca amino kiselina na pozicijama 356 do 358 (EU numeracija) može biti DEL ili EEM. U određenim realizacijama, roditeljski Fc region je Fc region izveden iz konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 (SEQ ID NO: 249), humanog IgG2 (SEQ ID NO: 250), humanog IgG3 (SEQ ID NO: 251) ili humanog IgG4 (SEQ ID NO: 252). U drugoj realizaciji, roditeljski Fc region je Fc region izveden iz konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 82 ili SEQ ID NO: 158. U daljim realizacijama, roditeljski Fc region može biti Fc region proizveden dodavanjem promena aminokiselina koje se razlikuju od promena amino-kiselina opisanih ovde, Fc regionu nativne sekvence (Fc region referentne varijante sekvence). Fc region nativne sekvence je generalno konstituisan kao homodimer koji se sastoji od dva identična polipeptidna lanca.
[0812] Pored toga, izmene amino-kiselina izvršene u druge svrhe mogu se kombinovati u varijanti Fc regiona opisanoj ovde. Na primer, supstitucije amino-kiselina koje poboljšavaju aktivnost vezivanja FcRn (Hinton et al., J. Immunol. 176(1): 346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33): 23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-159 (2010); WO 2006/019447; WO 2006/053301; i WO 2009/086320), a mogu se dodati supstitucije amino-kiselina za poboljšanje heterogenosti ili stabilnosti antitela (WO 2009/041613). Alternativno, polipeptidi sa svojstvom podsticanja klirensa antigena, koji su opisani u WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 ili WO 2013/180201, polipeptidi sa svojstvom specifičnog vezivanja za ciljno tkivo, koji su opisani u WO 2013/180200, polipeptidi sa svojstvom ponovljenog vezivanja za višestruke molekule antigena, koji su opisani u WO 2009/125825, WO 2012/073992 ili WO 2013/047752, mogu se kombinovati sa varijantom Fc regiona opisanom ovde. Alternativno, sa ciljem davanja sposobnosti vezivanja za druge antigene, promene amino-kiselina otkrivene u EP1752471 i EP1772465 mogu se kombinovati u CH3 varijante Fc regiona opisane ovde. Alternativno, sa ciljem povećanja zadržavanja u plazmi, promene amino-kiselina koje smanjuju pI konstantnog regiona (WO 2012/016227) mogu se kombinovati u varijanti Fc regiona opisanoj ovde. Alternativno, sa ciljem podsticanja unosa u ćelije, promene amino-kiselina koje povećavaju pI konstantnog regiona (WO 2014/145159) mogu se kombinovati u varijanti Fc regiona opisanoj ovde. Alternativno, sa ciljem podsticanja eliminacije ciljnog molekula iz plazme, promene aminokiselina koje povećavaju pI konstantnog regiona (WO 2016/125495) mogu se kombinovati u varijanti Fc regiona opisanoj ovde. U jednom primeru, takva izmena može uključivati, na primer, supstituciju na najmanje jednoj poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od pozicija 311, 343, 384, 399, 400 i 413 prema EU numerisanju. U daljem primeru, takva supstitucija može biti zamena amino-kiseline sa Lys ili Arg na svakoj poziciji.
[0814] Pored toga, tehnike proizvodnje heterodimerizovanih antitela koje koriste asocijaciju antitela CH1 i CL, i asocijaciju VH i VL, koje su opisane u WO 2011/028952, takođe se može koristiti.
[0816] Kao i kod postupka opisanog u WO 2008/119353 i WO 2011/131746, takođe je moguće koristiti tehniku proizvodnje heterodimerizovanih antitela tako što se unapred proizvode dve vrste homodimerizovanih antitela, inkubiraju se antitela pod redukujućim uslovima da bi se disocirala i ponovo se povezuju.
[0818] Štaviše, kao i kod postupka opisanog u WO 2012/058768, takođe je moguće koristiti tehniku proizvodnje heterodimerizovanih antitela dodavanjem izmena u CH2 i CH3 domene.
[0820] Kada se istovremeno eksprimuju dva polipeptida koja sadrže varijantni Fc region sa različitim amino-kiselinskim sekvencama, da bi se proizveli polipeptidi koji sadrže heterologne varijante Fc regione, polipeptidi koji sadrže homologne varijante Fc regione se, takođe, obično proizvode kao nečistoće. U takvim slučajevima, polipeptidi koji sadrže heterologne varijante Fc regione mogu se efikasno dobiti njihovim odvajanjem i prečišćavanjem od polipeptida koji sadrže homologne varijante Fc regione korišćenjem poznatih tehnologija. Prijavljen je postupak za efikasno odvajanje i prečišćavanje heterodimerizovanih antitela od homodimerizovanih antitela korišćenjem jonoizmenjivačke hromatografije, uvođenjem amino-kiselinskih promena u varijabilne regione teških lanaca dva tipa antitela kako bi se stvorila razlika u izoelektričnim tačkama između homodimerizovanih antitela i heterodimerizovanih antitela (WO 2007/114325). Prijavljen je još jedan postupakza prečišćavanje heterodimerizovanih antitela korišćenjem hromatografije proteina A, konstruisanjem heterodimerizovanog antitela koje sadrži dva tipa teških lanaca izvedenih iz mišjeg IgG2a koji se vezuje za protein A i pacovskog IgG2b koji se ne vezuje za protein A (WO 1998/050431 i WO 1995/033844).
[0822] Štaviše, heterodimerizovano antitelo može se efikasno prečistiti korišćenjem hromatografije proteina A, zamenom amino-kiselinskih ostataka na pozicijama 435 i 436 (EU numeracija), koje se nalaze na mestu vezivanja proteina A teškog lanca antitela, sa amino-kiselinama kao što su Tyr ili His, da bi se dobili različiti afiniteti vezivanja proteina A.
[0823] U predmetnom pronalasku, promena amino-kiselina znači bilo koju od supstitucije, delecije, adicije, insercije i modifikacije ili njihove kombinacije. U predmetnom pronalasku, promena amino-kiselina može se preformulisati kao mutacija amino-kiselina.
[0825] Broj amino-kiselinskih promena uvedenih u Fc region nije ograničen. U određenim realizacijama, može biti 1, 2 ili manje, 3 ili manje, 4 ili manje, 5 ili manje, 6 ili manje, 8 ili manje, 10 ili manje, 12 ili manje, 14 ili manje, 16 ili manje, 18 ili manje ili 20 ili manje.
[0827] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju antitela koje sadrži varijantni Fc region. U daljim aspektima, ovo otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju antitela koje sadrži varijantni Fc region čija je funkcija modifikovana. U nekim aspektima, antitela su Fc fuzioni proteini. U određenim realizacijama, ti postupci obuhvataju uvođenje najmanje jedne aminokiselinskih promena u matični Fc region. U određenim realizacijama, ti postupci obuhvataju: (i) obezbeđivanje antitela/antitela koja obuhvataju matični Fc region; i (ii) uvođenje najmanje jedne amino-kiselinskih promena u matični Fc region. U određenim realizacijama, ti postupci mogu dalje obuhvatati (iii) merenje funkcije antitela/antitela koja obuhvataju varijantni Fc region. Nativni Fc region je obično sastavljen od dva identična polipeptidna lanca. Amino-kiselinske promene matičnog Fc regiona mogu se uvesti u jedan od dva polipeptidna lanca matičnog Fc regiona ili u oba od dva polipeptidna lanca.
[0829] U drugoj realizaciji, postupak proizvodnje antitela/antitela koja sadrže varijantni Fc region obuhvata: (i) obezbeđivanje jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela koja sadrže matični Fc region; (ii) uvođenje najmanje jedne mutacije u region(e) koji kodiraju matični Fc region u nukleinskim kiselinama; (iii) uvođenje nukleinskih kiselina proizvedenih u (ii) u ćeliju domaćina; i (iv) kultivisanje ćelije opisane u (iii) tako da se antitelo/antitela koja sadrže varijantni Fc region ekspresuju. U određenim realizacijama, gore navedeni postupci mogu dalje obuhvatati (v) sakupljanje antitela/antitela koja sadrže varijantni Fc region iz kulture ćelije domaćina opisane u (iv).
[0831] U određenim realizacijama, nukleinske kiseline proizvedene u (ii) mogu biti uključene u jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora).
[0832] U nekim realizacijama, promene amino-kiselina koje se koriste u postupcima proizvodnje opisanim ovde su izabrane iz bilo koje pojedinačne promene izabrane među promenama aminokiselina koje mogu biti obuhvaćene gorepomenutim varijantama Fc regiona, kombinacijama pojedinačnih promena ili kombinovanih promena navedenih u tabelama 26 do 30.
[0834] Fc region se može dobiti ponovnim eluiranjem frakcije adsorbovane na kolonu proteina A nakon delimičnog varenja monoklonskih antitela IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili sličnih, korišćenjem proteaze kao što je pepsin. Proteaza nije posebno ograničena sve dok može da vari antitelo pune dužine tako da se Fab i F(ab')2 proizvode na restriktivan način odgovarajućim podešavanjem uslova enzimske reakcije kao što je pH, a primeri uključuju pepsin i papain.
[0836] Antitela, kako je definisano u patentnim zahtevima, koja sadrže varijantni Fc region predmetnog pronalaska, mogu se proizvesti i drugim metodama poznatim u tehnici, pored gorepomenutih postupaka proizvodnje. Takođe su stavljena na uvid javnosti i antitela koja sadrže varijantni Fc region proizveden ovde opisanim postupcima proizvodnje.
[0838] Postupci ispitivanja opisani ovde ili različiti postupci merenja poznati u tehnici mogu se koristiti za identifikaciju ili skrining varijantnih Fc regiona ovde datih, ili za razjašnjavanje njihovih fizičkih ili hemijskih svojstava ili bioloških aktivnosti.
[0840] Testovi za određivanje aktivnosti vezivanja antitela koje sadrži varijantni Fc region prema jednom ili više članova FcR porodice opisani su ovde ili su inače poznati u tehnici. Takvi testovi vezivanja uključuju, ali nisu ograničeni na, test površinske plazmonske rezonancije, skrining homogenog testa amplifikovane luminescentne bliskosti (ALPHA), ELISA i sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) (Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005‑4010).
[0842] U jednoj realizaciji, aktivnost vezivanja antitela koje sadrži varijantni Fc region za članove FcR porodice može se meriti korišćenjem testa površinske plazmonske rezonancije. Na primer, različiti FcR su podvrgnuti interakciji kao analiti sa antitelom koje sadrži varijantni Fc region imobilizovan ili zarobljen na senzorskom čipu korišćenjem poznatih postupaka i reagensa (npr. Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, antitela protiv λ lanca, antitela protiv κ lanca, antigeni peptidi i antigeni proteini). Alternativno, FcR mogu biti imobilizovani ili zarobljeni na senzorskom čipu, a antitelo koje sadrži varijantni Fc region može se koristiti kao analit. Kao rezultat takvih interakcija, dobijaju se senzogrami vezivanja i njihovom analizom mogu se izračunati vrednosti konstante disocijacije (KD) takvih vezivanja. Štaviše, razlika u vrednosti rezonantne jedinice (RU) u senzogramima pre i posle interakcije sa FcR (tj. količina vezivanja FcR) može se koristiti kao indikator aktivnosti vezivanja antitela koje sadrži varijantni Fc region za FcR. Štaviše, korigovana vrednost dobijena deljenjem gore pomenute količine vezivanja FcR sa razlikom u RU vrednosti u senzogramima pre i nakon što su antitela koja sadrže varijantni Fc region imobilizovana ili zabeležena na senzorskom čipu (tj. količina vezivanja antitela koja sadrži varijantni Fc region) (to jest, vrednost korekcije je količina vezivanja FcR po jedinici količine antitela koje sadrži varijantni Fc region) može se koristiti kao indikator aktivnosti vezivanja.
[0844] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže antitelo koje sadrži varijantu Fc regiona. Gore navedene farmaceutske formulacije dalje sadrže farmaceutski prihvatljive nosače.
[0846] Primeri
[0848] U nastavku su prikazani primeri postupaka i kompozicija predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da se mogu sprovesti i različiti drugi primeri u smislu gorenavedenih opštih opisa.
[0850] [Primer 0] Koncept prekidačkog antitela koje ispoljava citotoksičnu aktivnost zavisnu od antitela protiv markera ćelijske površine regulatornih T ćelija samo u mikrookruženjima raka
[0851] Smatralo se da ipilimumab ispoljava svoj antitumorski efekat inhibiranjem supresije aktivacije efektorskih T ćelija pomoću CTLA4 eksprimovanog na površini efektorskih T ćelija; međutim, nedavno je objavljeno da je citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC aktivnost) protiv T ćelija koje eksprimuju CTLA4 važna, i utvrđeno je da su uklanjanje regulatornih T ćelija u tumorima i ADCC aktivnost važni mehanizmi delovanja antitumorskog efekta anti-CTLA4 antitela.
[0853] Pored toga, poznato je da je ADCC aktivnost od strane IgG1 antitela rezultat indukcije citotoksične aktivnosti usled vezivanja konstantnog regiona antitela za FcγR NK ćelija i makrofaga, a antitela sa konstantnim regionom modifikovanim da pojačaju takvo vezivanje indukuju jaču citotoksičnu aktivnost, vršeći antitumorski efekat.
[0854] S druge strane, prijavljeno je da uklanjanje regulatornih T ćelija u celom telu izaziva sistemsku reakciju sličnu autoimunoj bolesti, i smatra se da je regulacija ravnoteže između citotoksične aktivnosti za ispoljavanje antitumorskog efekta i sistemskog odgovora veoma važna.
[0856] Preciznije, očekuje se da će antitelo pokazati snažniju citotoksičnu aktivnost i biti u stanju da suzbije sistemske odgovore kada se antitelo može snažno vezati za regulatorne T ćelije ili iscrpljene T ćelije u mikrookruženju raka, pokazati snažan antitumorski efekat uklanjanjem regulatornih T ćelija ili iscrpljenih T ćelija citotoksičnom aktivnošću i ograničiti odgovor samo na mikrookruženje raka. Antitela sa takvim mehanizmom delovanja još uvek nisu objavljena. Stoga smo zapravo generisali i verifikovali antitela (CTLA4 prekidačka antitela) koja deluju protiv CTLA4 samo lokalno na tumoru i sadrže konstantni region sa poboljšanim vezivanjem za FcγR(s) eksprimovane na NK ćelijama i makrofagima.
[0858] [Primer 1] Dobijanje antitela koja se vezuju za antigene u prisustvu ATP ili njegovog metabolita iz naivne biblioteke i racionalno dizajnirane biblioteke antitela korišćenjem tehnike fagnog prikaza
[0859] (1-1) Priprema antigena za dobijanje antitela koja se vezuju za antigen u prisustvu malog molekula
[0860] Biotinilovani mišji ekstracelularni region CTLA4 (mCTLA4), humani ekstracelularni region CTLA4 (hCTLA4) i abatacept su pripremljeni kao antigeni. Konkretno, u vezi sa ekstracelularnim regionom hCTLA4, gen hCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 1) u kome su His-oznaka i BAP-oznaka spojeni sa C-terminusom ekstracelularnog regiona hCTLA4 je sintetisan i umetnut u životinjski ekspresioni plazmid. Antigenski protein je eksprimovan i prečišćen korišćenjem sledećeg postupka. Pripremljeni plazmid je uveden metodom lipofekcije u liniju FreeStyle 293-F (Invitrogen) izvedenu iz ćelija humanog embrionalnog bubrega, koja je posejana u bočici nakon suspendovanja u FreeStyle 293 ekspresionom medijumu (Invitrogen) pri gustini ćelija od 1,33 x 10<6>ćelija/ml. Tri sata nakon uvođenja plazmida, dodat je biotin do konačne koncentracije od 100 µM, kultivisan u CO<2>inkubatoru (37°C, 8% CO<2>, 125 rpm) tokom 4 dana, a antigen je prečišćen metodom poznatom stručnjacima u tehnici iz supernatanta kulture. Apsorbancija prečišćenog rastvora antigena na 280 nm je merena pomoću spektrofotometra. Koncentracija prečišćenog antigena je izračunata iz dobijene izmerene vrednosti korišćenjem koeficijenta ekstinkcije izračunatog PACE metodom (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). S druge strane, mCTLA4-His (Sino Biologics Inc. 50503-M08H, pristupni broj NP_033973.2), kod koga je His-oznaka spojena sa ekstracelularnim regionom mCTLA4, i Abatacept (Alfresa Corporation), kod koga je konstantni region humanog IgG1 spojen sa hCTLA4, biotinilovani su postupkom aminskog kuplovanja (PIERCE kat. br.21329).
[0862] (1-2) Akvizicija antitela koja se vezuju za mišji CTLA4 u prisustvu malih molekula iz biblioteke naivnih humanih antitela pomoću ispiranja perlicama
[0864] Biblioteka faga za prikazivanje humanih antitela koja se sastoji od više faga koji prezentuju Fab domene sekvenci humanih antitela koje se razlikuju jedni od drugih konstruisana je prema metodi poznatoj stručnjacima u tehnici koristeći, kao šablon, poli A RNK pripremljene iz humanih PBMC, komercijalno dostupne humane poli A RNK i slično.
[0866] Iz konstruisane biblioteke fagnog displeja na bazi naivnih humanih antitela, skrinirana su antitela čija se aktivnost vezivanja za ekstracelularni region mišjeg CTLA4 (mCTLA4) menja u prisustvu i odsustvu malog molekula. Konkretnije, sakupljeni su fagi koji prezentuju antitela i pokazuju aktivnost vezivanja za mCTLA4 zabeležen na kuglicama u prisustvu malog molekula. Fagi su regenerisani iz eluata faga eluiranog sa kuglica u odsustvu malog molekula. U ovoj metodi akvizicije, kao antigen je korišćen mCTLA4 obeležen biotinom (mCTLA4-His-Biotin).
[0868] Fagi proizvedeni iz e. coli koji nose konstruisani fagemid za fagni displej prečišćene su opštom metodom. Zatim je dobijen rastvor fagne biblioteke dijalizovan protiv TBS. Paning je izvršen korišćenjem antigena imobilizovanog na magnetnim kuglicama. Kao magnetne kuglice korišćene su kuglice obložene NeutrAvidin-om (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) ili kuglice obložene streptavidinom (Dynabeads M‑280 Streptavidin).
[0870] Da bi se efikasno dobilo antitelo-prekidač zavisno od malih molekula koje može delovati kao prekidač u tkivima raka, sprovedeno je ispitivanje prema postupku prikazanom u prethodnoj patentnoj literaturi WO 2013/180200. Ova metoda paninga obogaćuje antitela koja se vezuju za antigen u prisustvu adenozin 5'-trifosfata (ATP) i ATP metabolita, ali se ne vezuju za antigen u odsustvu ATP.
[0872] (1-3) Procena aktivnosti vezivanja u prisustvu i odsustvu malog molekula pomoću fagnog ELISA testa
[0873] Iz pojedinačnih kolonija e-coli dobijenih u (1-2), supernatant kulture koji sadrži fage je izolovan prema konvencionalnoj metodi (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133‑145). Supernatanti kulture dobijeni pomoću NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL) su ultrafiltrirani. 100 µL svakog supernatanta kulture je naneto u svako ležište NucleoFast 96 i centrifugirano na 4.500 g tokom 45 minuta da bi se uklonio protok.100 µL H<2>Dodat je O i ponovo ispran centrifugiranjem na 4.500 g tokom 30 minuta. Zatim je dodato 100 µL TBS i smeša je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 5 minuta, nakon čega su rastvori faga koji su u supernatantima regenerisani.
[0875] Prečišćeni fagi kojima je dodat TBS podvrgnuti su ELISA testu sledećim postupkom. Mikrotitarska ploča StreptaWell 96 (Roche) je preko noći obložena sa 100 µL TBS koji sadrži mCTLA4-His-Biotin. Nakon što je svako ležište isprana sa TBST da bi se uklonio mCTLA4-His-Biotin koji nije vezan za ploču, ležišta su blokirana sa 250 µL 2% obranog mleka-TBS tokom 1 sata ili duže. Nakon uklanjanja 2% obranog mleka-TBS, pripremljeni prečišćeni fagi su dodati u svako ležište, a ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 1 sat, čime se omogućava fagima koji prezentuju antitela da se vežu za mCTLA4-His-Biotin prisutan u svakom ležištu u odsustvu ili prisustvu ATP. Nakon pranja svakog ležišta sa TBST ili ATP/TBST, dodato je HRP-konjugovano anti-M13 antitelo (Amersham Pharmacia Biotech) razblaženo sa TBS ili ATP/TBS i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon pranja sa TBST ili ATP/TBST, reakcija razvoja boje rastvora u svakom ležištu u koju je dodat TMB pojedinačni rastvor (ZYMED) zaustavljena je dodatkom sumporne kiseline, a zatim je razvoj boje meren apsorbancijom na 450 nm. Kao rezultat toga, potvrđena su višestruka antitela koja su se vezivala za mCTLA4 samo u prisustvu ATP. Rezultati fagnog ELISA testa prikazani su u Tabeli 2. Ovde su klonovi sa apsorbancijom većom od 0,2 u prisustvu ATP utvrđeni kao pozitivni, a klonovi sa odnosom apsorbancije većim od 2 u prisustvu/odsustvu ATP utvrđeni su kao klonovi sa ATP-zavisnom sposobnošću vezivanja antigena (switch klonovi). U ovom primeru, SM se može koristiti kao skraćenica za mali molekul/molekul male težine kao što je ATP.
[0877] [Tabela 2]
[0879]
[0880]
[0882] (1-4) Akvizicija antitela koja se vezuju za antigen u prisustvu malog molekula iz biblioteke racionalnog dizajna korišćenjem ATP ili njegovog metabolita
[0884] Iz biblioteke fagnog prikaza antitela racionalnog dizajna konstruisane u prethodnoj patentnoj literaturi WO 2015/083764, antitela koja pokazuju aktivnost vezivanja antigena pod uslovom prisustva ATP ili ATP metabolita (na primer, ADP, AMP, adenozin (ADO), itd.) su dobijena. Za akviziciju antitela, sakupljeni su fagi koji prezentuju antitela i pokazuju sposobnost vezivanja za antigen zarobljen na perlama u prisustvu ATP ili ATP metabolita, a zatim su fagi regenerisani iz eluata eluiranog sa perli pod uslovom odsustva ATP ili ATP metabolita.
[0886] Fagi su proizvedeni opštom metodom iz e. Coli inoseći konstruisani fagemid za prikazivanje faga. Rastvor fagne biblioteke je dobijen razblaživanjem sa TBS populacije faga istaloženih dodavanjem 2,5 M NaCl/10% PEG u rastvor kulture e. coli u kojoj su proizvedeni fagi. Zatim je BSA dodat u rastvor fagne biblioteke da bi se postigla konačna koncentracija od 4%. Paning je obavljen korišćenjem antigena imobilizovanog na magnetnim kuglicama. Kao magnetne kuglice korišćene su kuglice obložene NeutrAvidin-om (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) ili kuglice obložene streptavidinom (Dynabeads M‑280 Streptavidin). Kao antigen je korišćen biotinilovani abatacept (Abatacept-Biotin).
[0888] Da bi se efikasno dobilo switch (prekidač) antitelo sa malim molekulom zavisno od malih molekula koje može delovati kao prekidač u tkivu raka, sprovedeno je ispitivanje radi obogaćivanja antitela koja se vezuju za antigen u prisustvu adenozin 5'-trifosfata (ATP) ili ATP metabolita, a ne vezuju se za antigen u odsustvu ATP ili ATP metabolita, uz upućivanje na postupak prikazan u prethodnoj patentnoj literaturi. WO 2015/083674.
[0890] (1-5) Procena aktivnosti vezivanja u prisustvu i odsustvu ATP, ili njegovog metabolita, pomoću fagnog ELISA testa
[0892] Iz pojedinačnih kolonija e. coli dobijen gore navedenim postupkom, supernatant kulture koji sadrži fage je izolovan prema konvencionalnoj metodi (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133‑145). Dobijeni supernatant kulture je ultrafiltriran korišćenjem NucleoFast 96 (MACHEREY-NAGEL).
[0893] Protok je uklonjen centrifugiranjem (4.500 g, 45 minuta) NucleoFast 96 sa 100 µL supernatanta kulture dodatim u svako ležište. NucleoFast 96 je dodato sa 100 µL H<2>O u svako ležište i ponovo isprano centrifugiranjem (4.500 g, 30 minuta). Konačno, dodato je 100 µL TBS, i rastvor faga koji se nalazio u supernatantu svakog ležišta NucleoFast 96 koji je ostavljen da stoji na sobnoj temperaturi 5 minuta je regenerisan.
[0895] TBS ili TBS koji sadrži ATP ili njegov metabolit (SM/TBS) je dodat prečišćenim fagima, a fagi su podvrgnuti ELISA testu sledećim postupkom. Mikrotitarska ploča StreptaWell 96 (Roche) je preko noći obložena sa 100 µL TBS koji sadrži biotinom obeleženi antigen (Abatacept-Biotin) pripremljen u Primeru 1-1. Nakon što je slobodan Abatacept-Biotin uklonjen ispiranjem svakog ležišta ploče sa TBST, ležišta su blokirana sa 250 µL 2% obranog mleka-TBS tokom 1 sata ili duže. Nakon uklanjanja 2% obranog mleka-TBS, pripremljeni prečišćeni fagi su dodati u svako ležište, a ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 1 sata, čime se omogućava fagima koji prezentuju antitelo da se vežu za Abatacept-Biotin prisutan u svakom ležištu u odsustvu ili prisustvu ATP ili njegovog metabolita. Nakon što je svako ležište ploče isprano sa TBST ili TBST koji sadrži ATP ili njegov metabolit (SM/TBST), dodato je HRP-konjugovano anti-M13 antitelo (Amersham Pharmacia Biotech) razblaženo sa TBS ili SM/TBS, a ova ploča je inkubirana 1 sat. Nakon ispiranja ležišta sa TBST ili SM/TBST, reakcija razvoja boje rastvora u svakom ležištu u koju je dodat TMB pojedinačni rastvor (ZYMED) zaustavljena je dodatkom sumporne kiseline, a zatim je razvoj boje meren apsorbancijom na 450 nm. Kao rezultat toga, potvrđeno je više antitela čija se aktivnost vezivanja za abatacept menja u prisustvu i odsustvu ATP ili njegovog metabolita. Rezultati fagnog ELISA testa su prikazani u Tabeli 3. Ovde su klonovi koji imaju odnos apsorbancije S/N veći od 2 u prisustvu ATP ili njegovog metabolita utvrđeni kao pozitivni, a klonovi koji imaju odnos apsorbancije veći od 2 u prisustvu/odsustvu ATP ili njegovog metabolita utvrđeni su kao klonovi koji imaju sposobnost vezivanja antigena zavisnu od ATP ili njegovog metabolita (switch/prekidač klonovi).
[0897] [Tabela 3]
[0899]
[0900]
[0902] (1-6) Analiza sekvence prekidačkih antitela čija se aktivnost vezivanja antigena menja u zavisnosti od prisustva ili odsustva ATP i njegovih metabolita
[0904] Analizirane su nukleotidne sekvence gena amplifikovanih korišćenjem specifičnih prajmera lacPF (SEQ ID NO: 2) i G1seqR (SEQ ID NO: 3) iz klonova za koje je utvrđeno da imaju aktivnost vezivanja antigena pod uslovom prisustva ATP i njegovih metabolita kao rezultat fagnog ELISA testa. Kao rezultat analize, dobijeni su klonovi ABADh11-4_020, ABADh11-4_086, ABADh12-4_014, ABADh12-5_001, ABADh12-5_046, i ABADh5-5_041 za koje je ocenjeno da imaju aktivnost vezivanja za abatacept obeležen biotinom u prisustvu ATP i njegovih metabolita. Imena klonova su preimenovana u ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005 i ABAM006, redom (Tabela 4).
[0906] [Tabela 4]
[0908]
[0910] (1-7) Ekspresija i prečišćavanje prekidačkih (switch) antitela čija se aktivnost vezivanja antigena menja u zavisnosti od prisustva i odsustva ATP i njegovih metabolita
[0912] Geni koji kodiraju varijabilne regione ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005 i ABAM006 dobijene iz humane biblioteke faga racionalnog dizajna umetnuti su u plazmid životinjske ekspresije, humani IgG1/Lambda. Antitela su eksprimovana korišćenjem sledećeg postupka. Pripremljeni plazmid je unet metodom lipofekcije u liniju FreeStyle 293-F (Invitrogen) izvedenu iz ćelija humanog embrionalnog bubrega, koja je suspendovana u FreeStyle 293 ekspresionoj podlozi (Invitrogen) pri gustini ćelija od 1,33 x 10<6>ćelija/ml, i posejanih u količini od 3 ml/ležište u svako ležište ploča sa 6 ležišta. Antitela su prečišćena iz supernatanta kulture kultivisanog u CO<2>inkubatoru (37°C, 8% CO<2>, 90 obrtaja u minuti) tokom 4 dana koristeći rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) metodom poznatom stručnjacima u tehnici. Apsorbancija prečišćenih rastvora antitela na 280 nm je merena pomoću spektrofotometra. Iz dobijenih izmerenih vrednosti, koncentracija prečišćenih antitela je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije izračunatog PACE metodom (Protein Science (1995) 4, 2411‑2423).
[0913] (1-8) Procena aktivnosti vezivanja dobijenih antitela protiv hCTLA4 u prisustvu i odsustvu AMP pomoću IgG ELISA
[0915] Dobijenih šest antitela ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005 i ABAM006 podvrgnuto je IgG ELISA testu. Puferi prikazani u Tabeli 5 su pripremljeni na odgovarajući način. Kao antigen je korišćen biotinom obeležen humani CTLA4 (hCTLA4-His-Biotin).
[0917] [Tabela 5]
[0919]
[0921] Prvo, mikrotitarska ploča StreptaWell 96 (Roche) je obložena sa 100 µL TBS koji sadrži hCTLA4-His-Biotin na sobnoj temperaturi tokom 1 sata ili duže. Nakon što je svako ležište ploče isprano puferom za ispiranje da bi se uklonio hCTLA4-His-Biotin koji nije vezan za ploču, ležišta su blokirana sa 250 µL blokirajućeg pufera tokom 1 sata ili duže. U svako ležište iz koje je uklonjen blokirajući pufer, dodato je 100 µL svakog prečišćenog IgG pripremljenog do 2,5 µg/mL u puferu za uzorke koji sadrži AMP u konačnoj koncentraciji od 1 mM, a ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, čime se omogućava da se svaki IgG veže za hCTLA4-His-Biotin prisutan u svakom ležištu. Nakon pranja puferom za ispiranje koji sadrži AMP u konačnoj koncentraciji od 1 mM, ploča u koju je u svako ležište dodato HRP-konjugovano anti-humano IgG antitelo (BIOSOURCE) razblaženo puferom za uzorke, inkubirana je 1 sat. Nakon pranja puferom za ispiranje koji sadrži svaki mali molekul, reakcija razvoja boje rastvora u svakom ležištu u koje je dodat TMB pojedinačni rastvor (ZYMED) zaustavljena je dodatkom sumporne kiseline, a zatim je razvoj boje meren apsorbancijom na 450 nm. Puferi koji sadrže kompozicije prikazane u Tabeli 5 korišćeni su kao puferi.
[0923] Izmereni rezultati su prikazani u Tabeli 6. Za ležišta sa prepunim vrednostima pretpostavljeno je da su 5,00. Rezultati su pokazali da je kod svih klonova ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005 i ABAM006 apsorbancija u odsustvu AMP bila značajno niža nego u prisustvu AMP. Iz ovog rezultata je potvrđeno da svi klonovi ABAM001, ABAM002, ABAM003, ABAM004, ABAM005 i ABAM006 imaju svojstvo promene vezivanja za antigen u zavisnosti od prisustva ili odsustva malih molekula.
[0925] [Tabela 6]
[0927]
[0930] (1-9) Procena efekta ATP i njegovih metabolita na vezivanje za humani CTLA4 pomoću površinske plazmonske rezonance
[0932] ABAM004 je dalje procenjen kao CTLA4 prekidačko antitelo.
[0934] Interakcija reakcije antigen-antitelo između ABAM004 i hCTLA4-His-BAP analizirana je korišćenjem Biacore T200 (GE Healthcare). ABAM004 je omogućeno da bude zahvaćen senzorskim čipom CM5 (GE Healthcare) na koji je protein A/G (Pierce) imobilisan u odgovarajućoj količini metodom aminskog kuplovanja, i omogućeno mu je da interaguje sa antigenom hCTLA4-His-BAP pripremljenim u Primeru 1-1. TBS je korišćen kao pufer za rad, a 10 mM glicin-HCl (pH 1,5) je korišćen kao rastvor za regeneraciju.
[0935] Nakon što je 1 µg/ml ABAM004 suspendovan u TBS zarobljen, rastvor koji sadrži 500 nM hCTLA4-His-BAP i 10 koncentracija ATP, ADP ili AMP razblaženih u uobičajenom odnosu 4 od 4000 µM, i 2 mM MgCl<2>je ubrizgan u svaku protočnu ćeliju brzinom protoka od 10 µL/min tokom 3 minuta. Ova 3 minuta su korišćena kao faza vezivanja hCTLA4-His-BAP. Nakon završetka faze vezivanja, ubrizgavanje je prebačeno na pufer za rad tokom 2 minuta, što je korišćeno kao faza disocijacije hCTLA4-His-BAP. Nakon završetka faze disocijacije, rastvor za regeneraciju je ubrizgan brzinom protoka od 30 µL/min tokom 30 sekundi. Gore navedeno je uzeto kao ciklus merenja aktivnosti vezivanja ABAM004. Količina vezivanja hCTLA-4-His-BAP koja je interagovala sa ABAM004 u fazi vezivanja je korigovana za količinu zarobljenog antitela. Za analizu i crtanje podataka korišćeni su Biacore T200 softver za evaluaciju verzije: 2.0 i Microsoft Excel 2013 (Microsoft).
[0937] Slika 1 prikazuje količinu vezivanja ABAM004 i hCTLA4-His-BAP u prisustvu ATP i njegovih metabolita dobijenih ovim merenjem.
[0939] Kao što je prikazano na slici 1, potvrđeno je da ABAM004 ima svojstvo vezivanja za hCTLA4 koristeći ne samo ATP već i ATP metabolite kao prekidač. Pored toga, pokazano je da antitelo ima najjaču aktivnost vezivanja, posebno u prisustvu AMP.
[0941] (1-10) Evaluacija vezivanja antitela za humane ćelije koje eksprimuju CTLA4
[0943] Protočni citometar je korišćen za procenu kako se interakcija antigen-antitelo između ABAM004 i humanog CTLA4 menja u prisustvu i odsustvu AMP. CHO ćelije koje stabilno eksprimuju humani CTLA4 (hCTLA4-CHO ćelije) su pripremljene u odgovarajućoj koncentraciji. U ovom trenutku, PBS koji sadrži 0,1% BSA (FACS pufer) je korišćen za suspenziju. Antitelo je dodato u 100 µL ćelijskog rastvora do konačne koncentracije od 10 mg/mL, a zatim je dodat AMP do konačne koncentracije od 0, 0,4, 4, 40, 200 i 1000 µM, i ostavljeno da stoji na 4°C tokom 30 minuta. Nakon toga, ćelijska linija je isprana puferom za pranje, što je FACS pufer koji sadrži AMP u konačnoj koncentraciji od 0, 0,4, 4, 40, 200 i 1000 µM, a zatim je dodato FITC-obeleženo sekundarno antitelo (Goat F(ab'2) Anti-Human IgG Mouse ads-FITC, Beckman, 732598) i ponovo ostavljeno da stoji na 4°C tokom 30 minuta u mraku. Nakon što je operacija pranja ponovo izvršena, merenja i analize su obavljene pomoću protočnog citometra (FACS CyAn™ ADP). Rezultati su prikazani na slici 2.
[0944] Gorenavedeni rezultati pokazuju da je ABAM004 pokazao zavisnu od koncentracije AMP aktivnost vezivanja za ćelije koje eksprimuju hCTLA4, i pokazao je zavisnu od koncentracije AMP aktivnost vezivanja ne samo za rastvorljive antigene, već i za antigene membranskog tipa.
[0946] (1-11) ADCC aktivnost testnog antitela korišćenjem mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka kao efektorskih ćelija
[0948] ADCC aktivnost zavisna od koncentracije antitela, antitela koje se vezuje za antigen na ATP-zavisan način, merena je prema sledećem postupku. U ovom trenutku, ADCC aktivnost testiranog antitela merena je na sledeći način koristeći mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka (u daljem tekstu: humani PBMC) kao efektorske ćelije.
[0950] Prvo je pripremljen rastvor humanih PBMC. 50 ml periferne krvi je prikupljeno od zdravih dobrovoljaca (odraslih muškaraca) korišćenjem šprica koji je već sadržao 200 µL rastvora heparina od 1000 jedinica/mL (Novo-heparin injekcija 5000 jedinica, Novo Nordisk). Periferna krv razblažena 2 puta sa PBS(-)podeljena je na 4 alikvota i dodata u epruvete za separaciju limfocita Leukosep (Greiner Bio-One) koje su centrifugirane nakon prethodnog ubrizgavanja 15 ml Ficoll-Paque PLUS. Epruvete za separaciju u koje je alikvotirana periferna krv su centrifugirane na 2150 rpm tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim su odvojene frakcije mononuklearnih ćelija. Nakon jednog pranja ćelija sadržanih u frakcijama sa RPMI-1640 (Nacalai Tesque) koji sadrži 10% FBS (u daljem tekstu 10% FBS/RPMI), ćelije su suspendovane u 10% FBS/RPMI do gustine ćelija od 1 x 10<7>ćelija/ml. Ćelijska suspenzija je korišćena kao rastvor humanih PBMC za naredne eksperimente.
[0952] Zatim, kao ciljne ćelije, hCTLA4-CHO ćelije, pripremljene prisilnom ekspresijom ekstracelularnog regiona humanog CTLA4 u CHO ćelijama, suspendovane su i pripremljene u 10% FBS/RPMI tako da bude 2 x 10<5>ćelija/ml. Štaviše, AMP (Sigma) razblažen na 4 mM pomoću RPMI je korišćen kao AMP rastvor za naredne testove.
[0954] ADCC aktivnost je procenjena oslobađanjem LDH (laktat dehidrogenaze). Prvo, 50 µL rastvora antitela pripremljenog u svakoj koncentraciji (0, 0,04, 0,4, 4 i 40 µg/mL) dodato je u svako ležište ploče sa U-dnom od 96 ležišta, na koju je posejano 50 µL svake od ciljnih ćelija (1 x 10<4>ćelija/ležište). Pored toga, u svako ležište je dodato 50 µL rastvora AMP, a smeša je ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi 15 minuta.50 µL (5 x 10<5>ćelija/ležište) rastvora humanih PBMC je dodato u svako ležište, a ploča je centrifugirana, a zatim ostavljena da stoji na 37°C tokom 4 sata u inkubatoru sa 5% ugljen-dioksida. Nakon završetka reakcije, 100 µL supernatanta kulture je sakupljeno i preneto na ploču sa 96 ležišta radi merenja, a zatim su katalizator (C) i rastvor boje (D) pričvršćeni za komplet za detekciju LDH (TaKaRa) pomešani u odnosu 1:45 i dodato je 100 µL ove smeše. Nakon što je ostavljeno da reaguje na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, dodato je 50 µL 1N HCl da bi se zaustavila reakcija. Izmerena je apsorbancija na 492 nm, a ADCC aktivnost je merena oslobađanjem LDH. ADCC aktivnost je određena na osnovu sledeće formule.
[0956] ADCC aktivnost (%) = {(A-D) - (C-D)} x 100/{(B-D)-(C-D)}
[0957] U gornjoj formuli, A predstavlja srednju vrednost LDH aktivnosti (OD 492 nm) u ležištima u koje je dodato svako test antitelo. B predstavlja srednju vrednost LDH aktivnosti (OD 492 nm) u ležištima u koje je dodato 10 µL 20% vodenog rastvora Triton-X nakon reakcije. C predstavlja srednju vrednost LDH aktivnosti (OD 492 nm) u ležištima u koje je dodato 150 µL 10% FBS/RPMI, ili 100 µL 10% FBS/RPMI i 50 µL AMP rastvora ciljnim ćelijama. D predstavlja srednju vrednost LDH aktivnosti (OD 492 nm) u ležištima koja sadrže samo 10% FBS/RPMI. Test je sproveden u duplikatima, a izračunata je srednja vrednost ADCC aktivnosti (%) u testu koja odražava ADCC aktivnost test antitela. Rezultati su prikazani na slici 3.
[0959] Iz gore navedenih rezultata, pokazano je da antitelo ABAM004 ima aktivnost vezivanja antigena u prisustvu AMP i ima sposobnost da ubija ciljne ćelije ispoljavanjem ADCC aktivnosti.
[0961] [Primer 2] Analiza kristalne strukture anti-CTLA4 antitela koje ima ATP-zavisna svojstva vezivanja
[0963] (2-1) Rendgenska analiza kristalne strukture antitela ABAM004 koje se vezuje protiv CTLA4 i koje koristi AMP kao prekidač
[0965] Za antitelo ABAM004 koje se vezuje za hCTLA4, koje koristi AMP kao prekidač i dobijeno je iz biblioteke u Primeru 1, analizirane su kristalne strukture samog Fab fragmenta ABAM004, kompleksa Fab fragmenta ABAM004 i AMP, i kompleksa Fab fragmenta ABAM004, AMP i ekstracelularnog domena hCTLA4.
[0966] (2-2) Priprema antitela ABAM004 pune dužine za kristalizaciju
[0968] Priprema i prečišćavanje antitela ABAM004 pune dužine za kristalizaciju sprovedeni su metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[0970] (2-3) Priprema Fab fragmenta za analizu kristalne strukture ABAM004 Fab fragmenta
[0972] Fab fragment ABAM004 je pripremljen konvencionalnom metodom restrikcione digestije sa rLys-C (Promega, kataloški broj V1671), nakon čega je nanet na kolonu sa proteinom A (MabSelect SuRe, GE Healthcare), kolonu za katjonsku izmenu (HiTrap SP HP, GE Healthcare), i kolonu za gel filtraciju (Superdex200 16/60, GE Healthcare) radi uklanjanja Fc fragmenata. Frakcije koje sadrže Fab fragmente su sakupljene i čuvane na -80°C.
[0974] (2-4) Generisanje kristala ABAM004 Fab fragmenta
[0976] Fab fragment ABAM004 za kristalizaciju prečišćen metodom 2-3 je koncentrovan na oko 13 mg/ml i kristalizovan na 20°C tehnikom difuzije pare sedećim kapljicama. Rastvor rezervoara se sastojao od 0,1 M MES, pH 6.5, 25% w/v polietilen glikola 4000. Dobijeni kristali su uronjeni u rastvor 0,08 M MES, pH 6.5, 20% w/v polietilen glikola 4000 i 20% etilen glikola.
[0978] (2-5) Prikupljanje podataka rendgenske difrakcije sa kristala određivanja Fab fragmenta ABAM004 i određivanje strukture
[0980] Podaci difrakcije X-zraka mereni su pomoću BL-17A radijacionog postrojenja, Photon Factory, organizacije High Energy Accelerator Research Organization. Tokom merenja, kristali su stalno držani zamrznuti pod strujom azota na -178°C, a ukupno 360 slika difrakcije X-zraka je prikupljeno pomoću Quantum 270 CCD detektora (ADSC) povezanog sa linijom snopa, uz rotiranje kristala za 0,5° istovremeno. Određivanje parametara ćelije, indeksiranje difrakcionih tačaka i obrada podataka difrakcije sa difrakcionih slika obavljeni su pomoću programa Xia2 (J. Appl. Cryst.43: 186-190 (2010)), XDS package (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) i Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)), i konačno su dobijeni podaci o intenzitetu difrakcije do rezolucije od 1,70 Å. Statistika kristalografskih podataka prikazana je u Tabeli 7.
[0982] Struktura je određena metodom molekularne supstitucije korišćenjem programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). Model pretrage Fab fragmenata je izveden iz objavljene Fab kristalne strukture (PDB kod: 4NKI). Model je napravljen pomoću Coot programa (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) i usavršen pomoću programa Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-467 (2011)). Kristalografski faktor pouzdanosti (R) podataka o intenzitetu difrakcije od 52,92-1,70 Å bio je 16,92%, a vrednost slobodnog R bila je 21,22%. Statistika strukturnog rafiniranja prikazana je u Tabeli 7.
[0984] [Tabela 7]
[0987]
[0990] (2-6) Priprema ABAM004 Fab fragmenta iz antitela pune dužine za analizu kristalne strukture kompleksa ABAM004 Fab fragmenta i AMP, i kompleksa ABAM004 Fab fragmenta, AMP i hCTLA4
[0992] Fab fragment ABAM004 je pripremljen konvencionalnom metodom restrikcione digestije papainom (Roche Diagnostics, kataloški br.1047825), nakon čega je nanet na kolonu sa proteinom A (MabSelect SuRe, GE Healthcare), kolonu za katjonsku izmenu (HiTrap SP HP, GE Healthcare) i kolonu za gel filtraciju (Superdex200 16/60, GE Healthcare) radi uklanjanja Fc fragmenata. Frakcije koje sadrže Fab fragmente su sakupljene i čuvane na -80°C.
[0993] (2-7) Generisanje kristala kompleksa ABAM004 Fab fragmenta i AMP
[0995] Fab fragment ABAM004 za kristalizaciju, prečišćen metodom 2-6, koncentrovan je na oko 13 mg/ml, čemu je dodat AMP da bi se postigla konačna koncentracija od 2 mM, a kristalizacija je izvršena na 20°C tehnikom difuzije pare sedećim kapljicama. Rastvor rezervoara se sastojao od 0,1 M Morpheus pufera 2, pH 7.5, 37,5% w/v MPD_P1K_P3350, 10% Morpheus karboksilnih kiselina (Morpheus, Molecular Dimensions).
[0997] (2-8) Prikupljanje podataka difrakcije X-zraka sa kristala kompleksa Fab fragmenta ABAM004 i AMP i određivanje strukture
[0999] Podaci difrakcije X-zraka mereni su pomoću BL-1A radijacionog postrojenja, Photon Factory, organizacije High Energy Accelerator Research Organization. Tokom merenja, kristali su stalno držani zamrznuti pod strujom azota na -178°C, a 720 slika difrakcije X-zraka je prikupljeno pomoću detektora Pilatus 2M (DECTRIS) povezanog sa linijom snopa, uz rotiranje kristala za 0,25° istovremeno. Određivanje parametara ćelije, indeksiranje difrakcionih tačaka i obrada podataka difrakcije sa difrakcionih slika obavljeni su pomoću programa Xia2 (J. Appl. Cryst.43: 186-190 (2010)), XDS paketa (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) i Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)), i konačno su dobijeni podaci o intenzitetu difrakcije do rezolucije od 1,70 Å. Statistički podaci kristalografskih podataka prikazani su u Tabeli 7.
[1001] Struktura je određena metodom molekularne supstitucije korišćenjem programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). Model pretrage Fab fragmenata je izveden iz objavljene Fab kristalne strukture (PDB kod: 4NKI). Model je napravljen pomoću Coot programa (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) i prečišćen programom Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)). Kristalografski faktor pouzdanosti (R) podataka o intenzitetu difrakcije od 47,33-2,89 Å bio je 19,97%, a vrednost slobodnog R bila je 25,62%. Statistika strukturnog rafiniranja prikazana je u Tabeli 7.
[1003] (2-9) Priprema ekstracelularnog domena hCTLA4
[1005] Ekstracelularni domen hCTLA4 je pripremljen konvencionalnom metodom restrikcione digestije abatacepta pomoću endoproteinaze Lys-C (Roche, kataloški broj 11047825001), nakon čega je nanet na kolonu sa proteinom A (MabSelect SuRe, GE Healthcare) i kolonu za gel filtraciju (Superdex200 10/300, GE Healthcare) radi uklanjanja Fc fragmenata. Frakcije koje sadrže ekstracelularni domen hCTLA4 su sakupljene i čuvane na -80°C.
[1007] (2-10) Priprema kompleksa ABAM004 Fab fragmenta, AMP i hCTLA4 ekstracelularnog domena
[1008] Ekstracelularni domen hCTLA4 prečišćen metodom 2-9 pomešan je sa Fab fragmentom ABAM004 prečišćenim metodom 2-6 u molarnom odnosu od 1,5:1, a zatim je dodat AMP da bi se dobila konačna koncentracija od 2 mM. Kompleks je prečišćen gel filtracionom hromatografijom (Superdex200 10/300, GE Healthcare) korišćenjem kolone uravnotežene sa 25 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 2 mM AMP.
[1010] (2-11) Generacija kristala kompleksa Fab fragmenta ABAM004, AMP i ekstracelularnog domena hCTLA4
[1012] Prečišćeni kompleks je koncentrovan na oko 8 mg/ml i kristalizovan na 20°C tehnikom difuzije pare sedećim kapljicama u kombinaciji sa metodom zasejavanja. Rastvor rezervoara se sastojao od 0,1 M Morfeus pufera 1, pH 6.5, 37,5% w/v M1K3350, 10% halogena (Morpheus, Molecular Dimensions).
[1014] (2-12) Prikupljanje podataka difrakcije X-zraka sa kristala kompleksa Fab fragmenta ABAM004, AMP i hCTLA4 ekstracelularnog domena i određivanje strukture
[1016] Podaci difrakcije X-zraka mereni su pomoću BL32XU pribora SPring-8. Tokom merenja, kristali su stalno držani zamrznuti pod protokom azota od -178°C, a ukupno 180 slika difrakcije X-zraka je prikupljeno korišćenjem CCD detektora MX-225HS (RAYONIX) povezanog sa linijom snopa, uz rotiranje kristala za 1,0° istovremeno. Određivanje parametara ćelije, indeksiranje difrakcionih tačaka i obrada podataka difrakcije sa difrakcionih slika obavljeni su korišćenjem programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 43: 186-190 (2010)), XDS paketa (Acta. Cryst. D66: 125-132 (2010)) i Scala (Acta. Cryst. D62: 72-82 (2006)) i konačno su dobijeni podaci o intenzitetu difrakcije do rezolucije od 1,70 Å. Statistički podaci kristalografskih podataka prikazani su u Tabeli 7.
[1018] Struktura je određena metodom molekularne supstitucije korišćenjem programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). Model pretrage Fab fragmenata izveden je iz objavljene Fab kristalne strukture (PDB kod: 4NKI), a model pretrage hCTLA4 ekstracelularnog domena izveden je iz objavljene humane CTLA4 kristalne strukture (PDB kod: 3OSK, J. Biol. Chem. 286: 6685-6696 (2011)). Model je napravljen pomoću Coot programa (Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)) i prečišćen programom Refmac5 (Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)). Kristalografski faktor pouzdanosti (R) podataka o intenzitetu difrakcije od 52,81-3,09 Å bio je 23,49%, a vrednost slobodnog R bila je 31,02%. Statistika strukturnog rafiniranja prikazana je u Tabeli 7.
[1020] (2-13) Identifikacija mesta interakcije između ABAM004 i AMP
[1022] Kristalna struktura je pokazala da AMP uglavnom prepoznaje teški lanac antitela.
[1024] Adeninski prsten AMP prepoznaju CDR1 i CDR3 teškog lanca, a ribozni deo i fosfatnu grupu prepoznaju CDR1 i CDR2.
[1026] Konkretno, kao što je prikazano na slici 4, deo adeninskog prstena AMP prepoznaju bočni lanci T33 koji pripadaju teškom lancu CDR1 i Y95, L100B i W100C koji pripadaju CDR3, i glavni lanci G96 i M100A antitela. Konkretno, utvrđeno je da karbonilni kiseonici u glavnim lancima G96 i M100A formiraju vodonične veze sa N na poziciji 6 AMP, amidna NH grupa glavnog lanca W100C formira vodoničnu vezu sa N na poziciji 1, a bočni lanci Y95, L100B i W100C formiraju interakciju koristeći pi-elektrone dela adeninskog prstena, tako da antitelo snažno prepoznaje deo adeninskog prstena. Ribozni deo prepoznaje svaki od bočnih lanaca T33 koji pripadaju CDR1 teškog lanca, a Y56 i Y58 koji pripadaju CDR2 putem van der Valsove interakcije i putem interakcije sa pi-elektronima Y56. Pored toga, fosfatni deo prepoznaje svaki od bočnih lanaca T33 koji pripadaju CDR1 teškog lanca i S52, S52A i R53 koji pripadaju CDR2, i glavni lanac S52A. Posebno se smatra da vodonične veze koje formiraju bočni lanac T33 i amidna NH grupa glavnog lanca S52A sa fosfatnim delom i van der Valsovom interakcijom sa S52 i R53 igraju važnu ulogu u prepoznavanju fosfatnog dela. Numerisanje amino-kiselinskih ostataka Fab zasniva se na Kabat šemi numeracije.
[1028] (2-14) Identifikacija epitopa ABAM004
[1030] Na slikama 5 i 6, epitopi kontaktnog regiona ABAM004 Fab su mapirani unutar kristalne strukture hCTLA4 i u amino-kiselinskoj sekvenci, redom. Epitopi sadrže amino-kiselinske ostatke hCTLA4 koji sadrže jedan ili više atoma koji nisu vodonik, a nalaze se unutar 4,2 Å od bilo kog dela ABAM004 Fab ili AMP u kristalnoj strukturi.
[1031] Iz kristalne strukture je postalo jasno da barem M3, E33, R35, T53, E97, M99, Y100, P101, P102, P103, Y104, Y105 i L106 antigene prepoznaju CDR2 i CDR3 teškog lanca, i CDR1 i CDR3 lakog lanca antitela, kao i AMP. Konkretno, petlja koja se sastoji od M99 do Y104 antigena je snažno prepoznata od strane antitela na način koji je zakopan u CDR petlji antitela, i smatra se da petlja igra glavnu ulogu u prepoznavanju antigena od strane antitela.
[1033] (2-15) AMP-zavisni mehanizam vezivanja antigena
[1035] Varijabilni region antitela je ekstrahovan iz kristalne strukture samog ABAM004 Fab, kristalne strukture kompleksa ABAM004 Fab i AMP, i kristalne strukture ternarnog kompleksa koji se sastoji od ABAM004 Fab, AMP i CTLA4, a slika 7 je preklopljena slika ekstrahovanih varijabilnih regiona centriranih oko teškog lanca. Za vezivanje antigena zavisno od AMP, smatra se da je važna ne samo direktna interakcija između AMP i CTLA4 prikazana u primeru 2-14, već i strukturna promena antitela povezana sa vezivanjem AMP.
[1037] Kao što je prikazano na slici 7, poređenjem kristalne strukture samog antitela sa kristalnom strukturom antitela za koje se AMP vezuje, otkriveno je da su se promenile i strukture petlji CDR3 teškog lanca i CDR3 lakog lanca, kao i ugao torzije između teškog i lakog lanca u varijabilnom regionu antitela. Štaviše, poređenjem kristalne strukture antitela za koje se AMP vezuje i kristalne strukture ternarnog kompleksa koji se sastoji od antitela, AMP i CTLA4, takođe se prepoznaje da su strukture CDR3 teškog lanca i CDR1 lakog lanca dodatno promenjene vezivanjem antigena, pokazujući strukturne promene zavisne od antigena. S druge strane, pošto nije došlo do promene u strukturi petlje CDR3 lakog lanca i uglu torzije između teškog i lakog lanca, smatra se da je vezivanje AMP moglo promeniti strukturu antitela u stanje blisko strukturi u vreme vezivanja antigena. Stoga se smatra da su strukturne promene povezane sa vezivanjem AMP neophodne za formiranje odgovarajuće strukture za vezivanje antigena i da igraju važnu ulogu u vezivanju antigena zavisnom od AMP.
[1039] [Primer 3] Generisanje izmenjenih CTLA4 antitela i procena njihove aktivnosti (3-1) Generacija varijanti antitela ABAM004 sa poboljšanom aktivnošću vezivanja za CTLA4
[1040] Sekvenca amino-kiselina ABAM004 (VH SEQ ID NO: 10, VL SEQ ID NO: 11) dobijena iz humane biblioteke faga racionalnog dizajna opisane u Primeru 1 je izmenjena da bi se smanjila aktivnost vezivanja CTLA4 pomenute sekvence u odsustvu ATP analoga, da bi se poboljšala aktivnost vezivanja humanog CTLA4 u prisustvu ATP analoga i da bi se poboljšalo vezivanje za ATP i ATP analoge. Da bi se ovo postiglo, generisane su varijante sa tačkastim mutacijama u ostacima za koje se očekuje da budu uključeni u vezivanje na osnovu kokristalne strukture ABAM004 i AMP i kokristalne strukture ABAM004, AMP i humanog CTLA4 dobijene postupkom opisanim u Primeru 2. Štaviše, generisane su i varijante u kojima je svaka aminokiselina sadržana u CDR zamenjena sa Ala ili Pro. Varijante tačkastih mutacija merene su pomoću Biacore T200 ili Biacore 4000 (GE Healthcare) za aktivnost vezivanja humanog CTLA4 (abatacept i hCTLA4-His-BAP) u odsustvu ATP i u prisustvu ATP, ADP ili AMP, kako bi se skrinirale mutacije koje pojačavaju aktivnost vezivanja. Varijante su pripremljene kombinovanjem mutacija koje su pojačale aktivnost vezivanja, a KD vrednost je izračunata pomoću Biacore-a. Kao rezultat toga, razjašnjeno je da uvođenje supstitucija H32A i S52aT u teški lanac ABAM004 i T24D, T26P i E50F u laki lanac (prema Kabat numeraciji) poboljšava svojstvo vezivanja ABAM004. Varijanta se naziva 04H0150/04L0072 (VH SEQ ID NO: 47, VL SEQ ID NO: 48).
[1041] (3-2) Merenje efekta ATP i njegovih metabolita na aktivnost vezivanja humanog CTLA4 kod ABAM004 i 04H0150/04L0072 pomoću površinske plazmonske rezonance
[1043] Prvo je napravljen čip za merenje Biacore T200. Temperatura Biacore T200 je podešena na 25°C, a brzina protoka na 10 µL/min. HBS-EP+ je korišćen kao pufer za rad. Smeša jednakih zapremina NHS (N-hidroksisukcinimida) i EDC (N-etil-N'-(dimetilaminopropil)karbodiimida) je dodata u senzorski čip CM5 (GE Healthcare) brzinom protoka od 10 µL/min tokom 10 minuta da bi se aktivirale protočne ćelije. Zatim je dodato 25 µg/mL Proteina A/G (Pierce) suspendovanog u 10 mM natrijum acetata pH 4.0 i ostavljeno da se veže brzinom od 10 µL/min tokom 30 minuta. Višak aktivnih grupa na protočnim ćelijama je zatim blokiran dodavanjem 1 M etanolamin-HCl brzinom od 10 µL/min tokom 10 minuta.
[1045] Zatim je izmeren efekat ATP i njegovih metabolita na vezivanje ciljnog antitela za humani CTLA4. Podešena temperatura je bila 25°C, a TBS je korišćen kao pufer za rad.10 mM Glicin-HCl (pH 1.5) je korišćeno kao rastvor za regeneraciju. Nakon što je antitelo suspendovano u TBS zarobljeno, svaka protočna ćelija je ubrizgana TBS rastvorom koji sadrži 500 nM hCTLA4-His-BAP, 10 koncentracija ATP, ADP ili AMP razblaženih u uobičajenom odnosu 4 od 4000 µM i 2 mM MgCl<2>pri brzini protoka od 10 µL/min tokom 3 minuta. Ova 3 minuta su korišćena kao faza vezivanja hCTLA4-His-BAP. Nakon završetka faze vezivanja, ubrizgavanje je prebačeno na pufer za rad tokom 2 minuta, što je korišćeno kao faza disocijacije. Nakon završetka faze disocijacije, rastvor za regeneraciju je ubrizgan brzinom protoka od 30 µL/min tokom 30 sekundi, a gore navedeno je uzeto kao ciklus merenja aktivnosti vezivanja. Količina vezivanja hCTLA4-His-BAP koja je interagovala sa ABAM004 ili 04H0150/04L0072 u fazi vezivanja je korigovana količinom zarobljenog antitela. Rezultati su prikazani na slici 8. Pored toga, u merenju vezivanja ABAM004 i 04H0150/04L0072, koncentracija malih molekula u fazi vezivanja održavana je na 62,5 µM ili 1 mM, a 8 koncentracija hCTLA4-His-BAP razblaženih u uobičajenom odnosu 2 od 2000 nM korišćeno je u fazi vezivanja. KD vrednosti dobijene analizom količine vezivanja hCTLA4-His-BAP prikazane su u Tabeli 8. Za analizu i crtanje podataka korišćeni su Biacore T200 Evaluation Software verzija: 2.0 i Microsoft Excel 2013 (Microsoft). Za izračunavanje KD vrednosti korišćen je model afiniteta u stabilnom stanju.
[1047] [Tabela 8]
[1049]
[1051] SM predstavlja mali molekul (ATP, ADP ili AMP) koji se koristi u svakom testu.
[1053] (3-3) Poboljšanje vezivne sposobnosti uvođenjem sveobuhvatnih izmena
[1055] Da bi se generisala bolja anti-CTLA4 antitela, sveobuhvatne promene amino-kiselina su uvedene u 04H0150/04L0072, što su varijabilni regioni anti-humanog CTLA4 antitela pripremljenog u Primeru 3-1. Varijante u kojima je supstitucija amino-kiselina na svakih 18 amino-kiselina osim cisteina sprovedena u svim CDR 04H0150 i 04L0072 generisane su metodama poznatim stručnjacima u tehnici, kao što je PCR. Merenja oko 1200 varijanti generisanih za vezivanje za humani CTLA4 su izvršena korišćenjem Biacore 4000. Protein A/G (Thermo Fisher Scientific) je imobilizovan na senzorski čip serije S CM5 (GE Healthcare), a antitela su zarobljena na čipu interakcijom supernatanta kulture koji sadrži varijantu antitela. Zatim, rastvor humanog CTLA4 kome je dodat mali molekul (ATP, ADP ili AMP) ili rastvor humanog CTLA4 kome nije dodat mali molekul je ostavljen da interaguje sa antitelom kako bi se procenila sposobnost vezivanja antitela za humani CTLA4 u prisustvu ili odsustvu malog molekula. Test je izveden na 25°C koristeći Tris puferovani fiziološki rastvor, 0,02% PS20 kao pufer za rad.
[1057] Promene koje su poboljšale vezivanje za humani CTLA4 u prisustvu malog molekula i promene koje su smanjile vezivanje za humani CTLA4 u odsustvu malog molekula, pri čemu su promene pronađene korišćenjem gorenavedene metode, kombinovane su da bi se generisala anti-humana CTLA4 antitela koja pokazuju bolje profile. Kod gena teškog lanca antitela 04H0150-G1m (SEQ ID NO: 209), koji ima 04H0150 kao varijabilni region teškog lanca i G1m (SEQ ID NO: 82) u kome su C-terminalni Gly i Lys humanog IgG1 uklonjeni kao konstantni region teškog lanca, promene pronađene uvođenjem sveobuhvatnih promena i promena u okviru su kombinovane da bi se pripremili geni teškog lanca antitela. Kod lakog lanca antitela 04L0072-lam1 (SEQ ID NO: 208) koji ima 04L0072 kao varijabilni region lakog lanca i humani λ lanac lam1 (SEQ ID NO: 87) kao konstantni region lakog lanca, pronađene promene su kombinovane da bi se generisali geni lakog lanca antitela. Štaviše, generisana je i varijanta u kojoj su okvir varijabilnog regiona lakog lanca i konstantni region zamenjeni sekvencom humanog κ lanca. Radi poređenja, gen za teški lanac antitela MDX10D1H-G1m (SEQ ID NO: 210) koji ima varijabilni region teškog lanca MDX10D1H (SEQ ID NO: 154) i gen za laki lanac antitela MDX10D1L-k0MT (SEQ ID NO: 211) koji ima varijabilni region lakog lanca MDX10D1L (SEQ ID NO: 155) postojećeg antihumanog CTLA4 antitela opisanog u WO 0114424 su generisani. Antitela su eksprimovana i prečišćena metodom poznatom stručnjacima u tehnici kombinovanjem ovih gena da bi se generisala anti-CTLA4 antitela od interesa. Tabela 9 navodi SEQ ID NO varijabilnih regiona teškog lanca, varijabilnih regiona lakog lanca, konstantnih regiona teškog lanca, konstantnih regiona lakog lanca i hipervarijabilnih regiona generisanih antitela.
[1059] Antitela ovde su imenovana prema sledećem pravilu: (varijabilni region teškog lanca) - (konstantni region teškog lanca)/(varijabilni region lakog lanca) - (konstantni region lakog lanca). Na primer, to znači da ako je naziv antitela 04H0150-G1m/04L0072-lam1, varijabilni region teškog lanca ovog antitela je 04H0150, konstantni region teškog lanca je G1m, varijabilni region lakog lanca je 04L0072, a konstantni region lakog lanca je lam1.
[1061] Sekvence amino-kiseline teških lanaca, lakih lanaca i njihovih hipervarijabilnih regiona (označeno sa SEQ ID NO:)
[1063] [Tabela 9]
[1066]
[1069] Biacore T200 je korišćen za merenje vezivanja generisanih antitela za humani CTLA4. 20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl<2>, 0.05% Tween 20 sa dodatkom ATP do željene koncentracije je korišćeno kao pufer za rad, a test je izveden na 37°C. Prvo, protein G (CALBIOCHEM) je imobilizovan na senzorski čip serije S CM3 (GE Healthcare), a antitela su zarobljena interakcijom rastvora antitela pripremljenog u puferu za rad bez ATP sa čipom. Zatim, interakcijom sa rastvorom humanog CTLA4 pripremljenim u puferu za rad koji sadrži ATP do željene koncentracije, ili rastvorom humanog CTLA4 pripremljenim u puferu za rad koji ne sadrži ATP, procenjena je sposobnost vezivanja antitela za humani CTLA4 u prisustvu ili odsustvu ATP. Čipovi su regenerisani sa 25 mM NaOH i 10 mM glicin-HCl (pH 1.5), a test je izveden ponovljenim hvatanjem antitela. Konstanta disocijacije svakog antitela za CTLA4 izračunata je pomoću Biacore T200 Evaluation Software 2.0. Konkretno, konstanta brzine vezivanja ka (L/mol/s) i konstanta brzine disocijacije kd (1/s) izračunate su globalnim uklapanjem senzograma dobijenih merenjem, koristeći 1:1 Langmuirov model vezivanja. Konstanta disocijacije KD (mol/L) izračunata je iz tih vrednosti. Alternativno, konstanta disocijacije KD (mol/L) izračunata je pomoću modela stabilnog stanja. Pored toga, količina vezivanja CTLA4 po jedinici količine antitela izračunata je korekcijom količine vezanog CTLA4 izračunate iz senzograma dobijenog testom sa količinom antitela zarobljenog na površini čipa. Tabela 10 prikazuje rezultate ovih testova.
[1071] Analiza vezivanja izmenjenog antitela za humani CTLA4
[1073] [Tabela 10]
[1075]
[1076]
[1078] Vrednost „Vezivanje za humani CTLA4“ u tabeli označava količinu vezivanja humanog CTLA4 po jedinici količine antitela kada je humanom CTLA4 dozvoljeno da interaguje na 1000 nM pod svakim od navedenih uslova koncentracije ATP, a „KD za humani CTLA4 (M)“ označava konstantu disocijacije za humani CTLA4 pod svakim uslovom koncentracije ATP. KD vrednosti označene sa * u tabeli izračunate su korišćenjem modela stabilnog stanja. Pokazano je da su sve varijante pripremljene korišćenjem 04H0150-G1m/04L0072-lam1 kao matičnog antitela imale poboljšano vezivanje u prisustvu ATP u poređenju sa 04H0150-G1m/04L0072-lam1. Pored toga, kao i 04H0150-G1m/04L0072-lam1 i ove varijante imale su veću količinu vezivanja pod uslovom kada je ATP bio prisutan u koncentraciji od 10 µM nego u koncentraciji od 1 µM; i količina vezivanja u prisustvu 100 µM bila je dodatno veća, primećeno je vezivanje za humani CTLA4 na način zavisan od koncentracije ATP. S druge strane, uporedni MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-kOMT nije pokazao takvo vezivanje za humani CTLA4 zavisno od koncentracije ATP. Iako je 04H1077-G1m/04L1305-k0MT u kome su okvir lakog lanca i konstantni region 04H1077-G1m/04L1086-lam1 zamenjeni humanim κ lancem, imao poboljšano vezivanje za humani CTLA4 u odsustvu ATP u poređenju sa 04H1077-G1m/04L1086-lam1, vezivanje zavisno od koncentracije ATP je, takođe, bilo poboljšano. Ovi rezultati su pokazali da se svojstvo vezivanja za humani CTLA4 na način zavisan od ATP održava čak i kada je sekvenca zamenjena sekvencom humanog κ lanca. Među ovde generisanim antitelima, 04H1077-G1m/04L1066-lam1, 04H1077-G1m/04L1305-kOMT i 04H1207-G1m/04L1086-lam1 pokazali su skoro istu aktivnost vezivanja kao postojeće anti-humano CTLA4 antitelo MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-kOMT pod uslovom kada je ATP bio prisutan u koncentraciji od 100 µM, a 04H1208-G1m/04L1407-kOMT pokazao je jaču aktivnost vezivanja od MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT pod uslovom kada je ATP bio prisutan u koncentraciji od 10 µM ili više.
[1080] Zatim, među antitelima pripremljenim u Tabeli 10, procenjeno je vezivanje 04H1077-G1m/04L1086-lam1 i 04H1208-G1m/04L1407-k0MT za mišji CTLA4. Radi poređenja, generisani su gen za teški lanac antitela hUH02-G1d (SEQ ID NO: 212) koji ima varijabilni region teškog lanca hUH02 (SEQ ID NO: 156) anti-mišjeg CTLA4 antitela i gen za laki lanac antitela hUL01-k0 (SEQ ID NO: 213) koji ima varijabilni region lakog lanca hUL01 (SEQ ID NO: 157), a antitelo je eksprimovano, prečišćeno i korišćeno. Test je izvršen korišćenjem Biacore T200 pod istim uslovima kao i merenje vezivanja za humani CTLA4, osim što je mišji CTLA4 korišćen kao uzorak (Tabela 11). Mišji CTLA4 je pripremljen na sledeći način.
[1082] Gen mišjeg ekstracelularnog regiona CTLA4 povezan sa His-oznakom (mCTLA4-His) (SEQ ID NO: 49) je sintetisan i umetnut u životinjski ekspresioni plazmid. Pripremljeni plazmid je unet metodom lipofekcije u liniju FreeStyle 293-F (Invitrogen) izvedenu iz ćelija humanog embrionalnog bubrega, koja je posejana u bočici nakon suspendovanja u FreeStyle 293 ekspresionom medijumu (Invitrogen) pri gustini ćelija od 1,33 x 10<6>ćelija/ml. Apsorbancija prečišćenog rastvora antigena na 280 nm je merena pomoću spektrofotometra. Iz dobijenih izmerenih vrednosti, koncentracija prečišćenog antigena je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije izračunatog PACE metodom (Protein Science (1995) 4, 2411‑2423).
[1084] Analiza vezivanja izmenjenih antitela za mišji CTLA4
[1086] [Tabela 11]
[1088]
[1089]
[1091] Vrednost „Vezivanje za mišji CTLA4“ u tabeli označava količinu vezivanja mišjeg CTLA4 po jedinici količine antitela kada je mišjem CTLA4 dozvoljeno da interaguje na 1000 nM pod svakim od navedenih uslova koncentracije ATP, a „KD za mišji CTLA4 (M)“ označava konstantu disocijacije za mišji CTLA4 pod svakim uslovom koncentracije ATP. Pokazano je da se hUH02-G1d/hUL01-k0 vezuje za mišji CTLA4 u istoj meri bez obzira na koncentraciju ATP, dok je pokazano da se i 04H1077-G1m-04L1086-lam1 i 04H1208-G1m/04L1407-k0MT vezuju za mišji CTLA4 na način zavisan od koncentracije ATP. U poređenju sa sposobnošću vezivanja za humani CTLA4 prikazanom u Tabeli 10, sposobnost vezivanja 4H1077-G1m-04L1086-lam1 za mišji CTLA4 bila je oko 5 puta slabija u poređenju sa sposobnošću vezivanja za humani CTLA4, a sposobnost vezivanja 04H1208-G1m/04L1407-k0MT za mišji CTLA4 bila je oko dva puta slabija u poređenju sa sposobnošću vezivanja za humani CTLA4, u prisustvu 100 µM ATP.
[1093] (3-4) Generisanje kontrolnog anti-mCTLA4 antitela i prekidačkih anti-mCTLA4 antitela
[1094] Generisani su kontrolno antitelo anti-mCTLA4 (hUH02-mFa55/hUL01-mk1, skraćenica: mNS-mFa55) i anti-CTLA4 prekidači (04H1077-mFa55/04L1086-mlOr, skraćenica: SW1077-mFa55; i 04H1208-mFa55/04L1407s-mk1, skraćenica: SW1208-mFa55). U mNS-mFa55 antitelu, korišćeni su varijabilni region teškog lanca hUH02 (SEQ ID NO: 16) i varijabilni region lakog lanca hUL01 (SEQ ID NO: 17), a za konstantne regione korišćeni su konstantni region teškog lanca miša mFa55 (SEQ ID NO: 18) i konstantni region lakog lanca miša divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). U ovom trenutku, korišćen je konstantni region teškog lanca miša kome su dodate izmene radi poboljšanja vezivanja za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1096] U antitelu SW1077-mFa55 korišćeni su varijabilni region teškog lanca 04H1077 (SEQ ID NO: 20) i varijabilni region lakog lanca 04L1086 (SEQ ID NO: 21), a za konstantne regione korišćeni su konstantni region teškog lanca miša mFa55 (SEQ ID NO: 18) i konstantni region lakog lanca miša divljeg tipa ml0r (SEQ ID NO: 22). U ovom trenutku, korišćen je konstantni region teškog lanca miša kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1098] U antitelu SW1208-mFa55, korišćeni su varijabilni region teškog lanca 04H1208 (SEQ ID NO: 23) i varijabilni region lakog lanca 04L1407s (SEQ ID NO: 24), a za konstantne regione korišćeni su konstantni region teškog lanca miša mFa55 (SEQ ID NO: 18) i mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). U ovom trenutku, korišćen je mišji konstantni region teškog lanca kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1100] (3-6) Procena neutrališuće aktivnosti CTLA4 prekidačkog antitela
[1102] Neutralizujuća aktivnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela (SW1077-mFa55) pripremljenog u Primeru 3-4 je procenjena kompetitivnom ELISA metodom. mCTLA4-Fc (SEQ ID NO: 25) u kome je humani konstantni region bio povezan sa mCTLA4 je razblažen na 5 µg/mL (55 nM) sa 0,1 M NaHCO<3>, 0,05% NaN<3>da se pripremi rastvor mCTLA4-Fc. 100 µL svakog pripremljenog rastvora mCTLA4-Fc dodato je na ploču sa 96 ležišta, a ploča je ostavljena da stoji na 4°C preko noći da bi se mCTLA4-Fc imobilisao na površini ploče. Nakon ispiranja 3 puta sa TBS, 0,1% Tween 20, 250 µL rastvora BSA razblaženog na 2% sa TBS dodato je u svako ležište da bi se izvršilo blokiranje površine ploče. Nakon toga, ploča je isprana 3 puta. mCD86-Fc-His (Sino Biologics Inc. 50068-M03H, pristupni broj NP_062261.3) u kome su humani konstantni region i His-oznakom spojeni sa mišjim CD86 razblaženim sa TBS do konačne koncentracije od 55 nM, rastvor antitela SW1077-mFa55 razblažen do konačne koncentracije od 6,25, 1,56, 0,390, 0,0977, 0,0061 i 0 µg/mL, i rastvor ATP razblažen do konačne koncentracije od 0, 1, 10 i 100 µM su pomešani tako da se dobije ukupno 100 µL, smeša je dodata u svako ležište, a ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 1 sata. Svako ležište je zatim isprana 3 puta sa TBS, 0,1% Tween 20, pripremljenim da sadrži istu koncentraciju ATP kao rastvor dodat u svako ležište. U svako ležište je dodato 100 µL anti-His-tag mAb-HRP-Direct (MBL Life Sciences) razblaženog 10000 puta blokirajućim puferom tako da sadrži istu koncentraciju ATP kao rastvor dodat u svako ležište, a ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 1 sata. Svako ležište je zatim isprana 3 puta sa TBS, 0,1% Tween 20, pripremljenim da sadrži istu koncentraciju ATP kao rastvor dodat u svako ležište. U svako ležište je dodato 100 µL TMB rastvora, a ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 1 sata. 50 µL 1 M H<2>SO<4>je dodato u svako ležište da bi se zaustavila reakcija, a apsorbancija na 450 nm je detektovana čitačem apsorbancije mikroploča (Wako Sunrise).
[1104] Vrednost apsorbancije bunara bez antitela pod istim uslovima koncentracije ATP uzeta je kao brzina vezivanja mCTLA4-mCD86 od 100%, a procenjeno je koliko je brzina vezivanja smanjena dodatkom antitela. Rezultati su prikazani na slici 9.
[1106] Iz ovih rezultata je pokazano da neutrališuća aktivnost antitela SW1077 protiv interakcije mCTLA4-mCD86 postaje jača kako se koncentracija ATP u testu povećava. Ovi rezultati su potvrdili da antitelo SW1077 ima neutrališuću aktivnost zavisnu od ATP.
[1108] (3-7) Efikasnost anti-CTLA4 prekidačkog antitela u modelu miša sa transplantiranim singenskim tumorskim ćelijama, povećanje/smanjenje regulatornih T (Treg) ćelija u tumoru i promena markera sistemskog odgovora u slezini
[1110] (3-7-1) Priprema ćelijske linije i modela miša sa transplantiranom singenskom tumorskom linijom
[1111] Korišćene ćelije bile su ćelije linije raka dojke miša FM3A kupljene od RIKEN-a. FM3A ćelije su održavane i pasirane u RPMI 1640 medijumu (Sigma) koji sadrži 10% goveđeg seruma (Thermo Fisher Scientific). Kao miševi, korišćeni su C3H/HeN miševi (ženke, stare 7 nedelja) kupljeni od Charles River Laboratories, Japan. FM3A ćelije su transplantirane pod kožu abdomena miševa, a model je utvrđen kao uspostavljen kada zapremina transplantiranog tumora postane od oko 150 mm<3>do oko 300 mm<3>.
[1113] Zapremina transplantiranog tumora izračunata je pomoću sledeće formule.
[1115] Zapremina tumora = dugi prečnik x kratki prečnik x kratki prečnik / 2
[1116] (3-7-2) Priprema lekova za primenu
[1118] Lekovi koji su primenjeni na model sa transplantiranim ćelijama FM3A bili su kontrolno antitelo protiv mišjeg CTLA4 (mNS-mFa55) i anti-CTLA4 prekidačko antitelo (SW1208-mFa55) pripremljeno u Primeru 3-4. Koristeći His-pufer (20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0), mNS-mFa55 je pripremljen u koncentracijama od 0,0005 mg/ml, 0,005 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,5 mg/ml i 5 mg/ml, a SW1208-mFa55 je pripremljen u koncentracijama od 0,005 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,5 mg/ml, 5 mg/ml i 25 mg/ml, redom.
[1120] (3-7-3) Davanje lekova za merenje antitumorskog efekta
[1122] Devetog dana nakon transplantacije, mNS-mFa55 je davan miševima u dozama od 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,25 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, a SW1208-mFa55 je davan u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg, redom. Pripremljeni rastvori za primenu su davani u dozi od 20 ml/kg preko repne vene.
[1124] Tabela 12 prikazuje detalje lečenja lekovima pri merenju antitumorskog efekta.
[1126] Merenje antitumorskog efekta u modelu transplantacije ćelija FM3A
[1128] [Tabela 12]
[1130]
[1131] (3-7-4) Procena antitumorskog efekta
[1133] Antitumorski efekat je procenjen zapreminom tumora izračunatom formulom opisanom u (3-7-1).
[1134] Vrednost stope inhibicije rasta tumora (TGI: Tumor Growth Inhibition) je izračunata pomoću sledeće formule.
[1136] TGI (%) = (1 - (Srednja zapremina tumora u grupi od interesa u vreme merenja - Srednja zapremina tumora u grupi od interesa u vreme početne primene) / (Srednja zapremina tumora u kontrolnoj grupi u vreme merenja - Srednja zapremina tumora u kontrolnoj grupi u vreme početne primene)) x 100
[1138] Kao rezultat toga, pokazana je efikasnost leka od TGI = 60% ili više 13. dana nakon primene za mNS-mFa55 u dozama od 0,1 mg/kg ili više i za SW1208-mFa55 u dozama od 1 mg/kg ili više (slike 10 i 11).
[1140] (3-7-5) Primena lekova za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskih efekata u slezini
[1141] Sedmog dana nakon transplantacije, davano je kontrolno antitelo protiv mišjeg CTLA4 (mNS-mFa55) preko repne vene u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 100 mg/kg, a davano je i anti-CTLA4 prekidačko antitelo (SW1208-mFa55) preko repne vene u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg. Tabela 13 prikazuje detalje lečenja lekovima za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskih efekata u slezini.
[1143] Verifikacija intratumoralnih i sistemskih efekata u modelu transplantacije ćelija FM3A (mNS-mFa55 i SW1208-mFa55)
[1145] [Tabela 13]
[1147]
[1148]
[1150] (3-7-6) Resekcija tumora i slezine kod miševa sa transplantiranim FM3A ćelijama
[1152] Šestog dana nakon primene antitela, miševi su eutanazirani pod anestezijom, a tumor i slezina su resektovani. Od resektovane slezine, ćelijska suspenzija je pripremljena korišćenjem RPMI-1640 medijuma (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (SIGMA), a zatim je hemolizovana korišćenjem kompleta za lizu eritrocita miša (R&D) da bi se pripremile ćelije slezine. Resektovani tumori su zdrobljeni korišćenjem Tumor Dissociation Kt, mouse (Miltenyi). I ćelije slezine i zgnječeni tumori su reagovali sa sledećim antitelima, a frakcije prisutnih imunih ćelija su analizirane FACS analizom: anti-CD45 antitelo (BD, klon: 30-F11), anti-CD3 antitelo (BD, klon: 145-2C11), anti-CD4 antitelo (BD, klon: RM4-5), anti-FoxP3 antitelo (eBioscience, klon: FJK-16s)), anti-ICOS antitelo (eBioscience, klon: 7E17G9), anti-KLRG1 antitelo (Biolegend, klon: 2F1/KLRG1). FACS analiza je izvršena pomoću BD LSR Fortessa X-20 (BD).
[1154] (3-7-7) Procena tumorskih Treg ćelija u modelu transplantacije ćelija FM3A
[1156] Promene u efektorskim Treg ćelijama (CD4<+>Foxp3<+>KLRG1<+>) u tumoru nakon primene kontrolnog antitela protiv mišjeg CTLA4 (mNS-mFa55) ili anti-CTLA4 prekidačkog antitela (SW1208-mFa55). Kao rezultat toga, i mNS-mFa55 i SW1208-mFa55 su smanjili odnos efektorskih Treg ćelija na manje od 0,2% CD45-pozitivnih ćelija pri dozama od 1 mg/kg i više (Slika 12).
[1158] (3-7-8) Evaluacija sistemskih efekata na slezinu u modelu transplantacije ćelija FM3A Promene u aktiviranim T ćelijama pomagačima (CD4<+>Foxp3<->IKOS<+>) u slezini nakon primene mNS-mFa55 ili SW1208-mFa55 procenjene su FACS analizom. Kao rezultat toga, odnos aktiviranih T ćelija pomagača i CD45-pozitivnih ćelija u slezini značajno se povećao kada je primenjen mNS-mFa55, ali nije bilo značajnog povećanja odnosa aktiviranih T ćelija pomagača i CD45-pozitivnih ćelija u slezini čak ni kada je doza SW1208-mFa55 povećana (Sl.13). Potvrđeno je da, iako je prekidačko antitelo pokazalo istu efikasnost kao kontrolno antitelo, nije izazvalo odgovor u tkivima osim tumora, a dokazan je i koncept ispoljavanja aktivnosti samo lokalno u tumoru in vivo kod miša.
[1160] [Primer 4] Generisanje izmenjenih CTLA4 antitela i procena njihove aktivnosti
[1162] Dalja izmena i evaluacija anti-CTLA4 prekidačkih antitela generisanih u Primeru 3 su sprovedene.
[1163] (4-1) Pojačavanje sposobnosti vezivanja za CTLA4 promenama pojačavanja vezivanja za ATP
[1164] Na osnovu rezultata strukturne analize sprovedene u Primeru 2-1, pokazano je da CDR2 teškog lanca antitela interaguje sa fosfatnom grupom AMP. Smatralo se da kada je mali molekul ATP, γfosfatna grupa može izazvati sternu smetnju za CDR2 teškog lanca. Zatim su amino-kiseline u ovom regionu supstituisane da bi se ispitalo povećanje sposobnosti vezivanja za ATP. Konkretno, 04H1389-G1m/04L1086-lam1 i 04H1382-G1m/04L1086-lam1 su generisani uvođenjem promena R53Q i G55H u varijabilne regione teškog lanca 04H1207-G1m/04L1086-lam1 i 04H1208-G1m/04L1086-lam1 generisanih u Primeru 3. Pored toga, 04H1389-G1m/04L1305-kOMT je generisan zamenom lakog lanca 04H1389-G1m/04L1086-lam1 sekvencom humanog κ lanca. Tabela 14 navodi SEQ ID NO varijabilnih regiona teškog lanca, varijabilnih regiona lakog lanca, konstantnih regiona teškog lanca, konstantnih regiona lakog lanca i hipervarijabilnih regiona ovih antitela.
[1166] Sekvence amino-kiseline teških lanaca, lakih lanaca i njihovih hipervarijabilnih regiona (označeno SEQ ID NO:)
[1167] [Tabela 14]
[1169]
[1171] Biacore T200 je korišćen za procenu vezivanja generisanih varijanti za ATP i za humani CTLA4. Test vezivanja za ATP je izvršen na 37°C koristeći 20 mM ACES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl<2>, 0,05% Tween20 kao pufer za rad. Prvo, Sure Protein A (GE Healthcare) je imobilizovan na Series S Sensor Chip CM3 (GE Healthcare), a antitela su zarobljena na čipu interakcijom sa rastvorom antitela pripremljenim u puferu za rad. Zatim, sposobnost vezivanja za antitelo je procenjena interakcijom sa rastvorom ATP pripremljenim u puferu za rad. Čipovi su regenerisani sa 25 mM NaOH i 10 mM Glycine-HCl (pH 1,5) i test je izvršen ponovljenim hvatanjem antitela. Za količinu vezivanja svakog antitela za ATP, količina vezivanja ATP po jedinici količine antitela je izračunata korekcijom količine vezivanja kada je ATP ubrizgan u koncentraciji od 100 nM sa količinom antitela zarobljenog na površini čipa. Vezivanje za humani CTLA4 je mereno pomoću Biacore T200 metodom opisanom u Primeru 3-3. Tabela 15 prikazuje rezultate ovih merenja.
[1172] Analiza vezivanja za ATP i za humani CTLA4
[1174] [Tabela 15]
[1176]
[1177]
[1179] 04H1389-G1m/04L1086-lam1 i 04H1382-G1m/04L1086-lam1 imali su poboljšanu sposobnost vezivanja za ATP u poređenju sa matičnim antitelima 04H1207-G1m/04L1086-lam1 i 04H1208-G1m/04L1086-lam1 za koja R53Q/G55H nije uveden. Sposobnost vezivanja 04H1389-G1m/04L1086-lam1 i 04H1382-G1m/04L1086-lam1 za humani CTLA4 bila je povećana oko 10 puta u prisustvu 10 µM ATP u poređenju sa matičnim antitelima 04H1207-G1m/04L1086-lam1 i 04H1208-G1m/04L1086-lam1 za koje R53Q/G55H nije uveden. Poređenje količina vezivanja pokazalo je da je sposobnost vezivanja za humani CTLA4 pri nižim koncentracijama ATP bila poboljšana. Pokazalo se da 04H1389-G1m/04L1305-kOMT, u kome je laki lanac 04H1389-G1m/04L1086-lam1 bio supstituisan sekvencom humanog κ lanca, takođe ima ekvivalentnu sposobnost vezivanja ATP i sposobnost vezivanja ATP-zavisnog humanog CTLA4 kao 04H1389-G1m/04L1086-lam1.
[1181] (4-2) Generisanje kontrolnog antitela protiv humanog CTLA4 i anti-CTLA4 prekidačkog antitela i procena njihove sposobnosti vezivanja
[1183] Generisani su kontrolno antitelo protiv humanog CTLA4 (MDX10D1H-mFa55/MDX10D1L-mk1, skraćenica: hNS-mFa55) i antitelo za prekidanje protiv CTLA4 (04H1389-mFa55/04L1305-mk1, skraćenica: SW1389-mFa55). U hNS-mFa55 antitelu korišćeni su varijabilni region teškog lanca MDX10D 1H (SEQ ID NO: 26) i varijabilni region lakog lanca MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), a za konstantne regione korišćeni su mišji konstantni region teškog lanca mFa55 (SEQ ID NO: 18) i mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). U ovom trenutku, korišćen je mišji konstantni region teškog lanca kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1185] U antitelu SW1389-mFa55 korišćeni su varijabilni region teškog lanca 04H1389 (SEQ ID NO: 29) i varijabilni region lakog lanca 04L1305 (SEQ ID NO: 30), a za konstantne regione korišćeni su mišji konstantni region teškog miša mFa55 (SEQ ID NO: 18) i mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). U ovom trenutku, korišćen je mišji konstantni region teškog lanca kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1187] Vezivanje generisanih hNS-mFa55 i SW1389-mFa55 za humani CTLA4 je procenjeno. 20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl<2>, 0.05% Tween 20 sa ATP dodatim do željenih koncentracija je korišćeno kao pufer za rad, a test je izveden na 37°C. Prvo, zečji anti-mišji IgG (Thermo Fisher Scientific) je imobilizovan na senzorskim čipovima serije S CM5 (GE Healthcare), a antitelo je zarobljeno na čipu interakcijom sa rastvorom antitela pripremljenim u puferu za rad bez ATP. Zatim, sposobnost vezivanja antitela za humani CTLA4 u prisustvu ili odsustvu ATP je procenjena interakcijom sa rastvorom humanog CTLA4 pripremljenim u puferu za rad sa dodatkom ATP do željene koncentracije, ili rastvorom humanog CTLA4 pripremljenim u puferu za rad bez ATP. Čipovi su regenerisani sa 25 mM NaOH i 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) i test je izveden ponovljenim hvatanjem antitela. Konstanta disocijacije svakog antitela za CTLA4 je izračunata pomoću Biacore T200 Evaluation Software 2.0. Konkretno, konstanta brzine vezivanja ka (L/mol/s) i konstanta brzine disocijacije kd (1/s) izračunate su globalnim uklapanjem senzograma dobijenih merenjem korišćenjem 1:1 Langmirovog modela vezivanja, a konstanta disocijacije KD (mol/L) je izračunata iz tih vrednosti. Tabela 16 prikazuje rezultate ovih analiza.
[1188] Analiza vezivanja varijanti sa mišjim konstantnim regionima za humani CTLA4
[1190] [Tabela 16]
[1192]
[1193] Potvrđeno je da se oba antitela generisana korišćenjem mišjih konstantnih regiona vezuju za humani CTLA4. Takođe je pokazano da se SW1389-mFa55 vezuje za humani CTLA4 na ATP-zavisan način, slično kao 04H1389-G1m/04L1305-kOMT generisani korišćenjem istog varijabilnog regiona i humanog konstantnog regiona prikazanog u Tabeli 15.
[1195] (4-3) Efikasnost svakog od anti-CTLA4 prekidačkih antitela i anti-CTLA4 neprekidačkih antitela u singenskom modelu transplantacije tumorskih ćelija korišćenjem humanog CTLA4 nokauta, humanog CD3 transgenog miša, povećanje/smanjenje Treg ćelija u tumoru i promena markera sistemskog odgovora u slezini
[1197] (4-3-1) Ćelijska linija
[1199] Korišćene su ćelije Hepa1-6/hGPC3. Ova ćelijska linija je dobijena kupovinom ćelija mišje linije raka jetre Hepa1-6 od ATCC, koje konstitutivno eksprimuju humani gen Glypican 3 (hGPC3, SEQ ID NO: 181) transfekcijom i kloniranjem. Ćelije Hepa1-6/hGPC3 su održavane i pasirane u D-MEM (visokoglukoznom) medijumu (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (SIGMA) i 600 µg/mL GENETICIN-a (Gibco).
[1201] (4-3-2) Priprema modela miša sa transplantiranom singenskom tumorskom linijom
[1203] Humani CTLA4 KI, korišćeni su miševi sa zamenjenim humanim CD3 EDG (hCTLA4 KI hCD3 EDG-zamenjeni miševi), koji su hibridi humanog CTLA4 knock-in miša (Blood (2005) 106 (9): 3127‑3133) i miša sa zamenjenim CD3 EDG genom, generisanog u sopstvenoj laboratoriji (Sci Rep (2017) 7: 45839). Ćelije Hepa1-6/hGPC3 su supkutano transplantirane u miševe kojima je zamenjen hCTLA4 KI hCD3 EDG, a model je utvrđen kao uspostavljen kada je prosečna zapremina transplantiranih tumora dostigla približno 200 mm<3>do približno 400 mm<3>.
[1205] Zapremina transplantiranog tumora izračunata je pomoću sledeće formule.
[1207] Zapremina tumora = dugi prečnik x kratki prečnik x kratki prečnik / 2
[1208] (4-3-3) Priprema lekova za primenu
[1210] Kao lekovi koji se primenjuju na modelu sa transplantacijom ćelija Hepa1-6/hGPC3, antitelo protiv CTLA4 prekidača (SW1389-mFa55) i kontrolno antitelo protiv humanog CTLA4 (hNS mFa55) pripremljeni u Primeru 4-2 pripremljeni su u koncentracijama od 0,01, 0,1, 1, 5, 10 i 20 mg/ml i 0,01, 0,1, 1 i 3 mg/ml, redom, koristeći His pufer (150 mM NaCl/20 mM His-HCl pufer, pH 6.0).
[1212] (4-3-4) Primena lekova za merenje antitumorskog efekta
[1214] Sedmog dana nakon transplantacije, SW1389-mFa55 je davano miševima u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 100 mg/kg, a hNS-mFa55 je davano u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg preko repne vene. Tabela 17 prikazuje detalje lečenja lekovima pri merenju antitumorskog efekta.
[1216] Merenje antitumorskog efekta u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3
[1218] [Tabela 17]
[1220]
[1222] (4-3-5) Procena antitumorskog efekta
[1224] Antitumorski efekat je procenjen zapreminom tumora izračunatom formulom opisanom u (4-3-2). Za statističku analizu je korišćen JMP 11.2.1 (SAS Institute Inc.).
[1226] Vrednost TGI (inhibicija rasta tumora) je izračunata pomoću sledeće formule.
[1227] TGI = (1 - (Srednja vrednost zapremine tumora u grupi od interesa u vreme merenja - Srednja vrednost zapremine tumora pre primene antitela) / (Srednja vrednost zapremine tumora u kontrolnoj grupi u vreme merenja - Srednja vrednost zapremine tumora pre primene antitela)) x 100
[1229] Kao rezultat toga, i hNS-mFa55 i SW1389-mFa55 pokazali su efikasnost leka od TGI = 60 ili više 18. dana nakon primene u dozama od 1 mg/kg ili više (slike 14 i 15).
[1231] (4-3-6) Primena lekova za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskih efekata u slezini
[1232] Sedmog dana nakon transplantacije, SW1389-mFa55 je davan miševima u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg i 500 mg/kg preko repne vene, a hNS-mFa55 je dat u dozama od 0,1 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg i 30 mg/kg preko repne vene. Tabela 18 prikazuje detalje lečenja lekovima za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskih efekata u slezini.
[1234] Verifikacija intratumoralnih i sistemskih efekata u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3 (hNS-mFa55 i SW1389-mFa55)
[1236] [Tabela 18]
[1238]
[1239] (4-3-7) Resekcija tumora i slezine kod miševa sa transplantiranim ćelijama Hepa1-6/hGPC3
[1240] Šestog dana nakon primene antitela, miševi su eutanazirani pod anestezijom, a tumori i slezina su resektovani. Od resektovanih slezina, ćelijska suspenzija je pripremljena korišćenjem RPMI-1640 medijuma (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (SIGMA), a zatim je hemolizovana korišćenjem kompleta za lizu eritrocita miša (R & D) da bi se pripremile ćelije slezine. Resektovani tumori su zdrobljeni korišćenjem kompleta za disocijaciju tumora, miš (Miltenyi). I ćelije slezine i zgnječeni tumori su reagovali sa sledećim antitelima, a frakcije prisutnih imunih ćelija su analizirane FACS analizom: anti-CD45 antitelo (BD, klon: 30-F11), anti-CD3 antitelo (BD, klon: UCHT1), anti-CD4 antitelo (BD, klon: RM4-5), anti-FoxP3 antitelo (eBioscience, klon: FJK-16s), anti-ICOS antitelo (eBioscience, klon: 7E17G9), anti-CCR7 antitelo (Biolegend, klon: 4B12), anti-KLRG1 antitelo (Biolegend, klon: 2F1/KLRG1). FACS analiza je izvršena pomoću BD LSR Fortessa X-20 (BD).
[1242] (4-3-8) Procena tumorskih Treg ćelija u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3
[1243] Promene u efektorskim Treg ćelijama (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<low>KLRG1<+>) u tumoru su procenjene nakon primene SW1389-mFa55 ili hNS-mFa55. Kao rezultat toga, i hNS-mFa55 i SW1389-mFa55 su smanjili odnos efektorskih Treg ćelija na manje od 0,2% CD45-pozitivnih ćelija pri dozama od 1 mg/kg ili više (Slika 16).
[1245] (4-3-9) Evaluacija sistemskog efekta u slezini kod modela transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3
[1246] Promene u aktiviranim pomoćnim T ćelijama (CD4<+>Foxp3<->IKOS<+>) u slezini nakon primene hNS-mFa55 ili SW1389-mFa55 procenjene su FACS analizom. Kao rezultat toga, odnos aktiviranih T ćelija pomagača i CD45-pozitivnih ćelija u slezini značajno se povećao kada je primenjen hNS-mFa55, ali nije primećeno značajno povećanje aktiviranih T ćelija pomagača u slezini kada je primenjen SW1389-mFa55, čak ni kada je doza primene povećana (Sl.17). Ovo je potvrdilo da je prekidačko antitelo pokazalo istu efikasnost kao kontrolno antitelo, ali nije izazvalo odgovor u tkivima osim tumora. Dakle, dokazan je koncept pokazivanja aktivnosti samo lokalno u tumoru in vivo kod humanih CTLA4 KI miševa.
[1248] (4-4) Generisanje kontrolnog antitela protiv CTLA4 i anti-CTLA4 prekidačkog antitela za test toksičnosti kod cynomolgus majmuna
[1249] Generisani su kontrolno antitelo protiv CTLA4 (MDX10D1H-Kn125/MDX10D1L-k0MT//MDX10D1H-Hl076/MDX10D1Lk0MT, skraćenica: NS-ART1) i anti-CTLA4 prekidačko antitelo (04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-H1076/04L1305-k0MT skraćenica: SW1389-ART1). U NS-ART1 antitelu, korišćeni su varijabilni region teškog lanca MDX10D1H (SEQ ID NO: 26) i varijabilni region lakog lanca MDX10D1L (SEQ ID NO: 27), a za konstantne regione, konstantni region humanog teškog lanca Kn125 (SEQ ID NO: 31) i konstantni region humanog teškog lanca Hl076 (SEQ ID NO: 32) opisani u prethodnoj patentnoj literaturi. WO 2013/002362, i korišćeni su konstantni region humanog lakog lanca k0MT (SEQ ID NO: 33). U ovom trenutku, korišćen je konstantni region humanog teškog lanca kome su dodate izmene da bi se pojačalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1251] U antitelu SW1389-ART1 korišćeni su varijabilni region teškog lanca 04H1389 (SEQ ID NO: 29) i varijabilni region lakog lanca 04L1305 (SEQ ID NO: 30), a za konstantne regione korišćeni su konstantni region humanog teškog lanca Kn125 (SEQ ID NO: 31) i konstantni region humanog teškog lanca Hl076 (SEQ ID NO: 32), i konstantni region humanog lakog lanca k0MT (SEQ ID NO: 33). U ovom trenutku, korišćen je konstantni region humanog teškog lanca kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1253] Heterodimerizovana antitela (antitela koja imaju dva različita polipeptida teškog lanca i/ili dva različita polipeptida lakog lanca) su ovde imenovana prema sledećem pravilu: (Prvi varijabilni region teškog lanca)-(Prvi konstantni region teškog lanca)/(Prvi varijabilni region lakog lanca)-(Prvi konstantni region lakog lanca)//(Drugi varijabilni region teškog lanca)-(Drugi konstantni region teškog lanca)/(Drugi varijabilni region lakog lanca)-(Konstantni region drugog lakog lanca). Na primer, ako je naziv antitela 04H1389-Kn125/04L1305-k0MT//04H1389-H1076/04L1305-k0MT, to znači da je u ovom antitelu prvi varijabilni region teškog lanca 04H1389, prvi konstantni region teškog lanca je Kn125, prvi varijabilni region lakog lanca je 04L1305, prvi konstantni region lakog lanca je k0MT, drugi varijabilni region teškog lanca je 04H1389, drugi konstantni region teškog lanca je Hl076, drugi varijabilni region lakog lanca je 04L1305, a drugi konstantni region lakog lanca je k0MT.
[1254] (4-5) Sprovođenje testa toksičnosti kod majmuna cynomolgus
[1256] Da bi se procenila i uporedila toksičnost, uključujući sistemski odgovor, antitelo NS-ART1 ili antitelo SW1389-ART1 pripremljeno u Primeru 4-4 je davano mužjacima cynomolgus majmuna (po 3 slučaja) u dozi od 60 mg/kg, jednom nedeljno, ukupno 5 puta. Primena je vršena polako intravenozno pomoću špric pumpe, a obavljeno je posmatranje opšteg stanja, merenje telesne težine, test krvi/hemijskog sastava krvi, test koštane srži, patološki pregled i merenje koncentracije leka u plazmi.
[1258] Pojava antitela protiv leka je primećena tokom perioda primene oba antitela, ali je izloženost održana do kraja perioda primene. Primena NS-ART1 antitela je rezultirala sistemskim promenama sličnim autoimunim bolestima, kao što su pojava autoantitela, inflamatorne promene (vaskulitis, infiltracija inflamatornih ćelija), anemijske promene i aktivacija T ćelija, dok gore navedene promene nisu primećene kod primene SW1389-ART1 antitela. Ovi rezultati ukazuju da SW1389-ART1 antitelo ima smanjenu toksičnost in vivo.
[1260] [Primer 5] Generisanje izmenjenih CTLA4 antitela i procena njihove aktivnosti
[1262] Dalja izmena i evaluacija anti-CTLA4 prekidačkih antitela pripremljenih u Primeru 4 su sprovedene.
[1264] (5-1) Optimizacija antitela uvođenjem sveobuhvatnih izmena i supstitucijom okvira
[1266] Promene amino-kiselina su sveobuhvatno uvedene u CDR 04H1389-G1m/04L1086-lam1, a istražene su i promene sa boljim profilima. Sveobuhvatno uvođenje i evaluacija promena aminokiselina su izvršeni korišćenjem metode opisane u Primeru 3-3. Generisane su varijante u kojima je uvedena kombinacija promena otkrivenih ovde i zamenjeni su Okviri. Tabela 19 navodi SEQ ID NO varijabilnih regiona teškog lanca, varijabilnih regiona lakog lanca, konstantnih regiona teškog lanca, konstantnih regiona lakog lanca i hipervarijabilnih regiona ovih antitela. Laki lanci 04L1594-lam1, 04L1581-lam1, 04L1610-lam1, 04L1612-lam1 i 04L1610-lam1 u Tabeli 19 su uvedeni sa izmenama u CDR i okvirima u poređenju sa lakim lancem matičnog antitela 04L1086-lam1, i imaju okvire i konstantni region germinativnih sekvenci humanog λ lanca. Pored toga, 04L1615-k0MT, 04L1616-k0MT i 04L1617-k0MT imaju izmene uvedene u CDR-ove 04L1086-lam1 i imaju okvire i konstantni region germinativnih sekvenci humanog κ lanca. Varijabilni region teškog lanca 04H1389v373 je onaj koji je uveden sa izmenama u CDR varijabilnog regiona teškog lanca 04H1389 matičnog antitela. Varijabilni regioni teškog lanca 04H1637, 04H1643, 04H1654, 04H1656, 04H1642 i 04H1735 imaju izmene uvedene u CDR-ove 04H1389, kao i supstitucije okvirnih sekvenci sa onima iz druge germinativne linije.
[1268] Sekvence amino-kiseline teških lanaca, lakih lanaca i njihovih hipervarijabilnih regiona (označeno SEQ ID NO:)
[1270] [Tabela 19]
[1272]
[1273]
[1275] Aktivnost vezivanja generisanih varijanti za humani CTLA4 je procenjena metodom opisanom u Primeru 3-3 (Tabela 20).
[1276] Analiza vezivanja za humani CTLA4
[1277] [Tabela 20]
[1278]
[1279] Vrednosti KD u tabeli označene sa * izračunate su korišćenjem modela stabilnog stanja. Pokazano je da se sve varijante pripremljene korišćenjem 04H1389-G1m/04L1086-lam1 kao matičnog antitela vezuju za humani CTLA4 na ATP-zavisan način i imaju jaču sposobnost vezivanja od matičnog antitela sa KD od 3,7 x 10<-8>M pod uslovom kada je ATP prisutan u koncentraciji od 10 µM. Takođe je pokazano da sva ova antitela imaju sposobnost vezivanja jaču od postojećeg antihumanog CTLA4 antitela MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT pod uslovom kada je ATP prisutan u koncentraciji od 10 µM.
[1281] Sposobnost vezivanja generisanih varijanti za humani CTLA4 u prisustvu ADP ili AMP je procenjena pomoću Biacore T200 i upoređena sa sposobnošću vezivanja u prisustvu ATP. Sposobnost vezivanja za humani CTLA4 u prisustvu ADP ili AMP je merena korišćenjem postupka opisanog u Primeru 3-3, kao u proceni sposobnosti vezivanja u prisustvu ATP, ali korišćenjem ADP ili AMP umesto ATP (Tabela 21).
[1283] Procena zavisnosti od ATP, ADP i AMP
[1284] [Tabela 21]
[1285]
[1286] Postojeće humano CTLA4 antitelo MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-kOMT pokazalo je slične kinetičke parametre bez obzira na vrstu i prisustvo malih molekula, dok su se sva ATP-zavisna anti-CTLA4 antitela vezala za humani CTLA4 ne samo u prisustvu ATP već i u prisustvu ADP ili AMP, a sposobnost vezivanja u prisustvu ovih malih molekula bila je veća od sposobnosti vezivanja u odsustvu malih molekula prikazanih u Tabeli 20. Stoga je pokazano da su ova antitela antitela koja se vezuju za CTLA4 na ATP-, ADP- i AMP-zavisan način. Ova antitela su imala najveću sposobnost vezivanja u prisustvu ATP, zatim najveću sposobnost vezivanja u prisustvu ADP i najnižu sposobnost vezivanja u prisustvu AMP. U svim slučajevima, sposobnost vezivanja u prisustvu ADP bila je oko 3 puta jača od sposobnosti vezivanja u prisustvu AMP, a sposobnost vezivanja u prisustvu ATP bila je oko 5 puta jača od sposobnosti vezivanja u prisustvu AMP. Vrednost ka je bila slična u prisustvu bilo kog od malih molekula, ali je postojala razlika u vrednosti kd. Pošto je disocijacija u prisustvu ADP bila brža nego u prisustvu ATP, a dalja disocijacija u prisustvu AMP bila je brža nego u prisustvu ADP, pokazano je da je razlika u vrednosti KD u zavisnosti od vrste malog molekula posledica razlike u brzini disocijacije.
[1288] Zatim je procenjena sposobnost vezivanja nekih varijanti za mišji CTLA4 i CTLA4 majmuna cynomolgus. Aktivnost vezivanja za humani CTLA4, mišji CTLA4 i CTLA4 majmuna cynomolgus procenjena je korišćenjem Biacore T200 metodom opisanom u Primeru 3-3 (Tabela 22). CTLA4 majmuna cynomolgus je pripremljen sledećim metodom.
[1290] Gen CyCTLA4-His-BAP (SEQ ID NO: 50), koji je fuzija His-oznake i BAP-oznake na C-terminusu ekstracelularnog regiona cynomolgus majmuna CTLA4, sintetisan je i umetnut u životinjski ekspresioni plazmid. Pripremljeni plazmid je unet metodom lipofekcije u liniju FreeStyle 293-F (Invitrogen) izvedenu iz ćelija humanog embrionalnog bubrega, koja je posejana u bočici nakon suspendovanja u FreeStyle 293 ekspresionom medijumu (Invitrogen) pri gustini ćelija od 1,33 x 10<6>ćelija/ml. Tri sata nakon transfekcije plazmida, dodat je biotin do konačne koncentracije od 100 µM, ćelije su kultivisane u CO<2>inkubatoru (37°C, 8% CO<2>, 125 rpm) tokom 4 dana, a antigen je prečišćen metodom poznatom stručnjacima u tehnici iz supernatanta kulture svakog uzorka. Apsorbancija prečišćenih rastvora antigena na 280 nm je merena pomoću spektrofotometra. Iz dobijenih izmerenih vrednosti, koncentracija prečišćenog antigena je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije izračunatog PACE metodom (Protein Science (1995) 4, 2411‑2423).
[1291] Analiza vezivanja za humani, mišji i CTLA4 cynomolgus majmuna [Tabela 22] Pokazano je da se svih šest procenjenih antitela na CTLA4, zavisnih od malih molekula, vezuju ne samo za humani CTLA4, već i za mišji CTLA4 i za CTLA4 cynomolgus majmuna na ATP-zavisan način.
[1293] (5-2) Generisanje izmenjenih anti-CTLA4 prekidačkih antitela i negativnog kontrolnog antitela
[1294] Generisana su izmenjena anti-CTLA4 antitela tipa prekidača (04H1654-mFa55m2P1/04L1610-ml0r//04H1656-mFa55m2N1/04L1610-ml0r, skraćenica: SW1610-mFa55; 04H1654-mFa55m2P1/04L1612-ml0r//04H1656-mFa55m2N1/04L1612-ml0r, skraćenica: SW1612-mFa55; i 04H1389-mFa55/04L1615-mk1, skraćenica: SW1615-mFa55), i antitelo negativne kontrole (IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1, skraćenica: KLH-mFa55).
[1296] U antitelu SW1615-mFa55, korišćeni su varijabilni region teškog lanca 04H1389 (SEQ ID NO: 29) i varijabilni region lakog lanca 04L1615 (SEQ ID NO: 34), a za konstantne regione korišćeni su mišji konstantni region teškog lanca mFa55 (SEQ ID NO: 18) i mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). U ovom trenutku, korišćen je mišji konstantni region teškog lanca kome su dodate izmene da bi se poboljšalo vezivanje za Fcγ receptor. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1298] U antitelu SW1610-mFa55, kao konstantni regioni, jedan varijabilni region teškog lanca 04H1654 (SEQ ID NO: 35) je povezan sa mišji konstantnim regionom teškog lanca mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36), drugi varijabilni region teškog lanca 04H1656 (SEQ ID NO: 37) je povezan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca mFa55m2N1 (SEQ ID NO: 38), a za varijabilni region lakog lanca 04L1610 (SEQ ID NO: 39) korišćen je mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa ml0r (SEQ ID NO: 22). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1300] U antitelu SW1612-mFa55, kao konstantni regioni, jedan varijabilni region teškog lanca 04H1654 (SEQ ID NO: 35) je povezan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca mFa55m2P1 (SEQ ID NO: 36), drugi varijabilni region teškog lanca 04H1656 (SEQ ID NO: 37) je povezan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca mFa55m2N1 (SEQ ID NO: 38), a za varijabilni region lakog lanca 04L1612 (SEQ ID NO: 40) korišćen je mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa ml0r (SEQ ID NO: 22). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1302] U antitelu negativne kontrole, kao konstantni regioni, varijabilni region teškog lanca IC17Hdk (SEQ ID NO: 51) je povezan sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca mFa55 (SEQ ID NO: 18), a za varijabilni region lakog lanca IC17L (SEQ ID NO: 52) korišćen je mišji konstantni region lakog lanca divljeg tipa mk1 (SEQ ID NO: 19). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1304] (5-3) Procena sposobnosti vezivanja antitela koja imaju mišji konstantni region za humani CTLA4
[1305] Sposobnost anti-CTLA4 antitela koja imaju mišji konstantni region da se vežu za antigen procenjena je postupkom opisanim u Primeru 4-2 (Tabela 23). Pokazano je da sva ova antitela koja imaju mišji konstantni region imaju istu ATP-zavisnu sposobnost vezivanja za humani CTLA4 kao antitela prikazana u Tabeli 22 koja imaju isti varijabilni region, ali imaju humani konstantni region.
[1306] Analiza vezivanja varijanti sa mišjim konstantnim regionima za humani CTLA4
[1308] [Tabela 23]
[1310]
[1312] (5-4) Efikasnost anti-CTLA4 prekidačkih antitela u singenskom modelu transplantacije tumorskih ćelija korišćenjem humanog CTLA4 nokauta, humanog CD3 transgenog miša, povećanje/smanjenje Treg ćelija u tumoru i promena markera sistemskog odgovora u slezini (5-4-1) Ćelijska linija
[1314] Korišćene su ćelije Hepa1-6/hGPC3. Ova ćelijska linija je dobijena kupovinom ćelija mišje linije raka jetre Hepa1-6 od ATCC, konstitutivnom ekspresijom humanog gena Glypican 3 (hGPC3) transfekcijom i kloniranjem. Ćelije Hepa1-6/hGPC3 su održavane i pasirane u D-MEM (visokoglukoznom) medijumu (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (Sigma) i 0,6 mg/mL G418 (Nacalai Tesque).
[1316] (5-4-2) Generisanje modela miša sa transplantiranom singenskom tumorskom linijom
[1317] Korišćeni su humani CTLA4 KI, miševi sa zamenom humanog CD3 EDG gena (hCTLA4 KI hCD3 EDG-zamenjeni miševi), koji su hibrid humanog CTLA4 nokaut miša (Blood (2005) 106 (9): 3127‑3133) i miša sa zamenjenim CD3 EDG genom, generisan u sopstvenoj laboratoriji (Sci Rep (2017) 7: 45839). Ćelije Hepa1-6/hGPC3 su supkutano transplantirane u miševe kojima je zamenjen hCTLA4 KI hCD3 EDG, a model je utvrđen kao uspostavljen kada je srednja zapremina transplantiranih tumora dostigla približno 200 mm<3>do približno 400 mm<3>.
[1319] Zapremina transplantiranog tumora izračunata je pomoću sledeće formule.
[1321] Zapremina tumora = dugi prečnik x kratki prečnik x kratki prečnik / 2
[1322] (5-4-3) Priprema lekova za primenu
[1324] Lekovi koji su primenjeni na model sa transplantiranim ćelijama Hepa1-6/hGPC3 bila su anti-CTLA4 prekidačka antitela (SW1610-mFa55, SW1612-mFa55, SW1615-mFa55) pripremljena u Primeru 5-2. Lekovi za primenu su pripremljeni korišćenjem His-pufera (20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0) tako da budu 0,03 mg/ml, 0,1 mg/ml i 0,3 mg/ml.
[1326] (5-4-4) Primena lekova za merenje antitumorskog efekta
[1328] Osmog dana nakon transplantacije, miševima su data tri uzorka anti-CTLA4 prekidačkih antitela u dozama od 0,3 mg/kg, 1 mg/kg i 3 mg/kg, redom, preko repne vene. Tabela 24 prikazuje detalje lečenja lekovima pri merenju antitumorskog efekta.
[1329] Merenje antitumorskog efekta u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3 (anti-CTLA4 prekidačka antitela)
[1331] [Tabela 24]
[1333]
[1335] (5-4-5) Procena antitumorskog efekta
[1337] Antitumorski efekat je procenjen zapreminom tumora izračunatom formulom opisanom u (5-4-2).
[1338] Vrednost stope inhibicije rasta tumora (TGI: Tumor Growth Inhibition) je izračunata pomoću sledeće formule.
[1340] TGI (%) = (1 - (Srednja vrednost zapremine tumora u grupi od interesa u vreme merenja - Srednja vrednost zapremine tumora u grupi od interesa u vreme početne primene) / (Srednja vrednost zapremine tumora u kontrolnoj grupi u vreme merenja - Srednja vrednost zapremine tumora u kontrolnoj grupi u vreme početne primene)) x 100
[1342] Kao rezultat toga, SW1610-mFa55 i SW1612-mFa55 su pokazali efikasnost leka od TGI = 60% ili više 16. dana nakon primene u dozama od 1 mg/kg ili više i SW1615-mFa55 u dozama od 3 mg/kg ili više (slike 18 do 20).
[1343] (5-4-6) Primena lekova za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskog efekta u slezini
[1344] Desetog dana nakon transplantacije, miševima je davan SW1610-mFa55 u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, SW1612-mFa55 u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg i 200 mg/kg, a SW1615-mFa55 u dozama od 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg i 400 mg/kg preko repne vene. Pored toga, za kontrolnu grupu, antitelo negativne kontrole IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1 (skraćenica: KLH-mFa55) je davano u dozi od 400 mg/kg preko repne vene. Tabela 25 prikazuje detalje lečenja lekovima za procenu Treg ćelija u tumoru i verifikaciju sistemskih efekata u slezini.
[1345] Verifikacija intratumoralnih i sistemskih efekata u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3 (anit-CTLA4 prekidačko antitelo)
[1347] [Tabela 25]
[1349]
[1350] (5-4-7) Resekcija tumora i slezine kod miševa sa transplantiranim ćelijama Hepa1-6/hGPC3
[1351] Šestog dana nakon primene antitela, miševi su eutanazirani pod anestezijom, a tumori i slezina su resektovani. Od resektovanih slezina, ćelijska suspenzija je pripremljena korišćenjem RPMI-1640 medijuma (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (SIGMA), a zatim je hemolizovana korišćenjem kompleta za lizu eritrocita miša (R & D) da bi se pripremile ćelije slezine. Resektovani tumori su zdrobljeni korišćenjem kompleta za disocijaciju tumora, miša (Miltenyi). I ćelije slezine i zgnječeni tumori su reagovali sa sledećim antitelima, a frakcije prisutnih imunih ćelija su analizirane FACS analizom: anti-CD45 antitelo (BD, klon: 30-F11), anti-CD3 antitelo (BD, klon: UCHT1), anti-CD4 antitelo (BD, klon: RM4-5), anti-FoxP3 antitelo (eBioscience, klon: FJK-16s), anti-ICOS antitelo (eBioscience, klon: 7E17G9), anti-CCR7 antitelo (Biolegend, klon: 4B12), anti-KLRG1 antitelo (Biolegend, klon: 2F1/KLRG1). FACS analiza je izvršena pomoću BD LSR Fortessa X-20 (BD).
[1353] (5-4-8) Procena tumorskih Treg ćelija u modelu transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3
[1354] Promene u efektorskim Treg ćelijama (CD4<+>Foxp3<+>CCR7<low>KLRG1<+>) u tumorima nakon primene anti-CTLA4 prekidačkih antitela su procenjene. Kao rezultat toga, SW1610-mFa55, SW1612-mFa55 i SW1615-mFa55 su smanjili odnos efektorskih Treg ćelija na manje od 0,2% CD45-pozitivnih ćelija u svim primenjenim dozama (Slika 21).
[1356] (5-4-9) Evaluacija sistemskog efekta u slezini kod modela transplantacije ćelija Hepa1-6/hGPC3
[1357] Promene u aktiviranim pomoćnim T ćelijama (CD4<+>Foxp3<->ICOS<+>) u slezini nakon primene anti-CTLA4 prekidačkih antitela procenjene su FACS analizom. Kao rezultat toga, odnos aktiviranih T ćelija pomagača i CD45-pozitivnih ćelija u slezini nije značajno povećan pri 50 mg/kg procenjenih doza za SW1610-mFa55 i SW1612-mFa55 i pri 200 mg/kg ili manje procenjenih doza za SW1615-mFa55. Danetov test je sproveden na grupi kojoj je primenjen KLH-mFa55 koristeći JMP 11.2.1 (SAS Institute Inc.) za test značajnosti (Sl.22). Potvrđeno je da, iako su sva prekidačka antitela pokazala efikasnost, ona nisu izazvala odgovor u drugim tkivima osim tumora i da su imala svojstvo da pokazuju aktivnost samo lokalno u tumoru.
[1359] [Primer 6] Generisanje varijante Fc sposobne da pojača ADCC/ADCP aktivnost
[1360] Da bi se generisala antitela sa poboljšanim ADCC i ADCP, koje imaju citotoksične efektorske funkcije, ispitana je priprema varijanti Fc regiona sa poboljšanom sposobnošću vezivanja za aktiviranje FcyR-ova FcγRIIIa i FcγRIIa.
[1362] (6-1) Generisanje i evaluacija varijanti sa poboljšanim vezivanjem za FcγR
[1363] Heterodimerizovano antitelo, 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-H1076/04L1610-lam1, koje ima konstantne regione teškog lanca Kn125 i Hl076 sa poboljšanom sposobnošću vezivanja za FcyR, opisano u WO 2013/002362, i ima 04H1637 kao varijabilni region teškog lanca i 04L1610-lam1 kao laki lanac, je generisano. Konkretno, generisan je gen za teški lanac antitela 04H1637-Kn125 (SEQ ID NO: 162), koji sadrži 04H1637 (SEQ ID NO: 138) kao jedan varijabilni region teškog lanca, i ima L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A uveden u G1d (SEQ ID NO: 158) sa uklonjenim Gly i Lys na C-terminusu konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1, a takođe ima i promene Y349C/T366W u CH3 regionu koje promovišu heterodimerizaciju. Slično tome, generisan je gen za teški lanac antitela 04H1637-Hl076 (SEQ ID NO: 163), koji obuhvata 04H1637 (SEQ ID NO: 138) kao drugi varijabilni region teškog lanca, i ima D270E/K326D/A330M/K334E uveden u konstantni region G1d teškog lanca humanog IgG1 (SEQ ID NO: 158), a takođe ima i promene D356C/T366S/L368A/Y407V u CH3 regionu koje promovišu heterodimerizaciju. Koristeći 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) kao laki lanac antitela, heterodimer 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1 je generisan metodom poznatom stručnjacima u tehnici. Geni teških lanaca antitela 04H1637-Kn462 (SEQ ID NO: 164), 04H1637-Hl441 (SEQ ID NO: 165), 04H1637-Hl445 (SEQ ID NO: 166), 04H1637-Kn461 (SEQ ID NO: 167), i 04H1637-Hl443 (SEQ ID NO: 168) su generisani, koji, pored L235Q, G236W, S239M, H268D, D270E, S298A, K326D i K334E, imaju izmene uvedene u CH2 regionu L234F i A330K objavljene u WO 2013/002362 kao promene koje menjaju vezivanje za FcyR; G236A, I332E i I332D objavljene u Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517‑2527 i WO 2004/029207; i T250V i T307P prijavljeni u WO 2013/118858 kao promene za poboljšanje stabilnosti, u kombinaciji. Pored toga, generisan je gen za teški lanac antitela 04H1654-KT462 (SEQ ID NO: 182), koji ima uklonjene Gly i Lys na C-terminusu humanog IgG1 (IGHG1*03), ima iste promene kao Kn462 u CH2 regionu, ima promenu E356K koja promoviše heterodimerizaciju kao što je opisano u WO 2006/106905 u CH3 regionu i sadrži 04H1654 (SEQ ID NO: 140) kao varijabilni region teškog lanca. Slično tome, generisan je gen za teški lanac antitela 04H1656-HT441 (SEQ ID NO: 170), koji ima uklonjene Gly i Lys na C-terminusu humanog IgG1 (IGHG1*03), ima iste promene kao Hl441 u CH2 regionu, ima promenu K439E koja promoviše heterodimerizaciju kao što je opisano u WO 2006/106905 u CH3 regionu i obuhvata 04H1656 (SEQ ID NO: 141) kao varijabilni region teškog lanca. Slično tome, generisani su geni 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171), 04H1654-KT461 (SEQ ID NO: 183), i 04H1656-HT443 (SEQ ID NO: 173). Pored toga, ispitana je kombinacija promena za poboljšanje kinetike krvi antitela opisanih u Mabs, 2017, 9, 844-853. Konkretno, generisan je gen za 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184), koji ima N434A/Y436T/Q438R/S440E uveden u CH3 region 04H1654-KT462 (SEQ ID NO: 182), što je kombinacija promena koje poboljšavaju vezivanje za humani FcRn pod kiselim uslovima i promena koje smanjuju vezivanje za reumatoidni faktor. Slično, generisan je gen za 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185), koji ima N434A/Y436T/Q438R/S440E uveden u 04H1656-HT445 (SEQ ID NO: 171). Slično tome, teški lanac antitela 04H1654-KT481 (SEQ ID NO: 186) i teški lanac antitela 04H1656-HT498 (SEQ ID NO: 187) su generisani uvođenjem istih izmena u 04H1654-KT461 i 04H1656-HT443, redom. Kombinovanjem ovih teških lanaca i korišćenjem 04L1610-lam1 ili 04L1612-lam1 (SEQ ID NO: 188) kao lakog lanca, generisana su željena heterodimerizovana antitela.
[1365] Ekstracelularni domeni FcyR su pripremljeni sledećim metodom. Prvo, geni ekstracelularnih domena FcyR su sintetizovani metodom poznatom stručnjacima u tehnici. Tada je sekvenca svakog FcγR pripremljena na osnovu informacija registrovanih u NCBI. Konkretno, FcγRI je pripremljen na osnovu sekvence NCBI pristupnog broja NM_000566.3, FcγRIIa je pripremljen na osnovu sekvence NCBI pristupnog broja NM_001136219.1, FcγRIIb je pripremljen na osnovu sekvence NCBI pristupnog broja NM_004001.3, a FcγRIIIa je pripremljen na osnovu sekvence NCBI pristupnog broja NM_001127593.1, a His-oznaka je dodata na C-terminus. Polimorfno mesto FcγRIIa je pripremljeno u odnosu na J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25, a polimorfno mesto FcγRIIIa je pripremljeno u odnosu na J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070. Ekspresioni vektori su pripremljeni umetanjem dobijenih genskih fragmenata u ekspresione vektore životinjskih ćelija. Pripremljeni ekspresioni vektori su prolazno uvedeni u ćelije FreeStyle293 izvedene iz ćelija raka bubrega humanog embriona (Invitrogen) da bi se ekspresovali proteini od interesa. Nakon što su supernatanti kulture sakupljeni, propušteni su kroz filter od 0,22 µm i prečišćeni u sledeća četiri koraka, u principu. Prvi korak je bila katjonsko-izmenjivačka kolonska hromatografija (SP Sepharose FF), drugi korak je bila afinitetna kolonska hromatografija za His-oznaku (HisTrap HP), treći korak je bila gel filtraciona kolonska hromatografija (Superdex200), a četvrti korak je bila aseptična filtracija. Međutim, za FcγRI, anjonsko-izmenjivačka hromatografija na koloni korišćenjem Q sepharose FF je izvršena u prvom koraku. Koncentracija prečišćenog proteina je izračunata merenjem apsorbancije na 280 nm pomoću spektrofotometra i korišćenjem koeficijenta ekstinkcije izračunatog iz dobijene vrednosti metodom kao što je PACE (Protein Science, 1995, 4, 2411‑2423). Humani FcRn je pripremljen metodom opisanom u WO 2010/107110.
[1367] Interakcija između generisanih antitela i humanih FcγR analizirana je sledećom metodom korišćenjem Biacore T200. Kao pufer za rad korišćen je 50 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 (pH 7.4), a test je izveden na 25°C. Za senzorske čipove korišćeni su čipovi serije S SA (GE Healthcare) na kojima je imobilizovan CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin konjugat (Thermo Fisher Scientific). Antitela od interesa su zarobljena na ovim čipovima i FcγR razblažen u puferu za rad je ostavljen da interaguje sa njima. Čipovi su regenerisani sa 10 mM Glycine-HCl (pH 1,5) i 25 mM NaOH, a test je izveden ponovljenim hvatanjem antitela. Konstante disocijacije KD (mol/L) za FcyR svakog antitela izračunate su korišćenjem Biacore T200 Evaluation Software 2.0, koristeći 1:1 Langmuirov model vezivanja za FcγRIa i FcγRIIIa i model afiniteta u stabilnom stanju za FcγRIIa. Za FcγRIIb, količina vezivanja FcγRIIb po jedinici količine antitela izračunata je korekcijom količine vezivanja FcγRIIb dobijene iz senzograma dobijenog merenjem sa količinom antitela zarobljenog na površini čipa.
[1369] Interakcija između generisanih antitela i humanog FcRn analizirana je sledećom metodom koristeći Biacore T200. 50 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 (pH 6.0) je korišćen kao pufer za rad, a test je izveden na 25°C. Za senzorski čip korišćeni su čipovi serije S SA (GE Healthcare) na kojima je imobilizovan CaptureSelect Human Fab-lambda Kinetics Biotin konjugat (Thermo Fisher Scientific). Antitela od interesa su zarobljena na ovim čipovima i FcRn razblažen u puferu za rad je ostavljen da interaguje sa njima. Čipovi su regenerisani sa 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) i 25 mM NaOH, a test je izveden ponovljenim hvatanjem antitela. Konstanta disocijacije za FcRn svakog antitela izračunata je korišćenjem modela stabilnog stanja, koristeći Biacore T200 Evaluation Software 2.0.
[1371] Tabela 26 prikazuje ove rezultate merenja.
[1373] Analiza vezivanja varijanti Fc regiona za humane FcyR i FcRn
[1374] [Tabela 26]
[1375]
[1376] Vrednosti „KD za hFcRn (M)“ i „KD za hFcyRs (M)“ u tabeli označavaju konstante disocijacije za hFcRn i FcyR, redom, a „količina vezivanja“ pokazuje količinu vezivanja FcγRIIb po jedinici količine antitela kada je FcγRIIb dozvoljeno da interaguje na 1000 nM. „Relativna vrednost prema KD između G1m i hFcRn“ i „Relativna vrednost prema KD između G1m i hFcyRs“ su vrednosti dobijene deljenjem KD vrednosti 04H1637-G1m/04L1610-lam1 za hFcRn i za svaki FcγR sa KD vrednošću svake varijante, redom. „Relativna količina vezivanja“ označava vrednost dobijenu deljenjem količine vezivanja svake varijante za FcγRIIb sa količinom vezivanja 04H1637-G1m/04L1610-lam1. Sekvence amino-kiseline teškog lanca antitela 04H1637-G1m i lakog lanca antitela 04L1610-lam1 prikazane su u SEQ ID NO: 160 i 161, redom. Pokazano je da sva generisana heterodimerizovana antitela imaju pojačano vezivanje za FcγRIIa i FcγRIIIa u poređenju sa 04H1637-G1m/04L1610-lam1 koji ima konstantni region prirodnog humanog IgG1. Štaviše, pokazano je da 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl441/04L1610-lam1, 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1445/04L1610-lam1 i 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1 imaju pojačano vezivanje za FcγRIIa u poređenju sa 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1 koji ima varijantu Fc regiona prijavljenu u WO 2013/002362. Pokazano je da je sposobnost vezivanja 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-Hl445/04L1610-lam1 za FcγRIIIa ekvivalentna 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1, a da je sposobnost vezivanja 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1 za FcγRIIIa poboljšana u poređenju sa 04H1637-Kn125/04L1610-lam1//04H1637-Hl076/04L1610-lam1. Slično tome, pokazano je da 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1 i 04H1654-KT462/04L1612-lam1//04H1656-HT445/04L1610-lam1, koji imaju različite izmene za heterodimerizaciju u konstantnom regionu i CH3 regionu IGHG1*03, imaju uporediv profil vezivanja FcγR sa 04H1637-Kn462/04L1610-lam1//04H1637-H1445/04L1610-lam1, i 04H1654-KT461/04L1610-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1 i Pokazano je da 04H1654-KT461/04L1612-lam1//04H1656-HT443/04L1610-lam1 imaju uporediv profil vezivanja FcγR sa 04H1637-Kn461/04L1610-lam1//04H1637-Hl443/04L1610-lam1. Pored toga, pokazalo se da 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1, 04H1654-KT481/04L1610-lam1//04H1656-HT498/04L1610-lam1, 04H1654-KT473/04L1612-lam1//04H1656-HT482/04L1612-lam1 i 04H1654-KT481/04L1612-lam1//04H1656-HT498/04L1612-lam1 uvedeni sa izmenama radi poboljšanja kinetike krvi imaju poboljšanu sposobnost vezivanja za humani FcRn i uporedivu sposobnost vezivanja za FcyR u poređenju sa antitelima pre uvođenja izmena. da poboljša kinetiku krvi.
[1378] Pored toga, generisan je gen 04H1656-HT451 (SEQ ID NO: 272), u koji je N434A/Y436T/Q438R/S440E uveden u 04H1656-HT441, što je kombinacija promena koje poboljšavaju vezivanje za humani FcRn pod kiselim uslovima i promena koje smanjuju vezivanje za reumatoidni faktor. Sekvenca amino-kiselina teškog lanca antitela HT451 prikazana je u SEQ ID NO: 276. Heterodimerizovano antitelo je generisano kombinovanjem 04H1654-KT473 i 04H1656-HT451 i korišćenjem 04L1610-lam1 kao lakog lanca antitela. Tabela 27 prikazuje rezultate analize interakcije generisanih antitela sa humanim FcRn i sa humanim FcyR.
[1380] Analiza vezivanja varijanti Fc regiona za humane FcyR i FcRn
[1382] [Tabela 27]
[1383]
[1384] Pokazano je da generisana heterodimerizovana antitela 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1 i 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1 imaju pojačano vezivanje za aktivirajuće FcyR-ove FcγRIIa i FcγRIIIa, u poređenju sa 04H1656-G1m/04L1610-lam1 koji ima konstantni region prirodnog humanog IgG1. Pored toga, vezivanje za FcγRIIb, koji je inhibitorni FcγR, održavano je na istom nivou kao i 04H1656-G1m/04L1610-lam1 kod oba ova antitela. Pokazano je da 04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1, u koji je N434A/Y436T/Q438R/S440E uveden u 04H1654-KT462/04L1610-lam1//04H1656-HT441/04L1610-lam1, ima poboljšanu sposobnost vezivanja za humani FcRn u poređenju sa onim pre uvođenja izmena.
[1386] Zatim, varijante sa poboljšanim vezivanjem FcγR generisane korišćenjem različitih promena za heterodimerizaciju opisanih u Nat. Biotechnol., 1998, 16, 677‑681 su procenjene na njihovu aktivnost vezivanja za humani FcRn i FcyR. Generisani su geni teških lanaca antitela 04H1389-Ks462 (SEQ ID NO: 191) i 04H1389-Km462 (SEQ ID NO: 199), koji obuhvataju 04H1389 (SEQ ID NO: 136) kao varijabilni region teškog lanca i imaju konstantni region teškog lanca koji ima iste izmene kao KT462 uveden u CH2 region konstantnog regiona sa uklonjenim Gly i Lys na C-terminusu humanog IgG1 (IGHG1*03), a dalje ima u CH3 regionu T366W uveden kao izmena za heterodimerizaciju za 04H1389-Ks462, i Y349C/T366W korišćen kao izmene za heterodimerizaciju za 04H1389-Km462. Pored toga, generisani su geni za teške lance antitela 04H1389-Hs445 (SEQ ID NO: 192) i 04H1389-Hm445 (SEQ ID NO: 200), koji imaju iste izmene kao HT445 uvedene u CH2 region, a dalje imaju u CH3 regionu, T366S/L368A/Y407V uvedene kao izmene za heterodimerizaciju za 04H1389-Hs445, i E356C/T366S/L368A/Y407V korišćene kao izmene za heterodimerizaciju za 04H1389-Hm445. Slično tome, generisani su 04H1389-Ks461 (SEQ ID NO: 193), 04H1389-Km461 (SEQ ID NO: 201), 04H1389-Hs443 (SEQ ID NO: 194) i 04H1389-Hm443 (SEQ ID NO: 202), koji imaju iste izmene kao KT461 i HT443 u CH2 regionu. Pored toga, generisani su geni za teške lance antitela 04H1389-Ks473 (SEQ ID NO: 195), 04H1389-Hs482 (SEQ ID NO: 196), 04H1389-Ks481 (SEQ ID NO: 197), 04H1389-Hs498 (SEQ ID NO: 198), 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203), 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204), 04H1389-Km481 (SEQ ID NO: 205), and 04H1389-Hm498 (SEQ ID NO: 206) koji imaju izmene N434A/Y436T/Q438R/S440E koje poboljšavaju kinetiku krvi, a uvedene su u gore navedene konstantne regione teških lanaca antitela. Ks462, Hs445, Ks461, Hs443, Km462, Hm445, Km461 i Hm443, i imaju 04H389 kao varijabilni region.04L1615-k0MT (SEQ ID NO: 190) je korišćen kao laki lanac, i generisani su heterodimeri od interesa. Radi poređenja, generisan je homodimer 04H1389-G1m/04L16150k0MT koji ima 04H1389-G1m (SEQ ID NO: 189). Interakcija između generisanih antitela i humanih FcyR je analizirana korišćenjem Biacore T200.50 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 (pH 7.4) je korišćen kao pufer za rad, a test je izveden na 25°C. Za senzorski čip korišćeni su čipovi serije S SA (GE Healthcare) na kojima je imobilizovan CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin konjugat (Thermo Fisher Scientific). Antitela od interesa su zarobljena na ovim čipovima i svaki FcγR razblažen u puferu za rad je ostavljen da interaguje sa njima. Čipovi su regenerisani sa 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) i 25 mM NaOH, a test je izvršen ponovljenim hvatanjem antitela. Konstante disocijacije KD (mol/L) za FcγR svakog antitela su izračunate korišćenjem Biacore T200 Evaluation Software 2.0, i korišćenjem 1:1 Langmuir modela vezivanja za FcγRIa i FcγRIIIa i modela afiniteta u stabilnom stanju za FcγRIIa. Za FcγRIIb, količina vezivanja FcγRIIb po jedinici količine antitela izračunata je korekcijom količine vezivanja FcγRIIb dobijene iz senzograma merenja sa količinom antitela zarobljenog na površini čipa. Za merenje vezivanja za FcRn, 50 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20 (pH 6.0) je korišćen kao pufer za rad, a konstanta disocijacije KD (mol/L) je izračunata pomoću modela stabilnog stanja (Tabela 28). Od konstanti disocijacije za FcγRIIIa u Tabeli 28, vrednosti označene sa „*“ su vrednosti izračunate pomoću modela afiniteta stabilnog stanja.
[1388] Analiza vezivanja varijanti Fc regiona za humane FcyR i FcRn
[1390] [Tabela 28]
[1391]
[1392] Sva heterodimerizovana antitela generisana ovde imala su pojačanu aktivnost vezivanja za FcγRIIa i FcγRIIIa u poređenju sa 04H1389-G1m/04L1615-k0MT. Pored toga, svi 04H1389-Ks473/04L1615-k0MT//04H1389-Hs482/04L1615-k0MT, 04H1389-Ks481/04L1615-k0MT//04H1389-Hs498/04L1615-k0MT, 04H1389-Km473/04L1615-k0MT//04H1389-Hm482/04L1615-k0MT i 04H1389-Km481/04L1615-k0MT//04H1389-Hm498/04L1615-k0MT, koji imaju izmene uvedene radi poboljšanja kinetike antitela u krvi, imali su poboljšanu aktivnost vezivanja za humane FcRn u poređenju sa matičnim antitelom pre uvođenja izmena, i za aktivnost vezivanja FcγR, imali su isti profil vezivanja kao matično antitelo.
[1394] Štaviše, generisan je gen za 04H1389-Hm441 (SEQ ID NO: 273), koji obuhvata 04H1389 (SEQ ID NO: 136) kao varijabilni region teškog lanca, ima iste izmene kao HT441 uvedene u CH2 region teškog lanca, i ima Y349C/366W korišćene kao izmene za heterodimerizaciju u CH3 regionu. Nasuprot tome, generisan je 04H1389-Hm451 (SEQ ID NO: 274), sa uvedenim N434A/Y436T/Q438R/S440E, što je kombinacija izmena koje poboljšavaju vezivanje za humani FcRn pod kiselim uslovima i izmena koje smanjuju vezivanje za reumatoidni faktor. Sekvence amino-kiseline teških lanaca antitela Hm441 i Hm451 prikazane su u SEQ ID NO: 277 i 278, redom. Heterodimerizovana antitela su generisana korišćenjem 04H1389-Km473, 04H1389-Hm451 ili 04H1389-Hm482 kao teškog lanca antitela i 04L1305-k0MT kao lakog lanca antitela. Tabela 29 prikazuje rezultate analize interakcije generisanih antitela sa humanim FcRn i sa humanim FcyR.
[1396] Analiza vezivanja varijanti Fc regiona za humane FcyR i za FcRn
[1398] [Tabela 29]
[1399]
[1400] Pokazano je da generisana heterodimerizovana antitela 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT i 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT imaju pojačano vezivanje za aktivirajuće FcyR FcγRIIa i FcγRIIIa u poređenju sa 04H1389-G1m/04L1305-k0MT koji imaju konstantni region prirodnog humanog IgG1. Takođe je pokazano da oba ova antitela imaju pojačanu sposobnost vezivanja za humani FcRn u poređenju sa 04H1389-G1m/04L1305-k0MT.
[1402] Zatim, varijante konstantnog regiona sa poboljšanim vezivanjem za FcγR pronađene ovde su upoređene sa postojećim varijantama sa poboljšanim vezivanjem za FcγR. Generisani su geni za teške lance antitela MDX10D1H-Kn125 (SEQ ID NO: 217), MDX10D1H-Hl076 (SEQ ID NO: 218), MDX10D1H-Kn462 (SEQ ID NO: 219), MDX10D1H-Hl445 (SEQ ID NO: 220), MDX10D1H-Kn461 (SEQ ID NO: 221) i MDX10D1H-Hl443 (SEQ ID NO: 222), koji obuhvataju MDX10D1H (SEQ ID NO: 154) kao varijabilni region teškog lanca, i konstantne regione teškog lanca navedene u Tabeli 26, i gen za MDX10D1H-G1m (SEQ ID NO: 210) koji obuhvata CH2 region prirodnog humanog IgG1. Gen za teški lanac antitela MDX10D1H-GASDIE (SEQ ID NO: 215) je generisan, sa promenama G236A/S239D/I332E u CH2 regionu, kao što je opisano u Mol. Cancer Ther., 2008, 7, 2517‑2527 kao varijanta sa poboljšanim vezivanjem za FcγRIIa. Štaviše, generisan je i gen za teški lanac antitela MDX10D1H-GASDALIE (SEQ ID NO: 216), koji ima G236A/S239D/A330L/I332E u CH2 regionu kao što je opisano J. Struct. Biol., 2016, 194, 78‑89 kao varijanta sa poboljšanim vezivanjem za FcγRIIIa. MDX10D1L-k0MT (SEQ ID NO: 211) je korišćen kao laki lanac antitela, i generisana su antitela od interesa. Aktivnost vezivanja ovih antitela za humane FcγR merena je gore opisanom metodom korišćenjem CaptureSelect Human Fab-kappa Kinetics Biotin konjugata (Tabela 30).
[1404] Analiza vezivanja varijanti Fc regiona za humane FcyR
[1406] [Tabela 30]
[1407]
[1408] Vrednost „KD za hFcyRs (M)“ u tabeli označava konstantu disocijacije za svaki od navedenih FcyR, a „Količina vezivanja“ označava količinu vezivanja FcγRIIb po jedinici količine antitela kada je FcγRIIb dozvoljeno da interaguje na 1000 nM. „Relativna vrednost KD između G1m i hFcyR“ označava vrednost dobijenu deljenjem KD vrednosti MDX10D1H-G1m/MDX10D1L-k0MT za svaki FcγR sa KD vrednošću svake varijante, a „Relativna količina vezivanja“ označava vrednost dobijenu deljenjem količine vezivanja svake varijante za FcγRIIb sa količinom vezivanja MDX10D1H-Glm/MDX10D1L-k0MT.
[1410] Generisani heterodimeri, MDX10D1H-Kn125/MDX10D1H-Hl076/MDX10D1L-k0MT, MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT i MDX10D1H-Kn461/MDX10D1H-Hl443/MDX10D1L-k0MT, svi su imali pojačano vezivanje za FcγRIIIa u poređenju sa postojećim antitelima sa pojačanim vezivanjem za FcγR, MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT i MDX10D1H-GASDALIE/MDX10D1L-k0MT. Takođe je pokazano da MDX10D1H-Kn462/MDX10D1H-Hl445/MDX10D1L-k0MT ima oko 2 puta pojačano vezivanje za FcyRIIaH u poređenju sa postojećim antitelom MDX10D1H-GASDIE/MDX10D1L-k0MT pojačanim vezivanjem za FcγRIIa.
[1412] (6-2) Evaluacija in vitro ADCC aktivnosti različitih antitela sa izmenjenim konstantnim regionima
[1413] hFcγRIIIaV ADCC Reporter BioAssay, Core Kit (Promega) je korišćen za in vitro test ADCC aktivnosti. U svako ležište ploče sa 96 ležišta, dodato je 25 µL hCTLA4-CHO ćelija sa koncentracijom pripremljenom na 2 x 10<6>/mL koristeći medijum je dodato kao ciljne ćelije, a pufer za ispitivanje (90% RPMI1640, 10% FBS) je korišćen kao medijum. Zatim je dodato 25 µL svakog rastvora antitela razblaženog puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0, 0,001, 0,01, 0,1 i 1 µg/mL. Na kraju, dodato je 25 µL Jurkat ćelija koje eksprimuju hFcγRIIIaV (uključene u komplet) pripremljenih do 6 x 10<6>/mL sa medijumom je dodato kao rastvor efektorskih ćelija, tako da su rastvori pomešani do ukupno 75 µL. Ploča je ostavljena da stoji na 37°C preko noći u 5% CO<2>inkubatoru. Ploča je zatim ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 15 minuta i u svako ležište je dodato 75 µL Bio-Glo reagensa. Kao Bio-Glo reagens je korišćen Bio-glo sistem za ispitivanje luciferaze (pufer i supstrat). Luminescencija svakog ležišta je zatim merena čitačem ploča. Vrednost dobijena deljenjem vrednosti luminescencije svakog ležišta sa vrednošću luminescencije ležišta bez antitela definisana je kao indukcija pregiba, koja je korišćena kao indeks za procenu ADCC svakog antitela. Dobijeni rezultati su prikazani na slici 23. Na slici je indukcija pregiba predstavljena kao relativne jedinice luminescencije (RLU).
[1415] Ovi rezultati su pokazali da je ADCC aktivnost antitela koja imaju izmenjeni Fc protiv hCTLA4-CHO ćelija jača od aktivnosti konstantnog regiona divljeg tipa humanog IgG1.
[1417] (6-3) Evaluacija in vitro ADCP aktivnosti različitih antitela sa izmenjenim konstantnim regionima
[1418] hFcyRIIaH ADCP Reporter BioAssay, Core Kit (Promega) je korišćen za in vitro test ADCC aktivnosti. U svako ležište ploče sa 96 ležišta, dodato je 25 µL hCTLA4-CHO ćelija sa koncentracijom pripremljenom na 1 x 10<6>/mL koristeći medijum kao ciljne ćelije, a pufer za ispitivanje (4% serum sa niskim IgG u RPMI1640) je korišćen kao medijum. Zatim je dodato 25 µL svakog rastvora antitela razblaženog puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0, 0,001, 0,01, 0,1 i 1 µg/mL. Na kraju, dodato je 25 µL Jurkat ćelija koje eksprimuju hFcγRIIaH uključenih u komplet kao rastvor efektorskih ćelija, tako da su rastvori pomešani do ukupno 75 µL. Ploča je ostavljena da stoji na 37°C preko noći u 5% CO<2>inkubatoru. Gustina ćelijskog rastvora Jurkat ćelija koje eksprimuju hFcγRIIaH bila je 8,25 x 10<5>/mL. Ploča je zatim ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 15 minuta i u svako ležište je dodato 75 µL Bio-Glo reagensa. Bio-Glo sistem za ispitivanje luciferaze (pufer i supstrat) je korišćen kao Bio-Glo reagens. Luminescencija svakog ležišta je zatim merena čitačem ploča. Vrednost dobijena deljenjem vrednosti luminescencije svakog ležišta sa vrednošću luminescencije ležišta bez antitela je definisana kao indukcija pregiba, koja je korišćena kao indeks za procenu ADCP svakog antitela. Dobijeni rezultati su prikazani na slici 24. Na slici, indukcija pregiba je predstavljena kao relativne jedinice luminescencije (RLU).
[1420] Rezultati su pokazali da je ADCP aktivnost antitela koja imaju izmenjeni Fc protiv hCTLA4-CHO ćelija jača od aktivnosti konstantnog regiona divljeg tipa humanog IgG1.
[1422] (6-4) Evaluacija in vitro ADCC aktivnosti anti-CTLA4 prekidačkih antitela sa izmenjenim Fc
[1423] Generisana su anti-CTLA4 prekidačka antitela sa izmenjenim Fc (04H1654-Kn462/04L1610-lam1//04H1656-Hl445/04L1610-lam1, skraćenica: SW1610-ART6; 04H1654-Kn462/04L1612-lam1//04H1656-Hl445/04L1612-lam1, skraćenica: SW1612-ART6; i 04H1389-Kn462/04L1305-k0MT//04H1389-H1445/04L1305-k0MT, skraćenica: SW1389-ART6).
[1424] U antitelu SW1610-ART6, jedan varijabilni region teškog lanca 04H1654 (SEQ ID NO: 35) je bio povezan sa konstantnim regionom humanog teškog lanca Kn462 (SEQ ID NO: 43), drugi varijabilni region teškog lanca 04H1656 (SEQ ID NO: 37) je bio povezan sa konstantnim regionom humanog teškog lanca Hl445 (SEQ ID NO: 44) kao konstantni region, a za varijabilni region lakog lanca 04L1610 (SEQ ID NO: 39) korišćen je konstantni region humanog lakog lanca divljeg tipa lam1 (SEQ ID NO: 53). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1426] U antitelu SW1612-ART6, jedan varijabilni region teškog lanca 04H1654 (SEQ ID NO: 35) je bio povezan sa konstantnim regionom humanog teškog lanca Kn462 (SEQ ID NO: 43), drugi varijabilni region teškog lanca 04H1656 (SEQ ID NO: 37) je bio povezan sa konstantnim regionom humanog teškog lanca Hl445 (SEQ ID NO: 44) kao konstantni region, a za varijabilni region lakog lanca 04L1612 (SEQ ID NO: 40) korišćen je konstantni region humanog lakog lanca divljeg tipa lam1 (SEQ ID NO: 53). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1428] U antitelu SW1389-ART6, dva varijabilna regiona teškog lanca 04H1389 (SEQ ID NO: 29) su povezana sa konstantnim regionom humanog teškog lanca Kn462 (SEQ ID NO: 43) i konstantnim regionom humanog teškog lanca Hl445 (SEQ ID NO: 44) kao konstantnim regionom, a dalje za varijabilni region lakog lanca 04L1305 (SEQ ID NO: 30) korišćen je konstantni region divljeg tipa humanog lakog lanca k0MT (SEQ ID NO: 33). Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1430] hFcγRIIIaVADCC Reporter Bioassay, Core Kit (Promega) je korišćen za in vitro test ADCC aktivnosti. U svako ležište ploče sa 96 ležišta, dodato je 12,5 µL hCTLA4-CHO ćelija sa koncentracijom pripremljenom na 2 x 10<6>/mL medijumom kao ciljne ćelije, a pufer za ispitivanje (4% serum sa niskim IgG u RPMI1640) je korišćen kao medijum. Zatim, rastvori ATP razblaženi puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0 i 100 µM, i rastvori antitela SW1389-ART6, SW1610-ART6 i SW1612-ART6 razblaženi puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 i 10 µg/mL, su sekvencijalno dodani. Na kraju, 25 µL Jurkat ćelija koje eksprimuju hFcγRIIIaV (uključene u komplet) pripremljenih do 3 x 10<6>/mL sa medijumom je dodato kao rastvor efektorskih ćelija, a rastvori su pomešani do ukupno 75µL. Ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 6 sati u 5% CO<2>inkubatoru. Ploča je zatim ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 15 minuta i u svako ležište je dodato 75 µL Bio-Glo reagensa. Kao Bio-Glo reagens korišćen je Bio-Glo sistem za ispitivanje luciferaze (pufer i supstrat). Luminescencija svakog ležišta je zatim merena čitačem ploča. Vrednost dobijena deljenjem vrednosti luminescencije svakog ležišta sa vrednošću luminescencije ležišta bez antitela definisana je kao indukcija pregiba, koja je korišćena kao indeks za procenu ADCC svakog antitela. Dobijeni rezultati su prikazani na slikama 25 (SW1389-ART6), slici 26 (SW1610-ART6) i slici 27 (SW1612-ART6). Na slikama, indukcija pregiba je predstavljena kao relativne jedinice luminescencije (RLU).
[1432] Na osnovu ovih rezultata, potvrđeno je da se ADCC aktivnost anti-CTLA4 prekidačkih antitela koja imaju izmenjeni Fc protiv hCTLA4-CHO ćelija razlikuje između prisustva i odsustva ATP, i da postoji ATP-zavisna citotoksičnost protiv hCTLA4-CHO ćelija.
[1434] (6-5) Evaluacija in vitro neutralizujuće aktivnosti anti-CTLA4 prekidačkih antitela
[1436] Kao izmenjena anti-CTLA4 prekidačka antitela, proizvedena su humana antitela koja imaju varijabilne regione SW1389, SW1610, SW1612 i SW1615.
[1438] Za antitelo SW1389, 04H1389 (SEQ ID NO: 29) je korišćen kao varijabilni region teškog lanca, a 04L1305 (SEQ ID NO: 30) je korišćen kao varijabilni region lakog lanca. Nakon što su varijabilni regioni povezani sa humanim konstantnim regionima, antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1440] Za antitelo SW1610, 04H1654 (SEQ ID NO: 35) i 04H1656 (SEQ ID NO: 37) su korišćeni kao varijabilni region teškog lanca, a 04L1610 (SEQ ID NO: 39) je korišćen kao varijabilni region lakog lanca. Nakon što su varijabilni regioni povezani sa humanim konstantnim regionima, antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1442] Za antitelo SW1612, 04H1654 (SEQ ID NO: 35) i 04H1656 (SEQ ID NO: 37) su korišćeni kao varijabilni region teškog lanca, a 04L1612 (SEQ ID NO: 40) je korišćen kao varijabilni region lakog lanca. Nakon što su varijabilni regioni povezani sa humanim konstantnim regionima, antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1443] Za antitelo SW1615, 04H1389 (SEQ ID NO: 29) je korišćen kao varijabilni region teškog lanca, a 04L1615 (SEQ ID NO: 34) je korišćen kao varijabilni region lakog lanca. Nakon što su varijabilni regioni povezani sa humanim konstantnim regionima, antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1445] CTLA‑4 Blockade Bioassay (Promega) je korišćen za merenje in vitro neutrališuće aktivnosti. U svako ležište ploče sa 96 ležišta, dodato je 25 µL aAPC-Raji ćelija pričvršćenih za komplet sa koncentracijom pripremljenom na 1 x 10<6>/mL medijumom kao ciljne ćelije, a pufer za ispitivanje (10% FBS u RPMI1640) je korišćen kao medijum. Zatim, rastvori ATP razblaženi puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0 i 100 µM, a zatim su sekvencijalno dodani rastvori antitela sa varijabilnim regionima SW1389, SW1610, SW1612 i SW1615 razblaženi puferom za ispitivanje tako da je konačna koncentracija bila 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 i 10 µg/mL. Na kraju, 25 µL IL2-luc2-CTLA4-Jurkat ćelija (uključenih u komplet) pripremljenih do 2 x 10<6>/mL sa medijumom je dodato kao rastvor efektorskih ćelija, tako da je rastvor pomešan do ukupno 75 µL. Ploča je ostavljena da stoji na 37°C tokom 6 sati u 5% CO<2>inkubatoru. Ploča je zatim ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 15 minuta i u svako ležište je dodato 75 µL Bio-Glo reagensa. Kao Bio-Glo reagens korišćen je Bio-Glo sistem za ispitivanje luciferaze (pufer i supstrat). Luminescencija svakog ležišta je zatim merena čitačem ploča. Vrednost dobijena deljenjem vrednosti luminescencije svakog ležišta sa vrednošću luminescencije ležišta bez antitela definisana je kao indukcija pregiba, koja je korišćena kao indeks za procenu neutralizujuće aktivnosti svakog antitela. Dobijeni rezultati su prikazani na slici 28 (SW1389), slici 29 (SW1610), slici 30 (SW1612) i slici 31 (SW1615). Na slikama, indukcija pregiba je predstavljena kao relativne jedinice luminescencije (RLU).
[1447] Iz ovih rezultata je potvrđeno da je neutralizujuća aktivnost anti-CTLA4 prekidačkih antitela protiv ćelija koje eksprimuju hCTLA4 bila različita u prisustvu i odsustvu ATP, i da je postojala ATP-zavisna neutralizujuća aktivnost.
[1449] (6-6) Evaluacija in vitro citotoksične aktivnosti anti-CTLA4 prekidačkih antitela protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4
[1451] Anti-CTLA4 prekidačka antitela sa izmenjenim Fc (04H1654-KT473/04L1610-lam1//04H1656-HT451/04L1610-lam1, skraćenica: SW1610-ART5+ACT1; 04H1654-KT473/04L1610 lam1//04H1656-HT482/04L1610-lam1, skraćenica: SW1610-ART6+ACT1; 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm451/04L1305-k0MT, skraćenica: SW1389-ART5+ACT1; 04H1389-Km473/04L1305-k0MT//04H1389-Hm482/04L1305-k0MT, skraćenica: SW1389-ART6+ACT1).
[1453] Za antitelo SW1610-ART5+ACT1, 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) je korišćen kao jedan teški lanac, 04H1656-HT451 (SEQ ID NO: 272) je korišćen kao drugi teški lanac, a 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) je korišćen kao laki lanac. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1455] Za antitelo SW1610-ART6+ACT1, 04H1654-KT473 (SEQ ID NO: 184) je korišćen kao jedan teški lanac, 04H1656-HT482 (SEQ ID NO: 185) je korišćen kao drugi teški lanac, a 04L1610-lam1 (SEQ ID NO: 161) je korišćen kao laki lanac. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1457] Za antitelo SW1389-ART5+ACT1, 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) je korišćen kao jedan teški lanac, 04H1389-Hm451 (SEQ ID NO: 274) je korišćen kao drugi teški lanac, a 04L1305-k0MT (SEQ ID NO: 275) je korišćen kao laki lanac. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1459] Za antitelo SW1389-ART6+ACT1, 04H1389-Km473 (SEQ ID NO: 203) je korišćen kao jedan teški lanac, 04H1389-Hm482 (SEQ ID NO: 204) je korišćen kao drugi teški lanac, a 04L1305-k0MT (SEQ ID NO: 275) je korišćen kao laki lanac. Antitelo je eksprimovano i prečišćeno metodom poznatom stručnjacima u tehnici.
[1461] In vitro citotoksična aktivnost generisanih anti-CTLA4 prekidačkih antitela sa izmenjenim Fc protiv regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4 (CD3<+>CD4<+>CD25<+>CD45RA<->CTLA4<+>) je procenjen. Prvo, humane PBMC (CTL krioprezervirane humane PBMC, CTL) su zamrznuteodmrznute i suspendovane u 50 U/ml interleukina 2 (IL-2)/RPMI/10% FBS tako da je gustina ćelija bila 2 x 10<6>ćelija/ml, i kultivisane na 37°C tokom 4 dana u 5% CO<2>inkubatoru. Posle 4 dana, ćelije su sakupljene i isprane dva puta sa RPMI/10% FBS, a zatim posejane u količini od 100 µL u svako ležište ploče sa 96 ležišta i U-dnom (8 x 10<5>ćelija/ležište, ili 5 x 10<5>ćelija/ ležište), i dodato je 25 µL rastvora KLH-G1m podešenog sa RPMI/10% FBS na 8 mg/ml u svako ležište.
[1462] Zatim je dodato 25 µL svakog rastvora antitela pripremljenog za svaku koncentraciju (0, 2,4, 8, 24 i 80 µg/mL, ili 0, 0,8, 8, 80 i 800 µg/mL) u RPMI/10% FBS u svako ležište ploče sa U-dnom sa 96 ležišta. Pored toga, dodato je 50 µL rastvora ATP podešenog na 0 ili 400 µM u RPMI/10% FBS, smeša je dobro suspendovana, a zatim ostavljena da stoji na 37°C tokom 6 sati u CO<2>inkubatoru (5 µL ATP rastvora podešenog na 0 ili 4000 µM je dodato svaka 2 sata dva puta ukupno). Nakon 6 sati, PBMC su sakupljene, isprane dva puta sa auto MACS rastvorom za ispiranje (Miltenyi), reagovale sa sledećim antitelima, a frakcije prisutnih imunih ćelija su analizirane FACS analizom: reagens za određivanje vijabilnosti (Biolegend, Zombie Aqua), anti-CD3 antitelo (BD, klon: UCHT1), anti-CD4 antitelo (BD, klon: RPA-T4), anti-CD8 antitelo (BD, klon: SK1), anti-CD45RA antitelo (Biolegend, klon: HI100), anti-CD25 antitelo (BD, klon: 2A3), anti-CD16 antitelo (Biolegend, klon: 3G8), anti-CD56 antitelo (Biolegend, klon: HCD56), anti-CTLA4 antitelo (Biolegend, klon: BNI3). FACS analiza je izvršena pomoću BD LSR Fortessa X-20 (BD). Izračunat je odnos regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4 u održivim ćelijama pri svakoj koncentraciji antitela, a relativna vrednost, pri čemu je vrednost pri koncentraciji antitela od 0 uzeta kao 100%, definisana je kao stopa preživljavanja (%) regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4, i ovo je korišćeno kao indeks pri proceni citotoksične aktivnosti svakog antitela. Dobijeni rezultati su prikazani na slici 32 (SW1389-ART5+ACT1), slici 33 (SW1389-ART6+ACT1), slici 34 (SW1610-ART5+ACT1) i slici 35 (SW1610-ART6+ACT1).
[1464] Iz ovih rezultata je potvrđeno da se citotoksična aktivnost anti-CTLA4 prekidačkih antitela sa izmenjenim Fc protiv Regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4 razlikuje između prisustva i odsustva ATP, i da postoji ATP-zavisna citotoksična aktivnost protiv Regulatornih T ćelija pozitivnih na CTLA4.
[1466] [Industrijska primenljivost]
[1468] Anti-CTLA-4 antitela ovog otkrića i postupci koji ih koriste mogu se koristiti u razvoju, proizvodnji, obezbeđivanju, upotrebi i slično takvih farmaceutskih proizvoda sa malo neželjenih efekata, jer antitela ovog otkrića, iako imaju aktivnost aktiviranja imunih ćelija, citotoksičnu aktivnost i/ili antitumorsku aktivnost, imaju nizak efekat na netumorska tkiva kao što su normalna tkiva. Pored toga, polipeptidi koji sadrže varijantni Fc region ovog otkrića i postupci za njegovu proizvodnju i upotrebu mogu se koristiti u razvoju, proizvodnji, obezbeđivanju, upotrebi i slično takvih farmaceutskih proizvoda.

Claims (7)

1. Patentni zahtevi
1. Anti-CTLA-4 antitelo, koje obuhvata:
(1) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 83 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 97;
(2) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 86 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 134;
(3) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 136 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 95;
(4) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146;
(5) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146;
(6) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147;
(7) VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147;
(8) prvi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146 i drugi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 146; ili
(9) prvi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 140 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147 i drugi varijabilni region koji sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 141 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 147.
2. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema zahtevu 1.
3. Ćelija domaćina koja obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 2.
4. Postupak za proizvodnju antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 3 tako da se proizvede antitelo.
5. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
6. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 5 za upotrebu u lečenju tumora.
7. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu je tumor rak dojke ili rak jetre.
RS20260610A 2019-12-27 2019-12-27 Anti-ctla-4 antitelo i njegova upotreba RS68121B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2019/051447 WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2019-12-27 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
EP19958033.3A EP4082570B1 (en) 2019-12-27 2019-12-27 Anti-ctla-4 antibody and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS68121B1 true RS68121B1 (sr) 2026-06-30

Family

ID=76573011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260610A RS68121B1 (sr) 2019-12-27 2019-12-27 Anti-ctla-4 antitelo i njegova upotreba

Country Status (26)

Country Link
US (2) US20230058982A1 (sr)
EP (2) EP4082570B1 (sr)
JP (3) JP7373588B2 (sr)
KR (2) KR102645629B1 (sr)
CN (2) CN120757649A (sr)
AU (1) AU2019479791B2 (sr)
CA (1) CA3162444C (sr)
CO (1) CO2022010422A2 (sr)
CR (1) CR20220357A (sr)
DK (1) DK4082570T3 (sr)
ES (1) ES3068105T3 (sr)
FI (1) FI4082570T3 (sr)
HR (1) HRP20260650T1 (sr)
IL (1) IL294226B2 (sr)
LT (1) LT4082570T (sr)
MA (1) MA58152B1 (sr)
MX (1) MX2022007840A (sr)
MY (1) MY202559A (sr)
PE (1) PE20221585A1 (sr)
PH (1) PH12022551580A1 (sr)
PL (1) PL4082570T3 (sr)
PT (1) PT4082570T (sr)
RS (1) RS68121B1 (sr)
SI (1) SI4082570T1 (sr)
UA (1) UA128549C2 (sr)
WO (1) WO2021131021A1 (sr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 中外製藥股份有限公司 Antibody constant region change body
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
EP4624490A3 (en) 2012-02-09 2025-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified fc region of antibody
EP4310191A3 (en) 2012-06-14 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified fc region
TWI702316B (zh) 2013-12-04 2020-08-21 日商中外製藥股份有限公司 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
US20230416371A1 (en) * 2020-08-28 2023-12-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimer fc polypeptide
US12448451B2 (en) 2021-06-25 2025-10-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
CN117616123B (zh) * 2021-06-25 2024-11-08 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
IL308633B2 (en) * 2021-06-25 2025-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Use of anti-ctla-4 antibody
US12030945B2 (en) 2022-10-25 2024-07-09 Seismic Therapeutic, Inc. Variant IgG Fc polypeptides and uses thereof
AU2024392593A1 (en) * 2023-12-07 2026-06-25 LaNova Medicines Limited Anp-dependent antibodies

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
DE4419399C1 (de) 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
ES2706547T3 (es) 1998-12-23 2019-03-29 Pfizer Anticuerpos monoclonales humanos para CTLA-4
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
CA2832136C (en) 2002-09-27 2015-11-17 Xencor Optimized fc variants and methods for their generation
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
EP3342782B1 (en) 2004-07-15 2022-08-17 Xencor, Inc. Optimized fc variants
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US9200079B2 (en) 2004-11-12 2015-12-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
ATE423140T1 (de) 2005-01-05 2009-03-15 F Star Biotech Forsch & Entw Synthetische immunoglobulindomänen mit in regionen des moleküls, die sich von den die komplementarität bestimmenden bereichen unterscheiden, modifizierten bindeeigenschaften
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP2626372B1 (en) 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
KR101616758B1 (ko) 2007-12-26 2016-04-29 젠코어 인코포레이티드 ＦｃＲｎ에 대한 변경된 결합성을 갖는 Ｆｃ 변이체
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
TW201920257A (zh) 2008-04-11 2019-06-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗原結合分子
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
PT2560993T (pt) 2010-04-20 2024-09-16 Genmab As Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas
EP2598530A2 (en) 2010-07-29 2013-06-05 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
WO2012032080A1 (en) 2010-09-07 2012-03-15 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H Stabilised human fc
CN103429620B (zh) 2010-11-05 2018-03-06 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
TWI654203B (zh) 2010-11-30 2019-03-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
WO2012125850A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Amgen Inc. Fc variants
WO2013002362A1 (ja) 2011-06-30 2013-01-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
KR20250078601A (ko) 2011-09-30 2025-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항원의 소실을 촉진시키는 항원 결합 분자
EP4624490A3 (en) 2012-02-09 2025-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified fc region of antibody
JPWO2013180201A1 (ja) 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
WO2013180200A1 (ja) * 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
CN105102618B (zh) 2012-12-27 2018-04-17 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
WO2014145159A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Permeon Biologics, Inc. Charge-engineered antibodies or compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use
TWI702316B (zh) 2013-12-04 2020-08-21 日商中外製藥股份有限公司 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
JP6413235B2 (ja) 2013-12-06 2018-10-31 株式会社ニコン 撮像素子および撮像装置
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
DK3303394T3 (da) 2015-05-29 2020-07-06 Agenus Inc Anti-ctla-4-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN108473565B (zh) 2015-11-18 2022-05-27 默沙东公司 Ctla4结合剂
EP3634484A4 (en) * 2017-06-05 2022-01-12 The Council of the Queensland Institute of Medical Research A COMBINATION OF OR A BI-SPECIFIC BINDING MOLECULE TO AN IMMUNOCONTROL MOLECULE ANTAGONIST AND A RANK-L (NF-κB-LIGAND) ANTAGONIST FOR CANCER THERAPY OR PROPHYLAXIS AND USES THEREOF
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
MX2021001431A (es) * 2018-08-10 2021-05-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno anti grupo de diferenciacion 137 (cd137) y su uso.
MX2021005048A (es) * 2018-10-31 2021-09-08 Bioatla Inc Anticuerpos anti-ctla4, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos.
CN117616123B (zh) * 2021-06-25 2024-11-08 中外制药株式会社 抗ctla-4抗体
IL308633B2 (en) * 2021-06-25 2025-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Use of anti-ctla-4 antibody

Also Published As

Publication number Publication date
PL4082570T3 (pl) 2026-06-29
JP7624493B2 (ja) 2025-01-30
CN115942956A (zh) 2023-04-07
FI4082570T3 (fi) 2026-04-30
UA128549C2 (uk) 2024-08-07
BR112022011723A2 (pt) 2022-09-06
KR20220119433A (ko) 2022-08-29
JPWO2021131021A1 (sr) 2021-07-01
AU2019479791B2 (en) 2024-05-02
JP2025061475A (ja) 2025-04-10
KR20240035914A (ko) 2024-03-18
CN120757649A (zh) 2025-10-10
PH12022551580A1 (en) 2023-11-20
CO2022010422A2 (es) 2022-09-09
JP2024010057A (ja) 2024-01-23
ES3068105T3 (es) 2026-05-27
WO2021131021A1 (ja) 2021-07-01
CR20220357A (es) 2022-08-24
CA3162444C (en) 2024-04-30
IL294226A (en) 2022-08-01
HRP20260650T1 (hr) 2026-07-03
PT4082570T (pt) 2026-04-06
EP4082570B1 (en) 2026-02-25
CA3162444A1 (en) 2021-07-01
AU2019479791A1 (en) 2022-07-14
MX2022007840A (es) 2022-07-19
JP7373588B2 (ja) 2023-11-02
LT4082570T (lt) 2026-05-25
MY202559A (en) 2024-05-08
US20230058982A1 (en) 2023-02-23
PE20221585A1 (es) 2022-10-06
KR102645629B1 (ko) 2024-03-07
US20260092115A1 (en) 2026-04-02
DK4082570T3 (da) 2026-05-26
EP4082570A4 (en) 2023-09-13
EP4082570A1 (en) 2022-11-02
MA58152B1 (fr) 2026-04-30
EP4755457A2 (en) 2026-06-10
IL294226B2 (en) 2025-05-01
IL294226B1 (en) 2025-01-01
CN115942956B (zh) 2025-08-15
SI4082570T1 (sl) 2026-07-31