HK84994A - Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences - Google Patents

Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences Download PDF

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Claims (13)

  1. Procédé pour la détection de la présence ou de l'absence d'au moins une séquence spécifique d'acide nucléique bicaténaire dans un échantillon, ou pour la distinction entre deux séquences différentes d'acide nucléique bicaténaire dans ledit échantillon, lequel procédé comprend d'abord l'amplification exponentielle de la séquence ou des séquences (si elles existent) spécifiques par les étapes suivantes, et ensuite la détection de la séquence ou des séquences (si elles existent) ainsi amplifiées:
    (a) séparation des brins d'acide nucléique dans l'échantillon et traitement de l'échantillon par un excès molaire d'une paire d'amorces oligonucléotidiques pour chaque séquence spécifique différente qui est détectée, une amorce pour chaque brin, dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates de manière à synthétiser pour chacun desdits brins un produit d'extension de l'amorce respective, qui est complémentaire du brin, lesdites amorces étant choisies de manière que chacune soit pratiquement complémentaire d'une extrémité de la séquence à amplifier sur l'un des brins, de sorte que le produit d'extension synthétisé à partir d'une amorce, lorsqu'il est séparé de son complément, peut servir de matrice pour la synthèse d'un produit d'extension de l'autre amorce de la paire;
    (b) traitement de l'échantillon résultant de (a), dans des conditions de dénaturation, pour séparer les produits d'extension d'amorces d'avec leurs matrices;
    (c) traitement comme en (a) de l'échantillon, résultant de (b), par des amorces oligonucléotidiques de manière à synthétiser un produit d'extension d'amorce au moyen de chacun des monobrins produits dans l'étape (b) en tant que matrice; et, si on le désire,
    (d) répétition au moins une fois des étapes (b) et (c); l'amplification exponentielle de la séquence ou des séquences, si elles existent, d'acide nucléique ayant donc pour résultat de permettre leur détection; et, si on le désire,
    (e) addition au produit de l'étape (c) ou (d) d'une sonde oligonucléotidique marquée capable d'hybridation avec ladite séquence à détecter; et
    (f) détermination ayant pour but d'établir si ladite hybridadation a eu lieu.
  2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel une séquence à amplifier et détecter est contenue dans une séquence plus grande.
  3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'agent de polymérisation est l'ADN polymérase I de E. coli, le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli, l'ADN polymérase de T4, la transcriptase inverse ou une enzyme thermostable.
  4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'acide nucléique est l'ADN et les amorces sont des oligodésoxyribonucléotides.
  5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel chaque amorce utilisée contient un site de restriction qui est identique à ou différent d'un site de restriction de l'autre amorce, et, après l'étape (c) ou (d) et avant l'étape (e), le produit de l'étape (c) ou (d) (selon le cas) est coupé par une enzyme de restriction spécifique de chacun desdits sites de restriction et les produits coupés sont séparés d'avec les produits non coupés, et utilisés dans l'étape (e).
  6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel une séquence à amplifier et à détecter est associée à une maladie génétique, cancéreuse ou infectieuse.
  7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on traite d'abord une séquence d'acide nucléique monocaténaire que l'on désire détecter, dans des conditions d'hybridation, par une amorce, un agent inducteur de polymérisation et les différents nucléoside triphosphates, pour former un brin complémentaire de celle-ci, pour obtenir ladite séquence d'acide nucléique bicaténaire de départ et permettre la détection de ladite séquence monocaténaire.
  8. Procédé pour le clonage, dans un vecteur, d'une séquence ou de séquences spécifique(s) d'acide nucléique bicaténaire, contenue(s) dans un acide nucléique ou un mélange d'acides nucléiques, lequel procédé comprend d'abord l'amplification deladite séquence ou desdites séquences, par les étapes suivantes:
    (a) séparation des brins d'acide(s) nucléique(s) et traitement de l'acide nucléique ou des acides nucléiques par un excès molaire d'une paire d'amorces oligonucléotidiques pour chaque séquence spécifique distincte qui est amplifiée et clonée, une pour chaque brin, dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates de manière à synthétiser pour chacun desdits brins un produit d'extension de chaque amorce, qui est complémentaire de son brin respectif, lesdites amorces étant choisies de manière que chacune soit pratiquement complémenmentaire d'une extrémité de la séquence à amplifier sur l'un des brins, de sorte que le produit d'extension synthétisé à partir d'une amorce, lorsqu'il est séparé de son complément, peut servir de matrice pour la synthèse du produit d'extension de l'autre amorce de la paire, et lesdites amorces contenant chacune un site de restriction qui est identique au(x) ou différent du(des) site(s) de restriction de l'autre (des autres) amorce(s);
    (b) séparation des produits d'extension d'amorce d'avec les matrices sur lesquelles ils ont été synthétisés, pour la production de molécules monocaténaires;
    (c) traitement comme en (a) des molécules monocaténaires, produites dans l'étape (b), par des amorces oligonucléotidiques de manière à synthétiser un produit d'extension d'amorce au moyen de chacun des monobrins produits dans l'étape (b) en tant que matrice; et, si on le désire,
    (d) répétition au moins une fois des étapes (b) et (c); l'amplification exponentielle de la séquence ou des séquences d'acide nucléique en résultant;
    (e) addition au produit de l'étape (c) ou (d) d'une enzyme de restriction pour chacun des desdits sites de restriction, pour l'obtention de produits coupés dans une digestion de restriction; et
    (f) ligature du(des) produit(s) coupé(s) dans un ou plusieurs vecteurs de clonage.
  9. Procédé pour la synthèse d'un fragment d'acide nucléique à partir d'une séquence existante d'acide nucléique bicaténaire comportant moins de nucléotides que le fragment qui est synthétisé et deux amorces oligonucléotidiques, l'acide nucléique qui est synthétisé étant composé d'un segment gauche, d'un segment médian et d'un segment droit, et le segment médian représentant au moins essentiellement la séquence nucléotidique de ladite séquence existante d'acide nucléique, et les segments droit et gauche représentant la séquence nucléotidique à une extrémité de chacune des deux amorces, dont les autres extrémités sont complémentaires ou pratiquement complémentaires des extrémités des monobrins produits par séparation des brins de ladite séquence existante d'acide nucléique, lequel procédé comprend:
    (a) le traitement des brins dudit fragment existant par un excès molaire de deux amorces oligonucléotidiques, une pour chacun des brins, dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates de manière à synthétiser pour chaque brin un produit d'extension de l'amorce respective, qui est complémentaire du brin, lesdites amorces étant choisies de manière que chacune soit pratiquement complémentaire d'une extrémité d'un brin de ladite séquence existante, de sorte que le produit d'extension synthétisé à partir d'une amorce, lorsqu'il est séparé de son complément, peut servir de matrice pour la synthèse d'un produit d'extension de l'autre amorce, et dans lequel chaque amorce contient également une séquence de nucléotides qui ne sont pas complémentaires de ladite séquence existante et qui correspondent aux deux extrémités du fragment d'acide nucléique qui est synthétisé;
    (b) la séparation des produits d'extension d'amorce d'avec les matrices sur lesquelles ils ont été synthétisés, pour la production de molécules monocaténaires; et
    (c) le traitement des molécules monocaténaires provenant de l'étape (b) par les amorces de l'étape (a), dans des conditions telles qu'un produit d'extension d'amorce est synthétisé au moyen de chacun des monobrins produits dans l'étape (b), en tant qu'amorce, de manière à produire deux molécules intermédiaires d'acide nucléique bicaténaire, dans chacune desquelles a été incorporée la séquence nucléotidique présente à une extrémité des amorces oligonucléotidiques, et deux molécules complètes d'acide nucléique bicaténaire, dans chacune desquelles a été incorporée la séquence nucléotidique à l'extrémité de l'une et l'autre des amorces oligonucléotidiques;
    (d) la répétition des étapes (b) et (c) un nombre de fois suffisant pour produire en une quantité suffisante les molécules bicaténaires complètes.
  10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le produit de l'étape (d) est ensuite utilisé pour la production d'une séquence d'acide nucléique étendue davantage, par extension de celle-ci selon un procédé tel que défini dans la revendication 9.
  11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel la séquence existante d'acide nucléique est obtenue par traitement de deux oligonucléotides, dont chacun comporte à l'une de ses extrémités une séquence nucléotidique qui est complémentaire d'une extrémité de l'autre oligonucléotide et qui sont complémentaires l'une de l'autre à leurs autres extrémités, par un agent de polymérisation et les différents nucléoside triphosphates, dans des conditions telles qu'est synthétisé un produit d'extension de chaque oligonucléotide, qui est complémentaire de l'autre des produits d'extension résultants.
  12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans lequel on traite d'abord une séquence d'acide nucléique monocaténaire, dans des conditions d'hybridation, par une amorce, un agent inducteur de polymérisation et les différents nucléoside triphosphates, pour former un brin complémentaire de celui-ci afin obtenir ainsi ladite séquence d'acide nucléique bicaténaire de départ.
  13. Nécessaire pour la détection d'au moins une séquence spécifique d'acide nucléique dans un échantillon, lequel nécesaire comprend, sous forme emballée, une unité à plusieurs contenants comportant:
    (a) chacune de deux amorces oligonucléotidiques pour chaque séquence distincte à détecter,
    (I) si la séquence spécifique d'acide nucléique à détecter est monocaténaire, une amorce étant pratiquement complémentaire d'une extrémité du brin, de sorte qu'un produit d'extension deladite amorce, formé dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates, est pratiquement complémentaire dudit brin, et l'autre amorce étant pratiquement complémentaire d'une extrémité du brin dudit produit d'extension et pouvant être utilisée, dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates, pour synthétiser un autre produit d'extension en utilisant comme matrice ledit produit d'extension de de ladite amorce en tant que matrice, afin d'obtenir ainsi un acide nucléique constitué de deux brins; ou
    (II) si la séquence spécifique d'acide nucléique à détecter est bicaténaire, les amorces étant telles que chacune est pratiquement complémentaire d'une extrémité de l'un des brins et un produit d'extension synthétisé à partir de chaque amorce, au moyen de son brin complémentaire en tant que matrice, dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent inducteur de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates, lorsqu'il est séparé de son complément, pouvant servir de matrice pour la synthèse d'un produit d'extension de l'autre amorce dans des conditions d'hybridation et en présence d'un agent d'induction de polymérisation et des différents nucléoside triphosphates;
    (b) un agent de polymérisation;
    (c) chacun des différents nucloside triphosphates;
    (d) une sonde oligonucléotidique capable d'hybridation avec ladite séquence si celle-ci est présente dans ledit échantillon; et
    (e) un moyen pour la détection d'hybrides de ladite sonde et de ladite séquence.
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