MX2014000158A - Metodo para el cribado de alfa-amilasas. - Google Patents

Metodo para el cribado de alfa-amilasas.

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Abstract

La presente invención se refiere a variantes de una alfa-amilasa original. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican las variantes; a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos; y a métodos para utilizar las variantes.

Description

METODO PARA EL CRIBADO DE ALFA-AMILASAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos para el cribado de alfa-amilasas que presentan un rendimiento elevado a temperaturas bajas, en particular que presentan un rendimiento elevado a temperaturas bajas en detergentes. La invención se refiere además a composiciones detergentes que comprenden tales amilasas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las alfa-amilasas (alfa-1 , 4 -glucan-4-glucanohidrolasas , E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo- y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
Desde hace mucho tiempo se utilizan alfa-amilasas a nivel industrial en varias aplicaciones conocidas tales como en detergentes, para cocinar, en la elaboración de cervezas, en la sacarificación y licuación del almidón, p. ej . , en la preparación de jarabes ricos en fructosa o como parte de la producción de etanol a partir de almidón. Se conocen estas y otras aplicaciones de las alfa-amilasas y emplean alfa-amilasas derivadas de microorganismos, en particular alfa-amilasas bacterianas.
Entre las primeras alfa-amilasas bacterianas que se utilizaron, se encuentra una alfa-amilasa de B . licheniformis, Ref . 245639 también conocida como Termamyl, la cual se ha caracterizado exhaustivamente y se ha determinado la estructura cristalina para esta enzima. Las amilasas alcalinas, tales como SP707, forman un grupo particular de alfa-amilasas que han encontrado aplicación en detergentes. Muchas de estas amilasas bacterianas conocidas han sido modificadas con el fin de mejorar su funcionalidad en una aplicación particular.
Los métodos para incrementar la termoestabilidad de las al a-amilasas se han estudiado en profundidad. Suzuki et al. (1989) han descrito alfa-amilasas quiméricas, en las cuales regiones específicas de una alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens han sido sustituidas por las regiones correspondientes de una alfa-amilasa de B. licheniformis. Las alfa-amilasas quiméricas se construyeron con el fin de identificar las regiones responsables de la termoestabilidad. Se descubrió que tales regiones incluían los residuos aminoacídicos 177-186 y los residuos aminoacídicos 255-270 de la alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens. Igarashi et al. 1998 han demostrado que la termoestabilidad de las amilasas de tipo AmyS se puede incrementar mediante la supresión de dos residuos aminoacídicos, R179-G180, (numeración de AmyS) de un bucle (de F178 a A184). Sin embargo, Shiau et al. (2003) demostraron que una enzima AmyS con una supresión en el mismo bucle presenta una actividad específica menor para la hidrólisis de almidón de maíz a una temperatura elevada que la enzima original, lo cual niega una de las principales ventajas de las amilasas AmyS.
Por motivos medioambientales, cada vez resulta más importante reducir la temperatura de los procesos de lavado, lavado de platos y/o limpieza. Sin embargo, la mayoría de las enzimas, incluidas las amilasas, presentan una temperatura óptima que está por encima de la temperatura empleada normalmente en un lavado a baja temperatura. La alfa-amilasa es una enzima clave para el uso en composiciones detergentes y su uso se ha vuelto cada vez más importante para la eliminación de manchas de almidón durante el lavado de la ropa o de los platos. Por consiguiente, es importante encontrar variantes de alfa-amilasas que conserven su rendimiento de lavado, efecto de eliminación de manchas y/o actividad cuando se reduce la temperatura. Sin embargo, a pesar de la eficacia de las composiciones enzimáticas detergentes actuales, muchas manchas son difíciles de eliminar completamente. Estos problemas se ven agravados por el uso cada vez más frecuente de temperaturas de lavado bajas (p. ej . , agua fría) y ciclos de lavado más cortos. Por lo tanto, sería deseable disponer de enzimas amilolíticas que pudieran actuar a una temperatura baja y a la vez conservar o incrementar otras propiedades deseables tales como la actividad específica (actividad amilolítica) , la estabilidad y/o el rendimiento de lavado.
De este modo, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos mejorados para el cribado de alfa-amilasas y variantes que presenten un rendimiento elevado, en particular un rendimiento de lavado elevado, a temperaturas bajas.
SUMARIO DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el cribado de alfa-amilasas que presentan un rendimiento elevado, en particular un rendimiento de lavado elevado, a temperaturas bajas, que comprende los pasos de a) determinar la unión de las enzimas a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón, b) seleccionar alfa-amilasas que presenten una afinidad baja por el sustrato, en particular que presenten una proporción baja entre la unión al sustrato y la actividad .
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para seleccionar variantes de una alfa-amilasa original que comprende los pasos de a) generar variantes mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original; b) evaluar las variantes para determinar su unión a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón, c) seleccionar las variantes que presenten una unión al sustrato menor que la de la alfa-amilasa original.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a variantes que se pueden seleccionar basándose en el método reivindicado y a composiciones detergentes que comprenden una alfa-amilasa seleccionada utilizando el método de la invención.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se basa en la observación de que existe una correlación inversa entre la unión de una amilasa a almidón crudo y el rendimiento a temperaturas bajas, en particular el rendimiento de lavado a temperaturas bajas. Por ejemplo, utilizando los datos de una serie de muestras de amilasas detergentes experimentales, se ha observado una correlación clara entre la unión al almidón del arroz y el rendimiento de lavado en un ensayo AMSA. De este modo, se ha descubierto sorprendentemente que las alfa-amilasas que presentan una unión baja a un sustrato sólido presentan un rendimiento elevado a temperatura baja, en particular un rendimiento elevado en detergentes a temperaturas bajas.
Definiciones Actividad alfa-amilasa: La expresión "actividad alfa-amilasa" se refiere a la actividad de alfa-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas , E.C. 3.2.1.1, las cuales constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo- y polisacáridos 1 , 4 -glucosídicos lineales y ramificados .
Unión a un sustrato: La expresión "unión a un sustrato" o "unión a un sustrato sólido", o expresiones gramaticalmente equivalentes, se refieren a la propiedad de una alfa-amilasa de unirse a un sustrato sólido, incluido un sustrato inmovilizado en un material sólido. La expresión es una expresión relativa y en general se expresa como una unión relativa en comparación con una alfa-amilasa de referencia. Para las variantes, la unión al sustrato se mide en general respecto a la alfa-amilasa original que se ha utilizado como punto de partida para las variantes. La unión al sustrato se puede medir incubando una solución de la alfa-amilasa con el sustrato sólido, eliminando el sustrato y determinando la fracción de la cantidad inicial de alfa-amilasa que permanece unida al sustrato sólido. Los métodos preferidos para determinar la unión al sustrato para un sustrato sólido se describen más adelante en la sección de Materiales y métodos.
Variante: El término "variante" se refiere a un polipéptido que posee actividad alfa-amilasa y que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o supresión en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere a un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una supresión se refiere a una eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a una adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición .
Mutante: El término "mutante" se refiere a un polinucleótido que codifica una variante.
Enzima de origen natural: La expresión alfa-amilasa "de origen natural" se refiere a una alfa-amilasa expresada por un microorganismo de origen natural tal como una bacteria, levadura u hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza .
Progenitor o alfa-amilasa original: El término "progenitor" o la expresión "alfa-amilasa original" se refiere a una alfa-amilasa a la cual se le aplica una alteración para producir las variantes enzimáticas de la presente invención. El progenitor puede ser un polipéptido que se encuentre en la naturaleza (de origen natural) o una variante de este. Con relación a las variantes, el polipéptido original es el polipéptido que presenta exactamente la misma secuencia que la variante excepto por los residuos específicamente modificados en la variante.
Variante aislada: La expresión "variante aislada" se refiere a una variante que ha sido modificada mediante la manipulación humana. En un aspecto, la variante presenta una pureza de al menos un 1%, p. e . , al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 80% y al menos un 90%, según se determina mediante SDS-PAGE.
Variante sustancialmente pura: La expresión "variante sustancialmente pura" se refiere a un preparado que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante . Preferentemente, la variante presenta una pureza de al menos un 92%, p. ej . , de al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99.5% y un 100% en peso del material polipeptídico total presente en el preparado. Las variantes de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando la variante mediante métodos recombinantes de uso común o mediante métodos de purificación clásicos.
Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualesquiera modificaciones posteriores a la traducción, tales como el procesamiento del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glucosilación, fosforilación, etc.
Secuencia codificante del polipéptido maduro: La expresión "secuencia codificante del polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que posee actividad alfa-amilasa .
Identidad secuencial: El grado de correlación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad secuencial " .
A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman- unsch (Needlman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS ("EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BL0SUM62) . El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Residuos idénticos x 100) / (Longitud de la alineación -Número total de huecos en la alineación) A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, mencionado anteriormente) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS ("EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", Rice et al., 2000, mencionado anteriormente), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100 )/ (Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación) Fragmento: El término "fragmento" se refiere a un polipéptido con uno o más (varios) aminoácidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento presenta actividad alfa-amilasa .
Subsecuencia: El término " subsecuencia" se refiere a un polinucleótido con uno o más (varios) nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de la secuencia codificante de un polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que presenta actividad alfa-amilasa .
Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. Las variaciones alélicas aparecen de manera natural debido a una mutación y pueden dar como resultado polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Polinucleótido aislado: La expresión "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que ha sido modificado mediante la manipulación humana. En un aspecto, el polinucleótido aislado presenta una pureza de al menos un 1%, p. ej . , de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 40%, al menos un 60%, al menos un 80%, al menos un 90% y al menos un 95%, según se determina mediante electroforesis en agarosa. Los polinucleótidos pueden tener origen genómico, semisintético, sintético, en el ADNc, ARN o cualesquiera combinaciones de estos.
Polinucleótido sustancialmente puro: La expresión "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a un preparado polinucleotídico exento de otros nucleótidos externos o no deseados y que adopta una forma adecuada para su uso en los sistemas de producción de polipéptidos modificados genéticamente. Por lo tanto, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0.5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante . Sin embargo, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como promotores y terminadores . Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro presente una pureza de al menos un 90%, p. ej . , de al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% y al menos un 99.5% en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferentemente en una forma sustancialmente pura.
Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto polipeptídico . Los límites de una secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, el cual normalmente comienza con el codón de iniciación ATG o codones de iniciación alternativos tales como GTG y TTG y finaliza con un codón de terminación tal como TAA, TAG y TGA.
La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc, un polinucleótido sintético o recombinante .
ADNc El término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm maduro, que ya ha experimentado corte y empalme, obtenida a partir de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de tipo intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de varios pasos, incluido el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme .
Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono o bicatenaria, la cual se aisla a partir de un gen de origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo sintético o que no existiría en la naturaleza. La expresión constructo de ácido nucleico es un sinónimo de la expresión "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" se refiere a todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exógena respecto al polinucleót ido que codifica la variante o pueden ser nativas o exógenas entre ellas. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de tipo propéptido, un promotor, una secuencia de tipo péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
Ligado operablemente: La expresión "ligado operablemente" se refiere a una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición adecuada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción de la variante, que incluye, sin carácter limitante, la transcripción, modificación posterior a la transcripción, traducción, modificación posterior a la traducción y secreción.
Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN circular o lineal que comprende un polinucleótido que codifica una variante y está ligada operablemente a nucleótidos adicionales que permiten su expresión.
Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de célula que es susceptible de ser transformada, transfectada, transducida y similares con un constructo de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que ocurren durante la replicacion.
Proceso de eliminación de almidón: La expresión "proceso de eliminación de almidón" se refiere a cualquier tipo de proceso mediante el cual se elimina (o se convierte) almidón, por ejemplo, procesos de lavado en los cuales se elimina almidón de artículos textiles, p. ej . , la limpieza de artículos textiles tal como el lavado de la ropa. Un proceso de eliminación de almidón también podría ser la limpieza de superficies duras, tal como el lavado de platos, o podrían ser procesos de limpieza en general tales como la limpieza industrial o institucional. La expresión también comprende otros procesos de eliminación de almidón o conversión de almidón, producción de etanol, licuación de almidón, desaprestado de artículos textiles, producción de papel y pasta de papel, elaboración de cerveza y detergentes en general .
Propiedad mejorada: La expresión "propiedad mejorada" se refiere a una característica asociada con una variante que se mejora en comparación con el progenitor. Tales propiedades mejoradas incluyen, sin carácter limitante, la actividad térmica, termoestabilidad, actividad en función del pH, estabilidad en función del pH, especificidad del sustrato/cofactor , propiedades de superficie mejoradas, especificidad del producto, mayor estabilidad o solubilidad en presencia de biomasa pretratada, estabilidad mejorada en condiciones de almacenamiento y estabilidad química.
Rendimiento de lavado: En el presente contexto, la expresión "rendimiento de lavado" se utiliza como la capacidad de un enzima para eliminar almidón o manchas que contengan almidón presentes en el objeto que se ha de limpiar durante, p. ej . , el lavado de la ropa o la limpieza de superficies duras tal como el lavado de los platos. El rendimiento de lavado se puede cuantificar calculando el denominado valor de intensidad (Int) que se define en la descripción de AMSA o en la prueba de rendimiento de lavado en vasos de precipitados en la sección de Métodos más adelante .
Rendimiento de lavado mejorado: La expresión "rendimiento de lavado mejorado" se define en la presente como una enzima variante que presenta una alteración del rendimiento de lavado de una variante de amilasa respecto al rendimiento de lavado de la amilasa original o respecto a una alfa-amilasa que tenga una secuencia de aminoácidos idéntica a la variante pero que no contenga la supresión en una o más de las posiciones específicas o respecto a la actividad de una alfa-amilasa que contenga la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO 4, p. ej . , que consiste en una mayor eliminación de manchas. La expresión "rendimiento de lavado" incluye la limpieza en general, p. ej . , la limpieza de superficies duras tal como en el lavado de platos, pero también el rendimiento de lavado en artículos textiles, por ejemplo, el lavado de la ropa, y también la limpieza industrial e institucional.
Temperatura baja: La expresión "temperatura baja" se refiere a una temperatura de 5-35 °C, preferentemente 5-30 °C, más preferentemente 5-25 °C, más preferentemente 5-20 °C, de la forma más preferida 5-15 °C y en particular 5-10 °C. En una modalidad preferida, una "temperatura baja" es una temperatura de 10-35 °C, preferentemente 10-30 °C, más preferentemente 10-25 °C, de la forma más preferida 10-20 °C y en particular 10-15 °C.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el cribado de alfa-amilasas que presentan un rendimiento elevado a temperatura baja, en particular que presentan un rendimiento de lavado elevado a temperaturas bajas, que comprende los pasos de a) determinar la unión de las enzimas a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón, b) seleccionar alfa-amilasas que presenten una unión baja al sustrato, en particular alfa-amilasas que presenten una proporción baja de unión al sustrato y actividad.
De acuerdo con este aspecto, la invención se refiere al cribado de alfa-amilasas que presentan un rendimiento elevado a temperaturas bajas, en particular al cribado de alfa-amilasas detergentes que presentan un rendimiento de lavado elevado a temperatura baja. El método es adecuado para el cribado de alfa-amilasas nuevas con el fin de encontrar enzimas que presenten un rendimiento satisfactorio a temperatura baja. El método también se puede automatizar y adaptar de forma beneficiosa para un procedimiento de cribado de alto rendimiento.
En una modalidad, el método es adecuado para encontrar alfa-amilasas nuevas. Un procedimiento conveniente consiste en evaluar una serie de alfa-amilasas candidatas e incluir una alfa-amilasa detergente conocida como patrón y a continuación seleccionar las alfa-amilasas candidatas nuevas que presenten una unión al sustrato menor que la alfa-amilasa detergente patrón. Las alfa-amilasas seleccionadas serán las candidatas que presenten un rendimiento de lavado elevado y se pueden evaluar adicionalmente para determinar otras propiedades importantes de las enzimas detergentes tales como la estabilidad, actividad específica, etc.
En la bibliografía existe constancia de varias amilasas detergentes, incluidas las amilasas de origen natural tales como las alfa-amilasas que contienen la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 , 11 y 12; variantes de cualquiera de estas tales como las variantes que se describen en O2001066712 y O2006002643 , y cualquiera de estas amilasas detergentes conocidas se puede incluir de forma adecuada en el método como una alfa-amilasa detergente patrón.
Las alfa-amilasas de esta modalidad se seleccionan para que presenten una unión al sustrato menor que la amilasa detergente patrón seleccionada, por ejemplo, para que presenten menos de un 95% de la unión de la alfa-amilasa detergente patrón, por ejemplo, menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión, más preferentemente menos de un 10% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 5% de la unión.
Como alternativa, utilizando SP722, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 1, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que SP722, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando SP707, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 2, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que SP707, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando AA560, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 3, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que AA560, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando SP690, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 4, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que SP690, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando KSM-AP1378, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 5, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que KSM-AP1378, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando SP7-7, una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 6, como alfa-amilasa detergente patrón, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que SP7-7, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
El método de la invención también se puede utilizar con otras alfa-amilasas originales tales como la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (BLA) , una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 13, para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que BLA, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) , una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 14, como alfa-amilasa original, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que BAN, preferentemente menos de un 90% de la unión, 4 preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Como alternativa, utilizando la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) (BSG) , una alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 15, como alfa-amilasa original, el método se puede utilizar para seleccionar alfa-amilasas que presenten un rendimiento mejorado a temperatura baja mediante la selección de alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato menor que BSG, preferentemente menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para seleccionar variantes de una alfa-amilasa original que comprende los pasos de a) generar variantes mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original; b) evaluar las variantes para determinar su unión a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón, c) seleccionar las variantes que presenten una unión al sustrato menor que la de la alfa-amilasa original.
En principio, el método se puede utilizar en cualquier alfa-amilasa conocida para la cual se desee seleccionar variantes que presenten un rendimiento mejorado a temperatura baja, sin embargo, en una modalidad preferida, el método de la invención se utiliza para generar variantes que presenten un rendimiento de lavado mejorado a temperatura baja.
En otras modalidades, el método de la invención se utiliza con el fin de encontrar amilasas para seleccionar variantes de una alfa-amilasa original que presenten un rendimiento mejorado a temperatura baja en aplicaciones relacionadas con el área de la limpieza, en aplicaciones tales como la sacarificación o licuación de almidón para degradar el almidón a azúcares que se puedan fermentar para proporcionar etanol para el consumo o para combustible, o en aplicaciones en la elaboración de artículos textiles. Todas estas aplicaciones son conocidas en la técnica y el experto apreciará cómo se pueden aplicar las alfa-amilasas seleccionadas de acuerdo con el método de la invención en estas aplicaciones.
En esta modalidad preferida, la alfa-amilasa original puede ser una alfa-amilasa detergente, es decir, una alfa-amilasa que presente actividad en condiciones que se aplican normalmente para limpiar y lavar la ropa, por ejemplo, actividad en presencia de tensioactivos , agentes quelantes y otros componentes utilizados de forma rutinaria en los detergentes, y actividad en un pH alcalino tal como en el intervalo de 8-11, tal como 9-10.
Las variantes se pueden preparar mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original.
El experto sabrá cómo identificar los residuos que se han de modificar identificando residuos situados en la superficie de la molécula original. En este sentido, se sobreentiende que los residuos situados en la superficie de la molécula son residuos tales que al menos parte del residuo está en contacto directo con el medio circundante en una forma natural de la molécula. Se apreciará que el experto puede extraer este tipo de información a partir de las estructuras 3-D de la molécula original, en el caso de que haya una estructura 3-D de la molécula original disponible, o, en el caso de que no haya una estructura 3-D de la molécula original disponible, alineando la alfa-amilasa original con una alfa-amilasa para la cual haya una estructura 3-D disponible e identificando los residuos situados en la superficie de la molécula como los residuos de la alfa-amilasa original que se corresponden en la alineación con los residuos situados en la superficie de la alfa-amilasa. Debido a que en la técnica se conoce más de una estructura 3-D para las alfa-amilasas , la identificación de los residuos situados en la superficie de una alfa-amilasa original determinada se debería basar en la alineación de la alfa-amilasa original con la estructura 3-D de la alfa-amilasa que presente la identidad secuencial más elevada con la alfa-amilasa original.
Las variantes se generan mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original o uno o más residuos aminoacídicos en posiciones situadas en la superficie de la alfa-amilasa original, por ejemplo, mediante la sustitución, supresión o inserción de al menos un residuo situado en la superficie, tal como al menos dos residuos, p. ej . , al menos tres residuos, p. ej . , al menos cuatro residuos, p. ej . , al menos cinco residuos, p. ej . , al menos seis residuos, p. ej . , al menos siete residuos, p. ej . , al menos ocho residuos, p. ej . , al menos nueve residuos, p. ej . , al menos diez residuos, tal como hasta un máximo de quince residuos, p. ej . , hasta un máximo de veinte residuos o hasta un máximo de treinta residuos situados en la superficie de la alfa-amilasa original .
Las variantes pueden contener opcionalmente otras sustituciones, deleciones o inserciones en uno o más residuos aminoacídicos que no estén situados en la superficie de la molécula. En la técnica anterior se han descrito muchas de estas sustituciones, deleciones o inserciones y también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. Como ejemplos de tal sustitución, inserción o supresión adicional preferida se puede mencionar la supresión de los residuos D183 y G184 en la alfa-amilasa original, según se describe en 096/23873.
Preferentemente, las variantes se generan de modo que presenten al menos un 90% de identidad secuencial respecto a su alfa-amilasa original, preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial.
Las variantes se seleccionan para que presenten una unión al sustrato menor que la alfa-amilasa original, por ejemplo, para que presenten menos de un 95% de la unión de la alfa-amilasa original, por ejemplo, menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
En una modalidad preferida, la invención se refiere a un método para seleccionar variantes de una alfa-amilasa original seleccionada entre alfa-amilasas que contienen la SEQ ID NO: 1-15 y alfa-amilasas que presentan al menos un 80% de identidad secuencial respecto a una de estas, preferentemente al menos un 85% de identidad, preferentemente al menos un 90% de identidad, más preferentemente al menos un 95% de identidad, más preferentemente al menos un 97% de identidad, que comprende los pasos de a) generar variantes mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original, donde las variantes presentan al menos un 90% de identidad secuencial con su alfa-amilasa original, preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial ; b) evaluar las variantes para determinar su unión a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón; y c) seleccionar las variantes que presenten una unión al sustrato menor que la alfa-amilasa original, donde las variantes presentan menos de un 95% de la unión de la alfa-amilasa original, por ejemplo, menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a variantes de una alfa-amilasa original seleccionada entre alfa-amilasas que contienen la SEQ ID NO: 1-15 y alfa-amilasas que presentan al menos un 80% de identidad secuencial respecto a una de estas, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 87% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 97% de identidad secuencial, donde: i) la variante presenta al menos un 80% de identidad secuencial respecto a la alfa-amilasa original, preferentemente al menos un 85%, preferentemente al menos un 87% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, y ii) la variante presenta una unión a un soporte sólido menor en comparación con la alfa-amilasa original, por ejemplo, menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70%, preferentemente menos de un 60%, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
Tales variantes se pueden proporcionar utilizando el método de la invención.
Las variantes de la invención también incluyen variantes en las cuales uno o más residuos situados en la superficie de las alfa-amilasas originales y que forman parte de un sitio de unión al sustrato han sido sustituidos o eliminados. Tales sitios de unión al sustrato presentes en la superficie de las alfa-amilasas originales se han descrito en la bibliografía para algunas alfa-amilasas originales y el experto apreciará que tales sitios de unión al sustrato se pueden identificar en otras alfa-amilasas originales alineando una alfa-amilasa original determinada con la secuencia de otra alfa-amilasa para la cual se hayan identificado los sitios de unión al sustrato .
Como ejemplos de residuos que forman parte de un sitio de unión al sustrato se pueden mencionar: a) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 2 b) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 5 c) W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, 284, F289, G304, G305, K320, W347, W439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 4 d) W138, W157, W165, E167, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, K315, W342, R437, W467 y G475 en la SEQ ID NO: 13 e) W136, W155, W163, E165, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, R315, W342, R437, W467 y G475 en la SEQ ID NO: 14 f) W139, W158, W166, E168, W187, E192, F260, F287, G302, G303, 345, W437, 467, G474 y G475 en la SEQ ID NO: 15 Las variantes de la invención también incluyen variantes que incluyen una o más modificaciones que introducen uno o más residuos aminoacídicos voluminosos en una posición cercana a un residuo que forma parte de un sitio de unión al sustrato, tal como los residuos mencionados en a) -h) anteriormente. En este sentido, un residuo aminoacídico voluminoso se puede seleccionar entre los aminoácidos que contienen una cadena lateral grande, tales como Tyr, Trp, Phe, His e lie, donde Tyr y Trp son los preferidos. Se pretende que la expresión "posición cercana a un residuo que forma parte de un sitio de unión al sustrato" se refiera a que el residuo modificado se encuentra a menos de 10 Á del residuo que forma parte de un sitio de unión al sustrato, preferentemente a menos de 6 Á y, de la forma más preferida, a menos de 3 Á de tales residuos. La identificación de tales residuos basándose en información estructural disponible se encuentra dentro de las competencias de los expertos.
Otras variantes preferidas incluyen variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 2, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 87% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad, más preferentemente al menos un 99% de identidad secuencial, pero menos de un 100% de identidad secuencial y que comprenden las siguientes sustituciones: H183*+G184*+W140F; H183*+G184*+Q169N; H183*+G184*+Q169A; H183*+G184*+W189Y+E190P; H183*+G184*+N260D; H183*+G184*+G477E; H183*+G184*+G477Q; H183*+G184*+G477K; H183*+G184*+W189E+E190P; H183*+G184*+A51I+W140Y; H183*+G184*+ 140Y+ 189E; H183*+G184*+W140Y+N260P; H183*+G184*+W140Y+W284D; H183*+G184*+W140Y+G476R; H183*+G184*+ 140Y+G477E; H183*+G184*+ 189E+W439R; H183*+G184*+W284D+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R H183*+G184*+ 439R+G477E; H183*+G184*+E194D; H183*+G184*+W439R+D467K; H183*+G184*+R320M+W439R; H183*+G184*+W439R+K485R; H183*+G184*+Y160S; H183*+G184*+W189F+E190P; H183*+G184*+F262A; H183*+G184*+Y363H; H183*+G184*+G476E; H183*+G184*+N260P+W439R; H183*+G184*+N260P+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R; H183*+G184*+K72S+W140Y; H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G; H183*+G184*+E194S; H183*+G184*+E345D+G477R; H183*+G184*+K302N+W439R; H183*+G184*+R320K+W439R H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+ 469V+G476E+G477K; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G4 E; H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E; H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R; H183*+G184*+ 159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R; H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477K; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q; H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
Otras variantes preferidas incluyen variantes constituidas por la SEQ ID NO: 2 con una de las sustituciones mencionadas anteriormente.
Otra variante preferida de la invención es una variante que presenta al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 13 y que comprende una sustitución en una posición que corresponde a K315 y/o W467 en la SEQ ID NO: 13, preferentemente K315ANCQEGHILMFPST YVM, en particular se prefiere K315M y/o W467AF. En una modalidad preferida, la sustitución en la posición K315 se combina con otras sustituciones, preferentemente seleccionadas entre G48A, T51IL, G107A, H156Y; A181T, N190F, I201F, A209V y Q264S.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una alfa-amilasa seleccionada utilizando el método de la invención.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una alfa-amilasa variante caracterizada por que: i) presenta al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial respecto a una de las SEQ ID NO: 1-12 ii) presenta una unión a un sustrato sólido o inmovilizado que es menos de un 95% de la unión de la alfa-amilasa original, por ejemplo, menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición detergente que comprende una alfa-amilasa variante caracterizada por que: i) presenta al menos un 80% de identidad secuencial respecto a una de estas, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad respecto a una de las SEQ ID NO: 1-12 ii) presenta una unión a un sustrato sólido o inmovilizado que es menos de un 95% de la unión de la alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, menos de un 90% de la unión, preferentemente menos de un 80% de la unión, preferentemente menos de un 70% de la unión, preferentemente menos de un 60% de la unión, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
La invención también se refiere a una composición detergente que comprende una alfa-amilasa, donde la unión de la alfa-amilasa al almidón del arroz es menor que la unión de la alfa-amilasa que contiene la SEQ ID NO: 8 al almidón del arroz, preferentemente menos de un 80%, más preferentemente menos de un 70%, más preferentemente menos de un 60%, más preferentemente menos de un 50%, más preferentemente menos de un 40%, más preferentemente menos de un 30%, más preferentemente menos de un 20% y, de la forma más preferida, menos de un 10%.
Determinación de la unión de alfa-amilasas a un sustrato sólido A los efectos de la presente invención, la unión de alfa-amilasas a un sustrato sólido o inmovilizado se puede determinar, en principio, utilizando cualquier método conocido en la técnica para determinar la unión a un sustrato. En general, tal método implica poner en contacto una alfa-amilasa con un sustrato sólido o inmovilizado y determinar la fracción de alfa-amilasa que se une a los sustratos .
El sustrato sólido o inmovilizado puede ser cualquier sustrato para alfa-amilasas que sea sustancialmente insoluble en las condiciones del ensayo. El sustrato sólido puede ser un almidón tal como almidón de trigo, almidón de maíz o almidón de arroz, donde el almidón del arroz es el preferido. Como alternativa, la determinación se puede llevar a cabo utilizando un sustrato inmovilizado, que incluye cualesquiera sustratos solubles o insolubles para alfa-amilasas inmovilizados sobre una matriz sólida. De acuerdo con la invención, la unión de una alfa-amilasa a su sustrato se determina como la fracción de amilasa unida medida a 20 °C en presencia de almidón a pH 8. La unión de una alfa-amilasa a su sustrato se puede determinar incubando una solución acuosa de la alfa-amilasa con el almidón y determinando la fracción de amilasa unida utilizando el método que se describe más adelante.
Convenciones para designar las variantes A los efectos de la presente invención, el polipéptido maduro que se describe en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 se utiliza para determinar el residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa. La secuencia de aminoácidos de otra alfa-amilasa se alinea con el polipéptido maduro que se describe en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 y, basándose en la alineación, el número de la posición aminoacídica correspondiente a cualquier residuo aminoacídico del polipéptido maduro descrito en la SEQ ID NO: 2 se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS ("EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores.
La identificación del residuo aminoacídico correspondiente en otra alfa-amilasa se puede confirmar mediante una alineación de múltiples secuencias de polipéptidos utilizando "Clustal " (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).
Cuando la otra enzima difiere del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, de modo tal que una comparación tradicional basada en las secuencias no consigue detectar su correlación (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), se pueden utilizar otros algoritmos de comparación de secuencias por pares. Se puede obtener una mayor sensibilidad en la búsqueda basada en secuencias utilizando programas de búsqueda que emplean representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para búsquedas en bases de datos.
Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso iterativo de búsqueda en bases de datos y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Se puede obtener una sensibilidad incluso mayor si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras proteicas. Los programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de varias fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructurales y potenciales de solvatación) como entrada para una red neural que predice el plegamiento estructural para una secuencia problema. De forma similar, el método de Gough et al., 2000, J". Mol. Biol. 313: 903-919 se puede utilizar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones se pueden utilizar a su vez para generar modelos de homología para el polipéptido y tales modelos se pueden evaluar para determinar su precisión utilizando varias herramientas desarrolladas con este fin.
Para proteínas de estructura conocida, existen varias herramientas y fuentes disponibles para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas han sido alineadas estructuralmente y estas alineaciones son accesibles y se pueden descargar. Se pueden alinear dos o más estructuras proteicas utilizando varios algoritmos tales como la matriz de alineación a distancia (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extensión combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y se pueden utilizar adicionalmente implementaciones de estos algoritmos para cuestionar bases de datos de estructuras con una estructura de interés con el fin de descubrir posibles homólogos estructurales (p. ej . , Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
A la hora de describir las variantes de alfa-amilasas de la presente invención, la nomenclatura que se describe a continuación se adapta para facilitar su referencia. Se emplea la abreviación de los aminoácidos de tres letras o de una única letra aceptada por la IUPAC.
Sustituciones . Para la sustitución de aminoácidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina con alanina en la posición 226 se denomina "Thr226Ala" o "T226A" . Las mutaciones múltiples se separan mediante el signo de la suma (" +"), p. ej . , "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F) , respectivamente.
Deleciones . Para la supresión de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición*. Por consiguiente, la supresión de glicina en la posición 195 se denomina "Glyl95*" o "G195*" . Las deleciones múltiples se separan mediante el signo de la suma ("+"), p. ej . , "Glyl95* + Ser411*" o "G195* + S411*" .
Inserciones . Para la inserción de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se denomina "Glyl95GlyLys" o "G195GK" . Una inserción de múltiples aminoácidos se denomina [aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.] . Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 se indica como "Glyl95GlyLysAla" o "G195GKA" .
En tales casos, el (los) residuo (s) aminoacídico (s) insertado (s) se numera (n) mediante la adición de letras en minúscula al número de la posición del residuo aminoacídico que precede al (a los) residuo (s) aminoacídico (s) insertado (s) . De este modo, en el ejemplo anterior, la secuencia sería: Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden alteraciones múltiples se separan mediante el signo de la suma ("+"), p. ej . , "Argl70Tyr+Glyl95Glu" o "R170Y+G195E" , que representa una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente .
Sustituciones diferentes. Cuando se pueden introducir diferentes sustituciones en una posición, las diferentes sustituciones se separan con una coma, p. ej . , "Argl70Tyr, Glu" representa una sustitución de arginina con tirosina o ácido glutámico en la posición 170. De este modo, "Tyrl67Gly, Ala + Argl70Gly, Ala" designa las siguientes variantes : "Tyrl67Gly+Argl70Gly" , "Tyrl67Gly+Argl70Ala" , "Tyrl67Ala+Argl70Gly" y "Tyrl67Ala+Argl70Ala" .
Alfa-amilasas originales La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 1, SP722.
En un aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa . En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 1.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2, SP707, que se describe en Tsukamoto et al. 1988, Biochem. Biophys . Res Comm. 151, 25-31.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa . En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 3, AA560.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 3 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 3.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4, SP690, que se describe en W09526397.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 4 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5, SM-AP1378, que se describe en EP 670367.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 5.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6, sp 7-7.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 6 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa . En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 6.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 6.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 6.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 7, SP722+T183*+G184* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 7 de al menos un 80%, p. e . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 7.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 7.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 7.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 8, SP 707+G182*+H183* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 8 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 8.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 8.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 8.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 9, AA560+T183*+G184* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 9 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa . En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 9.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 9.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipeptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10, SP690+T183*+G184* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 10.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 11, KSM-AP1378+D183*+G184* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 11 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 11.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 11.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 11.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12, SP-7-7+G182*+H183* .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12 de al menos un 80%, p. e . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 12.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 13, que deriva de Bacillus licheniformis.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 13 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 13.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 13.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 13.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 14, que deriva de Bacillus amyloliquefaciens.
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 14 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 14.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 14.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 14.
La alfa-amilasa original también puede ser un polipéptido con al menos un 80% de identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15, que deriva de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) .
En otro aspecto, el progenitor presenta una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15 de al menos un 80%, p. ej . , al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, el cual presenta actividad alfa-amilasa. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del progenitor no difiere en más de diez aminoácidos, p. ej . , difiere en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15.
El progenitor comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto, el progenitor comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15.
En otra modalidad, el progenitor es una variante alélica del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 15.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o un fragmento de estas, se puede utilizar con el fin de diseñar sondas de ácidos nucleicos para identificar y clonar el ADN que codifica un progenitor procedente de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos de uso común en la técnica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar en la hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blotting, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Este tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben tener una longitud de al menos 14, p. e . , al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos. Preferentemente, la sonda de ácidos nucleicos tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, p. ej . , al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Normalmente, las sondas se marcan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . La presente invención abarca este tipo de sondas.
Se puede cribar una colección de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otros organismos de este tipo para detectar ADN que se hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un progenitor. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otros organismos de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizar sobre este, el cual se utiliza en Southern Blotting.
A los efectos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida con una sonda de nucleótidos marcada correspondiente a un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o una subsecuencia de estas, en condiciones de rigurosidad de baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica .
En un aspecto, la sonda de ácidos nucleicos está constituida por un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o un fragmento de estas .
Para sondas largas con una longitud de al menos 100 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad de muy baja a muy alta se definen como la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5x SSPE, SDS al 0.3%, 200 microgramos/mL de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y bien formamida al 25% para rigurosidades muy bajas y bajas, formamida al 35% para rigurosidades medias y medias-altas, o bien formamida al 50% para rigurosidades altas y muy altas, siguiendo los procedimientos estándar de Southern Blotting durante 12-24 horas idealmente. Finalmente, el material portador se lava tres veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 2X SSC y SDS al 0.2% a 45 °C (rigurosidad muy baja), 50 °C (rigurosidad baja) , 55 °C (rigurosidad media) , 60 °C (rigurosidad media-alta) , 65 °C (rigurosidad alta) o 70 °C (rigurosidad muy alta) .
Para sondas cortas con una longitud de entre aproximadamente 15 nucleótidos y aproximadamente 70 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad se definen como la prehibridación e hibridación a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C por debajo de la Tf calculada utilizando los cálculos de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 48: 1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M de pH 7.6, EDTA 6 m , NP-40 al 0.5%, IX de solución de Denhardt, pirofosfato sódico 1 mM, fosfato sódico monobásico 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por mL, siguiendo los procedimientos estándar de la Southern Blotting durante 12-24 horas idealmente. Finalmente, el material portador se lava una vez en 6X SCC con SDS al 0.1% durante 15 minutos y dos veces, durante 15 minutos cada vez, utilizando 6X SSC a una temperatura de 5 °C a 10 °C por debajo de la Tf calculada.
El progenitor se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. A los efectos de la presente invención, la expresión "obtener/obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el progenitor codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una célula en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el progenitor se secreta extracelularmente .
El progenitor puede ser una alfa-amilasa bacteriana. Por ejemplo, el progenitor puede ser un polipéptido de bacterias Gram positivas tal como una alfa-amilasa de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus o Streptomyces, o un polipéptido de bacterias Gram negativas tal como una alfa-amilasa de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella o Ureaplasma .
En un aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.
En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus .
En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans .
El progenitor puede ser una alfa-amilasa fúngica. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de levadura tal como una alfa-amilasa de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia. Por ejemplo, el progenitor puede ser una alfa-amilasa de un hongo filamentoso tal como una alfa-amilasa de Acremonium, Agaricus, Alternaría , Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia., Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonypha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria.
En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis .
En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowens , Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicu , Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium retículatura, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride .
En otro aspecto, el progenitor es una alfa-amilasa de Bacillus sp., p. ej . , la alfa-amilasa de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.
Se sobreentenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, p. ej . , anamorfos, independientemente del nombre de la especie con el cual se los conoce. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.
Las cepas de estas especies son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
El progenitor se puede identificar y obtener a partir de otras fuentes, que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (p. ej . , el suelo, compost, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. El polinucleótido que codifica un progenitor se puede obtener a continuación cribando de manera similar una colección genómica o de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez que se ha detectado el polinucleótido que codifica un progenitor con una o más sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que son de uso común para los expertos en la técnica (remítase, p. ej . , a Sambrook et al., 1998, mencionado anteriormente) .
El progenitor puede ser un polipéptido híbrido en el cual una porción de un polipéptido se fusiona al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de una porción de otro polipéptido .
El progenitor también puede ser un polipéptido fusionado o un polipéptido de fusión escindible en el cual un polipéptido se fusiona al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de otro polipéptido. Un polipéptido fusionado se produce fusionando un polinucleótido que codifica un polipéptido con un polinucleótido que codifica otro polipéptido. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del mismo promotor o promotores y del mismo terminador. Las proteínas de fusión también se pueden construir utilizando la tecnología de las inteínas, en la cual las fusiones se crean posteriormente a la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, sin carácter limitante, los sitios descritos en Martin et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al . , 1997, Ap l . Environ. Microbiol . 63: 3488-3493; Ward et al . , 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins : Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery IVorld 4: 35-48.
Preparación de las variantes Las variantes se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica tal como la mutagénesis dirigida al sitio, la construcción de genes sintéticos, la construcción de genes semisintéticos , la mutagénesis aleatoria, el reordenamiento, etc.
La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la cual se crean una o más (varias) mutaciones en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el progenitor .
La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo in vi tro mediante PCR que implica el uso de cebadores oligonucleotídicos que contienen la mutación deseada. La mutagénesis dirigida al sitio también se puede llevar a cabo in vitro mediante mutagénesis de cásete, que implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio del plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el progenitor y la ligación posterior de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido . Normalmente, la enzima de restricción que se digiere en el plásmido y el oligonucleótido es la misma, lo cual permite obtener extremos adhesivos del plásmido y la inserción para ligar el uno con el otro. Remítase, p. ej . , a Scherer y Davis, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.
La mutagénesis dirigida al sitio también se puede llevar a cabo in vivo mediante métodos conocidos en la técnica. Remítase, p. ej . , a la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat . Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet . Newslett . 43: 15-16.
En la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Existen muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar las variantes.
La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula de polinucleótido diseñada para que codifique un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede llevar a cabo utilizando una serie de técnicas tales como la tecnología basada en microchips multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en las cuales los oligonucleótidos se sintetizan y acoplan en chips microfluídicos fotoprogramables .
Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de un único aminoácido o de múltiples aminoácidos se pueden realizar y evaluar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de cribado relevante tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; O 95/17413 o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la PCR propensa a error, expresión en fago (p. ej . , Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE. UU. N.° 5.223.409; WO 92/06204), mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al. , 1988, DNA 7 : 127) .
Los métodos de mutagénesis/reordenamiento se pueden combinar con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutados expresados por las células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutado que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar a partir de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente utilizando métodos estándar de la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido .
La construcción de genes semisintéticos se consigue combinando aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria y/o reordenamiento. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos polinucleotídicos que se sintetizan de forma combinada con técnicas de PCR. De este modo, las regiones definidas de los genes se pueden sintetizar de novo, mientras que otras regiones se pueden amplificar utilizando cebadores mutagénicos específicos para un sitio, mientras que otras regiones más se pueden someter a PCR propensa a error o amplificación por PCR no propensa a error. A continuación, las subsecuencias de polinucleótidos se pueden reorganizar.
Variantes Los aminoácidos esenciales de un progenitor se pueden identificar de acuerdo con procedimientos de uso común en la técnica tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . En la última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula y las moléculas mutadas resultantes se evalúan para determinar su actividad alfa-amilasa y para identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al., 1996, J. Biol.
Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la alfa-amilasa u otra interacción biológica también se pueden determinar mediante el análisis físico de la estructura, que se determina mediante técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o mareaje de fotoafinidad, junto con la mutación de posibles aminoácidos del sitio de contacto. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol . 224: 899-904; lodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden deducir a partir del análisis de las identidades con polipéptidos relacionados con el progenitor .
Polinucleo idos La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de las variantes de la presente invención.
Constructos de ácidos nucleicos La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de la presente invención ligado operablemente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El polinucleótido se puede manipular de diferentes maneras para hacer posible la expresión de una variante. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son de uso común en la técnica.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, la cual es reconocida por una célula hospedadora para la expresión del polinucléotido . La secuencia promotora contiene secuencias de control de la transcripción que regulan la expresión de la variante. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que presente actividad de transcripción en la célula hospedadora, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares , tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedadora.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis {amyL) , gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis (sacB) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, operón lac de E. coli, gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor {dagA) , y gen de la beta-lactamasa procariota (Villa-Karaaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Se describen otros promotores en "Useful proteins Erom recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente .
Algunos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora de un hongo filamentoso son los promotores obtenidos a partir de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori [glaA) , TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa-fosfato- isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787) , amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Daría de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor de NA2-tpi (un promotor modificado que incluye un gen que codifica una alfa-amilasa neutra en Aspergilli en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente de un gen que codifica la triosa-fosfato-isomerasa en Aspergilli; los ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados, incluido el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus niger en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido procedente del gen que codifica la triosa-fosfato- isomerasa en Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y promotores híbridos, truncados y mutados de estos.
En un hospedador de tipo levadura, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP) , triosa-fosfato-isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3 - fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospedadoras de tipo levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, la cual es reconocida por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está ligada operablemente al extremo 3' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.
Los terminadores preferidos para las células hospedadoras de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, alfa-glucoamilasa de Aspergillus niger, glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células hospedadoras de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3 -fosfato-deshidrogenasa Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospedadoras de tipo levadura se describen en Romanos et al., 1992, mencionado anteriormente .
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por parte de la célula hospedadora. La secuencia líder está ligada operablemente al extremo 5' del polinucleótido que codifica la variante. Se puede utilizar cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula hospedadora.
Los líderes preferidos para las células hospedadoras de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa-fosfato-isomerasa de Aspergillus nidulans .
Los líderes adecuados para las células hospedadoras de tipo levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3-fosfoglicerato-cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol-deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) .
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia ligada operablemente al extremo 3' de la secuencia que codifica la variante y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células hospedadoras de tipo hongo filamentoso se obtienen a partir de los genes de la antranilato-sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para las células hospedadoras de tipo levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control también puede ser una región codificante de un péptido señal, la cual codifica un péptido señal ligado al extremo N-terminal de una variante y dirige la variante hacia la vía secretora de la célula. El extremo 51 de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera intrínseca una región codificante de un péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la región codificante que codifica la variante. Como alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de un péptido señal que sea exógena respecto a la secuencia codificante. La región codificante del péptido señal exógena puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga de manera natural ninguna región codificante del péptido señal. Como alternativa, la región codificante del péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la región codificante del péptido señal natural con el fin de fomentar la secreción de la variante. Sin embargo, se puede utilizar cualquier región codificante del péptido señal que dirija la variante expresada hacia la vía secretora de la célula hospedadora .
Las secuencias codificantes de péptidos señal eficaces para las células hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes de péptidos señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis . Se describen otros péptidos señal en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias codificantes de péptidos señal eficaces para las células hospedadoras de tipo hongo filamentoso son las secuencias codificantes de péptidos señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei.
Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de tipo levadura se obtienen a partir de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Se describen otras secuencias codificantes de péptidos señal útiles en Romanos et al., 1992, mencionado anteriormente.
La secuencia de control también puede ser una región codificante de un propéptido, la cual codifica un propéptido situado en el extremo N-terminal de una variante. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis {nprT) , lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), aspártico-proteinasa de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
Cuando tanto la región del propéptido como la del péptido señal estén presentes en el extremo N-terminal de una variante, la región del propéptido se colocará a continuación del extremo N-terminal de la variante y la región del péptido señal se colocará a continuación del extremo N-terminal de la región del propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de la variante en función del crecimiento de la célula hospedadora. Algunos ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que se ha de activar o desactivar como respuesta a un estímulo físico o químico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores de lac, tac y trp. En levaduras, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden utilizar el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA-alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de las metalotioneínas , que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica la variante estaría ligado operablemente con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diferentes nucleótidos y secuencias de control se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en este tipo de sitios. Como alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante esté ligada operablemente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej . , un plásmido o un virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y que pueda inducir la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la cual se va a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej . , un plásmido, un elemento extracromosómico, un rainicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación . Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integre en el genoma y se replique junto con el o los cromosomas en los cuales se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o se pueden utilizar dos o más vectores o plásmidos que contengan conjuntamente el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula hospedadora, o se puede utilizar un transposón.
El vector contiene preferentemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten una selección sencilla de las células transformadas, transfectadas , transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxotrofos y similares.
Algunos ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformís o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol , kanamicina o tetraciclinas . Algunos marcadores adecuados para células hospedadoras de tipo levadura son ADE2, HIS3, LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una célula hospedadora de tipo hongo filamentoso incluyen, sin carácter limitante, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina-carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina-acetiltransferasa) , hph (higromicina-fosfotransferasa) , niaD (nitrato-reductasa) , pyrG (orotidina-5 ' -fosfato-descarboxilasa) , sC ( sulfato-adeniltransferasa) y trpC (antranilato-sintasa) , así como equivalentes de estos. Para su uso en una célula de Aspergillus, se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus .
El vector contiene preferentemente uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. Como alternativa, el vector puede contener secuencias de nucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedadora en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas. Para incrementar la probabilidad de la integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10 000 pares de bases, entre 400 y 10 000 pares de bases y entre 800 y 10 000 pares de bases, las cuales poseen un grado de identidad elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de nucleótidos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homologa.
Para la replicacion autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicacion que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador plasmídico que regule la replicacion autónoma que está en funcionamiento en una célula. La expresión "origen de replicacion" o "replicador plasmídico" se refiere a una secuencia de nucleótidos que permite la replicacion in vivo de un plásmido o vector.
Algunos ejemplos de orígenes de replicacion bacterianos son los orígenes de replicacion de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicacion en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y pAMSl, que permiten la replicacion en Bacillus .
Algunos ejemplos de orígenes de replicacion para su uso en células hospedadoras de tipo levadura son los orígenes de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.
Algunos ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de tipo hongo filamentoso son AMAl y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; O 00/24883). El aislamiento del gen AMAl y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden lograrse de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883.
Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula hospedadora para incrementar la producción de una variante. Puede obtenerse un incremento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen que sea un marcador seleccionable amplificable junto con el polinucleótido, de modo que las células que contienen copias amplificadas del gen que es un marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente con el fin de construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son muy conocidos por los expertos en la técnica (remítase, p. e . , a Sambrook et al., 1989, mencionado anteriormente) para obtener variantes sustancialmente puras.
Células hospedadoras La presente invención también se refiere a células hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de una variante de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora, de modo que el constructo o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante según se ha descrito previamente. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica la variante y su fuente .
La célula hospedadora puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de una variante, p. ej . , una célula procariota o eucariota.
La célula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria Gram-positiva o Gram-negativa . Las bacterias Gram-positivas incluyen, sin carácter limitante, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces . Las bacterias Gram-negativas incluyen, sin carácter limitante, Campylobacter, JE?, coli, Flavobacterium, Fusojbacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neísseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
La célula hospedadora bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluidas, sin carácter limitante, las células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis .
La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluidas, sin carácter limitante, las células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus .
La célula hospedadora bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluidas, sin carácter limitante, las células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans .
La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej . , a Chang y Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115), utilizando células competentes (remítase, p. ej . , a Young y Spizizen, 1961, J\ Bacteriol . 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol . 56: 209-221), mediante electroporacion (remítase, p. ej . , a Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o mediante conjugación (remítase, p. ej . , a Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej . , a Hanahan, 1983, Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporacion (remítase, p. ej . , a Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145) . La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar, por ejemplo, mediante la transformación del protoplasto y electroporacion (remítase, p. ej . , a Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), mediante conjugación (remítase, p. ej . , a azodier et al., 1989, J. Bacteriol . 171: 3583-3585) o mediante transducción (remítase, p. ej., a Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 98: 6289-6294) . La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar, por ejemplo, mediante electroporacion (remítase, p. ej . , a Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o mediante conjugación (remítase, p. ej . , a Pinedo y Smets, 2005, Appl . Environ.
Microbiol . 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar, por ejemplo, mediante competencia natural (remítase, p. ej . , a Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), mediante la transformación del protoplasto (remítase, p. ej . , a Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-2070), mediante electroporación (remítase, p. ej . , a Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o mediante conjugación (remítase, p. ej . , a Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora.
La célula hospedadora también puede ser una célula eucariota tal como una célula de mamífero, insecto, vegetal o fúngica.
La célula hospedadora puede ser una célula fúngica. El término "hongos", según se utiliza en la presente, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como Oomycota y todos los hongos mitospóricos (según definen Hawksworth et al. en Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi , 8.a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de levadura. El término "levadura", según se utiliza en la presente, incluye levaduras que se reproducen por ascosporas (Endomicetales) , levaduras que se reproducen por basidiosporas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomicetos) . Debido a que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, a los efectos de esta invención, las levaduras se definirán según se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A. , Passmore, S.M. y Davenport , R.R., eds, Soc . App . Bacteriol . Symposium Series N. ° 9, 1980) .
La célula hospedadora de tipo levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica .
La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de tipo hongo filamentoso. La expresión "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según se define en Hawksworth et al., 1995, mencionado previamente) . Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por tener una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo tiene lugar mediante la elongación de la hifa y el metabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae tiene lugar mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.
La célula hospedadora de tipo hongo filamentoso puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma .
Por ejemplo, la célula hospedadora de tipo hongo filamentoso puede ser una célula de Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rívulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinu , Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata , Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris , Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de protoplastos y la regeneración de la pared celular en una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma en EP 238023 y en Yelton et al., 1984, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para la transformación de la especie Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y en O 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guárante en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, págs . 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la variante; y (b) recuperar la variante.
Las células hospedadoras se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción de la variante utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante el cultivo en un matraz agitado o la fermentación a pequeña escala o gran escala (incluidas las fermentaciones continua, discontinua, por lote alimentado o de estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales, llevada a cabo en un medio adecuado y en condiciones que permitan que el polipéptido se exprese y/o se aisle. El cultivo tiene lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos de uso común en la técnica. Los medios adecuados se pueden adquirir de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (p. ej . , en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si la variante se secreta al medio de nutrientes, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar a partir de los lisados celulares .
La variante se puede detectar utilizando métodos de uso común en la técnica que son específicos para las variantes. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad de la variante.
La variante se puede recuperar mediante métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, la variante se puede recuperar del medio de nutrientes mediante procedimientos convencionales, que incluyen, sin carácter limitante, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación.
La variante se puede purificar mediante varios procedimientos de uso común en la técnica, que incluyen, sin carácter limitante, cromatografía (p. ej . , de intercambio iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electro oréticos (p. ej . , isoelectroenfoque preparativo) , solubilidad diferencial (p. ej . , precipitación con sulfato amónico) , SDS-PAGE o extracción (remítase, p. ej . , a Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.
En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que en su lugar se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa una variante como fuente de la variante .
Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una variante de la presente invención. Preferentemente, las composiciones están enriquecidas en una variante de este tipo. El término "enriquecido/a" indica que se ha incrementado la actividad alfa-amilasa de la composición, p. ej . , con un factor de enriquecimiento de 1.1.
La composición puede comprender una variante como componente enzimático principal, p. ej . , una composición monocomponente . Como alternativa, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina-glicosiltransferasa , desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa , haloperoxidasa , invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa , peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa , enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La o las enzimas adicionales pueden ser producidas, por ejemplo, por un microorganismo que pertenezca al género Aspergillus, p. ej . , Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Fusarium, p. ej . , Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellen.se, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Humicola, p. ej . , Humicola insolens o Humicola lanuginosa; o Trichoderma, p. ej . , Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos de uso común en la técnica y pueden adoptar la forma de una composición liquida o seca. Por ejemplo, la composición puede adoptar la forma de un granulado o un microgranulado . La variante se puede estabilizar de acuerdo con métodos de uso común en la técnica.
Composiciones detergentes En una modalidad, la invención se refiere a composiciones detergentes que comprenden una enzima de la presente invención combinada con uno o más componentes adicionales de la composición de limpieza.
La elección de los componentes adicionales se encuentra dentro de las competencias del experto e incluye ingredientes convencionales, incluidos los componentes ilustrativos no limitantes que se exponen a continuación. La elección de los componentes puede incluir, para el cuidado de telas, tener en cuenta el tipo de tela que se ha de limpiar, el tipo y/o grado de suciedad, la temperatura a la cual va a tener lugar la limpieza y la formulación del producto detergente. Aunque los componentes que se mencionan a continuación están clasificados según un título general de acuerdo con una funcionalidad particular, esto no debe interpretarse como una limitación, ya que un componente puede comprender funcionalidades adicionales que el experto en la técnica podrá apreciar.
Enzima de la presente invención En una modalidad de la presente invención, el polipéptido de la presente invención se puede añadir a una composición detergente en una cantidad correspondiente a 0.001-100 mg de proteína, tal como 0.01-100 mg de proteína, preferentemente 0.005-50 mg de proteína, más preferentemente 0.01-25 mg de proteína, aún más preferentemente 0.05-10 mg de proteína, de la forma más preferida 0.05-5 mg de proteína e incluso de la forma más preferida 0.01-1 mg de proteína por litro de solución de lavado.
La o las enzimas de la composición detergente de la invención se pueden estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales, p. ej . , un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico o un derivado del ácido bórico, p. ej . , un éster de tipo borato aromático, o un derivado de un ácido fenilborónico tal como el ácido 4-formilfenilborónico, y la composición se puede formular según se describe, por ejemplo, en WO92/19709 y WO92/19708.
Un polipéptido de la presente invención también se puede incorporar a las formulaciones detergentes descritas en O97/07202, que se incorpora a la presente por referencia.
Tensioactivos La composición detergente puede comprender uno o más tensioactivos, los cuales pueden ser aniónicos y/o catiónicos y/o no iónicos y/o semipolares y/o zwiteriónicos o una mezcla de estos. En una modalidad particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioac ivos aniónicos. El o los tensioactivos están presentes normalmente en un nivel comprendido entre aproximadamente un 0.1% y un 60% en peso, tal como entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 20%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 10%. El o los tensioactivos se seleccionan en función de la aplicación de limpieza deseada e incluyen cualquier o cualesquiera tensioactivos convencionales conocidos en la técnica. Se puede utilizar cualquier tensioactivo conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa.
Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% en peso, tal como entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 30%, incluido entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 15%, o entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 25% de un tensioactivo aniónico. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos aniónicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS) , isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS) , fenilalcanosulfonatos , alfa-olefinsulfonatos (AOS) , olefinsulfonatos , alquenosulfonatos , alcano-2 , 3-diilbis (sulfatos) , hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos , alquilsulfatos (AS) tales como dodecilsulfato sódico (SDS) , sulfatos de alcoholes grasos (FAS) , sulfatos de alcoholes primarios (PAS) , étersulfatos de alcoholes (AES o AEOS o FES, también conocidos como etoxisulfatos de alcoholes o étersulfatos de alcoholes grasos) , alcanosulfonatos secundarios (SAS) , sulfonatos de parafina (PS) , sulfonatos de ásteres, esteres de glicerol y ácidos grasos sulfonados, ásteres metílicos de ácidos grasos alfa-sulfonados (alfa-SFMe o SES) incluido el sulfonato de un áster metílico (MES) , ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenilsuccínico (DTSA) , derivados de tipo ácido graso de aminoácidos, diésteres y monoésteres del ácido sulfosuccínico o jabón y combinaciones de estos.
Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo catiónico. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos catiónicos incluyen alquildimetiletanolamina cuaternaria (ADMEAQ) , bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) , cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio y combinaciones de estos, compuestos de alquilamonio cuaternario y amonio cuaternario alcoxilado (AQA) .
Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 0.2% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, entre aproximadamente un 0.5% y aproximadamente un 30%, en particular entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 20%, entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 10%, tal como entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 5% o entre aproximadamente un 8% y aproximadamente un 12%. Los ejemplos no limitantes de tensioactivos no iónicos incluyen los etoxilatos de alcoholes (AE o AEO) , propoxilatos de alcoholes, alcoholes grasos propoxilados (PFA) , ésteres alquílicos de ácidos grasos alcoxilados, tales como ésteres alquílicos de ácidos grasos propoxilados y/o etoxilados, etoxilatos de alquilfenol (APE) , etoxilatos de nonilfenol (NPE) , alquilpoliglucósidos (APG) , aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácidos grasos (FAM) , dietanolamidas de ácidos grasos (FADA) , monoetanolamidas de ácidos grasos etoxilados (EFAM) , monoetanolamida de ácidos grasos propoxilados (PFAM) , amidas de ácidos grasos polihidroxialquílieos o derivados de tipo W-acilo o W-alquilo de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácidos grasos, FAGA) , así como productos disponibles con los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de estos.
Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo semipolar. Algunos ejemplos no limitantes de tensioactivos semipolares incluyen óxidos de aminas (AO) tales como el óxido de alquildimetilamina, óxido de N- (cocoalquil ) -N, N-dimetilamina y óxido de N- (seboalquil) -N,W-bis (2-hidroxietil) amina, alcanolamidas de ácidos grasos y alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, y combinaciones de estos .
Cuando se incluya en el detergente, este contendrá normalmente entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 40% en peso de un tensioactivo zwiteriónico . Los ejemplos no limitantes de tensioactivos zwiteriónicos incluyen betaína, alquildimetilbetaína y sulfobetaína, y combinaciones de estos .
Hidrótropos Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrófobos en soluciones acuosas (o, al contrario, sustancias polares en un entorno no polar) . Normalmente, los hidrótropos tienen un carácter tanto hidrófilo como hidrófobo (las denominadas propiedades anfifílicas que se conocen en los tensioactivos) ; sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea, remítase, p. ej . , al artículo de revisión de Hodgon y Kaler (2007) , Current Opinión in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Los hidrótropos no presentan ninguna concentración crítica por encima de la cual tenga lugar la autoagregación, como se observa para los tensioactivos y lípidos que forman fases micelares, lamelares u otras mesofases bien definidas. En su lugar, muchos hidrótropos presentan un proceso de agregación de tipo continuo, en el cual los tamaños de los agregados crecen a medida que se incrementa la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos modifican el comportamiento de la fase, la estabilidad y las propiedades coloidales de los sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluidas las mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrotropos se han utilizan tradicionalmente en diferentes industrias, desde la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria hasta las aplicaciones técnicas. El uso de hidrotropos en composiciones detergentes permite obtener, por ejemplo, formulaciones más concentradas de tensioactivos (como en el proceso de compactación de detergentes líquidos eliminando el agua) sin introducir fenómenos no deseados tales como la separación de fases o una viscosidad elevada.
El detergente puede contener un 0-5% en peso, tal como entre aproximadamente un 0.5% y aproximadamente un 5%, o entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 5%, de un hidrótropo. Se puede utilizar cualquier hidrótropo conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa. Los ejemplos no limitantes de hidrotropos incluyen el bencenosulfonato sódico, p-toluenosulfonatos sódicos (STS) , xilenosulfonatos sódicos (SXS) , cumenosulfonatos sódicos (SCS) , cimenosulfonato sódico, óxidos de aminas, alcoholes y éteres poliglicólicos , hidroxinaftoato sódico, hidroxinaftalenosulfonato sódico, etilhexilsulfato sódico y combinaciones de estos.
Adyuvantes y coadyuvantes La composición detergente puede contener aproximadamente un 0-65% en peso, tal como entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 40% de un adyuvante o coadyuvante para detergentes, o una mezcla de estos. En un detergente para lavar los platos, el nivel de adyuvante es normalmente de un 40-65%, concretamente de un 50-65%. Concretamente, el adyuvante y/o coadyuvante pueden ser un agente quelante que forme complejos hidrosolubles con Ca y Mg. Se puede utilizar cualquier adyuvante y/o coadyuvante conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar los platos o la ropa o detergentes utilizados para la limpieza industrial o institucional (?). Los ejemplos no limitantes de adyuvantes incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos ) , trifosfatos tales como trifosfato sódico (STP o STPP) , carbonatos tales como carbonato sódico, silicatos solubles tales como metasilicato sódico, silicatos estratificados (p. ej . , SKS-6 de Hoechst) , etanolaminas tales como 2-aminoetan-l-ol (MEA) , iminodietanol (DEA) y 2 , 2 ' , 2 ' 1 -nitrilotrietanol (TEA) y carboximetilinul ina (CMI) , y combinaciones de estos.
La composición detergente también puede contener aproximadamente un 0-50% en peso, tal como entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 40%, de un coadyuvante para detergentes o una mezcla de estos. La composición detergente puede incluir un coadyuvante solo o combinado con un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante de tipo zeolita. Los ejemplos no limitantes de coadyuvantes incluyen homopolímeros de poliacrilatos o copolímeros de estos, tales como el ácido poliacrílico (PAA) o el copolímero del ácido acrílico y el ácido maleico (PAA/PMA) . Otros ejemplos no limitantes incluyen el citrato, agentes quelantes tales como aminocarboxilatos , aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico . Otros ejemplos específicos incluyen el ácido 2 , 21 , 21 ' -nitrilotriacético (NTA) , ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) , ácido iminodisuccínico (IDS) , ácido etilendiamino-iV, N' -disuccínico (EDDS) , ácido metilglicinodiacético (MGDA) , ácido glutámico-W, N-ácido diacético (GLDA) , 1-hidroxietano-l , 1-diilbis (ácido fosfónico) (HEDP) , etilendiaminotetrakis (metilen) tetrakis (ácido fosfónico) (EDTMPA) , dietilentriaminopentakis (metilen) pentakis (ácido fosfónico) (DTPMPA) , ácido N- (2 -hidroxietil ) iminodiacético (EDG) , ácido aspártico-N-ácido monoacético (ASMA) , ácido aspártico-W, N-ácido diacético (ASDA) , ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP) , ácido iminodisuccínico (IDA) , ácido N-(2-sulfometil) aspártico (SMAS) , ácido N- (2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil) glutámico (SMGL) , ácido N- (2-sulfoetil) glutámico (SEGL) , ácido N-metiliminodiacético (MIDA), -alanina-ácido N, N-diacético (OÍ-ALDA) , serina-IV, N-ácido diacético (SEDA), isoserina-N, N-ácido diacético (ISDA) , fenilalanina-N/ N-ácido diacético (PHDA) , ácido antranílico-N/N-ácido diacético (ANDA) , ácido sulfanílico-N, JV-ácido diacético (SLDA) , taurina-N, N-ácido diacético (TUDA) y ácido sulfometil-iV,N-diacético (SMDA) , N-(hidroxietil) etilidendiaminotriacetato (HEDTA) , dietanolglicina (DEG) , dietilentriaminapenta (ácido metilenfosfónico) (DTPMP) , aminotris (ácido metilenefosfónico) (ATMP) y combinaciones y sales de estos. Se describen otros adyuvantes y/o coadyuvantes ilustrativos, p. ej . , en WO 09/102854 y US 5977053.
Inhibidores de la incrustación tales como los fosfonatos.
Sistemas de blanqueo El detergente puede contener un 0-20% en peso, tal como entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 10%, de un sistema de blanqueo. Se puede utilizar cualquier sistema de blanqueo conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa + lavar los platos + I&I. Los componentes de los sistemas de blanqueo adecuados incluyen catalizadores del blanqueo, fotoblanqueantes , activadores del blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato sódico y perboratos sódicos, perácidos preformados y mezclas de estos. Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin carácter limitante, ácidos peroxicarboxílieos y sales, ácidos percarbónicos y sales, ácidos perimídicos y sales, ácidos peroximonosulfúricos y sales, por ejemplo, Oxone® y mezclas de estos. Los ejemplos no limitantes de sistemas de blanqueo incluyen sistemas de blanqueo a base de peróxidos, los cuales pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, incluidas las sales de metales alcalinos tales como las sales sódicas de un perborato (normalmente un mono- o tetrahidrato) , sales de percarbonatos , persulfatos, perfosfatos, persilicatos , combinadas con un activador del blanqueo que forma perácidos. La expresión "activador del blanqueo" se refiere en la presente a un compuesto que reacciona con un blanqueante peroxigenado tal como el peróxido de hidrógeno para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueante activado. Los activadores del blanqueo adecuados que se pueden utilizar en la presente incluyen aquellos que pertenecen a la clase de los esteres, amidas, imidas o anhídridos. Algunos ejemplos adecuados son la tetraacetiletilendiamina (TAED) , 3,5,5-trimetilhexanoilbencenosulfonato sódico, ácido diperoxidodecanoico, 4- (dodecanoiloxi ) bencenosulfonato (LOBS) , 4- (decanoiloxi ) bencenosulfonato, 4- (decanoiloxi) benzoato (DOBS) , 4- (3,5,5-trimetilhexanoiloxi ) bencenosulfonato (ISONOBS) , tetraacetiletilendiamina (TAED) y 4- (nonanoiloxi) bencenosulfonato (NOBS) , y/o los descritos en 098/17767. En el documento EP624154 se ha descrito una familia particular de activadores del blanqueo de interés y en esa familia se prefiere particularmente el acetilcitrato de trietilo (ACT) . El ACT o un triglicérido de cadena corta como la triacina presenta la ventaja de que es ecológico, ya que en última instancia se degrada para obtener ácido cítrico y alcohol. Además, el acetilcitrato de trietilo y la triacetina presentan una buena estabilidad hidrolítica en el producto cuando se almacenan y son unos activadores del blanqueo eficaces. Finalmente, el ATC proporciona una buena capacidad adyuvante al aditivo para lavar la ropa. Como alternativa, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos , por ejemplo, de tipo amida, imida o sulfona. El sistema de blanqueo también puede comprender perácidos tales como el ácido 6- (ftaloilamino) percaproico (PAP) . El sistema de blanqueo también puede incluir un catalizador de blanqueo. En algunas modalidades, el componente de blanqueo puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo constituido por catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas : (iii) y mezclas de estos; donde cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 24 átomos de carbono o un grupo alquilo lineal que contiene entre 11 y 24 átomos de carbono, preferentemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado que contiene entre 9 y 18 átomos de carbono o un grupo alquilo lineal que contiene entre 11 y 18 átomos de carbono, más preferentemente cada R1 se selecciona independientemente del grupo constituido por 2 -propilheptilo, 2 -butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2 -hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo , isononilo, isodecilo, isotridecilo e isopentadecilo . Se describen otros sistemas de blanqueo ilustrativos, p. ej . , en WO2007/087258 , WO2007/087244 , WO2007/087259 y WO2007/087242. Un fotoblanqueante adecuado puede ser, por ejemplo, la ftalocianina de zinc sulfonada.
Polímeros El detergente puede contener un 0-10% en peso, tal como un 0.5-5%, 2-5%, 0.5-2% o 0.2-1% de un polímero. Se puede utilizar cualquier polímero conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa, lavar los platos e I&I. El polímero puede actuar como un coadyuvante, tal como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar propiedades contra la redeposición, de protección de las fibras, liberación de la suciedad, inhibición de la transferencia de tintes y/o limpieza de la grasa. Los polímeros contra la redeposición ilustrativos incluyen (carboximetil) celulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA) , poli (vinilpirrolidona) (PVP) , poli (etileneglicol ) u óxido de polietileno (PEG) , poli (etilenimina) etoxilada y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico. Los polímeros para la protección de las fibras ilustrativos incluyen CMC modificada hidrófobamente (HM-CMC) y siliconas. Los polímeros para la liberación de la suciedad ilustrativos incluyen copolímeros del ácido tereftálico y glicoles oligoméricos . Los polímeros para la inhibición de la transferencia de tintes ilustrativos incluyen PVP, poli (vinilimidazol) (PVI) y N-óxido de poli (vinilpiridina) (PVPO o PVPNO) . Se describen otros polímeros ilustrativos, p. ej . , en WO 2006/130575.
Agentes colorantes de la tela Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir agentes colorantes de la tela, tales como tintes o pigmentos, los cuales, cuando se formulan en las composiciones detergentes, se pueden depositar sobre una tela cuando la tela se pone en contacto con una solución de lavado que comprenda las composiciones detergentes, de este modo se altera el color de la tela mediante la absorción/reflexión de la luz visible. Los agentes de blanqueo fluorescentes emiten al menos cierta cantidad de luz visible. En cambio, los agentes colorantes de la tela alteran el color de una superficie, ya que absorben al menos una porción del espectro de la luz visible. Los agentes colorantes de la tela adecuados incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y también pueden incluir pigmentos. Los tintes adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular y tintes poliméricos . Los tintes que son moléculas de bajo peso molecular adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular seleccionados del grupo constituido por los tintes incluidos en las clasificaciones del índice de Color (C.I.) de Azul directo, Rojo directo, Violeta directo, Azul ácido, Rojo ácido, Violeta ácido, Azul básico, Rojo básico y Violeta básico, o mezclas de estos, por ejemplo, según se describe en WO2005/03274, WO2005/03275 , WO2005/03276 y EP1876226 (que se incorporan a la presente por referencia) . La composición detergente comprende preferentemente entre aproximadamente un 0.00003% en peso y aproximadamente un 0.2% en peso, entre aproximadamente un 0.00008% en peso y aproximadamente un 0.05% en peso, o incluso entre aproximadamente un 0.0001% en peso y aproximadamente un 0.04% en peso del agente colorante de la tela. La composición puede comprender entre un 0.0001% en peso y un 0.2% en peso de agente colorante de la tela, esto puede preferirse especialmente cuando la composición esté en forma de bolsitas de dosis unitaria. También se describen agentes colorantes adecuados, p. ej . , en WO 2007/087257 y WO2007/087243.
Enzimas (adicionales) El aditivo del detergente, así como la composición detergente, pueden comprender una o más enzimas [adicionales] tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, p. ej . , una lacasa y/o peroxidasa .
En general, las propiedades de la o las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la o las enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces.
Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej . , las celulasas fúngicas producidas por Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum que se describen en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios en cuanto al cuidado del color. Algunos ejemplos de tales celulasas son las celulasas que se describen en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397 y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasas tales como las que se describen en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Las celulasas comercializadas incluyen Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) .
Proteasas: Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. La proteasa puede ser una serina-proteasa o una metaloproteasa, preferentemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa similar a la tripsina. Algunos ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas , especialmente las derivadas de Bacillus, p. ej . , la subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (que se describen en WO 89/06279) . Algunos ejemplos de proteasas similares a la tripsina son la tripsina (p. ej . , de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium que se describen en WO 89/06270 y WO 94/25583.
Algunos ejemplos de proteasas útiles son las variantes que se describen en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Las enzimas de tipo proteasa comercializadas preferidas incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™ y Kannase™ (Novozymes A/S) , Maxatase™, axacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™ y FN3™ (Genencor International Inc.) .
Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los imitantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de r ermomyces) , p. ej . , de H. lanuginosa (T. lanuginosus) según se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. insolens según se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej . , de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp . cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002) , P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej . , de B. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B . stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422) .
Otros ejemplos son variantes de lipasas tales como las que se describen en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202.
Las enzimas de tipo lipasa comercializadas preferidas incluyen Lipolase™, Lipolase Ultra™ y Lipex™ (Novozymes A/S) .
Amilasas : Las amilasas (a y/o ß) adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas a partir de Bacillus, p. ej . , una cepa especial de Bacillus licheniformis, que se describe más detalladamente en GB 1,296,839.
Algunos ejemplos de amilasas útiles son las variantes que se describen en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
Las amilasas comercializadas son Stainzyme™, Stainzyme™ Plus, Natalase™, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ , Powerase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.).
Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas alteradas genéticamente. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej . , de C. cinereus y variantes de estas tales como las que se describen en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.
Las peroxidasas comercializadas incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S) .
La o las enzimas detergentes se pueden incluir en una composición detergente añadiendo aditivos independientes que contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo del detergente de la invención, es decir, un aditivo independiente o un aditivo combinado, se puede formular, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspensión, etc. Las formulaciones de aditivos de detergentes preferidas son los granulados, en particular los granulados que no generan polvo, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones.
Los granulados que no generan polvo se pueden producir, p. ej . , según se describe en US 4.106.991 y 4.661.452 y opcionalmente se pueden recubrir utilizando métodos conocidos en la técnica. Algunos ejemplos de materiales de recubrimiento céreos son los productos de tipo poli (óxido de etileno) (polietilenglicol , PEG) con pesos molares medios comprendidos entre 1000 y 20 000; nonilfenoles etoxilados que contienen entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene entre 12 y 20 átomos de carbono y en los cuales hay entre 15 y 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. En el documento GB 1483591 se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento peliculígenos adecuados para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado. Los preparados enzimáticos líquidos se pueden estabilizar, por ejemplo, añadiendo un poliol tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con métodos establecidos. Se pueden preparar enzimas protegidas de acuerdo con el método descrito en EP 238,216.
Materiales adjuntos También se pueden utilizar cualesquiera componentes de detergentes conocidos en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa, lavar los platos o I&I. Otros componentes de detergentes opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes antiencogimiento, agentes contra la redeposición de la suciedad, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, agentes desintegrantes/de desintegración, tintes, estabilizantes enzimáticos (incluidos el ácido bórico, boratos, CMC y/o polioles tales como propilenglicol) , suavizantes para la ropa que incluyen arcillas, rellenos/auxiliares de procesamiento, agentes de blanqueo fluorescentes/abrillantadores ópticos, potenciadores de la espuma, reguladores de la espuma (espuma de jabones) , perfumes, agentes de suspensión de la suciedad, suavizantes, supresores de la espuma de jabones, inhibidores de la decoloración y agentes absorbentes, tanto solos como combinados. Se puede utilizar cualquier ingrediente conocido en la técnica por su uso en detergentes para lavar la ropa, lavar los platos o I&I. La elección de tales ingredientes se encuentra dentro de las competencias del experto.
Dispersantes - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergente, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc.
Agentes inhibidores de la transferencia de tintes - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Los agentes inhibidores de la transferencia de tintes poliméricos adecuados incluyen, sin carácter limitante, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. Cuando están presentes en una composición en cuestión, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes en niveles de aproximadamente un 0.0001 % a aproximadamente un 10%, de aproximadamente un 0.01% a aproximadamente un 5% o incluso de aproximadamente un 0.1% a aproximadamente un 3% en peso de la composición.
Agentes de blanqueo fluorescentes - Las composiciones detergentes de la presente invención también contendrán preferentemente componentes adicionales que pueden dar color a los artículos que se están limpiando, tales como agentes de blanqueo fluorescentes o abrillantadores ópticos. Cuando el abrillantador está presente, está preferentemente en un nivel de entre aproximadamente un 0.01% y aproximadamente un 0.5%. En la composición de la presente invención se puede utilizar cualquier agente de blanqueo fluorescente adecuado para su uso en una composición detergente para lavar la ropa. Los agentes de blanqueo fluorescentes utilizados más f ecuentemente son los que pertenecen a las clases de derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenildiestirilo . Los ejemplos de agentes de blanqueo fluorescentes de tipo derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico incluyen las sales sódicas de: 4 , 4 ' -bis (2 -dietanolamino-4 -anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato ; 4,4' -bis (2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato; 4,41 -bis (2-anilino-4- (N-met il -N-2 -hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato, 4,4' -bis (4-fenil-2, 1 , 3 -triazol-2 - il) estilbeno-2 , 21 -disulfonato; 4,4'- bis (2-anilino-4- (l-metil-2-hidroxietilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 21 -disulfonato y 2 - (estilbil -4 " -nafto-1. , 2 ' : 4 , 5) -1, 2 , 3 -triazol-2 " -sulfonato . Los agentes de blanqueo fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, que se pueden adquirir de Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica del 4 , 41 -bis (2 -morfolino-4 -anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbenodisulfonate . Tinopal CBS es la sal disódica del 2 , 2 ' -bis ( fenilestiril ) disulfonato . También es un agente de blanqueo fluorescente preferido el producto comercializado Parawhite KX, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Bombai, India. Otros agentes fluorescentes adecuados para su uso en la invención incluyen las 1, 3 -diarilpirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas .
Los niveles de abrillantadores fluorescentes adecuados incluyen niveles inferiores de aproximadamente un 0.01, de un 0.05, de aproximadamente un 0.1 o incluso de aproximadamente un 0.2% en peso y niveles superiores de un 0.5 o incluso un 0.75% en peso .
Polímeros que liberan la suciedad - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más polímeros que liberan la suciedad, los cuales facilitan la eliminación de suciedad de telas tales como telas a base de algodón y poliéster, en particular la eliminación de suciedad hidrófoba de telas a base de poliéster. Los polímeros que liberan la suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros basados en tereftalato aniónicos o no iónicos, polivinilcaprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros vinílicos de injerto, poliéster, poliamidas, remítase, por ejemplo, al Capítulo 7 en Powdered Detergente, Surfactant science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros que liberan la suciedad son los polímeros alcoxilados anfifílicos que limpian la grasa, los cuales comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de tipo polialquilenimina o una estructura de tipo polialcanolamina, según se describe detalladamente en O 2009/087523 (que se incorpora a la presente por referencia) . Además, los copolímeros de injerto aleatorio son polímeros que liberan la suciedad adecuados. En los documentos WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (que se incorporan a la presente por referencia) se describen detalladamente copolímeros de injerto adecuados. Otros polímeros que liberan la suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, especialmente estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificados tales como los que se describen en EP 1867808 o WO 2003/040279 (ambos se incorporan a la presente por referencia) . Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de estos. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa modificada aniónicamente , celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de estas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metilcelulosa , carboximetilcelulosa, etilcelulosa , hidroxiletilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, áster de la carboximetilcelulosa y mezclas de estas.
Agentes contra la redeposición - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes contra la redeposición tales como carboximetilcelulosa (CMC) , alcohol polivinílico (PVA) , polivinilpirrolidona (PVP) , polioxietileno y/o polietileneglicol (PEG) , homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros de base celulósica descritos en los polímeros que liberan la suciedad anteriores también pueden actuar como agentes contra la redeposición.
Otros materiales adjuntos adecuados incluyen, sin carácter limitante, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tintes, estabilizantes enzimáticos, suavizantes, agentes de relleno, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de la espuma de jabones, disolventes, estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes que confieren elasticidad a la estructura.
Formulación de productos detergentes La composición detergente de la invención puede adoptar cualquier forma conveniente, p. ej . , una pastilla, un comprimido homogéneo, un comprimido con una o más capas, un polvo compacto o regular, un gránulo, una pasta, un gel o un líquido concentrado, compacto o regular.
Formas de formulaciones detergentes: en capas (fases iguales o diferentes), bolsitas, frente a formas para una unidad de dosificación para máquinas.
Las bolsitas se pueden configurar con un único compartimento o con múltiples compartimentos. Puede tener cualquier forma, figura y material que sea adecuado para guardar la composición, p. ej . , sin permitir que se libere la composición de la bolsita antes de que entre en contacto con el agua. La bolsita está hecha de una película hidrosoluble que encierra un volumen interno. El volumen interno se puede dividir en compartimentos de la bolsita. Las películas preferidas son materiales poliméricos, preferentemente polímeros a los cuales se les da forma de película o lámina. Los polímeros, copolímeros o derivados de estos preferidos son poliacrilatos seleccionados y copolímeros de acrilato hidrosolubles , metilcelulosa, carboximetilcelulosa , dextrina sódica, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina, polimetacrilatos , más preferentemente copolímeros del alcohol polivinílico e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) . Preferentemente, el nivel de polímero en la película, por ejemplo, PVA es de al menos aproximadamente un 60%. El peso molecular medio preferido estará comprendido normalmente entre aproximadamente 20 000 y aproximadamente 150 000. Las películas también pueden estar constituidas por composiciones mezcladas que comprenden mezclas de polímeros hidrosolubles y degradables hidrolíticamente tales como ácido poliláctico y alcohol polivinílico (conocidos con la referencia comercial M8630 y comercializados por Chris Craft en Prod. Of Gary, Ind., EE . UU.), además de plastificantes tales como glicerol, etilenglicerol , propilenglicol , sorbitol y mezclas de estos. Las bolsitas pueden comprender una composición para lavar la ropa o componentes parciales sólidos y/o una composición de limpieza y/o componentes parciales líquidos separados por la película hidrosoluble . El compartimento para los componentes líquidos puede tener una composición diferente que los compartimentos que contienen los sólidos. Ref : (US2009/0011970 Al) .
Los ingredientes del detergente se pueden separar físicamente unos de otros mediante compartimentos en bolsitas que se disuelven en agua o en diferentes capas de comprimidos. De este modo, pueden evitarse interacciones negativas entre los componentes durante el almacenamiento.
Los diferentes perfiles de disolución de cada uno de los compartimentos también pueden dar lugar a una disolución más tardía de los componentes seleccionados en la solución de lavado .
Formulaciones detergentes granuladas Un detergente granulado se puede formular según se describe en WO09/092699, EP1705241, EP1382668, WO07/001262, US6472364, WO04/074419 o WO09/102854. Se describen otras formulaciones detergentes útiles en WO09/124162, WO09/124163, WO09/117340, WO09/117341, O09/117342 , WO09/072069, WO09/063355, O09/132870, W009/121757, WO09/112296, WO09/112298, WO09/103822, WO09/087033, O09/050026, WO09/047125, WO09/047126, WO09/047127, WO09/047128, O09/021784, O09/010375, WO09/000605, WO09/122125, O09/095645, WO09/040544, W009/040545, WO09/024780, WO09/004295, WO09/004294, WO09/121725, WO09/115391, WO09/115392, O09/074398, WO09/074403, WO09/068501, WO09/065770, W009/021813, O09/030632 y WO09/015951, WO2011025615, O2011016958 , WO2011005803 , WO2011005623 , WO2011005730, WO2011005844, WO2011005904 , WO2011005630, WO2011005830, WO2011005912, WO2011005905, WO2011005910, WO2011005813, WO2010135238, WO2010120863 , WO2010108002, O2010111365, WO2010108000, O2010107635 , WO2010090915, O2010033976, WO2010033746, WO2010033747 , WO2010033897, WO2010033979, WO2010030540, WO2010030541 , O2010030539, WO2010024467, WO2010024469, WO2010024470, WO2010025161, WO2010014395, O2010044905, WO201014 5887, WO2010142503, WO2010122051 , WO2010102861, O2010099997, WO2010084039, WO2010076292 , O2010069742, WO2010069718, WO2010069957, O2010057784, WO2010054986, WO2010018043, WO2010003783, WO2010003792 , O201102 3716, WO2010142539, WO2010118959 , WO2010115813 , WO2010105942, O2010105961, O2010105952, WO2010094356, O2010084203 , WO2010078979, O2010072456, WO2010069905, WO2010076165, WO2010072603 , WO2010066486, O2010066631, WO2010066632 , O2010063689, WO2010060821, WO2010049187, WO2010031607 y WO2010000636.
Usos La presente invención también se refiere a métodos para utilizar las composiciones de esta .
Lavado de la ropa/artículos textiles/telas (lavado de ropa doméstico, lavado de la ropa industrial) Limpieza de superficies duras (lavado de platos automático, lavado de coches, superficie industrial) Uso en detergentes. Los polipéptidos de la presente invención se pueden añadir a una composición detergente y convertirse, de esta manera, en un componente de la composición detergente.
La composición detergente de la presente invención se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente para lavar ropa a mano o a máquina que incluye una composición aditiva para lavar ropa adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante de telas añadida en el aclarado, o se puede formular como una composición detergente para su uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas en general, o se puede formular para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.
La composición detergente se puede formular además en una forma de dosificación unitaria o en forma de una pastilla de jabón o una pastilla para lavar la ropa.
En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo del detergente que comprende un polipéptido de la presente invención según se ha descrito en la presente. En otro aspecto, la presente invención proporciona un detergente adecuado para lavar a temperaturas inferiores o iguales a 35 °C.
Métodos Rendimiento de lavado de la alfa-amilasa utilizando AMSA Con el fin de evaluar el rendimiento de lavado de las variantes de alfa-amilasas en una composición a base de detergente, se pueden realizar experimentos de lavado. Las enzimas se evalúan utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA, por sus siglas en inglés) . Con el ensayo AMSA, se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes enzimáticas de volumen pequeño. La placa A SA tiene una serie de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que aprieta con firmeza la muestra del artículo textil que se ha de lavar contra todos los orificios de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el artículo textil y la tapa se agitan enérgicamente para que la solución de ensayo entre en contacto con el artículo textil y para aplicar un estrés mecánico de modo regular, periódico y oscilante. Para consultar una descripción más detallada, remítase a WO02/42740, especialmente el párrafo "Modalidades especiales del método" en las páginas 23-24.
Descripción general del rendimiento de lavado Se prepara una solución de ensayo que comprende agua (15°dH) , 0.8 g/L de detergente, p. ej . , el detergente modelo A que se describe más adelante, o HCO3" 50 mM y la enzima de la invención, p. ej . , con una concentración de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.8 y/o 1.2 mg de proteína enzimática/L . Las telas manchadas con almidón (p. ej . , CS-28 del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT, Vlaardingen, Países Bajos) se añaden y se lavan durante 30 minutos a 20 °C, o como alternativa durante 20 minutos a 15 °C, o como alternativa durante 45 minutos a 15 °C, o como alternativa durante 20 minutos a 15 °C o 40 °C, según se especifica en los ejemplos. Después de un aclarado completo con agua del grifo y secado en la oscuridad, se miden a continuación los valores de intensidad o reflectancia de la luz de las telas manchadas, como una medida del rendimiento de lavado. Se utiliza como blanco una prueba con 0 mg de proteína enzimática/L para obtener un valor del incremento de reemisión (AREM) . Como alternativa, el rendimiento de lavado se compara con el de la alfa-amilasa original, donde se asigna un valor de 100 al resultado de rendimiento de la alfa-amilasa original y los resultados de las variantes se comparan con este valor. Preferentemente, se aplica una acción mecánica durante el paso de lavado, p. ej . , en forma de vibración, rotación o agitación de la solución de lavado con las telas.
Los experimentos de rendimiento de lavado AMSA se llevaron a cabo en las condiciones experimentales que se especifican a continuación: Tabla A: Condiciones experimentales Tabla B: Detergente modelo A La dureza del agua se ajustó a 15 °dH añadiendo CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca2+ : Mg2+ : HC03" = 4:1:7.5) al sistema de ensayo. Tras el lavado, los artículos textiles se aclararon con agua del grifo y se secaron.
Tabla C: Condiciones experimentales Tabla D: Detergente modelo X *E1 modelo X se mezcla sin AEO. El AEO se añade al lavado por separado. pH de lavado aproximado en agua de 12 °dH (Ca: Mg : HC03 = 2:1:4.5) La dureza del agua se ajustó a 12 °dH añadiendo CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca: Mg: HC03 = 2:1:4.5) al sistema de ensayo. Tras el lavado, los artículos textiles se aclararon con agua del grifo y se secaron.
El rendimiento de lavado se mide como el brillo del color del artículo textil lavado. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de la muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el rendimiento de lavado .
Las mediciones del color se realizan con un escáner de superficie plana profesional (Kodak iQsmart, Kodak) , el cual se utiliza para capturar una imagen del artículo textil lavado .
Con el fin de extraer un valor para la intensidad de la luz de las imágenes escaneadas, los valores en píxeles de 24 bits se convierten en valores para rojo, verde y azul (RBG, por sus siglas en inglés) . El valor de la intensidad (Int) se calcula añadiendo los valores RBG juntos como vectores y tomando a continuación la longitud del vector resultante: Artículos textiles: La muestra textil CS-28 (almidón de arroz sobre algodón) se ha obtenido del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Bajos.
Prueba de rendimiento de lavado utilizando vasos de precipi ados Este ensayo es un modelo a pequeña escala de una lavadora completamente cargada y se ha utilizado para evaluar el rendimiento de lavado de las amilasas.
La prueba de rendimiento de lavado en vasos de precipitados, utilizando vasos de precipitados de 250 mL y una varilla agitadora que proporciona un movimiento rotacional oscilante, de 180° en cada dirección, con una frecuencia de 80 por minuto, comprende los siguientes pasos: proporcionar 100 mL de solución de lavado (6 °C, 15 °dH, , pH de 8.0) que contiene NaHC03 50 mM y 0.4 mg/L de enzima; añadir dos muestras de CS-28 (5x5 cm) y dos muestras de E PA 162 (5x5 cm) a la solución de lavado para iniciar el lavado; fijar la velocidad de agitación a 80 rpm; detener la agitación después de 60 minutos, aclarar las muestras con agua del grifo fría; secar las muestras aclaradas en la oscuridad durante toda la noche; y evaluar el rendimiento de lavado midiendo la reemisión de luz incidente a 460 nm utilizando un instrumento Color-Eye según se describe más adelante .
Equipo y material Baño de agua (5 °C) con circulación; vasos de precipitados de vidrio (250 mL) ; un brazo rotatorio por cada vaso de precipitados con capacidad para 100 mL de solución de lavado; muestras de prueba: CS-28 (almidón de arroz sobre algodón) del Center for Testmaterials BV, Vlaardingen, Países Bajos, y EMPA 162 (almidón de arroz sobre algodón/poliéster) de EMPA Testmaterials AG, St . Gallen, Suiza, las muestras se cortan en trozos de 5 x 5 cm.
Solución de lavado: amortiguador de NaHC03 50 mM, pH de 8.0, dureza del agua: 15 °dH, proporción de calcio :magnesio de 4:1.
Solución patrón de amilasa: 1 mg de proteína enzimática por mL. - Se utiliza una solución de Tritón X-100 al 0.1 % (p/v) y CaCl2 0.1 mM en agua ultrapura (agua MilliQ) para la dilución de la amilasa (amortiguador de dilución de la amilasa) .
Medición con Color-Eye El rendimiento de lavado se expresa como el valor del incremento de la reemisión (ARem) . Las evaluaciones de la reflectancia de la luz de las muestras se realizaron utilizando un espectrofotómetro de reflectancia Macbeth Color Eye 7000 con un orificio oval muy pequeño, es decir, de 0.7 cm2 (-0.7 x 1.0 cm) . Las mediciones se realizaron sin UV en la luz incidente y se extrajo la reemisión a 460 nm. La muestra que se ha de evaluar se colocó sobre otra muestra del mismo tipo antes de evaluarla para reducir la reflexión del pistón que empuja la muestra contra el orificio en el cual se realiza la medición. Los valores del incremento de la reemisión para muestras individuales se calcularon restando el valor de reemisión de la muestra lavada sin amilasa añadida (control) del valor de reemisión de la muestra lavada con amilasa.
Rendimiento de lavado de las alfa-amilasas utilizando un robot de minilavado El robot de minilavado es un modelo a pequeña escala de una lavadora y se ha utilizado para evaluar el rendimiento de lavado de las amilasas.
En vasos de precipitados de 100 mL, se añaden 60 mL de solución de lavado, la cual se calienta hasta 15°C o 40°C. A continuación, se añade la enzima (concentraciones: 0.00; 0.015; 0.05; 0.25; 0.50; 1.00 mg de proteína enzimática/L) . El artículo textil (CS-28; almidón de arroz sobre algodón) colocado sobre una rejilla se sumerge en la solución de lavado que contiene una concentración determinada de enzima y se lava durante 20 minutos. Tras el lavado, el artículo textil colocado sobre la rejilla se seca en cámaras de secado sin calentamiento. La reemisión del artículo textil se mide a 460 nm utilizando un espectrofotómetro MCS 521 VIS de ZEISS. Los valores del incremento de la reemisión para un artículo textil individual se calcularon restando el valor de reemisión del artículo textil lavado sin amilasa añadida (control) del valor de reemisión del artículo textil lavado con amilasa.
Ensayo de pNP-G7 para determinar la actividad alfa-amilasa La actividad alfa-amilasa se puede determinar mediante un método que emplea el sustrato G7-pNP. G7-pNP, que es una abreviación para 4 , 6-etiliden (G7) -p-nitrofenil (Gi) -a, D-maltoheptaósido, es un oligosacárido bloqueado que puede ser escindido por una endo-amilasa tal como una alfa-amilasa . Tras la escisión, la alfa-glucosidasa incluida en el kit digiere el sustrato hidrolizado adicionalmente para liberar una molécula de p-nitrofenol (pNP) libre, que presenta una coloración amarilla y, por lo tanto, se puede medir mediante espectrometría visible a ? = 405 nm (400-420 nm) . Los kits que contienen el sustrato G7-pNP y la alfa-glucosidasa son producidos por Roche/Hitachi (N.° de cat. 11876473) .
REACTIVOS : El sustrato G7-pNP de este kit contiene 4 , 6-etiliden-G7-pNP 22 mM y HEPES 52.4 mM (ácido 2 - [4- ( 2 -hidroxietil) - 1 -piperazinil] etanosulfónico) , pH de 7.0) .
El reactivo alfa-glucosidasa contiene HEPES 52.4 mM, NaCl 87 mM, MgCl2 12.6 mM, CaCl2 0.075 mM, > 4 kU/L de alfa-glucosidasa) .
La solución de trabajo del sustrato se prepara mezclando 1 mL del reactivo alfa-glucosidasa con 0.2 mL del sustrato G7-pNP. Esta solución de trabajo del sustrato se prepara inmediatamente antes de utilizarla.
Amortiguador de dilución: MOPS 50 mM, un 0.05% (p/v) de Tritón X100 (éter p- (1 , 1 , 3 , 3 -tetrametilbutil ) fenil polietilenglicólico (C14H220 (C2H40) n (n = 9-10))), CaCl2 1 mM, pH de 8.0.
PROCEDIMIENTO: La muestra de amilasa que se ha de analizar se diluyó con amortiguador de dilución para garantizar que el pH de la muestra diluida fuera de 7. El ensayo se llevó a cabo transfiriendo muestras de enzimas diluidas de 20 µ??? a una placa de microvaloracion de 96 pocilios y añadiendo 80 \ih de solución de trabajo del sustrato. La solución se mezcló y se preincubó durante 1 minuto a temperatura ambiente, y se midió la absorción cada 20 s durante 5 minutos con una DO de 405 nm.
La pendiente (absorbancia por minuto) de la curva de absorción en función del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión en el conjunto determinado de condiciones. La muestra de amilasa se debe diluir hasta un nivel en el cual la pendiente sea inferior a 0.4 unidades de absorbancia por minuto.
Determinación de la unión al almidón Principio del ensayo: Las variantes de las amilasas se incuban en presencia o ausencia de almidón de arroz crudo insoluble con un valor de pH seleccionado, comprendido en el intervalo de pH de 4.0 a 11.0, dependiendo del valor de pH deseado para la aplicación de las alfa-amilasas que se han de seleccionar, p. ej . , para aplicaciones de detergentes el pH se selecciona convenientemente en el área alcalina tal como un pH de 8.0 o un pH de 10.0; durante un tiempo seleccionado, en general entre 5 minutos y una hora, preferentemente comprendido en el intervalo de 10 a 30 min tal como 10 min o 30 minutos; y a una temperatura seleccionada, en general comprendida en el intervalo de 0 °C a 30 °C, preferentemente a 4 °C. Después de la centrifugación, se determina la actividad amilasa en los sobrenadantes. La diferencia de actividad de las muestras incubadas en presencia y ausencia de almidón de arroz es una medida de la unión de la amilasa al almidón insoluble.
Materiales y métodos: Almidón de arroz (Sigma Inc , N.° de cat. S7260) , HEPES, Cloruro de calcio, Tritón X-100, Glicina, kit de ensayo para amilasas EnzChek Ultra (Life Technologies, N.° de cat. E33651) , placas de 96 micropocillos para la incubación y dilución (Nunc, N.° de cat. 269620) y placas de 96 pocilios con la mitad del área negra para las mediciones de fluorescencia (Corning, N.° de cat. 3694).
El amortiguador de ensayo contenía HEPES 50 mM (pH de 8.0), CaCl2 0.1 mM y un 0.01% de Tritón X-100. Las soluciones de proteínas enzimáticas se diluyeron hasta 0.15 mg/mL con el amortiguador de ensayo. El amortiguador de unión de pH elevado contenía Glicina-NaOH 50 mM (pH de 10.0) y un 0.01% de Tritón X-100. La solución de almidón de arroz (2.5%) se preparó en el amortiguador de ensayo para las variantes de la SEQ ID NO: 14 y en amortiguador de unión de pH elevado para las variantes de la SEQ ID NO : 2. La solución de sustrato del kit para amilasas EnzCheck Ultra se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se diluyó hasta 50 µg/mL en el amortiguador de ensayo. a) Se añadieron 100 µ?. de amortiguador con o sin almidón de arroz (2.5%) a una placa de 96 pocilios y se preincubaron a 4 °C durante 30 min. b) Se añadieron 20 ih de las soluciones de enzimas a los pocilios anteriores y la placa se colocó en una mezcladora y se mezcló a 900 rpm durante 30 min a 4 °C. c) La placa se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min a 4 °C para que el almidón se sedimentara y el sobrenadante se retiró cuidadosamente y se diluyó hasta aproximadamente 1250 veces en el amortiguador de ensayo, de manera que la concentración de proteína fuera de aproximadamente 20 ng/mL. d) Se añadieron 25 µL de las muestras de enzimas diluidas a las placas de 96 pocilios con la mitad del área negra que contenían 25 ih de la solución de sustrato del kit para amilasas EnzCheck Ultra y la placa se colocó inmediatamente en un lector de placas para realizar las mediciones de fluorescencia. e) El cambio de la intensidad de fluorescencia (ñF.I.) se midió a 25 °C durante 30 min con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 512 nm. Las lecturas de fluorescencia entre los intervalos de tiempo de 0.5 a 5 tnin se consideraron para el cálculo de la actividad, es decir, el cambio de la intensidad de fluorescencia por min (AF.I./min) . 5 Actividad sin almidón -Actividad con almidón Unión (%) = X 100 Actividad sin almidón Unión para las variantes Unión respecto al progenitor = Union para el progenitor EJEMPLOS Ejemplo 1: Determinación de la unión a amilosa y -1-O rendimiento de lavado Utilizando el método para medir la unión a almidón y la prueba de rendimiento de lavado AMSA que se han descrito en la sección de los métodos, se analizaron una serie de amilasas y variantes de estas para determinar su unión a 15 amilosa y su rendimiento de lavado.
El análisis de unión se llevó a cabo a un pH de 8.0, con un periodo de unión de 10 minutos y a una temperatura de 4 °C. La unión se evaluó utilizando amilosa al 5% (p/v) (Sigma A0512) y la prueba de rendimiento de lavado se llevó a cabo 20 según se ha descrito para la prueba de rendimiento de lavado AMSA utilizando el Detergente modelo A y una dosis de enzima de 0.4 mg de proteína enzimática/L de solución de lavado y una temperatura de lavado de 15 °C. El tiempo de lavado fue de 45 minutos. 25 Los resultados se presentan en la Tabla 1 a continuación. existe una correlación inversa entre la fracción unida al almidón y el rendimiento de lavado.
Ejemplo 2: Determinación de la unión a almidón de arroz crudo y rendimiento de lavado Principio : El principio es el mismo que el descrito en el Ejemplo 1, con la única diferencia que se utilizó una suspensión al 5% (p/v) de almidón de arroz (Sigma S7260) en lugar de amilasa. El análisis de unión se llevó a cabo a un pH de 8.0, con un periodo de unión de 10 minutos y a una temperatura de 4 °C.
Ejemplo 3: Determinación de la unión a amilopectina El principio es el mismo que el descrito en el Ejemplo 1, con la única diferencia que se utilizó una suspensión al 5% (p/v) de amilopectina (de Fluka) de maíz en lugar de amilosa .
Ejemplo 4: Variantes de la alf -amilasa de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 13) Se prepararon variantes de la alfa-amilasa de 23. 4 licheniformis que contenía la SEQ ID NO: 13. Las variantes evaluadas presentaron una unión al almidón menor y un rendimiento de lavado mejor en comparación con la alfa-amilasa original que contenía la SEQ ID NO: 13.
El análisis de unión se llevó a cabo a un pH de 8 , con un 5% (p/v) de almidón de arroz insoluble, con un periodo de unión de 10 minutos y a una temperatura de 5 °C.
El rendimiento de lavado de las variantes se evaluó mediante el uso de un minilavado empleando las condiciones descritas en "Rendimiento de lavado de las alfa-amilasas utilizando un robot de minilavado" y demostró que las variantes presentan un rendimiento de lavado mejorado utilizando 0.5 mg/L a 40 °C en comparación con la alfa-amilasa original de Bacillus licheniformis . El tiempo de lavado fue de 20 minutos.
Rendimiento de lavado = Valor (Variante - Blanco) / Valor (Termamyl - Blanco) * 100 Ejemplo 5: Variantes de la alfa-amilasa de Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2) Se generaron variantes adicionales de la alfa-amilasa que contenía la SEQ ID NO: 2 y las variantes se evaluaron para determinar la unión al sustrato y el rendimiento de lavado según el ensayo AMSA utilizando 0.3 mg de proteína enzimática/L a 15 °C durante 20 minutos con el Detergente modelo X.
El análisis de unión se llevó a cabo a un pH de 10.0, con un 2.5% (p/v) de almidón de arroz insoluble, con un periodo de unión de 10 minutos y a una temperatura de 4°C.
El rendimiento de lavado se indica con relación al rendimiento de lavado de la alfa-amilasa original que contiene la SEQ ID NO: 2 con las modificaciones H183*+G184* Ejemplo 6: Variantes de la alfa-amilasa de Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2) Se generaron variantes adicionales de la alfa-amilasa que contenía la SEQ ID NO: 2, las variantes se evaluaron para determinar la unión al sustrato y el rendimiento de lavado a temperatura baja, y se seleccionaron las variantes que presentaron una unión al sustrato menor que la alfa-amilasa original que contenía la SEQ ID NO: 2 con las modificaciones H183*+G184*. Las pruebas de lavado AMSA se realizaron utilizando 0.3 mg de proteína enzimática/L a 15 °C durante 20 minutos con el Detergente modelo X.
El rendimiento de lavado se indica con relación al rendimiento de lavado de la alfa-amilasa original que contiene la SEQ ID NO: 2 con las modificaciones H183*+G184*.
Ejemplo 7: Variantes de la alfa-amilasa de Bacillus sp 707 (SEQ ID NO: 2) Se generaron variantes adicionales de la alfa-amilasa que contenía la SEQ ID NO: 2, las variantes se evaluaron para determinar la unión al sustrato y el rendimiento de lavado a temperatura baja, y se seleccionaron las variantes que presentaron una unión al sustrato menor que la alfa-amilasa original que contenía la SEQ ID NO: 2 con las modificaciones H183*+G184*. Las pruebas de lavado AMSA se realizaron utilizando 0.3 mg de proteína enzimática/L a 15 °C durante 20 minutos con el Detergente modelo X.
El análisis de unión se llevó a cabo a un pH de 8.0, con un periodo de unión de 10 minutos y a una temperatura de 4 °C.
El rendimiento de lavado se indica con relación al rendimiento de lavado de la alfa-amilasa original que contiene la SEQ ID NO: 2 con las modificaciones H183*+G184*.
La invención descrita y reivindicada en la presente no debe estar limitada en cuanto a su alcance por los aspectos específicos que se describen en la presente, ya que se pretende que estos aspectos sean ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualesquiera aspectos equivalentes queden incluidos en el alcance de esta invención. Además, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones queden incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluidas las definiciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para el cribado de alfa-amilasas que presentan un rendimiento elevado a temperatura baja, caracterizado porque comprende los pasos de a) determinar la unión de las alfa-amilasas a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón,- b) seleccionar las alfa-amilasas que presenten una unión al sustrato baja.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las alfa-amilasas presentan un rendimiento de lavado elevado a temperatura baja.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las alfa-amilasas presentan menos de un 90% de la unión a almidón de la alfa-amilasa que presenta la SEQ ID NO: 8, preferentemente menos de un 80%, preferentemente menos de un 70%, preferentemente menos de un 65%, preferentemente menos de un 60%, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
4. Un método para seleccionar variantes de una alfa-amilasa original, caracterizado porque comprende los pasos de a) generar variantes mediante la sustitución, supresión o inserción de uno o más residuos aminoacídicos en uno o más aminoácidos situados en la superficie de la alfa-amilasa original; b) evaluar las variantes para determinar su unión a un sustrato sólido o inmovilizado para la alfa-amilasa tal como almidón; c) seleccionar las variantes que presenten una unión al sustrato menor que la de la alfa-amilasa original.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la alfa-amilasa original se selecciona entre amilasas que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial respecto a una de las SEQ ID NO: 1-15.
6. El método de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque las variantes presentan menos de un 90% de la unión a almidón de la alfa-amilasa original, preferentemente menos de un 80%, preferentemente menos de un 70%, preferentemente menos de un 65%, preferentemente menos de un 60%, preferentemente menos de un 50% de la unión, preferentemente menos de un 40% de la unión, preferentemente menos de un 30% de la unión, más preferentemente menos de un 20% de la unión y, de la forma más preferida, menos de un 10% de la unión.
7. Un polipéptido variante, caracterizado porque presenta actividad alfa-amilasa y que presenta al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97 % de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a una de las SEQ ID NO: 1-15, la variante se obtiene a partir de una alfa-amilasa original mediante una o más (p. ej . , varias) modificaciones seleccionadas entre sustituciones, inserciones y deleciones, donde la alfa-amilasa variante presenta una unión al almidón sólido menor y un rendimiento de lavado más elevado a temperatura baja, p. ej . , 15 °C, en comparación con la alfa-amilasa original .
8. La alfa-amilasa variante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque se ha modificado un residuo aminoacidico en uno o más sitios de unión al sustrato en la superficie de la molécula.
9. La alfa-amilasa variante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque se selecciona de entre : a) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 2 y que comprenden una supresión de las posiciones 181+182 o 182+183 o 183+184 y además una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, 284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 2; b) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 5 y que comprenden una supresión de las posiciones 181+182 o 182+183 o 183+184 y comprenden además una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a W140, W159, W167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, 439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 5 ; c) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 4 y que comprenden una supresión de las posiciones 181+182 o 182+183 o 183+184 y comprenden además una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a W140, 159, 167, Q169, W189, E194, F262, W284, F289, G304, G305, K320, W347, 439, W469, G476 y G477 en la SEQ ID NO: 4 ; d) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 13 y que comprenden una modificación en cualquiera de las posiciones correspondientes a W138, W157, W165, E167, W184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, K315, W342, R437, W467 y G475 en la SEQ ID NO: 13; e) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 14 y que comprenden una supresión de las posiciones 176+177 o 177+178 o 178+179 y comprenden además una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a W136, W155, W163, E165, 184, E189, E255, F257, F279, F284, G299, G300, R315, W342, R437, W467 y G475 en la SEQ ID NO: 14; y f) alfa-amilasas variantes que presentan al menos un 80% de identidad secuencial, preferentemente al menos un 85% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 90% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 95% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 97% de identidad secuencial, más preferentemente al menos un 98% de identidad secuencial y, de la forma más preferida, al menos un 99% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 15 y que comprenden una supresión de las posiciones 179+180 o 180+181 o 181+182 y comprenden además una o dos o más modificaciones en cualquiera de las posiciones correspondientes a 139, W158, 166, E168, 187, E192, F260, F287, G302, G303, W345, W437, 467, G474 y G475 en la SEQ ID NO: 15 donde las modificaciones en a-f son preferentemente sustituciones .
10. La alfa-amilasa variante de de conformidad con las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque presenta al menos un 90% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 2 y que comprende modificaciones en las posiciones que corresponden a las siguientes posiciones en la SEQ ID NO: 2: H183*+G184*+W140F; H183*+G184*+Q169N; H183*+G184*+Q169A; H183*+G184*+W189Y+E190P; H183*+G184*+N260D; H183*+G184*+G477E; H183*+G184*+G477Q; H183*+G184*+G477K; H183*+G184*+W189E+E190P; H183*+G184*+A51I+W140Y; H183*+G184*+W140Y+W189E; H183*+G184*+W140Y+N260P; H183*+G184*+W140Y+W284D; H183*+G184*+W140Y+G476R; H183*+G184*+W140Y+G477E; H183*+G184*+W189E+W439R; H183*+G184*+W284D+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R; H183*+G184*+W439R+G477E; H183*+G184*+E194D; H183*+G184*+W439R+D467K; H183*+G184*+R320M+W439R; H183*+G184*+W439R+K485R; H183*+G184*+Y160S; H183*+G184*+W189F+E190P; H183*+G184*+F262A; H183*+G184*+Y363H; H183*+G184*+G476E; H183*+G184*+N260P+W439R; H183*+G184*+N260P+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R; H183*+G184*+K72S+W140Y; H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G; H183*+G184*+E194S; H183*+G184*+E345D+G477R; H183*+G184*+K302N+W439R; H183*+G184*+R320K+W439R H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439R+W469Y+G476K+G4 E; H183*+G184*+ 159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E; H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260G+W439R+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+W439Y; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+W439Y+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+W469Y+G476R; H183*+G184*+W167F+N260D+F262P+P380Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+W469V+G476Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469Y+G476E+G477 ; H183*+G184*+ 159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+N260D+F262P+W469Y+G476R+G477Q; H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q y H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
11. La alfa-amilasa variante de conformidad con 1 reivindicación 10, caracterizada porque está constituida po la SEQ ID NO: 2 con una modificación seleccionada entre: H183*+G184*+W140F; H183*+G184*+Q169N; H183*+G184*+Q169A; H183*+G184*+W189Y+E190P; H183*+G184*+N260D; H183*+G184*+G477E H183*+G184*+G477Q H183*+G184*+G477K H183*+G184*+W189E+E190P; H183*+G184*+A51I+W140Y; H183*+G184*+W140Y+W189E H183*+G184*+W140Y+N260P H183*+G184*+W140Y+W284D H183*+G184*+W140Y+G476R H183*+G184*+W140Y+G477E H183*+G184*+W189E+W439R; H183*+G184*+W284D+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R; H183*+G184*+W439R+G477E; H183*+G184*+E194D; H183*+G184*+W439R+D467K; H183*+G184*+R320M+W439R; H183*+G184*+ 439R+K485R; H183*+G184*+Y160S; H183*+G184*+W189F+E190P; H183*+G184*+F262A; H183*+G184*+Y363H; H183*+G184*+G476E; H183*+G184*+N260P+W439R; H183*+G184*+N260P+G477E; H183*+G184*+W439R+G476R; H183*+G184*+K72S+W140Y; H183*+G184*+G109A+M202L+Y203G; H183*+G184*+E194S; H183*+G184*+E345D+G477R; H183*+G184*+K302N+W439R; H183*+G184*+R320K+W439R H183*+G184*+W159Y+W167Y+F262P+W439R+W469Y+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260D+W439Y+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476E+G477K; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+ 439R+W469Y+G476K+G4 E; H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W439V+W469Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+F262P+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+W469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260G+W439R+ 469Y; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+G476Q+G477E; H183*+G184*+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477R; H183*+G184*+W159Y+ 167F+N260G+ 439R+W469Y+G476R; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+F262P+ 439Y; H183*+G184*+ 159Y+W167F+N260P+ 439Y+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W167Y+N260D+W439R+W469V+G476Q+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+F262P+W439R+G476E+G477K; H183*+G184*+ 159Y+ 167F+N260P+F262P+ 439Y+W469Y+G476R; H183*+G184*+ 167F+N260D+F262P+P380Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439R+ 469V+G476Q+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+F262P+W439V+ 469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260D+W439R+ 469V+G476E+G477K; H183*+G184*+W167Y+N260D+ 439R+W469Y+G476E+G477K; H183*+G184*+ 159Y+W167Y+N260D+G476E+G477Q; H183*+G184*+W159Y+W167F+N260P+F262P+W439Y+G476K+G477Q; H183*+G184*+N260D+F262P+ 469Y+G476R+G477Q; H183*+G184*+W167Y+L230I+N260P+ 469Y; H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q y H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q.
12. La alfa-amilasa variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque presenta al menos un 90% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 14 y que comprende modificaciones en las posiciones que corresponden a las siguientes posiciones en la SEQ ID NO: 14: E178*+G179* ; E178*+G179*+T36N; E178*+G179*+W136Y; E178*+G179*+W155Y; E178*+G179*+W155F; E178*+G179*+W163Y; E178*+G179*+G299E; E178*+G179*+G299K; E178*+G179*+G299R; E178*+G179*+R315M; E178*+G179*+R315A; E178*+G179*+R315Q y E178*+G179*+W342Y.
13. La variante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque está constituida por la SEQ ID NO: 14 con una modificación seleccionada entre: E178*+G179* ; E178*+G179*+T36N; E178*+G179*+W136Y; E178*+G179*+W155Y; E178*+G179*+W155F; E178*+G179*+W163Y; E178*+G179*+G299E; E178*+G179*+G299K; E178*+G179*+G299R; E178*+G179*+R315M; E178*+G179*+R315A; E178*+G179*+R315Q y E178*+G179*+W342Y.
14. La alfa-amilasa variante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque presenta al menos un 90% de identidad secuencial respecto a la SEQ ID NO: 13 y que comprende modificaciones en las posiciones que corresponden a la posición K315 y/o W467 en la SEQ ID NO:
15. La variante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque está constituida por la SEQ ID NO: 13 con una sustitución K315M.
16. Una composición detergente, caracterizada porque comprende una alfa-amilasa variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-15.
17. El uso de una alfa-amilasa variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-15, para un proceso de limpieza tal como el lavado de la ropa o la limpieza de superficies duras, incluido el lavado de platos automatizado.
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