JP2017514143A - メラノーマに使用するための抗ｄｌｌ３抗体および薬物コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

メラノーマの診断および処置に使用するための抗ＤＬＬ３抗体および抗体薬物コンジュゲート。

Description

全体が本明細書に組み込まれる２０１４年２月２１日に出願された米国仮出願第６１／９４２，７９６号に対して優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年２月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩの写しは、Ｓ６９６９７＿１２００ＷＯ＿ＳＥＱＬ＿０２２３１５．ｔｘｔと名付けられ、大きさが６０９ＫＢ（６２４，２９６バイト）である。
発明の分野
本出願は、一般に、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートおよびこれらの組成物を使用してメラノーマを診断、処置、監視および予防する方法に関する。
皮膚がんは、がんの最も一般的な形態であり、皮膚の上皮組織から誘導されるケラチノサイトのがん（基底細胞癌および扁平上皮癌）と、皮膚および身体の他の部位に存在する色素産生メラノサイトから誘導されるメラノーマとから構成される。メラノーマは、皮膚がんの５％未満を占めるが、皮膚がん関連死の８０％の原因となっている。皮膚局在化病期で早期に診断された場合、外科的切除により、通常、疾患は治癒し得る。したがって、病期Ｉのメラノーマについて、予後はかなり良好であり、５年生存率は９０％を超える。しかしながら、メラノーマの浸潤および転移する傾向のため、予後は病変が皮下により深く拡張するほど悪化する。転移性メラノーマは依然として処置が最も困難ながんの１つであり、外科的切除は一般に根治的処置の選択肢ではない。病期ＩＶのメラノーマについての５年生存率は１５％から２０％である。世界中でメラノーマの発生率は驚くべき速度で増加しており、メラノーマが発生する生涯リスクは、米国の男性で１／５８からオーストラリアの男性で１／２５もの高さである。ここ数十年の発生率の増加は、人々の日光曝露の習慣の変化により一部説明されるが、いくつかの遺伝性のリスク因子も知られている。
メラノーマの発生は複雑で、環境および遺伝的因子と関連している。色素特性は、メラノーマの発生率と強く相関しており、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ分類により定義される通り、Ｉ型の皮膚タイプはＶＩ型の皮膚タイプよりもリスクが高い。他の重要なリスク因子は、色素性母斑（一般的なほくろ）の数、異型母斑の数および悪性メラノーマの家族歴である。ＭＡＰＫ経路における変異は、メラノーマの発生において非常に重要であることが示されてきており、最大で９０％のメラノーマおよび良性メラノサイト性新生物は、ＢＲＡＦまたはＮＲＡＳのいずれかに活性化変異を有する。ＢＲＡＦ変異は、原発性皮膚メラノーマのおよそ５０％および悪性メラノーマの最大７０％で生じ（Ｔｈｏｍａｓら、２００４、ＰＭＩＤ：１５１４０２２８）、これらの変異の８０％は、６００位でのバリンからグルタミン酸への変化である（Ｖ６００Ｅ）（Ｄａｖｉｅｓら、２００２、ＰＭＩＤ：１２０６８３０８）。ＮＲＡＳ変異は、原発性皮膚メラノーマのおよそ２０％で生じる。メラノーマに対して最近開発されている処置は、メラノーマに伴うこれらの一般的な遺伝子変異に着目したものであり、例えば、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異に対するベムラフェニブが挙げられる。しかしながら、このような治療薬は、特異的変異により特徴付けられないメラノーマに対しては効果がない。さらにこれらの治療薬の多くは、多少の短期的利益は提供するものの、大部分において、腫瘍の悪化または再発のない永続的な治癒は提供できない。様々な変異特徴を有するメラノーマの処置に使用でき、持続的な寛解を提供する治療の開発が依然として強く必要とされている。
Ｔｈｏｍａｓら、２００４、ＰＭＩＤ：１５１４０２２８ Ｄａｖｉｅｓら、２００２、ＰＭＩＤ：１２０６８３０８
（発明の要旨）
本発明は、メラノーマ、例えば、不応性メラノーマを、抗ＤＬＬ３抗体および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、これらの医薬組成物および製品を使用して、診断、予後診断、処置、監視および予防する方法を開示する。さらに、本明細書では、ＤＬＬ３についての代用バイオマーカーが開示される。
本発明の一態様は、患者の予後を評価する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程、および（ｂ）決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る場合に予後不良を評価する工程を含む方法を提供する。関連する態様において、処置について患者を選択する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程、および（ｂ）決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る場合に、抗ＤＬＬ３抗体を使用する処置について患者を選択する工程を含む方法が提供される。これらの方法において、ＤＬＬ３発現レベルを決定する工程は、ＤＬＬ３タンパク質発現を、例えば、抗ＤＬＬ３抗体を使用して検出する工程を含むことができる。検出工程は、当該技術分野で公知の任意の適切な技術、例えば、免疫組織化学を含むことができる。閾値指標値は、本開示の検討に沿って当該技術分野で十分に理解されているように、使用する技術に従って変動する。一例として、免疫組織化学が検出方法として使用される場合、閾値指標値は、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０および最大３００のＨ−Ｓｃｏｒｅよりも通常大きい。
ＤＬＬ３レベルに関する予後診断、患者選択および／または検出のための開示された方法は、任意のＤＬＬ３抗体、例えば、配列番号１７３の軽鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲおよび配列番号１７５の重鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３抗体、または特定の態様において配列番号１７３の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１７５の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ３抗体を利用することができる。
さらにＤＬＬ３レベルに関する予後診断、患者選択および／または検出のための開示された方法は、本開示により示される治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを投与する処置工程をさらに含み得る。例えば、本発明のいくつかの態様において、治療抗体薬物コンジュゲートは、内在化抗体および／またはキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体もしくはヒト化抗体を含むことができる。本発明の特定の態様において、治療抗体薬物コンジュゲートは、配列番号１４９の軽鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲおよび配列番号１５１の重鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３抗体、または特定の態様において、配列番号４０５の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４０７の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ３抗体を含む。
本発明の別の態様は、メラノーマを処置する方法であって、単離された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその医薬的に許容される塩を投与する工程を含み、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ（式中、Ｍは抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌは場合によるリンカーを含み、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含み、ｎは１から２０の整数である）を含む方法を提供する。
メラノーマは、様々な点変異（例えば、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＫＩＴ）を通じて活性化された発がん遺伝子または様々な機構を通して発現抑制された腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２ＡおよびＰＴＥＮ）の発現によりしばしば特徴付けられる。本発明者らは、ＤＬＬ３を発現するメラノーマが、メラノーマにおける発がん遺伝子および腫瘍抑制因子の最も一般的な注釈の付された変異とは独立して、そうすることを見出した。これらのデータは、標的化薬剤（例えば、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ダサチニブ）でも処置されているメラノーマ患者またはこのような処置に不応性であるメラノーマを処置する可能性を示している。
したがって、本発明の一態様において、本発明の方法は、不応性メラノーマ、例えば、ダカルバジン不応性メラノーマまたはベムラフェニブ不応性メラノーマを処置するために使用することができる。
本発明の別の態様において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型ＢＲＡＦを発現しているメラノーマを処置するためにまたは変異ＢＲＡＦを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。別の態様において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型ＮＲＡＳを発現しているメラノーマを処置するためにまたは変異ＮＲＡＳを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。
本発明の特定の態様において、病期ＩＩのメラノーマを有する対象を処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程であって、決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る、工程、および（ｂ）抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで患者を処置する工程を含む方法が提供される。
本明細書で開示されるように、ＤＬＬ３発現は、メラノーマで発現している様々な遺伝子と正に相関していることが見出された。したがって、本発明の別の態様は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の正相関代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の正相関代用バイオマーカーの発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を提供する。
さらなる態様において、正相関代用バイオマーカーは、以下のマーカーＰＵＳ７、ＥＦＨＤ１、ＰＴＰ４Ａ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＵＤＴ１４、ＮＲ６Ａ１、ＪＡＧ２、ＨＡＵＳ５、ＡＤＡＴ３、ＰＡＦＡＨ１Ｂ３、ＣＣＤＣ１３６、ＧＡＳ５、ＰＰＦＩＡ３、ＣＤＫ８、ＺＮＦ１１４、ＫＨＳＲＰ、ＭＵＲＣ、ＺＮＲＤ１、ＲＰＳ１９、ＬＲＲＣ４３、ＺＣＣＨＣ３、ＬＩＮ９、ＺＮＦ４１７、ＡＴＯＨ８、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＢＣＬ７Ａ、ＣＨＲＮＢ２、ＣＡＭＫＫ１、ＳＮＯＲＡ４３、ＴＭＥＭ１１７、ＣＢＬＬ１、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＯＲ４Ｃ４６、ＺＮＦ５７０、ＦＡＮＣＦ、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＭ６、ＣＨＤ７の１つおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
本明細書で開示されるように、ＤＬＬ３発現は、メラノーマで発現される様々な遺伝子と反相関していることも見出された。したがって、本発明の一態様は、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の陽性の反相関代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の反相関代用バイオマーカーの低発現または無発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を提供する。代表的な反相関代用バイオマーカーとしては、ＺＢＴＢ２０、ＧＰＲ１５５、ＭＳＴ１、ＣＬＶＳ１、Ｐ４ＨＡ２、ＣＩＩＴＡ、ＩＴＰＲ２、ＢＲＫ１、ＴＧＯＬＮ２、ＴＡＤＡ３、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＫＣＮＱ１、ＴＭＥＤ６、ＮＲＸＮ３、ＳＮＸ２４、ＯＬＦＭＬ３、ＫＣＴ２、ＰＪＡ２、ＳＥＰＴ８およびこれらの組合せが挙げられる。
本発明者らは、ＤＬＬ３と相関している特定のバイオマーカーが分泌されており、したがって、例えば、血液または血清などの試料を使用する診断アッセイにおいて有用であり得ることをさらに発見した。したがって、本発明の別の態様は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の分泌された代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の分泌された代用バイオマーカーの発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を提供する。代表的な生物学的試料としては、血液試料が挙げられる。
さらなる態様において、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料、例えば、血液試料におけるＥＦＨＤの発現を決定する工程、およびＥＦＨＤが発現している場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を提供する。本発明の別の態様は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料、例えば、血液試料におけるＯＬＦＭＬ３の発現を決定する工程、およびＯＬＦＭＬ３が発現していることが見出される場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で対象を処置する工程を含む方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料におけるＪＡＧ２の発現を決定する工程、およびＪＡＧ２が低発現である場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で対象を処置する工程を含む方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料におけるＮＲＸＮ２の発現を決定する工程、およびＮＲＸＮ２が低発現である場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で対象を処置する工程を含む方法を提供する。
開示された処置方法は、抗ＤＬＬ３抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物コンジュゲートを使用して実施される。本発明のいくつかの態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、内在化抗体および／またはキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体もしくはヒト化抗体である。例えば、開示された処置方法において、治療抗体薬物コンジュゲートは、配列番号１４９の軽鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲおよび配列番号１５１の重鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３抗体、または特定の態様において、配列番号４０５の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４０７の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ３抗体を含むことができる。
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化および詳細の省略を含む。結果として、当業者は、概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴または必須の特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を決定する際の補助として利用されることも意図していない。
培養メラノサイト、メラノーマ（ＭＥＬ）腫瘍組織およびぶどう膜メラノーマ試料（ＵＶＭ）に由来するＲＮＡの全トランスクリプトーム（ＳＯＬｉＤ）配列決定を使用して測定されたＤＬＬ３の発現レベルを示す図である。 正常皮膚、ケラチノサイトおよび線維芽細胞（正常皮膚）、培養正常メラノサイト、原発性患者生検標本（「ｐ０」で示す）ならびにマウスで継代したＭＥＬ患者由来異種移植（ＰＤＸ）腫瘍から単離された様々なＲＮＡ試料における、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるときのＤＬＬ３転写産物の相対発現レベルを示す図である。 正常組織およびＭＥＬ ＰＤＸ細胞株におけるマイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定されるＤＬＬ３転写産物発現の正規化強度値を示す図である。 様々な正常組織および公的に利用可能なデータセットであるがんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）からの原発性メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３転写産物の発現を示す図である。 ＴＣＧＡデータセットからの原発性メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３転写産物の高発現および低発現に基づくＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す図であり、ここで閾値指標値は、ＲＰＫＭ値の算術平均を使用して決定される。病期Ｉ−ＩＶのメラノーマを有する患者を示す。 ＴＣＧＡデータセットからの原発性メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３転写産物の高発現および低発現に基づくＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す図であり、ここで閾値指標値は、ＲＰＫＭ値の算術平均を使用して決定される。メラノーマの病期分類に基づき階層化した患者を示す。 例示的抗ＤＬＬ３抗体のビニング、ドメインマッピングおよび親和性特徴を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的マウスおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の軽鎖および重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を示す図である。 例示的抗ＤＬＬ３抗体のドメインレベルマッピング解析の結果を示す図である。 正常組織、培養メラノサイトおよびＭＥＬ ＰＤＸにおける電気化学発光サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されたヒトＤＬＬ３の相対的タンパク質発現を示す図である。 様々な原発性ＭＥＬ生検試料およびＭＥＬ ＰＤＸにおける抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体または対照マウスＩｇＧ２ａ抗体を使用した免疫組織化学解析の結果を、細胞に対して計算されるパーセンテージを−（発現なし）から＋＋＋（高発現）までスコア化して、細胞質で見られる発現（ｃ）または膜で見られる発現（ｍ）として示す図である。 フローサイトメトリにより決定される代表的ＭＥＬ ＰＤＸ細胞株におけるＤＬＬ３の表面タンパク質発現（黒線）を、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ、ＦＭＯ）アイソタイプ対照染色集団（固形灰色）と比較して示す図である。 フローサイトメトリにより決定される培養正常メラノサイトにおけるＤＬＬ３またはＭＣＳＰの表面タンパク質発現（黒線）を、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）アイソタイプ対照染色集団（固形灰色）と比較して示す図である。 選択されたコンジュゲート化抗ＤＬＬ３抗体が、インビトロでＭＥＬ腫瘍細胞を殺傷および／または成長抑制する能力を示す図である。 選択された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートまたは標準治療ダカルバジンのインビボでＭＥＬ腫瘍細胞を殺傷および／または成長抑制する能力を示す図である。 選択された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートまたは標準治療ダカルバジンのインビボでＭＥＬ腫瘍細胞を殺傷および／または成長抑制する能力を示す図である。 選択された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートまたは標準治療ダカルバジンのインビボでＭＥＬ腫瘍細胞を殺傷および／または成長抑制する能力を示す図である。 選択された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートまたは標準治療ダカルバジンのインビボでＭＥＬ腫瘍細胞を殺傷および／または成長抑制する能力を示す図である。 ＭＥＬ ＰＤＸにおけるＤＬＬ３発現と正相関する代用バイオマーカーの遺伝子を列挙した図である。 ＢＭＥＬ ＰＤＸにおけるＤＬＬ３発現と反相関する代用バイオマーカーの遺伝子を列挙した図である。 ４つの代用バイオマーカーのプロットを示す図であり、２つはＤＬＬ３と相関するマーカー（例えば、ＥＦＨＤ１およびＪＡＧ２）であり、２つは反相関するマーカー（例えば、ＮＲＸＮ２またはＯＬＦＭＬ３）である。 ＤＬＬ３を発現している（左）またはＤＬＬ３の発現が欠乏している（右）、転移性メラノーマにおいて一般に変異している発がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の点変異またはコピー数変化（ＣＮＶ）を含むＭＥＬ ＰＤＸの数を列挙する表である。 抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１の存在下の腫瘍体積の減少を示す図である。 限界希釈アッセイおよびＰｏｉｓｓｏｎ分布統計を使用した解析に基づいて、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置されたＭＥＬ腫瘍細胞が、ＰＢＤ１にコンジュゲートしたＩｇＧ１で処置されたＭＥＬ腫瘍または未処置腫瘍と比較して、がん幹細胞の出現頻度の減少を示したことを示す図である。
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、組織化を目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースおよび／またはＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
本発明は、メラノーマの予後診断、診断、診断治療、処置および／または予防のための抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣの使用を提供する。
Ｉ．ＤＬＬ３生理学
デルタ様３（ＤＬＬ３；ＳＣＤＯ１としても知られる）は、Ｎｏｔｃｈ Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ ＬＡＧ２（ＤＳＬ）リガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で最初に同定され、後に、無脊椎動物から脊椎動物へ進化的に保存されていることが示され、正常胚発生、成体組織恒常性および幹細胞維持を含む一連の根本的な生物学的過程に関与している（Ｄ’Ｓｏｕｚａら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０８１６３９３；Ｌｉｕら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０８１６４０２）。ヒトでは４つの既知のＮｏｔｃｈ受容体と５つのＤＳＬリガンド、つまりＪａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２として知られる２つのＳｅｒｒａｔｅホモログと、デルタ様リガンドまたはＤＬＬ１、ＤＬＬ３およびＤＬＬ４と称される３つのＤｅｌｔａホモログがある。
代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソログとして、これらに限定されないが、ヒト（受託番号ＮＰ＿０５８６３７（配列番号１）およびＮＰ＿９８２３５３（配列番号２））、チンパンジー（受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（受託番号ＮＰ＿０３１８９２）ならびにラット（受託番号ＮＰ＿４４６１１８）が挙げられる。ヒトにおいて、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３に位置する９．５ｋＢｐに及ぶ８つのエクソンからなる。最後のエクソン内の代替的スプライシングにより、２つのプロセシングされた転写産物が生じ、２３８９塩基（受託番号ＮＭ＿０１６９４１）の１つおよび２０５２塩基（受託番号ＮＭ＿２０３４８６）の１つである。前者の転写産物は、６１８アミノ酸タンパク質（受託番号ＮＰ＿０５８６３７）をコードし、一方で後者は５８７アミノ酸タンパク質（受託番号ＮＰ＿９８２３５３）をコードしている。ＤＬＬ３のこれらの２つのタンパク質アイソフォームは、それらの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびそれらの膜貫通ドメインにわたって、全体的に１００％の同一性を有し、長い方のアイソフォームは、タンパク質のカルボキシ末端で３２個のさらなる残基を含有する延長された細胞質側末端を含有する点のみが異なっている。アイソフォームの生物学的関連性は不明であるが、両方のアイソフォームが、腫瘍細胞で検出され得る（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／２７３９１）。
一般に、ＤＳＬリガンドは、一連の構造ドメイン：固有のＮ末端ドメイン、次いで保存されたＤＳＬドメイン、複数のタンデム上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピート、膜貫通ドメイン、およびリガンドにわたって高度に保存されていないが特有のＥ３ユビキチンリガーゼによりユビキチン化され得る部位である複数のリシン残基を含有する細胞質ドメインからなる。ＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用のために必要ではあるが十分ではない変性ＥＧＦドメインである。さらに、ほとんどのＤＳＬリガンドの最初の２つのＥＧＦ様リピートは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化時にＤＳＬドメインと協調的に相互作用するＤＯＳドメインとして知られる小さいタンパク質配列モチーフを含有する。
ＤＬＬ３タンパク質のＥＣＤは、６つのＥＧＦ様ドメイン、１つのＤＳＬドメインおよびＮ末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、ヒトＤＬＬ３の約２１６〜２４９（ドメイン１）、２７４〜３１０（ドメイン２）、３１２〜３５１（ドメイン３）、３５３〜３８９（ドメイン４）、３９１〜４２７（ドメイン５）および４２９〜４６５（ドメイン６）のアミノ酸残基で生じ、ＤＳＬドメインは約１７６〜２１５のアミノ酸残基、Ｎ末端ドメインは約２７〜１７５のアミノ酸残基で生じると認識されている。本開示の目的に関して、各ＥＧＦ様ドメインはＥＧＦ１からＥＧＦ６と称される場合があり、ＥＧＦ１がタンパク質のＮ末端部分に最も近い。ＤＬＬ３の両方のアイソフォームにおいて、成熟タンパク質は、細胞表面発現する前に切断され得る２６アミノ酸のシグナルペプチドを含む。したがって、成熟タンパク質において、Ｎ末端ドメインは、タンパク質の２７位からＤＳＬドメインの開始点まで伸びる。
ＤＬＬ３遺伝子の欠損は、ヒトにおける脊椎肋骨異骨症と関係しており、重度の先天性出生時欠損は異常な椎骨形成および肋骨奇形に至る。これは、適切な発生のためにＮｏｔｃｈ、ＷｎｔおよびＦＧＦシグナル伝達経路間の微妙に調節された周期的相互作用を必要とする体節、胚前駆体から椎骨への極性およびパターン形成の決定に重要な役割を果たすことが知られているＮｏｔｃｈシグナル伝達の変化と関係している。ＤＬＬ１およびＤＬＬ３は、通常、発生中のマウス胚内の同様の場所で発現するが、トランスジェニックマウスを用いた実験で、ＤＬＬ３がＤＬＬ１を代償するものではないことが実証されている。ＤＬＬ１ノックアウトマウスは胚致死性であるが、ＤＬＬ３変異マウスは生存し、しかも脊椎肋骨異骨症のヒトにおいて見出だされる表現型と類似した表現型を示す。これらのデータは、正常発生に不可欠なＮｏｔｃｈトランスおよびシス相互作用の微妙な相互作用と一致する。
一般に、シグナル受信細胞の表面上のＮｏｔｃｈ受容体は、反対のシグナル送信細胞の表面に発現するリガンドとの相互作用によって活性化される（トランス相互作用と称される）。これらのトランス相互作用は、Ｎｏｔｃｈ受容体の一連のプロテアーゼ媒介切断を引き起こす。結果として、Ｎｏｔｃｈ受容体細胞内ドメインは、膜から核へ自由に移動し、核で転写因子ＣＳＬファミリー（ヒトではＲＢＰＪ）と対になり、これらを転写抑制因子からＮｏｔｃｈ応答遺伝子の活性化因子へと変換する。しかし、ヒトＮｏｔｃｈリガンドのうち、ＤＬＬ３は、トランス相互作用を介してＮｏｔｃｈ受容体を活性化できないようである点で異なっている（Ｌａｄｉら、２００５、ＰＭＩＤ：１６１４４９０２）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特異化、パターン形成および形態形成中の様々な細胞型にとって重要である。しばしば、この伝達は側方阻害機構を通じて生じ、この場合にＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞は、デフォルトの細胞運命を採択しても、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の刺激を介し、隣接細胞においてこの運命を抑制する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達により媒介されるこのバイナリーな細胞運命選択は、多数の組織で役割を果たしていることが見出されており、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達により増殖または自己再生を始動または阻害させる発生およびシグナル伝達の合図の幅広い状況で生じる。
様々なデルタ様リガンドのうち、ＤＬＬ３は、変性ＤＳＬドメインを含有し、ＤＯＳモチーフを含有せず、リシン残基が欠如した細胞内ドメインを含有するため、ファミリーの中で最も他と異なっている。変性ＤＳＬおよびＤＯＳモチーフの欠如は、ＤＬＬ３がトランス（細胞間）でＮｏｔｃｈシグナル伝達を開始できないことと一致しており、ＤＬＬ３が、ＤＬＬ１またはＤＬＬ４と異なり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤としてのみ作用することを示唆している（Ｌａｄｉら、２００５、ＰＭＩＤ：１６１４４９０２）。研究により、ＤＬＬ３が、主にｃｉｓ−ゴルジに常在し得ることが示されている。一部のＤＬＬ３タンパク質は、インビトロ過剰発現系において細胞表面で発現したことが示されている（Ｌａｄｉら、２００５、ＰＭＩＤ：１６１４４９０２）。しかしながら、これが正常な生物学的状況またはＤＬＬ３ ｍＲＮＡ転写産物が上昇している腫瘍における状況なのかは明らかでない。やや驚くべきことに、腫瘍におけるＤＬＬ３タンパク質発現レベルに基づいて、著しい量のＤＬＬ３タンパク質が実際に様々な腫瘍の細胞表面へ脱出しているらしいことが示された（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／２７３９１）。
ＩＩ．メラノーマ
本明細書に開示された組成物および方法は、メラノーマを診断、監視、処置または予防するために使用することができる。用語「メラノーマ」は、本明細書で使用される場合、全ての種類のメラノーマ、例えば、これらに限定されないが、原発性メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、真皮外メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、ポリープ状メラノーマ、黒色癌、黒色上皮腫、黒色肉腫、上皮内メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、結節型悪性メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、黒子型メラノーマ、黒子型悪性メラノーマ、粘膜部黒子型メラノーマ、粘膜部メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、軟組織メラノーマ、眼内メラノーマ、浸潤性メラノーマ、家族性異型母斑メラノーマ（ＦＡＭ−Ｍ）症候群、線維形成性悪性メラノーマまたはぶどう膜メラノーマを含む。
転移性メラノーマは、メラノサイト、メラノサイト性母斑または異型母斑から誘導され得、様々な腫瘍進行期（例えば、肥大成長期または垂直成長期）を通じて進行し得る。メラノーマは、染色体異常、退行性の成長（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ）および／または発達障害、分裂促進剤、紫外線照射、ウイルス感染、発がん剤、様々な遺伝子変異または遺伝子の異常発現に起因し得る。
１．メラノーマの病期
病期０のメラノーマは、上皮内メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｓｉｔｕはラテン語で「本来の場所にて」）として知られる非常に初期段階の疾患である。上皮内メラノーマを有する患者は、ＴｉｓＮＯＭ（上皮内腫瘍）として分類される。腫瘍は上皮に限定されており、周囲組織、リンパ節または遠隔部位の浸潤はない。上皮内メラノーマは、疾患再発またはリンパ節もしくは遠隔部位への拡散のリスクが非常に低いと考えられている。
病期Ｉのメラノーマは、腫瘍の厚さ、有糸分裂の存在および数ならびに潰瘍形成状態により特徴付けられる。所属リンパ節または遠隔転移の証拠はない。病期Ｉのメラノーマは、再発および転移のリスクが低いと考えられる。病期Ｉのメラノーマの２つの小分類がある：（ｉ）病期ＩＡ（Ｔ１ａＮ０Ｍ０）：腫瘍が１ｍｍ以下で、潰瘍を伴わず、有糸分裂がない；および（ｉｉ）病期ＩＢ（Ｔ１ｂＮ０Ｍ０またはＴ２ａＮ０Ｍ０）：腫瘍が１ｍｍ以下で、潰瘍または有糸分裂を伴う。
病期ＩＩのメラノーマも、腫瘍の厚さおよび潰瘍形成状態によって特徴付けられる局在性腫瘍である。一般的に、所属リンパ節または遠隔転移の証拠はない。処置すると、病期ＩＩの疾患は、局所的再発または遠隔転移について中間リスクになると考えられる。病期ＩＩのメラノーマには、以下の３つの小分類がある：（ａ）病期ＩＩＡ（Ｔ２ｂＮ０Ｍ０またはＴ３ａＮ０Ｍ０）、これは、（ｉ）２ｂ、腫瘍が厚さ１．０１〜２．０ｍｍで、潰瘍を伴う；（ｉｉ）Ｔ３ａ、腫瘍が厚さ２．０１〜４．０ｍｍで、潰瘍を伴わない；（ｉｉｉ）Ｎ０、腫瘍が近傍リンパ節に拡散していない；および（ｉｖ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含み；（ｂ）病期ＩＩＢ（Ｔ３ｂＮ０Ｍ０またはＴ４ａＮ０Ｍ０病期ＩＩＢ、Ｔ３ｂＮ０Ｍ０またはＴ４ａＮ０Ｍ０）、これは、（ｉ）Ｔ３ｂ、腫瘍が厚さ２．０１〜４．０ｍｍで、潰瘍を伴う；（ｉｉ）Ｔ４ａ、腫瘍が厚さ４．０ｍｍを超え、潰瘍を伴わない；（ｉｉｉ）Ｎ０、腫瘍が近傍リンパ節に拡散していない；および（ｉｖ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含み；ならびに（ｃ）病期ＩＩＣ（Ｔ４ｂＮ０Ｍ０）、これは、（ｉ）Ｔ４ｂ、腫瘍が厚さ４．０ｍｍを超え、潰瘍を伴う、（ｉｉ）Ｎ０、腫瘍が近傍リンパ節に拡散していない；および（ｉｉｉ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含む。
病期ＩＩＩのメラノーマは、所属リンパ節に拡散した、またはイントランジット転移もしくは衛星転移を起こした腫瘍である。遠隔転移の証拠はないことが多い。処置すると、病期ＩＩＩの疾患は、局所的再発または遠隔転移について中間から高リスクであると考えられる。病期ＩＩＩのメラノーマは、一般的に、腫瘍が拡散しているリンパ節の数、リンパ節に拡散している腫瘍が微視的または巨視的であるか、イントランジットまたは衛星腫瘍の存在およびリンパ節の拡散源である原発腫瘍が潰瘍の証拠を示しているかによって定義される。原発性メラノーマの部分を覆っている上皮は、無傷でないことが多い。潰瘍は、病理学者による組織の微視的評価により決定され、肉眼で見えるものでは決定されない。微小転移は、肉眼で視認できない小さな腫瘍である。微小転移は、センチネルリンパ節生検または選択的リンパ節郭清後に微視的評価で検出し得る。マクロ転移はしばしば、外科医または病理学者により身体検査中に蝕知される場合もあるし、または検査の際に肉眼で観察される場合もある。存在はしばしば、リンパ節郭清によって、または腫瘍がリンパ節被膜を超えて延びていると観察されるときに、確認される。
病期ＩＩＩのメラノーマの小分類には、以下が含まれる：（ａ）病期ＩＩＩＡ（Ｔ１−Ｔ４ａ Ｎ１ａＭ０またはＴ１−Ｔ４ａＮ２ａＭ０）であり、これは、（ｉ）Ｔ１−Ｔ４ａ、腫瘍が潰瘍を伴わず、サイズが厚さ１．０ｍｍ未満から４．０ｍｍを超える範囲である；（ｉｉ）Ｎ１ａ、微小転移が１個の近傍リンパ節に認められる；（ｉｉｉ）Ｎ２ａ、微小転移が２〜３個の近傍リンパ節に認められる；および（ｉｉｉ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含み；（ｂ）病期ＩＩＩＢ（Ｔ１−Ｔ４ｂＮ１ａＭ０、Ｔ１−Ｔ４ｂＮ２ａＭ０、Ｔ１−Ｔ４ａＮ１ｂＭ０、Ｔ１−Ｔ４ａＮ２ｂＭ０またはＴ１−Ｔ４ａ／ｂＮ２ｃＭ０）であり、これは、（ｉ）Ｔ１−Ｔ４ａ、腫瘍が潰瘍を伴わず、サイズが厚さ１．０ｍｍ未満から４．０ｍｍを超える範囲である；（ｉｉ）Ｔ１−４−ｂ、腫瘍が潰瘍を伴い、サイズが厚さ１．０ｍｍ未満から４．０ｍｍを超える範囲である；（ｉｉｉ）Ｎ１ｂ、マクロ転移が１個の近傍リンパ節に認められる；（ｉｖ）Ｎ２ｂ、マクロ転移が２〜３個の近傍リンパ節に認められる；（ｖ）Ｎ２ｃ、イントランジット転移または衛星転移が存在する；および（ｖｉ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含み；ならびに（ｃ）病期ＩＩＩＣ（Ｔ１−４−ｂＮ１ｂＮ０、Ｔ１−４−ｂＮ２ｂＭ０、Ｔ１−４−ａＮ３Ｍ０またはＴ１−４−ｂＮ３Ｍ０）であり、これは、（ｉ）Ｔ１−Ｔ４ａ、腫瘍が潰瘍を伴わず、サイズが厚さ１．０ｍｍ未満から４．０ｍｍを超える範囲である；（ｉｉ）Ｔ１−４−ｂ、腫瘍が潰瘍を伴い、サイズが厚さ１．０ｍｍ未満から４．０ｍｍを超える範囲である；（ｉｉｉ）Ｎ１ｂ、マクロ転移が１個の近傍リンパ節に認められる；（ｉｖ）Ｎ２ｂ、マクロ転移が２〜３個の近傍リンパ節に認められる；（ｖ）Ｎ３、４個以上のリンパ節転移、癒着したリンパ節の存在またはイントランジット／衛星転移および転移性リンパ節の組合せ；ならびに（ｖｉ）Ｍ０、腫瘍が原発腫瘍から遠隔部位に拡散していないものを含む。
病期ＩＶのメラノーマは、しばしば所属リンパ節を超えた身体の遠隔部位への転移を伴う。一般的な転移部位は、生命維持に重要な臓器（肺、腹部臓器、脳および骨）ならびに軟組織（皮膚、皮下組織および遠隔リンパ節）である。病期ＩＶのメラノーマは、遠隔転移の場所、腫瘍の数および大きさ、ならびに血清乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルによって特徴付けられ得る。ＬＤＨは、血液中および多くの身体組織で見出される酵素である。ＬＤＨレベルの上昇は、通常、腫瘍が内部臓器に拡散していることを示す。
病期ＩＶのメラノーマは、一般に、Ｔ分類もＮ分類も含まず、以下を含む：（ａ）Ｍ１ａ、腫瘍が、遠隔皮膚、皮下層または遠隔リンパ節に転移しており、血清ＬＤＨが正常である；（ｂ）Ｍ１ｂ、腫瘍が肺に転移しており、血清ＬＤＨが正常である；および（ｃ）Ｍ１ｃ、腫瘍が肺以外の生命維持に重要な臓器に転移しており、血清ＬＤＨが正常であり、ＬＤＨの上昇を伴う何らかの遠隔転移がある。
本発明の抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣは、限定された病期のメラノーマまたは広範囲の病期のメラノーマを示す患者を診断または処置するために使用することができる。本発明のいくつかの実施形態において、メラノーマは、本明細書で定義される病期Ｉ、病期ＩＩ、病期ＩＩＩ、病期ＩＶまたは病期Ｖのメラノーマであり得る。
２．メラノーマの変異状態
正常メラノサイトのメラノーマ細胞への形質転換は、細胞増殖を通常導く成長刺激経路の活性化ならびにアポトーシスおよび腫瘍抑制経路の不活性化により達成される。細胞の形質転換および腫瘍進行に関わる標的遺伝子は、発がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子（成長抑制遺伝子としても知られる）の２つのカテゴリーに分類される。点変異（例えば、ＲＡＦおよびＲＡＳ）、増幅、転位（例えば、ＭＹＣ）、またはさらには非真核性配列の挿入による発がん遺伝子の活性化により、この遺伝子を束縛している正常な制御機構が蝕まれ、細胞増殖が生じる発がん遺伝子がもたらされる。腫瘍抑制遺伝子の不活性化は、主に対立遺伝子の欠失、次いで対側性対立遺伝子の点変異を通して生じる。発がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変化は、メラノーマにおいて広く知られており、様々な治療がこれらの変化を標的とするために開発されている。
本発明者らは、ＤＬＬ３を発現するメラノーマが、メラノーマにおける発がん遺伝子および腫瘍抑制因子の最も一般的な注釈の付された変異とは独立して、そうすることを見出した。したがって、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型または変異発がん遺伝子を発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型発がん遺伝子を発現するメラノーマを処置するために使用され、一方、他の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、変異発がん遺伝子を発現しているメラノーマを処置するために使用される。野生型または変異型のいずれかとしてメラノーマで発現され、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣで処置し得る発がん遺伝子の例は、ＲＡＦファミリー（ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ）、ＢＲＡＦ（例えば、以下の変異を有するＢＲＡＦ：Ｖ６００Ｅ、Ｒ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｖ６００Ｋ、Ａ７２７Ｖ）、ＲＡＳファミリー（ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ）（例えば、以下の変異を有するＮＲＡＳ：Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ）、ＭＩＴＦ（例えば、Ｅ３１８Ｋ変異および過剰発現を導く様々な機構を有するＭＩＴＦ）、ＭＣ１Ｒ（例えば、以下の変異を有するＭＣ１Ｒ：Ｖ６０Ｌ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｗ、Ｄ２９４Ｈ）、ｃ−Ｋｉｔ（例えば、点変異の活性化または増加されたコピー数）、ＧＲＩＮ２Ａ（例えば、リガンド結合を変化させるいくつかを含む様々な点変異）、ＥＲＢＢ４（例えば、主に細胞外ドメインにおける機能的変異の獲得）、ＥＧＦＲ（例えば、点変異および限局的増幅）、ＡＫＴ３（例えば、コピー数増加および点変異）、ＴＧＦβ２、ＷＮＴ５Ａ、ＲＡＣ１（例えば、Ｐ２９Ｓバリアント）、ＰＲＥＸ１およびＰＲＥＸ２（例えば、変異、増幅、再配列）、ＢＲＣＡ２、ＢＣＬ２、ＧＮＡＱ（例えば、Ｑ２０９Ｌ）、ＧＮＡ１１（例えば、Ｒ１８３）、ＣＤＫ４（例えば、Ｒ２４Ｃおよび他の変異ならびに増幅）ならびに／またはＭＭＰ８（例えば、Ｓ５０Ｆ、Ｐ７８Ｓ、Ｋ８７Ｎ、Ｇ１０４Ｒ、Ｅ１３８Ｑ）である。１つまたは両方の対立遺伝子が失われている、後成的機構を通じて発現抑制されているまたは変異されているメラノーマにおける変異腫瘍抑制遺伝子の例としては、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（生殖系列および体性変異）、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＢＣＬＡＦ１およびＲＢ１が挙げられる。本発明の抗ＤＬＬ３抗体による、変異腫瘍抑制遺伝子を有する腫瘍の処置も本明細書において検討される。
一実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型ＢＲＡＦを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、例えば、Ｖ６００Ｅ変異またはＶ６００Ｒ変異を含む変異ＢＲＡＦを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。さらなる実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、野生型ＮＲＡＳを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。他の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、例えば、Ｑ６１ＫまたはＱ６１Ｒ変異を有する変異ＮＲＡＳを発現しているメラノーマを処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、変異ＢＡＰ１、ＥＩＦ１ＡＸまたはＳＦ３Ｂ１遺伝子を発現しているぶどう膜メラノーマを処置するために使用することができる。
原発性ＭＥＬ腫瘍またはＭＥＬ患者由来異種移植（ＰＤＸ）株の様々な関連遺伝子の変異状態は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の標的化再配列決定を実施することによって決定されてもよい。例示的実施形態において、ｇＤＮＡの標的化再配列決定は、それぞれのＭＥＬ ＰＤＸ細胞株由来のｇＤＮＡを使用して実施し、２５０ｂｐまでの３０００を超えるアンプリコンを包含し、多数の遺伝子のコード領域および非コード領域を網羅する、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２．０およびＡｍｐｌｉＳｅｑプライマーのカスタムパネル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ライブラリを生成することができる。各試料は、Ｉｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ Ｂａｒｃｏｄｅ Ａｄａｐｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結させて、各配列決定の実施のために複数の試料をプールしてもよい。配列決定は、次いで、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ機器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施されてもよく、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ転写産物およびタンパク質レベルで変化を導くメラノーマ−関連遺伝子の配列の変動を同定するためにデータ解析が実施されてもよい。いくつかの実施形態において、様々な遺伝子変異とＤＬＬ３の発現との間に相関があるかを決定するために、メラノーマ関連遺伝子の変異状態が代用バイオマーカー（下記により詳細に記載）として使用されてもよく、この決定は、本発明の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣで腫瘍（例えば、ＭＥＬ）を処置する有効性の情報となり得る。
一実施形態において、メラノーマ発がん遺伝子の変異状態を使用して、遺伝子変異と本発明の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣによる処置に対する応答との間に相関があるかが決定され得る。さらなる実施形態において、メラノーマ発がん遺伝子の変異状態を使用して、効果的な併用療法（下記により詳細に記載）が決定され得る。
３．メラノーマの処置
本明細書の方法および組成物、例えば、本発明の抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣは、対象または患者におけるメラノーマの診断、処置、予防または病期分類に有用であり得る。「対象」または「患者」は、ヒトであり得、または哺乳動物種、例えば、マウス、ラットもしくはカニクイザルであり得る。用語、例えば、「処置すること」または「処置」または「処置するための」は、診断された病理学的状態または障害の症状を治癒、減速、減少させるおよび／または進行を停止させる治療的効果と、標的とする病理学的状態または障害の発生を防止および／または減速させる予防的手段との両方を指す。処置され得る患者には、メラノーマに罹患している患者、メラノーマに罹患し易い患者およびメラノーマを予防すべき患者が挙げられる。
センチネルリンパ節生検は、通常、１．０ｍｍを超える厚さの病期Ｉの腫瘍および任意の潰瘍を伴う任意の厚さの腫瘍に対して推奨される処置である。目的は、原発腫瘍からの流入を受ける最初のリンパ節であるセンチネル節に何らかのがん細胞が拡散しているかどうかを決定することである。生検の結果は、処置の方針を導くのに役立ち得る。センチネル節生検は、腫瘍および周囲皮膚を除去する外科手術の前に実施される場合、最も的確であることが多い。病期ＩＡの５年生存率は約９７％であり、１０年生存率は約９７％であり、病期ＩＩＡの５年生存率は約９２％であり、１０年生存率は約８６％である。
病期ＩまたはＩＩのメラノーマを有する患者は、腫瘍の起源または予後を決定するために使用し得る分子マーカーを使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）染色でさらに病期分類することができ、例えば、Ｓ１００、ＨＭＢ−４５、Ｋｉ−６７（ＭＩＢ１）、ＭＩＴＦ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＵＣ１８、ＰＣＮＡ、ＩＮＫ４Ａなどの抗体またはいくつかの抗体のカクテルを染色に使用し得る（Ｉｖａｎ ａｎｄ Ｐｒｉｅｔｏ、２０１０、ＰＭＩＤ：２０６２４１２８；Ｌｉｎｏｓら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１６５７８４２；Ｒｏｔｈｂｅｒｇら２００９、ＰＭＩＤ：１９３１８６３５）。いくつかの実施形態において、他の病理組織学的検査（例えば、ヘマトキシリンおよびエオシン染色）が、メラノーマのさらなる病期分類のために使用されてもよい。本発明の一実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．６５；配列番号１７３および１７５）を免疫組織化学染色に使用して、病期ＩＩまたは病期ＩＩＩのメラノーマ患者の予後が決定され得る。
外科手術は、病期Ｉのメラノーマに対する一般的な処置である。外科手術の目的は、生検後に残存するあらゆるがんを除去することである。この手法は広範囲局所切除と称される。外科医は、生検部位だけでなく、外科的マージン、正常に見える皮膚の周囲の領域および下層の皮下組織を含めて、腫瘍を除去する。切除されるマージンの幅は、原発腫瘍の厚さに依存する。外科手術の最近の進歩により、外科医は以前より狭いマージンを切除することが可能となり、より多くの正常皮膚が残される。
病期Ｉについて記載した生検および外科手術に加えて、病期ＩＩの処置は、外科手術後に一次がん処置に加えて行われる処置であるアジュバント療法を含んでもよい。全身治療は、血流を通って移動し、全身のがん細胞に到達して作用する物質を使用する。処置としては、ウイルス感染および疾患に応答して、ほとんどの身体組織の正常細胞により産生される天然タンパク質のインターフェロンが挙げられる。インターフェロン療法は、身体の免疫系が疾患とより効果的に闘うことを助けることが示されている。研究により、インターフェロンの製品形態である低用量インターフェロンα−２ａは、病期ＩＩのメラノーマおよびより高リスクの病期ＩＩＢの疾患を有する患者における再発を一貫して遅延させるが、全体的な生存を延ばしはしないことが示されている。高用量インターフェロンα−２ｂは、高リスクの病期ＩＩＢおよび病期ＩＩＩのメラノーマを有する患者において、疾患の無い全体的な生存を顕著に延ばすことが示されている。ワクチンは、インターフェロンと同様に、免疫系をブーストしてメラノーマの再発と闘うことができる。ワクチン療法は、インターフェロンなどの免疫療法の副作用に耐えることができない患者のための治療として検討されてきた。病期ＩＩＡの５年生存率は約８１％であり、１０年生存率は約６７％であり、病期ＩＩＢの５年生存率は約７０％であり、１０年生存率は約５７％であり、病期ＩＩＣの５年生存率は約５３％であり、１０年生存率は約４０％である。
ＤＬＬ３が、メラノーマ患者における転帰不良の予後診断マーカーであると決定された。驚くべきことに、切除およびアジュバント療法により一般に良好な転帰が得られる病期ＩＩのメラノーマと診断された患者でも、ＤＬＬ３発現は予後不良の指標である（実施例４；図４Ｂおよび４Ｃ参照）。したがって一実施形態において本発明は、病期ＩＩのメラノーマを有する対象を処置する方法であって、対象における病期ＩＩのメラノーマを診断する工程、患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３の発現を決定する工程、およびこのような試料が閾値指標値を上回るＤＬＬ３発現を有する場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を開示する。
病期ＩＩＩのメラノーマの処置には、がんリンパ節が見出された部位から所属リンパ節を除去する外科手術である治療的リンパ節郭清（ＴＬＮＤ）に加えて、上記の外科手術およびアジュバント療法が含まれることが多い。このような外科手術は、マクロ転移を有する患者に対して非常に推奨される。外科手術の目的は、疾患がリンパ系を通じてさらに拡散することを予防することである。ＴＬＮＤは、未処置のリンパ節疾患によりしばしば生じる痛みの制御においても重要な役割を果たす。リンパマッピングおよびセンチネル節生検は、一般に、臨床的に診断された病期ＩＩＩ疾患を有する患者には推奨されていない。しかしながらこれらの手法は、病期ＩＩＩ疾患の特定の亜群を有する患者に対して推奨され得る。アジュバント放射線療法は、無作為化対照研究では有益であることが証明されていないが、腫瘍がリンパ節の外に出て周囲組織の中へ成長するときにしばしば推奨される（関節外拡散）。目的は、疾患のさらなる拡散を制御することである。病期ＩＩＩＡの５年生存率は約７８％であり、１０年生存率は約６８％であり、病期ＩＩＩＢの５年生存率は約５９％であり、１０年生存率は約４３％であり、病期ＩＩＩＣの５年生存率は約４０％であり、１０年生存率は約２４％である。
これまで病期ＩＶのメラノーマにおいて生存を延長または疾患を治癒させることが決定的に示された処置はない。代わりに、処置の焦点は疾患によって生じる不快な症状の軽減に当てられている。処置としては、身体の他の部位に転移しているがん性腫瘍またはリンパ節の数がわずかであり、症状を引き起こしている場合に、これらの腫瘍またはリンパ節を除去するための外科手術、確立された実験的な全身治療および放射線療法が挙げられる。放射線療法（ｒａｄｉａｎ ｔｈｅｒａｐｙ）は、一般的に、外科手術が不可能または複雑となり得る進行したケースのためおよび脳または骨への転移性疾患の症状を軽減するのにもっぱら使用される。病期ＩＶの５年生存率は約１５％であり、１０年生存率は約２４％である。
さらなる実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、不応性メラノーマを処置するために使用し得る。本明細書で使用される場合、「不応性メラノーマ」は、処置もしくは治癒に耐性であるメラノーマ、または初回の全身治療（化学療法および／もしくは生物学的治療）に応答せず、初回の処置応答後に進行もしくは再発したメラノーマまたは初回の外科手術もしくは外科手術およびアジュバント療法後に局所的（皮膚および／または所属リンパ節）に再発したメラノーマを意味する。本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、不応性メラノーマ（例えば、ダカルバジン不応性メラノーマまたはベムラフェニブ不応性メラノーマ）を処置するために使用され得る。
別の実施形態において、開示された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、初回の処置後の腫瘍再発の確率を減少または無くすための維持療法に使用され得る。好ましくは、障害は、開示された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣまたは他の治療剤により処置され、当初の腫瘍塊は、患者が無症候状態または寛解状態であるように消去または低減されている。このような場合、対象には、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんどまたは全くない場合でも、医薬として有効な量の開示された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣが１回以上投与され得る。
病期ＩおよびＩＩのメラノーマのための標準的処置は、広範囲切除（メラノーマおよびこの周辺の正常皮膚のマージンを除去する外科手術）である。病期ＩおよびＩＩのメラノーマは、非転移性であるため、腫瘍組織の局所的除去が腫瘍を除去するのに十分であり得る。しかしながら、本発明の一実施形態において、高レベルのＤＬＬ３を発現しているメラノーマは予後不良を示すことが分かった（図、本発明のいくつかの実施形態において、病期ＩまたはＩＩのメラノーマの場合）。特定の実施形態において、測定可能な治療効果が示される場合、患者は、本発明の方法にしたがってメラノーマが成功裏に処置される。治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、測定可能な治療効果を生じさせるのに十分である。本明細書で使用される場合、用語「測定可能な治療効果」は、これらに限定されないが、がんもしくは腫瘍細胞の数を減少させることもしくは完全に無くすこと、腫瘍サイズを減少させること、周囲臓器へのがんもしくは腫瘍細胞の浸潤、例えば、軟組織および骨への腫瘍の拡散を阻害もしくは無くすこと、腫瘍転移を阻害もしくは無くすこと、腫瘍成長を阻害もしくは無くすこと、がん細胞の細胞溶解、がん細胞の抗原を減少させること、メラノーマに伴う１つ以上の症状を軽減させること、罹病率および死亡率を減少させること、生活の質を高めること、無憎悪で生存させること、循環腫瘍細胞の数もしくは出現頻度を減少させること、腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍の腫瘍形成性を減少させること、腫瘍における腫瘍形成性細胞の数および出現頻度を減少させること、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性状態に分化させることまたは効果の何らかの組合せを含む。
表現「実質的に不応性」は、本明細書で使用される場合、治療成分の投与後に測定可能な治療効果を示さない腫瘍またはがん（例えば、メラノーマ）を指す。この表現は、治療剤の投与後に安定な疾患または進行性の疾患を示す患者も指す場合がある。この表現は、治療剤による処置に耐性の腫瘍またはがんを指すときに使用される場合がある。表現「少なくとも１つのＢＲＡＦ阻害剤に対して実質的に不応性」は、本明細書で使用される場合、ＢＲＡＦ阻害剤の投与後に安定な成長または亢進した成長を示す腫瘍またはがん（例えば、メラノーマ）を指す。いくつかの実施形態において、「ＢＲＡＦ阻害剤」は、小分子化合物阻害剤を指す。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤は、ベムラフェニブまたはＰＬＸ４７２０である。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤は、ソラフェニブである。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＧＤＣ−０８７９である。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤が処置の必要な患者に投与され、患者がＢＲＡＦ阻害剤に対して「実質的に不応性」であることは、この処置が測定可能な治療効果をほとんどまたは全くもたらさないことを意味する。
４．併用療法
以下の議論においておよび本明細書で一般的に使用される場合、抗体およびＡＤＣという用語は、文脈上の限定によって排除されない限り、一方についての言及が、他方が同様の様式で使用され得ることを一般に意味するという点で相互に交換可能である。
併用療法は、メラノーマの予防または処置およびメラノーマの転移または再発の予防に有用であり得る。「併用療法」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと少なくとも一つの治療成分（例えば、抗がん剤）および／または外科的手法（例えば、腫瘍切除）との組合せを含む処置を意味し、ここで組合せは好ましくは、メラノーマの処置において、（ｉ）抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣの単独使用または（ｉｉ）治療成分の単独使用または（ｉｉｉ）抗ＤＬＬ３抗体もＡＤＣも含まない別の治療成分と組み合わせた治療成分の使用を上回る治療的相乗作用を有するまたは測定可能な治療効果を改善する。用語「治療的相乗作用」は、本明細書で使用される場合、抗ＤＬＬ３ ＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せの相加的効果よりも大きい治療効果を有する、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せを意味する。
開示された組合せの所望の転帰は、対照またはベースラインの測定に対する比較によって定量される。本明細書で使用される場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」または「減少させる」は、対照、例えば、本明細書に記載の処置の開始前の同じ個体の測定値または本明細書に記載の抗ＤＬＬ３抗体もＡＤＣも不在であるが、標準治療処置などの他の治療成分の存在下における対照個体（もしくは複数の対照個体）の測定値に対する値を示す。代表的な対照個体は、処置されている個体と同じ形態のメラノーマに罹患しており、処置されている個体とほぼ同じ年齢の個体である（処置される個体および対照個体の疾患の病期が同等であることを確実にするため）。
治療に応答した変化または改善は、一般に、統計学的に有意である。本明細書で使用される場合、用語「有意性」または「有意」は、２つ以上の実体間に非ランダムな関係がある確率についての統計学的解析に関する。関係が「有意」であるまたは「有意性」を有するかどうかを決定するために「ｐ値」が計算され得る。ユーザー定義のカットオフ点を下回るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。
相乗的治療効果は、単一の治療成分もしくは抗ＤＬＬ３ ＡＤＣにより誘発される治療効果よりもまたは所与の組合せの抗ＤＬＬ３ ＡＤＣもしくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計よりも少なくとも約２倍大きいまたは少なくとも約５倍大きいまたは少なくとも約１０倍大きいまたは少なくとも約２０倍大きいまたは少なくとも約５０倍大きいまたは少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。また相乗的治療効果は、単一の治療成分もしくは抗ＤＬＬ３ ＡＤＣにより誘発される治療効果または所与の組合せの抗ＤＬＬ３ ＡＤＣもしくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも１００％以上の治療効果の増加として観察され得る。相乗的効果は、組合せで使用したときに、治療剤の投与量の減少を可能にする効果でもある。
併用療法の実施において、患者は、抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣおよび治療成分の投与の前にまたは抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣの投与過程の間に、外科手術（例えば、腫瘍切除）を受け得る。
さらに、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、単一の組成物、または同じもしくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物で、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣでの処置は、例えば、数分から数週間の間隔で、治療成分による処置に先行または追随してもよい。一実施形態において、治療成分と、抗体またはＡＤＣとの両方が互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６もしくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）または数カ月間（１、２、３、４、５、６、７もしくは８）が、抗体と治療成分の投与の間に経過してもよい。
併用療法は、状態が処置されるまで、緩和されるまで、または治癒されるまで、様々なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回もしくは３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、投与されてもよくまたは連続的に投与されてもよい。抗体および治療成分は、１日おきにもしくは１週間おきに投与されてもよく、または一連の抗ＤＬＬ３抗体もしくはＡＤＣ処置を行い、後にさらなる治療成分で１回以上処置してもよい。一実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは１つ以上の治療成分と組み合わせて短期処置サイクルで投与される。他の実施形態において、組合せ処置は、長期処置サイクルで投与される。併用療法は、外科的手法（例えば、腫瘍切除）の前または後に任意の経路を介して投与され得る。
いくつかの実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、メラノーマの様々な第一選択処置との組合せで使用され得る。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣ、およびダカルバジンおよび場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。さらなる実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣ、およびテモゾロミドおよび場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣ、および白金系治療成分（例えば、カルボプラチンまたはシスプラチン）および場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびビンカアルカロイド治療成分（例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンまたはビンデシン）および場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターロイキン２および場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターフェロンαおよび場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、メラノーマのアジュバント処置および／または外科的手法（例えば、腫瘍切除）との組合せで使用され得る。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよびインターフェロンαおよび場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
本発明者らは、ＤＬＬ３を発現するメラノーマが、メラノーマにおける発がん遺伝子および腫瘍抑制因子の最も一般的な注釈の付された変異とは独立してＤＬＬ３を発現することを発見した（実施例１９参照）。したがって、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、変異発がん遺伝子（例えば、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ）または活性化発がん遺伝子もしくはタンパク質（例えば、ＭＥＫ）、特にシグナル伝達経路における遺伝子を発現しているメラノーマの処置に有効である標的化学療法成分とを含み得る。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、ＢＲＡＦ標的化学療法薬（例えば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）と、場合によって１つ以上の他の治療成分との使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、ＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ）と、場合によって１つ以上の他の治療成分とを含み得る。さらに別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、ＫＩＴ阻害剤（例えば、ダサチニブ、イマチニブまたはニロチニブ）とを含み得る。
Ｔリンパ球（例えば、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ））は、悪性腫瘍に対する宿主防御において重要な役割を果たす。ＣＴＬは、抗原提示細胞上の腫瘍関連抗原の提示によって活性化される。活性特異的免疫療法は、既知のメラノーマ関連抗原に由来するペプチドを患者にワクチン接種することによりメラノーマに対するＴリンパ球応答を増強するために使用され得る方法である。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、メラノーマ関連抗原（例えば、メラノサイト系譜特異的抗原チロシナーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１またはｇｐ７５）に対するワクチンを含んでもよい。他の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣの投与と共に、自己ＣＴＬまたはナチュラルキラー細胞のインビトロ拡大増殖、活性化および養子性再導入を含み得る。ＣＴＬ活性化は、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を増強する戦略によっても促進され得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞の動員および樹状細胞交差提示の活性化を促進する。一実施形態において併用療法は、抗原提示細胞の単離、このような細胞の刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）による活性化、腫瘍関連抗原でのプライミング、次いで抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣおよび場合によって１つ以上の異なる治療成分の使用と組み合わせた患者への抗原提示細胞の養子性再導入を含み得る。
メラノーマを処置するための別のアプローチは、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負の制御因子である細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）を標的とする（例えば、イピリムマブと呼ばれる抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の使用による）。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、イピリムマブおよび場合によって１つ以上の他の治療成分の使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、イピリムマブおよびメラノーマペプチドワクチンの使用を含む。さらに別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、イピリムマブおよびＧＭ−ＣＳＦの使用を含む。
ＰＤ−１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１と共に、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の別の負の制御因子である。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、ランブロリズマブ、ニボルマブ）および場合によって１つ以上の他の治療成分を含み得る。別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６）および場合によって１つ以上の他の治療成分を含み得る。さらに別の実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、他の抗ＰＤ−１および／または標的化ＢＲＡＦ併用療法（例えば、イピリムマブおよびベムラフェニブまたはダブラフェニブ）での処置後に進行が続いている患者に投与される抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペンブロリズマブ）を含み得る。
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと、メラノーマ細胞に感染して、その後殺傷するように改変された腫瘍溶解性ウイルス（例えば、タリモゲンラヘルパレプベック（ｔｅｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ））との組合せも提供する。一実施形態において、併用療法は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと共に、タリモゲンラヘルパレプベックおよび場合によって１つ以上の他の治療成分を含み得る。
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣと放射線療法との組合せも提供する。用語「放射線療法」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを意味する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本明細書に開示の抗ＤＬＬ３抗体と組み合わせてまたは抗ＤＬＬ３抗体のコンジュゲートとして使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。場合によって、放射線療法は、単独用量としてまたは複数回の連続用量として投与されてもよい。
他の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、下記の化学療法剤の１つ以上と組み合わせて使用され得る。
５．抗がん剤
用語「抗がん剤」または「化学療法剤」は、本明細書で使用される場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり、「医薬として活性な成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細には、「抗がん剤」は、細胞増殖性障害、例えば、がんを処置するために使用することができる任意の薬剤を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法および放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤が挙げられる。
用語「細胞毒性剤」は、抗がん剤である場合もあり、細胞に毒性があり、細胞の機能を減少もしくは阻害するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。典型的には、物質は、生存生物に由来する天然に存在する分子（または合成的に調製された天然産物）である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素または酵素的に活性な細菌毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス菌体内毒素および菌体外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシンおよびトリコテセン）または動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片および／またはバリアントを含む）が挙げられる。
抗がん剤としては、がん性細胞またはがん性になる可能性のある細胞もしくは腫瘍形成性後代（例えば、腫瘍形成性細胞）を生じる可能性のある細胞を、阻害または阻害するよう設計されている任意の化学薬剤が挙げられ得る。このような化学薬剤は、細胞成長または分裂に必要な細胞内処理に向かうことが多く、したがって一般的に急速に成長または分裂するがん性細胞に特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合し、したがって細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。このような薬剤は、例えばＣＨＯＰ製剤など、組合せで投与されることが多く、最も有効であることが多い。繰り返すが、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、開示された抗体とコンジュゲーションされ得る。
本発明の抗体と組み合わせて（またはコンジュゲートして）使用し得る抗がん剤の例としては、これらに限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アマニチン、アジリジン、エチレンイミンおよびメチラメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生剤、エンジイン抗生剤、ジネマイシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質エンジイン抗生剤発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクォン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクォン、２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、ベムラフェニブ、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、レチノイド、カペシタビン、コンブレタスタチン、ロイコボリン、オキサリプラチン、細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ｈ−Ｒａｓ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤およびＶＥＧＦ−Ａ阻害剤ならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体が含まれる。
腫瘍に対するホルモンの作用を調節するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤ならびに抗アンドロゲン剤ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビンおよびエスペラミシンならびに上記のうちのいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体なども含まれる。
他の適合抗がん剤は、商業的または臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））およびドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的または臨床的に利用可能な抗がん剤は、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含む。
用語「医薬として許容される塩」または「塩」は、分子または巨大分子の有機または無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。医薬として許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、医薬として許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が医薬として許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、医薬として許容される塩は、１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。
「医薬として許容される溶媒和物」または「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子または巨大分子との会合物を指す。医薬として許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
他の実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、現在臨床試験にあるまたは市販のいくつかの抗体（または免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。開示された抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＤＸ−１１０５およびＭＥＤＩ４７３６ならびにこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
他の特に好ましい実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
ＩＩＩ．診断、予後診断および代用バイオマーカー
本発明は、メラノーマを診断または監視し、メラノーマに罹患している患者の予後を決定するためのインビトロおよびインビボ方法を提供する。一実施形態において、場合によって検出可能な標識またはレポーター分子を含む本発明の抗体は、患者試料における特定の決定因子（例えば、ＤＬＬ３）のレベルを検出および定量するために使用されてもよく、さらにはメラノーマの進行を診断、病期分類もしくは監視するために使用されてもよくまたはメラノーマに罹患している患者の生存転帰の予後マーカーを提供することができる。一実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボまたはインビトロのいずれかで検出、監視および／または定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。別の実施形態において、本発明は、メラノーマに罹患している患者がＤＬＬ３を発現しているかどうかおよび腫瘍が本明細書に開示の抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣによる処置に感受性があるかどうかを決定するための代用バイオマーカー（下記に記載する）の使用を含む。さらに別の実施形態において、ＤＬＬ３の発現は、メラノーマを有する患者の予後を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。理解されるように、ＤＬＬ３発現レベルは、一般的に、定量的に「決定」されるが、いくつかの場合には、例えば、免疫組織化学を使用するＤＬＬ３発現レベルの決定の場合（実施例１４参照）、定性的にも決定され得る。
１．バイオマーカー源
バイオマーカーの存在、不在または量をエクスビボで決定するために、流体または組織試料が対象から取得されることが多い。組織試料が取得され得る非限定的な身体の部分としては、脚、腕、腹部、上背、下背、胸部、手、手指、手指爪、足、足指、足指爪、首、直腸、鼻、喉、口、頭皮、顔、脊椎、喉、心臓、肺、乳房、腎臓、肝臓、腸、結腸、膵臓、膀胱、頸部、精巣、筋肉、皮膚、毛髪、炎症領域、腫瘍、びまん性がん細胞の領域などが、いくつかの実施形態において挙げられる。
組織試料は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法により取得することができ、例えば、限定されないが、生検（例えば、剃り、パンチ、切開、切除、掻爬、微細針吸引、掬い、スカラップ、コア針、真空補助下、切開生検）などが、特定の実施形態において挙げられる。対象から取得され得る流体の例としては、限定されないが、血液または任意の血液成分、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管腔、耳、関節鏡（ａｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ））、尿、間質液、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、炎症領域からの滲出液、腫瘍領域からの滲出液、びまん性細胞過剰成長領域からの滲出液などが、いくつかの実施形態において挙げられる。
対象由来の試料は、バイオマーカーの存在、不在または量を決定する前に、処理され得る。例えば、対象由来の血液試料は、ある特定の分画、例えば、限定されないが、血漿、血清、バフィーコート、末梢血液単球（ＰＢＭＣ）などを得るために処理され、分画におけるバイオマーカーの存在、不在または量が決定されてもよい。ある特定の実施形態において、組織試料（例えば、腫瘍生検試料）は、組織試料を薄片化し、薄片化した試料をバイオマーカー（例えば、抗体）を視覚化させる薬剤と接触させる前および／または後に顕微鏡下で試料を観察することによって処理されてもよい。いくつかの実施形態において、組織試料は、以下の非限定的条件の１つ以上に曝されてもよい：洗浄、高塩または低塩溶液への曝露（例えば、高張性、低張性、等張性溶液）、剪断条件への曝露（例えば、超音波処理、プレス（例えば、フレンチプレス））、砕片化、遠心分離、細胞分離、組織分離など。ある特定の実施形態において、バイオマーカーは組織から分離されて、インビトロで存在、不在または量を決定されてもよい。試料は、一定期間保存された後に、バイオマーカーの存在、不在または量を決定されてもよい（例えば、試料は、凍結、冷凍保存、保存媒体（例えば、ホルムアルデヒド）中に維持されてもよい。）。
２．代用バイオマーカー
一実施形態において、ある特定の遺伝子は、ＤＬＬ３の発現についての代用バイオマーカーとして使用することができる。理解されるように、代用バイオマーカーの発現レベルは、一般的に、定量的に「決定」されるが、一部の場合には、例えば、免疫組織化学を使用して遺伝子発現レベルを決定する場合において、定性的にも決定される得る。本明細書で使用される場合、用語「代用バイオマーカー」は、発現がＤＬＬ３遺伝子またはタンパク質の発現と正に相関または負に相関（反相関）している遺伝子またはタンパク質を指す。代用バイオマーカーの発現は、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数（−１．０から１．０の範囲の無次元指数）を使用して、ＤＬＬ３発現と、正相関または反相関するものとして決定される。代用バイオマーカーの発現が、ＤＬＬ３の発現を示す場合、代用バイオマーカーはＤＬＬ３発現と正に相関する。「正相関代用バイオマーカー」は、０．５超、０．６超、０．７超、０．８超または０．９超である、ＤＬＬ３とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を有する。正相関代用バイオマーカーとしては、これらに限定されないが、ＰＵＳ７、ＥＦＨＤ１、ＰＴＰ４Ａ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＵＤＴ１４、ＮＲ６Ａ１、ＪＡＧ２、ＨＡＵＳ５、ＡＤＡＴ３、ＰＡＦＡＨ１Ｂ３、ＣＣＤＣ１３６、ＧＡＳ５、ＰＰＦＩＡ３、ＣＤＫ８、ＺＮＦ１１４、ＫＨＳＲＰ、ＭＵＲＣ、ＺＮＲＤ１、ＲＰＳ１９、ＬＲＲＣ４３、ＺＣＣＨＣ３、ＬＩＮ９、ＺＮＦ４１７、ＡＴＯＨ８、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＢＣＬ７Ａ、ＣＨＲＮＢ２、ＣＡＭＫＫ１、ＳＮＯＲＡ４３、ＴＭＥＭ１１７、ＣＢＬＬ１、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＯＲ４Ｃ４６、ＺＮＦ５７０、ＦＡＮＣＦ、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＭ６、ＣＨＤ７およびこれらの組合せが挙げられ得る。したがって、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料において１つ以上の正相関代用バイオマーカーの発現を決定する工程、および１つ以上の正相関代用バイオマーカーが発現されている場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で対象を処置する工程を含む方法を開示する。この方法は、ＤＬＬ３と正相関する任意の代用バイオマーカー、例えば、図１２Ａに列挙される遺伝子を用いて実施され得る。当業者は、好ましい実施形態において、相関マーカーの組合せが、ＤＬＬ３の発現を示すために使用され得ることを理解する。
別の実施形態において、本発明の代用バイオマーカーの発現は、ＤＬＬ３の発現と反相関することがあり、このことは、代用バイオマーカーの低発現が、ＤＬＬ３の発現を示すことを意味する。「反相関代用バイオマーカー」は、−０．５未満、−０．６未満、−０．７未満、−０．８未満または−０．９未満のＤＬＬ３とのＰｅａｒｓｏｎ相関係数を有する。反相関代用バイオマーカーとしては、これらに限定されないが、ＺＢＴＢ２０、ＧＰＲ１５５、ＭＳＴ１、ＣＬＶＳ１、Ｐ４ＨＡ２、ＣＩＩＴＡ、ＩＴＰＲ２、ＢＲＫ１、ＴＧＯＬＮ２、ＴＡＤＡ３、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＫＣＮＱ１、ＴＭＥＤ６、ＮＲＸＮ３、ＳＮＸ２４、ＯＬＦＭＬ３、ＫＣＴ２、ＰＪＡ２、ＳＥＰＴ８およびこれらの組合せが挙げられ得る。したがって、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料において１つ以上の反相関代用バイオマーカーの発現を決定する工程、および１つ以上の反相関代用バイオマーカーが低発現を有することが見出される場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）で対象を処置する工程を含む方法を開示する。
この処置方法は、ＤＬＬ３と反相関する任意の代用バイオマーカー、例えば、図１２Ｂに列挙した遺伝子を使用して実施され得る。当業者は、好ましい実施形態において、反相関マーカーの組合せが、ＤＬＬ３の発現を示すために使用され得ることを理解する。さらに、相関マーカーと反相関マーカーとの組合せは、ＤＬＬ３発現を示すために使用され得る。
上記の遺伝子のいずれかはＤＬＬ３の代用マーカーとして使用され得るが、好ましい実施形態において、代用バイオマーカーは、分泌された代用バイオマーカーである。本明細書で使用される場合、用語「分泌された代用バイオマーカー」は、上記バイオマーカー遺伝子により発現されたタンパク質が、細胞外に分泌され、したがって血液、血漿および／または血清で検出可能であることを意味する。特に、ＯＬＦＭＬ３は、分泌されることが公開されており（Ｚｅｎｇ ＬＣら、２００４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ）、ＥＦＨＤ１は、細胞外小胞エキソソームに関連することが推測されており（Ｐｒｕｎｏｔｔｏ Ｍら、２０１３ Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、したがって細胞外領域に放出され、血清中で検出され得る。
したがって、一実施形態において、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料、例えば、患者から取得された血液試料における、１つ以上の分泌された代用バイオマーカーの発現を決定する工程、および治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を含む。
別の実施形態において、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料、例えば、患者から取得された血液試料におけるＥＦＨＤの発現を決定する工程、およびＥＦＨＤが発現していることが見られる場合に、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、対象におけるメラノーマを処置する方法であって、患者から取得された生物学的試料、例えば、患者から取得された血液試料におけるＯＬＦＭＬ３の発現を決定する工程、およびＯＬＦＭＬ３が発現していることが見られる場合に、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法を検討する。
用語「発現を決定する」もしくは「発現の決定」またはこれらのあらゆる派生語は、本明細書で使用される場合、関連する遺伝子（例えば、ＤＬＬ３もしくは代用バイオマーカー）またはその発現産物の存在、不在またはいくつかの物理的、化学的もしくは遺伝的特徴のレベルを測定することを意味する。例えば、ＤＬＬ３の発現の決定は、ＤＬＬ３のＲＮＡ転写産物またはＤＬＬ３の代用バイオマーカーのレベルを評価することによって達成され得る。ＲＮＡの発現レベルを決定するための適切な方法としては、これらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、サザンブロット、スロットブロッティング、ヌクレアーゼプロテクションアッセイおよび核酸アレイ（例えば、マイクロアレイ）が挙げられる。ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ発現を検出する別の方法である。これは、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．０試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｗａｎｇら、２０１２、ＰＭＩＤ：２２１６６５４４）を使用して実施できる。ＲＮＡｓｃｏｐｅのプローブは、各代用バイオマーカーのためにまたはＤＬＬ３のために、特異的に設計され得る。代替的に、ＤＬＬ３の発現の決定は、ＤＬＬ３または代用バイオマーカーにコードされたタンパク質の存在、不在またはレベルを評価することによって達成され得る。適切な方法としては、これらに限定されないが、イムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリまたは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはウェスタンブロットが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、腫瘍（例えば、ＭＥＬ）を担持する対象由来の血清におけるＤＬＬ３および／または代用バイオマーカーの発現を決定し、腫瘍を担持していない対象におけるこのような発現と比較するために使用される。二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づく方法も使用することができる。免疫組織化学も、例えば、実施例１４に記載されるように、本出願で開示する抗体およびこのような抗体と競合する抗体（例えば、ｓｃ１６．６５；配列番号１７３および配列番号１７５）を使用して、使用し得る。
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ３または代用バイオマーカーが発現しているかどうかおよびどのレベル（例えば、高または低発現）で発現しているかの決定は、ＤＬＬ３または代用バイオマーカーの発現レベルを指標値と比較することによりなされる。用語「高発現」は、本明細書で使用される場合、ＤＬＬ３の発現を決定するための上記特徴の１つ以上（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベル）が、その特徴の指標値よりも高いことを意味する。逆に「低発現」は、上記特徴の１つ以上（例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベル）が、その特徴の指標値よりも低いことを意味する。この文脈において「低発現」は一般的に、特徴が存在しないまたは検出できない場合を含む。例えば、ＤＬＬ３は、ＤＬＬ３核酸および／またはタンパク質が試料中に存在しないまたは検出できない場合には低発現である。
当業者は、本発明の方法における指標値の取得および使用法を理解している。指標値およびこのような指標値を取得するための方法は、ＤＬＬ３または代用バイオマーカーの発現を決定する方法に基づいて様々である。いくつかの実施形態において、指標値は、患者から取得された正常（すなわち、非疾患）試料または健常（例えば、非メラノーマ患者）個体から採取した試料で見出されるＤＬＬ３遺伝子発現レベルであり得る。この場合、この指標値を上回る腫瘍試料における発現レベルは、抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを使用した処置が適していることを示す（例えば、図２参照）。
本発明のさらに他の実施形態において、ＤＬＬ３または代用バイオマーカーの発現産物の量は、目的の遺伝子の発現レベルを決定するときのバックグラウンドノイズを減少させることに単に役立つ指標値を生成させるために、正規化遺伝子（例えば、１つ以上のハウスキーピング遺伝子）の発現の量に対して正規化することができる。一実施形態において、例えば、本発明に伴う関連遺伝子の発現レベルを決定する際に、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質）の発現産物の量を、１つ以上の細胞、特に腫瘍細胞内で測定し、同じ１つ以上の細胞内の正規化遺伝子または１セットの正規化遺伝子の発現産物の量に対して正規化し、関連マーカー遺伝子の発現レベルを取得する。例えば、単一の遺伝子を正規化遺伝子として使用するとき、この発現がメラノーマの転帰／予後と独立して決定されるまたは正常細胞とメラノーマ細胞との間で変化しないハウスキーピング遺伝子が使用され得る（例えば、図３）。組み合わせた正規化遺伝子セットを提供するために、１セットのこのようなハウスキーピング遺伝子が遺伝子発現解析において使用されてもよい。ハウスキーピング遺伝子は、当該技術分野で周知であり、例として、これらに限定されないが、ＡＬＡＳ１、ＡＣＴＢ、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、ＨＭＢＳ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体、サブユニットＡ、フラボタンパク質）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）およびＹＷＨＡＺ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）が挙げられる。組み合わせた正規化遺伝子セットが正規化において使用される場合、このような正規化遺伝子の遺伝子発現量は平均化されてもよく、直列的加算または定義されたアルゴリズムによって一緒にまとめられてもよい。ハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子が正規化遺伝子として使用されてもよい。
ＤＬＬ３発現と正に相関する代用バイオマーカーの存在または高発現は、腫瘍が抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣを用いた処置に感受性であるかどうかを予測する。同様に、ＤＬＬ３発現と反相関する代用バイオマーカーの不在または低発現は、腫瘍が抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣを用いた処置に感受性であるかどうかを予測する。
３．メラノーマの予後診断バイオマーカー
類似の臨床的および病理学的特徴を有するメラノーマ患者は、それらの生存および処置に対する応答が大きく変わる場合がある。この変動のほとんどが、患者の腫瘍の分子構造および細胞構造の違いに関係し、それらの違いは、メラノーマの発生、浸潤または転移に影響を与えることがわかっている（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｏ、２０１３、ＰＭＩＤ：２４４１６６１７）。これらの知見により、それぞれの個体の腫瘍の分子特徴に基づき、処置決定が最適化され得ることが示唆される。マイクロアレイおよび高処理配列決定技術は、腫瘍における相対的存在量の何千もの遺伝子をプロファイルすることができ、これによって腫瘍状態の網羅的なスナップショットを与えることができる。ＤＬＬ３遺伝子発現の予後の値は、国際がんゲノムコンソーシアム（ＩＣＧＣ）のような大規模の網羅的なマルチノードプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｇｃ．ｏｒｇ／ｗｅｂｃｉｔｅ）および患者腫瘍の大規模な収集からのデータを保存し、異なるがんの種類（例えば、ＭＥＬ）についてゲノム、エピゲノミクスおよびトランスクリプトームレベルの組織的研究を可能にするがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｗｅｂｃｉｔｅ）からのデータを解析することによって決定され得る。本発明者らは、ＤＬＬ３が、ＴＣＧＡデータベースから取得したデータに基づいてメラノーマの疾患進行の分子予後診断マーカーとして使用され得ることを決定し、閾値指標値を上回るＤＬＬ３の発現を有するメラノーマ患者は予後不良を有することが見出された（実施例４参照）。理解されるように、ＤＬＬ３発現レベルは、一般的には、定量的に「決定される」が、いくつかの場合には、例えば、免疫組織化学を使用したＤＬＬ３発現レベルの決定の場合（実施例１４参照）、定性的にも決定され得る。
本発明の文脈において、「閾値指標値を上回る発現」は、「閾値指標値」よりも高い遺伝子発現レベルを意味し、「閾値指標値を下回る発現」は、「閾値指標値」よりも低い遺伝子発現レベルを意味する。当業者は、本発明の方法における閾値指標値の取得および使用法を理解している。閾値指標値およびこのような閾値指標値を取得する方法は、遺伝子発現レベルを決定する方法に基づき、変化する。一実施形態において、閾値指標値は、例えば、メラノーマを有する患者のランダムな試料採取における１セットの個体のＤＬＬ３平均発現レベルとして決定することができ、ここで、この閾値指標値より高いＤＬＬ３発現を有する患者は、閾値指標値より低い発現を有する患者と比較して予後不良を有すると予測される。この平均発現レベルは、採用する技術の性質および取得した測定値に依存して、１セットの算術平均（すなわち、「平均」）、幾何平均または調和平均であり得る。別の実施形態において、発現データの二峰性分布がある場合、閾値指標値はデータセットのピークの間に入る。実施例４は、実験的に決定され、検証された閾値指標値を決定する方法を示す。
閾値指標値は、ＤＬＬ３発現を決定するために使用される方法に基づいて異なる。一実施形態において、ＤＬＬ３発現は、腫瘍試料において、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームを使用してＲＮＡ配列決定を行い、各遺伝子の個々のエクソンからの集合リードを解析して、単一のＲＰＫＭ値（ＲＮＡ−Ｓｅｑのマッピングされたリード１００万あたり転写産物のキロベースあたりのリード数）を生成することにより決定され得る。この場合に、閾値指標値を算術平均ＲＰＫＭ値として決定することができ、患者のＲＰＫＭ値が算術平均または閾値指標値より上または下であるかに基づいて患者を階層化してもよい。図４Ｂは、臨床生存データが患者腫瘍試料を用いて利用可能であるＴＣＧＡデータベースからのＭＥＬ腫瘍のサブセットに基づく患者の生存についてのＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。２つの別個の生存確率曲線を示しており、１つは、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現が算術平均ＲＰＫＭ値を上回る患者についての曲線であり、１つは、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現が算術平均ＲＰＫＭ値を下回る患者についての曲線である。これらのデータは、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現が、患者の生存に関係し、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現が閾値指標値を上回る患者は、閾値指標値を下回る患者と比較して、がん診断後の生存期間が短いことを示している。この違いは統計学的に有意であり、ｐ値が０．００１９である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して決定した閾値指標値は、ＲＰＫＭが１７である。他の実施形態において、閾値指標値は、より低い値である（例えば、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１）。
したがって、一実施形態において、本発明は、メラノーマを有する患者の予後を評価する方法であって、患者由来の生物学的試料におけるＤＬＬ３の発現を決定する工程、およびこのような試料が閾値指標値を上回るＤＬＬ３発現を有する場合に、この患者が予後不良を有すると評価する工程を含む方法を開示する。
代替的に、ＤＬＬ３発現は、抗ＤＬＬ３抗体、例えば、ＳＣ１６．６５またはヒトＤＬＬ３に対する結合に対してＳＣ１６．６５と競合する抗体を使用した免疫組織化学で決定することができる。免疫組織化学は、ホルマリンで固定され、パラフィン包埋された腫瘍組織切片上で実施することができる。膜発現は、細胞表面染色の強度を定量する自動化画像解析ソフトウェアパッケージ（例えば、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析することができ、各強度レベルで染色された腫瘍細胞の割合を反映する最終「Ｈ−Ｓｃｏｒｅ」を提供する（０は染色なし、３は強い染色）。Ｈ−Ｓｃｏｒｅは、以下のように計算することができる：（０での％）＊０＋（１＋での％）＊１＋（２＋での％）＊２＋（３＋での％）＊３。したがって、Ｈ−Ｓｃｏｒｅにより、０から３００の範囲の連続的な変量が生じる。このような場合に、メラノーマ患者の集団から取得した腫瘍のＩＨＣ染色解析から誘導した平均Ｈ−Ｓｃｏｒｅに基づいて閾値指標値が決定され得る。一態様において、ＤＬＬ３発現が免疫組織化学により決定される場合、閾値指標値は、例えば、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０および最大３００のＨ−Ｓｃｏｒｅを上回る。染色が定性的に評価される場合、閾値指標値は、集団の様々なメラノーマ腫瘍試料間の発現の比較に基づく平均値である染色強度として定義され得る。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、メラノーマを有する患者の予後を評価する方法であって、患者由来の生物学的試料におけるＤＬＬ３の発現を、抗ＤＬＬ３抗体を用いた免疫組織化学を使用して決定する工程を含む方法を開示する。本発明の一態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号１７３に示される軽鎖可変領域および配列番号１７５に示される重鎖可変領域またはこのような抗体と競合する抗体を含み、このような試料が閾値指標を上回るＤＬＬ３の発現を有する場合、この患者が予後不良を有すると決定する。
別の態様において、ＤＬＬ３発現は、ｑＰＣＲ（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定され得、閾値指標値は、１セットのメラノーマ腫瘍試料由来のＤＬＬ３の算術平均（すなわち、「平均」）、幾何平均または調和平均発現値として決定され得る。さらに別の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、マイクロアレイを使用して決定され得、閾値指標値は、１セットのメラノーマ腫瘍試料由来のＤＬＬ３発現の算術平均（すなわち、「平均」）、幾何平均または調和平均正規化強度値として決定され得る。
さらに、本発明者らは、閾値指標値を上回るＤＬＬ３発現が、初期段階のメラノーマ、例えば、病期ＩＩおよび病期ＩＩＩを有する患者におけるメラノーマの予後不良のバイオマーカーであることがわかったことを見出した（実施例４ならびに図４Ｂおよび４Ｃ参照）。一実施形態において、本発明は、メラノーマを有する患者の予後を評価する方法であって、患者由来の生物学的試料におけるＤＬＬ３の発現を決定する工程、およびこのような試料が、他の患者のメラノーマ試料におけるＤＬＬ３の発現と比較して、ＤＬＬ３の高発現を有する場合に、患者が予後不良を有すると決定する工程を含む方法を開示する。
病期ＩＩのメラノーマを有する対象を処置する方法であって、対象における病期ＩＩのメラノーマを診断する工程、患者由来の生物学的試料におけるＤＬＬ３の発現を決定する工程、およびこのような試料が閾値指標値を上回るＤＬＬ３発現を有する場合、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法。
ＩＶ．医薬調製物
１．製剤および投与経路
抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまままたは最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で場合によって適切な医薬として許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「医薬として許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバントおよび希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照）。
適切な医薬として許容される担体は、比較的不活性である物質を含み、抗体の投与を容易にすることができるまたは活性化合を作用部位に送達するために医薬として最適化された調製物に処理することを補助し得る。
このような医薬として許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集または溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤および皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびこれらの組合せを含む。全身投与のための開示された抗体は、経腸的、非経口的または局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的および経口的薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。抗体の非経口投与のための適切な製剤としては、水溶液または懸濁液が挙げられる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。リポソームを、薬剤を封入して細胞に送達するために使用することができる。
経腸投与のために適切な製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤およびこれらの制御放出形態を含む。非経口投与（例えば、注射による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化または他の方法で（例えば、リポソームまたは他の微小粒子系で）提供される水性または非水性、等張性、発熱物質不含、滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の医薬として許容される成分、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤および製剤を対象とするレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤に使用するための適切な等張担体の例としては、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液または乳酸リンゲル注射剤が挙げられる。
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合する製剤は、約１０μｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＤＣまたは抗体を含む。ある特定の選択された実施形態において、抗体またはＡＤＣの濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌを含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣの濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌを含む。
本発明の化合物および組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮およびくも膜下腔内またはそれ以外に移植もしくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体または気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルが挙げられる。適切な製剤および投与経路は、意図する適用および治療レジメンにより選択され得る。
２．投与量
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象ならびに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態および処置される状態の重症度、処置される対象の年齢および全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能および投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害または状態のマーカーに基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、これらには、触診または視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善および腫瘍試料の顕微鏡検査；本明細書に記載の方法により特定された代用バイオマーカー（例えば、ＢＲＡＦ）または抗原の測定、増殖性または腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少または転移の発生の遅延が含まれる。
一般的に、本発明のＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重および用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
選択された実施形態において、ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、用量あたりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内に）投与される。他の実施形態は、用量あたり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｇ／ｋｇ体重でのＡＤＣの投与を含む。他の好ましい実施形態において、開示されたコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５８、９または１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり１２、１４、１６、１８または２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察ならびに標準的な医学および生化学的技術および測定に基づいて、様々なＤＬＬ３抗体またはＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
有効用量の本発明の組成物は、対象に、様々な濃度範囲で１回以上、１カ月に１回、１カ月に２回以上または１カ月に１回未満投与することができる。個体は増分の投与量の治療組成物も与えられ得る。
いくつかの実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体またはＡＤＣは、一定の期間にわたり定期的なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回または３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間に１回、２週毎に１回、１カ月に１回、６週毎、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎または１年に１回投与される。このような処置は、数週間、数カ月間、数年間またはさらには患者の応答ならびに臨床的および診断的パラメータにより永続的に継続され得る。
Ｖ．がん幹細胞
現在のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫不全マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。腫瘍形成性細胞は、本明細書で「腫瘍開始細胞」（ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ、ＴＩＣ）とも称され、メラノーマ腫瘍の細胞集団の０．１〜９５％を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）と腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）の両方を包含する。
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。ＣＳＣは、腫瘍形成性後代と非腫瘍形成性後代の両方を生成することができ、連続的単離および少数の単離されたＣＳＣの免疫不全マウスへの移植によって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、原発性移植片における腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、少数の高精製ＴＰｒｏｇの免疫不全マウスへの連続移植により実証されるように、一般に限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＣＳＣはＴＰｒｏｇよりも高い腫瘍形成能を示し、比較的静止状態が多く、非腫瘍形成性細胞、例えば、腫瘍−浸潤性細胞、例えば、線維芽細胞／間質、内皮および造血性細胞は、通常、バルクの腫瘍を含む。従来の治療およびレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、より急速に増殖する非腫瘍形成性細胞よりも従来の治療およびレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズムおよび抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。ＣＳＣにおけるこれらの特性は、進行した病期の新生物を有する多くの患者に対して長期利益を確保するための腫瘍学的標準処置レジメンが失敗する主な理由となる。なぜなら標準的化学療法は、継続的な腫瘍成長および再発を実際に促進しているＣＳＣを標的としていないためである。
ＤＬＬ３の発現は、様々な腫瘍形成性細胞小集団に関連することが示されており（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＰＣＴ／ＵＳ１３／２７３９１）、したがって、本明細書で開示される抗ＤＬＬ３ ＡＤＣはＣＳＣを阻害し、発生頻度を減少させることによるメラノーマの処置に有用であり得る。腫瘍形成性細胞の発生頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、これらに限定されないが、インビトロまたはインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２およびＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。フローサイトメトリおよび免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の出現頻度を決定するために使用され得る。両方の技術が、腫瘍形成性細胞を濃縮することが知られている、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質またはマーカーに結合する１つ以上の抗体または試薬を利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリ（例えば、ＦＡＣＳ）は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を特徴付け、単離、精製、濃縮または分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリは、細胞の混合集団が懸濁されている流体の流れを、秒あたり最大何千もの粒子の物理的および／または化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体または試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される信頼性のある方法である。
本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化またはＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、特徴付け、監視、単離、薄片化または集団もしくは小集団の富化に有用であり得る。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴付けおよび操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６および１２／７５７，６４９において見ることができる。
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離または特徴付けるために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ｅｅｄ、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、Ｎａｎｏｇ、ＮＢ８４、ネスチン、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、オンコスタチンＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ｓｍａｒｃＡ３、ｓｍａｒｃＤ３、ｓｍａｒｃＥ１、ｓｍａｒｃｋＡ５、Ｓｏｘ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、トランスフェリン受容体、ＴｒｋＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１およびβ−カテニン。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６および２０１１／００２０２２１参照。
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋ならびに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。
したがって、腫瘍形成性細胞の発生頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術およびマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＤＬＬ３抗体は、腫瘍形成性細胞の発生頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の発生頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、開示された化合物は、腫瘍形成性細胞の発生頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の発生頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性および新生物の攻撃性の対応する減少をもたらし得る。
ＶＩ．抗体
１．抗体の構造
抗体ならびにそのバリアントおよび誘導体は、承認されている命名法および番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；またはＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
「抗体」または「無傷な抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合および非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖に分類される。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤの場合にＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭおよびＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む。）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、可変長のプロリンおよびシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（一般的に、ＩｇＧにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間および鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテインおよびバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖＦｃ）ならびにＦｃ融合および他の修飾を含むそれらの誘導体、ならびに決定因子との優先的会合または結合を示す限り、あらゆる他の免疫反応分子を含む。
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である。）。ＶＨおよびＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、またはより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる可変性の少ない領域によって分離されている。ＶＨおよびＶＬ領域間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。ＳｃＦｖ断片（一本鎖可変部断片の場合）は、遺伝子操作によって取得することができ、単一のポリペプチド鎖中でペプチドリンカーによって分離された抗体のＶＨおよびＶＬ領域と会合している。
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域およびＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．によって提供される番号付けスキームの１つに従い得る。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＭａｃＣａｌｌｕｍによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基は、下記の表１に示されている。
Figure 2017514143
抗体配列における可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則に従って（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）または既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）およびｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されているまたはこれらを通じてアクセスされ得る。好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ ｂｏｏｋ ｃｈａｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８−８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１ Ｅｕ抗体に基づいた残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら、１９９１に示されている。本発明に適合する例示的カッパＣＬおよびＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号５および６に示されている。開示された定常領域配列は、標準的な分子生物学的技術を使用して、開示される重鎖および軽鎖可変領域と連結されて、そのまま使用され得るまたは本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣに組み込まれ得る完全長抗体を提供することができる。
本発明の抗体または免疫グロブリンは、任意の関連する決定因子を特異的に認識するまたはこれと会合する抗体から生成され得る。本明細書で使用される場合「決定因子」または「標的」は、特定の細胞、細胞集団または組織で同定可能的に伴われるまたはこれらにおいてもしくはこれらの上で特異的に見出される任意の検出可能な形質、特性、バイオマーカーまたは因子を意味する。決定因子または標的は、形態学的、機能的または生化学的性質であってもよく、好ましくは表現型である。ある特定の好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型またはある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点におけるまたは特定の微小環境における細胞）によって異なって発現（過剰発現または過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＤＬＬ３タンパク質またはそのスプライスバリアント、アイソフォームもしくはファミリーメンバーまたはこれらの特異的ドメイン、領域もしくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」または「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入されたときに免疫応答を刺激できるおよび免疫応答により生じる抗体によって認識される任意のタンパク質または任意の断片、領域もしくはドメインを意味する。本明細書で検討される決定因子の存在または不在は、細胞、細胞小集団または組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞またはＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
実施例において下記に示されるように、本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＤＬＬ３に結合するマウス抗体を含み、この抗体は、「出所」抗体と考えることができる。他の実施形態において、本発明で検討される抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域またはエピトープ−結合アミノ酸配列の場合による修飾を通じて誘導され得る。一実施形態において、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合または組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ）がアクセプター抗体配列と組み合わされるまたはアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導された」（例えば、ヒト化またはＣＤＲグラフト化）抗体は、標準的な分子生物学的技術を使用して、様々な理由のために、例えば、決定因子に対する親和性を改善するために、細胞培養における産生および収率を向上させるために、インビボにおける免疫原性を下げるために、毒性を下げるために、活性部分のコンジュゲーションを容易にするために、または多重特異的抗体を作製するために生成され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段または翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターンまたはペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
図６Ａまたは図６Ｂに示されるマウス可変領域アミノ酸配列に由来する開示された軽鎖および重鎖ＣＤＲのいずれかは、アクセプター抗体と組合せてもよく、または最適化された抗ヒトＤＬＬ３（例えば、ヒト化またはキメラ）抗体を提供するために再配列されてもよい。つまり、図６Ａに示される連続する軽鎖可変領域アミノ酸配列または図６Ｂに示される連続する重鎖可変領域アミノ酸配列から誘導されたまたは取得されたＣＤＲの１つ以上（まとめて配列番号２１〜３８７、奇数）が、抗ＤＬＬ３抗体に組み込まれてもよく、いくつかの実施形態において、１つ以上のＤＬＬ３アイソフォームと免疫特異的に関連するＣＤＲグラフト化またはヒト化抗体に組み込まれてもよい。このようなヒト化抗体の「誘導された」軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列の例は、図６Ａおよび６Ｂにも示されている（配列番号３８９〜４０７、奇数）。
２．抗体生成および産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
Ａ．宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫不全動物は抗原性タンパク質または抗原性タンパク質を含む細胞もしくは調製物で免疫化される。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清が、動物を出血させ、または屠殺することにより取得される。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、または抗体を部分的もしくは完全に精製して免疫グロブリン分画もしくは均質な抗体調製物を得てもよい。
任意の形態の抗原または抗原を含有する細胞もしくは調製物を、決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片または選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一もしくは複数のドメインまたはＥＣＤを含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、これらの表面上の抗原の少なくとも一部を発現している細胞で免疫化されている）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分のみで免疫化されている）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意の遺伝的ベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドおよびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
Ｂ．モノクローナル抗体
一実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知のように、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、ハイブリドーマ、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））またはこれらの何らかの組合せを使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第１版 ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、第１版 ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ、第２版 １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマおよび生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクーナル抗体を産生した後、特に有効な抗体を、例えば、決定因子に対するその親和性に基づいた様々なスクリーニングプロセスによって選択してもよい。本発明で検討される抗体は、例えば、標的に対する親和性を改善するため、細胞培養におけるその産生を向上させるため、インビボのその免疫原性を減少させるため、多重特異的抗体を作製するためなどのためにエピトープ結合配列がさらに変更されている抗体を含む。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングのより詳細な説明は、下記および添付の実施例に示される。
Ｃ．キメラおよびヒト化抗体
別の実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種またはクラス由来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片の対応する配列と同一または相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。
一実施形態において、キメラ抗体は、マウスＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と、ヒト供給源、例えば、下記に記載のヒト化抗体に由来する定常領域とを含んでもよい。いくつかの実施形態において、抗体は「ＣＤＲグラフト化」されていてもよく、この場合に抗体は、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する１つ以上のＣＤＲを含むが、抗体鎖の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である。ヒトで使用するために、選択されたげっ歯類ＣＤＲ、例えば、マウスＣＤＲは、ヒト抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度の抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用される場合、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、１つ以上の非ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の１つ以上のＣＤＲ由来の残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター抗体）である。ある特定の好ましい実施形態において、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインの１つ以上のＦＲの残基は、ドナー抗体由来の対応する非ヒト残基で置換されて、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性を改善している。このことは、「逆変異」の導入と称される場合がある。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むこともある。
様々な供給源を使用して、ヒト化抗体に使用するためのヒト配列が決定され得る。このような供給源としては、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ １４：４６２８−４６３８に開示されているヒト生殖系列配列、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２ − Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４、２００５）；または例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトＦＲが挙げられる。
ＣＤＲグラフト化およびヒト化抗体は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０および５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１および７，０８７，４０９を参照。
別の方法は、「ヒューマニリング（Ｈｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ）」と称され、この方法は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００５／０００８６２５に記載されている。別の実施形態において、非ヒト抗体は、ヒトＴ−細胞エピトープの特異的欠失またはＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示される方法によって「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」により修飾されてもよい。
選択された実施形態において、ヒト化またはＣＤＲグラフト化抗体重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸残基の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％または８０％が、レシピエントヒト配列の重鎖または軽鎖可変領域アミノ酸残基に相当する。他の実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基の少なくとも８３％、８５％、８７％または９０％が、レシピエントヒト配列のヒト化抗体可変領域残基に相当する。さらに好ましい実施形態において、ヒト化抗体可変領域残基のそれぞれの９５％超が、レシピエントヒト配列のヒト化抗体可変領域残基に相当する。
Ｄ．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体および／または下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体を指す。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。一実施形態において、組換えヒト抗体は、ファージディスプレイを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨ ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージまたは酵母ディスプレイライブラリである。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、この産生は、遺伝子再配列、アセンブリおよび抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１および６，１５０，５８４；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ、１９９５、ＰＭＩＤ：７４９４１０９）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得るまたはインビトロで免疫化され得る。）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、ＰＭＩＤ：２０５１０３０；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
Ｅ．抗体の組換え産生
抗体およびその断片は、抗体産生細胞から取得された遺伝子材料および組換え技術を使用して産生または修飾され得る（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２巻 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（編集）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１参照）。
より詳細には、本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で周知の他のものを使用して精製されるとき、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有してもしていなくてもよい。用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの一本鎖または二本鎖の人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含む。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記載されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸が、ライブラリから収集され得る。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片が取得されたら、これらのＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。下記により詳細に述べられるように、本明細書の教示に適合する例示的ＩｇＧ１定常領域は、添付の配列表の配列番号６に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。この点に関して、例示的な適合するカッパ軽鎖定常領域は、添付の配列表の配列番号５に示されている。
本発明は、プロモーターに操作可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節およびプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞および宿主発現系も提供する。本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、またはポリペプチドおよび抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））または哺乳動物細胞もしくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターでコトランスフェクトされていてもよい。
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１および４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォームまたはＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれかを使用することができ、例えば、ある特定の条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的または部分的にＥＰ ０ ２１６ ８４６、ＥＰ ０ ２５６ ０５５、ＥＰ ０ ３２３ ９９７およびＥＰ ０ ３３８ ８４１ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９および５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の好ましい発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
本発明の抗体が、組換え発現または任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製または単離されてもよく、このことは、これが同定されることならびにその天然環境から分離および／もしくは回収されることならびに抗体の診断的または治療的用途に干渉する混入物から分離されることを意味する。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーションおよび親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。
Ｆ．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は選択され、クローン化され、所望の特徴、例えば、堅固な成長、抗体高産生および目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロでまたは同系遺伝子免疫不全動物においてインビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマおよび／またはコロニーを選択、クローニングおよび拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学および生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作および発現させてもよい。
ナイーブなライブラリ（天然または合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）および抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージまたは酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体またはｓｃＦｖ断片のライブラリがファージまたは酵母で合成されるファージまたは酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージまたは酵母を単離して、これらから抗体または免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージまたは酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングに使用され得る他の方法および試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；およびＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
ＶＩＩ．抗体誘導体
１．Ｆｃ領域の修飾
本明細書に記載の開示された抗体の可変領域への様々な修飾に加えて、抗体は、Ｆｃ領域の欠失、置換または修飾を含んでもよい。様々なアミノ酸残基の置換、変異および／または修飾は、抗体の特定の特性を有利に増強させることができる好ましい特徴をもつ化合物をもたらし得る。このような特性としては、これらに限定されないが、薬物動態、血清半減期の増加、結合親和性または特異性の増加、免疫原性の減少、産生の増加、Ｆｃ受容体に対するＦｃリガンド結合の変化、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増強、糖鎖結合の変化、ファゴサイトーシスの増加、および／または細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御が挙げられる。例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、１９９１、ＰＭＩＤ：１９１０６８６；Ｃａｐｅｌら、１９９４、ＰＭＩＤ：８０６９５２４；ｄｅ Ｈａａｓら、１９９５、ＰＭＩＤ：７５６１４４０；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；ならびにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６および２００３／０１９０３１１を参照。
２．グリコシル化の変化
本発明の実施形態は、例えば、Ｆｃドメイン上の修飾された糖鎖結合を含む抗体である（例えば、Ｓｈｉｅｌｄら、２００２、ＰＭＩＤ：１１９８６３２１参照）。操作されたグリコフォーム（例えば、低フコシル化抗体）は、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強または減少、標的に対する抗体の親和性の増加または抗体の産生促進のために有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域ＦＲ糖鎖結合部位の消去に至り得るアミノ酸置換は周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０および６，３５０，８６１参照）。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、組換え技術、例えば、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１））の共発現または発現後修飾（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）を使用して生成され得る。
３．多価抗体
開示された抗体または抗体断片は、一価または多価であり得る。一価抗体は、単一の結合部位を有し、一方で、多価抗体（例えば、二価または三価）は、２つ以上の標的または抗原結合部位を含む。それぞれの場合において、結合部位の少なくとも１つは、標的に関連するエピトープ、モチーフまたはドメインを含む。多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープまたは抗原決定因子に免疫特異的に結合することができるまたは二価抗体の一実施形態において、異なる構造、例えば、異種性ポリペプチドもしくは固形支持材料の標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合することができる。さらなる実施形態において、「ヘテロコンジュゲート」抗体は、複数の抗体を含み、例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つは、アビジンに結合することができ、他方は、ビオチンに結合することができる。二重特異的および他の多価抗体およびそれらの産生に関するさらなる考察については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５、２００９／０１５５２５５；ＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、ＰＭＩＤ：３７２４４６１；およびＷＯ９６／２７０１１を参照。
４．相同タンパク質および核酸
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原または抗体）が検討される。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。このような同一性、類似性または相同性は、様々な配列解析ソフトウェアプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ Ｇａｐ、ＢｅｓｔｆｉｔまたはＦＡＳＴＡを使用して測定することができる。
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセントまたは類似度を上昇するように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、好ましい実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能または活性を保持する。
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」または「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％または９８％の配列同一性を示し得る。
ＶＩＩＩ．抗体の特徴
開示された抗体は、一定の特徴を示す場合があり、これらの特徴は、スクリーニングされてもよく、抗体産生動物を特定の抗原で免疫することにより付与されてもよく、またはある特定の望ましい特徴、例えば、親和性、薬物動態、安全性プロファイルなどを増強もしくは洗練させるために上記のような組換え遺伝的技術を通じて改変されてもよい。
１．内在化、中和および枯渇抗体
特に好ましい実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞などの異常細胞に内在化される（任意のコンジュゲーションされた医薬活性成分を伴う）ような内在化抗体を含み得る。内在化は、インビトロまたはインビボで生じ得る。治療的適用について、内在化は、好ましくは、それを必要とする対象においてインビボで生じる。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体または、一部の場合に抗体薬物コンジュゲートの効力に依存して、単一抗体分子の細胞への取込みは、抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体が哺乳動物細胞に結合して内在化するかどうかは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８に記載のものを含む様々なアッセイにより決定され得る。
他の選択された実施形態において、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」または「中和」抗体であり得、このことは、抗体が決定因子と会合して、前記決定因子の活性を、直接的にまたは決定因子と結合パートナー、例えば、リガンドまたは受容体との会合を予防することにより、阻止または阻害し得ることを意味し、それにより、そうしなければ分子の相互作用から生じる生物学的応答は中断され得る。過剰な抗体が、決定因子に結合する結合パートナーの量を、例えば、標的分子活性またはインビトロ競合結合アッセイにより測定するとき、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはより多く減少させる場合、中和またはアンタゴニスト抗体は、決定因子がそのリガンドまたは基質に結合することを実質的に阻害する。修飾された活性は、当該技術分野で認識されている技術を使用して直接的に測定され得るまたは変化した活性が下流で有する影響（例えば、腫瘍形成または細胞生存）により測定され得る。
さらなる実施形態において、本明細書に開示される抗体または抗体薬物コンジュゲートは、「枯渇」抗体であり得、このことは、抗体が細胞表面上または細胞表面近傍で決定因子と会合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣまたは細胞毒性剤の導入により）細胞の死または消去を誘導することを意味する。好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団における決定因子を発現する細胞、例えば、ＤＬＬ３発現腫瘍細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％を不能にするまたは消去することができる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、単離された腫瘍形成性細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料または腫瘍形成性細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術を使用して腫瘍細胞の枯渇を監視および定量してもよい。
２．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＤＬＬ３に対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数または見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満または５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数またはｋｏｎ（またはｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満または１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数またはｋｏｆｆ（またはｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋ ｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法およびフローサイトメトリを使用して決定され得る。
３．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）およびエピトープマッピング
本明細書に開示された抗体は、それらが会合する個別のエピトープに関して特徴付けることができる。「エピトープ」は抗体または免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいてまたはタンパク質および／もしくは巨大分子の複雑な混合物におけるその標的抗原の抗体による優先的認識により（例えば、競合アッセイにおいて）、確認し、定義することができる。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続するアミノ酸により形成される。線状エピトープに優先的に結合する能力は、一般に、抗原が変性しているときでも維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列に、非連続性のアミノ酸であるが、抗原の二次的、三次的または四次的構造の意味において、単一の抗体により同時に結合されるために互いに物理的に十分に近いアミノ酸を含む。立体エピトープを有する抗原が変性しているとき、抗体はもはや抗原を認識しない。エピトープは、通常少なくとも３、より一般的には少なくとも５または８〜１０または１２〜２０のアミノ酸を、特有の空間的立体配置に含む。
本発明の抗体を、それらが属する群または「ビン（ｂｉｎ）」の観点で特徴付けることもできる。「ビニング」は、免疫原性決定因子に同時に結合することができない抗体の対を同定し、それによって結合について「競合する」抗体を同定する競合的抗体結合アッセイの使用を指す。抗体の競合は、試験される抗体または免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を予防または阻害するアッセイによって決定され得る。試験抗体は参照抗体の結合を予防または阻害し得るが、これは試験抗体と参照抗体の両方が同じエピトープを有し得るため、またはこれらが重複するエピトープを有し得るため、またはこれらが立体的に互いに近接しているエピトープを有し得るためである。競合実験を実施することによって、１つの抗体が別の抗体または抗体断片と「競合する」かを決定することができる。このような競合実験は、単離抗体または細胞培養（例えば、ハイブリドーマ）上清を用いて実施され得る。抗体の個々のビンに対する実験的帰属は、特定のビンにおける抗体の治療的、診断的または試薬の可能性を示し得る情報を提供することができる。
競合アッセイが基礎とし、本明細書で検討される１つの一般的な原理は、精製された抗原（または抗原を過剰発現している細胞）が表面上に被覆されているアッセイを含む。標識化されていない参照抗体は、飽和条件下で被覆された表面に露出されていない。第２の標識化された試験抗体が、同じ被覆された表面と競合するまたは結合する能力は、様々な当該技術分野で認識されている技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定される。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；およびＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ参照）。
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；または、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリが挙げられる。
「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムの特異的相互作用を解析することのできる光学的現象を指す。Ｌｕｍｉｎｅｘは、結合が試験されている抗原を固定化するためにビーズを利用するビーズ形式イムノアッセイである。同時に最大１００種類の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原および／または抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力および解像度がもたらされる。
一実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層および内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中または異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１およびＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１およびＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。
好ましい実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％以上阻害される。
競合抗体の群を包含するビンが決定されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメインまたはエピトープを決定するためにさらなる特徴付けを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコールを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージまたは酵母ディスプレイを使用して実施され得る。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）またはペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出および抗原の化学的修飾などの方法も（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）、酵素、例えば、タンパク分解酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）；化学物質、例えば、サクシニミジルエステルおよびそれらの誘導体、一次アミン含有化合物、ヒドラジンおよびカルボヒドラジン、遊離アミノ酸などを利用して使用され得る。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）としても知られる、改変−援用プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類できる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
ＩＸ．抗体薬物コンジュゲート
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、医薬として活性なまたは診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）または「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法に関わらず、任意の医薬として活性なまたは診断的成分と本発明の抗体との共有結合的または非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシンまたはシステイン残基を通じて達成される。特に好ましい実施形態において、医薬として活性なまたは診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲーションされ得る。開示されるＡＤＣは、治療および診断目的のために使用され得る。
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒または他のペイロードを、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞および／またはＤＬＬ３を発現している細胞）に送達し得る。本明細書で使用される場合、用語「薬物」または「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」は相互に交換可能に使用でき、生物学的に活性なまたは検出可能な分子もしくは薬物、例えば、下記に記載された抗がん剤を意味する。「ペイロード」は、場合によりリンカー化合物と組み合わせた薬物または「弾頭」を含み得る。コンジュゲート上の「弾頭」は、ペプチド、タンパク質またはインビボで代謝されて活性薬剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子および放射性同位体を含み得る。有利な実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロードを、ペイロードの放出および活性化の前に、比較的非反応性の非毒性の状態で標的部位に向かわせる。ペイロードのこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステインを介して）および過剰にコンジュゲートされた毒性種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物を通じて達成される。ペイロードを大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合されて腫瘍部位に送達されると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的な毒性を実質的に低減し得る。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞および組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
本発明の好ましい実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）のペイロードを含むが、診断剤および生体適合性修飾剤などの他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより提供される標的化放出から利益を得ることができる。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤または生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的にまたは非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。本発明のコンジュゲートは、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
ｂ）Ｌは、場合によるリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
またはその医薬として許容される塩によって表され得る。
前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカーおよび薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々である。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システインまたはリシン）と会合する任意の薬物または薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対する部位特異的コンジュゲーションを可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明の特に好ましい実施形態は、薬物または薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーションおよび混入物がより少なく、対応して毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
本発明の教示と適合する例示的なペイロードは、以下に列挙される：
１．治療成分
本発明の抗体は、医薬として活性な成分、例えば、治療成分または治療剤、例えば、抗がん剤、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤および免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、融合、会合または組み合わせて使用されてもよい。
本発明で検討される治療成分の例としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、マイタンシノイド、例えば、ＤＭ−１およびＤＭ−４（免疫原）、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカインならびに上記のいずれかのホモログ、誘導体または医薬として許容される塩もしくは溶媒和物もしくは酸が挙げられる。
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチンおよびオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチンまたはε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾もしくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）（Ｓｐｉｒｏｇｅｎ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体または誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブ（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体およびパクリタキセルおよびＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシンおよびエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビンおよび５−フルオロウラシル デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチンおよびアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシンならびに上記のいずれかの医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体を含む。ＷＯ０３／０７５９５７およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５に列挙される治療成分も本発明内で検討される。
さらに、一実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤを、細胞毒性剤およびその医薬として許容される塩または溶媒和物、酸または誘導体として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（および場合によるリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７およびＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０およびＷＯ２０１１／１３０６１６に記載されている。
本発明に適合するＰＢＤ化合物の例が、すぐ下に示される。
Figure 2017514143
Figure 2017514143
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒおよび２１１Ａｔが挙げられる。他の放射性核種も診断剤および治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にもコンジュゲートされ得る。例えば、特に好ましい実施形態において、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（または別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦαまたはＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）およびＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
２．診断剤または検出剤
他の好ましい実施形態において、本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチドまたはヌクレオチド）、小分子、フルオロフォアまたは放射性同位体であり得る診断剤もしくは検出剤、マーカーまたはレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生もしくは進行を監視するのに、または開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するためのもしくは処置の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として有用であり得る。このようなマーカーまたはレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合または抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離もしくは単離するためにまたは前臨床的手法もしくは毒性研究においても、有用であり得る。
このような診断、解析および／または検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオンおよび特定の放射性同位体に放射標識またはコンジュゲートした分子にカップリングすることによって行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
他の実施形態において、抗体またはその断片は、マーカー配列または化合物、例えば、ペプチドまたはフルオロフォアに融合またはコンジュゲートされて、精製または診断または分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７６７）および「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善または緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子にコンジュゲートされてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体または融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。ＰＥＧは、抗体に特定の特性が付与されるように（例えば半減期の調節が可能である）選択することができる多くの様々な分子量および分子構造で取得される。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを通じてまたはリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーありまたはなしで、抗体または抗体断片または誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状または分岐ポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体もしくは抗体断片をインビボでより安定にするためにまたはインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７；およびＥＰ０４１３，６２２を参照。
４．リンカー化合物
多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステインまたはリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定な抗体薬物コンジュゲートを提供するために使用することができる任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
多数の適合リンカーは、求核性である還元されたシステインおよびリシンに有利に結合し得る。還元されたシステインおよびリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィドおよびチオールパラフルオロ反応が挙げられる。チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、その速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、および抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失または移行である。しかしながら、好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、実施例１１および１２において本明細書で示される選択的還元および部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィドおよびピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホンおよびチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合する。
好ましい実施形態において適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体および単量体状態における自由な可溶性を保持する。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断または分解されるように設計されている。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲートまたは薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達または輸送されるまで、安定および無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；および（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果または細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣならびに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体および薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。２つ以上の機能的または生物学的に活性な部分を結合するために有用である２価のリンカー試薬、例えば、ＭＭＡＥおよび抗体は公知であり、それらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されてきた。
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカーおよび非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー、プロテアーゼ切断可能リンカーおよびジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーム−リソソーム経路において切断される。細胞毒の放出および活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾンまたはオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーム−特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコールまたはアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーム分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、ＡＤＣで使用される特定の薬物、特定の指標および抗体標的に依存する。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の好ましい実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されているようなＶａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−ＡｌａリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、薬剤がコンジュゲートされると通常減弱化され、コンジュゲートの血清安定性が通常高いことである。
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ｐＨ５．５または５．０未満のほぼリソソームのｐＨで不安定である。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−サクシニミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−サクシニミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
特に好ましい実施形態において（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される）適合ペプチジルリンカーは、
Figure 2017514143
 （ここで、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡは抗ＤＬＬ３抗体であり、Ｌ１はリンカーであり、ＡはＬ１を抗体上の反応性残基に連結する連結基（場合によってスペーサーを含む）であり、Ｌ２は共有結合であるまたは−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成し、Ｌ１またはＬ２は切断可能なリンカーである。）を含む。
Ｌ１は、好ましくは切断可能リンカーであり、切断のためのリンカーの活性化のための引き金と称され得る。
存在する場合、Ｌ１およびＬ２の性質は、広く変動し得る。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸もしくは塩基不安定性）、温度の変化または放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元または酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含み得る。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼまたはペプチダーゼである。
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１およびＸ２のＮ末端およびＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
さらに、カルボキシルまたはアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕおよびＬｙｓに対して、ＣＯおよびＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−および−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−および−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−または−Ｖａｌ−Ａｌａ−である。
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、それにより薬物の放出を可能にする。
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
Ｌ１およびＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基から誘導され得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、またはアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基から誘導され得る。
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基から誘導され得る。
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチンおよびシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体および天然に存在するアミノ酸の誘導体；ならびに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態およびそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−およびＬ２は一緒になって基：
Figure 2017514143
 （ここで、アスタリスクは、薬物または細胞毒性剤の位置に対する結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−または−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である。）を形成する。フェニレン環は、本明細書に記載の１、２または３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、ＲまたはＯＲで置換されていてもよい。
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
一実施形態において、ｎは０または１である。好ましくは、ｎは０である。
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
別の特に好ましい実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカーおよびジペプチドを含み、一緒になって、以下に図示される基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成し得る：
Figure 2017514143
 （ここで、アスタリスクは、選択された細胞傷害性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す。）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、保護された化合物（すなわち細胞毒）を、以下に示す流れに沿って進み、明確な放出を可能にする：
Figure 2017514143
 （ここで、Ｌ＊は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である。）。薬物の明確な放出により、確実に所望の毒性活性が維持される。
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
Ｌ１およびＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰまたは本明細書に記載の穏やかな還元剤での処置によってリンカー試薬とコンジュゲーションするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システインおよび（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている、糖のヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられる。アミン、チオールおよびヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；および（ｖ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルが挙げられ、それらのいくつかは、以下のように例示される：
Figure 2017514143
特に好ましい実施形態において、部位特異的抗体と薬物−リンカー部分との連結は、部位特異的抗体の遊離システインのチオール残基およびリンカー上に存在する末端マレイミド基を通じる。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、
Figure 2017514143
 （ここで、アスタリスクは、薬物−リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す。）である。この実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインから誘導される。他の適合リンカーに関して、結合部分は、活性化残基と反応して所望のコンジュゲートを提供し得る末端ヨードアセトアミドを含む。いずれにしても、当業者は、開示された薬物−リンカー化合物のそれぞれと適合抗ＤＬＬ３部位特異的抗体とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートし得る。
５．コンジュゲーション
いくつかの周知の異なる反応を使用して、薬物部分および／またはリンカーを選択された抗体に結合してもよい。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。特に好ましい実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニンおよびセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて開示されたペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るために仕立てられる。
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミドおよびヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインのシステインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよくまたはリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件および試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；および（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、および化合物と共有または非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処置により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオールまたはリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬または化合物−リンカー中間体または薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物またはリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分またはリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジド基が挙げられる。
好ましい標識化試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドサクシニミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホラミダイトが挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類またはハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性サクシニミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８および９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできるイソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
化合物をスレオニンまたはセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリンまたはスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的におよび迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
特に好ましい実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（またはその断片）に、１、２、３、４またはより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位および／または新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体または改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性および実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内または鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全または部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元およびそれに対する薬物リンカーの方向をさらに提供する。部位の改変および選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなる。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作および選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物および非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物および開示された新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態および／または薬力学ならびに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、遊離システインは還元されると、例えば、上記で開示するものなどのリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる、求核性であるチオール基を含む。本発明の好ましい抗体は、還元可能な不対の鎖間または鎖内システイン、すなわちこのような求核性基を提供するシステインを有する。したがって、ある特定の実施形態において、還元された不対のシステインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミドまたはハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処置により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にしてもよい。各遊離システインは、したがって論理的に、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬は適合性を有する。部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に公知の様々な反応、条件および試薬を使用して達成され得る。
さらに、改変抗体の遊離システインを選択的に還元することにより、部位特異的コンジュゲーションの向上および望ましくない潜在的な毒性混入物の減少がもたらされ得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内または分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」または「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、選択的還元は、特定の還元剤により影響を受け得る。他の好ましい実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒で選択的に還元された改変抗体のコンジュゲーションを意味する。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤の使用は、抗体重鎖および軽鎖のコンジュゲーションの程度ならびに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節および／または立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を形成（水素結合および静電相互作用を介して）することが知られており、好ましい構造変化を生じさせ得るおよび／または好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させ得る安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（および分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、これにより、本明細書に示すように作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーションおよび対応する不純物のレベルは相当に減少する。
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の好ましい実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の好ましい実施形態において、アミン部分は、三級アミンまたはグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリンおよびシステインを含み得る。さらに適合安定化剤は、グアニジンおよび塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の好ましい実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の好ましい実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。関連するｐＫａは、標準的技術を使用して容易に計算または決定することができ、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用することもできる。
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションのための遊離の部位特異的システインの還元を生じる任意の化合物を含み得る。このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤または還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」または「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（場合によって安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質または条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤または条件は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく遊離システインを効果的に還元（チオールを提供）することができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。好ましい実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、特に好ましい実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオールおよび２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的である。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（本発明では、軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはそれ以上である。
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生または保存されるときに、阻止またはキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることがさらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオンおよびスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防または阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じまたは異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、無キャップ反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元または選択的還元）中に生じる。
６．ＤＡＲ分布および精製
本発明の部位特異的抗体とのコンジュゲーションの利点の１つは、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力である。この点に関して、開示された構築物および／または選択的コンジュゲーションにより、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点で試料内のＡＤＣ種の均質性が提供される。上記で簡単に述べたように、用語「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」は、抗体に対する薬物のモル比を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、調製物内で、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関しても均一である特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明のある特定の実施形態において、部位特異的抗体および／または選択的還元ならびにコンジュゲーションの使用を通じて所望の均質性を達成することができる。他の好ましい実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の特に好ましい実施形態において、調製物は、分析的または分取クロマトグラフィー技術を使用してさらに精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）またはキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
ＡＤＣ調製物の精製に関して、標準的医薬調製方法を使用して所望の純度を得ることができる。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）または混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
開示されたＡＤＣおよびその調製物は、抗体の構成および少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分および抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１から２０の弾頭を含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である。）。他の選択された実施形態は、１から１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２の弾頭、またはより好ましくは１から１０の弾頭を含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性および弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物および他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞６は、凝集、不溶性、毒性またはある特定の抗体薬物コンジュゲートの細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される実際の薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る。）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４または６であり、特に好ましい実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
本発明により提供される均質性の比較的高いレベルにもかかわらず、開示される組成物は、１から８の範囲の薬物化合物とのコンジュゲートの混合物（ＩｇＧ１の場合）を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成抗体のほとんどは１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（選択的還元のコンジュゲート特異性にもかかわらず）この薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合し得る。つまり、以下の本発明のコンジュゲートＡＤＣ組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するコンジュゲートの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされるある特定の反応混入物を含む）。選択的還元および作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値または特異度、平均値、範囲または分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
したがって、ある特定の好ましい実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の好ましい実施形態において、本発明は、２、４、６または８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された好ましい実施形態において、本発明は、２＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲または偏差は、ある特定の好ましい実施形態において、０．４未満であり得る。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７もしくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６もしくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２もしくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、またはさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７または８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６または８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。特に好ましい実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２）は、他のＤＡＲ種に対して測定するとき、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度またはさらに９７％超の濃度で存在する。
下記実施例に詳述されるように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、従来手段、例えば、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡおよび電気泳動法により特徴付けられ得る。抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も決定され得る。ＥＬＩＳＡにより、ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値が決定され得る。しかしながら、抗体あたりの薬物の分布の値は、抗体−抗原結合およびＥＬＩＳＡの検出限界により識別可能でない。さらに、抗体−薬物コンジュゲートの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体に結合する場所、例えば、重鎖もしくは軽鎖断片または特定のアミノ酸残基を判別しない。
Ｘ．製品
本発明は、１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体またはＡＤＣを含み得る。ある特定の実施形態において、パックまたはキットは、単位用量を含み、単位用量とは、例えば、本発明の抗体またはＡＤＣを、１つ以上の添加剤および場合によって１つ以上の抗がん剤を伴ってまたは伴わずに含む組成物の所定の量を意味する。
本発明のキットは、一般的に、適切な容器内に、本発明の抗体またはＡＤＣの医薬として許容される製剤を含有し、場合によって、同じまたは異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断または併用療法のいずれかのために、他の医薬として許容される製剤または装置を含んでもよい。診断装置または機器の例としては、細胞または増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化またはプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの全ての列挙について、上記参照）。特に好ましい実施形態において、装置は、インビボまたはインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視および／または定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の好ましい実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体またはＡＤＣを抗がん剤または診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９を参照）。
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、または適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の医薬として許容されるバッファーまたは他の希釈剤、例えば、注射用滅菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液またはデキストロース液を含み得る。キットが、本発明の抗体またはＡＤＣをさらなる治療薬または薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、または一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体またはＡＤＣおよび任意の場合による抗がん剤または他の薬剤は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
キットは、１つまたは複数の容器、および封入される組成物が選択される疾患状態の診断または処置に使用されることを示す標識または添付文書を、容器内に、容器上にまたは容器に付随して含んでもよい。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラスまたはプラスチックなどで形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを含んでもよく、例えば、容器は、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、抗体および任意の場合による成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射もしくは導入するまたは身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針またはシリンジ（充填済または空）、点眼器、ピペットまたは他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアルまたはそれと同様のもの、および市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアルおよび他の装置を配置および保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
ＸＩ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点および終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０および２．０と３．０との間の全ての点を含む。
一般的に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学および化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法および技術は、一般的に、当該技術分野で周知のおよび本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
ＸＩＩ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願および出版物ならびに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、ならびに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込む」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かに関わらず、参照により組み込む。前述の詳細な説明および以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
ＸＩＩＩ．配列表の要約
下記表２にまとめたいくつかの核酸配列およびアミノ酸配を含む配列表を本出願に添付している。
Figure 2017514143
Figure 2017514143
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施された全てまたは唯一の実験であると表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０−ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前にマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプおよびサブタイプの略称が以下の通り表３に示される：
Figure 2017514143
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［実施例１］
全トランスクリプトーム配列決定を使用したメラノーマにおけるＤＬＬ３発現の同定
がん患者に存在する固形腫瘍の細胞異質性を特徴付け、臨床的に関連する治療標的を同定するために、当該技術分野で認識されている技術を使用して、大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の個別の腫瘍細胞株を含むＰＤＸ腫瘍バンクは、メラノーマ（ＭＥＬ）を含む様々な固形腫瘍悪性病変に罹患しているがん患者から初めに取得した腫瘍細胞の複数回継代により免疫不全マウスで増殖させた。低継代ＰＤＸ腫瘍は、天然環境にある腫瘍を表し、腫瘍の成長および現行治療に対する耐性を駆動させる根底のメカニズムに臨床的に関連する洞察を与える。
全トランスクリプトーム解析を実施するために、ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍（例えば、ＭＥＬ３およびＭＥＬ１３）を、８００〜２，０００ｍｍ３に達した後でマウスから切除した。切除したＰＤＸ腫瘍を、当該技術分野で認識されている酵素消化技術（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４参照）を使用して、単一細胞懸濁液に解離した。マウス細胞含量が＞５％であるいくつかの場合において、ＰＤＸ腫瘍試料を、ビオチン化抗マウスＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄ抗体ならびにストレプトアビジン−被覆鉄ビーズと共にインキュベートしてマウス細胞を枯渇させた。マウス細胞を枯渇させた後、ＲＮＡを、１％の２−メルカプトエタノール（Ｑｉａｇｅｎ）を補足したＲＬＴプラスＲＮＡ溶解バッファー中に溶解させることによって、腫瘍細胞または組織から抽出し、溶解物を−８０℃で凍結させ、次いで、ＲＮＡを抽出するためにＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解物を解凍した。代替的に、原発性ＭＥＬ腫瘍切除試料（例えば、ＭＥＬ２６）またはＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ）に保存したぶどう膜メラノーマ（例えば、ＵＶＭ１）由来の原発性組織生検材料を製造業者の指示書に従って処理し、ＲＮＡを単離した。最後に、ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／またはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量し、得られた全ＲＮＡ調製物を、次世代配列決定および遺伝子発現解析により評価した。
高品質ＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定を実施し、結果をＯｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）４．５またはＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ次世代配列決定システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）配列決定を使用して解析した。ＳＯＬｉＤ全トランスクリプトーム解析を、バルクＭＥＬ腫瘍試料由来の１ｎｇのＲＮＡから生成したｃＤＮＡで、低インプット全ＲＮＡについて設計したＡＢＩからの改変全トランスクリプトームプロトコールまたはＯｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２（商標）（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して実施した。得られたｃＤＮＡライブラリを断片化し、配列決定実施の間の異なる試料からの断片ライブラリのプールを可能にするためにバーコードアダプターを加えた。ＳＯＬｉＤプラットフォームにより生成したデータは、公開されたヒトゲノムのＮＣＢＩバージョンｈｇ１９．２を用いたＲｅｆＳｅｑバージョン４７により注釈の付された３４，６０９遺伝子にマッピングされ、ほとんどの試料においてＲＮＡレベルの検証可能な測定を提供した。ＳＯＬｉＤプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域にマッピングされた測量単位ＲＰＭ（１００万あたりのリード数）またはＲＰＫＭ（１００万あたりキロベースあたりのリード数）を使用した転写産物発現値として名目上表され、基本的な遺伝子発現解析を、ＲＰＭ＿転写産物またはＲＰＫＭ＿転写産物として正規化および計数することが可能になっている。図１に示されるように、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現は、正常メラノサイトおよび試験されたＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍株の一部（例えば、ＭＥＬ３、ＭＥＬ１３）で上昇しており、一方で他のＭＥＬおよびＵＶＭ ＰＤＸ腫瘍株において、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現は低かった（例えば、ＭＥＬ２６、ＵＶＭ１）。
ＭＥＬ腫瘍のサブセットで上昇したＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現が特定されることは、ＤＬＬ３が、メラノーマにおける有望な診断および／または免疫療法標的としてさらに評価する価値があり得るという先行的な表れである。
［実施例２］
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した腫瘍におけるＤＬＬ３ ｍＲＮＡの検出
ＭＥＬにおけるＤＬＬ３のｍＲＮＡ発現を確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを使用して、産業上の標準プロトコールにしたがってＭＥＬ ＰＤＸ細胞株に対して行った。ＲＮＡを、実施例１に記載のバルクＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍細胞から抽出した。１ｎｇのＲＮＡを、高性能ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ材料は、ＤＬＬ３特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して事前に増幅し、次いで後のｑＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
正常皮膚細胞およびメラノサイトにおける発現を、原発性ＭＥＬ生検およびＭＥＬ ＰＤＸ株における発現と比較した（図２；各ドットは、内在性対照／正規化遺伝子に対して正規化した後の固有の個体正常組織またはＰＤＸ株の相対的発現を表す；水平線は、同様の試料のそれぞれのセットにおける試料の幾何平均を表す。）。以下の全ての事例において、ＤＬＬ３の高発現は、メラノサイト、ＭＥＬｐ０およびＭＥＬ ＰＤＸ試料についての幾何平均の代表値より高い発現を有する腫瘍と定義し、代表値はおよそ１×１０５である。ＤＬＬ３ ｍＲＮＡは、３つの正常皮膚試料、２つのケラチノサイト試料および２つの正常ヒト二倍体線維芽細胞試料（集約して正常皮膚と表示、図２）において検出されなかった。対照的に、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの高発現が、５つの正常メラノサイト試料のうち４つで見られた。同様に、約半分のＭＥＬ ＰＤＸで、高ＤＬＬ３ ｍＲＮＡが検出され、２５／４２ＭＥＬ ＰＤＸが含まれた。この観察を、ＭＥＬ（ＭＥＬｐ０）の原発性生検試料にまで拡大すると、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡが、５／７原発性ＭＥＬ生検試料で検出されたことが示された。これには、同じ患者からのＰＤＸモデルを樹立するために使用した２つの原発性生検（ｐ０）試料が含まれており、本発明者らは、この原発性生検と確立されたＰＤＸ株との両方がＤＬＬ３ ｍＲＮＡの同等の発現レベルを有することを確認した。具体例は、ＭＥＬ１９であり、ｐ０原発性生検試料および継代ＰＤＸ試料の両方が、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの高発現を有する。このことは、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの発現が、マウスにおけるＭＥＬ ＰＤＸの継代の単なる結果ではないことを実証している。
上記ｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、実施例１で観察された結果と同様であり、正常メラノサイトおよび約半分のＭＥＬ ＰＤＸの両方におけるＤＬＬ３のｍＲＮＡ発現を実証している。しかしながら、ｑＲＴ−ＰＣＲは、線維芽細胞およびケラチノサイトを含む正常皮膚の他の成分が、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの発現を有しないことを示した。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、多くのＭＥＬ ＰＤＸがＤＬＬ３を高発現することを実証し、ＤＬＬ３がメラノーマの治療薬の開発において良好な標的であり得ることを示している。
［実施例３］
マイクロアレイを使用した腫瘍におけるＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現の決定
ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ発現を、マイクロアレイ解析を使用して決定し、上記実施例１および２の結果を確認した。１〜２μｇの全腫瘍の全ＲＮＡを、実質的に実施例１に記載されるように、ＭＥＬ ＰＤＸ細胞株ならびに皮膚、末梢血単球（ＰＢＭＣ）、乳房、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、脾臓および胃を含む正常細胞から誘導した。試料を、ヒトゲノムにおける２７，９５８遺伝子および７，４１９ ｌｎｃＲＮＡに対して設計された５０，５９９個の生物学的プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ＧＥヒト８×６０ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して解析した。標準的産業手段を使用して、強度値を正規化し、変換し、各試料について遺伝子発現を定量した。各試料におけるＤＬＬ３発現の正規化強度を図３にプロットし、各腫瘍タイプに由来する幾何平均を水平棒で示す。
図３は、ＤＬＬ３のｍＲＮＡ発現が、ＭＥＬ ＰＤＸにおいて正常組織の１００倍上昇し、正常組織ではバックグラウンド発現のみ検出されていることを示す。詳細には、ＭＥＬ１９は、４８００の正規化強度値を有する一方、ＭＥＬ６は、７４４の正規化強度値を有し、ＭＥＬ６ ＰＤＸにおけるｍＲＮＡのレベルの方が低いことを示す。これは、実施例２におけるｍＲＮＡ発現の結果を確認するものであり、データを拡張すると、試験された正常組織を上回るＭＥＬ ＰＤＸにおける発現の良好な治療ウインドウがあることが示唆される。
［実施例４］
がんゲノムアトラスからの腫瘍におけるＤＬＬ３発現
ＭＥＬ腫瘍におけるＤＬＬ３ ｍＲＮＡの過剰発現を、がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）として知られる大規模な公的に利用可能な腫瘍および正常試料のデータセットを使用して確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォーム由来のＤＬＬ３発現データを、ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードし、解析して各遺伝子の個々のエクソンからのリードを集計し、マッピングされたリード１００万あたりエクソンのキロベースあたりの単一値のリードを生成した（ＲＰＫＭ）。図４Ａは、ＤＬＬ３発現が、約半分の原発性ＭＥＬ腫瘍において、ＴＣＧＡデータベースで見出された正常組織に対して実質的に上昇していることを示す。対照的に、正常な乳房、腎臓、結腸、肺および前立腺組織における非常に低いＲＰＫＭレベルは、ＤＬＬ３発現の欠乏を実証する。これらのデータは、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡの上昇が多くのＭＥＬ腫瘍で見られ得るが、正常組織では見られないという先の観察結果を確認するものであり、正常組織を上回る良好な治療指標があること、したがって抗ＤＬＬ３抗体およびＡＤＣがこれらの腫瘍の有用な治療薬であり得ることを意味する。
図４Ｂは、患者の生存データが利用可能であったＭＥＬ ＴＣＧＡ腫瘍のサブセットについてのＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。患者は、メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３ ｍＲＮＡの高発現、すなわち閾値指標値を上回る発現、またはＤＬＬ３ ｍＲＮＡの低発現、すなわち閾値指標値を下回る発現に基づいて階層化した。閾値指標値は、ＲＰＫＭ値の算術平均として計算され、算術平均は１１．１と計算された。
プロットの下に示されている「リスクのある数（ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｒｉｓｋ）」は、各患者が最初に診断された日（０日目）から２０００日毎のデータセットに残っている生存している患者数を示す。メラノーマ患者の生存に対するＤＬＬ３発現の予後的関連性を、Ｃｏｘ比例ハザード退行モデルを２７０人の患者についてのＴＣＧＡ生存およびＤＬＬ３ ＲＮＡ−Ｓｅｑ発現データに当てはめて概算した。この概算は、Ｒ「生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）」パッケージにおける「ｃｏｘｐｈ」関数を使用して行った。ＤＬＬ３発現は、有意な変数（Ｗａｌｄ試験によりｐ＝０．０００７４）であることが見出され、ハザード比は１．００９（９５％信頼区間１．００４〜１．０１４）であった。これらのデータは、ＤＬＬ３の高発現を示すＭＥＬ腫瘍を有する患者が、ＤＬＬ３の低発現を示すＭＥＬ腫瘍を有する患者と比較して、生存時間がはるかに短いことを示す。このように、メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３の高発現は、生存不良と相関しており、メラノーマを処置するための抗ＤＬＬ３治療の有用性と、それに基づいて処置決定がなされ得る予後診断バイオマーカーとしてのＤＬＬ３発現の有用性とを強調する。
ＤＬＬ３発現が診断時の疾患進行の病期と相関するかどうかを判断するために、各ＴＣＧＡ試料に伴った病理学的報告書を使用した。根拠となる病理学コメントにおいて病期分類が明確に示されていない場合には、ＴＣＧＡデータセットの根拠となるメタデータに存在するデータに基づく皮膚病期分類のメラノーマに関するＡＪＣＣ第７版のガイダンスに従って腫瘍を病期分類した。ＤＬＬ３発現についての閾値指標値は、病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに対してそれぞれ１０．３、１３．４、７．７および１７であることが分かった。解析の結果から、病期ＩＩの患者において、ＤＬＬ３発現は、有意な変数（ｐ＝０．００２９）であることが見出され、ハザード比は１．００１（９５％信頼区間１．００４〜１．０１７）であることが示された。このことは、疾患の速い進行および予後不良を有する患者において、ＤＬＬ３の発現が増加していることを意味している。ＤＬＬ３発現は、病期ＩＩＩの患者に対しても有意な変数であることが分かった（図４Ｃ）。このことは、初期段階の非転移性メラノーマにおけるＤＬＬ３発現が予後不良の有用なバイオマーカーであることを示しており、ＤＬＬ３を発現している初期段階の患者でさえ、抗ＤＬＬ３治療または他のメラノーマ治療薬で処置することを論じている。
［実施例５］
抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体を以下のように作製した。第１の免疫化キャンペーンにおいて、３匹のマウス（各々、以下の株：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢのそれぞれに由来）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはアルムアジュバントで乳化したヒトＤＬＬ３−Ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物は、Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３）。初回免疫化は、マウスあたり１０μｇのｈＤＬＬ３−ＦｃのＴｉｔｅｒＭａｘ中エマルジョンを用いて行った。次いでアルムアジュバント中マウスあたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを用いて、隔週でマウスを追加免疫した。融合前の最終注射は、ＰＢＳ中マウスあたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃを用いた。
第２の免疫化キャンペーンにおいて、６匹のマウス（２匹毎に次のいずれかで染色：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等体積のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）またはアルムアジュバントで乳化したｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質をｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように操作したＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。初回免疫化は、マウスあたり１０μｇのｈＤＬＬ３−ＨｉｓのＴｉｔｅｒＭａｘ中エマルジョンを用いた。次いでアルムアジュバント中マウスあたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを用いて隔週でマウスを追加免疫した。最終注射は、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作した２×１０５のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を用いた。
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特異的な抗体を示した。簡単に述べると、９６ウェルプレートを、ＥＬＩＳＡコーティングバッファー中０．５μｇ／ｍｌの組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓで一晩被覆した。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて１時間、室温でブロッキングした。マウス血清を用量設定し（１：１００、１：２００、１：４００および１：８００）、ＤＬＬ３被覆プレートに５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで５０μＬ／ウェルの３％ＢＳＡ−ＰＢＳまたは２％ＦＣＳのＰＢＳ中で１：１０，０００希釈したＨＲＰ−標識化ヤギ抗マウスＩｇＧと１時間、室温でインキュベートした。プレートを再び洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１５分間、室温で添加した。展開した後、等体積の２ＮのＨ２ＳＯ４を加え、基質の展開を止め、プレートを分光光度計によりＯＤ４５０で解析した。
血清−陽性免疫化マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径および内腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞の細胞懸濁液（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫化マウス由来のおよそ２２９×１０６細胞およびｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化マウス由来の５１０×１０６細胞）を、非分泌Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比率でエレクトロセルフュージョンによりＢＴＸ Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅシステム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）モデルを使用して融合した。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清、１０％のＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＨＥＰＥ、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、フラスコあたり１００ｍＬの選択培地を含む４つのＴ２２５フラスコで培養した。フラスコを、５％ＣＯ２および９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータ内に６から７日間置いた。
融合から６または７日後、ハイブリドーマライブラリ細胞をフラスコから回収し、２００μＬの補足ハイブリドーマ選択培地（上記の通り）中のウェルあたり１個の細胞（ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｉ細胞ソーターを使用）で、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫化キャンペーンについては６４のＦａｌｃｏｎ ９６ウェルプレートに蒔き、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化キャンペーンについては４８の９６ウェルプレートに蒔いた。ライブラリの残りは、今後のライブラリ試験およびスクリーニングのために、液体窒素中で保存した。
ハイブリドーマを１０日間培養し、以下の通りに実施したフローサイトメトリを使用して、ｈＤＬＬ３に特異的な抗体について上清をスクリーニングした。ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作したウェルあたり１×１０５のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、３０分間、２５μＬのハイブリーマ上清とインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ ＦＣＳで洗浄し、次いで試料あたり２５μＬのＰＢＳ／２％ ＦＣＳで１：３００希釈したＦｃ断片二次特異的、ＤｙｅＬｉｇｈｔ６４９標識化ヤギ−抗マウスＩｇＧとインキュベートした。１５分間インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で再懸濁し、アイソタイプ対照抗体で染色した細胞の蛍光を超える蛍光について、フローサイトメトリにより分析した。
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫化キャンペーンによりおよそ５０のマウスの抗ｈＤＬＬ３抗体が得られ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫化キャンペーンによりおよそ９０のマウスの抗ｈＤＬＬ３抗体が得られた。
［実施例６］
抗ＤＬＬ３抗体の結合特性
様々な方法を使用して、上記の実施例５で示した通りに生成した選択された抗ＤＬＬ３抗体の結合特性を解析した。抗体を、ｈＤＬＬ３タンパク質に関する親和性、動態、ビニングおよび結合位置について特徴付けた（図５）。
ｈＤＬＬ３タンパク質に対する選択された抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴により決定した。抗マウス抗体捕捉キットを使用してＣＭ５バイオセンサーチップ上にマウス抗ＤＬＬ３抗体を固定化した。各抗原の注射サイクルの前に、マウス抗体を濃度２μｇ／ｍＬで、接触時間２分および流速５μＬ／分で表面上に捕捉させた。ベースラインからの捕捉抗体負荷は、８０〜１２０応答単位で一定であった。抗体捕捉および１分間のベースライン後、単量体ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ抗原を、濃度２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび６．２５ｎＭで表面上に流し、４分の会合段階、次いで４分の解離段階を流速５μＬ／分で実施した。抗マウス抗体捕捉キットは、各サイクル後に、２分間の接触時間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７で、１０μＬ／分で再生した。データは、特異的な抗体表面応答から対照マウスＩｇＧ表面応答を差し引いて処理し、データを会合および解離段階に切り詰めた。得られた応答曲線を用いて、１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを当てはめ、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、計算したｋｏｎおよびｋｏｆｆ動態定数を用いて見かけの親和性を算出した。選択された抗体は、ｈＤＬＬ３に対してナノモル範囲の親和性を示した（図５）。
ｈＤＬＬ３タンパク質に対する抗体の親和性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤを用いて生成した動態曲線からも以下のように決定した。抗ＤＬＬ３抗体を、抗マウスＦｃ捕捉バイオセンサー上に、接触時間３分および流速１０００ｒｐｍで固定化した。ベースラインからの捕捉された抗体負荷は、０．３１単位で一定であった。抗体捕捉および３０秒のベースライン後、バイオセンサーを２００ｎＭのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ溶液に浸し、１０００ｒｐｍの振盪速度で、４分の会合段階、続いて３分の解離段階を実行した。バイオセンサーは、各サイクル後に１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７に浸して再生した。特異的な抗体応答から対照マウスＩｇＧ表面応答を差し引くことによってデータを処理し、データを会合段階および解離段階に切り詰めた。会合および解離曲線を使用して選択された抗体の親和性を推定した。
抗体ビニングを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＲＥＤを使用して決定し、同じまたは異なるビンに結合する競合抗体を同定した。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで高濃度の非結合抗体を使用してチップをブロックし、ベースラインを収集した。次いで単量体の組換えヒトＤＬＬ３−Ｆｌａｇ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を特異的抗体（Ａｂ１）により捕捉させ、チップを、対照として同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェルまたは異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェルのいずれかに浸漬した。新しい抗体を加えてさらなる結合が観察された場合は、Ａｂ１およびＡｂ２を異なるビンであると決定した。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定し、さらなる結合が生じなかった場合は、Ａｂ２を同じビンであると決定した。当該技術分野で公知のように、このプロセスは、９６ウェルプレート中で特有のビンを示す抗体の完全な列を使用して固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大することができる。試験した抗ＤＬＬ３抗体は、少なくとも９つの異なるビンに結合した（図５でビンＡからＩとして命名）。ＤＬＬ３抗原の見かけのサイズ（ＥＣＤはおよそ５６ｋＤである。）および採用したビニング法の解像度に基づくと、９つの同定されたビンはＤＬＬ３細胞外抗原上に存在するビンの大半を表していると考えられる。
［実施例７］
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
実施例５で上述したように生成した抗体を、ＤＬＬ３に対する親和性に基づいた配列決定のために選択した。所望の抗体を発現しているハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ精製システム、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で溶解し、抗体をコードしているＲＮＡを調製した。１０４から１０５の細胞を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００μＬのクロロホルムを添加した後、激しく振盪した。次いで試料を、４℃で１０分間遠心分離し、水性相を新鮮な微量遠心チューブに移し、等体積の７０％エタノールを添加した。試料を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムに充填し、２ｍＬの採取チューブ内に入れ、製造業者の指示書に従って処理した。全ＲＮＡを、１００μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加えることによって、スピンカラム膜中に直接溶離して抽出した。ＲＮＡ調製物の質は、３μＬの１％アガロースゲル中で分画して決定した後、使用するまで−８０℃で保存した。
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組合せて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した３２の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ラムダ軽鎖を含有する抗体について、３つの５’Ｖλリーダー配列を、マウスラムダ定常領域に特異的な１つのリバースプライマーと組み合わせて使用して増幅を実施した。ＶＨおよびＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を、各ハイブリドーマについて実施し、４つはＶκ軽鎖に対して、４つはＶγ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０．５μＬの１００μＭの重鎖またはカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄａｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含有する１μＬの酵素ミックスならびに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）を含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分、９５℃で１５分、続いて３０サイクル×（９５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで、最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
抽出したＰＣＲ産物は、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。直接的ＤＮＡ配列決定のためにＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡを、５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムから溶出し、次いで両方の鎖から直接配列決定した。ヌクレオチド配列は、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子メンバーを同定した。誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨおよびＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−およびＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
図６Ａは、抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規マウス軽鎖可変領域および代表的なマウス抗ＤＬＬ３抗体の可変軽鎖から誘導される例示的ヒト化軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を示す。図６Ｂは同じ抗ＤＬＬ３抗体由来の新規マウス重鎖可変領域およびヒト化軽鎖を提供する同じマウス抗体由来のヒト化重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を示す。マウス軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２１〜３８７、奇数で提供されており、一方で、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３８９〜４０７、奇数で提供されている。
したがって、まとめると、図６Ａおよび６Ｂは、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９およびＳＣ１６．１５０と称されるいくつかのマウス抗ＤＬＬ３抗体の注釈の付された配列ならびにｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４およびｈＳＣ１６．５６と称されるヒト化抗体の注釈の付された配列を提供している。
本出願の目的に関して、各特定の抗体の配列番号は、連続した奇数である。したがって、モノクローナル抗ＤＬＬ３抗体、ＳＣ１６．３は、軽鎖および重鎖可変領域についてそれぞれアミノ酸配列番号２１および２３を含み、ＳＣ１６．４は、配列番号２５および２７を含み、ＳＣ１６．５は、配列番号２９および３１を含み、他も同様である。各抗体のアミノ酸配列に対応する核酸配列が、添付の配列表に含まれており、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの配列番号はそれぞれ２１および２３であり、ＳＣ１６．３抗体のＶＬおよびＶＨの核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０および２２である。
配列決定の例外により、ある特定の重鎖および軽鎖可変領域の配列が、配列決定プロセスの間に早々に切断されたことに留意すべきである。これにより、報告されたＦＲ４配列における１つ以上のアミノ酸の脱落が生じた。このような場合は、適合アミノ酸（他の抗体クローンからの対応配列の再調査により決定される）を補足して可変領域配列を本質的に完全なものにした。例えば、残基「ＩＫ」を、図６ＡのＳＣ１６．２２軽鎖配列（配列番号７３）の末端に加えて、完全なフレームワーク４を有する操作可能な軽鎖可変領域を得た。この追加したアミノ酸をコードする塩基は、一貫性を確保するために、対応する核酸配列（配列番号７２）に同様に加えた。このような図６Ａおよび６Ｂのそれぞれの場合において、識別を容易にするために、追加したアミノ酸に下線を付して太字としている（但し、添付の配列表では太字にしていない）。ＣＤＲは、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売バージョンを使用してＫａｂａｔら（前掲）に従って定義している。
［実施例８］
キメラおよびヒト化抗ＤＬＬ３抗体の生成
実施例２からの５つのマウス抗体（ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６）を使用して、ヒト定常領域とマウス可変領域とを含むキメラ抗体ならびにヒトアクセプター抗体にグラフト化したマウスＣＤＲを含むヒト化抗体を誘導した。いくつかの実施形態において、これらの誘導抗体（キメラまたはヒト化）は、開示された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣに組み込まれる場合がある。
キメラ抗ＤＬＬ３抗体を、当該技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。全ＲＮＡをハイブリドーマから抽出し、実施例１に示される通りに増幅した。マウス抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントに関するデータを、誘導した核酸配列から取得した。抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のリーダー配列に特異的なプライマーセットを、以下の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してはＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、ＶＬ断片に対してはＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩならびにＶＬ断片に対してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＬおよびＶＨ消化ＰＣＲ産物を精製し、カッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクターまたはＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクターにそれぞれ連結した。
ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物ならびに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。形質転換受容性のあるＥ．コリＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬのライゲーション産物を用いて４２℃での熱ショックを介して形質転換し、アンピシリンを濃度１００μｇ／ｍＬで用いてプレート上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製および消化後、ＶＨ断片をｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１５０ｍｍプレートで、標準条件下、１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％集密度まで成長させた。各１２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１およびｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクション試薬に加えた。ミックスを３０分間室温でインキュベートし、蒔いた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製した。
同じマウス抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６）を使用してＣＤＲグラフト化またはヒト化抗体も誘導した。マウス抗体は、専売のコンピュータ支援ＣＤＲグラフト化方法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）と標準的な分子操作技術を以下のように使用してヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列およびＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列およびＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらの番号付けに従って行った。可変領域が選択されたら、これらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
選択されたヒトアクセプター可変領域のための遺伝的組成物を、ヒト化抗体のそれぞれについて、直下の表４に示す。表４に示した配列は、配列番号３８９および３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３および３９５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号３９７および３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１および４０３（ｈＳＣ１６．３４）ならびに配列番号４０５および４０７（ｈＳＣ１６．５６）に示す連続する可変領域配列に対応する。表４は、選択された抗体の好ましい結合特性を維持するためにフレームワーク変化も逆変異も必要でなかったことを示す。
Figure 2017514143
フレームワーク領域で変化した残基はないが、ヒト化クローン（ｈＳＣ１６．１３）の１つにおいて、変異を安定性の問題に対処するために重鎖ＣＤＲ２に導入した。抗体の改変したＣＤＲに対する結合親和性を調べて、対応するキメラまたはマウス抗体のいずれかと同等であることを確認した。
選択された抗体のヒト化後、得られたＶＬおよびＶＨ鎖アミノ酸配列を解析して、マウスドナーおよびヒトアクセプター軽鎖および重鎖可変領域に関する相同性を決定した。直下の表５に示される結果は、ヒト化構築物が、一貫して、マウスドナー配列よりもヒトアクセプター配列に対して高い相同性を示したことを明らかにしている。マウス重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト化抗体とドナーハイブリドーマタンパク質配列との相同性（７４％〜８３％）と比較して、全体的に類似した相同性パーセンテージを示し、ヒト生殖系列遺伝子に対して最も近い一致を示した（８５％〜９３％）。
Figure 2017514143
誘導したヒト化構築物のそれぞれを、実施例６に記載のように表面プラズモン共鳴を使用して分析して、ＣＤＲグラフト化プロセスが、ＤＬＬ３タンパク質に対する構築物の見かけの親和性を明らかに変化させているかを決定した。ヒト化構築物を、マウス親（またはドナー）重鎖および軽鎖可変ドメインとヒト化構築物で使用したものと実質的に同等のヒト定常領域とを含むキメラ抗体と比較した。ヒト化抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ親抗体により示される結合特性とほぼ同等の結合特性を示した（データ示さず）。
［実施例９］
抗ＤＬＬ３抗体のドメインおよびエピトープマッピング
開示された抗ＤＬＬ３抗体が結合するエピトープを特徴付けるおよび位置付けるために、ドメイン−レベルのエピトープマッピングを、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４（前掲）に記載のプロトコールを改変して用いて実施した。特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインは、酵母の表面上に発現しており、各抗ＤＬＬ３抗体による結合はフローサイトメトリを通じて決定した。
酵母ディスプレイプラスミド構築物を、以下の構築物の発現により生成した：ＤＬＬ３細胞外ドメイン（アミノ酸２７〜４６６）；ＤＬＬ１−ＤＬＬ３キメラ、これは、Ｎ末端領域とＤＬＬ１のＤＳＬドメイン（アミノ酸２２〜２２５）をＤＬＬ３のＥＧＦ様ドメイン１から６（アミノ酸２２０〜４６６）に融合してなる；ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラ、これは、Ｎ末端領域と、ＤＬＬ３のＤＳＬドメイン（アミノ酸２７〜２１４）融合ＤＬＬ１のＥＧＦ様ドメイン１から８（アミノ酸２２２〜５１８）からなる；ＥＧＦ１（アミノ酸２１５〜２４９）；ＥＧＦ２（アミノ酸２７４〜３１０）；ＥＧＦ１およびＥＧＦ２（アミノ酸２１５〜３１０）；ＥＧＦ３（アミノ酸３１２〜３５１）；ＥＧＦ４（アミノ酸３５３〜３８９）；ＥＧＦ５（アミノ酸３９１〜４２７）；ならびにＥＧＦ６（アミノ酸４２９〜４６５）。（ドメイン情報については、全体的にＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＪ７を参照。アミノ酸番号付けは、配列番号１に示される配列に含まれるリーダー配列を有する未処理ＤＬＬ３タンパク質を参照していることに留意のこと。）。Ｎ末端領域またはＥＧＦドメイン全体の解析に関して、ファミリーメンバーＤＬＬ１を有するキメラ（ＤＬＬ１−ＤＬＬ３およびＤＬＬ３−ＤＬＬ１）を、タンパク質フォールディングの潜在的問題を最小化するために、断片に対向するものとして使用した。ドメイン−マッピングされた抗体はＤＬＬ１と交差反応しないことが以前に示されており、これらの構築物に対するあらゆる結合が構築物ＤＬＬ３部分との会合を通じて生じたものであることを示している。これらのプラスミドを酵母に形質転換し、次いで成長させ、Ｃｏｃｈｒａｎらに記載された通りに誘導した。
特定の構築物への結合を試験するために、所望の構築物を発現している２００，０００個の誘導酵母細胞を、ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＰＢＳＡ）中で２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳＡ中で０．１μｇ／ｍＬビオチン化抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および５０ｎＭの精製抗体または１：２希釈した培養したハイブリドーマからの非精製上清と共に７日間インキュベートした。細胞を氷上で９０分間インキュベートし、次いでＰＢＳＡ中で２回洗浄した。次いで細胞を、５０μＬのＰＢＳＡ中で適切な２次抗体と共にインキュベートした：マウス抗体についてはＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート化ストレプトアビジンおよびＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート化ヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ１μｇ／ｍＬで添加した；ヒト化またはキメラ抗体については、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート化ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各１μｇ／ｍＬで添加した。２０分間氷上でインキュベーションした後、細胞をＰＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで解析した。ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラに結合した抗体は、Ｎ末端領域＋ＤＳＬに対する結合と名付けた。特定のＥＧＦ−様ドメイン上に存在するエピトープに特異的に結合する抗体は、その各々のドメインに対する結合と名付けた（図７）。
エピトープを立体配座（例えば、不連続）または線状として分類するために、ＤＬＬ３ ＥＣＤを提示している酵母を、３０分間８０℃で加熱処理して、ＤＬＬ３ ＥＣＤを変性させ、次いで氷冷ＰＢＳＡ中で２回洗浄した。抗ＤＬＬ３抗体が変性酵母に結合する能力を、フローサイトメトリにより上記と同じ染色プロトコールを使用して試験した。変性および天然酵母の両方に結合する抗体を線状エピトープに結合するものとして分類し、一方で、天然酵母に結合するが変性酵母に結合しない抗体を立体配座特異的として分類した。
試験した抗体のドメインレベルのエピトープマッピングデータの概略を図７に示し、線状エピトープに結合する抗体は下線を付し、決定される場合、対応するビンを括弧内に記した。図７の概要は、抗ＤＬＬ３抗体の大半がＤＬＬ３のＮ末端／ＤＳＬ領域またはＥＧＦ２のいずれかに見られるエピトープにマッピングする傾向があることを示している。図５は、様々な抗ＤＬＬ３抗体に対するビン決定およびドメインマッピングに関する同様のデータを表形式で表している。
ファインエピトープマッピングを、２つの方法の１つを用いて、選択された抗体にさらに実施した。第１の方法では、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を採用し、製造業者の指示書に従って使用した。抗体を、エピトープマッピングのため、３ｍＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ８中、５０μｇ／ｍＬでＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐチューブ（Ｎｕｎｃ）上に一晩被覆した。チューブを、３％の重炭酸塩溶液中ＢＳＡ溶液を用いてブロックした。次いで、ＰＢＳ中１０１１のインプットファージ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を結合させ、次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて１０回連続的に洗浄して非結合ファージを洗い流した。残りのファージは、１ｍＬの０．２Ｍグリシンを用いて１０分間室温で穏やかに撹拌しながら溶出し、次いで１５０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ９で中和した。溶出したファージを増幅し、１０１１のインプットファージと共に再度洗浄し、この洗浄工程の間に０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、選択ストリンジェンシーを増加させた。第２のラウンドからの溶出したファージの２４プラーク由来のＤＮＡをＱｉａｐｒｅｐ Ｍ１３ Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、配列決定した。クローンファージの結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて確認し、ここでマッピングした抗体または対照抗体はＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、ブロックし、各ファージクローンに曝露させた。ファージ結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１−Ｓｔｅｐ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出した。特異的結合ファージ由来のファージペプチド配列を、ベクターＮＴＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抗原ＥＣＤペプチド配列に対して整列させ、結合のエピトープを決定した。
代替的に、酵母ディスプレイ方法（Ｃｈａｏら、２００７、ＰＭＩＤ：１７４０６３０５）を使用して、選択された抗体のエピトープをマッピングした。ＤＬＬ３ ＥＣＤ変異体のライブラリを、エラープローンＰＣＲで、ヌクレオチドアナログ８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−トリホスフェートおよび２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’トリホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏ）を使用して、クローンあたり１アミノ変異の標的変異誘発割合について生成した。これらを、酵母ディスプレイ形式に変換した。ドメインレベルのマッピングについて上記した技術を使用して、ライブラリを、ＨＡおよび抗体結合について５０ｎＭで染色した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＤＬＬ３ ＥＣＤと比較して結合の消失を示したクローンを選別した。これらのクローンを再成長させ、標的抗体に対する結合の消失について別のラウンドのＦＡＣＳ選別にかけた。ＺｙｍｏｐｒｅｐＹｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、配列決定した。必要であれば、変異を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して単一変異ＥＣＤクローンに再編成した。
個々のＥＣＤクローンを次いでスクリーニングし、結合の消失がエピトープ中の変異によるものまたはミスフォールディングを引き起こした変異によるものかを決定した。システイン、プロリンおよびストップコドンが関与する変異は、ミスフォールディング変異の可能性が高いために自動的に廃棄された。次いで残りのＥＣＤクローンは、非競合性の立体配座特異的抗体への結合についてスクリーニングした。非競合性の立体配座特異的抗体への結合が消失したＥＣＤクローンは、ミスフォールディング変異を含むと結論され、一方で、野生型ＤＬＬ３ＥＣＤへの等価な結合を保持したＥＣＤクローンは、適切にフォールディングされていると結論された。後者群のＥＣＤクローン中の変異は、エピトープ中にあると結論された。
抗体結合に関与するアミノ酸残基を含む誘導されたエピトープを含む選択された抗体の概要を、下記表６に列挙している。抗体ＳＣ１６．３４およびＳＣ１６．５６は、図５に示すビニング情報およびドメインマッピング結果と一致して一般のアミノ酸残基と相互作用する。さらに、ＳＣ１６．２３は、別個の近接エピトープと相互作用することが見出され、ＳＣ１６．３４またはＳＣ１６．５６とビニングしないことが見出された。添付の配列表のため、配列番号４は、２０４位にプレースホルダーのアミノ酸を含むことに留意されたい。
Figure 2017514143
［実施例１０］
抗ＤＬＬ３抗体−薬物コンジュゲートの調製
上述のＡｂ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを調製した。各ＡＤＣは、細胞毒に共有結合で連結した抗ＤＬＬ３抗体を含んでいた。ＡＤＣは、例えば、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１またはｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１と名付けられ、ここでＳＣ１６またはｈＳＣ１６は例示的ヒト化抗ＤＬＬ３抗体を表し、「Ｌ」は、好ましくは遊離スルフヒドリル基を有する末端マレイミド部分を含む特異的リンカーを表し、「ＰＢＤ１」は、本出願のＩＸの項目で上に示した構造を有するＰＢＤを表す。
ＬＰＢＤ１薬物−リンカー組合せを、当該技術分野で認識されている技術を使用して、以下の通り、合成し、精製した。選択された抗ＤＬＬ３抗体のシステイン結合を、抗体１モルあたり所定のモル添加率のモル数のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）で９０分間、２０℃で、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で還元した。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に溶解させたリンカー−薬物を、３ｍｏｌ／ｍｏｌ抗ＤＬＬ３抗体の割合で添加した。反応を３０分間、進行させた。未反応の薬物−リンカーは、過剰のモル当量のＮ−アセチルシステインの添加によりキャップした。最低２０分間クエンチした後、ｐＨを０．５Ｍの酢酸を添加して６．０に調整し、３０ｋＤａの膜を使用してダイアフィルトレーションによりバッファー交換した。次いでダイアフィルトレーションした抗ＤＬＬ３ ＡＤＣをショ糖およびポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを、タンパク質濃度（ＵＶで測定）、凝集（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による薬物抗体比（ＤＡＲ）およびインビトロ細胞傷害性について解析した。
［実施例１１］
部位特異的抗ＤＬＬ３抗体の生成
４つの改変されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を構築した。４つの改変抗体のうち２つは、天然の軽鎖定常領域を含み、重鎖に変異を有し、軽鎖のシステイン２１４と鎖間ジスルフィド結合を形成する、重鎖の上部ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）がセリンで置換されている（Ｃ２２０Ｓ）または欠失している（Ｃ２２０△）。残りの２つの改変抗体は、天然の重鎖定常領域と変異軽鎖とを含んでおり、軽鎖のシステイン２１４がセリンで置換されている（Ｃ２１４Ｓ）または欠失している（Ｃ２１４△）。構築されたとき、重鎖および軽鎖は、治療剤とのコンジュゲーションに適切である２つの遊離システインを含む抗体を形成した。直下の表７に変化をまとめている。他に記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示されるＥＵ番号付けスキームに従っている。
Figure 2017514143
改変抗体は、以下のように生成した。
実施例８に示すように誘導したヒト化抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６軽鎖（配列番号１４）または重鎖（配列番号１５）をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅および部位特異的変異誘発の鋳型として使用した。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示書にしたがってＱｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。
２つの重鎖変異体に対して、ｈＳＣ１６．５６の変異体Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０△重鎖をコードするベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるｈＳＣ１６．５６の天然ＩｇＧ１カッパ軽鎖でコトランスフェクトし、哺乳動物一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０ＳまたはＣ２２０△変異体を含む改変抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、それぞれｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（配列番号１６および１４）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（配列番号１７および１４）と名付けた。
２つの軽鎖変異体について、ｈＳＣ１６．５６の変異体Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４△軽鎖をコードするベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるｈＳＣ１６．５６の天然ＩｇＧ１重鎖にコトランスフェクトし、哺乳動物一過性発現システムを使用して発現させた。改変抗体をタンパク質Ａクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）を使用して精製し、適切なバッファーに保存した。Ｃ２１４ＳまたはＣ２１４△変異体を含有する改変抗ＤＬＬ３部位特異的抗体は、それぞれｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（配列番号１５および１８）またはｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（配列番号１５および１９）と名付けた。
改変抗ＤＬＬ３抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在および不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した。２つの重鎖（ＨＣ）変異体ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１（Ｃ２２０Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２（Ｃ２２０△）ならびに２つの軽鎖（ＬＣ）変異体ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３（Ｃ２１４Ｓ）およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４（Ｃ２１４△）のバンドパターンを観察した。還元条件下、各抗体について、遊離ＬＣおよび遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、４つの改変抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１−ｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）が、天然ＩｇＧ分子とは異なる、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示すバンドパターンを示した。４つの変異体全てが、ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドを示した。ＬＣ上の欠失または変異を有する変異体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ３およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ４）は、遊離のＬＣに対応する約２４ｋＤの単一のバンドを示した。重鎖上に欠失または変異を含有する改変抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１およびｈＳＣ１６．５６ｓｓ２）は、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの優勢バンドとを示した。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各軽鎖上のＣ末端における遊離システインによるｓｓ１およびｓｓ２構築物により予測される。
［実施例１２］
選択的還元プロセスを使用した部位特異的抗ＤＬＬ３抗体のコンジュゲーション
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］構造を有する抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を上述のように調製した。ここで、Ａｂ部分は、部位特異的抗体、例えば、上記実施例１１に示すように生成されたｈＳＣ１６．５６ｓｓ１である。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システインに最大限コンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）または２未満（ＤＡＲ＜２）である薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを最小化する一方で、ＤＡＲが２（ＤＡＲ＝２）であるＡＤＣを最大化するＡＤＣである。
コンジュゲーションの特異性および最終部位特異的ＡＤＣの均質性をさらに改善するために、部位特異的抗体（例えば、「ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１」）を、例えば、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）および穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して選択的に還元した後、リンカー薬物でコンジュゲーションし、その後、分取疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して異なるＤＡＲ種を分離した。上記手法は、例えば、下記に記載されるように実施した。
部位特異的抗体の調製物を、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのグルタチオン、還元（ＧＳＨ）／５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含有するバッファーで最低１時間、室温で部分的に還元した。次いで全ての調製物を、３０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）を使用して、２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．２バッファーにバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた部分還元調製物を、リンカー（例えば、マレイミドリンカー）を介して、最低３０分間、室温で、細胞毒（例えば、ＰＢＤ１）とコンジュゲーションした。次いで水中で調製した１０ｍＭのＮＡＣ原液を使用して過剰のＮＡＣを薬物をリンカー薬物に添加することにより、反応をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを６．０に調整した。部位特異的ＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を使用してダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで部位特異的ＡＤＣ調製物を高塩バッファーで希釈して伝導率を増加させて樹脂への結合を促進させ、次いでブチルＨＰ樹脂クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填した。次いで塩勾配の低下を利用して、疎水性に基づいて異なるＤＡＲ種を分離し、この分離では、ＤＡＲ＝０種が最初に溶出され、次いでＤＡＲ＝１、ＤＡＲ＝２、この後にＤＡＲのより高い種が溶出される。
最終ＡＤＣ「ＨＩＣ精製ＤＡＲ＝２」調製物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用して解析し、ＨＣおよびＬＣに関するコンジュゲーションパーセントならびにＤＡＲ分布を決定した。解析用ＨＩＣを使用して試料を解析し、望ましくないＤＡＲ＞２およびＤＡＲ＜２の種に対するＤＡＲ＝２の種の量も決定した。
［実施例１３］
ＥＬＩＳＡアッセイを使用する腫瘍におけるＤＬＬ３タンパク質発現
実施例１−４により、ＤＬＬ３ ｍＲＮＡ転写産物レベルが、正常細胞と比較してＭＥＬ腫瘍の約５０％において上昇することが実証された。ＤＬＬ３タンパク質発現を検出および定量化するために、電気化学発光ＤＬＬ３サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイをＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（「ＭＳＤアッセイ」）を使用して展開した。
ＭＳＤアッセイは以下のように実施した。ＰＤＸ ＭＥＬ腫瘍をマウスから切り出し、ドライアイス／エタノールで急速凍結した。正常組織を、市販の供給源から購入した。タンパク質抽出バッファー（Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、解凍した腫瘍または正常組織に加え、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して微粉砕した。溶解物を、遠心分離（２０，０００ｇ、２０分、４℃）により清澄化し、各溶解物中の全タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量化した。次いでタンパク質溶解物を５ｍｇ／ｍＬに正規化して、アッセイするまで−８０℃で保存した。溶解物試料由来のＤＬＬ３タンパク質濃度を、ヒスチジンタグを有する精製組換えＤＬＬ３タンパク質を使用して生成した標準タンパク質濃度曲線からの値を内挿することによって決定した。ＤＬＬ３タンパク質標準曲線およびタンパク質定量アッセイを以下のように実施した：
ＭＳＤ標準プレートを、一晩４℃で、ＰＢＳ中１５μＬの４μｇ／ｍＬの抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体で被覆した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、３５μＬのＭＳＤ３％ブロッカーＡ溶液中で１時間、振盪しながらブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ中で再び洗浄した。ＭＳＤ１％ブロッカーＡ含有１０％タンパク質抽出バッファー中１０μＬの１０倍希釈溶解物（または段階希釈組換えＤＬＬ３標準）もウェルに加え、振盪しながら２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで再び洗浄した。異なるエピトープを認識する抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ ＮＨＳエステルを製造業者のプロトコールに従って使用して、スルホタグ化した。ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ ＮＨＳ−エステルは、タンパク質の第一アミン基に弱塩基性条件下で容易に結合して安定なアミド結合を形成するアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。１０μＬのスルホタグ化抗ＤＬＬ３モノクローナル抗体を、ＭＳＤ１％ブロッカーＡ中０．５μｇ／ｍＬで、洗浄したプレートに１時間室温で振盪しながら加えた。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄した。ＭＳＤ ＲｅａｄバッファーＴを界面活性剤と共に水中に１倍希釈し、３５μＬを各ウェルに加えた。プレートをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００で、組み込まれたソフトウェア解析プログラムを使用して読み取り、標準曲線からの内挿を介してＰＤＸ試料におけるＤＬＬ３濃度を導き出した。次いで値を全タンパク質濃度で除算して、全溶解タンパク質のミリグラムあたりのＤＬＬ３のナノグラム数を得た。得られた濃度を図８に示し、ここで各スポットは、単一ＰＤＸ腫瘍株または正常組織試料におけるＤＬＬ３タンパク質濃度を表す。各スポットは、単一のＰＤＸ株から誘導しているが、ほとんどの場合、複数の生物学的複製物を同じＰＤＸ株から試験し、値を平均してデータ点を得た。
図８は、ほとんどの正常組織において、ＤＬＬ３の完全なタンパク質の発現が全くないまたは非常に少ないことを示している。試験した正常組織は、副腎、動脈、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、末梢および坐骨神経、膵臓、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、気管、赤血球および白血球ならびに血小板、膀胱、脳、乳房、眼、リンパ節、卵巣、下垂体、前立腺および脊髄を含んでいた。さらに、培養メラノサイト由来のタンパク質溶解物の単一試料は、これらの培養メラノサイトにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ発現上昇が検出されたにもかかわらず、ＤＬＬ３タンパク質を検出可能に発現しなかった（実施例１〜２参照）。まとめると、これらの観察結果は、ＤＬＬ３発現が、正常メラノサイトにおいて転写後に調節されているようであることを示す。この転写後調節がＭＥＬでも見られるかを判定するために、ＭＳＤアッセイをＭＥＬ ＰＤＸ溶解物に実施した。図８は、試験したＭＥＬ ＰＤＸ株のうち、およそ５０％が、ＰＤＸ試料のＤＬＬ３発現の幾何平均である指標値０．５９ｎｇのＤＬＬ３／ｍｇタンパク質と比較して定義されたＤＬＬ３タンパク質の高発現を示したことを示す。例えば、ＭＥＬ１９ＰＤＸ細胞株は、７．８ｎｇのＤＬＬ３／ｍｇタンパク質を発現し、ＤＬＬの低発現を示したＰＤＸ細胞株の一例はＭＥＬ６であったが、この株は０．５４ｎｇのＤＬＬ３／ｍｇタンパク質しか発現しなかった。ＭＥＬにおけるＤＬＬ３タンパク質の示差発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイで観察されたＤＬＬ３ｍＲＮＡの示差発現と一致し（実施例１〜３参照）、このことは、ＭＥＬにおいて、ＤＬＬ３が、正常メラノサイトで見られるような転写後調節されていないことを示している。
メラノサイトを含め、正常組織と比較したＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍におけるＤＬＬ３タンパク質の明確な示差発現は、ＤＬＬ３タンパク質が、ＤＬＬ３を発現するメラノーマ腫瘍のサブセットにおける抗ＤＬＬ３抗体を使用する治療薬介入の魅力的な標的であることを強く示唆する。
［実施例１４］
免疫組織化学を使用したメラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３の検出
免疫組織化学（ＩＨＣ）を、ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍組織切片に対して実施し、ＭＥＬ腫瘍細胞におけるＤＬＬ３の発現および位置を評価した。
ＩＨＣ適合抗ＤＬＬ３抗体を同定するために、多数の本発明の抗ＤＬＬ３抗体を使用して、ＩＨＣをＨＥＫ−２９３Ｔ親細胞ペレットまたはＤＬＬ３発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットに実施した。ＩＨＣは、下記に記載するように、当該技術分野の標準通りにホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットに実施した。細胞ペレット塊の平らな部分を切断し、顕微鏡スライドガラス上に載せた。キシレン脱パラフィン後、５μｍの切片を、抗原回収溶液（Ｄａｋｏ）を用いて２０分間９９℃で前処理し、７５℃に冷却し、次いで、ＰＢＳ中０．３％過酸化水素、続いて、アビジン／ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。次いで、ＦＦＰＥスライドを、ＰＢＳバッファー中３％ＢＳＡ中１０％ウマ血清でブロッキングし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌに希釈した本発明の一次モノクローナル抗ＤＬＬ３抗体と共に３０分間室温でインキュベートした。ＦＦＰＥスライドを、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で２．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチンコンジュゲート化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に３０分間室温でインキュベートした後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。原発腫瘍試料（ｐ０）を備えたスライドを、チラミドシグナル増幅試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中１：２５で４分間さらにインキュベートし、次いで３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中でインキュベートした。色素生産性検出により、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で５分間、室温で発色させた。組織をＭｅｙｅｒのヘマトキシリン（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ）で対比染色し、アルコールで洗浄し、キシレン中に浸漬した。
試験した本発明の他の抗ＤＬＬ３抗体よりも効果的にＤＬＬ３過剰発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ペレットを特異的に検出可能な抗ＤＬＬ３抗体を同定して、さらなる研究に使用した。抗ＤＬＬ３抗体がＤＬＬ３を特異的に検出する能力は、競合実験で、抗体を５×モル比の過剰のｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質と混合させ、次いでＤＬＬ３−発現ＨＥＫ−２９３Ｔ ＦＦＰＥ切片と共にインキュベートすることにより確認した。陽性染色が存在しないことにより、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質が、ＤＬＬ３過剰発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に対する抗ＤＬＬ３抗体の結合に干渉していることが実証された（データ示さず）。
次いで、この抗ＤＬＬ３抗体を使用して、ｈＤＬＬ３が、様々な原発性ＭＥＬ生検およびＰＤＸ腫瘍細胞株に発現しているかを上述のＩＨＣを使用して決定した。染色強度は、様々なＭＥＬ腫瘍と正常メラノサイトとの間の発現の比較に基づいて、染色なし（−）から高染色強度（＋＋＋）でスコア化した。ｈＤＬＬ３を発現している細胞のパーセンテージも記している。図９は、ＤＬＬ３タンパク質の発現が、膜（「ｍ」）および／または細胞質（「ｃ」）で見られることを実証しており、「ｍ／ｃ」は膜における染色が優勢であることを示し、「ｃ／ｍ」は細胞質における染色が優勢であることを示す。以下のメラノーマ腫瘍はＤＬＬ３を発現しており：ＭＥＬ８、ＭＥＬ１７、ＭＥＬ１８、ＭＥＬ１９、ＭＥＬ２０、ＭＥＬ３０、ＭＥＬ３７、ＭＥＬ４８およびＭＥＬ６６、これらは、試験したＭＥＬ ＰＤＸ株の約半分にあたる。
これらのデータは、抗ＤＬＬ３抗体がメラノーマにおける診断上および治療上の有用性を有することを実証する。
［実施例１５］
フローサイトメトリを使用した腫瘍に関するＤＬＬ３タンパク質発現
フローサイトメトリを使用して、本発明の抗ＤＬＬ３抗体が、ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍細胞株表面のヒトＤＬＬ３タンパク質の存在を特異的に検出する能力を評価した。
ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍を採取し、当該技術分野で認識されている酵素組織消化技術を使用して解離し、ＰＤＸ腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を取得した（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４参照）。腫瘍細胞を、市販の抗マウスＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄ抗体で共染色した。ＣＤ４５およびＨ−２Ｋｄで陽性染色されたマウス細胞を解析から排除した。図１０Ａは、ＤＬＬ３の発現が様々なＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍株で検出されたが（例えば、ＭＥＬ１９、ＭＥＬ５５、ＭＥＬ６９；黒線）が、その他で検出されなかった（例えば、ＭＥＬ６；黒線）ことを示す。アイソタイプ対照抗体を用いて染色の特異性を確認した（灰色塗りつぶし）。これは他の結果と一致し、例えば、ＩＨＣ染色は、ＭＥＬ１９の原発性生検がＤＬＬ３タンパク質を発現していることを示し（図９）、ＭＳＤアッセイは、ＭＥＬ１９ ＰＤＸ細胞株がＭＥＬ６ ＰＤＸ細胞株と比較して高レベルのＤＬＬ３タンパク質を発現していることを示す（実施例１３）。
正常メラノサイトがＤＬＬ３タンパク質を発現しないという実施例１３の観察結果を裏付けるために、上述のようなフローサイトメトリを、上述のようにインビトロで拡大したメラノサイトに実施した。図１０Ｂは、ＤＬＬ３タンパク質がメラノサイト上で発現していないことを明確に示す（黒線）。陽性対照として、メラノサイトの同一性を確認するために、メラノーマに伴うコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ；ＣＳＰＧ４としても知られており、メラノサイトで発現することが知られている）のタンパク質発現を試験した。図１０Ｂに示すように、ＭＣＳＰの培養メラノサイト上の高発現により、これらの同一性と生存性の両方が確認された。アイソタイプ対照抗体をさらに使用して染色特異性（灰色塗りつぶし）を確認した。このデータは、ＤＬＬ３タンパク質がＭＥＬ腫瘍で発現するが、正常メラノサイトで発現せず、実施例１３の観察結果と一致することを示す。ＤＬＬ３がメラノーマ腫瘍細胞で発現するが正常メラノサイトで発現しないという発現の差異は、抗ＤＬＬ３抗体が、メラノーマの処置のための優れた候補治療を構成し得ることを示唆する。
［実施例１６］
抗ＤＬＬ３抗体は、インビトロにおける細胞毒性剤の送達を容易にする
本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣが内在化し、細胞毒性剤の生腫瘍細胞への送達を媒介することができるかを決定するために、インビトロ細胞殺傷アッセイを選択された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを使用して実施した。
マウス系統−枯渇ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍細胞（ＭＥＬ１９）を、単一細胞懸濁液に分離し、組織培養プレートに蒔いた。１日後、腫瘍細胞を、ヒト化抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ、０ｐＭから５００ｐＭの範囲の様々な濃度のｈＳＣ１６ＬＰＢＤ１または０ｎＭから１００ｎＭの範囲の様々な濃度のマウスアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）コンジュゲート化ＰＢＤ１（ｍＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１）に曝露した。１６８時間インキュベーションした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示書に従って使用して、生存細胞を数えた。未処理の細胞を含有する培養物を使用した素の発光カウント数を１００％の参照値に設定し、他のカウント数は全てこの参照値に対するパーセンテージとして計算した。ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１に曝露させた腫瘍は、対照ｍＩｇＧ１ ＡＤＣと比較して生存細胞パーセントの大きな減少を示した（図１１Ａ）。ｍＩｇＧ１ ＡＤＣは高濃度で細胞に対して細胞傷害性であるが、試験した抗ＤＬＬ３ ＡＤＣはより強力で、ＤＬＬ３に特異的な応答であり、ＰＢＤ細胞毒によるものだけではないことを示した。上記の結果は、抗ＤＬＬ３ ＡＤＣの抗ＤＬＬ３抗体の内在化を媒介する能力および細胞傷害性ペイロードを送達する能力を実証し、抗ＤＬＬ３抗体がＡＤＣに対する標的部分として治療有用性を有し得るという仮説を支持する。
［実施例１７］
抗ＤＬＬ３抗体はインビボメラノーマ成長を抑制する
上記実施例１０で記載されるように生成された抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを試験して、免疫不全マウスにおいてメラノーマ成長を殺傷および抑制する能力を実証した。
ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍株を、当該技術分野で認識されている技術を使用して雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部中で皮下的に成長させた。腫瘍体積およびマウスの重量を、１週間に１回または２回監視した。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に処置群に割り当て、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１（実施例１０を参照）または抗ハプテン対照ヒトＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１で腹腔内注射した。処置後、腫瘍体積およびマウス重量を、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるまでまたはマウスが病気になるまで監視した。ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置されたマウスは、免疫不全の腫瘍担持ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで通常見られるものを超える有害な健康への影響を何ら示さなかった。ＭＥＬ１９腫瘍を担持するマウスに、各１ｍｇ／ｋｇのＳＣ１６−ＬＰＢＤ１を全部で３用量、２週間の期間にわたり４日毎に投与したところ、腫瘍抑制が処置後１２０日を超えて持続した（図１１Ｂ）。対照的に、単一用量の標準治療薬物ダカルバジン１５０ｍｇ／ｋｇで処置したＭＥＬ１９担持マウスは、腫瘍量の顕著な減少を示さなかった（図１１Ｂ）。ＭＥＬ５６を担持しているマウスを、単一用量のｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１ ２ｍｇ／ｋｇまたはダカルバジン１００ｍｇ／ｋｇで処置した。ＭＥＬ５６はダカルバジンに不応性であり、ＩｇＧ対照に一次的にのみ応答することが証明されたが、ｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１は永続的にインビボ成長を阻害し、処置後８０日を超えて鎮静が持続した（図１１Ｃ）。ＭＥＬ２３腫瘍を担持しているマウスを、各０．５ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１を全部で３用量用いて、４日毎に２週間の期間にわたり処置したところ、腫瘍抑制が５０日を超えて持続した（図１１Ｄ）。陰性対照としておよびＤＬＬ３を発現している腫瘍に対するｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１の特異性を実証するために、ＰＤＸ腫瘍ＭＥＬ６を担持し、ＤＬＬ３を発現していないマウス（図１０Ａ参照）を、ｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置した。ＭＥＬ６腫瘍担持マウスを、単一用量のｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で２ｍｇ／ｋｇで処置したところ、ＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１対照で見られるものを上回る腫瘍成長阻害はもたらされなかった（図１１Ｅ）。
さらに、３００ｍｇ／ｋｇのダカルバジンによる処置に不応性の病期ＩＩＡの非転移性メラノーマ腫瘍であるＭＥＬ３は、ＤＬＬ３を発現し（図１）、インビボでのｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１を用いた処置に応答した（データ示さず）。このことは、ＤＬＬ３を発現している非転移性メラノーマ患者を抗ＤＬＬ３治療で処置することの有用性および不応性メラノーマの処置における抗ＤＬＬ３ ＡＤＣの有用性をさらに実証する。
標準治療のダカルバジンと比較して、ｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１がＤＬＬ３発現メラノーマ腫瘍細胞を特異的に殺傷し、メラノーマ成長を長期間インビボで劇的に抑制する能力は、ヒトメラノーマの治療的処置における抗ＤＬＬ３ ＡＤＣの使用をさらに確証する。
［実施例１８］
メラノーマにおけるＤＬＬ３発現の代用バイオマーカー
ＤＬＬ３発現の代用バイオマーカーは、マイクロアレイを使用して検出されたＤＬＬ３ｍＲＮＡ発現との正の相関または負の相関（反相関）に基づいて発見された。マイクロアレイデータを、実施例３で上に記載のように、参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）で注釈の付された公式遺伝子記号を有する２１，４４０遺伝子に対してマッピングされた３４，０２１プローブについて取得した。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、ＤＬＬ３発現と、様々なＭＥＬ ＰＤＸ細胞株における互いの遺伝子の発現との間で決定した。ＤＬＬ３と正の相関を有する遺伝子、すなわちＰｅａｒｓｏｎ相関が０．６以上の大きさの遺伝子を、図１２Ａに列挙する；ＤＬＬ３と反相関する遺伝子、すなわちＰｅａｒｓｏｎ相関が−０．６以下である遺伝子を図１２Ｂに列挙する。図１２Ｃは、発現がＤＬＬ３と正相関する遺伝子（例えば、ＥＦＨＤ１およびＪＡＧ２）または反相関する遺伝子（ＮＲＸＮ２およびＯＬＦＭＬ３）の例を示す。選択された遺伝子およびＤＬＬ３の正規化強度値を、各ＭＥＬ ＰＤＸ試料についてプロットする。最良適合直線状傾向線および対応するＰｅａｒｓｏｎ相関値を各パネルに示す。図１２Ｃの遺伝子のいくつかの配列に基づいて、これらの対応するタンパク質が細胞外に分泌される可能性があり、したがって、血液、血漿および／または血清で検出可能であると仮定する。詳細には、ＯＬＦＭＬ３は、分泌されることが公表されている（Ｚｅｎｇ ＬＣら、２００４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ）。ＥＦＨＤ１は、細胞外小胞エキソソームに関連することが推測されており（Ｐｒｕｎｏｔｔｏ Ｍら、２０１３ Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、したがって、細胞外領域に放出され、血清中で検出可能と考えられる。ＤＬＬ３と同様に、ＪＡＧ２は、ＮＯＴＣＨシグナル伝達経路に関連し、ＤＬＬ３の高い相関関係およびメラノーマ試料におけるＪＡＧ２共発現は、抗ＤＬＬ３抗体治療での処置に適するメラノーマのさらなるバイオマーカーとなり得る。ＮＲＸＮ２は、一回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、このｍＲＮＡ転写産物に対する２つの異なるマイクロアレイは、ＤＬＬ３と有意な反相関発現を示した。このデータは、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現が、ＤＬＬ３発現に対する相関または反相関代用バイオマーカーとして使用でき、それらの予測される分泌の結果として体液中で検出され得ることを実証する。
［実施例１９］
メラノーマにおけるＤＬＬ３発現と様々な発がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の遺伝子変異との相関
Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異は、悪性メラノーマ腫瘍の４０〜７０％で見出される。ベムラフェニブは、変異ＢＲＡＦに対して３０倍の選択性を有する特異的阻害剤である。Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有する患者は、ベムラフェニブに対して７０％の応答率を示し、腫瘍退縮および生存の向上を伴うが、ＭＡＰキナーゼ経路（再）活性化を導く変異により、数カ月間の処置後に獲得耐性がしばしば生じる。したがって、ＢＲＡＦ変異患者におけるベムラフェニブに代わり得るまたはベムラフェニブと組み合わせ得る新規併用療法が必要とされており、さらに野生型ＢＲＡＦを有する腫瘍を有するメラノーマ患者に対する処置が必要とされている。
ＢＲＡＦが選択ＭＥＬ ＰＤＸで変異しているかを決定するために、実施例１に記載されるようにマウス細胞の枯渇後にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＭＥＬ ＰＤＸからＤＮＡ Ｗｉｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＤＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＡｌｌＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、野生型またはＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ対立遺伝子を、Ｔａｑｍａｎ変異検出アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｏｉｅｓ）を使用した競合的ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＢＲＡＦ＿４７５＿ｍｕおよびＨｓ０００００１７２＿ｒｆ ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを用い、ＡＢＩ７９００サーモサイクラーを使用して検出した。当分野において標準であるように、内部陽性参照対照を含めた。
生殖系列変異を、ＢＲＡＦ変異状態を決定するために１６のＭＥＬ ＰＤＸ細胞株で決定した。Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異は、試験した１６のＭＥＬ ＰＤＸ細胞株のうち６つで見出され、ＭＥＬ腫瘍における公開されている変異頻度と一致した（Ｄａｖｉｅｓら、２００２、ＰＭＩＤ：１２０６８３０８；Ｔｈｏｍａｓら、２００４、ＰＭＩＤ：１５１４０２２８；Ｅｄｌｕｎｄｈら、２００６、ＰＭＩＤ：１７１１９４４７、Ｔｈｏｍａｓら、２００７、ＰＭＩＤ：１７５０７６２７）。驚くべきことに、ＤＬＬ３発現と、メラノーマ腫瘍におけるＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異の発現との間に相関はなかった。；Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有する６つのＭＥＬ ＰＤＸ細胞株のうち３つが高いＤＬＬ３発現を有した（データ示さず）。さらに、野生型ＢＲＡＦを発現している１０個のＭＥＬ ＰＤＸ細胞株のうち６つも、高いＤＬＬ３発現を有した（データ示さず）。例えば、ＭＥＬ１９は、Ｖ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有し、一方で、ＭＥＬ２３はＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異がなく、両方のＰＤＸ細胞株が、インビボで抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ処置に応答した（図１１Ａおよび１１Ｃ）。したがって、開示された抗ＤＬＬ３治療は、野生型ＢＲＡＦおよびＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異転移性メラノーマの両方の処置に有用である。
ＤＬＬ３発現とメラノーマで一般に変異している発がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異との相関関係の解析を拡張するために、３２のＭＥＬ ＰＤＸ試料からのｇＤＮＡをＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）での次世代配列決定にかけた。ＴａｑＭａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ検出試薬（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）を用いた定量により決定される１０ｎｇのｇＤＮＡを、各ＭＥＬ ＰＤＸから使用した。目的のゲノム領域を、製造業者が推奨するプロトコールに従って、カスタムのＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑプライマープール（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）で増幅した。標的増幅の後、個々のバーコードおよび配列決定アダプターを、個々のＭＥＬ ＰＤＸ試料に連結した。ライブラリを、Ｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）を使用して定量し、等濃度の各ＭＥＬ ＰＤＸライブラリを、配列決定のために４つのバーコードを付けたライブラリの群でプールした。４つのバーコード付加ライブラリのプールから配列決定される２００塩基リードについてのテンプレート−陽イオン球粒子（ＩＳＰ）の濃縮を、製造業者のプロトコールに従って、Ｉｏｎ ＯｎｅＴｏｕｃｈ２でＩｏｎ ＰＧＭ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＯＴ２ ２００キットまたはＩｏｎ Ｃｈｅｆ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）でＩｏｎ ＰＧＭ ＩＣ２００ Ｋｉｔを使用して調製した。配列決定は、Ｉｏｎ ＰＧＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ２００ Ｋｉｔ ｖ２またはＩｏｎ ＰＧＭ ＩＣ ２００ Ｋｉｔを使用して、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭを利用したＩｏｎ ３１８ Ｃｈｉｐ ｖ２（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）で実施した。
この標的化配列決定アプローチを使用して、試験したＭＥＬ ＰＤＸの１４／３２（４４％）が変異ＢＲＡＦ（１２＝Ｖ６００Ｅ、１＝Ｖ６００Ｋ、１＝Ｖ６００Ｒ）を有することが見出され、この割合は公開されている変異割合に沿うものであり、野生型と変異ＢＲＡＦとを識別するためのＴａｑｍａｎアッセイを使用した先の知見と一致する。メラノーマ腫瘍におけるＤＬＬ３発現とＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異の発現との間に相関はなく、ＤＬＬ３の高発現を有する１４のＭＥＬ ＰＤＸ細胞株のうち、４つがＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有し、１つがＶ６００Ｒ変異を有していた（図１３）。さらに、ＤＬＬ３発現が低いまたは無くない１８のＭＥＬ ＰＤＸ細胞株のうち、８つがＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異を有し、１つがＶ６００Ｋ変異を有していた（図１３）。それゆえ、開示される抗ＤＬＬ３治療は、野生型ＢＲＡＦおよびＤＬＬ３を発現するＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異メラノーマの両方の処置において、組合せでまたは標準単独治療として有用である。
標的化治療に適するメラノーマで変異している他の発がん遺伝子としては、ＮＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＫＩＴが挙げられる。図１３に示すように、ＤＬＬ３を発現するＭＥＬ ＰＤＸは、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＫＩＴに変異を有する場合があり、抗ＤＬＬ３抗体と構成的に活性な発がん遺伝子の阻害剤との併用療法の可能性が示唆される。
一方または両方の対立遺伝子の点変異または消失を伴うコピー数変化（ＣＮＶ）を、メラノーマで変異していることが多いいくつかの腫瘍抑制遺伝子、例えば、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２ＡおよびＰＴＥＮについて検出した。再び、主要な腫瘍抑制遺伝子の消失とＤＬＬ３の発現との間に相関はなかった。ＤＬＬ３を発現し、野生型ＢＲＡＦを有するＭＥＬ２３は、ＴＰ５３およびＰＴＥＮの両方に不活化点変異を有するが、図１１Ｄに示されるように、インビボでの抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ処置に対して応答性である。したがって、開示された抗ＤＬＬ３療法は、複数の腫瘍抑制遺伝子の機能が失われている状況におけるＤＬＬ３を発現する転移性メラノーマの処置に有用である。
まとめると、これらのデータは、ＤＬＬ３を発現するメラノーマが、メラノーマにおける発がん遺伝子および腫瘍抑制因子の最も一般的な注釈の付された変異とは独立して、そうすることを総合して示唆している。これらのデータは、標的化薬剤（例えば、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ダサチニブ）でも処置されているメラノーマ患者を処置できる可能性を意味している。
［実施例２０］
がん幹細胞の標的化のためのＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート
ＤＬＬ３発現は、薬剤耐性ならびに腫瘍再発および転移亢進性であることが一般に知られている（ＷＯ／２０１３／１２６７４６）がん幹細胞に関連する。抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを用いた処置が、メラノーマ腫瘍における腫瘍形成性細胞の出現頻度を減少させることを実証するために、インビボ限定希釈アッセイを、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１を用いた処置の後で実施した。
ＭＥＬ ＰＤＸ腫瘍（例えば、ＭＥＬ４０）を、６匹の免疫不全宿主マウスの皮下で成長させた。腫瘍体積が、平均して１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３である場合、マウスをそれぞれ２匹のマウスの３つの群にランダムに分離した。マウスに、ビヒクル対照、抗ハプテン対照ヒトＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１またはＳＣ１６−ＬＰＢＤ１のいずれかを０、４および７日目に１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した（実施例１０参照）。８日目に、各群からの２匹の代表的マウスを安楽死させ、次いで腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に分散させた。アイソタイプ対照で処置した残りの４匹のマウスの腫瘍は成長し続け、一方で、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置した腫瘍の体積はゼロまたはほぼゼロに減少した。さらなる対照は、ビヒクルで処置したマウスの腫瘍も成長し続けたことを示す（図１４Ａ）。
次いで、２つの処置群のそれぞれからの腫瘍細胞をプールし、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用したＦＡＣＳにより、ヒト生細胞を周囲マウス細胞から以下のように単離した。腫瘍細胞を、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗マウスＨ２Ｋｄおよび抗マウスＣＤ４５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識し、次いで１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩに（死細胞を検出するため）再懸濁化した。次いで得られた懸濁液を、標準条件下で選別した。ヒト生細胞を収集し、一方でマウスおよび死細胞を廃棄した。
５匹のレシピエントマウスに、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置した腫瘍由来の２００、５０、１２または３つの選別したヒト生細胞を移植した。比較のために、５匹のレシピエントマウスに、ＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１で処置した腫瘍由来の１００、３０、１５または５つの選別したヒト生細胞を移植した。さらに、先の研究で、未処置ＭＥＬ４０細胞ＬＤＡ１３１を選別し、７００、７０および７つのヒト生細胞を、それぞれ５匹のレシピエントマウスに移植した。レシピエントマウスの腫瘍は、毎週測定し、腫瘍が１５００ｍｍ３に達する前に個々のマウスを安楽死させた。研究は、いずれの１匹のマウスにも新たな腫瘍が発生しなかった連続する４週間後に終了した。この際、レシピエントマウスを腫瘍成長について陽性または陰性でスコア化し、陽性の成長は、２００ｍｍ３を超える体積を有するものとした。ＩｇＧ１−ＬＰＢＤ１対照で処置したメラノーマ腫瘍担持マウスは、ＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置したメラノーマ腫瘍担持マウスより大きな腫瘍を多く発生していた。Ｐｏｉｓｓｏｎ分布統計（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各集団におけるがん幹細胞の出現頻度を決定した。ｈＳＣ１６−ＬＰＢＤ１で処置したマウスのがん幹細胞の出現頻度は、アイソタイプ処置したマウスにおける４０細胞中約１または未処置の処置マウスにおける１０細胞中約１と比較して、１０００細胞中１より少なく低減された（図１４Ｂ）。この結果は、メラノーマの腫瘍体積の減少に加えて、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣが、顕著に特異的にがん幹細胞集団を減少させたことを示し、拡張して考えれば、本発明の抗ＤＬＬ３ ＡＤＣは、メラノーマ腫瘍の再発、転移または再成長も減少させる。

Claims (28)

  1. 患者の予後を評価する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程、および（ｂ）決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る場合に予後不良を評価する工程を含む方法。
  2. 処置について患者を選択する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程、および（ｂ）決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る場合に、抗ＤＬＬ３抗体を使用する処置について患者を選択する工程を含む方法。
  3. ＤＬＬ３発現レベルを決定する工程が、ＤＬＬ３タンパク質発現を検出する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＤＬＬ３タンパク質発現が、抗ＤＬＬ３抗体を使用して検出される、請求項３に記載の方法。
  5. 抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１７３の軽鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲおよび配列番号１７５の重鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１７３の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１７５の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
  7. ＤＬＬ３タンパク質発現が、免疫組織化学アッセイにおいて検出される、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. （ｃ）治療量の抗ＤＬＬ３抗体で患者を処置する工程をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. メラノーマを処置する方法であって、単離された抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートまたはその医薬として許容される塩を投与する工程を含み、抗体薬物コンジュゲートが式：Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
    （式中、
    Ｍは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
    Ｌは、場合によるリンカーを含み、
    Ｄは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含み、
    ｎは、１から２０の整数である）
    を含む方法。
  10. メラノーマが、不応性メラノーマである、請求項９に記載の方法。
  11. メラノーマが、ダカルバジン不応性メラノーマまたはベムラフェニブ不応性メラノーマである、請求項１０に記載の方法。
  12. メラノーマが、野生型ＢＲＡＦを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. メラノーマが、変異ＢＲＡＦを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. メラノーマが、野生型ＮＲＡＳを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
  15. メラノーマが、変異ＮＲＡＳを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
  16. 病期ＩＩのメラノーマを有する対象を処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料におけるＤＬＬ３発現レベルを決定する工程であって、決定されたＤＬＬ３発現レベルが閾値指標値を上回る、工程、および（ｂ）抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで患者を処置する工程を含む方法。
  17. 対象におけるメラノーマを処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の正相関代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の正相関代用バイオマーカーの発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法。
  18. １つ以上の正相関代用バイオマーカーが、以下のマーカーＰＵＳ７、ＥＦＨＤ１、ＰＴＰ４Ａ３、ＭＹＯ１Ｂ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＵＤＴ１４、ＮＲ６Ａ１、ＪＡＧ２、ＨＡＵＳ５、ＡＤＡＴ３、ＰＡＦＡＨ１Ｂ３、ＣＣＤＣ１３６、ＧＡＳ５、ＰＰＦＩＡ３、ＣＤＫ８、ＺＮＦ１１４、ＫＨＳＲＰ、ＭＵＲＣ、ＺＮＲＤ１、ＲＰＳ１９、ＬＲＲＣ４３、ＺＣＣＨＣ３、ＬＩＮ９、ＺＮＦ４１７、ＡＴＯＨ８、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１９、ＢＣＬ７Ａ、ＣＨＲＮＢ２、ＣＡＭＫＫ１、ＳＮＯＲＡ４３、ＴＭＥＭ１１７、ＣＢＬＬ１、ＨＳＰＡ１２Ｂ、ＯＲ４Ｃ４６、ＺＮＦ５７０、ＦＡＮＣＦ、ＺＮＦ４８０、ＴＲＰＭ６、ＣＨＤ７の１つおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 対象におけるメラノーマを処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の陽性の反相関代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の反相関代用バイオマーカーの低発現または無発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法。
  20. １つ以上の反相関代用バイオマーカーが、以下のマーカーＺＢＴＢ２０、ＧＰＲ１５５、ＭＳＴ１、ＣＬＶＳ１、Ｐ４ＨＡ２、ＣＩＩＴＡ、ＩＴＰＲ２、ＢＲＫ１、ＴＧＯＬＮ２、ＴＡＤＡ３、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＫＣＮＱ１、ＴＭＥＤ６、ＮＲＸＮ３、ＳＮＸ２４、ＯＬＦＭＬ３、ＫＣＴ２、ＰＪＡ２、ＳＥＰＴ８の１つおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 対象におけるメラノーマを処置する方法であって、（ａ）患者から取得された生物学的試料を１つ以上の分泌された代用バイオマーカーに対して照合する工程、（ｂ）試料における１つ以上の分泌された代用バイオマーカーの発現を検出する工程、および（ｃ）治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートで対象を処置する工程を含む方法。
  22. 生物学的試料が血液試料である、請求項２１に記載の方法。
  23. 分泌された代用バイオマーカーがＥＦＨＤである、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 分泌された代用バイオマーカーがＯＬＦＭＬ３である、請求項２１または２２に記載の方法。
  25. 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、内在化抗体である抗ＤＬＬ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項９から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体またはヒト化抗体である抗ＤＬＬ３抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項９から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１４９の軽鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲおよび配列番号１５１の重鎖可変領域アミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号４０５の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４０７の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
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