JP2020141694A - α−アミラーゼのスクリーニング方法 - Google Patents

α−アミラーゼのスクリーニング方法 Download PDF

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Abstract

【課題】低温で高い洗浄性能を有するα−アミラーゼおよび変異体をスクリーニングする方法の提供。
【解決手段】高い性能を低温で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、ａ）前記α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質に対するα−アミラーゼの結合性を判定するステップ；ｂ）前記基質に対する結合性が低いα−アミラーゼを選択するステップ、を含む方法など。
【選択図】なし

Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
本発明は、低温で高い性能を有する、特に洗剤中において低温で高い性能を有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法に関する。本発明はさらに、このようなアミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
α−アミラーゼ（α−1,4−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.1）は、デンプンならびに他の直鎖および分岐1,4−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
洗剤、製パン、醸造、例えば異性化糖の調製またはデンプンからのエタノール製造の一部におけるデンプン液化および糖化などの数々の公知の用途におけるα−アミラーゼの産業的な使用には長い歴史がある。α−アミラーゼのこれらの用途および他の用途は公知であり、特に細菌性α−アミラーゼといった微生物由来のα−アミラーゼが利用される。
用いられた最初の細菌性α−アミラーゼは、Termamylとしても知られるＢ．リケニホルミス（B.licheniformis）由来のα−アミラーゼであり、これは広範に特徴付けが行われ、この酵素に係る結晶構造が判明している。SP707などのアルカリ性アミラーゼが、洗剤における用途が見出された特定の一群のα−アミラーゼを形成する。これらの公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途における機能が改善されるよう修飾されている。
α−アミラーゼの耐熱性を高める方法は詳細に研究されている。Suzuki et al.(1989)には、Ｂ．アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）α−アミラーゼの特定の領域がＢ．リケニホルミス（B.licheniformis）α−アミラーゼの対応する領域で置換されたキメラα−アミラーゼが開示されている。このキメラα−アミラーゼは、耐熱性に関わる領域を特定するために構築された。このような領域は、Ｂ．アミロリケファシエンス（B.amyloliquefaciens）α−アミラーゼのアミノ酸残基177−186およびアミノ酸残基255−270を含むことが見出された。Igarashi et al.1998では、AmyS−タイプアミラーゼの耐熱性は、２つのアミノ酸残基R179−G180（AmyS番号）をループ（F178〜A184）から欠失させることにより高められることが示されている。しかしながら、Shiau et al.(2003)には、同一のループが欠失したＡｍｙＳ酵素は、高温でのコーンスターチ加水分解に対して親酵素よりも特異活性が低く、ＡｍｙＳアミラーゼの重要な利点の一つが犠牲になっていることが示されている。
環境保護のために、洗浄、皿洗いおよび／またはクリーニングプロセス中の温度を下げることがますます重要となっている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常用いられる温度よりも高い。α−アミラーゼは洗剤組成物において用いられる重要な酵素であり、その使用は、ランドリーの洗濯または皿洗いの最中におけるデンプン質の汚れを除去するためにますます重要となっている。従って、温度が低い場合であっても洗浄性能、汚れ除去効果および／または活性が保持されるα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にも関わらず、多くの汚れは完全に除去することが困難である。これらの問題は、低い洗浄温度（例えば冷水）および短期間の洗浄サイクルの使用増加により悪化している。それ故、低温下で機能することが可能であり、同時に特異活性（デンプン分解活性）、安定性および／または洗浄性能などの他の望ましい特性が維持または増加可能であるデンプン分解酵素を得ることが望ましい。
それ故、本発明は、低温で高い性能、特に高い洗浄性能を有するα−アミラーゼおよび変異体をスクリーニングする向上した方法を提供することを目的とする。
第１の態様において、本発明は、特に高い洗浄性能といった高い性能を低温で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、
ａ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する酵素の結合性を判定するステップ、
ｂ）基質に対する親和性が低く、特に基質に対する結合性と活性との間の比が小さいα−アミラーゼを選択するステップ
を含む方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ
を含む、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、特許請求された方法に基づいて選択可能である変異体および本発明の方法を用いて選択したα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
本発明は、生デンプンに対するアミラーゼの結合性と、特に低温での洗浄性能といった低温性能との間に逆相関が存在するという所見に基づいている。例えば、多数の実験用洗剤アミラーゼサンプルに対するデータを用いることにより、米デンプンに対する結合性とAMSA試験における洗浄性能との間に明らかな相関が見られる。それ故、固体基質に対する結合性が低いα−アミラーゼが、特に低温での洗剤における高い性能といった、低温での高い性能を有することが意外にも見出された。
定義
α−アミラーゼ活性：「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐1,4−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成するα−1,4−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（E.C.3.2.1.1）の活性を意味する。
基質結合性：「基質結合性」もしくは「固体基質に対する結合性」という用語、または、文法的に同等の用語は、固体材料に固定化された基質を含む固体基質に対して結合するα−アミラーゼの特性として理解される。この用語は相対的な用語であり、これは、普通、基準α−アミラーゼと比した相対的な結合性として表記される。変異体に関しては、基質結合性は普通、変異体の出発点とされた親α−アミラーゼに対して計測される。基質結合性は、固体基質を伴うα−アミラーゼの溶液をインキュベートし、基質を除去し、固体基質に結合したままのα−アミラーゼの初期量の画分を測定することにより計測され得、固体基質に対する基質結合性を判定するための好ましい方法が以下の材料および方法の項において開示されている。
変異体：「変異体」という用語は、改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を１つまたは複数（いくつか）の位置で含むα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
ミュータント：「ミュータント」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
野生型酵素：「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されたα−アミラーゼを意味する。
親または親α−アミラーゼ：「親」または「親α−アミラーゼ」という用語は、本発明の酵素変異体をもたらすために改変が行われたα−アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチドまたはその変異体であり得る。変異体に関連して、親ポリペプチドは、変異体において特異的に改変された残基を除いて、変異体と全く同一の配列を有するポリペプチドである。
単離された変異体：「単離された変異体」という用語は、人工的に修飾された変異体を意味する。一態様において、この変異体は、SDS-PAGEによる測定で、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも10％の純度、少なくとも20％の純度、少なくとも40％の純度、少なくとも60％の純度、少なくとも80％の純度および少なくとも90％の純度といった、少なくとも１％の純度である。
実質的に純粋な変異体：「実質的に純粋な変異体」という用語は、最大で10重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で0.5重量％の元々関連しているかまたは組換えにより関連している他のポリペプチド材料を含有する調製物を意味する。好ましくは、この変異体は、調製物中に存在するポリペプチド材料の総重量を基準として、少なくとも92％の純度、例えば、少なくとも94％の純度、少なくとも95％の純度、少なくとも96％の純度、少なくとも97％の純度、少なくとも98％の純度、少なくとも99％、少なくとも99.5％の純度および100％の純度である。本発明の変異体は、実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは、例えば、周知の組換え方法によって、または、古典的な精製方法によって変異体を調製することにより達成されることが可能である。
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾に続くその最終形態にあるポリペプチドを意味する。
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン3.0.0以降のEMBOSSパッケージ（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277）のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵM62（BLOSUM62のEMBOSSボージョン）置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」（−nobriefオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×100)／(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン3.0.0以降のEMBOSSパッケージ（前述のEMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000）のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman-Wunschアルゴリズム（前述のNeedleman and Wunsch,1970）を用いて判定される。用いられる任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびEDNAFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」（-nobriefオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×100）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
断片：「断片」という用語は、成熟型ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、この断片はα−アミラーゼ活性を有する。
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’−および／または３’−末端から欠失された１つまたは複数（いくつか）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
対立遺伝子変異体：「対立遺伝子変異体」という用語は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替的な形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異を介して自然に生じ、また、個体群中の多型性によりもたらされ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされるポリペプチドにおける変化無し）であることが可能であり、または、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
単離されたポリヌクレオチド：「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、人工的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％の純度、例えば、少なくとも５％の純度、少なくとも10％の純度、少なくとも20％の純度、少なくとも40％の純度、少なくとも60％の純度、少なくとも80％の純度、少なくとも90％の純度および少なくとも95％の純度である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成由来、または、これらのいずれかの組み合わせであり得る。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」という用語は、他の外来性または不要なヌクレオチドを含まず、および、遺伝的に操作されたポリペプチド産生系における使用に好適な形態のポリヌクレオチド調製物を意味する。それ故、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、元々または組換え的に関連している他のポリヌクレオチド材料を最大で10重量％、最大で８重量％、最大で６重量％、最大で５重量％、最大で４重量％、最大で３重量％、最大で２重量％、最大で１重量％および最大で0.5重量％含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータおよびターミネータなどの天然の5’-および3’-非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量基準で、少なくとも90％の純度、例えば、少なくとも92％の純度、少なくとも94％の純度、少なくとも95％の純度、少なくとも96％の純度、少なくとも97％の純度、少なくとも98％の純度、少なくとも99％の純度および少なくとも99.5％の純度であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、実質的に純粋な形態であることが好ましい。
コード配列：「コード配列」という用語は、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、通常は、ATG開始コドン、または、GTGおよびTTGなどの代わりの開始コドンで開始され、TAA、TAGおよびTGAなどの終止コドンで終わる。コード配列は、DNA、cDNA、合成または組換えポリヌクレオチドであり得る。
cDNA：「cDNA」という用語は、真核細胞から得られる成熟したスプライシングされたmRNA分子からの逆転写により調製されることが可能であるDNA分子を意味する。cDNAは、対応するゲノムDNA中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次RNA転写物は、成熟型のスプライシングされたmRNAとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるmRNAの前駆体である。
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に要求される制御配列を含有する場合、用語「発現カセット」と同義である。
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要なすべての成分を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来もしくは外来のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含む変異体の生成に関与するいずれかのステップを含む。
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす追加のヌクレオチドに作動可能にリンクされている直鎖または環状DNA分子を含む。
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
デンプン除去プロセス：「デンプン除去プロセス」という表現は、ランドリーなどの例えば生地クリーニングといったデンプンが生地から除去される洗浄プロセスにおけるものなどの、デンプンが除去（または転化）されるいずれかの種類のプロセスに関する。デンプン除去プロセスはまた、皿洗浄などの硬質面クリーニングであることが可能であり、または、産業上もしくは組織的なクリーニングなどの一般的なクリーニングプロセスであることが可能である。この表現はまた、一般的に、他のデンプン除去プロセスまたはデンプン転化、エタノール製造、デンプン液化、生地糊抜き、紙およびパルプ製造、ビール製造、ならびに、洗剤を含む。
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比して向上した変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、熱活性、耐熱性、pH活性、pH安定性、基質／補助因子特異性、向上した表面特性、生成物特異性、前処理されたバイオマスの存在下での高い安定性または溶解度、保管条件下での向上した安定性および化学安定性が挙げられる。
洗浄性能：本文脈において、「洗浄性能」という用語は、例えばランドリー、または、皿洗浄などの硬質面クリーニングの最中にクリーニングされるべき対象物に存在するデンプンまたはデンプンを含有する汚れを除去する酵素の能力として用いられる。洗浄性能は、AMSAの記載において、または、以下の方法の項におけるビーカ洗浄性能テストにおいて定義されるいわゆる強度値（Int）を算出することにより定量化され得る。
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、例えば汚れ除去の向上により、親アミラーゼの洗浄性能と相対的な、または、前記変異体と同等のアミノ酸配列を有するが１つまたは複数の特定の位置に欠失を有さないα−アミラーゼと相対的な、または、配列番号４に示されているアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの活性と相対的なアミラーゼ変異体の洗浄性能の改変を示す変異体酵素として本明細書において定義される。「洗浄性能」という用語は、一般的なクリーニング（例えば皿洗浄における硬質面クリーニング）を含むが、ランドリーなどの生地における洗浄性能、および、産業上もしくは組織的なクリーニングをも含む。
低温：「低温」は、５〜35℃、好ましくは５〜30℃、より好ましくは５〜25℃、より好ましくは５〜20℃、最も好ましくは５〜15℃および特に５〜10℃の温度である。好ましい実施形態において、「低温」は、10〜35℃、好ましくは10〜30℃、より好ましくは10〜25℃、最も好ましくは10〜20℃および特に10〜15℃の温度である。
第１の態様において、本発明は、
ａ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する酵素の結合性を判定するステップ、
ｂ）特に基質に対する結合性と活性との間の比が小さいα−アミラーゼといった、基質に対する結合性が低いα−アミラーゼを選択するステップ
を含む、特に低温で高い洗浄性能を有するといった、低温で高い性能を有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法に関する。
この態様によれば、本発明は、低温で高い性能を有するα−アミラーゼのスクリーニングであって、特に低温で高い洗浄性能を有する洗剤α−アミラーゼのスクリーニングに関する。この方法は、低温で良好な性能を有する酵素を見出すために新規のα−アミラーゼをスクリーニングするために好適である。この方法はまた、自動化され、また、高スループットのスクリーニング法に適合しているという利点を有し得る。
一実施形態において、この方法は、新規のα−アミラーゼを見出すために好適である。簡便な一つの方法は、多数の候補α−アミラーゼをテストし、１種の既知の洗剤α−アミラーゼを標準として包含し、次いで、標準洗剤α−アミラーゼよりも基質に対する結合性が低い新規の候補α−アミラーゼを選択することである。選択されたα−アミラーゼは、高い洗浄性能を有する候補となり、安定性、特異活性等などの洗剤酵素に重要な他の特性についてさらにテストされることが可能である。
数々の洗剤アミラーゼが文献から公知であって、配列番号１、２、３、４、５、６、８、10、11および12を有するα−アミラーゼなどの野生型アミラーゼ：国際公開第2001066712号パンフレットおよび国際公開第2006002643号パンフレットにおいて開示されている変異体などのこれらのいずれかの変異体が挙げられ、これらの公知の洗剤アミラーゼのいずれかが標準洗剤α−アミラーゼとしてこの方法において好適に包含され得る。
この実施形態におけるα−アミラーゼは、90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性、より好ましくは10％未満の結合性および最も好ましくは５％未満の結合性などの標準洗剤α−アミラーゼの95％未満の結合性を有するなど、選択された標準洗剤アミラーゼよりも低い基質に対する結合性を有するよう選択される。
あるいは、配列番号１を有するα−アミラーゼであるSP722を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、SP722よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号２を有するα−アミラーゼであるSP707を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、SP707よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号３を有するα−アミラーゼであるAA560を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、AA560よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号４を有するα−アミラーゼであるSP690を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、SP690よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号５を有するα−アミラーゼであるKSM-AP1378を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、KSM-AP1378よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号６を有するα−アミラーゼであるSP7-7を標準洗剤α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、SP7-7よりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した洗浄性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
本発明の方法はまた、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、BLAよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために、配列番号13を有するα−アミラーゼであるバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（BLA）などの他の親α−アミラーゼと共に用いられ得る。
あるいは、配列番号14を有するα−アミラーゼであるバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ（BAN）を親α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、BANよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
あるいは、配列番号15を有するα−アミラーゼであるバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（ゲオバチルス・ステアロテルモイルス（Geobacillus stearothermophilus））α−アミラーゼ（BSG）を親α−アミラーゼとして用いることにより、この方法は、好ましくは90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性といった、BSGよりも低い基質に対する結合性を有するα−アミラーゼを選択することにより、低温で向上した性能を有するα−アミラーゼを選択するために用いられ得る。
さらなる態様において、本発明は、
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップ
を含む親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関する。
この方法は、基本的には、低温で向上した性能を有する変異体の選択に望ましいいずれかの公知のα−アミラーゼについて用いられ得るが、しかしながら、好ましい実施形態において、本発明の方法は、低温で向上した洗浄性能を有する変異体の生成に用いられる。
他の実施形態において、本発明の方法は、クリーニング分野での用途、発酵されて摂取用もしくは燃料用のエタノールを提供するための糖質にデンプンを分解するためのデンプンの糖化もしくは液化などの用途、または、生地の生産における用途において、低温で向上した性能を有する親α−アミラーゼの変異体を選択するためのアミラーゼを見出すために用いられる。すべてのこのような用途は技術分野において公知であり、当業者は、本発明の方法に従って選択されたα−アミラーゼがこれらの用途にどのように適用され得るかを認識するであろう。
この好ましい実施形態において、親α−アミラーゼは、洗剤α−アミラーゼであって、すなわち、界面活性剤、キレート剤および洗剤においてルーチン的に用いられる他の成分の存在下での活性、ならびに、８〜11、９〜10などの範囲内などのアルカリ性pHでの活性などの、クリーニングおよびランドリーにおいて通常適用される条件下で活性を有するα−アミラーゼであり得る。
変異体は、親α−アミラーゼの表面に位置する１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップによって調製され得る。
当業者は、親分子の表面に位置する残基を同定することにより、修飾されるべき残基をどのようして同定するかを知っているであろう。これに関連して、分子の表面上に位置する残基は、自然な形態の分子における周囲の媒質と残基の少なくとも一部が直接接触している残基であると理解される。親分子の3D構造が入手可能である場合には親分子の3D構造から、または、親の3D構造が入手可能ではない場合には、親α−アミラーゼと3D構造が入手可能であるα−アミラーゼとアラインさせ、アラインメントにおいてα−アミラーゼの表面上に位置する残基に対応する分子の表面上に位置する残基を親α−アミラーゼの残基として同定することにより、当業者はこの種の情報を抽出することが可能であることが認識されるであろう。α−アミラーゼの3D構造は２つ以上が技術分野において公知であるため、所与の親α−アミラーゼの表面上に位置する残基の同定は、親α−アミラーゼと、この親α−アミラーゼに対する配列同一性が最も高いα−アミラーゼに係る３Ｄ構造とのアラインメントに基づいて行われるべきである。
変異体は、親α−アミラーゼの表面上の位置に残る１つまたは複数のアミノ酸について、親α−アミラーゼの表面に位置する１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップであって、親α−アミラーゼの表面に位置する、例えば少なくとも３個の残基、例えば少なくとも４個の残基、例えば少なくとも５個の残基、例えば少なくとも６個の残基、例えば少なくとも７個の残基、例えば少なくとも８個の残基、例えば少なくとも９個の残基、例えば少なくとも10個の残基といった少なくとも２個の残基など、例えば20個以下の残基または30個以下の残基といった15個以下の残基など、表面上に位置する少なくとも１個の残基を置換し、欠失させ、または、挿入するステップなどのステップによって生成される。
変異体はまた、分子の表面上に位置していない１つまたは複数のアミノ酸残基におけるさらなる置換、欠失または挿入を含有していてもよい。このような置換、欠失または挿入は従来技術において多く開示されており、本発明に従って用いられてもよい。このような好ましい追加の置換、挿入または欠失の例としては、国際公開第96/23873号パンフレットに開示されている親α−アミラーゼにおける残基D183およびG184の欠失を挙げることが可能である。
変異体は、その親α−アミラーゼに対して、好ましくは少なくとも90％配列同一性、好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％配列同一性、および、最も好ましくは少なくとも99％配列同一性を有して生成される。
変異体は、90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性など、親α−アミラーゼの95％未満の結合性を有するよう、親α−アミラーゼよりも低い基質に対する結合性を有するよう選択される。
好ましい一実施形態において、本発明は、配列番号１〜15を有するα−アミラーゼ、および、これらの１つに対して少なくとも80％配列同一性、好ましくは少なくとも85％同一性、好ましくは少なくとも90％同一性、より好ましくは少なくとも95％同一性、より好ましくは少なくとも97％同一性を有するα−アミラーゼから選択される親α−アミラーゼの変異体を選択する方法に関し、この方法は、以下のステップを含む。
ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップであって、ここで、変異体は、その親α−アミラーゼに対して少なくとも90％配列同一性、好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％配列同一性、および、最も好ましくは少なくとも99％配列同一性を有するステップ；
ｂ）α−アミラーゼに係るデンプンなどの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性について変異体をテストするステップ；ならびに
ｃ）基質に対する結合性が親α−アミラーゼよりも低い変異体を選択するステップであって、ここで、変異体は、90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性など、親α−アミラーゼの９５％未満の結合性を有するステップ。
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜15を有するα−アミラーゼ、および、これらの１つに対して少なくとも80％配列同一性、好ましくは少なくとも85％配列同一性、より好ましくは少なくとも87％配列同一性、より好ましくは少なくとも90％配列同一性、より好ましくは少なくとも95％配列同一性および最も好ましくは少なくとも97％配列同一性を有するα−アミラーゼから選択される親α−アミラーゼの変異体に関し、ここで：
ｉ）変異体は、親α−アミラーゼに対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも87％配列同一性、好ましくは少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％配列同一性を有し、ならびに
ii）変異体は、親α−アミラーゼと比して、80％未満の結合性、好ましくは70％未満、好ましくは60％未満、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性など、低い固体基質に対する結合性を有する。
本発明の方法を用いることにより、このような変異体が提供され得る。
本発明の変異体はまた、１つまたは複数の残基が親α−アミラーゼの表面上に位置していると共に、基質結合部位の一部が置換されているか欠失している変異体を含む。親α−アミラーゼの表面上に存在するこのような基質結合部位は文献においていくつかの親α−アミラーゼについて開示されており、このような基質結合部位は、所与の親α−アミラーゼとこのような基質結合部位が同定されている他のα−アミラーゼ配列とをアラインさせることにより他の親α−アミラーゼにおいて同定され得ることを当業者は認識するであろう。
基質結合部位の一部である残基の例としては以下が挙げられる。
ａ）配列番号２におけるW140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476およびG477、
ｂ）配列番号５におけるW140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476およびG477、
ｃ）配列番号４におけるW140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476およびG477、
ｄ）配列番号13におけるW138、W157、W165、E167、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、K315、W342、R437、W467およびG475、
ｅ）配列番号14におけるW136、W155、W163、E165、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、R315、W342、R437、W467およびG475、
ｆ）配列番号15におけるW139、W158、W166、E168、W187、E192、F260、F287、G302、G303、W345、W437、W467、G474およびG475。
本発明の変異体はまた、上記ａ）〜ｈ）に記載されている残基などの基質結合部位の一部である残基に近接した位置に１つまたは複数のかさ高いアミノ酸残基を導入する１つまたは複数の修飾を含む変異体を含む。これに関して、かさ高いアミノ酸残基は、Tyr、Trp、Phe、HisおよびIleなどの、TyrおよびTrpが好ましい大型の側鎖を有するアミノ酸から選択されることが可能である。基質結合部位の一部である残基に近接してとは、修飾される残基が基質結合部位の一部である残基から10Å未満に位置し、好ましくはこのような残基から６Å未満、および、最も好ましくは３Å未満に位置することを意味することが意図されている。入手可能である構造情報に基づいてこのような残基を同定することは当業者により実施可能な範囲内である。
他の好ましい変異体は、配列番号２に対して少なくとも80％配列同一性、好ましくは少なくとも85％配列同一性、より好ましくは少なくとも87％配列同一性、より好ましくは少なくとも90％配列同一性、より好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％同一性、より好ましくは少なくとも99％配列同一性であるが、100％未満の配列同一性を有すると共に、以下の置換を含む変異体を含む。
H183*+G184*+W140F；
H183*+G184*+Q169N；
H183*+G184*+Q169A；
H183*+G184*+W189Y+E190P；
H183*+G184*+N260D；
H183*+G184*+G477E；
H183*+G184*+G477Q；
H183*+G184*+G477K；
H183*+G184*+W189E+E190P；
H183*+G184*+A51I+W140Y；
H183*+G184*+W140Y+W189E；
H183*+G184*+W140Y+N260P；
H183*+G184*+W140Y+W284D；
H183*+G184*+W140Y+G476R；
H183*+G184*+W140Y+G477E；
H183*+G184*+W189E+W439R；
H183*+G184*+W284D+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+W439R+G477E；
H183*+G184*+E194D；
H183*+G184*+W439R+D467K；
H183*+G184*+R320M+W439R；
H183*+G184*+W439R+K485R；
H183*+G184*+Y160S；
H183*+G184*+W189F+E190P；
H183*+G184*+F262A；
H183*+G184*+Y363H；
H183*+G184*+G476E；
H183*+G184*+N260P+W439R；
H183*+G184*+N260P+G477E；
H183*+G184*+W439R+G476R；
H183*+G184*+K72S+W140Y；
H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G；
H183*+G184*+E194S；
H183*+G184*+E345D+G477R；
H183*+G184*+K302N+W439R；
H183*+G184*+R320K+W439R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G477E；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E；
H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R；
H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K；
H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q；
H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q；
H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y；
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q；
H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q。
他の好ましい変異体は、上記の置換の１つを伴う配列番号２から構成される変異体を含む。
本発明の他の好ましい変異体は、配列番号13に対して、少なくとも80％配列同一性、好ましくは少なくとも85％配列同一性、より好ましくは少なくとも90％配列同一性、より好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％同一性を有すると共に、配列番号13におけるK315および／またはW467、好ましくはK315ANCQEGHILMFPSTWYVM、特に好ましくはK315Mおよび／またはW467AFに対応する位置において置換を含む変異体である。好ましい実施形態において、位置K315における置換は、好ましくはG48A、T51IL、G107A、H156Y；A181T、N190F、I201F、A209VおよびQ264Sから選択されるさらなる置換と組み合わされる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法を用いて選択されるα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、以下を特徴とする変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
ｉ）配列番号１〜12の１つに対して、少なくとも80％配列同一性、好ましくは少なくとも85％配列同一性、より好ましくは少なくとも90％配列同一性、より好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％同一性を有し、
ii）90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性など、親α−アミラーゼの95％未満の結合性である固体基質もしくは固定化基質に対する結合性を有する。
さらなる実施形態において、本発明は、以下を特徴とする変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
ｉ）これらの１つに対して少なくとも80％配列同一性であって、配列番号１〜１２の１つに対して好ましくは少なくとも85％配列同一性、より好ましくは少なくとも90％配列同一性、より好ましくは少なくとも95％配列同一性、より好ましくは少なくとも97％配列同一性、より好ましくは少なくとも98％同一性を有し
ii）90％未満の結合性；好ましくは80％未満の結合性、好ましくは70％未満の結合性、好ましくは60％未満の結合性、好ましくは50％未満の結合性、好ましくは40％未満の結合性、好ましくは30％未満の結合性、より好ましくは20％未満の結合性および最も好ましくは10％未満の結合性など、配列番号８を有するα−アミラーゼの95％未満の結合性である固体基質もしくは固定化基質に対する結合性を有する。
本発明はまた、α−アミラーゼの米デンプンに対する結合（ding）が配列番号８を有するα−アミラーゼの米デンプンに対する結合性よりも低く、好ましくは80％未満、より好ましくは70％未満、より好ましくは60％未満、より好ましくは50％未満、より好ましくは40％未満、より好ましくは30％未満、より好ましくは20％未満および最も好ましくは10％未満であるα−アミラーゼを含む洗剤組成物に関する。
α−アミラーゼの固体基質に対する結合性の判定
本発明の目的に関して、α−アミラーゼの固体基質もしくは固定化基質に対する結合性は、原理上は、技術分野において公知である基質に対する結合性を判定する方法のいずれかを用いて判定することが可能である。普通、このような方法は、α−アミラーゼを固体基質もしくは固定化基質と接触させ、基質に結合したα−アミラーゼの画分を判定するステップを含む。
固体基質もしくは固定化基質は、テスト条件下で実質的に不溶性であるα−アミラーゼに対するいずれかの基質であり得る。固体基質は、コムギデンプン、トウモロコシデンプンまたは米デンプンなどのデンプンであり得、ここで、米デンプンが好ましい。あるいは、この判定は、固体マトリックスに固定化されたα−アミラーゼに係る可溶性または不溶性基質のいずれかを含む固定化基質を用いて行われ得る。本発明によれば、その基質に対するα−アミラーゼの結合性は、20℃で、デンプンの存在下に、ｐＨ８で計測した結合したアミラーゼの画分として判定される。その基質に対するα−アミラーゼの結合性は、α−アミラーゼの水溶液をデンプンと共にインキュベートし、結合したアミラーゼの画分を以下に開示する方法を用いて判定することにより判定可能である。
従来の変異体の決定
本発明の目的のために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14または配列番号15において開示されている成熟型ポリペプチドが、他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基を判定するために用いられる。他のα−アミラーゼのアミノ酸配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14または配列番号15において開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号２に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン3.0.0以降のEMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277）において実装されているNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453）を用いて、判定される。
他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、「ClustalW」（Larkin et al.,2007,Bioinformatics 23:2947-2948）を用いて複数のポリペプチド配列のアラインメントによって確認可能である。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14または配列番号15の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、PSI-BLASTプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Atschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。GenTHREADER（Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin and Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（PSI-BLAST、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903-919による方法が、未知の構造の配列とSCOPデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のSCOPスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Holm and Sander,1998,Proteins 33:88-96）または組み合わせ拡張法（Shindyalov and Bourne,1998,Protein Engineering 11:739-747）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566-567）。
本発明のα−アミラーゼ変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているIUPACの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換．アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置226でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Thr226Ala」または「T226A」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Gly205Arg+Ser411Phe」または「G205R＋S411F」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置205および411での置換が表されている。
欠失．アミノ酸欠失に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置*。従って、位置195でのグリシンの欠失は「Gly195*」または「G195*」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Gly195*+Ser411*」または「G195*+S411*」とされる。
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」または「G195GK」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」または「G195GKA」と示される。
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
Figure 2020141694
複数の改変．複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」または「R170Y+G195E」は、それぞれ、アルギニンおよびグリシンに対する位置170および195でのチロシンおよびグルタミン酸の置換を表す。
異なる置換．１つの位置で異なる置換を導入可能である場合、異なる置換はコンマによって分けられ、例えば、「Arg170Tyr，Glu」は、アルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による位置170での置換を表す。それ故、「Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala」は以下の変異体を示す。
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」、および「Tyr167Ala+Arg170Aｌａ」。
親α−アミラーゼ
親α−アミラーゼはまた、配列番号１の成熟型ポリペプチドSP722に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
一態様において、この親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号１の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号１の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成されることが好ましい。
他の実施形態において、親は配列番号１の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、Tsukamoto et al.1988,Biochem.Biophys.Res Comm.151,25-31に開示されている配列番号２の成熟型ポリペプチドSP707に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号２の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号２の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号２の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号３の成熟型ポリペプチドAA560に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号３の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号３の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、国際公開第9526397号パンフレットに開示されている配列番号４の成熟型ポリペプチドSP690に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号４の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号４の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号４の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、欧州特許第670367号明細書に開示されている配列番号５の成熟型ポリペプチドKSM-AP1378に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号５の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号５の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号５の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号６の成熟型ポリペプチド、ｓｐ７−７に対して少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号６の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号６の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号６の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号７の成熟型ポリペプチド、SP722+T183*+G184*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号７の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号７の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号７の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号８の成熟型ポリペプチド、SP707+G182*+H183*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号８の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号８の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号８の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号９の成熟型ポリペプチド、AA560+T183*+G184*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号９の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99%または100％といった少なくとも８０％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号９の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号９の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号10の成熟型ポリペプチドSP690+T183*+G184*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号10の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号10の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号10のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号10の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号10の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号１１の成熟型ポリペプチド、KSM-AP1378+D183*+G184*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号11の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号11の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号11のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号11の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号11の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号12の成熟型ポリペプチド、SP-7-7+G182*+H183*に対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号12の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号12の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号12のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号12の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号12の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来の配列番号13の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号13の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号13の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号13のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号13の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号13の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefacienｓ）由来の配列番号14の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号14の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号14の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号14のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号14の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号14の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（ゲオバチルス・ステアロテルモイルス（Geobacillus stearothermophilus））由来の配列番号15の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも80％配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
他の態様において、親は、α−アミラーゼ活性を有する配列番号15の成熟型ポリペプチドに対して、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％といった少なくとも80％の配列同一性を有する。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号15の成熟型ポリペプチドとは、例えば、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸および１個のアミノ酸といった10個以下のアミノ酸が異なっている。
親は、配列番号15のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成されることが好ましい。他の態様において、親は、配列番号15の成熟型ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
他の実施形態において、親は、配列番号15の成熟型ポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15のアミノ酸配列またはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から親をコードするDNAを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング法の後に、対象の属もしくは種のゲノムもしくはcDNAとのハイブリダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも25、少なくとも35または少なくとも70ヌクレオチドといった少なくとも14ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも700ヌクレオチド、少なくとも800ヌクレオチドまたは少なくとも900ヌクレオチドの長さといった、少なくとも100ヌクレオチドの長さである。DNAおよびRNAプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の生体から調製したゲノムDNAもしくはcDNAライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするDNAについてスクリーニングされ得る。このような他の生体由来のゲノムまたは他のDNAは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのDNAまたは分離されたDNAが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得、これがサザンブロッティングにおいて用いられる。
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、低度〜きわめて高度の緊縮条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15またはそのサブ配列をコードするポリヌクレオチドに対応する標識化ヌクレオチドプローブにポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは技術分野において公知であるいずれかの他の検出手段を用いて検出可能である。
一態様において、核酸プローブは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15またはその断片のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
長さが少なくとも100ヌクレオチドの長鎖プローブに関して、きわめて低度〜きわめて高度の緊縮条件は、最適には12〜24時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、42℃での、５×SSPE、0.3％SDS、200マイクログラム／ml断片処理および変性済みのサケ精子DNA、ならびに、きわめて低度および低度の緊縮性に対しては25％ホルムアミド、中度および中度−高度の緊縮性に対しては35％ホルムアミド、または、高度およびきわめて高度の緊縮性に対しては50％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、２×SSC、0.2％SDS、45℃（きわめて低度の緊縮性）、50℃（低度の緊縮性）、55℃（中度の緊縮性）、60℃（中度−高度の緊縮性）、65℃（高度の緊縮性）または70℃（きわめて高度の緊縮性）で、１５分間、３回洗浄される。
長さが約15ヌクレオチド〜約70ヌクレオチドの短い短鎖プローブに関して、緊縮条件は、最適には12〜24時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、Bolton and McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390）に従う計算を用いて算出したＴmよりも約５℃〜約10℃低い温度で、0.9M NaCl、0.09Mトリス−HCl pH7.6、６mMEDTA、0.5％NP-40、１×デンハート溶液、１mMピロリン酸ナトリウム、１mMナトリウム一塩基性リン酸、0.1mM ATPおよび0.2mgのイースト菌RNA／mlでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。キャリア材料は、最終的には、６Ｘ SCC中で１度、また、0.1％SDS中で15分間、および、算出したＴmより５℃〜10℃低い温度で６×SSCを用いて15分間ずつ２回洗浄される。
親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
親は細菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、もしくはストレプトマイセス属（Streptomyces）α−アミラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Campylobacter）、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ネイッセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）またはウレアプラズマ属（Ureaplasma）α−アミラーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
一態様において、親は、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウツス（Bacillus lautus）、バチルス・レンツス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、古草菌（Bacillus subtilis）またはバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）またはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus Zooepidemicu equi subsps）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）またはストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）α−アミラーゼである。
親は、真菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、カンジダ属（Candida）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）またはヤロウイア属（Yarrowia）α−アミラーゼなどのイースト菌α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、アクレモニウム属（Acremonium）、アガリクス属（Agaricus）、アルテルナリア属（Alternaria）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ボトリオスペリア属（Botryospaeria）、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、ケトミジウム属（Chaetomidium）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、クラビセプス属（Claviceps）、コクリオボルス属（Cochliobolus）、コプリノプシス属（Coprinopsis）、コプトテルメス属（Coptotermes）、コリナスクス属（Corynascus）、クリホネクトリア属（Cryphonectria）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ジプロディア属（Diplodia）、エクシディア属（Exidia）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、ギベレラ属（Gibberella）、ホロマスチゴトイデス属（Holomastigotoides）、フミコラ属（Humicola）、イルペクス属（Irpex）、レンチヌラ属（Lentinula）、レプトスパエリア属（Leptospaeria）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、メラノカルプス属（Melanocarpus）、メリピルス属（Meripilus）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、パエシロマイセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、ピロマイセス属（Piromyces）、ポイトラシア属（Poitrasia）、シュードプレクタニア属（Pseudoplectania）、シュードトリコニムファ属（Pseudotrichonympha）、リゾムコール属（Rhizomucor）、シゾフィルム属（Schizophyllum）、シタリジウム属（Scytalidium）、タラロマイセス属（Talaromyces）、テルモアスクス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トリコデルマ属（Trichoderma）、トリコファエア属（Trichophaea）、ベルチシリウム属（Verticillium）、ボルバリエラ属（Volvariella）またはキシラリア属（Xylaria）α−アミラーゼなどの糸状真菌性α−アミラーゼであり得る。
他の態様において、親は、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）またはサッカロマイセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、アクレモニウム・セルロリチクス（Acremonium cellulolyticus）、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウムメルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウム・パンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、フザリウム・バクテリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis)、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクランツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウムス・ポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコラ・グリセア（Humicola grisea）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、イルペクス・ラクテウス（Irpex lacteus）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、チエラビア・アクロマチカ（Thielavia achromatica）、チエラビアアルボミセス（Thielavia albomyces）、チエラビア・アルボピロサ（Thielavia albopilosa）、チエラビア・アウストラレインシス（Thielavia australeinsis）、チエラビア・フィメティ（Thielavia fimeti）、チエラビア・ミクロスポラ（Thielavia microspora）、チエラビア・オビスポラ（Thielavia ovispora）、チエラビア・ペルビアナ（Thielavia peruviana）、チエラビア・セトサ（Thielavia setosa）、チエラビア・スペデドニウム（Thielavia spededonium）、チエラビア・スブテルモフィラ（Thielavia subthermophila）、チエラビア・テルレストリス（Thielavia terrestris）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）α−アミラーゼである。
他の態様において、親は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14または配列番号15のα−アミラーゼといったバチルス属の一種（Bacillus sp.）α−アミラーゼである。
前述の種について、本発明は、知られている種の名称に関わらず、完全および不完全世代、ならびに、例えば無性世代といった他の分類学上の均等物の両方を含むことが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ATCC：American Type Culture Collection）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（DSM：Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、オランダ微生物株保存センター（CBS：Centraalbureau Voor Schimmelcultures）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Agricultural Research Service Patent Culture Collection）、北方リサーチセンター（NRRL：Northern Regional Research Center）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたDNAサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびDNAを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合DNAサンプルのゲノムもしくはcDNAライブラリを同じようにスクリーニングすることによりもたらされ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のSambrook et al.,1989を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
親は、一のポリペプチドの一部分が、他のポリペプチドの一部分のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
親はまた、１個のポリペプチドが他のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Cooper et al.,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson et al.,1994,Science 266:776-779）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Martin et al.,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina et al.,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson et al.,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward et al.,1995,Biotechnology 13:498-503；および、Contreras et al.,1991,Biotechnology 9:378-381；Eaton et al.,1986,Biochemistry 25:505-512;Collins-Racie et al.,1995,Biotechnology 13:982-987；Carter et al.,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；および、Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35-48に開示されている部位が挙げられる。
変異体の調製
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（いくつか）の突然変異を形成する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Scherer and Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；および、Barton et al.,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第2004/0171154号明細書；Storici et al.,2001,Nature Biotechnol.19:773-776；Kren et al.,1998,Nat.Med.4:285-290；および、Calissano and Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16を参照のこと。
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Tian et al.(2004,Nature 432:1050-1054)により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Reidhaar-Olson and Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；国際公開第95/17413号パンフレット；または、国際公開第95/22625号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンPCR、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832-10837；米国特許第5,223,409号明細書；国際公開第92/06204号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al.,1986,Gene 46:145;Ner et al.,1988,DNA 7:127）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ness et al.,1999,Nature Biotechnology 17:893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、PCR技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンPCRまたは非エラープローンPCR増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
変異体
親における必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Cunningham and Wells,1989,Science 244:1081-1085）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにα−アミラーゼ活性についてテストされる。また、Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708を参照のこと。α−アミラーゼの活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、de Vos et al.,1992,Science 255:306-312；Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver et al.,1992,FEBS Lett.309:59-64を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、親に関連するポリペプチドによるよるアイデンティティの分析から推測されることも可能である。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドに関連する。
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えDNA法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であり得る。プロモータ配列は、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）ペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（amyM）、古草菌（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、古草菌（Bacillus subtilis）xylAおよびxylB遺伝子、大腸菌（E.coli）lacオペロン、ストレプトマイセ・スコエリコロル（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Villa-Kamaroff et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727-3731）、ならびに、tacプロモータ（DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Useful proteins from recombinant bacteria」,Gilbert et al.,1980,Scientific American 242:74-94；および、前述のSambrook et al.,1989に記載されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第96/00787号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第00/56900号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum Daria）（国際公開第00/56900号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum Quinn）（国際公開第00/56900号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）β−キシロシダーゼ、ならびに、NA2-tpiプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギリ属（Aspergilli）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギリ属（Aspergilli）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）におけるトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）における中性α−アミラーゼをコードする遺伝子を含む修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（GAL1）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ADH1、ADH2／GAP）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（CUP1）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Romanos et al.,1992,Yeast 8:423-488により記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる好適な転写ターミネータ配列であり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼおよびフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）チトクロムＣ（CYC1）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のRomanos et al.,1992に記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域である好適なリーダー配列であり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダー配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO-1）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ADH2／GAP）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、変異体をコードする配列の３’−末端に作動可能にリンクする配列であるポリアデニル化配列であり得、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。宿主細胞において機能するいずれかのポリアデニル化配列が用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼおよびフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード領域のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード領域を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード領域が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード領域は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード領域を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード領域がもちいられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Bacillus）NCIB11837マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）サブチリシン、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）中性プロテアーゼ（nprT、nprS、nprM）および古草菌（Bacillus subtilis）prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137に記載されている。
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼおよびリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子およびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のRomanos et al.,1992により記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード領域は、古草菌（Bacillus subtilis）アルカリ性タンパク分解酵素（aprE）、古草菌（Bacillus subtilis）中性タンパク分解酵素（nprT）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第95/33836号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）α−因子の遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が変異体のＮ−末端に存在する場合、プロペプチド領域は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のＮ−末端に隣接して位置されている。
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、lac、tac、およびtrpオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ADH2系またはGAL1系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigeｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）TAKAα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数（いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組換え発現ベクターは、組換えDNA法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数（いくつか）の選択マーカーを含有することが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）もしくは古草菌（Bacillus subtilis）由来のdal遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3である。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hph（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびtrpC（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）のamdSおよびpyrG遺伝子、ならびに、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）のｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Aspergillus）細胞における使用に好ましい。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のヌクレオチド配列を含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の同一性を有する、100〜10,000塩基対、400〜10,000塩基対および800〜10,000塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングヌクレオチド配列であり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（E.coli）における複製を許容するプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177およびpACYC184の複製起点、ならびに、バチルス属（Bacillus）における複製を許容するpUB110、pE194、pTA1060およびpAMβ1の複製起点である。
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、および、ARS4とCEN6との組み合わせである。
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、AMA1およびANS1（Gems et al.,1991,Gene 98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；国際公開第00/24883号パンフレット）である。AMA1遺伝子の単離およびAMA1遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第00/24883号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
実質的に純粋な変異体を得るために、上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のSambrook et al.,1989を参照のこと）。
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体の生成をもたらす１つまたは複数（いくつか）の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オセアノバチルス属（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）およびストレプトマイセス属（Streptomyces）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Campylobacter）、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、イリオバクター属（Ilyobacter）、ネイッセリア属（Neisseria）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）およびウレアプラズマ属（Ureaplasma）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バシラス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウツス（Bacillus lautus）、バチルス・レンツス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルスプミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、古草菌（Bacillus subtilis）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞を含むいずれかのバチルス属（Bacillus）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Streptococcus）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓtreptococcus）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividanｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Streptomyces）細胞であり得る。
バチルス属（Bacillus）細胞へのDNAの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Chang and Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115を参照のこと）、コンピテント細胞を用いることにより（例えば、Young and Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829、またはDubnau and Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Shigekawa and Dower,1988,Biotechniques 6:742-751を参照のこと）、または、接合により（例えば、Koehler and Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5271-5278を参照のこと）行われ得る。大腸菌（E.coli）細胞へのDNAの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換により（例えば、Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Dower et al.,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Streptomyces）細胞へのDNAの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換および電気穿孔法により（例えば、Gong et al.,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405を参照のこと）、接合により（例えば、Mazodier et al.,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Burke et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Pseudomonas）細胞へのDNAの導入は、例えば、電気穿孔法により（例えば、Choi et al.,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397を参照のこと）、または、接合により（例えば、Pinedo and Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Streptococcus）細胞へのDNAの導入は、例えば、天然コンピテンスにより（例えば、Perry and Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297を参照のこと）、プロトプラスト形質転換により（例えば、Catt and Jollick,1991,Microbios 68:189-2070を参照のこと）、電気穿孔法により（例えば、Buckley et al.,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804を参照のこと）、または、接合により（例えば、Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436を参照のこと）行われ得る。しかしながら、DNAを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）および接合菌門（Zygomycota）、ならびに、卵菌門（Oomycota）およびすべての栄養胞子形成真菌を含む（Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKに定義されているとおり）。
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Endomycetales））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Blastomycetes））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980）に記載されているとおりに定義されるものとする。
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロマイセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）またはヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞などのカンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）またはヤロウイア属（Yarrowia）細胞であり得る。
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Eumycota）および卵菌門（Oomycotａ）亜門（前述のHawksworth et al.,1995で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属（Aspergillus）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）、ブエルカンデラ属（Bjerkandera）、セリポリオプシス属（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コプリヌス属（Coprinus）、コリオルス属（Coriolus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、フィリバシジウム属（Filibasidium）、フザリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ムコール属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、ネオカリマスチクス属（Neocallimastix）、ニューロスポラ属（Neurospora）、パエシロマイセス属（Paecilomyces）、ペニシリウム属（Penicillium）、ファネロケーテ属（Phanerochaete）、フレビア属（Phlebia）、ピロマイセス属（Piromyces）、プレウロツス属（Pleurotus）、シゾフィルム属（Schizophyllum）、タラロマイセス属（Talaromyces）、テルモアスクス属（Thermoascus）、チエラビア属（Thielavia）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）、トラメテス属（Trametes）またはトリコデルマ属（Trichodermａ）細胞であり得る。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギル・スオリゼー（Aspergillus oryzae）、ヤケイロタケ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシスス・ブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、クリソスポリウム・イノプス（Chrysosporium inops）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Chrysosporium keratinophilum）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クリソスポリウム・メルダリウム（Chrysosporium merdarium）、クリソスポリウムパンニコラ（Chrysosporium pannicola）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Chrysosporium queenslandicum）、クリソスポリウム・トロピクム（Chrysosporium tropicum）、クリソスポリウム・ゾナツム（Chrysosporium zonatum）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、クリオルス・ヒルスツス（Coriolus hirsutus）、フザリウム・バクテリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクランツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpurogenum）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロツス・エリンギイ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テルレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Aspergillus）およびトリコデルマ属（Trichoderma）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第238023号明細書およびYelton et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474に記載されている。フザリウム属（Fusarium）種の形質転換に好適な方法は、Malardier et al.,1989,Gene 78:147-156および国際公開第96/00787号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.,editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito et al.,1983,J.Bacteriol.153:163；および、Hinnen et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920に記載の手法を用いて形質転換され得る。
生成方法
本発明はまた：（ａ）本発明の宿主細胞を変異体の発現に好適な条件下で培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体を生成する方法に関する。
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
変異体は、変異体に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
変異体は技術分野において公知である方法により回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS-PAGE、または、抽出（例えば、Protein Purification,J.-C.Janson and Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
組成物
本発明はまた、本発明の変異体を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、このような変異体が富化されている。「富化」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が、例えば1.1の富化因子で高められることを意味する。
組成物は、主な酵素成分として変異体を含み得る例えば単成分組成物である。または、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）といったアスペルギルス属（Aspergillus）；例えば、フザリウム・バクテリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フザリウム・クロークウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンディ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・レチクランツム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロセウム（Fusarium toruloseum）、フザリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）もしくはフザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）といったフザリウム属（Fusarium）；フミコラ属（Humicola）、例えば、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）もしくはフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）；または、例えば、トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）といったトリコデルマ属（Trichoderma）に属する微生物によって例えば生成され得る。
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。変異体は、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
洗剤組成物
一実施形態において、本発明は、本発明の酵素を１種または複数種の追加のクリーニング組成成分と共に含む洗剤組成物に関する。
追加の成分の選択は、当業者の技能の範囲内であり、以下に記載される例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分が含まれる。成分の選択には、布地の取り扱いに関して、クリーニングされる布地の種類、汚染物の種類および／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合物の検討が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、これは限定として解釈されるべきではなく、当業者に認識されるであろうとおり追加の官能基が成分中に含まれていてもよい。
本発明の酵素
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、洗浄液１リットル当たり、0.01〜100mgのタンパク質、好ましくは0.005〜50mgのタンパク質、より好ましくは0.01〜25mgのタンパク質、さらにより好ましくは0.05〜10mgのタンパク質、最も好ましくは0.05〜５mgのタンパク質、および、さらに最も好ましくは0.01〜１mgのタンパク質などの0.001〜100mgのタンパク質に対応する量で洗剤組成物に添加され得る。
本発明の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖質もしくは糖質アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくは、例えば芳香族ホウ酸エステルといったホウ酸誘導体、または、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体といった従来の安定化剤を用いて安定化され得、および、組成物は、例えば、国際公開第92/19709号パンフレットおよび国際公開第92/19708号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。
本発明のポリペプチドはまた、参照により本明細書に援用される国際公開第97/07202号パンフレットに開示の洗剤配合物に組み込まれてもよい。
界面活性剤
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／またはノニオン性および／または半極性および／または両イオン性またはこれらの混合物であり得る１種または複数種の界面活性剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種または複数種のノニオン性界面活性剤および１種または複数種のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約１％〜約４０％または約３％〜約２０％または約３％〜約10％などの約0.1％〜60重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含む。ランドリー洗剤に用いられ得る技術分野において公知であるいずれかの界面活性剤が利用され得る。
含まれる場合、洗剤は、通常は、約５％〜約15％または約20％〜約25％を含む約５％〜約30％などの約１％〜約40重量％のアニオン性界面活性剤を含有するであろう。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩およびスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、LASの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（BABS）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（AOS）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−2,3−ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などのアルキルスルフェート（AS）、脂肪族アルコールスルフェート（FAS）、第１級アルコールスルフェート（PAS）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても公知であるAESまたはAEOSまたはFES）、第２級アルカンスルホネート（SAS）、パラフィンスルホネート（PS）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α-SFMeまたはSES）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸またはセッケンのジエステルおよびモノエステル、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約40重量％のカチオン性界面活性剤を含むであろう。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ADMEAQ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ジメチルジステアリル塩化アンモニウム（DSDMAC）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ならびに、これらの組み合わせ、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルコキシル化第４級アンモニウム（AQA）が挙げられる。
含まれる場合、洗剤は、通常、約３％〜約５％または約８％〜約12％などの、例えば約0.5％〜約30％、特に約１％〜約20％、約３％〜約10％といった約0.2％〜約40重量％のノニオン性界面活性剤を含有するであろう。ノニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（AEまたはAEO)、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（PFA）、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステルなどのアルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（APE）、ノニルフェノールエトキシレート（NPE）、アルキルポリグリコシド（APG）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（FAM）、脂肪酸ジエタノールアミド（FADA）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（EFAM）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（PFAM）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルコサミドGAまたは脂肪酸グルカミドFAGA）、ならびに、商品名SPANおよびTWEENで入手可能な生成物、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約40重量％の半極性界面活性剤を含有するであろう。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−N,N−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（AO）、脂肪酸アルカノールアミドおよびエトキシル化脂肪酸アルカノールアミド、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
含まれる場合、洗剤は、通常、約０％〜約40重量％の両性イオン性界面活性剤を含有するであろう。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ベタイン、アルキルジメチルベタインおよびスルホベタイン、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
ヒドロトロープ
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Hodgdon and Kaler(2007),Current Opinion in Colloid & Interface Science 12:121-128による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
洗剤は、約0.5〜約５％または約３％〜約５％などの０〜５重量％のヒドロトロープを含有し得る。ランドリー洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（STS）、キシレンスルホン酸ナトリウム（SXS）、クメンスルホン酸ナトリウム（SCS）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフタレンナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
ビルダーおよびコビルダー
洗剤組成物は、約10％〜約40％などの約０〜65重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含有し得る。皿洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には40〜65％、特に50〜65％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、CaおよびMgと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリーまたは皿洗浄洗剤または産業上もしくは組織的な（？）クリーニングに用いられ得る洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのビルダーおよび／またはコビルダーが利用され得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（STPまたはSTPP）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Hoechst製SKS-6）、２−アミノエタン−１−オール（MEA）、イミノジエタノール（DEA）および2,2’2”−ニトリロトリエタノール（TEA）などのエタノールアミン、および、カルボキシメチルイヌリン（CMI）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
洗剤組成物はまた、約10％〜約40％などの０〜50重量％の洗剤コビルダーまたはこれらの混合物を含有し得る。洗剤組成物は、コビルダーを単独で含んでいても、または、例えばゼオライトビルダーといったビルダーと組み合わせて含んでいてもよい。コビルダーの非限定的な例としては、ポリ（アクリル酸）（PAA）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（PAA／PMA）などのポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマーが挙げられる。さらに非限定的な例としては、クエン酸塩、アミノカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩およびホスホン酸塩などのキレート剤、ならびに、アルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の特定の例としては、2,2’,2”−ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、イミノジコハク酸（IDS）、エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸（EDDS）、メチルグリシン二酢酸（MGDA）、グルタミン酸−N,N−二酢酸（GLDA）、１−ヒドロキシエタン−1,1−ジイルビス（ホスホン酸）（HEDP）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン）テトラキス（ホスホン酸）（EDTMPA）、ジエチレントリアミンエペンタキス（メチレン）ペンタキス（ホスホン酸）（DTPMPA）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（EDG）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ASMA）、アスパラギン酸−N,N−二酢酸（ASDA）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ASMP）、イミノジコハク酸（IDA）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（SMAS）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（SEAS）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（SMGL）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（SEGL）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（MIDA）、α−アラニン−N,N−二酢酸（α−ALDA）、セリン−N,N−二酢酸（SEDA）、イソセリン−N,N−二酢酸（ISDA）、フェニルアラニン−N,N−二酢酸（PHDA）、アントラニル酸−N,N−二酢酸（ANDA）、スルファニル酸−N,N−二酢酸（SLDA）、タウリン−N,N−二酢酸（TUDA）およびスルホメチル−N,N−二酢酸（SMDA）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチリデンジアミン三酢酸（HEDTA）、ジエタノールグリシン（DEG）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ATMP）、ならびに、これらの組み合わせおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／またはコビルダーは、例えば、国際公開第09/102854号パンフレット、米国特許第5977053号明細書に開示されている。
ホスホン酸塩などの湯垢抑制剤。
漂白系
洗剤は、約０％〜約10％などの０〜２０重量の漂白系を含有し得る。ランドリー＋皿洗浄＋Ｉ＆Ｉ洗剤において用いられるいずれかの技術分野において公知である漂白系が利用され得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白、漂白活性化剤、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウムなどの過酸化水素の供給源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。本明細書において漂白活性化剤とは、ペルオキシド漂白剤様過酸化水素と反応して、過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含み、好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ナトリウム3,5,5トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、ジペルオキシドデカン酸、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（LOBS）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼンスルホネート、４−（デカノイルオキシ）安息香酸塩（DOBS）、４−（3,5,5−トリメチルヘキサノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（ISONOBS）、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）および４−（ノナノイルオキシ）ベンゼンスルホネート（NOBS）、および／または、国際公開第98/17767号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ATC）が特に好ましいファミリーである。ATCまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、最終的にはクエン酸およびアルコールに分解されるために、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルシトレートおよびトリアセチンは、保管に際して生成物中における良好な加水分解安定性を有しており、これは効果的な漂白活性化剤である。最後に、ATCは、ランドリー添加剤に対して良好な補助能を提供する。または、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタロイルアミノ）過カプロン酸（PAP）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
Figure 2020141694
 （iii）およびこれらの混合物（式中、各Ｒ1は、独立して、９〜24個の炭素を含有する分岐アルキル基または11〜24個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ1は、独立して、９〜18個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ1は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソ−ノニル、イソ−デシル、イソ−トリデシルおよびイソ−ペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第2007/087258号パンフレット、国際公開第2007/087244号パンフレット、国際公開第2007/087259号パンフレット、国際公開第2007/087242号パンフレットに記載されている。好適な光漂白は、例えばスルホン化アエンフタロシアニンであり得る。
ポリマー
洗剤は、０．５〜５％、２〜５％、0.5〜２％または0.2〜１％などの０〜10重量％のポリマーを含有し得る。ランドリー、皿洗浄およびＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのポリマーが利用され得る。ポリマーは、上記のコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止および／もしくは油脂クリーニング特性を提供し得る。例示的な再汚染防止剤ポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（CMC）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（PEG）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、ならびに、PAA、PAA／PMAおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなどのポリカルボキシレートが挙げられる。例示的な繊維保護ポリマーとしては、疎水性修飾CMC（HM-CMC）およびシリコーンが挙げられる。例示的な汚染物遊離ポリマーとしては、テレフタル酸およびオリゴマー系グリコールのコポリマーが挙げられる。例示的な移染防止ポリマーとしては、PVP、ポリ（ビニルイミダゾール）（PVI）およびポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（PVPOまたはPVPNO）が挙げられる。他の例示的なポリマーは、例えば、国際公開第2006/130575号パンフレットに開示されている。
布地色調剤
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第2005/03274号パンフレット、国際公開第2005/03275号パンフレット、国際公開第2005/03276号パンフレットおよび欧州特許第1876226号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Direct Blue、Direct Red、Direct Violet、Acid Blue、Acid Red、Acid Violet、Basic Blue、Basic VioletおよびBasic Red、または、これらの混合物の染料索引（C.I.）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約0.00003重量％〜約0.2重量％、約0.00008重量％〜約0.05重量％またはさらには約0.0001重量％〜約0.04重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、0.0001重量％〜0.2重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば、国際公開第2007/087257号パンフレット、国際公開第2007/087243号パンフレットに開示されている。
（追加の）酵素
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、例えばラッカーゼおよび／またはペルオキシダーゼといった、タンパク分解酵素、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼなどの１種または複数種［追加］の酵素を含み得る。
普通、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、至適pH、他の酵素的および非酵素的処方成分等との親和性）、酵素は有効量で存在しているべきである。
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第4,435,307号明細書、米国特許第5,648,263号明細書、米国特許第5,691,178号明細書、米国特許第5,776,757号明細書および国際公開第89/09259号パンフレットに開示されている、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）およびフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）から生成された真菌セルラーゼといった、バチルス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、フミコラ属（Humicola）、フザリウム属（Fusarium）、チエラビア属（Thielavia）、アクレモニウム属（Acremonium）由来のセルラーゼが挙げられる。
特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第0 495 257、欧州特許第0 531 372号明細書、国際公開第96/11262号パンフレット、国際公開第96/29397号パンフレット、国際公開第98/08940号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第94/07998号パンフレット、欧州特許第0 531 315号明細書、米国特許第5,457,046号明細書、米国特許第5,686,593号明細書、米国特許第5,763,254号明細書、国際公開第95/24471号パンフレット、国際公開第98/12307号パンフレットおよび国際特許出願第PCT/DK98/00299号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
市販されているセルラーゼとしては、Celluzyme（商標）およびCarezyme（商標）（Novozymes A/S）、Clazinase（商標）およびPuradax HA（商標）（Genencor International Inc.）およびKAC-500（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物性由来のものを含む。微生物性由来のものが好ましい。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。タンパク分解酵素は、セリンタンパク分解酵素またはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物性タンパク分解酵素またはトリプシン−様タンパク分解酵素であり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシンであって、特にバチルス属（Bacillus）から誘導されたもの、例えば、サブチリシンNovo、サブチリシンCarlsberg、サブチリシン309、サブチリシン147およびサブチリシン168（国際公開第89/06279号パンフレットに記載）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、国際公開第89/06270号パンフレットおよび国際公開第94/25583号パンフレットに記載のトリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）およびフザリウム属（Fusarium）タンパク分解酵素である。
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第92/19729号パンフレット、国際公開第98/20115号パンフレット、国際公開第98/20116号パンフレットおよび国際公開第98/34946号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235および274。
好ましい市販されているタンパク分解酵素としては、Alcalase（商標）、Savinase（商標）、Primase（商標）、Duralase（商標）、Esperase（商標）およびKannase（商標）（Novozymes A/S）、Maxatase（商標）、Maxacal（商標）、Maxapeｍ（商標）、Properase（商標）、Purafect（商標）、Purafect OxP（商標）、FN2（商標）およびFN3（商標）（Genencor International Inc．）が挙げられる。
リパーゼ：好適なリパーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば、欧州特許第258 068号明細書および欧州特許第305 216号明細書に記載のＨ．ラヌギノサ（H.lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノスス（T.lanuginosus））または国際公開第96/13580号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（H.insolens）といったフミコラ属（Humicola）（同義語、テルモマイセス属（Thermomyces））由来のリパーゼ；例えば、Ｐ．アルカリ（P.alcali）遺伝子またはＰ．シュードアルカリ（P.pseudoalcali）遺伝子（欧州特許第218 272号明細書）、Ｐ．セパシア（P.cepacia）（欧州特許第331 376号明細書）、Ｐ．スツツェリ（P.stutzeri）（英国特許第1,372,034号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（P.fluorescens）、シュードモナス属の一種（Pseudomonas sp.）SD705株（国際公開第95/06720号パンフレットおよび国際公開第96/27002号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（P.wisconsinensis）（国際公開第96/12012号パンフレット）といったシュードモナス属（Pseudomonas）リパーゼ；例えば、枯草菌（B.subtilis）（Dartois et al.,1993,Biochemica et Biophysica Acta,1131:253-360）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭64/744992号公報）またはＢ．プミルス（B.pumilus）（国際公開第91/16422号パンフレット）といったバチルス属（Bacillus）リパーゼが挙げられる。
他の例は、国際公開第92/05249号パンフレット、国際公開第94/01541号パンフレット、欧州特許第407 225、欧州特許第260 105、国際公開第95/35381号パンフレット、国際公開第96/00292号パンフレット、国際公開第95/30744号パンフレット、国際公開第94/25578号パンフレット、国際公開第95/14783号パンフレット、国際公開第95/22615号パンフレット、国際公開第97/04079号パンフレットおよび国際公開第97/07202号パンフレットに記載のものなどのリパーゼ変異体である。
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、Lipolase（商標）、Lipolase Ultra（商標）およびLipex（商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またがβ）は、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第1,296,839号明細書により詳細に記載されているバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）の特別な系統といった、例えばバチルス属（Bacillus）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。
有用なアミラーゼの例は、国際公開第94/02597号パンフレット、国際公開第94/18314号パンフレット、国際公開第96/23873号パンフレットおよび国際公開第97/43424号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408および444。
市販されているアミラーゼは、Stainzyme（商標）、Stainzyme（商標）Plus，Natalase（商標）、Duramyl（商標）、Termamyl（商標）、Fungamyl（商標）およびBAN（商標）（Novozymes A/S）、Rapidase（商標）、Powerase（商標）およびPurastar（商標）（Genencor International Inc.製）である。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（C.cinereus）といったコプリヌス属（Coprinus）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第93/24618号パンフレット、国際公開第95/10602号パンフレットおよび国際公開第98/15257号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。
市販されているペルオキシダーゼとしては、Guardzyme（商標）（Novozymes A/S）が挙げられる。
洗剤酵素は、１種または複数種の酵素を含有する個別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤（すなわち、個別の添加剤または複合添加剤）は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第4,106,991号明細書および米国特許第4,661,452号明細書に開示のとおり生成され得、任意により、技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、1000〜20000の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含有し、および、15〜80個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第1483591号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖質または糖質アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第238,216号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
補助材
ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。他の任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤／分解剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、CMC、および／または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレイを含む布地コンディショナ、充填材／加工助剤、蛍光性白色化剤／光学増白剤、起泡増進剤、起泡（セッケンの泡）調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、セッケン泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。ランドリー、皿洗浄またはＩ＆Ｉ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの処方成分が利用され得る。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
分散剤−本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することが可能である。特に粉末洗剤が分散剤を含んでいてもよい。好適な水溶性有機材料としては、ホモ−またはコポリマー酸またはその塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71,Marcel Dekker,Inc.に記載されている。
移染防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、１種または複数種の移染防止剤を含み得る。好適な高分子移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約0.0001％〜約10％、約0.01％〜約５％、または、さらには約0.1％〜約３重量％のレベルで存在し得る。
蛍光性白色化剤−本発明の洗剤組成物はまた、好ましくは、蛍光性白色化剤または光学増白剤などのクリーニングされる物品の色合いを変え得る追加の成分を含有するであろう。存在する場合、増白剤は、約0,01％〜約0,5％のレベルであることが好ましい。ランドリー洗剤組成物における使用に好適ないずれかの蛍光性白色化剤が、本発明の組成物中に用いられ得る。最も一般的に用いられる蛍光性白色化剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体の分類に属するものである。ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体タイプの蛍光性白色化剤の例としては：4,4’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−2,2’−ジスルホネート；4,4’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−2.2’−ジスルホネート；4,4’−ビス−（２−アニリノ−４（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン-2,2’−ジスルホネート、4,4’−ビス−（４−フェニル−2,1,3−トリアゾール−２−イル）スチルベン−2,2’−ジスルホネート；4,4’−ビス−（２−アニリノ−４（１−メチル−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−2,2’−ジスルホネートおよび２−（スチビル−４”−ナフト-1.,2’:4,5）−1,2,3−トリアゾール−２”スルホネートのナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光性白色化剤は、Ciba-Geigy AG,Basel,Switzerlandから入手可能であるTinopal DMSおよびTinopal CBSである。Tinopal DMSは、4,4’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートのジナトリウム塩である。Tinopal CBSは、2,2’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートのジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光性白色化剤は、Paramount Minerals and Chemicals,Mumbai,India製の市販のParawhite KXである。本発明における使用に好適な他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。
好適な蛍光性増白剤レベルは、約0.01、0.05、約0.1、または、さらには約0.2重量％の下限レベルから、0.5またはさらには0.75重量％の上限レベルを含む。
汚染物遊離ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル系布地などの布地からの汚染物の除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚染物の除去を補助する１種または複数種の汚染物遊離ポリマーを含み得る。汚染物遊離ポリマーは、例えば、ノニオン性またはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであり得る（例えばChapter 7,Powdered Detergents,Surfactant science series volume 71,Marcel Dekker,Inc.を参照のこと）。他のタイプの汚染物遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第2009/087523号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第2007/138054号パンフレット、国際公開第2006/108856号パンフレットおよび国際公開第2006/113314号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）により詳細に記載されている。他の汚染物遊離ポリマーは、欧州特許第1867808号明細書または国際公開第2003/040279号パンフレット（共に本明細書において参照により援用されている）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造といった置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、ノニオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、および、これらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物が挙げられる。
再汚染防止剤−本発明の洗剤組成物としてはまた、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（PEG）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマー、ならびに、エトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種または複数種の再汚染防止剤が挙げられ得る。上記の汚染物遊離ポリマーに記載のセルロース系ポリマーは、再汚染防止剤としても機能し得る。
他の好適な補助材としては、これらに限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地軟化剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、セッケン泡抑制剤、溶剤、液体洗剤用構造化剤、および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
洗剤生成物の配合物
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、均質な錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の圧縮もしくは濃縮液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。
洗剤配合物形態：層（同一のまたは異なる相）、ポーチ、機械用量単位に対応した形態。
ポーチは、単一または複数のコンパートメントとして構成されることが可能である。例えば水との接触に先だってポーチから組成物が漏れ出るような組成物の漏れが防止される、組成物の保持に好適であれば如何なる形態、形状および材料のものであることも可能である。ポーチは、内部容積を有する水溶性フィルム製のものである。前記内部容積は、ポーチのコンパートメントに分離されていることが可能である。好ましいフィルムは、フィルムまたはシートに形成される好ましくはポリマーである高分子材料である。好ましいポリマー、コポリマーまたはその誘導体は、ポリアクリレート、および、水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）から選択される。好ましくは、フィルム中のポリマーのレベルは、例えばＰＶＡで少なくとも約60％である。好ましい平均分子量は、典型的には約20,000〜約150,000であろう。フィルムはまた、ポリアクチドおよびポリビニルアルコール（Chris Craft In.Prod.Of Gary,Ind.,USから市販されている商品名M8630で知られている）などの加水分解的に分解性および水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびこれらの混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物であることが可能である。ポーチは、水溶性フィルムにより分離された固体ランドリークリーニング組成物または部分成分および／または液体クリーニング組成物または部分成分を含んでいることが可能である。液体成分用のコンパートメントは、固形分を含有するコンパートメントとは組成が異なっていることが可能である。参照：（米国特許出願公開第2009/0011970 A1号明細書）
洗剤処方成分は、水溶性ポーチ中のコンパートメントにより、または、錠剤の異なる層中において相互に物理的に分離されていることが可能である。これにより、成分間の負の保管相互作用を防止することが可能である。コンパートメントの各々の異なる溶解プロファイルはまた、洗浄溶液中における選択された成分の溶解を遅延させることが可能である。
粒状洗剤配合物
粒状洗剤は、国際公開第09/092699号パンフレット、欧州特許第1705241号明細書、欧州特許第1382668号明細書、国際公開第07/001262号パンフレット、米国特許第6472364号明細書、国際公開第04/074419号パンフレットまたは国際公開第09/102854号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。他の有用な洗剤配合物が、国際公開第09/124162号パンフレット、国際公開第09/124163号パンフレット、国際公開第09/117340号パンフレット、国際公開第09/117341号パンフレット、国際公開第09/117342号パンフレット、国際公開第09/072069号パンフレット、国際公開第09/063355号パンフレット、国際公開第09/132870号パンフレット、国際公開第09/121757号パンフレット、国際公開第09/112296号パンフレット、国際公開第09/112298号パンフレット、国際公開第09/103822号パンフレット、国際公開第09/087033号パンフレット、国際公開第09/050026号パンフレット、国際公開第09/047125号パンフレット、国際公開第09/047126号パンフレット、国際公開第09/047127号パンフレット、国際公開第09/047128号パンフレット、国際公開第09/021784号パンフレット、国際公開第09/010375号パンフレット、国際公開第09/000605号パンフレット、国際公開第09/122125号パンフレット、国際公開第09/095645号パンフレット、国際公開第09/040544号パンフレット、国際公開第09/040545号パンフレット、国際公開第09/024780号パンフレット、国際公開第09/004295号パンフレット、国際公開第09/004294号パンフレット、国際公開第09/121725号パンフレット、国際公開第09/115391号パンフレット、国際公開第09/115392号パンフレット、国際公開第09/074398号パンフレット、国際公開第09/074403号パンフレット、国際公開第09/068501号パンフレット、国際公開第09/065770号パンフレット、国際公開第09/021813号パンフレット、国際公開第09/030632号パンフレット、および、国際公開第09/015951号パンフレット、国際公開第2011025615号パンフレット、国際公開第2011016958号パンフレット、国際公開第2011005803号パンフレット、国際公開第2011005623号パンフレット、国際公開第2011005730号パンフレット、国際公開第2011005844号パンフレット、国際公開第2011005904号パンフレット、国際公開第2011005630号パンフレット、国際公開第2011005830号パンフレット、国際公開第2011005912号パンフレット、国際公開第2011005905号パンフレット、国際公開第2011005910号パンフレット、国際公開第2011005813号パンフレット、国際公開第2010135238号パンフレット、国際公開第2010120863号パンフレット、国際公開第2010108002号パンフレット、国際公開第2010111365号パンフレット、国際公開第2010108000号パンフレット、国際公開第2010107635号パンフレット、国際公開第2010090915号パンフレット、国際公開第2010033976号パンフレット、国際公開第2010033746号パンフレット、国際公開第2010033747号パンフレット、国際公開第2010033897号パンフレット、国際公開第2010033979号パンフレット、国際公開第2010030540号パンフレット、国際公開第2010030541号パンフレット、国際公開第2010030539号パンフレット、国際公開第2010024467号パンフレット、国際公開第2010024469号パンフレット、国際公開第2010024470号パンフレット、国際公開第2010025161号パンフレット、国際公開第2010014395号パンフレット、国際公開第2010044905号パンフレット、国際公開第2010145887号パンフレット、国際公開第2010142503号パンフレット、国際公開第2010122051号パンフレット、国際公開第2010102861号パンフレット、国際公開第2010099997号パンフレット、国際公開第2010084039号パンフレット、国際公開第2010076292号パンフレット、国際公開第2010069742号パンフレット、国際公開第2010069718号パンフレット、国際公開第2010069957号パンフレット、国際公開第2010057784号パンフレット、国際公開第2010054986号パンフレット、国際公開第2010018043号パンフレット、国際公開第2010003783号パンフレット、国際公開第2010003792号パンフレット、国際公開第2011023716号パンフレット、国際公開第2010142539号パンフレット、国際公開第2010118959号パンフレット、国際公開第2010115813号パンフレット、国際公開第2010105942号パンフレット、国際公開第2010105961号パンフレット、国際公開第2010105962号パンフレット、国際公開第2010094356号パンフレット、国際公開第2010084203号パンフレット、国際公開第2010078979号パンフレット、国際公開第2010072456号パンフレット、国際公開第2010069905号パンフレット、国際公開第2010076165号パンフレット、国際公開第2010072603号パンフレット、国際公開第2010066486号パンフレット、国際公開第2010066631号パンフレット、国際公開第2010066632号パンフレット、国際公開第2010063689号パンフレット、国際公開第2010060821号パンフレット、国際公開第2010049187号パンフレット、国際公開第2010031607号パンフレット、国際公開第2010000636号パンフレットに記載されている。
使用
本発明はまた、その組成物の使用方法に関する。
ランドリー／生地／布地（家庭用ランドリーでの洗濯、産業用ランドリーでの洗濯）
硬質面クリーニング（ADW、洗車、産業用表面）
洗剤における使用．本発明のポリペプチドが添加され得、それ故、洗剤組成物の成分となる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適なランドリー添加剤組成物およびリンスが追加された布地軟化剤組成物を含む手動式もしくは機械式ランドリー洗剤組成物として配合され得、または、通所の家庭での硬質面クリーニング作業で使用される洗剤組成物として配合され得、または、手洗いもしくは機械洗いでの皿洗い作業用に配合され得る。
洗剤組成物はさらに、単位投与量形態またはセッケンバーもしくはランドリーバーの形態で配合され得る。
特定の態様において、本発明は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む洗剤添加剤を提供する。他の態様において、本発明は、３５℃以下の温度でのクリーニングに好適な洗剤を提供する。
方法
AMSAを用いたα−アミラーゼの洗浄性能
洗剤系組成物中のα−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を実施し得る。自動機械式応力アッセイ（AMSA）を用いて酵素をテストする。AMSAテストでは、大量の小容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験可能である。AMSAプレートは、テスト溶液用の多数のスロットと、洗浄される生地布きれをすべてのスロット開口部に対してしっかりと押し込む蓋とを有する。洗浄時間の間、プレート、テスト溶液、生地および蓋を激しく振盪してテスト溶液と生地とを接触させ、規則正しい周期的な振動で機械的応力を加える。さらなる説明については、国際公開第02/42740号パンフレット、特に第23〜24頁の段落「Special method embodiments」を参照のこと。
一般的な洗浄性能の説明
水（15°dH）、0.8ｇ／Ｌ洗剤（例えば以下に記載のモデル洗剤Ａ）または50mMのHCO3-および本発明の酵素（例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.8および／または1.2mg酵素タンパク質／Ｌの濃度）を含むテスト溶液を調製する。デンプン（例えば、Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120,3133 KT,Vlaardingen,The Netherlands製のCS-28）で汚れた布地を加え、実施例において特定されているとおり、20℃で30分間、または、15℃で20分間、または、15℃で45分間、または、15℃もしくは40℃で20分間洗浄する。水道からの流水で完全にすすぎ、暗中で乾燥させた後、洗浄性能の尺度として、汚れた布地の光強度または反射率値をその後に計測する。０mg酵素タンパク質／Ｌでのテストをブランクとして用いてΔレミッション値（ΔREM）を得た。または、洗浄性能は親α−アミラーゼのものと比較をし、ここでは、親α−アミラーゼの性能結果が100の値とされ、変異体の結果がこの値と比較される。洗浄ステップの最中においては、例えば布地と共に洗浄溶液を振盪、回転または攪拌するといった形態で機械的作用が適用されることが好ましい。
AMSA洗浄性能実験を以下に特定した実験条件下で実施した。
Figure 2020141694
Figure 2020141694
CaCl2、MgCl2およびNaHCO3（Ca2+：Mg2+：HCO3 -＝４：１：7.5）をテスト系に添加することにより水硬度を15°dHに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
Figure 2020141694
Figure 2020141694
12°dH水中でのおおよその洗浄pH（Ca：Mg：HCO3＝２：１：4.5）
CaCl2、MgCl2およびNaHCO3（Ca：Mg：HCO3＝２：１：4.5）をテスト系に添加することにより水硬度を12°dHに調節した。洗浄した後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄した生地の色の輝度として計測される。輝度はまた、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表されることが可能である。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能である。
色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Kodak iQsmart,Kodak）で行われる。
スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの24ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（RGB）の値に変換する。強度値（Int）は、RGB値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 2020141694
生地：
生地サンプルCS-28（綿上の米デンプン）は、Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120,3133 KT Vlaardingen,the Netherlandsから入手される。
ビーカを用いる洗浄性能テスト
このアッセイは縦型洗濯機の小規模モデルであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために用いられる。
250mLビーカ、および、各方向に180°で、80／分の周期で反復的な回転動作をもたらすパドル式攪拌機を用いるビーカ洗浄性能テストは、以下のステップを含む：50mMのNaHCO3および0.4mg／Ｌの酵素を含有する100mLの洗浄溶液（６℃、15°dH、pH8.0）を用意するステップ；CS-28（５ｘ５cm）の２枚の布きれとEMPA162（５ｘ５cm）の２枚の布きれとを洗浄溶液に加えて洗浄を開始するステップ；撹拌速度を80rpmに設定するステップ；60分後に撹拌を停止し、布きれを冷たい水道からの流水ですすぐステップ；すすいだ布きれを暗中に一晩乾燥させるステップ；ならびに、以下に記載のとおり、Color Eyeを用いて460nmでの入射光のレミッションを計測することにより洗浄性能を評価するステップ。
器具および材料
循環式水浴（５℃）；ガラスビーカ（250mL）；100mLの洗浄溶液容量を有するビーカ毎に１本の回転アーム；テスト布きれ：Center for Testmaterials BV,Vlaardingen,The Netherlands製のCS-28（綿上の米デンプン）およびEMPA Testmaterials AG,St.Gallen,Switzerland製のEMPA162（綿／ポリエステル上の米デンプン）であって、布きれは５×５cmに切断されている。
洗浄溶液：50mMのNaHCO3緩衝剤、pH8.0、水硬度：15°dH、カルシウム：マグネシウム比４：１。
アミラーゼストック溶液：１mgの酵素タンパク質／ｍＬ。−0.1％（ｗ／ｖ）Triton X-100および0.1mM CaCl2の超純水（MilliQ水）中の溶液を用いて、アミラーゼを希釈する（アミラーゼ希釈緩衝剤）。
Color Eye計測
洗浄性能は、Δレミッション値（ΔRem）として表される。布きれの光反射率の評価を、極小の楕円形のアパーチャ、すなわち0.7cm2（約0.7×1.0cm）を有するMacbeth Color Eye 7000反射率分光測光計を用いて行った。UVを含まない入射光で計測を行い、460nmでのレミッションを抽出した。布きれを計測開口対して持ち上げるピストンからの反射を低減するために、計測の前に、計測する布きれを他の同種の布きれの上に置いた。個別の布きれに係るΔレミッション値は、アミラーゼを添加することなく洗浄した布きれのレミッション値（対照）をアミラーゼで洗浄した布きれレミッション値から減じることにより算出した。
小型洗浄ロボットを用いるα−アミラーゼ洗浄性能：
小型洗浄ロボットは洗濯機の小規模モデルであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために用いられる。
100mLビーカに、60mL洗浄溶液を加え、これを15℃または40℃に加熱する。次いで、酵素（濃度：0.00；0.015；0.05；0.25；0.50；1.00mg酵素タンパク質／Ｌ）を添加する。ラック上の生地（CS-28；綿上の米デンプン）を一定の酵素濃度の洗浄溶液に沈め、20分間洗浄する。洗浄後、ラック上の生地を、乾燥棚の中で熱を加えることなく乾燥させる。生地のレミッションを、ZEISS MCS 521 VIS分光測光計を用いて460nmで計測する。個々の生地に係るΔレミッション値を、アミラーゼを添加することなく洗浄した生地のレミッション値（対照）をアミラーゼで洗浄した生地のレミッション値から減じることにより算出した。
α−アミラーゼ活性判定用のpNP-G7アッセイ
α−アミラーゼ活性は、G7-pNP基質を利用する方法により判定し得る。G7-pNPは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼにより切断されることが可能であるブロックオリゴ糖（blocked oligosaccharide）である4,6−エチリデン（Ｇ7）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ1）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドに対する略記である。切断の後、キット中のα−グルコシダーゼが加水分解された基質をさらに消化して、黄色の遊離ｐ−ニトロフェノール（pNP）分子を遊離させ、これにより、λ＝405nm（400〜420nm）での可視分光法による計測が可能である。G7-pNP基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Roche/Hitachi(カタログ番号11876473)により製造されている。
試薬：
このキットのG7-pNP基質は、22mMの4,6−エチリデン−G7-pNPおよび52.4mM HEPES（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、pH7.0）を含有する。
α−グルコシダーゼ試薬は、52.4mMのHEPES、87mMのNaCl、12.6mMのMgCl2、0.075mMのCaCl2、≧４kU／Ｌのα−グルコシダーゼ）を含有する。
基質処理溶液は、１mLのα−グルコシダーゼ試薬を0.2mLのG7-pNP基質と混合することにより形成される。この基質処理溶液は、使用直前に形成される。
希釈緩衝剤：50mMのMOPS、0.05％（ｗ／ｖ）のTriton X100（ポリエチレングリコールｐ−（1,1,3,3−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（C14H22O（C2H4O）n（ｎ＝９〜10）））、１mMのCaCl2、pH8.0。
手法：
分析されるアミラーゼサンプルを希釈緩衝剤中に希釈して、確実に希釈サンプル中のpHを７とした。アッセイを、20μlの希釈酵素サンプルを96ウェルマイクロタイタープレートに移し、80μlの基質処理溶液を添加することにより行った。溶液を混合し、室温で１分プレインキュベートし、OD405nmで５分間にわたって20秒毎に吸収を計測する。
時間依存吸収曲線の傾斜（吸光度／分）は、所与の一連の条件下で、対象のα−アミラーゼの特異活性(活性/mg酵素)と直接的に比例する。アミラーゼサンプルは、傾斜が0.4吸光度単位／分未満であるレベルまで希釈するべきである。
デンプンへの結合性の判定
アッセイ原理：
アミラーゼ変異体は、選択されるべきα−アミラーゼの用途について意図されるpH値（例えば、洗剤用途に関して、pHは、pH8.0またはpH10.0などのアルカリ性領域内で選択されることが好適である）に応じて、pH4.0〜11.0の範囲内で選択されたpH値で；普通５分間〜１時間の間、10分または30分間などの好ましくは10〜30分の範囲内の選択された時間で；および、普通、０℃〜30℃の範囲内、好ましくは４℃での選択された温度で、不溶性の生の米デンプンの存在下もしくは不在下でインキュベートされる。遠心分離の後、アミラーゼ活性が、上澄中で判定される。米デンプンの存在下および不在下でインキュベートしたサンプルにおける活性における差異が、アミラーゼの不溶性デンプンに対する結合性の尺度である。
材料および方法：
米デンプン（Sigma Inc,Cat No.S7260）、HEPES、塩化カルシウム、Triton X-100、グリシン、EnzChek Ultra Amylase Assay Kit（Life Technologies，カタログ番号E33651）、インキュベーションおよび希釈用96マイクロウェルプレート（Nunc、カタログ番号269620）、ならびに、蛍光計測用の半分の領域が黒色の96ウェルプレート（Corning，カタログ番号3694）。
アッセイ緩衝剤は、50mMのHEPES（pH8.0）、0.1mMのCaCl2および0.01％のTriton X-100を含有していた。酵素タンパク質溶液を、アッセイ緩衝剤で0.15mg／mlに希釈した。高pH結合緩衝剤は、50mMのグリシン−NaOH（pH10.0）および0.01%Triton X-100を含有していた。米デンプン溶液（2.5％）は、配列番号14の変異体用のアッセイ緩衝剤中で、および、配列番号２の変異体用の高pH結合緩衝剤中で調製した。EnzCheck Ultra Amylase基質溶液を、製造業者の説明書に従って調製し、アッセイ緩衝剤中に50μg／mlに希釈した。
ａ）米デンプン（2.5％）を含む、または、含まない緩衝剤を96マイクロウェルプレートに100μl加え、４℃で30分間プレインキュベートした。
ｂ）酵素溶液20μlを上記のウェルに加え、プレートをミキサに置いて、４℃で900rpmで30分混合した。
ｃ）プレートを４℃で2000rpmで５分間遠心分離してデンプンを沈降させ、上澄みを注意深く取り除き、酵素タンパク質濃度が約20ng／mlであるようアッセイ緩衝剤中で約1250倍に希釈した。
ｄ）希釈酵素サンプル25μlを、25μlのEnzCheck Ultra Amylase基質溶液を含有する半分の領域が黒色の96ウェルプレートに添加し、このプレートを直ぐに蛍光計測用のプレートリーダに置いた。
ｅ）蛍光強度の変化（ΔF.I.）を、485nmの励起波長および512nmの照射波長で、25℃で30分間計測した。0.5〜５分の時間間隔の間の蛍光の読み取り値を活性の計算に用いた（すなわち）蛍光強度／分の変化（ΔF.I.／分）。
Figure 2020141694
実施例１：アミロースに対する結合性および洗浄性能の判定
方法の項に記載のデンプンに対する結合性の計測方法およびAMSA洗浄性能テストを用いて、多数のアミラーゼおよびその変異体をアミロースに対する結合性および洗浄性能について分析した。
結合性分析を、8.0のpH、10分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。結合性を、５％（ｗ／ｖ）アミロース（Sigma A0512）を用いてテストし、洗浄性能テストを、モデル洗剤Ａ、および、0.4mg酵素タンパク質／Ｌ洗浄溶液の酵素投与量、および、15℃の洗浄温度を用いて、AMSA洗浄性能テストについて記載したとおり行った。洗浄時間は45分間であった。
結果が以下の表１に示されている。
Figure 2020141694
Figure 2020141694
これらの結果から、デンプンに結合した画分と洗浄性能との間に逆相関が存在することが明らかに分かる。
実施例２：生の米デンプンに対する結合性および洗浄性能の判定
原理：
原理は実施例１に記載のものと同一であるが、アミロースの代わりに、５％（ｗ／ｖ）米デンプン（Sigma S7260）の懸濁液のみを用いた。結合性分析を、8.0のpH、10分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
Figure 2020141694
実施例３：アミロペクチンに対する結合性の判定
原理は実施例１に記載のものと同一であるが、アミロースの代わりに、コーン由来の５％（ｗ／ｖ）アミロペクチン（Fluka製）の懸濁液のみを用いた。
Figure 2020141694
実施例４：バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（配列番号13）の変異体
配列番号13を有するＢ．リケニホルミス（B.licheniformis）α−アミラーゼの変異体を形成した。テストした変異体は、配列番号13を有する親α−アミラーゼと比して、デンプンに対する結合性が低く、より良好な洗浄性能を有するものであった。
結合性分析を、８のpH、５％（ｗ／ｖ）不溶性米デンプン、10分間の結合時間、および、５℃の温度で行った。
変異体の洗浄性能を、「小型洗浄ロボットを用いるα−アミラーゼ洗浄性能」に記載の条件を用いる小型洗浄を用いてテストしたところ、変異体は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来の親α−アミラーゼと比して、0.5mg／Ｌ、40℃で向上した洗浄性能を有することが示された。洗浄時間は20分間であった。
洗浄性能＝値（変異体−ブランク）／値（Termamyl−ブランク）×100
Figure 2020141694
実施例５：バチルス属の一種（Bacillus sp）707α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼの追加の変異体を生成し、変異体を基質結合性についてテストし、AMSA洗浄性能を、0.3mg酵素タンパク質／Ｌを用い、15℃で、モデル洗剤Ｘ中に20分間でテストした。
結合性分析を、10.0のpH、2.5％（ｗ／ｖ）不溶性米デンプン、10分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
洗浄性能は、修飾H183*＋G184*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
Figure 2020141694
実施例６：バチルス属の一種（Bacillus sp）707α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼのさらなる変異体を生成し、変異体を基質結合性および低温での洗浄性能についてテストしたところ、選択した変異体は、修飾H183*＋G184*を伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼよりも基質結合性が低いものであった。AMSA洗浄テストを、0.3mg酵素タンパク質／Ｌを用い、15℃、モデル洗剤Ｘ中に20分間で行った。
洗浄性能は、修飾H183*＋G184*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
Figure 2020141694
実施例７：バチルス属の一種（Bacillus sp）707α−アミラーゼ（配列番号２）の変異体
配列番号２を有するα−アミラーゼのさらなる変異体を生成し、変異体を基質結合性および低温での洗浄性能についてテストしたところ、選択した変異体は、修飾H183*＋G184*を伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼよりも基質結合性が低いものであった。AMSA洗浄テストを、0.3mg酵素タンパク質／Ｌを用い、15℃、モデル洗剤Ｘ中に20分間で行った。
結合性分析を、8.0のpH、10分間の結合時間、および、４℃の温度で行った。
洗浄性能は、修飾H183*＋G184*が伴う配列番号２を有する親α−アミラーゼの洗浄性能に対して示されている。
Figure 2020141694
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。

Claims (12)

  1. 高い洗浄性能を５〜35℃で有するα−アミラーゼをスクリーニングする方法であって、
    ａ）デンプンに対する前記α−アミラーゼの結合性を判定するステップ；
    ｂ）前記デンプンに対する結合性が標準洗剤α−アミラーゼよりも低いα−アミラーゼを選択するステップ
    を含む方法。
  2. 前記α−アミラーゼのデンプンに対する結合性が、配列番号８を有するα−アミラーゼの90％未満の結合性である、請求項１に記載の方法。
  3. ａ）親α−アミラーゼの表面に位置している１つまたは複数のアミノ酸における１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、欠失させ、または、挿入することにより変異体を生成するステップ；
    ｂ）デンプンに対する結合性について前記変異体をテストするステップ；
    ｃ）前記基質に対する結合性が前記親α−アミラーゼよりも低く、且つ、５〜３５℃で高い洗浄性能を有する変異体を選択するステップ
    を含む、親α−アミラーゼの変異体を選択する方法。
  4. 前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜15の１つに対して、少なくとも90％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜15の１つに対して、少なくとも95％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
  6. 前記親α−アミラーゼが、配列番号１〜15の１つに対して、少なくとも97％配列同一性を有するアミラーゼから選択される、請求項３に記載の方法。
  7. 前記変異体のデンプンに対する結合性が、前記親α−アミラーゼの90％未満の結合性である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. α−アミラーゼ活性を有し、かつ、配列番号２に対して少なくとも９０％配列同一性を有する変異体ポリペプチドであって、
    配列番号２におけるアミノ酸位置を基準とした場合に、以下：
    H183*+G184*+W140F；
    H183*+G184*+Q169A；
    H183*+G184*+W189Y+E190P；
    H183*+G184*+G477E；
    H183*+G184*+W140Y+G476R；
    H183*+G184*+W284D+G477E；
    H183*+G184*+W439R+G477E；
    H183*+G184*+W439R+D467K；
    H183*+G184*+R320M+W439R；
    H183*+G184*+W439R+K485R；
    H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K；および
    H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q；
    から選択される修飾を含み、
    配列番号２のアミノ酸配列からなる親α−アミラーゼと比して、デンプンに対する結合性が低く、かつ、５〜35℃での洗浄性能が高い、変異体ポリペプチド。
  9. 配列番号２に対して、少なくとも95％配列同一性を有する、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。
  10. 配列番号２に対して、少なくとも97％配列同一性を有する、請求項８に記載の変異体ポリペプチド。
  11. 請求項８〜10のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼを含む洗剤組成物。
  12. ランドリーまたは自動皿洗浄を含む硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける請求項８〜10のいずれか１項に記載の変異体α−アミラーゼの使用。
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