JP5647976B2 - 変異体微生物プロテアーゼを含む組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質工学及び変異体プロテアーゼに用いられる方法を提供する。特に、本発明は、部位評価ライブラリーを利用する方法を提供する。本発明はさらに、様々な用途に適するズブチリシン変異体を提供する。

セリン・プロテアーゼは、広範囲の特異性及び生物学的機能を有する多様な種類の酵素を含むカルボニル加水分解酵素のサブグループである。多くの研究が、ズブチリシンについて、主に洗浄及び栄養の適用におけるその有用性のために行なわれてきた。さらなる研究は、各種用途で不利にこれらの酵素の機能性に影響を与え得る、有害な環境要因（例えば酸化剤、キレート剤、極端な温度及び／またはｐＨへの暴露）に注目されてきた。それにもかかわらず、これらの有害な条件に耐えることができ、当該技術分野で現在既に知られるものよりも改良された活性を保持するか、有していることが出来る酵素系のための技術における必要性が残る。

多様なタンパク質工学の方法が、当業者に既に知られている。一般に、タンパク質は所望のタンパク質特性を得るために修飾される。大部分の方法において、タンパク質をコードするクローン遺伝子のヌクレオチド配列は、変異させられる。また、修飾遺伝子は、突然変異体を生産するために発現され、前記突然変異体は目的の活性のためにスクリーニングされる。しばしば、前記突然変異体の特性は、野生型タンパク質の特性と比較される。

歴史的に、タンパク質設計の過程は、所望の適用に最適な配列のものを、全てのタンパク質空間に見つける課題と等価なものとして検討されてきた。この課題は非常に難しく、「ＮＰ困難（ＮＰ ｈａｒｄ）」である。複雑性理論において、クラスＰにおけるものとして定義された課題は、容易かつ効率的であると考えられ、多項式時間アルゴリズムはそれらの解決のために存在する。ＮＰ困難な課題は、効率的な多項式時間アルゴリズムが現在知られていない課題である。また、いずれかのＮＰ困難な課題を解決することができた場合、全てのＮＰ困難な課題を解決することが出来るかもしれない（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ及びＷｉｎｆｒｅｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．、第１５巻、７７９−７８２頁、２００２年を参照されたい）。ライブラリーを構築し、スクリーニングするための現在の戦略は一般に、タンパク質内の全体の配列を無作為に横断して、または所定の位置での制御された無作為な方法でタンパク質の配列多様性を生産することに関与する。これらのライブラリーは一般に、目的の主要特性に関して「陰性」である多数の構成要素を有し、比較的少数の陽性の変異を見つけるために多数の構成要素がスクリーニングされることを必要とする。一般に、陰性の変異は無視され、陽性の構成要素に対する配列情報のみが取得される。

飽和突然変異誘発（世界バイオテクノロジー報告（Ｗｏｒｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ）、１９８４年、第２巻：アメリカ合衆国、オンライン出版物、ロンドン、１９８４年、１８１−１８７頁内のＥｓｔｅｌｌ他及びＷｅｌｌｓ他、Ｇｅｎｅ、第３４巻、３１５−３２３頁、１９８５年）は、タンパク質内のいくつかの特性を最適化する変異のためのタンパク質空間を探索するために使用することが出来る一技術である。いくつかのグループは、飽和突然変異誘発（Ｒｅｅｔｚ他、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｎ．、第４４巻、４１９２−４１９６頁、２００５年、加藤他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第３５１巻、６８３−６９２頁、２００５年及びＳａｎｄｂｅｒｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９０巻、８３６７−８３７１頁、１９９３年）により変更されるべき部位を同定するための戦略を開発したが、部位の同定のための一般的な系は提案されていない。

さらに、大部分のタンパク質工学の方法が、多くのアミノ酸変異の選択可能物を生産するため、多数の変異体のスクリーニングは一般に、所望のタンパク質特性を生産するために要求される。一般に、スクリーニングは有益な変異体を生産するために何度も繰り返される。従って、大抵の方法は、面倒かつ多くの時間を要する。タンパク質工学の方法の分野において、効率的かつ所望の結果を生産する持続的な必要性がある。

本発明は、タンパク質工学のための方法を提供する。特に、本発明は、部位評価ライブラリーを利用する方法を提供する。本発明は特に、それらの特性を最適化するライブラリーを合理的かつ効率的に設計するために、多くの所望の特性に関して得られた情報を用いる方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも二の所望の特性が改良されたライブラリーを設計する方法を提供する。

本発明は、タンパク質の所望の特性の改良に関連する、タンパク質のアミノ酸配列内の位置を同定する方法を提供する。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明は、どの変異が改良された特性と同様に、所望の特性を有するタンパク質を生産するために望ましいかを決定する方法を提供する。いくつかの追加の特に好ましい実施態様において、本発明は、野生型タンパク質より、特定の割合で優れた改良（例えば、一の特性について、野生型の１１０％より優れている）があるアミノ酸位置及び変異を同定する方法を提供する。さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも一の大いに改良された特性及び野生型タンパク質よりも有意に悪くない（例えば、一の特性について野生型の１１０％より優れているが、別の特性について野生型の９０％ほど悪くない）、少なくとも一の追加の特性を提供する変異を同定する方法を提供する。さらに別の好ましい実施態様において、ライブラリーは、この情報に基づいて構築される。いくつかの実施態様において、前記ライブラリーは同定された変異を全て用いて構築される一方、いくつかの他の実施態様において、前記ライブラリーは同定された変異のサブセットを用いて構築される。実際に、変異の任意特定の数及び／または型にライブラリーが制約されることは意図されない。

本発明は、以下の工程を含むタンパク質工学のための方法を提供する。すなわち、タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、目的の試験において、目的の少なくとも一の特性についてタンパク質変異体のライブラリーを試験する工程、前記目的の少なくとも一の特性について値域を同定する工程、目的の試験における好ましい結果に関連する値域内の最小値を同定する工程、及び前記目的の少なくとも一の特性の前記値域における前記最小値以上の少なくとも一の変異を有する、複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、少なくとも一の変異を含むタンパク質変異体のライブラリーであって、目的の試験における好ましい結果を有する構成要素が濃縮された前記ライブラリーを提供する工程である。いくつかの実施態様において、好ましい結果は、上記第１工程で示す前記試験において見られる最大値の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％より高い値に相当する。いくつかの他の実施例において、一以上の目的の試験が、本発明の前記方法で用いられる。いくつかの好ましい実施態様において、前記タンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる。

本発明はさらに、以下の工程を含むタンパク質工学のための方法を提供する。すなわち、タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、目的の試験において、目的の少なくとも二の特性についてタンパク質変異体のライブラリーを試験する工程、前記目的の少なくとも二の特性について値域を同定する工程、目的の試験における好ましい結果に関連する値域内の最小値を同定する工程、及び前記目的の少なくとも二の特性の前記値域の前記最小値以上の複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、目的の試験における好ましい結果を有する構成要素が濃縮されたタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程である。いくつかの好ましい実施態様において、好ましい結果は、上記第１工程で示す前記試験において見られる最大値の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％より高い値に相当する。いくつかの好ましい実施態様において、前記タンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる。

本発明はさらに、以下の工程を含むタンパク質工学のための方法を提供する。すなわち、野生型タンパク質及び野生型タンパク質のタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、目的の試験において、目的の少なくとも一の特性についてタンパク質変異体のライブラリー及び野生型タンパク質を試験する工程、前記目的の少なくとも一の特性について値域を同定する工程、目的の試験における好ましい結果に関連する値域内の最小値を同定する工程、野生型で得られた結果と比較して、好ましい結果を有するタンパク質変異体を同定する工程であって、好ましい結果は目的の改良された特性である、前記工程、及び前記目的の少なくとも一の特性の前記値域の前記最小値以上の複数のタンパク質変異体を提供し、それにより、目的の試験における好ましい結果を有する構成要素が濃縮された改良されたタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程である。いくつかの好ましい実施態様において、前記方法は、性能指数を測定する工程をさらに含む。ここで、前記性能指数は、改良されたタンパク質変異体の各々で得られた値を野生型タンパク質で得られた値で割ることにより算出される。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記方法は、改良されたタンパク質変異体を同定する工程をさらに含む。ここで、前記改良されたタンパク質変異体は、目的の試験で１．１を超える性能指数値に達する。いくつかの追加の実施態様において、前記タンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる。いくつかの他の実施態様において、前記タンパク質は抗体及び成長因子から選ばれる。さらに追加の好ましい実施態様において、野生型タンパク質は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる酵素の成熟形である。いくつかの好ましい実施態様において、前記目的の特性は、荷電、洗浄性能、硬質表面洗浄性能、溶解度、熱的安定性、保存安定性、洗剤安定性、基質結合能、酵素阻害能、発現レベル、反応速度及び基質分解能から選ばれる。いくつかの実施態様において、前記野生型タンパク質及び前記タンパク質変
異体は、少なくとも一の洗剤組成物の成分である。いくつかの好ましい実施態様において、洗浄性能は、５〜１２．０のｐＨを有する粉末または液体洗剤に配合された洗剤組成物で試験される。

本発明はさらに、以下の工程を含む、タンパク質の折りたたみ内における親タンパク質の改良された変異体を生産する方法を提供する。すなわち、目的の分析における目的の特性の範囲に及ぶタンパク質の折りたたみ内の試験タンパク質の複数の変異体を分析する工程、前記目的の分析における好ましい結果に関連する前記目的の特性の範囲内の最小値を同定する工程、前記目的の分析におけるタンパク質の折りたたみの親タンパク質を分析する工程、及び前記改良された変異体が前記目的の特性の範囲の最小値以上になるように、前記親タンパク質へのアミノ酸置換の導入により前記親タンパク質の改良された変異体を生産する工程である。いくつかの好ましい実施態様において、前記親タンパク質及び試験タンパク質が異なる。いくつかの実施態様において、前記方法は、性能指数を測定する工程をさらに含む。ここで、前記性能指数は、改良されたタンパク質変異体の各々で得られた値を野生型タンパク質で得られた値で割ることにより算出される。いくつかの実施態様において、前記試験タンパク質及び親タンパク質は酵素である。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる。いくつかの他の実施態様において、前記試験及び親タンパク質は、抗体及び成長因子から選ばれる。さらに追加の好ましい実施態様において、前記親タンパク質は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、金属プロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選ばれる酵素の成熟形である。いくつかの好ましい実施態様において、前記目的の特性は、荷電、洗浄性能、硬質表面洗浄性能、熱的安定性、溶解度、保存安定性、洗剤安定性、基質結合能、酵素阻害能、発現レベル、反応速度及び基質分解能から選ばれる。いくつかの別の実施態様において、前記試験及び親タンパク質は、少なくとも一の洗剤組成物の成分である。いくらかの他の実施態様において、前記改良されたタンパク質変異体は、洗剤組成物の成分である。いくつかの好ましい実施態様において、洗浄性能は、５〜１２．０のｐＨを有する粉末または液体洗剤に配合された洗剤組成物で試験される。

本発明はさらに、バチルス・ズブチリシンの単離されたズブチリシン変異体を提供する。ここで、前記ズブチリシン変異体は、タンパク質分解活性を有し、位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６５、６６、６７、７１、７２、７３、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４１、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０３、２０４、２０６、２０７、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２及び２７４から選ばれる一以上の位置での置換を含む成熟形である。ここで、前記位置は、配列番号２で示すＢ．アミロリケファシエンス
・ズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に対応した位置で番号付けされている。いくつかの実施態様において、前記一以上の位置は、１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６５、６６、６７、７１、７２、７３、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４１、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０３、２０４、２０６、２０７、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２及び２７４から選ばれる。ここで、前記位置は、配列番号２で示すＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に対応した位置で番号付けされている。いくつかの別の実施態様において、前記一以上の位置は、２、３
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２１、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４２、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６５、６６、６７、７１、７３、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、１０２、１０５、１０６、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２８、１２９、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６２、１６５、１６６、１６７、１６９、１７０、１７１、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８７、１８９、１９０、１９１、１９２、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０３、２０４、２０６、２０７、２１２、２１４、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５０、２５１、２５３、２５４、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３及び２７４から選ばれる。ここで、前記位置は、配列番号２で示すＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に対応した位置で番号付けされている。いくつかの実施態様において、前記ズブチリシン変異体は、１８、５２、７２、１１７、１１９、１２７、１４４、１８５、２０９及び２１３から選ばれる一以上の位置での置換をさらに含む。ここで、前記位置は、配列番号２で示すＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に対応した位置で番号付けされている。いくつかの好ましい実施態様において、前記置換は、位置Ａ００１Ｃ、Ａ００１Ｄ、Ａ０
０１Ｅ、Ａ００１Ｆ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｉ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｍ、Ａ００１Ｎ、Ａ００１Ｑ、Ａ００１Ｒ、Ａ００１Ｓ、Ａ００１Ｖ、Ａ００１Ｗ、Ｑ００２Ａ、Ｑ００２Ｄ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｇ、Ｑ００２Ｓ、Ｓ００３Ａ、Ｓ００３Ｄ、Ｓ００３Ｆ、Ｓ００３Ｇ、Ｓ００３Ｉ、Ｓ００３Ｋ、Ｓ００３Ｌ、Ｓ００３Ｍ、Ｓ００３Ｎ、Ｓ００３Ｐ、Ｓ００３Ｑ、Ｓ００３Ｒ、Ｓ００３Ｔ、Ｓ００３Ｖ、Ｓ００３Ｗ、Ｓ００３Ｙ、Ｐ００５Ｃ、Ｐ００５Ｅ、Ｐ００５Ｇ、Ｐ００５Ｑ、Ｐ００５Ｔ、Ｙ００６Ａ、Ｙ００６Ｃ、Ｙ００６Ｅ、Ｙ００６Ｆ、Ｙ００６Ｇ、Ｙ００６Ｋ、Ｙ００６Ｍ、Ｙ００６Ｎ、Ｙ００６Ｐ、Ｙ００６Ｑ、Ｙ００６Ｒ、Ｙ００６Ｔ、Ｙ００６Ｖ、Ｙ００６Ｗ、Ｓ００９Ａ、Ｓ００９Ｃ、Ｓ００９Ｅ、Ｓ００９Ｆ、Ｓ００９Ｇ、Ｓ００９Ｈ、Ｓ００９Ｋ、Ｓ００９Ｌ、Ｓ００９Ｍ、Ｓ００９Ｐ、Ｓ００９Ｑ、Ｓ００９Ｒ、Ｓ００９Ｔ、Ｓ００９Ｖ、Ｓ００９Ｗ、Ｑ０１０Ａ、Ｑ０１０Ｃ、Ｑ０１０Ｅ、Ｑ０１０Ｆ、Ｑ０１０Ｇ、Ｑ０１０Ｈ、Ｑ０１０Ｉ、Ｑ０１０Ｋ、Ｑ０１０Ｌ、Ｑ０１０Ｒ、Ｑ０１０Ｓ、Ｑ０１０Ｔ、Ｑ０１０Ｖ、Ｑ０１０Ｗ、Ｉ０１１Ｃ、Ｉ０１１Ｌ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０１１Ｖ、Ｉ０１１Ｙ、Ｋ０１２Ａ、Ｋ０１２Ｃ、Ｋ０１２Ｄ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｆ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｉ、Ｋ０１２Ｎ、Ｋ０１２Ｑ、Ｋ０１２Ｓ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０１２Ｖ、Ｋ０１２Ｗ、Ｋ０１２Ｙ、Ａ０１３Ｃ、Ａ０１３Ｆ、Ａ０１３Ｇ、Ａ０１３Ｈ、Ａ０１３Ｌ、Ａ０１３Ｒ、Ａ０１３Ｓ、Ａ０１３Ｔ、Ａ０１３Ｖ、Ｐ０１４Ａ、Ｐ０１４Ｃ、Ｐ０１４Ｄ、Ｐ０１４Ｅ、Ｐ０１４Ｆ、Ｐ０１４Ｇ、Ｐ０１４Ｋ、Ｐ０１４Ｌ、Ｐ０１４Ｍ、Ｐ０１４Ｎ、Ｐ０１４Ｑ、Ｐ０１４Ｒ、Ｐ０１４Ｓ、Ｐ０１４Ｔ、Ｐ０１４Ｖ、Ｐ０１４Ｗ、Ｐ０１４Ｙ、Ａ０１５Ｃ、Ａ０１５Ｄ、Ａ０１５Ｅ、Ａ０１５Ｆ、Ａ０１５Ｇ、Ａ０１５Ｈ、Ａ０１５Ｉ、Ａ０１５Ｋ、Ａ０１５Ｌ、Ａ０１５Ｍ、Ａ０１５Ｐ、Ａ０１５Ｑ、Ａ０１５Ｒ、Ａ０１５Ｔ、Ａ０１５Ｖ、Ａ０１５Ｙ、Ｌ０１６Ａ、Ｌ０１６Ｃ、Ｌ０１６Ｉ、Ｌ０１６Ｍ、Ｌ０１６Ｑ、Ｌ０１６Ｓ、Ｌ０１６Ｔ、Ｈ０１７Ｆ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｍ、Ｈ０１７Ｖ、Ｈ０１７Ｗ、Ｓ０１８Ａ、Ｓ０１８Ｅ、Ｓ０１８Ｆ、Ｓ０１８Ｇ、Ｓ０１８Ｈ、Ｓ０１８Ｉ、Ｓ０１８Ｋ、Ｓ０１８Ｌ、Ｓ０１８Ｍ、
Ｓ０１８Ｎ、Ｓ０１８Ｐ、Ｓ０１８Ｑ、Ｓ０１８Ｒ、Ｓ０１８Ｔ、Ｓ０１８Ｖ、Ｓ０１８Ｗ、Ｓ０１８Ｙ、Ｑ０１９Ａ、Ｑ０１９Ｃ、Ｑ０１９Ｄ、Ｑ０１９Ｅ、Ｑ０１９Ｇ、Ｑ０１９Ｉ、Ｑ０１９Ｋ、Ｑ０１９Ｍ、Ｑ０１９Ｒ、Ｑ０１９Ｔ、Ｑ０１９Ｖ、Ｇ０２０Ａ、Ｇ０２０Ｃ、Ｇ０２０Ｄ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｆ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｋ、Ｇ０２０Ｍ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｐ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｒ、Ｇ０２０Ｗ、Ｙ０２１Ａ、Ｙ０２１Ｃ、Ｙ０２１Ｄ、Ｙ０２１Ｅ、Ｙ０２１Ｆ、Ｙ０２１Ｇ、Ｙ０２１Ｈ、Ｙ０２１Ｋ、Ｙ０２１Ｍ、Ｙ０２１Ｒ、Ｙ０２１Ｓ、Ｙ０２１Ｔ、Ｙ０２１Ｖ、Ｙ０２１Ｗ、Ｔ０２２Ａ、Ｔ０２２Ｃ、Ｔ０２２Ｅ、Ｔ０２２Ｆ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｈ、Ｔ０２２Ｉ、Ｔ０２２Ｋ、Ｔ０２２Ｌ、Ｔ０２２Ｍ、Ｔ０２２Ｎ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ０２２Ｗ、Ｔ０２２Ｙ、Ｓ０２４Ｃ、Ｓ０２４Ｆ、Ｓ０２４Ｇ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｉ、Ｓ０２４Ｋ、Ｓ０２４Ｌ、Ｓ０２４Ｍ、Ｓ０２４Ｎ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｗ、Ｓ０２４Ｙ、Ｎ０２５Ｃ、Ｎ０２５Ｅ、Ｎ０２５Ｆ、Ｎ０２５Ｇ、Ｎ０２５Ｈ、Ｎ０２５Ｉ、Ｎ０２５Ｋ、Ｎ０２５Ｌ、Ｎ０２５Ｍ、Ｎ０２５Ｐ、Ｎ０２５Ｒ、Ｎ０２５Ｓ、Ｎ０２５Ｔ、Ｎ０２５Ｖ、Ｎ０２５Ｗ、Ｋ０２７Ａ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｆ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｈ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｗ、Ｋ０２７Ｙ、Ｓ０３３Ａ、Ｓ０３３Ｆ、Ｓ０３３Ｇ、Ｓ０３３Ｈ、Ｓ０３３Ｐ、Ｓ０３３Ｔ、Ｓ０３３Ｗ、Ｉ０３５Ａ、Ｉ０３５Ｄ、Ｉ０３５Ｒ、Ｉ０３５Ｓ、Ｉ０３５Ｔ、Ｉ０３５Ｖ、Ｄ０３６Ａ、Ｄ０３６Ｃ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ０３６Ｑ、Ｄ０３６Ｓ、Ｄ０３６Ｗ、Ｓ０３７Ａ、Ｓ０３７Ｃ、Ｓ０３７Ｅ、Ｓ０３７Ｆ、Ｓ０３７Ｇ、Ｓ０３７Ｈ、Ｓ０３７Ｋ、Ｓ０３７Ｌ、Ｓ０３７Ｍ、Ｓ０３７Ｐ、Ｓ０３７Ｑ、Ｓ０３７Ｒ、Ｓ０３７Ｔ、Ｓ０３７Ｗ、Ｈ０３９Ｃ、Ｈ０３９Ｑ、Ｈ０３９Ｔ、Ｈ０３９Ｖ、Ｐ０４０Ａ、Ｐ０４０Ｃ、Ｐ０４０Ｅ、Ｐ０４０Ｆ、Ｐ０４０Ｇ、Ｐ０４０Ｇ、Ｐ０４０Ｈ、Ｐ０４０Ｉ、Ｐ０４０Ｋ、Ｐ０４０Ｌ、Ｐ０４０Ｍ、Ｐ０４０Ｑ、Ｐ０４０Ｒ、Ｐ０４０Ｓ、Ｐ０４０Ｔ、Ｐ０４０Ｖ、Ｐ０４０Ｗ、Ｄ０４１Ｅ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０４２Ｖ、Ｋ０４３Ａ、Ｋ０４３Ｃ、Ｋ０４３Ｄ、Ｋ０４３Ｅ、Ｋ０４３Ｆ、Ｋ０４３
Ｇ、Ｋ０４３Ｉ、Ｋ０４３Ｌ、Ｋ０４３Ｍ、Ｋ０４３Ｎ、Ｋ０４３Ｒ、Ｋ０４３Ｓ、Ｋ０４３Ｔ、Ｋ０４３Ｖ、Ｋ０４３Ｗ、Ｋ０４３Ｙ、Ｖ０４４Ａ、Ｖ０４４Ｃ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ０４４Ｌ、Ｖ０４４Ｍ、Ｖ０４４Ｐ、Ｖ０４４Ｓ、Ｖ０４４Ｔ、Ａ０４５Ｃ、Ａ０４５Ｅ、Ａ０４５Ｆ、Ａ０４５Ｈ、Ａ０４５Ｉ、Ａ０４５Ｋ、Ａ０４５Ｍ、Ａ０４５Ｎ、Ａ０４５Ｐ、Ａ０４５Ｑ、Ａ０４５Ｓ、Ａ０４５Ｔ、Ａ０４５Ｖ、Ａ０４５Ｙ、Ｇ０４６Ａ、Ｇ０４６Ｃ、Ｇ０４６Ｅ、Ｇ０４６Ｈ、Ｇ０４６Ｋ、Ｇ０４６Ｍ、Ｇ０４６Ｎ、Ｇ０４６Ｑ、Ｇ０４６Ｔ、Ｇ０４６Ｗ、Ｇ０４６Ｙ、Ａ０４８Ｃ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｆ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｉ、Ａ０４８Ｋ、Ａ０４８Ｌ、Ａ０４８Ｍ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｒ、Ａ０４８Ｓ、Ａ０４８Ｔ、Ａ０４８Ｖ、Ａ０４８Ｗ、Ａ０４８Ｙ、Ｍ０５０Ａ、Ｍ０５０Ｃ、Ｍ０５０Ｆ、Ｍ０５０Ｈ、Ｍ０５０Ｉ、Ｍ０５０Ｌ、Ｍ０５０Ｑ、Ｍ０５０Ｒ、Ｍ０５０Ｓ、Ｍ０５０Ｔ、Ｍ０５０Ｖ、Ｍ０５０Ｗ、Ｍ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ａ、Ｖ０５１Ｃ、Ｖ０５１Ｄ、Ｖ０５１Ｅ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０５１Ｌ、Ｖ０５１Ｐ、Ｖ０５１Ｑ、Ｐ０５２Ｃ、Ｐ０５２Ｄ、Ｐ０５２Ｅ、Ｐ０５２Ｆ、Ｐ０５２Ｈ、Ｐ０５２Ｉ、Ｐ０５２Ｋ、Ｐ０５２Ｌ、Ｐ０５２Ｑ、Ｐ０５２Ｒ、Ｐ０５２Ｓ、Ｐ０５２Ｔ、Ｐ０５２Ｖ、Ｐ０５２Ｗ、Ｐ０５２Ｙ、Ｓ０５３Ｅ、Ｓ０５３Ｆ、Ｓ０５３Ｇ、Ｓ０５３Ｈ、Ｓ０５３Ｉ、Ｓ０５３Ｋ、Ｓ０５３Ｌ、Ｓ０５３Ｍ、Ｓ０５３Ｑ、Ｓ０５３Ｒ、Ｓ０５３Ｔ、Ｓ０５３Ｖ、Ｓ０５３Ｗ、Ｅ０５４Ａ、Ｅ０５４Ｎ、Ｅ０５４Ｑ、Ｅ０５４Ｓ、Ｔ０５５Ａ、Ｔ０５５Ｃ、Ｔ０５５Ｄ、Ｔ０５５Ｆ、Ｔ０５５Ｇ、Ｔ０５５Ｈ、Ｔ０５５Ｉ、Ｔ０５５Ｋ、Ｔ０５５Ｍ、Ｔ０５５Ｐ、Ｔ０５５Ｑ、Ｔ０５５Ｒ、Ｔ０５５Ｓ、Ｔ０５５Ｖ、Ｔ０５５Ｗ、Ｔ０５５Ｙ、Ｎ０５６Ｄ、Ｎ０５６Ｍ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｑ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｔ、Ｎ０５６Ｖ、Ｐ０５７Ｎ、Ｐ０５７Ｑ、Ｐ０５７Ｔ、Ｐ０５７Ｖ、Ｐ０５７Ｗ、Ｆ０５８Ｃ、Ｆ０５８Ｅ、Ｆ０５８Ｇ、Ｆ０５８Ｌ、Ｆ０５８Ｍ、Ｆ０５８Ｎ、Ｆ０５８Ｑ、Ｆ０５８Ｓ、Ｆ０５８Ｖ、Ｆ０５８Ｙ、Ｑ０５９Ａ、Ｑ０５９Ｃ、Ｑ０５９Ｄ、Ｑ０５９Ｅ、Ｑ０５９Ｆ、Ｑ０５９Ｇ、Ｑ０５９Ｈ、Ｑ０５９Ｋ、Ｑ０５９Ｌ、Ｑ０５９Ｍ、Ｑ０５９Ｎ、Ｑ０５９Ｐ、Ｑ０５９Ｒ、Ｑ０５９Ｓ、Ｑ０５９Ｔ、Ｑ０
５９Ｖ、Ｑ０５９Ｗ、Ｑ０５９Ｙ、Ｄ０６０Ｅ、Ｄ０６０Ｇ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｃ、Ｎ０６２Ｄ、Ｎ０６２Ｅ、Ｎ０６２Ｆ、Ｎ０６２Ｇ、Ｎ０６２Ｈ、Ｎ０６２Ｉ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｍ、Ｎ０６２Ｑ、Ｎ０６２Ｒ、Ｎ０６２Ｔ、Ｎ０６２Ｖ、Ｎ０６２Ｗ、Ｎ０６２Ｙ、Ｔ０６６Ｓ、Ｔ０６６Ｗ、Ｔ０６６Ｙ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｃ、Ｈ０６７Ｆ、Ｈ０６７Ｉ、Ｈ０６７Ｌ、Ｈ０６７Ｍ、Ｈ０６７Ｎ、Ｈ０６７Ｐ、Ｈ０６７Ｒ、Ｈ０６７Ｓ、Ｈ０６７Ｔ、Ｔ０７１Ｉ、Ｔ０７１Ｙ、Ｎ０７７Ｓ、Ｓ０７８Ａ、Ｓ０７８Ｃ、Ｓ０７８Ｄ、Ｓ０７８Ｆ、Ｓ０７８Ｇ、Ｓ０７８Ｉ、Ｓ０７８Ｋ、Ｓ０７８Ｌ、Ｓ０７８Ｍ、Ｓ０７８Ｎ、Ｓ０７８Ｐ、Ｓ０７８Ｑ、Ｓ０７８Ｒ、Ｓ０７８Ｔ、Ｓ０７８Ｖ、Ｓ０７８Ｗ、Ｓ０７８Ｙ、Ｉ０７９Ａ、Ｉ０７９Ｃ、Ｉ０７９Ｆ、Ｉ０７９Ｇ、Ｉ０７９Ｈ、Ｉ０７９Ｋ、Ｉ０７９Ｌ、Ｉ０７９Ｎ、Ｉ０７９Ｑ、Ｉ０７９Ｒ、Ｉ０７９Ｓ、Ｉ０７９Ｔ、Ｉ０７９Ｖ、Ｉ０７９Ｗ、Ｉ０７９Ｙ、Ｖ０８１Ｆ、Ｖ０８１Ｉ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｍ、Ｖ０８１Ｔ、Ｇ０８３Ｆ、Ｇ０８３Ｐ、Ｑ０８４Ａ、Ｑ０８４Ｃ、Ｑ０８４Ｈ、Ｑ０８４Ｉ、Ｑ０８４Ｎ、Ｑ０８４Ｔ、Ａ０８５Ｃ、Ａ０８５Ｆ、Ａ０８５Ｇ、Ａ０８５Ｒ、Ａ０８５Ｓ、Ｐ０８６Ａ、Ｐ０８６Ｄ、Ｐ０８６Ｅ、Ｐ０８６Ｇ、Ｐ０８６Ｍ、Ｐ０８６Ｎ、Ｐ０８６Ｑ、Ｐ０８６Ｒ、Ｐ０８６Ｓ、Ｐ０８６Ｗ、Ｐ０８６Ｙ、Ｓ０８９Ｃ、Ｓ０８９Ｄ、Ｓ０８９Ｅ、Ｓ０８９Ｆ、Ｓ０８９Ｇ、Ｓ０８９Ｈ、Ｓ０８９Ｋ、Ｓ０８９Ｌ、Ｓ０８９Ｖ、Ｓ０８９Ｗ、Ｓ０８９Ｙ、Ｌ０９０Ａ、Ｌ０９０Ｄ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｇ、Ｌ０９０Ｈ、Ｌ０９０Ｍ、Ｌ０９０Ｑ、Ｌ０９０Ｔ、Ｌ０９０Ｖ、Ｙ０９１Ａ、Ｙ０９１Ｃ、Ｙ０９１Ｄ、Ｙ０９１Ｅ、Ｙ０９１Ｆ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｌ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｑ、Ｙ０９１Ｓ、Ｙ０９１Ｔ、Ｙ０９１Ｖ、Ｌ０９６Ｆ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｌ０９６Ｋ、Ｌ０９６Ｍ、Ｌ０９６Ｖ、Ｇ０９７Ａ、Ｇ０９７Ｃ、Ｇ０９７Ｄ、Ｇ０９７Ｅ、Ｇ０９７Ｈ、Ｇ０９７Ｋ、Ｇ０９７Ｌ、Ｇ０９７Ｍ、Ｇ０９７Ｐ、Ｇ０９７Ｑ、Ｇ０９７Ｒ、Ｇ０９７Ｓ、Ｇ０９７Ｔ、Ｇ０９７Ｖ、Ａ０９８Ｃ、Ａ０９８Ｄ、Ａ０９８Ｆ、Ａ０９８Ｇ、Ａ０９８Ｈ、Ａ０９８Ｉ、Ａ０９８Ｌ、Ａ０９８Ｐ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｒ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ａ０９８Ｙ、
Ｄ０９９Ｃ、Ｄ０９９Ｅ、Ｄ０９９Ｉ、Ｄ０９９Ｋ、Ｄ０９９Ｌ、Ｄ０９９Ｎ、Ｄ０９９Ｐ、Ｄ０９９Ｑ、Ｄ０９９Ｒ、Ｄ０９９Ｓ、Ｄ０９９Ｔ、Ｓ１０１Ｃ、Ｓ１０１Ｅ、Ｓ１０１Ｆ、Ｓ１０１Ｇ、Ｓ１０１Ｉ、Ｓ１０１Ｋ、Ｓ１０１Ｌ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１０１Ｐ、Ｓ１０１Ｑ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０１Ｔ、Ｓ１０１Ｖ、Ｓ１０１Ｙ、Ｇ１０２Ａ、Ｇ１０２Ｃ、Ｇ１０２Ｅ、Ｇ１０２Ｆ、Ｇ１０２Ｉ、Ｇ１０２Ｎ、Ｇ１０２Ｓ、Ｇ１０２Ｖ、Ｇ１０２Ｙ、Ｑ１０３Ａ、Ｑ１０３Ｃ、Ｑ１０３Ｅ、Ｑ１０３Ｆ、Ｑ１０３Ｇ、Ｑ１０３Ｉ、Ｑ１０３Ｋ、Ｑ１０３Ｌ、Ｑ１０３Ｍ、Ｑ１０３Ｎ、Ｑ１０３Ｒ、Ｑ１０３Ｓ、Ｑ１０３Ｔ、Ｑ１０３Ｖ、Ｑ１０３Ｗ、Ｓ１０５Ａ、Ｓ１０５Ｄ、Ｓ１０５Ｅ、Ｓ１０５Ｆ、Ｓ１０５Ｇ、Ｓ１０５Ｉ、Ｓ１０５Ｋ、Ｓ１０５Ｌ、Ｓ１０５Ｍ、Ｓ１０５Ｎ、Ｓ１０５Ｐ、Ｓ１０５Ｒ、Ｓ１０５Ｖ、Ｓ１０５Ｗ、Ｗ１０６Ａ、Ｗ１０６Ｃ、Ｗ１０６Ｅ、Ｗ１０６Ｆ、Ｗ１０６Ｇ、Ｗ１０６Ｈ、Ｗ１０６Ｉ、Ｗ１０６Ｌ、Ｗ１０６Ｍ、Ｗ１０６Ｎ、Ｗ１０６Ｒ、Ｗ１０６Ｓ、Ｗ１０６Ｔ、Ｗ１０６Ｖ、Ｗ１０６Ｙ、Ｎ１０９Ａ、Ｎ１０９Ｃ、Ｎ１０９Ｅ、Ｎ１０９Ｆ、Ｎ１０９Ｇ、Ｎ１０９Ｈ、Ｎ１０９Ｌ、Ｎ１０９Ｍ、Ｎ１０９Ｐ、Ｎ１０９Ｑ、Ｎ１０９Ｒ、Ｎ１０９Ｓ、Ｎ１０９Ｖ、Ｎ１０９Ｗ、Ｎ１０９Ｙ、Ｉ１１１Ｃ、Ｉ１１１Ｆ、Ｉ１１１Ｌ、Ｉ１１１Ｍ、Ｉ１１１Ｎ、Ｉ１１１Ｐ、Ｉ１１１Ｔ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１１１Ｗ、Ｅ１１２Ａ、Ｅ１１２Ｃ、Ｅ１１２Ｄ、Ｅ１１２Ｆ、Ｅ１１２Ｇ、Ｅ１１２Ｉ、Ｅ１１２Ｌ、Ｅ１１２Ｍ、Ｅ１１２Ｎ、Ｅ１１２Ｑ、Ｅ１１２Ｒ、Ｅ１１２Ｓ、Ｅ１１２Ｔ、Ｅ１１２Ｖ、Ｅ１１２Ｗ、Ｅ１１２Ｙ、Ｗ１１３Ｄ、Ｗ１１３Ｅ、Ｗ１１３Ｆ、Ｗ１１３Ｎ、Ｗ１１３Ｐ、Ｗ１１３Ｑ、Ｗ１１３Ｓ、Ｗ１１３Ｖ、Ｗ１１３Ｙ、Ｉ１１５Ｅ、Ｉ１１５Ｈ、Ｉ１１５Ｎ、Ｉ１１５Ｔ、Ｉ１１５Ｖ、Ｉ１１５Ｗ、Ｉ１１５Ｙ、Ａ１１６Ｃ、Ａ１１６Ｄ、Ａ１１６Ｅ、Ａ１１６Ｆ、Ａ１１６Ｇ、Ａ１１６Ｈ、Ａ１１６Ｉ、Ａ１１６Ｋ、Ａ１１６Ｌ、Ａ１１６Ｍ、Ａ１１６Ｎ、Ａ１１６Ｐ、Ａ１１６Ｑ、Ａ１１６Ｒ、Ａ１１６Ｓ、Ａ１１６Ｔ、Ａ１１６Ｖ、Ａ１１６Ｗ、Ａ１１６Ｙ、Ｎ１１８Ａ、Ｎ１１８Ｃ、Ｎ１１８Ｄ、Ｎ１１８Ｅ、Ｎ１１８Ｆ、Ｎ１１８Ｇ、Ｎ１１８Ｈ、Ｎ１１８Ｉ、Ｎ１１８Ｋ、Ｎ１１８Ｌ、Ｎ１１８Ｍ、Ｎ１１８Ｑ、Ｎ１１８
Ｒ、Ｎ１１８Ｓ、Ｎ１１８Ｔ、Ｎ１１８Ｖ、Ｎ１１８Ｗ、Ｉ１２２Ａ、Ｉ１２２Ｃ、Ｉ１２２Ｈ、Ｉ１２２Ｋ、Ｉ１２２Ｌ、Ｉ１２２Ｍ、Ｉ１２２Ｎ、Ｉ１２２Ｐ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｃ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｉ、Ｎ１２３Ｌ、Ｎ１２３Ｍ、Ｎ１２３Ｑ、Ｎ１２３Ｓ、Ｎ１２３Ｔ、Ｎ１２３Ｖ、Ｍ１２４Ｃ、Ｍ１２４Ｄ、Ｍ１２４Ｉ、Ｍ１２４Ｌ、Ｍ１２４Ｓ、Ｍ１２４Ｔ、Ｍ１２４Ｖ、Ｍ１２４Ｗ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１２５Ｃ、Ｓ１２５Ｅ、Ｓ１２５Ｆ、Ｓ１２５Ｉ、Ｓ１２５Ｋ、Ｓ１２５Ｍ、Ｓ１２５Ｎ、Ｓ１２５Ｐ、Ｓ１２５Ｑ、Ｓ１２５Ｒ、Ｓ１２５Ｔ、Ｌ１２６Ａ、Ｌ１２６Ｃ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｎ、Ｌ１２６Ｒ、Ｌ１２６Ｓ、Ｌ１２６Ｔ、Ｌ１２６Ｖ、Ｌ１２６Ｗ、Ｌ１２６Ｙ、Ｇ１２７Ａ、Ｇ１２７Ｃ、Ｇ１２７Ｅ、Ｇ１２７Ｆ、Ｇ１２７Ｉ、Ｇ１２７Ｋ、Ｇ１２７Ｍ、Ｇ１２７Ｎ、Ｇ１２７Ｐ、Ｇ１２７Ｑ、Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｔ、Ｇ１２７Ｖ、Ｇ１２７Ｗ、Ｇ１２７Ｙ、Ｇ１２８Ａ、Ｇ１２８Ｄ、Ｇ１２８Ｆ、Ｇ１２８Ｈ、Ｇ１２８Ｌ、Ｇ１２８Ｎ、Ｇ１２８Ｐ、Ｇ１２８Ｓ、Ｇ１２８Ｔ、Ｇ１２８Ｖ、Ｇ１２８Ｗ、Ｇ１２８Ｙ、Ｐ１２９Ａ、Ｐ１２９Ｃ、Ｐ１２９Ｅ、Ｐ１２９Ｆ、Ｐ１２９Ｇ、Ｐ１２９Ｉ、Ｐ１２９Ｋ、Ｐ１２９Ｌ、Ｐ１２９Ｍ、Ｐ１２９Ｎ、Ｐ１２９Ｑ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１２９Ｔ、Ｐ１２９Ｖ、Ｐ１２９Ｙ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｃ、Ｇ１３１Ｅ、Ｇ１３１Ｆ、Ｇ１３１Ｋ、Ｇ１３１Ｌ、Ｇ１３１Ｍ、Ｇ１３１Ｎ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｓ、Ｇ１３１Ｔ、Ｇ１３１Ｖ、Ｇ１３１Ｗ、Ｇ１３１Ｙ、Ａ１３３Ｃ、Ａ１３３Ｄ、Ａ１３３Ｅ、Ａ１３３Ｆ、Ａ１３３Ｇ、Ａ１３３Ｉ、Ａ１３３Ｋ、Ａ１３３Ｌ、Ａ１３３Ｍ、Ａ１３３Ｐ、Ａ１３３Ｒ、Ａ１３３Ｔ、Ａ１３３Ｖ、Ａ１３３Ｗ、Ａ１３３Ｙ、Ａ１３４Ｄ、Ａ１３４Ｅ、Ａ１３４Ｆ、Ａ１３４Ｇ、Ａ１３４Ｉ、Ａ１３４Ｋ、Ａ１３４Ｌ、Ａ１３４Ｍ、Ａ１３４Ｐ、Ａ１３４Ｑ、Ａ１３４Ｒ、Ａ１３４Ｓ、Ａ１３４Ｔ、Ａ１３４Ｖ、Ａ１３４Ｗ、Ｌ１３５Ｄ、Ｌ１３５Ｅ、Ｌ１３５Ｍ、Ｌ１３５Ｒ、Ｌ１３５Ｗ、Ｌ１３５Ｙ、Ｋ１３６Ｅ、Ｋ１３６Ｈ、Ｋ１３６Ｌ、Ｋ１３６Ｍ、Ｋ１３６Ｎ、Ｋ１３６Ｒ、Ｋ１３６Ｓ、Ｋ１３６Ｔ、Ｋ１３６Ｖ、Ｋ１３６Ｗ、Ｋ１３６Ｙ、Ａ１３７Ｃ、Ａ１３７Ｅ、Ａ１３７Ｆ、Ａ１３７Ｈ、Ａ１３７Ｌ、Ａ１３７Ｍ、Ａ１
３７Ｎ、Ａ１３７Ｐ、Ａ１３７Ｑ、Ａ１３７Ｒ、Ａ１３７Ｓ、Ａ１３７Ｔ、Ａ１３７Ｖ、Ａ１３７Ｗ、Ａ１３７Ｙ、Ｖ１３９Ｃ、Ｖ１３９Ｉ、Ｖ１３９Ｌ、Ｖ１３９Ｎ、Ｖ１３９Ｓ、Ｖ１３９Ｔ、Ｋ１４１Ａ、Ｋ１４１Ｃ、Ｋ１４１Ｄ、Ｋ１４１Ｅ、Ｋ１４１Ｆ、Ｋ１４１Ｇ、Ｋ１４１Ｈ、Ｋ１４１Ｉ、Ｋ１４１Ｌ、Ｋ１４１Ｍ、Ｋ１４１Ｎ、Ｋ１４１Ｑ、Ｋ１４１Ｒ、Ｋ１４１Ｓ、Ｋ１４１Ｖ、Ｋ１４１Ｗ、Ｋ１４１Ｙ、Ｖ１４３Ａ、Ｖ１４３Ｃ、Ｖ１４３Ｄ、Ｖ１４３Ｅ、Ｖ１４３Ｆ、Ｖ１４３Ｇ、Ｖ１４３Ｌ、Ｖ１４３Ｍ、Ｖ１４３Ｎ、Ｖ１４３Ｑ、Ｖ１４３Ｒ、Ｖ１４３Ｓ、Ｖ１４３Ｔ、Ｖ１４３Ｗ、Ａ１４４Ｃ、Ａ１４４Ｄ、Ａ１４４Ｅ、Ａ１４４Ｇ、Ａ１４４Ｉ、Ａ１４４Ｋ、Ａ１４４Ｌ、Ａ１４４Ｍ、Ａ１４４Ｒ、Ａ１４４Ｓ、Ａ１４４Ｔ、Ａ１４４Ｖ、Ａ１４４Ｗ、Ｓ１４５Ａ、Ｓ１４５Ｃ、Ｓ１４５Ｄ、Ｓ１４５Ｅ、Ｓ１４５Ｆ、Ｓ１４５Ｇ、Ｓ１４５Ｈ、Ｓ１４５Ｉ、Ｓ１４５Ｌ、Ｓ１４５Ｍ、Ｓ１４５Ｑ、Ｓ１４５Ｒ、Ｓ１４５Ｔ、Ｓ１４５Ｖ、Ｓ１４５Ｗ、Ｓ１４５Ｙ、Ｇ１４６Ａ、Ｇ１４６Ｃ、Ｇ１４６Ｄ、Ｇ１４６Ｍ、Ｇ１４６Ｑ、Ｇ１４６Ｒ、Ｇ１４６Ｓ、Ｇ１４６Ｔ、Ｇ１４６Ｙ、Ａ１５３Ｓ、Ｇ１５４Ｌ、Ｇ１５４Ｐ、Ｇ１５４Ｔ、Ｅ１５６Ａ、Ｅ１５６Ｃ、Ｅ１５６Ｆ、Ｅ１５６Ｋ、Ｅ１５６Ｌ、Ｅ１５６Ｎ、Ｅ１５６Ｑ、Ｅ１５６Ｒ、Ｅ１５６Ｓ、Ｅ１５６Ｔ、Ｅ１５６Ｖ、Ｅ１５６Ｗ、Ｅ１５６Ｙ、Ｔ１５８Ａ、Ｔ１５８Ｄ、Ｔ１５８Ｅ、Ｔ１５８Ｇ、Ｔ１５８Ｈ、Ｔ１５８Ｉ、Ｔ１５８Ｋ、Ｔ１５８Ｌ、Ｔ１５８Ｍ、Ｔ１５８Ｎ、Ｔ１５８Ｑ、Ｔ１５８Ｓ、Ｔ１５８Ｖ、Ｔ１５８Ｙ、Ｓ１５９Ａ、Ｓ１５９Ｃ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｇ、Ｓ１５９Ｈ、Ｓ１５９Ｉ、Ｓ１５９Ｋ、Ｓ１５９Ｍ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｒ、Ｓ１５９Ｔ、Ｇ１６０Ｄ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｋ、Ｇ１６０Ｎ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｑ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｔ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｋ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１６２Ｎ、Ｓ１６２Ｑ、Ｓ１６２Ｒ、Ｓ１６２Ｔ、Ｓ１６２Ｖ、Ｓ１６３Ｇ、Ｓ１６３Ｐ、Ｙ１６７Ａ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１６７Ｈ、Ｙ１６７Ｉ、Ｐ１６８Ｄ、Ｐ１６８Ｇ、Ｐ１６８Ｉ、Ｐ１６８Ｍ、Ｐ１６８Ｓ、Ｐ１６８Ｙ、Ｇ１６９Ｅ、Ｇ１６９Ｆ、Ｇ１６９Ｈ、Ｇ１６９Ｉ、Ｇ１６９Ｍ、Ｇ１６９Ｎ、Ｇ１６９Ｒ、Ｇ１６９Ｔ、Ｇ１６９Ｖ、
Ｇ１６９Ｙ、Ｋ１７０Ａ、Ｋ１７０Ｃ、Ｋ１７０Ｆ、Ｋ１７０Ｇ、Ｋ１７０Ｈ、Ｋ１７０Ｒ、Ｋ１７０Ｖ、Ｋ１７０Ｗ、Ｋ１７０Ｙ、Ｙ１７１Ｇ、Ｙ１７１Ｋ、Ｙ１７１Ｐ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７２Ｃ、Ｐ１７２Ｅ、Ｐ１７２Ｋ、Ｐ１７２Ｌ、Ｐ１７２Ｍ、Ｐ１７２Ｎ、Ｐ１７２Ｑ、Ｐ１７２Ｒ、Ｐ１７２Ｓ、Ｐ１７２Ｔ、Ｐ１７２Ｖ、Ｐ１７２Ｙ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｃ、Ｓ１７３Ｅ、Ｓ１７３Ｉ、Ｓ１７３Ｔ、Ｖ１７４Ｃ、Ｖ１７４Ｆ、Ｖ１７４Ｈ、Ｖ１７４Ｒ、Ｖ１７４Ｔ、Ｉ１７５Ｇ、Ｉ１７５Ｌ、Ｉ１７５Ｍ、Ｉ１７５Ｒ、Ｉ１７５Ｔ、Ｉ１７５Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７６Ｅ、Ａ１７６Ｆ、Ａ１７６Ｋ、Ａ１７６Ｍ、Ａ１７６Ｓ、Ａ１７６Ｙ、Ａ１７９Ｇ、Ｖ１８０Ａ、Ｖ１８０Ｃ、Ｖ１８０Ｌ、Ｖ１８０Ｎ、Ｖ１８０Ｓ、Ｖ１８０Ｔ、Ｄ１８１Ｃ、Ｄ１８１Ｅ、Ｄ１８１Ｇ、Ｄ１８１Ｈ、Ｄ１８１Ｍ、Ｄ１８１Ｎ、Ｄ１８１Ｓ、Ｄ１８１Ｔ、Ｄ１８１Ｗ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｃ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｇ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｋ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｐ、Ｓ１８２Ｑ、Ｓ１８２Ｒ、Ｓ１８２Ｖ、Ｓ１８２Ｙ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｃ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｇ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｉ、Ｓ１８３Ｋ、Ｓ１８３Ｌ、Ｓ１８３Ｍ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｑ、Ｓ１８３Ｒ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｗ、Ｓ１８３Ｙ、Ｎ１８４Ｃ、Ｎ１８４Ｄ、Ｎ１８４Ｅ、Ｎ１８４Ｇ、Ｎ１８４Ｈ、Ｎ１８４Ｋ、Ｎ１８４Ｌ、Ｎ１８４Ｍ、Ｎ１８４Ｑ、Ｎ１８４Ｓ、Ｎ１８４Ｔ、Ｎ１８４Ｖ、Ｎ１８４Ｗ、Ｑ１８５Ａ、Ｑ１８５Ｃ、Ｑ１８５Ｅ、Ｑ１８５Ｇ、Ｑ１８５Ｈ、Ｑ１８５Ｉ、Ｑ１８５Ｋ、Ｑ１８５Ｌ、Ｑ１８５Ｍ、Ｑ１８５Ｎ、Ｑ１８５Ｓ、Ｑ１８５Ｔ、Ｑ１８５Ｖ、Ｑ１８５Ｗ、Ｒ１８６Ｉ、Ｒ１８６Ｌ、Ｒ１８６Ｗ、Ａ１８７Ｃ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｅ、Ａ１８７Ｆ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｓ、Ａ１８７Ｗ、Ａ１８７Ｙ、Ｓ１８８Ａ、Ｓ１８８Ｃ、Ｓ１８８Ｄ、Ｓ１８８Ｅ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１８８Ｉ、Ｓ１８８Ｋ、Ｓ１８８Ｌ、Ｓ１８８Ｍ、Ｓ１８８Ｐ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１８８Ｗ、Ｓ１８８Ｙ、Ｓ１９０Ｈ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ１９０Ｋ、Ｓ１９１Ａ、Ｓ１９１Ｇ、Ｓ１９１Ｎ、Ｓ１９１Ｐ、Ｖ１９２Ａ、Ｖ１９２Ｓ、Ｖ１９２Ｔ、Ｖ１９２Ｙ、Ｇ１９３Ｆ、Ｇ１９３Ｈ、Ｇ１９３Ｉ、Ｇ１９３Ｎ、Ｇ１９３
Ｐ、Ｇ１９３Ｒ、Ｇ１９３Ｔ、Ｐ１９４Ｃ、Ｐ１９４Ｅ、Ｐ１９４Ｈ、Ｐ１９４Ｉ、Ｐ１９４Ｋ、Ｐ１９４Ｌ、Ｐ１９４Ｍ、Ｐ１９４Ｑ、Ｐ１９４Ｔ、Ｐ１９４Ｖ、Ｐ１９４Ｗ、Ｌ１９６Ａ、Ｍ１９９Ｐ、Ｍ１９９Ｓ、Ａ２００Ｃ、Ａ２００Ｇ、Ａ２００Ｋ、Ａ２００Ｙ、Ｇ２０２Ｄ、Ｇ２０２Ｅ、Ｇ２０２Ｆ、Ｇ２０２Ｌ、Ｇ２０２Ｖ、Ｇ２０２Ｙ、Ｑ２０６Ａ、Ｑ２０６Ｃ、Ｑ２０６Ｄ、Ｑ２０６Ｅ、Ｑ２０６Ｆ、Ｑ２０６Ｇ、Ｑ２０６Ｈ、Ｑ２０６Ｉ、Ｑ２０６Ｌ、Ｑ２０６Ｍ、Ｑ２０６Ｎ、Ｑ２０６Ｐ、Ｑ２０６Ｒ、Ｑ２０６Ｓ、Ｑ２０６Ｔ、Ｑ２０６Ｖ、Ｑ２０６Ｗ、Ｑ２０６Ｙ、Ｓ２０７Ｄ、Ｓ２０７Ｅ、Ｓ２０７Ｋ、Ｓ２０７Ｑ、Ｓ２０７Ｔ、Ｓ２０７Ｖ、Ｐ２１０Ａ、Ｐ２１０Ｃ、Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｔ、Ｎ２１２Ａ、Ｎ２１２Ｃ、Ｎ２１２Ｅ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｈ、Ｎ２１２Ｋ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｍ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｒ、Ｎ２１２Ｓ、Ｎ２１２Ｖ、Ｋ２１３Ａ、Ｋ２１３Ｃ、Ｋ２１３Ｄ、Ｋ２１３Ｅ、Ｋ２１３Ｆ、Ｋ２１３Ｈ、Ｋ２１３Ｉ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｍ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｑ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２１３Ｓ、Ｋ２１３Ｔ、Ｋ２１３Ｖ、Ｋ２１３Ｙ、Ｙ２１４Ｗ、Ｇ２１５Ａ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１５Ｄ、Ｇ２１５Ｅ、Ｇ２１５Ｉ、Ｇ２１５Ｍ、Ｇ２１５Ｎ、Ｇ２１５Ｑ、Ｇ２１５Ｓ、Ｇ２１５Ｔ、Ｇ２１５Ｖ、Ａ２１６Ｃ、Ａ２１６Ｄ、Ａ２１６Ｅ、Ａ２１６Ｇ、Ａ２１６Ｋ、Ａ２１６Ｌ、Ａ２１６Ｍ、Ａ２１６Ｎ、Ａ２１６Ｐ、Ａ２１６Ｒ、Ａ２１６Ｓ、Ａ２１６Ｖ、Ａ２１６Ｗ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｃ、Ｙ２１７Ｄ、Ｙ２１７Ｅ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｇ、Ｙ２１７Ｈ、Ｙ２１７Ｉ、Ｙ２１７Ｋ、Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｍ、Ｙ２１７Ｎ、Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｒ、Ｙ２１７Ｓ、Ｙ２１７Ｔ、Ｙ２１７Ｖ、Ｙ２１７Ｗ、Ｎ２１８Ａ、Ｎ２１８Ｃ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ２１８Ｆ、Ｎ２１８Ｇ、Ｎ２１８Ｈ、Ｎ２１８Ｋ、Ｎ２１８Ｍ、Ｎ２１８Ｒ、Ｎ２１８Ｓ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｗ、Ｎ２１８Ｙ、Ｇ２１９Ａ、Ｇ２１９Ｃ、Ｇ２１９Ｄ、Ｇ２１９Ｈ、Ｇ２１９Ｉ、Ｇ２１９Ｐ、Ｇ２１９Ｑ、Ｇ２１９Ｒ、Ｇ２１９Ｓ、Ｇ２１９Ｔ、Ｇ２１９Ｖ、Ｇ２１９Ｗ、Ｔ２２０Ｄ、Ｔ２２０Ｅ、Ｔ２２０Ｆ、Ｔ２２０Ｇ、Ｔ２２０Ｋ、Ｔ２２０Ｍ、Ｔ２２０Ｓ、Ｔ２２０Ｙ、Ａ２２３Ｅ、Ａ２２３Ｆ、Ａ２２３Ｌ、Ａ２２３Ｍ、Ａ２２３Ｒ、Ａ２２３Ｓ、Ａ２２３Ｖ、Ａ２
２３Ｗ、Ａ２２３Ｙ、Ｓ２２４Ａ、Ｓ２２４Ｃ、Ｓ２２４Ｆ、Ｓ２２４Ｇ、Ｓ２２４Ｈ、Ｓ２２４Ｍ、Ｓ２２４Ｎ、Ｓ２２４Ｑ、Ｓ２２４Ｒ、Ｓ２２４Ｔ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｆ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ｈ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｍ、Ｐ２２５Ｒ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２８Ｐ、Ａ２２８Ｒ、Ａ２２８Ｓ、Ａ２２８Ｔ、Ａ２２８Ｗ、Ｇ２２９Ａ、Ｇ２２９Ｈ、Ｇ２２９Ｉ、Ｇ２２９Ｓ、Ａ２３０Ｃ、Ａ２３０Ｅ、Ａ２３０Ｇ、Ａ２３０Ｑ、Ａ２３０Ｒ、Ａ２３０Ｓ、Ａ２３０Ｔ、Ａ２３０Ｖ、Ａ２３１Ｃ、Ａ２３１Ｉ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｒ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｃ、Ｉ２３４Ｌ、Ｉ２３４Ｍ、Ｉ２３４Ｎ、Ｉ２３４Ｐ、Ｉ２３４Ｑ、Ｉ２３４Ｓ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｃ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｙ、Ｓ２３６Ａ、Ｓ２３６Ｃ、Ｓ２３６Ｄ、Ｓ２３６Ｅ、Ｓ２３６Ｇ、Ｓ２３６Ｈ、Ｓ２３６Ｎ、Ｓ２３６Ｑ、Ｓ２３６Ｔ、Ｓ２３６Ｖ、Ｓ２３６Ｙ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｅ、Ｋ２３７Ｆ、Ｋ２３７Ｇ、Ｋ２３７Ｈ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｍ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｑ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２３７Ｗ、Ｋ２３７Ｙ、Ｈ２３８Ｃ、Ｈ２３８Ｄ、Ｈ２３８Ｆ、Ｈ２３８Ｍ、Ｈ２３８Ｒ、Ｈ２３８Ｓ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｌ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｑ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ２３９Ｗ、Ｐ２３９Ｙ、Ｎ２４０Ａ、Ｎ２４０Ｃ、Ｎ２４０Ｄ、Ｎ２４０Ｆ、Ｎ２４０Ｇ、Ｎ２４０Ｋ、Ｎ２４０Ｌ、Ｎ２４０Ｑ、Ｎ２４０Ｒ、Ｎ２４０Ｓ、Ｎ２４０Ｔ、Ｎ２４０Ｖ、Ｎ２４０Ｗ、Ｎ２４０Ｙ、Ｗ２４１Ａ、Ｗ２４１Ｆ、Ｗ２４１Ｇ、Ｗ２４１Ｈ、Ｗ２４１Ｉ、Ｗ２４１Ｋ、Ｗ２４１Ｍ、Ｗ２４１Ｔ、Ｗ２４１Ｖ、Ｔ２４２Ａ、Ｔ２４２Ｃ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｆ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２４２Ｋ、Ｔ２４２Ｍ、Ｔ２４２Ｎ、Ｔ２４２Ｐ、Ｔ２４２Ｒ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４２Ｗ、Ｔ２４２Ｙ、Ｎ２４３Ｃ、Ｎ２４３Ｅ、Ｎ２４３Ｆ、Ｎ２４３Ｇ、Ｎ２４３Ｉ、Ｎ２４３Ｑ、Ｎ２４３Ｓ、Ｎ２４３Ｔ、Ｎ２４３Ｖ、Ｎ２４３Ｗ、Ｎ２４３Ｙ、Ｔ２４４Ａ、Ｔ２４４Ｄ、Ｔ２４４Ｆ、
Ｔ２４４Ｇ、Ｔ２４４Ｈ、Ｔ２４４Ｋ、Ｔ２４４Ｌ、Ｔ２４４Ｍ、Ｔ２４４Ｎ、Ｔ２４４Ｐ、Ｔ２４４Ｑ、Ｔ２４４Ｒ、Ｔ２４４Ｓ、Ｔ２４４Ｖ、Ｔ２４４Ｙ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｃ、Ｑ２４５Ｄ、Ｑ２４５Ｅ、Ｑ２４５Ｈ、Ｑ２４５Ｉ、Ｑ２４５Ｋ、Ｑ２４５Ｌ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｑ２４５Ｙ、Ｒ２４７Ｗ、Ｓ２４８Ａ、Ｓ２４８Ｅ、Ｓ２４８Ｆ、Ｓ２４８Ｇ、Ｓ２４８Ｈ、Ｓ２４８Ｉ、Ｓ２４８Ｌ、Ｓ２４８Ｍ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｑ、Ｓ２４８Ｒ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４８Ｖ、Ｓ２４８Ｗ、Ｓ２４８Ｙ、Ｓ２４９Ｃ、Ｓ２４９Ｄ、Ｓ２４９Ｈ、Ｓ２４９Ｉ、Ｓ２４９Ｋ、Ｓ２４９Ｌ、Ｓ２４９Ｍ、Ｓ２４９Ｎ、Ｓ２４９Ｑ、Ｓ２４９Ｒ、Ｓ２４９Ｖ、Ｓ２４９Ｗ、Ｓ２４９Ｙ、Ｌ２５０Ｄ、Ｌ２５０Ｆ、Ｌ２５０Ｈ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｌ２５０Ｔ、Ｌ２５０Ｖ、Ｅ２５１Ａ、Ｅ２５１Ｔ、Ｅ２５１Ｗ、Ｎ２５２Ａ、Ｎ２５２Ｃ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｇ、Ｎ２５２Ｈ、Ｎ２５２Ｉ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｍ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｎ２５２Ｔ、Ｎ２５２Ｖ、Ｎ２５２Ｙ、Ｔ２５３Ａ、Ｔ２５３Ｃ、Ｔ２５３Ｅ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｈ、Ｔ２５３Ｋ、Ｔ２５３Ｍ、Ｔ２５３Ｓ、Ｔ２５３Ｖ、Ｔ２５４Ａ、Ｔ２５４Ｃ、Ｔ２５４Ｌ、Ｔ２５４Ｍ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｃ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｅ、Ｔ２５５Ｆ、Ｔ２５５Ｇ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｋ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｍ、Ｔ２５５Ｒ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｖ、Ｋ２５６Ａ、Ｋ２５６Ｃ、Ｋ２５６Ｄ、Ｋ２５６Ｅ、Ｋ２５６Ｆ、Ｋ２５６Ｈ、Ｋ２５６Ｉ、Ｋ２５６Ｌ、Ｋ２５６Ｍ、Ｋ２５６Ｎ、Ｋ２５６Ｐ、Ｋ２５６Ｑ、Ｋ２５６Ｒ、Ｋ２５６Ｓ、Ｋ２５６Ｔ、Ｋ２５６Ｖ、Ｋ２５６Ｗ、Ｋ２５６Ｙ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｆ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｉ、Ｌ２５７Ｍ、Ｌ２５７Ｎ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｓ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｖ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｙ、Ｇ２５８Ｑ、Ｄ２５９Ａ、Ｄ２５９Ｅ、Ｄ２５９Ｆ、Ｄ２５９Ｇ、Ｄ２５９Ｌ、Ｄ２５９Ｎ、Ｄ２５９Ｐ、Ｄ２５９Ｑ、Ｄ２５９Ｒ、Ｄ２５９Ｓ、Ｄ２５９Ｔ、Ｄ２５９Ｖ、Ｄ２５９Ｗ、Ｄ２５９Ｙ、Ｓ２６０Ａ、Ｓ２６０Ｃ、Ｓ２６０Ｄ、Ｓ２６０Ｅ、Ｓ２６０Ｆ、Ｓ２６０Ｇ、Ｓ２６０Ｈ、Ｓ２６０Ｌ、Ｓ２６０Ｍ、Ｓ２６０Ｎ、Ｓ２６０Ｐ、Ｓ２６０Ｒ、Ｓ２６０
Ｖ、Ｓ２６０Ｗ、Ｓ２６０Ｙ、Ｆ２６１Ｈ、Ｆ２６１Ｗ、Ｙ２６２Ｃ、Ｙ２６２Ｅ、Ｙ２６２Ｆ、Ｙ２６２Ｈ、Ｙ２６２Ｌ、Ｙ２６２Ｍ、Ｙ２６２Ｎ、Ｙ２６３Ｆ、Ｙ２６３Ｍ、Ｙ２６３Ｔ、Ｇ２６４Ｆ、Ｇ２６４Ｉ、Ｇ２６４Ｌ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｃ、Ｋ２６５Ｅ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｈ、Ｋ２６５Ｌ、Ｋ２６５Ｍ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｑ、Ｋ２６５Ｒ、Ｋ２６５Ｓ、Ｋ２６５Ｗ、Ｋ２６５Ｙ、Ｇ２６６Ｃ、Ｇ２６６Ｆ、Ｇ２６６Ｌ、Ｇ２６６Ｍ、Ｇ２６６Ｐ、Ｇ２６６Ｒ、Ｇ２６６Ｖ、Ｇ２６６Ｗ、Ｇ２６６Ｙ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２６７Ｃ、Ｌ２６７Ｅ、Ｌ２６７Ｇ、Ｌ２６７Ｈ、Ｌ２６７Ｍ、Ｌ２６７Ｎ、Ｌ２６７Ｑ、Ｌ２６７Ｓ、Ｌ２６７Ｔ、Ｌ２６７Ｖ、Ｉ２６８Ａ、Ｉ２６８Ｃ、Ｉ２６８Ｋ、Ｉ２６８Ｌ、Ｉ２６８Ｍ、Ｉ２６８Ｐ、Ｉ２６８Ｒ、Ｉ２６８Ｖ、Ｎ２６９Ｄ、Ｎ２６９Ｅ、Ｎ２６９Ｋ、Ｎ２６９Ｌ、Ｎ２６９Ｐ、Ｎ２６９Ｑ、Ｎ２６９Ｓ、Ｑ２７１Ａ、Ｑ２７１Ｃ、Ｑ２７１Ｄ、Ｑ２７１Ｅ、Ｑ２７１Ｆ、Ｑ２７１Ｇ、Ｑ２７１Ｈ、Ｑ２７１Ｉ、Ｑ２７１Ｋ、Ｑ２７１Ｌ、Ｑ２７１Ｍ、Ｑ２７１Ｎ、Ｑ２７１Ｐ、Ｑ２７１Ｒ、Ｑ２７１Ｓ、Ｑ２７１Ｔ、Ｑ２７１Ｖ、Ｑ２７１Ｗ、Ｑ２７１Ｙ、Ａ２７２Ｆ、Ａ２７２Ｇ、Ａ２７２Ｈ、Ａ２７２Ｋ、Ａ２７２Ｌ、Ａ２７２Ｍ、Ａ２７２Ｎ、Ａ２７２Ｑ、Ａ２７２Ｒ、Ａ２７２Ｓ、Ａ２７２Ｔ、Ａ２７２Ｖ、Ａ２７２Ｗ、Ａ２７２Ｙ、Ａ２７４Ｃ、Ａ２７４Ｄ、Ａ２７４Ｆ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｈ、Ａ２７４Ｉ、Ａ２７４Ｋ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｑ、Ａ２７４Ｓ、Ａ２７４Ｔ及びＡ２７４Ｖの一以上を含む。

いくつかの好ましい実施態様において、前記置換は、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｅ−Ｇ１２８Ｒ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｄ０３６Ｎ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ｙ２１７Ｅ−Ｎ２１２Ｓ、Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｅ、Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｆ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ０２４Ｈ−Ａ０９２Ｇ−Ａ１１４Ｇ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｅ、Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｍ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｅ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｌ、Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｌ、Ａ０９２Ｇ−Ａ１１４Ｇ、Ｓ０２４Ｈ−Ａ０９２Ｇ−Ｑ１０３Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｅ、Ｖ２６Ｑ
−Ｋ２１３Ｉ、Ｙ０２１Ｈ−Ｓ１０１Ｎ、Ｓ１０１Ｅ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅから選ばれる組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、前記置換は、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｅ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｅ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｅ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｖ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｅ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ｇ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ０２４Ｈ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｅ、Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｐ−Ｋ２１３Ｎ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｋ２１３Ｌ、Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｐ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｉ、Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｐ−Ｋ２１３Ｎ、Ｓ１０１Ｅ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｍ１１９Ｆ
−Ｋ２１３Ｌ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｙ２１７Ｅ、Ｍ１１９Ｆ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｅ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ、Ｓ１０１Ｐ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｌ、Ａ０４８Ｈ−Ｋ２１３Ｌ、Ｖ０２６Ｑ−Ａ０４８Ｙ−Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｎ、Ｖ０２６Ｎ−Ｋ２１３Ｌ、Ｖ０２６Ｎ−Ｋ２１３Ｌ、Ｖ０２６Ｙ−Ｋ２１３Ｎ、Ａ０４８Ｄ−Ｋ２１３Ｎ、Ｖ０２６Ｑ−Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｌ、Ａ０４８Ｈ−Ｋ２１３Ｎ、Ｖ０２６Ｑ−Ａ０４８Ｈ−Ｋ２１３Ｌ、Ａ０４８Ｈ−Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｎ、Ｖ１４７Ｄ−Ｋ２１３Ｌ、Ｋ２１３Ｉ、Ｖ０２６Ｑ−Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｎ、Ｖ０２６Ｎ−Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｎ、Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｌ、Ｖ０２６Ｙ−Ａ０４８Ｅ−Ｋ２１３Ｉ、Ａ０４８Ｄ−Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｉ、Ａ０４８Ｈ−Ｋ２１３Ｎ、Ｖ１４７Ｄ−Ｋ２１３Ｎ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｅ、Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｐ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２
１Ｗ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ｙ２１７Ｅ−（Ｎ０２１２Ｓ）、Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ｓ１０１Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ａ−Ｖ２４６Ｔ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｐ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｖ−Ｍ０５０Ｍ−Ａ０９２Ａ−Ｑ１０３Ｑ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｍ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｑ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｖ−Ｓ１０１Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｗ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｈ−Ｋ２１３Ｌ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｆ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｑ及びＹ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌから選ばれる組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、前記置換は、Ｓ０２４Ｓ−Ｖ０２８Ｔ−Ｍ０５０Ｖ−Ａ０９２Ｇ−Ｑ１０３Ｅ−Ａ１１４Ｇ−Ｖ２４６Ｔ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｌ、Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｎ、Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｅ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｅ−Ｍ１１９Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｅ、Ｓ１０１Ｎ−Ｍ１１９Ｎ−Ｋ２１３Ｎ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌ、Ａ０４５Ｉ−Ｙ２１７Ｑ、Ｓ１０１Ｓ−Ｍ１１９Ｍ−Ｋ２１３Ｋ−Ｙ２１７Ｌ、Ｙ０２１Ｈ−Ａ０４５Ｉ
−Ｓ１０１Ｅ−Ｙ２１７Ｌから選ばれる組み合わせを含む。

本発明は、実施例に含まれる表に示す変異体及びこれらの変異体を含む組成物をさらに提供する。

さらに、ズブチリシン変異体をコードする単離された核酸、前記核酸を含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む宿主細胞が、本発明により提供される。さらに、本発明は、前記ズブチリシン変異体を含む洗浄組成物を提供する。いくつかの実施態様において、前記洗浄組成物は、洗濯用洗剤である。いくつかの実施態様において、前記洗濯用洗剤は、冷水用洗剤、低ｐＨ用洗剤または小型洗剤（ｃｏｍｐａｃｔ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）である。さらに、本発明は、以下の工程を含むバチルス・ズブチリシンのズブチリシン変異体を生産する方法を提供する。すなわち、ズブチリシン変異体をコードする核酸を含む発現ベクターを有する宿主細胞を形質転換する工程、及びズブチリシン変異体の生産に適する条件下で前記形質転換された宿主細胞を培養する工程である。いくつかの実施態様において、前記方法は、生産されたズブチリシン変異体を採取する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記宿主細胞はバチルス種である。また、これらの実施態様のサブセットにおいて、前記バチルス種はＢ．ズブチリスである。さらに、本発明は、繊維を含む表面及び／または物を単離されたズブチリシン変異体を含む洗浄組成物と接触させる工程を含む洗浄の方法を提供する。

さらに、本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ工学のための方法を提供する。すなわち、ａ）プロテアーゼの同一のアミノ酸位置で別個の置換を有する複数のプロテアーゼ変異体を各々含む複数の部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）を提供する工程、ｂ）目的の特性試験において前記ＳＥＬのプロテアーゼ変異体及び標準プロテアーゼを試験する工程、ｃ）前記試験に用いるプロテアーゼ変異体の各々において性能指数（ＰＩ）を測定する工程、ｄ）非制限的な位置としての二以上のアミノ酸位置を同定する工程であって、前記二のＳＥＬの各々における複数のプロテアーゼ変異体の少なくとも一は、０．５より高いＰＩを有する。及びｆ）前記二以上の非制限的な位置において置換を各々含む、複数の多置換のプロテアーゼ変異体を含む多重突然変異ライブラリーを提供する工程である。いくつかの実施態様において、前記試験は、染み抜きアッセイ（微小布見本（ｍｉｃｒｏｓｗａｔｃｈ））、ＬＡＳ安定性アッセイ、洗剤安定性アッセイ及び比活性度アッセイから成る群より選ばれる二以上の異なるアッセイを含む。いくつかの実施態様において、前記プロテアーゼは、細菌性セリン・プロテアーゼ、細菌性ズブチリシン及び細菌性中性金属プロテアーゼから成る群より選ばれる。

別の実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、バチルス・ズブチリシンの多置換のズブチリシン変異体を生産する方法を提供する。第１特性の第１試験及び第２特性の第２試験において、複数の単置換のズブチリシン変異体を試験する工程であって、親ズブチリシンの前記特性に各試験で１．０の値が与えられ、好ましい第１または第２特性が１．０を超える値を有し、また、過度に好ましくない第１または第２特性が約０．８０未満の値を有するか、またはいくつかの好ましい実施態様において、約０．６０未満の値を有する前記工程、好ましい第１特性に関連し、過度に好ましくない第２特性に関連しない、前記単置換のズブチリシン変異体の少なくとも一における置換を同定する工程、好ましい第２特性に関連し、過度に好ましくない第１特性に関連しない、前記単置換のズブチリシン変異体の少なくとも一における置換を同定する工程、及びズブチリシンへ前の工程からの置換を導入し、多置換のズブチリシン変異体を得る工程である。いくつかの実施態様において、前記方法は、第１試験及び第２試験において、多置換のズブチリシン変異体を試験する工程であって、改良されたズブチリシン変異体が第１及び第２試験両方において１．０を超える値に達するか、または第１試験において１．０を超える値かつ第２試験において０．８０〜１．０の値に達する、前記工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、改良されたズブチリシン変異体を生産する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、第１及び第２特性は、負に相関する。いくつかの実施態様において、好ましい第１または第２特性は、約１．２より高い値を有する。いくつかの実施態様において、過度に好ましくない第１または第２特性は、約０．４０未満の値を有する。いくつかの実施態様において、前記第１特性は安定性であり、前記第２特性は洗浄性能である。これらの一のサブセットにおいて、前記安定性は、洗剤における安定性を含み、洗浄性能は、洗剤の血液／ミルク／インキ（ＢＭＩ）洗浄性能を含む。いくつかの実施態様において、前記親細菌性ズブチリシンは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’の野生型成熟形である。他の実施態様において、前記親細菌性ズブチリシンは、配列番号５６２に示すアミノ酸配列を有するＢ．レンタス
ＧＧ３６ズブチリシンの野生型であるか、またはＹ２１７Ｌ置換（配列番号５６５）を含むＢＰＮ’’、単独または他の修飾との組み合わせである。本発明のいくつかの実施態様において、洗浄性能は、５〜１２．０のｐＨを有する粉末または液体洗剤組成物中で試験される。本発明において任意の適した順序が用いられるように、上に列記したそのままの順序に、前記工程が限定されることは意図されない。しかしながら、いくつかの好ましい実施態様において、前記置換は、約５０％より高いまたは約６５％より高い溶媒接触可能表面（ＳＡＳ）を有する親ズブチリシン内の位置での置換である。

図１Ａは、ｐＨＰＬＴ−ＶＡＡｃ１の遺伝子地図を提供する。 図１Ｂは、ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’の遺伝子地図を提供する。 図２Ａは、北アメリカの洗濯用洗剤内のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 同様に、図２Ｂは、北アメリカの洗濯用洗剤内のＧＧ３６ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 図３Ａは、西欧の液体洗濯用洗剤内のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 同様に、図３Ｂは、西欧の液体洗濯用洗剤内のＧＧ３６ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 図４Ａは、日本の粉末洗濯用洗剤内のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を荷電の変化の関数として表す。 同様に、図４Ｂは、日本の粉末洗濯用洗剤内のＧＧ３６ ＣＣＬのＢＭＩ洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 図５Ａは、自動食器洗浄洗剤内のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬの焼き卵黄洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 同様に、図５Ｂは、自動食器洗浄洗剤内のＧＧ３６ ＣＣＬの焼き卵黄洗浄性能を、荷電の変化の関数として表す。 図６は、８０の変異体を含むライブラリーについて、ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性を、親ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌと比較した正味荷電の変化の関数として表す。

発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質工学のための方法を提供する。特に、本発明は、部位評価ライブラリーを利用する方法を提供する。

実施の目的において、特定用途に最適のタンパク質を作成するためにタンパク質空間における最良の配列を見つけることは通常必要ではない。ほとんどの適用において、解決されるべき課題は、多くの特性に必要とされる最小値を満たすか、または超過する少なくとも一のタンパク質配列を同定することである。これは、特定の特性に優れた変異についての知識と同様に、所望の特性のいずれにも悪い変異についての知識も必要とする。本発明は、主要特性を改良し、かつ他の特性に対する値を所望の範囲内に維持するために改変され得る、前記タンパク質における前記変異の位置を同定することにより、目標を達成する方法を提供する。

本発明は、各部位で「部位評価ライブラリー」を構築することにより、前記目的の特性の全てについて、タンパク質における全ての位置を評価する方法を提供する。好ましい実施態様において、これらのライブラリーは各位置で９−１９の変異を含み、前記タンパク質工学及びライブラリーの構築で使用される各位置での評価に用いられる。各特性は親酵素に比べて測定される。また、各突然変異体対野生型についての見掛け自由エネルギー差が計算される。次に、これらのデルタ・デルタＧ（「すなわち、ΔΔＧ」）の見掛けの値は、加算性を算出するために用いられる。

変異体を分析する望ましい方法は、目的の過程での変異体対親タンパク質における自由エネルギーにおける差を用いる。過程に用いられるギブス自由エネルギーは、系により実行され得る活動の最大量を表わす。親酵素（ΔΔＧ）に対する自由エネルギーの変化は、以下のように与えられる。

ΔΔＧ＝−ＲＴ ｌｎ（ｋ_{ｖａｒｉａｎｔ}／ｋ_{ｐａｒｅｎｔ}）

ここで、ｋ_{ｖａｒｉａｎｔ}は変異体酵素に対する速度定数であり、ｋ_{ｐａｒｅｎｔ}は親酵素に対する速度定数である。また、Ｒは気体法則定数であり、Ｔは絶対温度である。大抵のアッセイは、真の自由エネルギーの測定を可能にするようには構成していない。従って、我々は以下の量を利用した。

ΔΔＧ _ａｐｐ＝−ＲＴ ｌｎ（Ｐ_{ｖａｒｉａｎｔ}／Ｐ_{ｐａｒｅｎｔ}）

ここで、Ｐ_{ｖａｒｉａｎｔ}は変異体に対する性能値であり、Ｐ_{ｐａｒｅｎｔ}は、同等の条件下での親酵素に対する性能値である。情報配給及び加算性のためのΔΔＧと同様の方法でΔΔＧ _ａｐｐ値が作用すると期待されることが出来る。しかしながら、ΔΔＧは親酵素に比べ、変異体により果されることが出来る活動の最大量であるため、前記量ΔΔＧ _ａｐｐは一般に、ΔΔＧを過小評価し、二の付加的位置の前記特性がそれらのΔΔＧ _ａｐｐ値を相互に加えることにより期待される値より大きくなり得るという点で相乗効果に見える結果をもたらす。

本発明の前記方法は、同時に多数の特性を処理するために用いられる効率的なライブラリーを設計するために用いられる。所定の酵素が本明細書で説明されるが、前記方法は工学的技術に用いられる任意の目的タンパク質に適用する。本明細書で記載するように、前記位置の各々で１２〜１９の置換を導入することにより部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）を構築した。得られた変異を、活性及び安定性アッセイを用いて分析した。野生型アミノ酸は、全ての位置に対する対照点として列記される。各特性について、測定値を親酵素に対するΔΔＧ _ａｐｐの平均及び標準偏差を測定するために用いた。親の平均（μ_{ｐａｒｅｎｔ}）を０に標準化し、ΔΔＧ _ａｐｐについての前記標準偏差（σ_{ｐａｒｅｎｔ}）を測定した。これらの値を、前記分子の各位置での各特性に対する対照として用いた。前記部位評価データを、特性間の相関の証明のために試験した。各特性についてのΔΔＧ _ａｐｐ値を、互いの特性に対しプロットし、相関係数を計算した。タンパク質基質における二の活性の測定値が相関していた。

アミノ酸配列内の位置を分析するため、二種類の部位を指定した。「生産的な」部位は親酵素よりも優れた少なくとも一の置換を有する一方、「非生産的な」部位には親酵素よりも優れた突然変異がない。部位が生産的になる可能性は、部位の総数で割られる生産的な部位の数で与えられる。任意の変異が親酵素より優れる可能性は低い（すなわち、６％−２８％）が、所与の部位が少なくとも一の上昇突然変異（Ｕｐ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する可能性は相当に高い。

進化において保存されている配列部位または変化しやすい配列部位と同様に、プロテアーゼにおける構造上の特徴（例えば、埋設アミノ酸（ｂｕｒｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、相互作用するアミノ酸、活性部位の近接位置等）に関して生産的及び非生産的な部位がどのように分配されたかを測定することは興味深かった。この測定を得るために、前記構造は調査され、前記配列は非重複のホモログと整列させられた。

実施例に示すように、特性の相関に関わらず、任意の特性についての有害突然変異は、一つおきの特性（ｅｖｅｒｙ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）についての有害突然変異と相関している。少数の位置（５−１０％）にだけ、全ての特性に悪い変異がある。これらの位置は「折りたたみ」を規定し、進化において保存される。この言外の意味は、任意の特性についての有利な変異の同定は、その特性に対する真に予測的なスクリーニングを必要とするが、任意の特性に対して有害と成り得る変異の同定は、いずれのスクリーニングを用いても達成されることが出来るということである。単純化されたタンパク質工学の戦略は、単一の活性及び／または安定性のスクリーニングを用いて、ＳＥＬ及びスクリーニングを構築することである。有害突然変異は同定され、また有害突然変異がほとんどない位置は、複数の特性を改良するライブラリー及び組み合わせ変異を構築するために用いられる。さらに、タンパク質の表面上にあり、相互作用をほとんど有さず、さらに配列アラインメントで可変的である部位の選択は、生産的な部位が高比率となることをもたらす。分子の内面にあり、多く接触し、さらに進化において強く保存される部位は、有害突然変異を有する高い確率を有し、回避されるべきである。コンピューター及び／または電子方法及び／またはプログラを含むが、それらに限られない、配列及び／または構造情報の分析に任意の適した方法が、本発明で使用されるように意図される。

前記方法は、二の特性に対する相関係数に加え、二の特性の各々について５％ｗｔより高い活性及び５％未満の活性を有する変異体の数の一対比較を提供する。

ライブラリー設計
いくつかの特に好ましい実施態様において、前記部位評価ライブラリーデータは、組み合わせライブラリーの設計に用いられる。従来の指向進化は、無作為のライブラリーを構築し、単一の特性のために多数のライブラリーをスクリーニングし、これらを組み合わせ、前記過程を繰り返す。数人の調査者が見つけてきたように（例えば、Ｂｌｏｏｍ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ、第１５巻、４４７−４５２頁、２００５年、Ｂｌｏｏｍ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第１０３巻、５８６９−５８７４頁、２００６年及びＧｕｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第１０１巻、９２０５−９２１０頁、２００４年を参照されたい）、一の特性についての正の変異の蓄積は一般に、他の特性の減少をもたらす。任意の変異が任意の特性を上昇させる可能性は小さい。また、任意の変異が任意の特性を低下させる可能性は高い（＞８５％）。また、活性を増加させる三（３）以上の変異の蓄積が他のいくつかの特性の減少を結果として生じさせる可能性は、相当に高い。この問題は、複数の特性に優れたライブラリーを構築するための部位評価データを用いることにより回避される。非生産的な部位は、組み合わせライブラリー中に含まれなかった。また、生産的な部位を、上昇した変異のパーセンテージによりさらに分類した。

洗浄組成物
本発明の洗浄組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面洗浄、自動食器洗浄用途の他、義歯、歯、髪及び皮膚のような化粧用途等に、有利に用いられる。しかしながら、低温溶液において増加する効果の特有の利点により、本発明の酵素は、理想的には洗濯用途に適している。さらに、本発明の酵素は、顆粒及び液体組成物の両方において使用されることが出来る。

本発明の変異体プロテアーゼはさらに、洗浄添加剤生産物に使用される。いくつかの実施態様において、低温溶液洗浄用途に使用される。添加剤生産物は、その最も単純な形態において、一以上のプロテアーゼとすることが出来る。いくつかの実施態様において、前記添加剤は、洗浄工程への追加に用いられる剤形に包まれる。錠剤、タブレット、ジェル・カプセルまたはあらかじめ計量された粉または液体のようなその他の単一使用量単位を含むが、それらに限られない、任意の適した単一使用量形態も、本発明で使用される。いくつかの実施態様において、充填剤またはキャリア材料が、そのような組成物の容量を増加させるために含まれる。適した充填剤またはキャリア材料は、多様な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩の他、滑石、粘土等を含むが、それらに限られない。液体組成物に適した充填剤またはキャリア材料は、水またはポリオール及びジオールを含む低分子量第１級及び第２級アルコールを含むが、それらに限られない。そのようなアルコールの例は、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールを含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、前記組成物は、約５％から約９０％のそのような材料を含む。酸性の賦形剤は、ｐＨを低下させるために使用される。あるいは、前記洗浄添加剤は、下記でより完全に述べるような添加剤成分を含む。

本発明に係る洗浄組成物及び洗浄添加剤は、本明細書に記載する、有効量の少なくとも一のプロテアーゼ変異体、単独でまたはその他のプロテアーゼ及び／または追加酵素との組み合わせを必要とする。酵素の必要レベルは、本発明の一以上のプロテアーゼ変異体の追加により達成される。本発明に係る洗浄組成物は通常、少なくとも約０．０００１の重量パーセント、約０．０００１〜約１、約０．００１〜約０．５またはさらに約０．０１〜約０．１の重量パーセントの少なくとも一の本発明の変異体プロテアーゼを含む。

本明細書の洗浄組成物は通常、水溶性の清浄作業での使用の際に、洗浄水が約５．０〜約１１．５またはさらに約７．５〜約１０．５のｐＨを有するように配合される。液体生産物配合物は通常、約３．０〜約９．０またはさらに約３〜約５の原液ｐＨを有するように配合される。顆粒の洗濯生産物は通常、約９〜約１１のｐＨを有するように配合される。推奨される使用レベルでのｐＨをコントロールする技術は、緩衝液、アルカリ及び酸等の使用を含み、当業者によく知られている。

適した低ｐＨ洗浄組成物は通常、約３〜約５の原液ｐＨを有し、また、そのようなｐＨ環境において加水分解する界面活性剤を通常含まない。そのような界面活性剤は、少なくとも一のエチレンオキシド部分またはさらに約１〜約１６モルのエチレンオキシドを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む。そのような洗浄組成物は通常、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミンまたは塩酸のような十分量のｐＨ調節剤を含み、約３〜約５の原液ｐＨを有する洗浄組成物を提供する。そのような組成物は通常、少なくとも一の酸安定化酵素を含む。いくつかの実施態様において、前記組成物は液体である一方、その他の実施態様において、それらは固体である。そのような液体組成物のｐＨは通常、原液ｐＨとして測定される。そのような固形組成物のｐＨは、前記組成物の１０％固形溶液として測定される。ここで、前記溶媒は、蒸留水である。これらの実施態様において、全てのｐＨ測定値は２０℃で得られている。

いくつかの実施態様において、前記変異体プロテアーゼが顆粒組成物または液体で用いられる場合、変異体プロテアーゼがカプセル化された粒子の形状であり、保管の間に顆粒組成物のその他の成分から変異体プロテアーゼを保護することは望ましい。さらに、カプセル化は、洗浄工程中に変異体プロテアーゼの有効性を制御する方法でもある。いくつかの実施態様において、カプセル化は、変異体プロテアーゼ及び／または追加酵素の性能を向上する。この点に関して、本発明の変異体プロテアーゼは、当該技術分野において知られる任意の適したカプセル化材料でカプセル化される。いくつかの実施態様において、前記カプセル化材料は通常、本発明の変異体プロテアーゼのための少なくとも一部の触媒をカプセル化する。通常、前記カプセル化材料は、水溶性及び／または水分散性である。いくつかの実施態様において、前記カプセル化材料は、０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度は、ＷＯ９７／１１１５１でより詳細に説明される。前記カプセル化材料は、炭水化物、天然または合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス及びそれらの組み合わせから成る群より選ばれる。前記カプセル化材料が炭水化物である場合、通常単糖、オリゴ糖、多糖類及びそれらの組み合わせから選ばれる。通常、前記カプセル化材料はデンプンである。適したデンプンは、ＥＰ０，９２２，４９９、ＵＳ４，９７７，２５２、ＵＳ５，３５４，５５９及びＵＳ５，９３５，８２６で説明される。いくつかの実施態様において、前記カプセル化材料は、加熱可塑性物、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びそれらの混合物のようなプラスチックから構成されたミクロスフィアである。使用される市販のミクロスフィアは、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ、スウェーデン）及びＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ社、バレー・フォージ、ペンシルベニア州）により供給されたものを含む。

本明細書で記載するように、本発明の変異体プロテアーゼは、洗濯及び食器洗剤を含むが、それらに限られない、洗浄工業で特に使用される。これらの用途は、酵素を多様な環境ストレス下に置く。本発明の変異体プロテアーゼは、多様な条件下でのその安定性により、多くの現在用いられている酵素に対する利点を提供する。

実際に、一様でない洗剤配合物、洗浄水容量、洗浄水温度及び洗浄に関与するプロテアーゼが暴露される洗浄時間の長さを含む、様々な洗浄条件がある。さらに、異なる地理的な領域で用いられる洗剤配合物は、洗浄水に存在するそれら関連成分を異なる濃度で有する。例えば、ヨーロッパの洗剤は通常、洗浄水中、約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を有する一方、日本の洗剤は通常、洗浄水中、約６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北米において、特にアメリカでは、洗剤は通常、洗浄水中、約９７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。

低洗剤濃度系は、約８００ｐｐｍ以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。日本の洗剤は通常、約６６７ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、低洗剤濃度系と考えられる。

中洗剤濃度は、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。北米の洗剤は通常、約９７５ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在するので、中洗剤濃度系と考えられる。ブラジルは、約１５００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する。

高洗剤濃度系は、約２０００ｐｐｍより高い洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤を含む。ヨーロッパの洗剤は通常、約４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に含むので、高洗剤濃度系と考えられる。

中南米の洗剤は通常、高泡立ちリン酸塩ビルダー洗剤（ｈｉｇｈ ｓｕｄｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｉｌｄｅｒ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）であり、中南米で使用される洗剤の範囲は、洗浄水中の洗剤成分が１５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍの範囲であるので、中及び高洗剤濃度の両方になる。上述の通り、ブラジルは通常、洗浄水中に約１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。しかしながら、その他の中南米の国に限られない、その他の高泡立ちリン酸塩ビルダー洗剤の地域は、約６０００ｐｐｍ以下の洗剤成分が洗浄水中に存在する高洗剤濃度系を有する。

上述に照らして、一般的な洗浄溶液中の洗剤組成物の濃度は世界中で、例えば、日本の約６６７ｐｐｍ等の約８００ｐｐｍより低い洗剤組成物（「低洗剤濃度地」）、例えば、アメリカの約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍ等の約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「中洗剤濃度地」）、及び例えば、ヨーロッパの約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍ及び高泡立ちリン酸塩ビルダー地域の約６０００ｐｐｍ等の約２０００ｐｐｍより高い洗剤組成物（「高洗剤濃度地」）まで様々であることがわかる。

一般的な洗剤溶液の濃度は実験的に決定する。例えば、米国において、一般的な洗濯機は洗浄溶液の約６４．４Ｌの体積を入れることが出来る。従って、洗浄溶液約６２．７９ｇの洗剤組成物内で約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗浄溶液を加えなければならない。この量は、洗剤と一緒に備えられる計量カップを用いて消費者により洗浄水中で測定される一般的な量である。

さらに別の例として、異なる地域では異なる洗浄温度を用いている。日本の洗浄水の温度は一般に、ヨーロッパで用いる温度よりも低い。例えば、北米及び／または日本における洗浄水の温度は、例えば約１０〜３０℃（例えば、約２０℃）であり、ヨーロッパにおける洗浄水の温度は通常、約３０〜６０℃（例えば、約４０℃）である。

別の例として、異なる地域では、異なる水硬度を有する。水硬度は一般的に、合計Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋のガロン当たりのグレインとして記載される。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ^２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ^２＋）の量の測定値である。アメリカのほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中程度の硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍの硬度ミネラルを含む（米国ガロン当たりのグレインに変換したｐｐｍは、ｐｐｍ数÷１７．１＝ガロン当たりのグレインである）。

［表１］

ヨーロッパの水の硬度は通常、１０．５より高い（例えば、１０．５〜２０．０）ガロン／グレイン合計Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋である（例えば、約１５ガロン／グレイン合計Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）。北米の水の硬度は通常、日本の水の硬度より高いが、ヨーロッパの水の硬度より低い。例えば、北米の水の硬度は、３〜１０グレイン、３〜８グレインまたは約６グレインであることが出来る。日本の水の硬度は通常、北米の水の硬度より低く、通常４未満、例えば、３グレイン／ガロン合計Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋である。

従って、いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも一組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度及び／または洗剤濃度）で驚くべき洗浄性能を示す変異体プロテアーゼを提供する。いくつかの実施態様において、本発明の変異体プロテアーゼは、洗浄性能において他のズブチリシン・プロテアーゼに匹敵する。いくつかの実施態様において、本発明の変異体プロテアーゼは、現在市販されるズブチリシン・プロテアーゼと比較して向上した洗浄性能を示す。従って、本発明のいくつかの好ましい実施態様において、本明細書に記載の変異体プロテアーゼは、向上した酸化安定性、向上した熱的安定性及び／または向上したキレート安定性を示す。さらに、本発明の変異体プロテアーゼは、洗剤を含まない洗浄組成物中で、この場合もやはり、単独でまたはビルダー及び安定剤との組み合わせにおいて使用される。

本発明のいくつかの実施態様において、洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．００００１％〜約１０％のレベルで、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含み、この組成物の重量の残部（例えば、約９９．９９９％〜約９０．０％）は、洗浄添加剤を含む。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量で約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、約０．００５％〜約０．５％のレベルの少なくとも一の変異体プロテアーゼ及び洗浄添加剤を含む洗浄組成物のバランス（例えば、重量で約９９．９９９９％〜約９０．０％、約９９．９９９％〜約９８％、約９９．９９５％〜約９９．５％）を含む。

いくつかの実施態様において、好ましい洗浄組成物は、本明細書に記載の一以上の変異体プロテアーゼに加え、洗浄性能を与え、及び／または繊維を保護する利点を与える、一以上の追加酵素または酵素誘導体を含む。そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えば、ラッカーゼ）及び／またはマンナナーゼを含むが、それらに限られない。

任意の適したその他のプロテアーゼが、本発明の組成物で使用される。適したプロテアーゼは、動物、植物または微生物由来のものを含む。いくつかの特に好ましい実施態様において、微生物プロテアーゼが使用される。いくつかの実施態様において、化学的にまたは遺伝学的に修飾された変異体が含まれる。いくつかの実施態様において、前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン類、特に、バチルス属由来のもの（例えば、ズブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６８）を含む。追加の例は、米国特許番号ＲＥ３４，６０６、第５，９５５，３４０号、５，７００，６７６号、６，３１２，９３６号及び６，４８２，６２８号で記載される変異体プロテアーゼを含み、それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。追加のプロテアーゼの例は、（例えば、ブタまたはウシの）トリプシン及びＷＯ８９／０６２７０に記載のフザリウム・プロテアーゼを含むが、それらに限られない。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）及びＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ（ジェネンコー）の他、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（ノボザイムズ）及びＢＬＡＰ（商標）（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ、デュッセルドルフ、ドイツ）を含む。種々のプロテアーゼが、ＷＯ９５／２３２２１、ＷＯ９２／２１７６０及び米国特許第５，８０１，０３９号、５，３４０、７３５号、５，５００，３６４号、５，８５５，６２５号、ＵＳ ＲＥ３４，６０６、米国特許第５，９５５，３４０号、５，７００，６７６号、第６，３１２，９３６号及び第６，４８２，６２８号及び多様な他の特許に記載される。

加えて、任意の適したリパーゼが、本発明で使用される。適したリパーゼは、細菌または菌類に由来するものを含むが、それらに限られない。化学的にまたは遺伝子学的に修飾された変異体が、本発明に含まれる。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ・ラヌギノザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）・リパーゼ（例えば、ＥＰ２５８０６８及びＥＰ３０５２１６を参照されたい）、リゾムコール・ミヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）・リパーゼ（例えば、ＥＰ２３８０２３を参照されたい）、Ｃ．アンタークチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）・リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークチカ・リパーゼＡまたはＢ、ＥＰ２１４７６１を参照されたい）等のカンジダ・リパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．シュードアルカリゲンス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）・リパーゼ（例えば、ＥＰ２１８２７２を参照されたい）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）・リパーゼ（例えば、ＥＰ３３１３７６を参照されたい）、Ｐ．スタットゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）・リパーゼ（例えば、ＧＢ１，３７２，０３４を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）・リパーゼ等のシュードモナス・リパーゼ、バチルス・リパーゼ（例えば、Ｂ．ズブチリス・リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１１３１巻、２５３−２６０頁、１９９３年）、Ｂ．ステアロサーモフィラス・リパーゼ（例えば、ＪＰ６４／７４４９９２を参照されたい）及びＢ．パミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）・リパーゼ（例えば、ＷＯ９１／１６４２２を参照されたい））を含む。

さらに、ペニシリウム・カメンベルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）・リパーゼ（山口他、Ｇｅｎｅ、第１０３巻、６１−６７頁、１９９１年を参照されたい）、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）・リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１０６巻、３８３−３８８頁、１９８９年）及び種々のリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）・リパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）・リパーゼ（Ｈａｓｓ他、Ｇｅｎｅ、第１０９巻、１１７−１１３頁、１９９１年）、Ｒ．ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）・リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５６巻、７１６−７１９頁、１９９２年）及びＲ・オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）・リパーゼを含むが、それらに限られない、多くのクローン化されたリパーゼが本発明のいくつかの実施態様で使用される。

シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ（ＷＯ８８／０９３６７を参照されたい）及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ）由来のクチナーゼ（ＷＯ９０／０９４４６を参照されたい）を含むが、それらに限られない、クチナーゼ等のその他の種類の脂肪分解酵素もまた、本発明のいくつかの実施態様で使用される。

追加の適したリパーゼは、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ジェネンコー）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（ノボザイムズ）、及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（アマノ薬品株式会社、日本）のような市販のリパーゼを含む。

本発明のいくつかの実施態様において、本発明の洗浄組成物はさらに、組成物の重量に対して約０．００００１％から約１０％のレベルで追加のリパーゼを含み、組成物の重量の残部は洗浄添加剤である。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量に対し約０．０００１％から約１０％、約０．００１％から約５％、約０．００１％から約２％、約０．００５％から約０．５％のレベルでリパーゼも含む。

アルカリ溶液での使用に適した任意のアミラーゼ（アルファ及び／またはベータ）も、本発明のいくつかの実施態様で使用される。適したアミラーゼは、細菌または菌類由来のものを含むが、それらに限られない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された変異体が、いくつかの実施態様に含まれる。本発明に使用されるアミラーゼは、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＧＢ１，２９６，８３９を参照されたい）から得られるα−アミラーゼを含むが、それに限られない。本発明に使用される市販のアミラーゼは、ＤＵＲＡ ＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＢＡＮ（商標）（ノボザイムズ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ジェネンコー・インターナショナル）を含むが、それらに限られない。

本発明のいくつかの実施態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．００００１％から約１０％のレベルで追加のアミラーゼをさらに含み、組成物の重量の残部は洗浄添加剤である。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量に対し約０．０００１％から約１０％、約０．００１％から約５％、約０．００１％から約２％、約０．００５％から約０．５％のレベルでアミラーゼを含む。

いくつかの別の実施態様において、任意の適したセルラーゼが、本発明の洗浄組成物で使用される。適したセルラーゼは、細菌または菌類由来のものを含むが、それらに限られない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された変異体が、いくつかの実施態様に含まれる。適したセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）を含むが、それらに限られない。特に適したセルラーゼは、色を保護する利点をもつセルラーゼである（例えば、ＥＰ０４９５２５７を参照されたい）。本発明で使用される市販のセルラーゼは、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）（ノボザイムズ）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、セルラーゼは、成熟した野生型または変異セルラーゼの一部または断片として組み込まれ、Ｎ末端の一部が欠失している（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。

いくつかの実施態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．００００１％から約１０％のレベルで追加のセルラーゼをさらに含み、組成物の重量の残部は洗浄添加剤である。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．０００１％から約１０％、約０．００１％から約５％、約０．００１％から約２％、約０．００５％から約０．５％のレベルでセルラーゼをさらに含む。

洗剤組成物での使用に適した任意のマンナナーゼも本発明で使用される。適したマンナナーゼは、細菌または菌類由来のものを含むが、それらに限られない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された変異体が、いくつかの実施態様に含まれる。本発明で使用される種々のマンナナーゼが知られている（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号、米国特許第６，６０２，８４２号、米国特許第６，４４０，９９１号を参照されたい。これら全ては参照により本明細書に組み込まれる。）いくつかの実施態様において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．００００１％から約１０％のレベルで追加のマンナナーゼをさらに含み、組成物の重量の残部は洗浄添加剤である。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物は、組成物の重量に対し約０．０００１％から約１０％、約０．００１％から約５％、約０．００１％から約２％、約０．００５％から約０．５％のレベルでマンナナーゼをさらに含む。

いくつかの実施態様において、本発明の組成物中でペルオキシダーゼが、過酸化水素またはその起源物（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩）と組み合わせて使用される。いくつかの別の実施態様において、酸化酵素が酸素と組み合わされて使用される。両種類の酵素は、「溶液漂白（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）」（すなわち、染色された繊維から他の繊維へ、洗濯液中で数種の繊維を同時に洗濯する時に、繊維の染料が他へ移ることを防ぐため）に、好ましくは強化剤（例えば、ＷＯ９４／１２６２１及びＷＯ９５／０１４２６を参照されたい）と共に使用される。適したペルオキダーゼ／酸化酵素は、植物、細菌または菌類由来のものを含むが、それらに限られない。化学的にまたは遺伝学的に修飾された突然変異体が、いくつかの実施態様に含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の洗浄組成物は、ペルオキシダーゼ及び／または酸化酵素を、組成物の重量に対し約０．００００１％から約１０％の追加のペルオキシダーゼ及び／または酸化酵素のレベルでさらに含み、組成物の重量の残部は洗浄添加剤である。本発明の他の側面において、本発明の洗浄組成物はまた、組成物の重量に対し約０．０００１％から約１０％、約０．００１％から約５％、約０．００１％から約２％、約０．００５％から約０．５％のレベルでペルオキシダーゼ及び／または酸化酵素をさらに含む。

いくつかの実施態様において、ペルヒドロラーゼ（例えば、ＷＯ０５／０５６７８２を参照されたい）を含むが、それらに限られない、追加酵素が使用される。加えて、いくつかの特に好ましい実施態様において、上述の酵素の混合物、特に、一以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ及び／または少なくとも一のセルラーゼが、本明細書に含まれる。実際に、これらの酵素の種々の混合物が、本発明で使用されることが意図される。種々のレベルの変異体プロテアーゼ及び一以上の追加酵素が、両方それぞれ約１０％までの範囲であり、洗浄組成物の残部が洗浄添加剤となり得ることが意図される。洗浄添加剤の特異的選択は、洗浄される表面、物または繊維、（例えば、洗剤の使用を通した）使用時の洗浄条件に適した望ましい形態の組成物を考慮することにより容易に行われる。

適した洗浄添加剤の例は、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、漂白触媒、その他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚泥放出ポリマー（ｓｏｉｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、染料転移剤（ｄｙｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔｓ）、分散剤、発泡抑制剤（ｓｕｄｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）、染料、香料、色素、充填剤塩、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、光活性化剤、蛍光剤、繊維柔軟剤、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、抗収縮剤、しわの防止剤、殺菌剤、抗かび剤、カラースペクル（ｃｏｌｏｒ ｓｐｅｃｋｌｅ）、シルバーケア、錆び防止剤及び／または腐食防止剤、アルカリ性供与剤（ａｌｋａｌｉｎｉｔｙ ｓｏｕｒｃｅｓ）、溶解剤、担体、処理助剤、顔料及びｐＨ調整剤（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、６，６０５，４５８号、５，７０５，４６４号、５，７１０、１１５号、５，６９８、５０４号、５，６９５，６７９号、５，６８６，０１４号及び５，６４６，１０１号を参照されたい。これら全ては参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、それらに限られない。特定の洗浄組成物材料の実施態様は、下記で詳細に例示する。洗浄添加剤が、洗浄組成物中で、本発明の変異体プロテアーゼと混合出来ない実施態様において、両成分を合わせることが適当であるときまで、洗浄添加剤とプロテアーゼを分離させておく（すなわち、互いに接触させない）、適した方法が使用される。そのような分離方法は、当該技術分野（例えば、ゲルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離等）で知られる任意の適した方法を含む。

いくつかの好ましい実施態様において、本明細書で提供される、有効量の一以上の変異体プロテアーゼが、タンパク質性の汚れの除去が必要な種々の表面を洗浄するために有用な組成物中に含まれる。このような洗浄組成物は、硬質表面、繊維、食器の洗浄のような用途のための洗浄組成物を含む。実際に、いくつかの実施態様において、本発明は繊維洗浄組成物を提供する一方、他の実施態様において、本発明は非繊維物質の洗浄組成物を提供する。特に、本願発明はまた、（デントリフィス（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅ）、歯磨き粉、口腔洗浄液等の他、入れ歯洗浄組成物を含めた）オーラルケア、皮膚及び髪の洗浄組成物等を含む、パーソナルケアに適した洗浄組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、顆粒、棒状、半固体、ゲル、懸濁液、錠剤、カプセル等）で洗浄組成物を含むことが意図される。

一例として、本発明の変異体プロテアーゼが使用されるいくつかの洗浄組成物を、下記でより詳細に述べる。本発明の洗浄組成物が洗濯機による洗濯法での使用に適した組成物として配合される実施態様において、好ましい本発明の組成物は、少なくとも一の界面活性剤と少なくとも一のビルダー化合物の他、有機ポリマー化合物、漂白剤、追加酵素、発泡抑制剤、分散剤、石灰―石鹸分散剤、土懸濁（ｓｏｉｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）及び再付着防止剤及び腐食防止剤から好ましくは選択される一以上の洗浄添加剤を含む。いくつかの実施態様において、洗濯組成物はまた、柔軟剤も（すなわち、追加の洗浄添加剤として）含む。本発明の組成物はまた、固体または液体の洗剤添加物としても使用される。このような添加物は、従来の洗浄組成物の性能を補う及び／または促進することが意図され、洗浄過程の任意の段階にも加えられることが出来る。いくつかの実施態様において、本明細書の洗濯用洗剤組成物の密度は、２０℃で測定された場合に、組成物の約４００から約１２００ｇ／リットルの範囲である一方、他の実施態様において、約５００から約９５０ｇ／リットルの範囲である。

手洗いによる食器洗浄法での使用に用いられる組成物として配合された実施態様において、本発明の好ましい組成物は、少なくとも一の界面活性剤及び好ましくは、有機ポリマー化合物、発泡促進剤、第ＩＩ族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ及び追加酵素から選択される少なくとも一の追加の洗浄添加剤を含む。

いくつかの実施態様において、米国特許第６，６０５，４５８号に記載されているような種々の洗浄組成物は、本発明の変異体プロテアーゼと共に使用される。従って、いくつかの実施態様において、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む組成物は、小型の顆粒繊維洗浄組成物である一方、他の実施態様において、前記組成物は色のついた繊維の洗濯に有用な顆粒繊維洗浄組成物であり、さらに別の実施態様において、前記組成物は、洗浄性能を通じて柔軟化する顆粒繊維洗浄組成物であり、別の実施態様において、前記組成物は、洗浄能力を介して柔軟性を与える顆粒繊維洗浄組成物であり、追加の実施態様において、前記組成物は、強力（ｈｅａｖｙ ｄｕｔｙ）液体繊維洗浄組成物である。いくつかの実施態様において、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び米国特許第６，３７６，４５０号で記載されるもののような繊維洗浄組成物である。加えて、本発明の変異体プロテアーゼは、ヨーロッパまたは日本の洗濯条件下で特に有用な顆粒洗濯洗剤組成物に使用される（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）。

いくつかの別の実施態様において、本発明は、本明細書で提供する少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む硬質表面洗浄組成物を提供する。従って、いくつかの実施態様において、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、６，３７６，４５０号及び６、３７６、４５０号で記載されるもののような硬質表面洗浄組成物である。

さらに別の実施態様において、本発明は、本明細書で提供する少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む食器洗浄組成物を提供する。従って、いくつかの実施態様において、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び６，３７６，４５０号の組成物のような硬質表面洗浄組成物である。さらに別の実施態様において、本発明は、本明細書で提供する少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む口腔洗浄組成物を提供する。いくつかの別の実施態様において、本発明の少なくとも一の変異体プロテアーゼを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び６，３７６，４５０号の組成物のようなオーラルケア組成物を含む。上述の米国特許第６，３７６，４５０号、６，６０５，４５８号及び６，６１０，６４２号に含まれる化合物及び洗浄添加剤の配合及び記述は、本明細書で提供する変異体プロテアーゼで使用される。

本発明の洗浄組成物は、任意の適した形態へ配合され、配合する者により選ばれる任意の過程で調製される。それらの非限定的な実施例は、米国特許第５，８７９，５８４号、５，６９１，２９７号、５，５７４，００５号、５，５６９，６４５号、５，５６５，４２２号、５，５１６，４４８号、５，４８９，３９２号及び５，４８６，３０３号で説明され、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。低ｐＨ洗浄組成物が望まれる場合、そのような組成物のｐＨは、モノエタノールアミンのような材料またはＨＣｌのような酸性物質の追加により調節される。

本発明の目的に必ずしも必要ではないが、以下で示す非限定的な記載の添加物が、本発明の洗浄組成物の使用に適する。いくつかの実施態様において、これらの添加物は、例えば、洗浄される基質の処理のための、洗浄性能を補助または増強するため、または香水、着色剤、染料等とともの場合のような洗浄組成物の美観を修飾するために組み込まれる。そのような添加物が、本発明の変異体プロテアーゼに加えられることが理解される。これらの追加成分の明確な特性及びそれらの組み込みの程度は、前記組成物の物理的形状及びその用いられる清浄作業の特性に依存する。適した添加剤は、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、色移り防止剤、沈殿補助剤、分散剤、追加酵素及び酵素安定化剤、触媒物質、漂白活性剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素源、あらかじめ形成された過酸（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｐｅｒａｃｉｄｓ）、ポリマー分散剤、粘土質土壌除去／再付着防止剤、増白剤、発泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌａｓｔｉｃｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、繊維柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤及び／または色素を含むが、それらに限られない。下記の開示に加えて、他のそのような添加物の適した例及び使用の程度は、米国特許第５，５７６，２８２号、６，３０６，８１２号及び６，３２６，３４８号で見られ、それらは参照により組み込まれる。上述の添加物成分は、本発明の洗浄組成物の残部を構成することが出来る。

いくつかの実施態様において、本発明に係る洗浄組成物は、界面活性剤または界面活性剤系を含む。ここで、前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、半極非イオン性界面活性剤及びそれらの混合物から選ばれる。

いくつかの追加の実施態様において、本発明の洗浄組成物は、一以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含む。ビルダーは、アルカリ金属、ポリリン酸のアンモニウムとアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類とアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダーポリカルボン酸化合物、エーテルヒドロキシカルボン酸塩、エチレンまたはビニルメチルエーテルを有する無水マレイン酸コポリマー、１，３，５‐トリヒドロキシベンゼン‐２，４，６‐トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、種々のアルカリ金属、エチレンジアミン４酢酸及びニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸のアンモニウム及び置換アンモニウム塩の他、メリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５‐トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸のようなポリカルボン酸、及びそれらの可溶性塩を含むが、それらに限られない。いくつかの別の実施態様において、本明細書の洗浄組成物は、キレート剤を含む。適したキレート剤は、銅、鉄及び／またはマンガンのキレート剤及びそれらの混合物を含む。

いくつかのさらに別の実施態様において、本明細書で提供する洗浄組成物は、沈澱補助剤を含む。適した沈澱補助剤は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸のような汚泥放出ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト及びそれらの混合物のような粘土を含む。

いくつかの追加の実施態様において、本発明の洗浄組成物はまた、一以上の色移り防止剤も含む。適したポリマー色移り防止剤は、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ‐オキシドポリマー、Ｎ‐ビニルピロリドンとＮ‐ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾールまたはそれらの混合物を含むが、それらに限られない。

いくつかのさらに追加の実施態様において、本発明の洗浄組成物は、分散剤も含む。適した水溶性有機物質は、ポリカルボン酸が二個以下の炭素原子によりお互いに分離される少なくとも二個のカルボキシルラジカルを含む、ホモまたはコポリマー酸またはそれらの塩を含む。

いくつかの特に好ましい実施態様において、前記洗浄組成物は、洗浄性能及び／または繊維のケアに効果のある一以上の洗剤酵素を含む。適した酵素の例は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、フォスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノール・オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リギニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルノニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼまたはそれらの混合物を含むが、それらに限られない。代表的な組み合わせは、少なくとも一のプロテアーゼ、少なくとも一のリパーゼ、少なくとも一のクチナーゼ及び／または少なくとも一のアミラーゼと共に少なくとも一のセルラーゼを含む従来の適用可能な酵素の反応混液である。

いくつかの別の実施態様において、洗浄組成物に使用される酵素は、任意の適した技術により安定化させられる。いくつかの実施態様において、酵素にイオンを提供する完成組成物中のカルシウム及び／またはマグネシウムイオンの水溶性供給源の存在により、本明細書で使用する酵素は、安定化されることが出来る。

いくつかのさらに別の実施態様において、本発明の洗浄組成物は、触媒金属錯体を含む。金属含有漂白触媒の一種は、銅、鉄、チタニウム、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンカチオンのような明確な漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン、亜鉛またはアルミニウムカチオンのようなわずかなまたは全く漂白触媒活性がない補助金属カチオン、及び特にエチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンリン酸）及びそれらの水溶性塩のような触媒及び補助金属カチオンに対して、明確な安定度定数を有するイオン封鎖錯体を含む触媒系である。これらのような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３号で開示される。

いくつかの実施態様において、本明細書の組成物は、マンガン化合物の手段により触媒される。そのような化合物及び使用レベルは、当該技術分野でよく知られ、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号で開示されるマンガンに基づく触媒を含む。加えて、本明細書で有用なコバルト漂白触媒が知られ、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び５，５９５，９６７号に記載される。そのようなコバルト触媒は、既知の方法により容易に調製可能であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び５，５９５，９６７号で開示されている。いくつかの実施態様において、本明細書で提供する組成物はまた、マクロポリサイクリック的剛性配位子（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｒｉｇｉｄ ｌｉｇａｎｄ）（すなわち、「ＭＲＬ」）の遷移金属錯体を適切に含む。実用的手段とし、限定手段ではないが、本明細書の組成物及び洗浄過程は、水性洗浄溶液中に少なくとも一億分の一の濃度の活性ＭＲＬ錯体を提供するよう調整可能であり、好ましくは、洗浄溶液中のＭＲＬが約０．００５ｐｐｍから約２５ｐｐｍ、より好ましくは、約０．０５ｐｐｍから約１０ｐｐｍ及び最も好ましくは約０．１ｐｐｍから約５ｐｐｍで提供される。本発明の遷移金属漂白触媒において、好ましい遷移金属は、マンガン、鉄及びクロムを含む。本明細書の好ましいＭＲＬは、５，１２‐ジエチル‐１，５，８，１２‐テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンのような特別種の架橋された超剛性配位子である。適切な遷移金属ＭＲＬは、例えば、ＷＯ００／３３２６０１及び米国特許第６，２２５，４６４号で開示されるような既知の方法で容易に調製出来る。

上述のように、本発明の洗浄組成物は、任意の適した形態へ配合され、配合する者により選択される任意の過程で調製される。これらの非限定的な例は、米国特許第５，８７９，５８４号、５，６９１，２９７号、５，５７４，００５号、５，５６９，６４５号、５，５１６，４４８号、５，４８９，３９２号及び５，４８６，３０３号に記載され、これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で開示する洗浄組成物は、所定の場所（例えば、所定の表面、食器または繊維）の洗浄に使用される。通常、前記の場所の少なくとも一部は、本発明の一の実施態様の洗浄組成物と、原液でまたは洗浄液に希釈されて接触する。次に、前記の場所は、任意に洗浄及び／または濯ぎを受ける。本発明の目的において、「洗浄」は、こすり洗いや機械的な撹拌を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、前記洗浄組成物は通常、溶液中で約５００ｐｐｍから約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は通常、約５℃から約９０℃の範囲である。前記の場所が繊維を含む場合、水対繊維の質量比は通常、約１：１から約３０：１である。

追加の実施態様において、本発明はさらに、洗剤組成物中のプロテアーゼの性能を解析し、改良するための種々の界面活性剤及び界面活性剤配合物を利用する組成物及び方法を提供する。実験計画ソフトウェアを用いて、シンプレックス格子混合実験を設計し、液体洗濯用洗剤中で最も一般に用いられる界面活性剤、すなわち、直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸塩（ＬＡＳ）、アルキルエトキシ硫酸塩（ＡＥＳ）及びアルコール・エトキシレート（ＡＥ）が存在する状態でのプロテアーゼの活性を評価した。ＬＡＳ及びＡＥＳは陰イオン界面活性剤であり、ＡＥは非イオン性界面活性剤である。

驚いたことに、プロテアーゼの最適性能のための界面活性剤組成物の選択が、単にプロテアーゼが最も安定する界面活性剤を選択するという問題ではないことが判明した。むしろ、最適な界面活性剤組成物の選択は、最良の全般的な洗浄結果を提供する比率で、異なる界面活性剤を組み合わせることに基づいた。ここで、前記混合物は、もし他の界面活性剤が存在しない状態において用いられた場合に、プロテアーゼを不安定化し得る界面活性剤を含む。

例えば、いくつかの実施態様において、プロテアーゼは、第１界面活性剤が存在する状態で、第２界面活性剤が存在する場合、より優れて機能出来るが、しかしながら、第３界面活性剤が存在する場合は、それほど機能しないことが判明した。追加の実施態様において、プロテアーゼは、第２及び第３界面活性剤の比率に依存して、大いに高いレベルの第１界面活性剤を許容する。界面活性剤の比率が注意深く選択されている場合に、異なる界面活性剤が存在する状態において酵素を用いることが出来るという所見は、酵素の使用を所定の洗剤組成物に制限し、酵素の活性に悪影響を及ぼさない界面活性剤との組み合わせでのみ酵素が用いられるに違いないという従来の信念に反する。

本明細書で説明する前記所見に一部基づき、本発明の組成物及び方法は、少なくとも一のプロテアーゼ及びプロテアーゼの活性を促進するためにあらかじめ選択された比率の界面活性剤の混合物を含む、洗剤組成物を提供する。ここで、前記界面活性剤は、各界面活性剤におけるプロテアーゼの安定性を測定するだけで選択されているのではない。いくつかの場合において、混合物中に、前記と同等の界面活性剤が異なる比率で存在する状態、または前記界面活性剤の任意のサブセットは存在するが、混合物中に少なくとも一の前記界面活性剤が存在しない状態で、前記プロテアーゼは不活性化されるかまたは活性が減少する。いくつかの場合において、混合物中に、前記界面活性剤のいずれか一は存在するが、混合物中に存在する他の前記界面活性剤がない状態で、前記プロテアーゼは不活性化されるかまたは活性が減少する。同様に、いくつかの場合において、第１界面活性剤の存在は、増加量の第２界面活性剤の使用を可能にする。ここで、第１界面活性剤がない状態での同量の第２界面活性剤は、前記プロテアーゼの活性を不活性化するか、減少させ得る。

加えて、第１の種類の界面活性剤（例えば、非イオンまたは陰イオン界面活性剤）の存在は、第２の種類の洗剤の使用を可能にする。ここで、第１の種類の界面活性剤が存在しない状態での第２の種類の洗剤は、プロテアーゼの活性を不活性化するか、減少させ得る。

これらの実験において、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ（「ＦＮＡ」、ジェネンコー）の他、この酵素の変異体が使用された。低温（すなわち、１６℃）において、比較的少量のＡＥ、及び多量のＡＥＳまたはＬＡＳのいずれか、または両方を含む組成物中で、前記プロテアーゼは活性があった。それに比べて、単にＡＥＳだけ、単にＬＡＳだけ、及び特に単にＡＥだけを含む組成物中では、前記プロテアーゼはそれほど活性がなかった。従って、好ましい組成物は、前記プロテアーゼの活性が最もあった、単一の界面活性剤だけを含むものではなく、むしろ、いずれかの一が単独かつ十分な濃度で使用された場合に、前記プロテアーゼの活性を不活性化するか減少し得る、少なくとも二、好ましくは三の全ての界面活性剤を含むものであった。ＡＥＳ＞ＬＡＳ＞ＡＥの特定の比率は、低温でこのプロテアーゼについての最善の結果をもたらすように思われた。

対照的に、高温（すなわち、３２℃）においては、及び単にＡＥＳだけ、またはＡＥＳとＬＡＳとの組み合わせ及び比較的少量のＡＥを含む組成物中で、前記プロテアーゼは活性があった。従って、ＡＥＳに対する耐性は、より高温で増加し、他の界面活性剤の包含をそれほど重要としていない。

いくつかの追加の試験も行った。インキュベーション後の前記プロテアーゼの活性は、ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質を使用して測定した。各洗剤配合物中の酵素の融点、Ｔｍを測定した。最後に、四の配合物が選択され、９６穴のアッセイ結果（実施例１７を参照されたい）との相関についてＴｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒで試験した。

定義
別途記載のない限り、本発明に係る実施は、分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡ分野で通常用いられる従来技術を含み、これらは当該技術分野の技術の範囲である。そのような技術は当業者に知られており、数多くの教科書及び参考文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年及びＡｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学における現在プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び刊行物は、すでに記載のもの、以下に記載するものを問わず、参照により明確に本明細書に組み込まれる。

別途記載のない限り、本明細書で用いる全ての技術及び科学上の用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。本明細書に含まれる用語を含む様々な科学用語辞典が当業者に周知であり、利用可能である。本明細書に記載の方法及び材料と同様のまたは同等の方法及び材料が本発明の実施または試験のために使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。従って、以下に定義される用語は明細書を全体として参照することによってより完全に規定される。本明細書で用いる単数形冠詞（ａ、ａｎ）及び定冠詞（ｔｈｅ）は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。数値範囲は、範囲を規定する数値も含むものとする。別途記載のない限り、核酸は左から右ヘ、５’末端から３’末端方向に、アミノ酸配列は左から右ヘ、アミノ基からカルボキシ基方向へ各々記載される。本発明は、当業者が使用する状況に依存し、変化することができ、記載された特定の手順、操作方法、及び試薬に限定されないことが理解される。

別途記載のない限り、本発明に係る実施は、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質配列決定の従来の技術を使用し、これらは当業者の技術の範囲である。

さらに、本明細書で提供する見出しは、多様な本発明の側面または実施態様を制限するものではない。これらは、明細書を全体として参照することにより理解されることが出来る。従って、以下に定義される用語は明細書を全体として参照することによってより完全に規定される。それにもかかわらず、本発明の理解を促進するために、多くの用語が下記に定義される。

本明細書で用いる「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の語は、ペプチドまたはペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質またはペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するための良く知られた方法は数多くある（例えば、生化学工学／生命工学における進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８８年内のＫａｌｉｓｚ、「微生物プロテインナーゼ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）」を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を分析する比較検定法により、確認されることが出来る。そのようなプロテアーゼまたはタンパク質分解活性の分析に有用な代表的な基質は、ジメチルカゼイン（シグマＣ−９８０１）、ウシ・コラーゲン（シグマＣ−９８７９）、ウシ・エラスチン（シグマＥ−１６２５）及びウシ・ケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ９０２１１１）を含むが、それらに限られない。これらの基質を用いた比色分析は、当業者に良く知られている（例えば、ＷＯ９９／３４０１１及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい。両文献は、参照により本明細書に援用する）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９９巻、３１６−３２０頁、１９７９年を参照されたい）も、勾配溶離の際に収集される断片の活性酵素濃度の決定で使用される。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解したときに放出されるｐ−ニトロアニリンの比率を測定する。加水分解反応からの黄色の生産速度が４１０ｎｍの比色計で測定され、活性酵素の濃度が計算される。さらに、２８０ｎｍの吸光度をタンパク質の総濃度を測定するために用いることが出来る。活性酵素／総タンパク質の比率が酵素の精製度を示す。

本明細書で用いる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」は、「バチルス」属に属すると当業者により認識される全ての種を含む。これは、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィリス、Ｂ．アルカノフィリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．スクラウジィ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．レンタス及びＢ．スリンギエンシスを含むが、それらに限られない。バシルス属は分類上再編成され続けていることが認識される。従って、前記の属は、現在はゲオバシルス・ステアロサーモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれているＢ．ステアロサーモフィリスのような有機体も含むが、それらに限定されない、再分類されている種を含むことが意図される。酸素の存在下で耐性のある内性胞子を生産することは、バシルス属の特徴であると定義されている。もっとも、この特徴は、近年分類されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバージバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）についても当てはまる。

本明細書で相互置換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、本明細書において、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの多量体型をいう。この用語は、一重鎖、二重鎖または三重鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的に、生物学的に修飾された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むが、それらに限られない。以下にポリヌクレオチドの非限定的な例を示す。すなわち、遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、ＥＳＴ、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似物、ウラシル、その他の糖及びフルオロリボース及びチオエイトのような結合基及びヌクレオチド分岐等の修飾されたヌクレオチドを含む。別の実施態様において、ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により阻害される。

本明細書で用いる「ＤＮＡ構築物」及び「形質転換ＤＮＡ」の語は、宿主細胞または有機体に配列を導入するために用いるＤＮＡをいうために相互置換可能に使用される。このＤＮＡは、ＰＣＲによりインビトロで生産されるかまたは当業者に知られている任意の他の適した方法で生産される。特に好ましい実施態様において、ＤＮＡ構築物は、（例えば、挿入配列として）目的の配列を含む。いくつかの実施態様において、この配列は、制御エレメント等（例えば、プロモーター等）の付加的なエレメントと操作可能に連結される。ＤＮＡ構築物はさらに、選択マーカーを含むことが出来る。さらに、ホモロジーボックスの傍にある挿入配列を含むことが出来る。別の実施態様において、形質転換ＤＮＡは、末端に付加している非相同配列を含む（例えば、スタッファー配列またはフランク等）。いくつかの実施態様において、挿入配列の末端を閉じて、形質転換ＤＮＡの閉鎖環を形成する。形質転換配列は、野生型、変異体または修飾されていることが出来る。いくつかの実施態様において、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の実施態様において、ＤＮＡ構築物は、非相同配列を含む。一旦、ＤＮＡ構築物がインビトロで構築されると、それは、１）異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び／または２）宿主細胞の染色体の領域を変異させるため（即ち、内性の配列を異種の配列で置換）、及び／または３）標的遺伝子を欠失させるため、及び／または４）宿主細胞に組換えプラスミドを導入するために用いられる。

本明細書で用いる「発現カセット」及び「発現ベクター」の語は、標的細胞内で特定の核酸の転写を可能とする、一連の特定の核酸エレメントで、組み換え的にまたは合成的に生産された核酸構築物をいう。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に取り込まれることが出来る。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列の中で、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好ましい実施態様において、発現ベクターは、宿主細胞内で異種のＤＮＡ断片を取り込み、発現する能力を有する。多くの真核及び原核発現ベクターが市販されている。好適な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。「発現カセット」の語は、本明細書で「ＤＮＡ構築物」と相互置換可能に用いられ、これらの語は同義である。

本明細書で用いる「ベクター」の語は、核酸を一以上の種類の細胞に導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド及びカセット等を含む。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド構築物は、適した宿主の中でＤＮＡの発現に影響を与えることが出来る適したプロ配列（例えば、分泌等）と操作可能に連結されるプロテアーゼ（例えば、前駆体及び成熟プロテアーゼ）をコードするＤＮＡ配列を含む。

本明細書で用いる「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いる環状二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成するか、または宿主染色体に統合することが出来るものをいう。核酸配列を細胞に導入することに関連して本明細書で用いる「導入する」の語は、細胞に核酸配列を転移させるために適した任意の方法をいう。そのような導入の方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、結合及び形質導入を含むが、それらに限られない（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ他編集、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）出版社、５７−７２ページ、１９８９年内のＦｅｒｒａｒｉ他、「遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」を参照されたい）。

本明細書で用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」の語は、そのゲノム内に、または少なくとも二世代にわたり維持されるエピソームプラスミドとして、統合される非天然の（異種の）ポリヌクレオチド配列を有する細胞をいう。

核酸は、他の核酸配列と機能的関係に位置する場合に「操作可能に連結する」という。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結し、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に操作可能に連結し、または翻訳に作用するように位置する場合、リボソーム結合部位はコーディング配列に操作可能に連結するという。一般に、「操作可能に連結する」とは、連結するＤＮＡ配列が隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接し、かつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも隣接しない。連結は、便宜的な制限部位でライゲーションされることにより行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の方法により用いられる。

本明細書で用いる「遺伝子」の語は、ポリペプチドをコードし、コーディング領域の前及び後ろに続く領域の他、個々のコーディング・セグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）をいう。

本明細書で用いる「相同遺伝子」の語は、異なるが通常関連する種に由来する一組の遺伝子を意味する。これらはお互いに対応し、お互いに同一であるか非常に似ている。この語は、スペシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の発達）（例えば、オーソログ遺伝子）の他に、遺伝子複製により分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）も含む。

本明細書で用いるように、タンパク質は、同じ配列において、同じトポロジー結合を有する同じ主要２次構造を有する場合、共通の「折りたたみ」を有すると定義される。同じ折りたたみを有する異なるタンパク質はしばしば、２次構造の末端エレメント及びサイズ及び立体構造において異なるターン領域を有するいくつかの場合において、これらの異なる末端領域は、構造の半分を占める場合がある。同じ折りたたみカテゴリに置かれたタンパク質は、必ずしも共通の進化の祖先を有しているわけではない（例えば、特定のパッキング配列及び鎖トポロジーを支持するタンパク質の物理性及び化学性由来の構造的類似性）。

本明細書で用いる「相同性」の語は、配列類似性または同一性をいい、同一性であることが好ましい。この相同性は、当該技術分野で知られる標準的な方法で測定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、第２巻、４８２頁、１９８１年、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３頁、１９７０年、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、２４４４頁、１９８８年、ウィスコンシン・ジェネティックス（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアパッケージ（ジェネティックス・コンピューター・グループ、マディソン、ウィスコンシン州）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのようなプログラム及びＤｅｖｅｒｅｕｘ他、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、第１２巻、３８７−３９５頁、１９８４年を参照されたい）。

本明細書で用いる「アナロガス配列」の語は、遺伝子の機能が、ＢＰＮ’プロテアーゼに基づく遺伝子と本質的に同じである配列をいう。アナロガス配列は配列アラインメントの既知の方法により決定される。通常用いられるアラインメント法は、ＢＬＡＳＴである。もっとも、上記及び下記で示すような、配列を整列する他の方法も用いられる。

有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズ・アラインメントを用いて、関連配列グループから複数の配列アラインメントを作り出す。このアラインメントを作り出すためにクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることが出来る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブ・アラインメント法の簡略化したものを用いる（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、第３５巻、３５１−３６０頁、１９８７年）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより説明されるものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、第５巻、１５１−１５３頁、１９８９年）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングスウエイト、及び加重エンドギャップを含む。

有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等により説明されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年及びＫａｒｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、５８７３−５７８７頁、１９９３年）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２６６巻、４６０−４８０頁、１９９６年を参照されたい）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、大部分がデフォルト値であるいくつかのサーチパラメーターを用いる。調節可能なパラメーターは、以下の値に設定されている。すなわち、オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１である。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的値であり、特定の配列の構成及びサーチされる目的の配列に対する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自身により確立される。しかしながら、この値は、感受性を高めるために調節することが出来る。アミノ酸配列同一性の％値は、同一残基適合数を、整列された領域における「より長い」配列の残基の総数で割ることにより決定される。「より長い」配列は、整列された領域において最も実際的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視される）。

従って、「核酸配列同一性のパーセンテージ（％）」は初期の配列（すなわち、目的の配列）の核酸残基と同一である候補配列中の核酸残基のパーセンテージであると定義される。好ましい方法は、デフォルトパラメータが設定され、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定されているＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを用いる。

本明細書で用いる「組み換え」の語は、異種核酸配列の導入により修飾されている細胞またはベクター、またはそのように修飾された細胞由来の、細胞またはベクターについての言及を含む。従って、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）の形態中に同一形態としては見られない遺伝子を発現するか、または計画された人為的介入の結果、過剰に発現する、不十分に発現する、またはまったく発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える」及び「組み換え」核酸配列を生産することは通常、二以上の核酸断片をキメラ遺伝子が生じるように組み立てることを意味する。

いくつかの好ましい実施態様において、変異体ＤＮＡ配列は、少なくとも一のコドンにおける飽和突然変異誘発を用いて生産される。他の好ましい実施態様において、飽和突然変異は、二以上のコドンにおいて実施される。別の実施態様において、変異体ＤＮＡ配列は、野生型配列に対して、約５０％より多い、約５５％より多い、約６０％より多い、約６５％より多い、約７０％より多い、約７５％より多い、約８０％より多い、約８５％より多い、約９０％より多い、約９５％より多い、または約９８％より多い配列相同性を有する。別の実施態様において、変異体ＤＮＡは、例えば、放射線、ニトロソグアニジン（ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の任意の既知の変異作成法を用いてインビボで生産される。次に、所望のＤＮＡ配列は単離され、本明細書で提供する方法に用いられる。

本明細書で用いる「増幅」及び「遺伝子増幅」の語は、特定のＤＮＡ配列が不均衡に複製され、増幅された遺伝子がゲノム中の初期に存在する遺伝子のコピー数よりも多くなる過程をいう。いくつかの実施態様において、薬物（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下の増殖による細胞の選択が、その薬物存在下の増殖のために必要な遺伝子生産物をコードする内因性の遺伝子の増幅またはこの遺伝子産物をコードする外因性（すなわち、挿入）配列の増幅、またはその両方をもたらす。

「増幅」は、テンプレート特異性を含む核酸複製の特別な場合である。非特異的テンプレート複製で構築される（すなわち、テンプレート依存性ではあるが特定のテンプレートには依存していない複製である）。テンプレート特異性は、本明細書において、複製の忠実性（すなわち、正確なポリヌクレオチド配列の合成）及び（リボまたはデオキシ）ヌクレオチド特異性とは区別して用いられる。テンプレート特異性はしばしば、「標的」特異性に関して記載される。標的配列は、他の核酸から選び出されるように求められるものであるという意味において「標的」である。増幅技術は主に、この選び出しのために設計されている。

本明細書で用いる「プライマー」の語は、核酸ストランドに相補的であるプライマー伸長生産物の合成が誘導される条件下（即ち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下、好適な温度とｐＨ）におかれた場合に、合成の開始点として作用することが出来る、精製された制限消化により自然発生するか、または合成的に生産されたオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、プライマーは増幅の最大効率のためには一重鎖であるが、代替的には二重鎖とすることも出来る。二重鎖を用いる場合、プライマーは、初めに各鎖を分離する処理が行われ、その後伸長生産物の調整に用いられる。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長生産物の合成を準備するために十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源及び用いる方法を含む、多くの要因に依存する。

本明細書で用いる「プローブ」の語は、他の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが出来る、精製された制限消化のように自然発生的にまたは合成的に、組み換え的にまたはＰＣＲ増幅により得られたオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）をいう。プローブは一重鎖または二重鎖とすることが出来る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明に用いる任意のプローブは、酵素（例えば、ＥＬＩＺＡの他、酵素に基づく組織学的アッセイ）、蛍光法、放射線法及び発光法を含むが、それらに限られない任意の検出系において、検出することが出来るように、任意の「レポーター分子」で標識されることが意図される。本発明を任意特定の検出法または標識に限定することは意図しない。

本明細書で用いる「標的」の語は、ポリメラーゼ連鎖反応についての言及に用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるためのプライマーにより結合される核酸領域をいう。従って、「標的」は、他の核酸配列から選び出されることが求められる。「セグメント」は、標的配列の中の核酸の領域であると定義される。

本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）の語は、クローニングまたは精製をせずに、ゲノムＤＮＡの混合物中で、標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法を含み、参照により本明細書に援用される米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４、９６５，１８８号の方法をいう。この標的配列を増幅する過程は、二つのオリゴヌクレオチド・プライマーの十分過度の量を所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入する工程、それに続くＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な熱サイクルを連続して行う工程から成る。二つのプライマーは、二重鎖標的配列の各鎖に相補的である。増幅を実行するために、前記混合物は変性され、その後プライマーは標的分子中の相補配列にアニーリングされる。アニーリングに続いて、プライマーは、新しい一対の相補鎖を形成するためにポリメラーゼにより伸長される。変性の工程、プライマー・アニーリング及びポリメラーゼ伸長は、高濃度の所望の標的配列の増幅セグメントを得るために何度も繰り返すことが出来る（すなわち、変性、アニーリング及び伸長は、一つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が行われることが出来る）。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの互いの相対的位置により決まり、そのため、この長さは調節可能なパラメータである。前記過程は繰り返されることから、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下ＰＣＲという）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが、混合物中で（濃度において）主な配列となることから、これらのことをＰＣＲ増幅物と言う。

本明細書で用いる「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸テンプレート及び増幅用酵素以外に必要な増幅のための試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩、緩衝液等）をいう。通常、増幅試薬は、他の反応成分と共に反応管（試験管、マイクロウェル等）内に含まれる。

本明細書で用いる「ＲＴ−ＰＣＲ」の語は、ＲＮＡ配列の複製及び増幅することをいう。この方法において、逆方向転写をＰＣＲに組み合せ、最も頻繁に熱安定性ポリメラーゼを用いる一の酵素的な方法を用いる。この方法は、米国特許第５，３２２，７７０に記載され、参照により本明細書に援用される。ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡテンプレートは、ポリメラーゼの逆転写活性によりｃＤＮＡに転換され、その後、（すなわち、ＰＣＲ方法に見られるように）ポリメラーゼの重合活性により増幅される。

本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語は、特定のヌクレオチド配列で、またはその付近でそれぞれが二重鎖ＤＮＡを切断する細菌性酵素をいう。

「制限部位」とは、所定の制限エンドヌクレアーゼにより認識され、切断される核酸配列をいい、しばしば、この部位はＤＮＡ断片に挿入される部位でもある。本発明の特定の実施態様において、制限部位は選択マーカー内に設計され、ＤＮＡ構築物の５’末端及び３’末端に導入される。

「相同組み換え」の語は、二つのＤＮＡ分子間または一対の染色体間のＤＮＡ断片を同一の部位または近くの同一核酸配列とで交換することを意味する。好ましい実施態様において、染色体の統合は相同組み換えである。

本明細書で用いる「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列、あるいはそれらの一部分をいう。「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」の語は、相互置換可能に使用される。

本明細書で用いる「目的のタンパク質」及び「目的のポリペプチド」の語は、目的の及び／または評価されるタンパク質／ポリペプチドをいう。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は細胞内で発現され、他の実施態様において、それは分泌ポリペプチドである。特に好ましい実施態様において、これらの酵素は、本発明のセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施態様において、目的のタンパク質は、シグナルペプチドと融合する分泌ポリペプチドである（すなわち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端伸長）。ほとんど全ての分泌タンパク質は、膜を横断する前駆体タンパク質を標的とするか、またはこの輸送に重要な役割をしているアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は、膜輸送の間または膜輸送の直後に、シグナルペプチダーゼにより、タンパク質を分解するように除去される。

ポリヌクレオチドは、天然の状態においてまたは当業者により既知の方法で操作される場合において、それが転写及び／または翻訳されてそのＲＮＡ、ポリペプチドまたはそれらの断片を生産する場合、ＲＮＡまたはポリペプチドを「コードする」と言う。そのような核酸のアンチセンス鎖も、この配列をコードする。当該技術分野で知られるように、ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼにより転写され、ＲＮＡを生産する。しかしながら、ＲＮＡは、逆転写酵素により逆転写されて、ＤＮＡを生産することも出来る。従って、ＤＮＡはＲＮＡをコードし、その逆も成立することが出来る。

「宿主株」または「宿主細胞」の語は、本発明に係るＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主をいう。

酵素が対応する野生型細胞において発現されるレベルよりも高いレベルで細胞内で発現された場合、酵素は宿主細胞内で「過剰発現」しているという。

「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、本明細書で相互置換可能に使用される。本明細書を通してアミノ酸には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法合同委員会（Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｒｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、ＪＣＢＮ）に基づいて規定された三文字コードが使用される。遺伝子コードの退縮により、一のポリペプチドが一以上の核酸配列によりコードされることも理解されている。

「プロ配列」は、プロテアーゼの分泌に必要な、シグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼをもたらす。

「シグナル配列」または「シグナルペプチド」の語は、タンパク質の成熟形または前駆型の分泌に関与するヌクレオチド及び／またはアミノ酸の任意の配列をいう。シグナル配列の定義は、機能的なものであり、タンパク質の分泌に影響を与えるタンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。これらはしばしば、しかし例外はあるが、タンパク質のＮ末端部分または前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合する。シグナル配列は内因性または外因性のものとすることが出来る。このシグナル配列は通常、タンパク質（例えば、プロテアーゼ）に関連するか、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来のものとすることが出来る。外因性シグナル配列の一例としては、バシルス・レンタス（ＡＴＣＣ２１５３６）由来のズブチリシンのシグナル配列の残部に融合されたバシルス・ズブチリス・ズズブチリシン由来のシグナル配列の最初の七個のアミノ酸残基を含む。

「ハイブリッドシグナル配列」の語は、配列の一部分が発現される遺伝子のシグナル配列に融合された発現宿主から得られるシグナル配列をいう。いくつかの実施態様において、合成配列が用いられる。

タンパク質またはペプチドの「成熟」形の語は、タンパク質またはペプチドの最終的な機能形態をいう。例えば、本発明のプロテアーゼの成熟形は、少なくとも配列番号２の残基位置１−２７５と同一のアミノ酸配列を含む。

タンパク質またはペプチドの「前駆体」形態の語は、タンパク質のアミノまたはカルボニル末端に操作可能に連結するプロ配列を有するタンパク質の成熟形をいう。前駆体は、プロ配列のアミノ末端と操作可能に連結する「シグナル」配列も有することが出来る。前駆体は、翻訳後の活性を伴う付加的なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質またはポリペプチドの成熟形から切断されたポリヌクレオチド）も有することが出来る。

「自然発生の酵素」及び「自然発生のタンパク質」は、自然に見られるものと同一の修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素をいう。自然発生の酵素は、天然酵素、特定の微生物中で自然に発現されるまたは見られる酵素を含む。

「由来の」及び「から得られた」の語は、問題となる有機体の株より生産されたまたは生産可能なプロテアーゼだけでなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列でコードされるプロテアーゼ及びそのようなＤＮＡ配列を含む宿主有機体で生産されたプロテアーゼもいう。加えて、この語は、合成ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列でコードされるプロテアーゼをいい、このプロテアーゼは問題となるプロテアーゼの同定された特性を有する。

この定義の範囲内において、「誘導体」の語は一般的に、誘導体が野生型、天然又親形態と同様の目的のために有用な誘導体であるという程度において、野生型、天然または親形態において見られるタンパク質分解活性の特性を有する。セリン・プロテアーゼの機能的な誘導体は、自然発生、合成または組み換えにより生産されたポリペプチドまたはペプチド断片を含み、それらは、本発明のセリン・プロテアーゼの一般的な特性を有する。

「機能的な誘導体」の語は、セリン・プロテアーゼをコードする核酸の機能的な特性を有する核酸の誘導体をいう。本発明のセリン・プロテアーゼをコードする核酸の機能的な誘導体は、自然発生、合成または組み換えにより生産された核酸または断片を含み、本発明のセリン・プロテアーゼの特性をコードする。本発明に係るセリン・プロテアーゼをコードする野生型核酸は、自然発生対立遺伝子及び当該技術分野で知られる遺伝子コードの退縮に基づく相同体を含む。

二つの核酸配列またはポリペプチド配列に関連する「同一」の語は、以下の配列比較または配列解析アルゴリズムの一を用いて測定する際、最大の一致で整列した時に、二つの配列における残基が同じであることをいう。

「最適アラインメント」の語は、最も高い同一性のパーセンテージスコアを有するアラインメントをいう。

二つの（必要に応じた）アミノ酸、ポリヌクレオチド及び／または遺伝子配列に関して「配列同一性パーセント」、「アミノ酸配列同一性パーセント」、「遺伝子配列同一性パーセント」及び／または「核酸／ポリヌクレオチド配列同一性パーセント」の語は、配列を最適に整列した場合に、二つの配列において同一の残基のパーセンテージをいう。従って、８０％のアミノ酸配列同一性は、二つの最適に整列されたポリペプチド配列において８０％のアミノ酸が同一であることを意味する。

従って、二つの核酸またはポリペプチドに関連して「実質的に同一」の語は、標準的なパラメーターを用いてプログラムまたはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を用いた対象の配列と比べ、少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性及び好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。二つのポリペプチドが実質的に同一であるという指摘は、第一ポリペプチドが免疫学的に第二ポリペプチドと交差反応性があることである。通常、同類アミノ酸置換により異なるポリペプチドが、免疫学的に交差反応性がある。従って、例えば、二つのペプチドが同類置換でのみ異なる場合、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一であると言う。二つの核酸配列が実質的に同一であるという他の指摘は、二つの分子がストリンジェントな条件において（例えば、中度から高度なストリンジェント条件の範囲内において）互いにハイブリダイズすることである。

この文脈で「同等物」の語は、中度から高度なストリンジェント条件下で、配列番号１で示す配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドでコードされるセリン・プロテアーゼ酵素をいう。例えば、同等物となることは、相当する成熟セリン・プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢＰＮ’セリン・プロテアーゼと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を含むことを意味する。

「単離された」または「精製された」の語は、本来の環境（例えば、それが自然発生的なものであるならば自然環境）から分離された物質をいう。例えば、この物質は、自然発生または野生型有機体と比較したときに、特定の組成物内でより高いまたはより低い濃度で存在するか、または自然発生または野生型有機体から発現する上では通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製された」と言う。例えば、生きた動物中に存在する自然発生のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていない。しかしながら、自然系において共存している物質のいくつかまたは全てを分離した、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言う。いくつかの実施態様において、そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、さらにそのようなベクターまたは組成物は自然環境の一部ではないという点で、単離されていると言う。好ましい実施態様において、例えば、電気泳動またはブロットにおいて実質的に一つのバンドか検出される場合、核酸またはタンパク質は精製されていると言う。

「単離された」の語は、ＤＮＡ配列に対して用いる場合、本来の遺伝的環境から分離されているＤＮＡ配列をいい、従って、これは他の外来または不要なコーディング配列を有しておらず、遺伝子操作によるタンパク質生産系での使用に適した形態である。そのような単離された分子は、それらの本来の環境から分離されており、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含む。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関連する他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーターのような自然発生の５’及び３’非翻訳領域を含むことが出来る。関連領域の同定は、当業者に明白である（例えば、Ｄｙｎａｎ及びＴｉｊａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、第３１６巻、７７４−７８頁、１９８５年を参照されたい）。「単離されたＤＮＡ配列」の語は、代替的に「クローン化されたＤＮＡ配列」ともいう。

「単離された」の語は、タンパク質について用いる場合、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質をいう。好ましい状態において、単離されたタンパク質は実質的に、他のタンパク質、特に、他の同種タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される場合、約１０％より高く、好ましくは約２０％より高く、さらに好ましくは約３０％より高く精製されている。本発明の別の側面において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される場合、高度に（すなわち、約４０％より高く、約６０％より高く、約８０％より高く、約９０％より高く、約９５％より高く、約９７％より高く及び約９９％より高く）精製されたタンパク質を含む。

本明細書で用いる「組み合わせ変異誘発」の語は、初期配列の変異体のライブラリーを生産する方法をいう。これらのライブラリーにおいて、変異体は、変異のあらかじめ決められた組から選択される一またはいくつかの変異を含む。加えて、この方法は、変異のあらかじめ決められた組の構成要素ではないランダム変異を導入する手段を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は２０００年１０月２６日にファイルされた米国特許出願第０９／６９９，２５０号に記載の方法を含む。この文献は、参照により本明細書に援用される。代替的な実施態様において、組み合わせ変異誘発法は、市販のキットを含む（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）マルチサイト、ストラタジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）。

本明細書で用いる「変異体のライブラリー」の語は、それらのゲノムの大部分が同一であるが、一以上の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団をいう。そのようなライブラリーは、例えば、改良された形質を有する遺伝子またはオペロンを同定するために用いることが出来る。

本明細書で用いる「開始遺伝子」の語は、本発明を用いて改良された及び／または変更された目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子をいう。

本明細書で用いる「多配列アラインメント」（「ＭＳＡ」）の語は、アルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）を用いて整列される、開始遺伝子の複数の相同体の配列をいう。

本明細書で用いる「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」の語は、比較される特定のタンパク質または目的の配列の全ての変異体に対して原型であるアミノ酸配列をいう。この用語はまた、目的のＤＮＡ配列中に最も多く存在するヌクレオチドを示す配列をいう。遺伝子の各位置に対して、コンセンサス配列は、ＭＳＡにおける位置という点で最も豊富なアミノ酸を与える。

本明細書で用いる「コンセンサス変異」の語は、開始遺伝子の配列とコンセンサス配列における差異をいう。コンセンサス変異は、開始遺伝子の配列とＭＳＡにより得られたコンセンサス配列を比較することにより同定される。いくつかの実施態様において、コンセンサス変異は、コンセンサス配列とより類似するように開始遺伝子に導入される。コンセンサス変異はまた、開始遺伝子におけるアミノ酸を、その位置での開始剤遺伝子におけるアミノ酸の頻度に比べ、ＭＳＡにおいてより高い頻度で見られるアミノ酸に改変するアミノ酸の変化を含む。従って、コンセンサス変異の語は、開始遺伝子のアミノ酸を、ＭＳＡでより豊富に存在するアミノ酸で置き換える、全ての単一アミノ酸の変化を含む。

本明細書で用いる「初期ヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｉｔ）の語は、組み合わせコンセンサス変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体をいう。好ましい態様において、イニシャルヒットは開始遺伝子と比べ、改良された性能特性を有する。

本明細書で用いる「改良されたヒット」の語は、向上した組み合わせコンセンサス変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体をいう。

本明細書で用いる「改良された変異」及び「性能が向上した変異」の語は、開始遺伝子に導入された場合に、改良された性能を示す変異をいう。いくつかの好ましい実施態様において、これらの変異は、前記方法のスクリーニング工程の際に同定されるシークエンシング・ヒット（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈｉｔｓ）により同定される。ほとんどの実施態様において、ヒット中により頻繁に見られる変異は、スクリーニングされていない組み合わせコンセンサス変異誘発ライブラリーと比べ、改良された変異であることが多い。

本明細書で用いる「向上した組み合わせコンセンサス変異誘発ライブラリー」の語は、ＣＣＭ変異誘発及びスクリーニングの初期のラウンドから得られたスクリーニング及び／または配列決定に基づいて設計され、構築されたＣＣＭライブラリーをいう。いくつかの実施態様において、向上したＣＣＭライブラリーは、ＣＣＭの初期のラウンドから得られたイニシャルヒットの配列に基づく。追加の実施態様において、向上したＣＣＭは、変異誘発及びスクリーニングの初期ラウンドから得られたイニシャルヒットにおいて頻繁に見られる変異が好ましくなるように設計される。いくつかの好ましい実施態様において、これは、初期のＣＣＭライブラリーにおいて用いられる他のプライマーと比べ、性能−低下変異をコードするプライマーを除外するまたは性能−向上変異をコードするプライマーの濃度を増加することにより、達成することが出来る。

本明細書で用いる「性能−低下変異」の語は、スクリーニングされていないコンセンサス変異誘発ライブラリーと比べ、スクリーニングから得られたヒットにおいてより低い頻繁で見られるコンセンサス変異誘発ライブラリーにおける変異をいう。好ましい実施態様において、スクリーニング過程は、「性能−低下変異」を含む多数の変異体を除去及び／または減少させる。

本明細書で用いる「機能性アッセイ」の語は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイをいう。特に好ましい実施態様において、この語は、タンパク質がその通常の能力において機能する性能について分析されるアッセイ系をいう。例えば、酵素の場合、機能性アッセイは、反応を触媒する酵素の有効性を決定することを含む。

本明細書で用いる「標的特性」の語は、改変される開始遺伝子の特性をいう。本発明を任意特定の標的特性に限定することは意図しない。しかしながら、いくつかの好ましい実施態様において、この標的特性は、遺伝子生産物の安定性であるが（例えば、変性、タンパク質分解性またはその他の分解因子に対する耐性）、他の実施態様において、生産宿主における生産レベルが改変される。実際に、開始遺伝子の任意の特性が本発明に使用されることが意図される。

核酸に関連して本明細書で用いる「特性」またはその同義語は、選択または検出することが出来る核酸の任意の特性または属性をいう。これらの特性は、ポリペプチドへの結合に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与えられた特性、遺伝子転写に影響する特性（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター制御、エンハンサー機能）、ＲＮＡプロセシングに影響する特性（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡコンフォメーション及び／または転写後の修飾）、翻訳に影響する特性（例えば、レベル、制御、ｍＲＮＡのリボゾームタンパク質への結合、翻訳後の修飾）を含むが、それらに限られない。例えば、核酸の転写因子についての結合部位、ポリメラーゼ、制御因子等は所望の特質を生産するためにまたは望ましくない特性を同定するために、改変される。

（タンパク質を含む）ポリペプチドに関連して本明細書で用いる「特性」またはその同義語は、選択または検出されるポリペプチドの任意の特性または属性をいう。この特性は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する耐性、Ｋ_Ｍ、ｋ_ｃａｔ、ｋ_ｃａｔ／ｋ_Ｍ比、タンパク質折りたたみ、免疫反応誘発性、リガンドへの結合性、レセプターへの結合性、分泌性能、細胞表面へ提示される能力、オリゴマー化性能、シグナル性能、細胞増幅の刺激性能、細胞増殖の抑制性能、アポトーシス誘発性能、リン酸化またはグリコシル化により修飾される能力及び／または病気を治癒する能力等を含むが、それらに限られない。

本明細書で用いる「スクリーニング」の語は、通常当該技術分野で用いられる意味を有し、一般に、多工程過程をいう。第一工程において、変異体核酸または変異体ポリペプチドが提供される。第二の工程において、変異体核酸または変異体ポリペプチドの特性が決定される。第三の工程において、決定された特性が、対応する前駆体核酸の特性、対応する自然発生のポリペプチドの特性または変異体核酸の生産のための開始物質（例えば、開始配列）と比較される。

改変された特性を有する核酸またはタンパク質を得るためのスクリーニング手順は、開始物質の特性及び変異体核酸の生産の促進が意図される修飾に依存することが、当業者に明らかである。従って、本発明は、スクリーンされる任意特定の特性に限定されず、以下の特性に関する記載は単に例示するのみであることが当業者に理解される。任意特定の特性のスクリーニング方法は一般に、当該技術分野で説明される。例えば、当業者は、結合、ｐＨ、特異性等を変異の前後で測定することができ、それらの変化が改変を示している。好ましいスクリーニングは、チップ、ファージディスプレイ及び複数基質及び／または指標を利用するアッセイを含むが、それらに限られない、複数のサンプルを同時にスクリーニングすることを含む、高い処理能力の方法で行われる。

いくつかの実施態様において、本明細書で用いるスクリーニングは、変異体の集団から目的の変異体を豊富に含むようにする選択工程を含む。これらの実施態様の例は、宿主有機体の生育を有利にする変異体の選択の他、ファージディスプレイまたは結合能または触媒特性に基づき、変異体を変異体の集団から捕捉することが出来る任意の他のディスプレイ法を含む。好ましい実施態様において、変異体のライブラリーは、ストレスに暴露され（熱、プロテアーゼ、変性）、続いて、已然としてインタクトである変異体をスクリーニングにおいて同定しまたは選択により高濃度化する。この語は、選択のための任意の適した手段を含むことが意図される。実際に、本発明を任意特定のスクリーニング方法に限定することは意図しない。

本明細書で用いる「標的無作為化」の語は、一またはいくつかの位置が無作為化されている複数の配列を生産する過程をいう。いくつかの実施態様において、無作為化は完全に行われる（すなわち、四つ全てのヌクレオチド、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣが無作為な位置に生じる）。別の実施態様において、ヌクレオチドの無作為化は、四つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的無作為化は、目的の一またはいくつかの位置をコードする、一またはいくつかの配列のコドンに適用することが出来る。発現したときに、得られたライブラリーは、タンパク質集団を生産する。このタンパク質集団において、無作為化コドンの無作為化スキームにより決定されるように、一以上のアミノ酸位置が、２０全てのアミノ酸またはアミノ酸のサブセットの混合物を含む。いくつかの実施態様において、標的無作為化から得られた集団の個々の構成要素は、標的にされたまたは無作為化挿入または欠失されたコドンに依存してアミノ酸数が異なる。別の実施態様において、合成アミノ酸は生産されるタンパク質の集団の中に含まれる。いくつかの好ましい実施態様において、標的無作為化の結果得られた集団の主な構成要素は、開始遺伝子よりもコンセンサス配列に対する配列相同性がより高い。いくつかの実施態様において、この配列は一以上の目的のタンパク質をコードする。別の実施態様において、タンパク質は異なる生物学的機能を有する。いくつかの好ましい実施態様において、挿入配列は、少なくとも一の選択マーカーを含む。この配列は、目的の一以上のタンパク質をコードすることが出来る。それは、他の生物学的機能を有する。多くの場合、挿入配列は、抗生物質耐性を与える遺伝子等の選択マーカーを含む。

「修飾配列」及び「修飾遺伝子」の語は、本明細書で相互置換可能に使用され、欠失、挿入または自然発生の核酸配列の阻害を含む配列をいう。いくつかの好ましい実施態様において、修飾配列の発現生産物は、切断されたタンパク質である（例えば、修飾が配列の欠失または中断である場合）。いくつかの特に好ましい実施態様において、前記切断されたタンパク質は生物活性を保持する。別の実施態様において、修飾配列の発現生産物は、伸長されたタンパク質である（例えば、修飾が核酸配列内への挿入を含む場合）。いくつかの実施態様において、挿入は切断タンパク質をもたらす（例えば、挿入が停止コドンの形成をもたらす場合）。従って、挿入は発現生産物として、切断タンパク質または伸長タンパク質のいずれかをもたらす。

本明細書で用いる「変異体配列」及び「変異体遺伝子」の語は、相互置換可能に使用され、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも一のコドンの改変を有する配列をいう。変異体配列の発現生産物は、野生型に対して改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現生産物は、改変された機能的な能力を有することが出来る（例えば、向上された酵素活性）。

「変異プライマー」または「変異オリゴヌクレオチド」の語は（本明細書で相互置換可能に使用され）、テンプレート配列の一部分に対応し、それにハイブリダイズすることが出来るオリゴヌクレオチド組成物をいうことが意図される。変異プライマーに関して、このプライマーはテンプレート核酸と正確に一致しない。プライマー内における一以上のミスマッチが、核酸ライブラリーへ目的の変異を導入するために用いられる。本明細書において「非変異プライマー」または「非変異オリゴヌクレオチド」の語は、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物をいう。本発明の一の実施態様において、変異プライマーのみが用いられる。本発明の別の好ましい実施態様において、前記プライマーは、変異プライマーが含まれる少なくとも一の領域について、オリグヌクレオチド混合物中に非変異プライマーが含まれるように設計される。変異プライマー及び少なくとも一の変異プライマーに対応する非変異プライマーの混合物を添加することにより、多様な組み合わせ変異パターンが存在する核酸ライブラリーを生産することが出来る。例えば、変異体核酸ライブラリーのいくつかの構成要素が特定の部位においてそれらの前駆体配列を有し、他の構成要素がそのような部位で変異していることが望まれる場合、非変異プライマーは、所定の残基に対して核酸ライブラリー内の非変異構成要素の特定のレベルを得ることが出来る能力を提供する。本発明の方法は、通常１０〜５０塩基の長さ、より好ましくは約１５〜４５塩基の長さの変異及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかしながら、所望の変異誘発を行うために、１０塩基より短いまたは５０塩基より長いプライマーのいずれかを用いることが必要である。対応する変異及び非変異プライマーに関して、対応するオリゴヌクレオチドが同一の長さである必要はないが、加えられる変異に対応する領域において、重複が見られるのみである。プライマーは、本発明に係る予め決められた比率で添加されることが出来る。例えば、得られたライブラリーが有意なレベルの特定の特異変異を有し、同じまたは別の部位において、より少ない量の別の変異を有することが望ましい場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望のバイアス・ライブラリーを生産することが出来る。あるいは、より少ないまたはより多い量の非変異プライマー
の添加により、対応する変異が変異体核酸ライブラリーで生産される頻度を調節することが出来る。

本明細書で用いる「隣接する変異」の語は、同じオリゴヌクレオチド・プライマー内に存在する変異をいう。例えば、隣接する変異は、隣にあるかまたはお互いに近い場所にあることが出来る。しかしながら、これらは同じプライマーにより得られた変異体テンプレート核酸に導入される。

本明細書で用いる「隣接しない変異」の語は、別個のオリゴヌクレオチド・プライマーに存在する変異をいう。例えば、隣接しない変異は、別個に調製されたオリゴヌクレオチド・プライマーにより、得られた変異体テンプレート核酸に導入される。

「野生型配列」または「野生型遺伝子」の語は、相互置換可能に用いられ、宿主細胞内で天然または自然発生の配列をいう。いくつかの実施態様において、この野生型配列は、タンパク質工学プロジェクトの開始点である目的の配列をいう。この野生型配列は、同種または異種タンパク質のいずれかをコードすることが出来る。同種タンパク質は、介在されることなく宿主細胞が生産するものである。異種タンパク質は、介在されなければ宿主細胞が生産することができないものである。

別途記載のない限り、アミノ酸位置番号は、配列番号２の成熟バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシン配列に割り当てられたものをいう。しかしながら、本発明は、この特定のズブチリシンの変異に限られず、バチルス・アミロリケファシエンス・ズブチリシンにおける特定の同定された残基と「同等」の位置でアミノ酸残基を含む前駆体プロテアーゼにまで及ぶ。

本明細書で用いる「修飾」及び「変異」の語は、アミノ酸配列における任意の変化または改変をいう。この語は、目的のアミノ酸配列（例えば、ズブチリシン配列）における置換、欠失、挿入及び／またはアミノ酸側鎖の交換を含むことが意図される。この語はまた、目的のアミノ酸配列の化学的修飾を含むことも意図される。

本明細書で用いる「抗体」の語は、免疫グロブリンをいう。抗体は、抗体を生産することが望ましい任意の種から直接得られた免疫グロブリンを含むが、それらに限られない。加えて、本発明は、修飾された抗体も含む。この語はまた、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が結合するエピトープに結合する能力を有する抗体断片をいい、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗ＩＤ）抗体を含む。抗体断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖断片可変領域（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むが、それらに限られない。ポリクローナル及びモノクローナル抗体も本発明に含まれる。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。

「酸化安定性」の語は、例えば、漂白剤または酸化剤に暴露されまたは接触される間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄または本発明の他の工程の間で実施される条件下で、所与の時間、酵素活性の特定量を保持する本発明のプロテアーゼをいう。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％のタンパク質分解活性を、例えば、少なくとも約１分、約３分、約５分、約８分、約１２分、約１６分、約２０分等の所与の時間において、漂白剤または酸化剤に接触させた後に保持している。いくつかの実施態様において、この安定性は実施例で記載するように測定される。

「キレート安定性」の語は、例えば、キレート剤に暴露されまたは接触される間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄または本発明の他の工程の間で実施される条件下で、所与の時間、酵素活性の特定量を保持する本発明のプロテアーゼをいう。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％のタンパク質分解活性を、例えば、少なくとも約１０分、約２０分、約４０分、約６０分、約１００分等の所与の時間において、キレート剤に接触させた後に保持している。いくつかの実施態様において、このキレート安定性は実施例で記載するように測定される。

「熱的に安定」及び「熱安定性」の語は、例えば、改変された温度に暴露される間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄または本発明の他の工程の間で実施される条件下で、所与の時間、特定された温度への暴露の後、酵素活性の特定量を保持する本発明のプロテアーゼをいう。改変された温度は、上昇されたかまたは低下された温度を含む。いくつかの実施態様において、このプロテアーゼは、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％のタンパク質分解活性を、例えば、少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分等の所与の時間において、改変された温度に暴露させた後に保持している。いくつかの実施態様において、この熱安定性は、実施例で記載するように測定される。

酸化安定性、キレート安定性、熱安定性及び／またはｐＨ安定性プロテアーゼに関連する「向上された安定性」の語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、ズブチリシン・プロテアーゼ）及び／または野生型酵素と比べ、一定の時間、より高く保持されたタンパク質分解活性をいう。

酸化安定性、キレート安定性、熱安定性及び／またはｐＨ安定性プロテアーゼに関連する「減少された安定性」の語は、他のセリンプロテアーゼ（例えば、ズブチリシン・プロテアーゼ）及び／または野生型酵素と比べ、一定の時間、より低く保持されたタンパク質分解活性をいう。

「洗浄活性」の語は、タンパク質分解、加水分解、洗浄または本発明の他の工程の間の条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄性能をいう。いくつかの実施態様において、洗浄性能は、例えば、草、血液、ミルクまたは卵タンパク質等の酵素感受性のある汚れを評価する各種洗浄アッセイを適用することにより、これらの汚れを標準的な洗浄条件に施した後に、各種クロマトグラフ、分光高度計または他の定量的方法を用いて測定される。例示的なアッセイは、ＷＯ９９／３４０１１及び米国特許第６，６０５，４５８号（両文献は、参照により本明細書に援用する）に記載のものの他、実施例で含む方法のものを含むが、それらに限られない。

プロテアーゼの「洗浄有効量」の語は、特定の洗浄組成物において酵素活性の望ましいレベルを達成する、上記記載のプロテアーゼの量をいう。そのような有効量は、当業者に容易に理解され、特定の用いるプロテアーゼ、洗浄用途、洗浄組成物の特定の組成及び液体または乾燥組成物（例えば、顆粒、棒状）が必要とされるかどうか等の多くの要因に基づく。

本明細書で用いる「洗浄添加物」の語は、組成物に用いられるプロテアーゼ酵素に特に相性のよい物質である、所望の洗浄組成物の特定のタイプ及び生産物の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、棒状、ペースト、スプレー、タブレット、ゲルまたは発泡組成物）が選択される、任意の液体、固体または気体物質を意味する。これらの物質はまた、組成物で用いられるプロテアーゼと好ましくは混合可能である。いくつかの実施態様において、顆粒組成物は、「小型」形態であり、他の実施態様において、液体組成物は「濃縮」形態である。

洗浄活性に関連する「向上された性能」の語は、標準的な洗浄サイクル及び／または複数の洗浄サイクルの後の通常の評価により測定されるような、卵、ミルク、草または血液等の特定の酵素感受性の汚れに対する増加されたまたはより高い洗浄活性をいう。

洗浄活性に関連する「低下された性能」の語は、標準的な洗浄サイクルの後の通常の評価により測定されるような、卵、ミルク、草または血液等の特定の酵素感受性の汚れに対する減少されたまたはより低い洗浄活性をいう。

洗浄活性に関連する「比較性能」の語は、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（ジェネンコー）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）プロテアーゼ製品（ジェネンコー）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（ノボザイムズ）、ＢＰＮ’変異体（米国特許番号Ｒｅ３４，６０６）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（ノボザイムズ）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（ジェネンコー、米国特許番号Ｒｅ３４，６０６、及び米国特許第５，７００，６７６号、５，９５５，３４０号、６，３１２，９３６号及び６，４８２，６２８号）及びＢ．レンタス変異体プロテアーゼ製品を含むが、それらに限られない比較ズブチリシン・プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）の洗浄活性の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の洗浄活性をいう。例示的なズブチリシン・プロテアーゼ変異体は、ＢＰＮ’の７６、１０１、１０３、１０４、１２０、１５９、１６７、１７０、１９４、１９５、２１７、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８及び／または２５２の位置と等しい残基位置で置換または欠失を有するものを含むが、それらに限られない。洗浄性能は、標準的な洗浄サイクル条件の後に通常の分光光度のまたは分析的方法論により測定されるような、草、血、またはミルク等の酵素感受性の汚れを考慮した各種洗浄アッセイにおいてこれらのズブチリシン・プロテアーゼと本発明のプロテアーゼを比較することにより決定されることが出来る。

本明細書で用いる「繊維洗浄組成物」は、洗濯用添加剤組成物及び汚れた繊維（例えば、衣類、リンネル及び他の繊維材料）の浸漬／または前処理の使用に適した組成物を含む、手洗い及び機械洗浄のための洗濯洗剤組成物を含む。

本明細書で用いる「非繊維洗浄用組成物」は、食器洗浄洗剤組成物、口腔洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物及びパーソナル洗浄組成物を含むが、それらに限られない、布（すなわち、繊維）以外の表面洗浄組成物を含む。

本明細書における洗浄組成物の「小型（ｃｏｍｐａｃｔ）」形態は、密度及び、組成物に関して、無機充填塩の量に最も良く反映される。無機充填塩は、粉末形態での洗浄組成物の通常成分である。従来の洗浄組成物において、充填塩は、組成物の総重量に対して通常約１７〜約３５％の相当量で存在する。対照的に、小型組成物において、充填塩は、組成物の総重量に対して約１５％を超えない量で存在する。いくつかの実施態様において、この充填塩は組成物の総重量に対して約１０％を超えない量で存在するか、またはより好ましくは約５％である。いくつかの実施態様において、無機充填塩は、硫酸または塩素のアルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択される。好ましい充填剤塩は、硫酸ナトリウムである。

本明細書で用いる「界面活性剤」の語は、界面活性特性を有すると当該技術分野で通常認められている任意の化合物をいう。界面活性剤は一般に、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性及び両イオン性の化合物を含み、これらは本明細書でさらに記載される。

本明細書で用いる「接触する」及び「暴露する」の語は、界面活性剤において可溶な脂肪酸を生産することにより、酵素及び界面活性剤が、汚れまたは土壌の量を少なくとも部分的に減少させることが可能な程、界面活性剤及び脂肪分解酵素を油汚れまたは油性土壌に十分接近して置くことをいう。接触は、洗濯機、流し台、体表面等で行われることが出来る。

実験
本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。これらの実施例は、いずれの場合においても、特許請求の範囲を限定することが意図されるものではない。添付の図は、明細書及び発明の説明の一部分をなす。以下の実施例は、例証するために提供され、特許請求の範囲を限定しない。以下の実施例の開示において、次の略語が適用される。ｐｐｍ（１００万分の１）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｎＭ（ナノモル）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（セントメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）、℃（摂氏温度）、ＱＳ（十分量）、ＮＤ（測定値なし）、ＮＡ（適用せず）、ｒｐｍ（分当たりの回転数）、Ｈ_２Ｏ（水）、ｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（ベースペア）、ｋｂ（キロベースペア）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（コピーまたは相補ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｗ／ｖ（重量対容量）、ｖ／ｖ（容量対容量）、ｇ（重力）、ＯＤ（光学密度）、ＰＩ（性能指数）、ダルベッコのリン酸緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＤＰＢＳ）、ＳＯＣ（２％バクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、０．５％バクトイースト抽出物（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ）、テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ、１２ｇ／ｌバクトトリプトン、２４ｇ／ｌグリセロール、２．３１ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４及び１２．５４ｇ／ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４）、ＯＤ_２８０（２８０ｎｍにおける光学密度）、ＯＤ_６００（６００ｎｍにおける光学密度）、Ａ_４０
５（４０５ｎｍの吸光度）、Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の最大初期速度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２））、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシルナトリウム硫酸塩）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホニック酸］、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−ヒドロクロライド）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパン−スルホン酸、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）、ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール）、ＳＡ（シナピニック酸）（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、Ｇｌｕｔ及びＧＳＨ（還元グルタチオン）、ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシメチル］ホスフィン）、Ｃｉ（キュリー）、ｍＣｉ（ミリキュリー）、μＣｉ（マイクロキュリー）、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス補助レーザー脱離／イオン化−飛行時間分析）、Ｔｓ（トシル）、Ｂｎ（ベンジル）、Ｐｈ（フェニル）、Ｍｓ（メシル）、Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）、Ｔａｑ（サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｉｔｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）断片）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ブラ（ｂｌａ）（βラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）、ＨＤＬ（高密度流体
）、ＭＪリサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＭＪリサーチ、レノ、ネバダ州）、ベースクリア（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）（ベースクリア・ビーブイ・インク、レイデン、オランダ）、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）（パーセプティブバイオシステムズ、フレーミングハム、マサチューセッツ州）、サーモフィニガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）（サーモフィニガン、サンノゼ、カリフォルニア州）、アルゴ（Ａｒｇｏ）（アルゴバイオアナリティカ、モリスプレインズ、ニュージャージー州）、セイツＥＫＳ（Ｓｅｉｔｚ ＥＫＳ）（セイツシェンク（ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ）フィルターシステムズＧｍｂＨ、バートクロイツナハ、ドイツ）、パル（Ｐａｌｌ）（パル社（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）、イーストヒルズ、ニューヨーク州）、スペクトラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）（スペクトラムラボラトリーズ、ドミングランコ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｒａｎｃｈｏ）、カリフォルニア州）、モレキュラーストラクチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（モレキュラーストラクチャー社、ウッドランド、テキサス州）、アセライズ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）（アセライズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ケミカルコンピューティング（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）（ケミカルコンピューティング社、モントリオール、カナダ）、ニューブランズウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）（ニューブランズウィック社、エジソン、ニュージャージー州）、ＣＦＴ（試験材料センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、フラールディンゲン、オランダ）、試験繊維（Ｔｅｓｔ Ｆａｂｒｉｃ）（試験繊維社、ウェストピッツバーグ、ペンシルベニア州）、プロクターアンドギャンブル（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）（プロクターアンドギャンブル社、シンシナティー、オハイオ州）、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＧＥヘルスケア、チャルフォントストリート、チャイルズ、イギリス）、ＯＸＯＩＤ（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）、ベージングストーク、ハンプシャー、イギリス）、メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）（メガザイム・インターナショナル・アイルランド社、ブレイビジネスパーク、ブレイ社、ウィックロー、アイルランド）、フィンザイムズ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）（フィンザイムズ・オイ、エスポー、フィンランド
）、ケルコ（Ｋｅｌｃｏ）（ＣＰケルコ、ウイルミントン、デラウェア）、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（コーニングライフサイエンス、コーニング、ニューヨーク州）、（ＮＥＮ（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ州）、ファルマＡＳ（Ｐｈａｒｍａ ＡＳ）（ファルマＡＳ、オスロ、ノルウェイ）、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）（ダイナル、オスロ、ノルウェイ）、バイオシンセシス（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（バイオシンセシス、ルイスビル、テキサス州）、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州）、ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（ギブコ／ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）、ＢＤバイオサイエンス及び／またはクロンテック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び／またはＣｌｏｎｔｅｃｈ）（ＢＤバイオラボサイエンス・クロンテックラボラトリーズ、パロアルト、カリフォルニア州）、オペロンテクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（オペロンテクノロジーズ社、アラメダ、カリフォルニア州）、ＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＭＷＧバイオテック、ハイポイント、ノースカロライナ州）、オリゴズＥｔｃ（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ）（オリゴズＥｔｃ社、ウィルソンビル、オレゴン州）、バケム（Ｂａｃｈｅｍ）（バケムバイオサイエンス社、キングオブペルシア、ペンシルベニア州）、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州）、メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）（メディアテック、ハーンドン、バージニア州）、サンタクルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）（サンタクルズバイオテクノロジー社、サンタクルズ、カリフォルニア州）、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）（オキソイド社、オグデンスバーグ、ニューヨーク州）、ワージントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（ワージントンバイオケミカル社、フリーホルド、ニュ
ージャージー州）、ギブコＢＲＬ（ライフテクノロジー社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ州）、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（バイオラド、ハーロキューズ、カリフォルニア州）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＮＥＢ（ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ピアスバイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ州）、タカラ（Ｔａｋａｒａ）（タカラ・バイオ社、大津、日本）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）（ホフマン・ロシュ、バーゼル、スイス）、ＥＭサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ＥＭサイエンス、ギブスタウン、ニュージャージー州）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）、バイオデザイン（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）（バイオデザイン社、ソーコ、メイン州）、アプタゲン（Ａｐｔａｇｅｎ）（アプタゲン社、ヘンドン、バージニア州）、ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（ケンドロラボラトリーによるソーバルブランド製品、アッシュビル、ノースカロライナ州）、ユナイテッド・ステイツ・テスティング（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ）（ユナイテッド・ステイツ・テスティング社、ホーボーケン、ニュージャージー州）、モレキュラー・ディバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）（モレキュラー・ディバイシーズ社、サニーベル、カリフォルニア州）、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）、ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ストラタジェンクローニングシステム、ラホーヤ、カリフォルニア州）、マーシュ（Ｍａｒｓｈ）（マーシュバイオサイエンス、ロチェスター、ニューヨーク州）、ジーンアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ジーンアートＧｍｂＨ、レーゲンスブルク、ドイツ）、Ｄ、ＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０、メンロパーク、カリフォルニア州）、ジーンオラクル（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）（ジーンオラクル、マウンテンビュー、カリフォルニア州）、バイオテック（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）（バイオテックイ
ンスツルメンツ、ウィヌースキー、バーモント州）、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（ビアコア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、バイオーク（Ｂｉｏｋｅ）（バイオーク、ライデン、オランダ）、ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（ペプロテック、ロッキーヒル、ニュージャージー州）、シンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）（シンペップ、ダブリン、カリフォルニア州）、ニューオブジェクティブ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（ニューオブジェクティブブランド、サイエンティフィックインスツルメンツサービス社、リンゴーズ、ニュージャージー州）、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（ウォーターズ社、ミルフォールド、マサチューセッツ州）、マトリックスサイエンス（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（マトリックスサイエンス、ボストン、マサチューセッツ州）、ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）（ディオネックス社、サニーベル、カリフォルニア州）、モンサント（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）（モンサント社、セントルイス、ミズーリ州）、ウインターシェル（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ）（ウインターシェルＡＧ、カッセル、ドイツ）、ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ社、フローハムパーク、ニュージャージー州）、ハンツマン（Ｈｕｎｔｓｍａｎ）（ハンツマンファーマスーティカル社、ソルトレイクシティー、ユタ州）、エニケム（Ｅｎｉｃｈｅｍ）（エニケムイベリカ、バルセロナ、スペイン）、フルカケミＡＧ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）（フルカケミＡＧ、ブッシュ、スイス）、ギストブロカデス（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）（ギストブロカデス、ＮＶ、デルフト、オランダ）、ダウコーニング（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ダウコーニング社、ミッドランド、ミネソタ州）及びマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）（マイクオソフト社、レドモンド、ワシントン）。

実施例１
アッセイ
以下の実施例において、各種アッセイ方法を読解の容易化のために以下に示すように使用した。下記で提供されるプロトコールの各種変更は実施例で示される。

Ａ．９６穴マイクロタイタープレートにおけるタンパク質含量決定のためのＴＣＡアッセイ
ＢＰＮ’（例えば、対照プロテアーゼ）及びＢＰＮ’変異体について、このアッセイは、２３０ｒｐｍの振とう及び湿気の高い空気を通気して、３３℃で３−４日間増殖したマイクロタイタープレートからのフィルターろ過した培養上清を用いて開始した。新しい９６穴平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）をアッセイに用いた。初めに、１００μＬ／ウェルの０．２５Ｍ ＨＣｌを各ウェルに添加した。その後、５０μＬのフィルターろ過した培養ブロスをウェルに添加した。次に、「ブランク」の値を決定するために、光散乱／４０５ｎｍの吸光度を測定した（プレートリーダーの５秒間混合モード（５ｓｅｃ ｍｉｘｉｎｇ ｍｏｄｅ）を使用した）。試験のために、１００μＬ／ウェルの１５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）をプレートに添加し、室温で５〜３０分間インキュベートした。次に、光散乱／４０５ｎｍの吸光度を測定した（プレートリーダーの５秒間混合モードを使用した）。

ＧＧ３６（例えば、対照プロテアーゼ）及びその変異体について、このアッセイを、３００ｒｐｍの振とう及び湿気の高い空気を通気して、３７℃で約３日間増殖したマイクロタイタープレートからのフィルターろ過した培養上清を用いて行った。このアッセイにおいて、１００μＬの０．２５Ｍ ＨＣｌ液を９６穴平底マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。続いて、（プロテアーゼを含む）２５μＬアリコートのフィルターろ過した培養上清をウェルに添加した。次に、「ブランク」の値を決定するために、光散乱／４０５ｎｍの吸光度を測定した（プレートリーダーの５秒間混合モードを使用した）。この測定の後、１００μＬの３０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを室温で５〜１５分間インキュベートした。最後に、得られた光散乱／４０５ｎｍの吸光度を測定した（プレートリーダーの５秒間混合モードを使用した）。

用いた設備は、バイオメックＦＸロボット（ベックマン・クルター）及びスペクトラマックス３４０型（モレキュラー・ディバイシーズ）ＭＴＰリーダー、ＭＴＰは９０１７型（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））のものであった。

ＴＣＡでの試験の値からブランク（ＴＣＡを含まない）の値を引いて、計算を行い、サンプル中のタンパク質含有の相対的測定値を得た。必要である場合、既知の変換因子を有するクローンのＡＡＰＦアッセイを用いてＴＣＡの値を較正することにより標準曲線を作成した。しかしながら、ＴＣＡの結果は、５０〜５００タンパク質／ｍｌ（ｐｐｍ）のタンパク質の濃度に対して直線性を有する。従って、優れた性能の変異体を選択する目的のために、酵素性能に対して直接的にプロットすることが出来る。サンプル中の濁度／光散乱の増加は、培養上清液内の沈殿可能なタンパク質の総量と相互に関連する。

Ｂ．９６穴マイクロタイタープレートにおけるＡＡＰＦプロテアーゼ・アッセイ
本発明のプロテアーゼ及びその変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解を測定した。前記試薬溶液は、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）―８０（Ｔｒｉｓ希釈緩衝液）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２及び０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（Ｔｒｉｓ／Ｃａ緩衝液）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液及びＤＭＳＯ中の１６０ｍＭ ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液）（シグマ：Ｓ−７３８８）を用いた。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡワーキング溶液を調製するために、１ｍｌ ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液を１００ｍｌ Ｔｒｉｓ／Ｃａ緩衝液に添加し、少なくとも１０秒間よく混合した。１０μｌの希釈プロテアーゼ溶液を各ウェルに添加し、直後に、１９０μｌの１ｍｇ／ｍｌ ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡワーキング溶液を添加してこのアッセイを行った。この溶液を５秒間混合し、２５℃で、ＭＴＰリーダーの４１０ｎｍでの動的モード（ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅ、５分間で２０回の測定）で吸光度の変化を測定した。このプロテアーゼ活性はＡＵとして示す（活性＝△ＯＤ・ｍｉｎ^−１ｍｌ^−１）。

Ｃ．界面活性剤及びキレート安定性アッセイ
ＬＡＳ及びＬＡＳ／ＥＤＴＡのそれぞれの存在下で試験プロテアーゼをインキュベートした後に、ＬＡＳ及びＬＡＳ／ＥＤＴＡの安定性を測定し、残存活性の機能をＡＡＰＦアッセイを用いて測定した。

ＬＡＳ安定性法
試薬：
ドデシルベンゼンスルフォネート、ナトリウム塩（＝ＬＡＳ）：シグマＤ−２５２５
ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０：シグマＰ−８０７４
ＴＲＩＳ緩衝液（酸を含まない）：６．３５ｇのシグマＴ−１３７８を約９６０ｍｌの水に溶解した。ｐＨを４Ｎ ＨＣｌで８．２に調節した。ＴＲＩＳの最終濃度は５２．５ｍＭである
ＬＡＳストック溶液：ＭＱ水中１０．５％ＬＡＳ溶液（＝１０．５ｇ／１００ｍｌ ＭＱ）を調製する
ＴＲＩＳ緩衝液：１００ｍＭ／ｐＨ８．６（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０）
ＴＲＩＳ−Ｃａ緩衝液：ｐＨ８．６（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＣａＣｌ_２／０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０）
設備機器：
平底ＭＴＰ（コースターＮｏ．９０１７）
バイオメックＦＸ
ＡＳＹＳマルチピペッター
スペクトラマックスＭＴＰリーダー
ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー
イノーバ４３３０インキュベーター／シェーカー
バイオヒットマルチチャンネルピペット
ＢＭＧサーモスターシェーカー
０．０６３％ＬＡＳ溶液を、５２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．２中で調製した。このｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡワーキング溶液を、１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌ ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液（ＤＭＳＯ中）を１００ｍｌ（１００ｍＭ）ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．６に添加して調製した。上清を希釈するため、平底プレートを希釈緩衝液で満たし、上清のアリコートを添加し、よく混合した。希釈比率は、増殖プレート中のプロテアーゼ・コントロールの濃度に依存した（ＡＡＰＦ活性）。所望のタンパク質濃度を、８０ｐｐｍとした。

１０μｌの希釈上清を、ウェル当たり１９０μｌの０．０６３％ＬＡＳ緩衝液に添加した。このＭＴＰを、テープで覆い、数秒振とうし、ＢＰＮ’またはＧＧ３６に対し、４５℃の温度で、２００ｒｐｍの攪拌速度の恒温槽（イノーバ４２３０）に６０分置いた。初期活性（ｔ＝１０分）を、インキュベーションの１０分後に各ウェルの１０μｌの混合物を１９０μｌのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡワーキング溶液を含む新しいＭＴＰに移すことで測定した。これらの溶液をよく混合し、ＡＡＰＦ活性をＭＴＰリーダー（５分間で２０回の測定、２５℃）を用いて測定した。

最終活性（ｔ＝６０分）を６０分間のインキュベーション後にインキュベートプレートから別の１０μｌの溶液を除去して測定した。次に、このＡＡＰＦ活性を上述のように測定した。サンプルの安定性を、以下のように、残存ＡＡＰＦ活性及び初期ＡＡＰＦ活性の比率を計算することにより、決定した。

残存活性（％）＝［ｔ−６０の値］^＊１００／［ｔ−１０の値］

ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性法
規定条件下でのインキュベーション後、代表的な陰イオン界面活性剤（ＬＡＳ＝直鎖アルキルベンゼン・スルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム−ＤＯＢＳ）及びジ・ナトリウムＥＤＴＡの存在下で、プロテアーゼ変異体の安定性を測定した。また、残存活性を、ＡＡＰＦアッセイを用いて測定した。用いた試薬は、ドデシルベンゼン‐スルホン酸、ナトリウム塩（ＤＯＢＳ、シグマＤ−２５２５）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０（シグマＰ−８０７４）、ジ・ナトリウムＥＤＴＡ（ジークフリート・ハンデルＮｏ．１６４５９９−０２）、ＨＥＰＥＳ（シグマＨ−７５２３）、アンストレス緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／ｌ）＋０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０、ｐＨ８．０、ストレス緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／ｌ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（３．３６ｇ／ｌ）、ｐＨ８．０、対照プロテアーゼ及び２００−４００μｇ／ｍｌのタンパク質を含む、プロテアーゼ変異体培養上清である。用いた設備は、希釈プレートとしてのＶ底またはＵ底ＭＴＰ（それぞれグレーナー６５１１０１及び６５０１６１）、アンストレス及びＬＡＳ／ＥＤＴＡ緩衝液の他、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプレートとしてのＦ底ＭＴＰ（コーニング９０１７）、バイオメックＦＸ（ベックマン・クルター）、スペクトラマックス・プラス３８４ＭＴＰリーダー（モレキュラー・ディバイシーズ）、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（１ｍｍ振幅）（サーモ・エレクトロン社）、シール用テープ：ヌンク（Ｎｕｎｃ）（２３６３６６）である。

ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ）は２９℃でセットした。培養上清を、アンストレス緩衝液を含むプレートに、２５ｐｐｍ以下の濃度になるように希釈した（マスター希釈プレート）。マスター希釈プレートからの２０μｌのサンプルを、１８０μｌのアンストレス緩衝液を含むプレートに添加し、２．５ｐｐｍの最終インキュベーション濃度にした。内容物を混合し、室温に置いた。また、ＡＡＰＦアッセイをこのプレートで行った。マスター希釈プレートからの２０μｌのサンプルを、１８０μｌのストレス緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１１．９ｇ／ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＯＢＳ（１ｇ／ｌ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（３．３６ｇ／ｌ）、ｐＨ８．０）を含むプレートにも添加した。その溶液を混合し、直後に３０分間、４００ｒｐｍで２９℃のｉＥＭＳシェーカーに置いた。３０分間のインキュベーション後、ＡＡＰＦアッセイをストレス・プレートで行った。サンプルの安定性を、以下のように、残存ＡＡＰＦ活性及び初期ＡＡＰＦ活性の比率を計算することにより測定した：残存活性（％）＝［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１ストレス］^＊１００／［ｍＯＤ．ｍｉｎ−１アンストレス］

Ｄ．洗浄性能アッセイ
プロテアーゼ変異体の染み抜き性能を、市販の洗剤中で測定した。商業用洗剤配合物の熱不活性化は、非酵素性成分の特性を保持する一方、任意のタンパク質成分の酵素活性を破壊する役目をする。従って、この方法は、本発明の酵素変異体の試験で使用するために、商業的に購入された洗剤の調製に適する。

微小布見本
１／４”円状直径の微小布見本を、ＣＦＴから得た。単一の微小布見本または二個の微小布見本を、全表面領域を暴露するため、９６穴ＭＴＰの各ウェルに垂直に置いた（すなわち、ウェルの底に平たく置くのではない）。

ＢＭＩ微小布見本アッセイ
血液、ミルク及びインク（ＢＭＩ）を含む０．２５インチ円状直径の微小布見本をＣＦＴから得た。布見本を切断する前に、繊維（ＥＭＰＡ１１６）を水で洗浄した。一の微小布見本を、全表面領域を暴露するため、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに垂直に置いた（すなわち、ウェルの底に平たく置くのではない）。所望の洗剤溶液を、本明細書で記載するように調製した。サーモミキサーを２５℃で平衡させた後、１９０μｌの洗剤溶液を、微小布見本を含むＭＴＰの各ウェルに添加した。この混合物に、１０μｌの希釈酵素溶液が添加し、最終酵素濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにした（ＢＣＡアッセイで測定した）。ＭＴＰをテープでシールし、１４００ｒｐｍで攪拌しながら、３０分間恒温槽に置いた。適当な条件下でのインキュベーション後、各ウェルから１００μｌの溶液を新たなＭＴＰに移した。ウェル当たり１００μｌの溶液を含む新しいＭＴＰを、ＭＴＰスペクトラマックスリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。ブランクコントロールの他、二個の微小布見本及び洗剤を含むが酵素を含まないコントロールも含めた。

焼き卵微小布見本アッセイ
これらのアッセイに用いた９６穴焼き卵黄基質プレートを、ニワトリ卵黄から調製した。ニワトリ卵黄を卵白から分離し、卵黄膜を除き、ミリキュウ水で２０％（容積／重量）希釈した。希釈した卵黄を、マグネティックスターラーを用いて室温で１５分間攪拌した。８チャンネルピペットを用いて、５μｌを注意深く９６穴Ｖ底プレート（コースター＃３８９４）の各ウェルの中央へピペットした。プレートを９０℃で１時間焼き、室温で冷ました。焼き卵黄基質プレートを室温で保存し、調製から１週間内で使用した。全自動食器洗浄用洗剤を本書の他の箇所で記載するように調製し、５０℃で予熱した。１９０μｌアリコートの洗剤を、８チャンネルピペットを用いて９６穴プレートの各ウェルに添加した。１０μｌの希釈酵素を９６チャンネルピペット装置を用いて各ウェルに添加した。プレートを注意深く吸着ホイルシーラーで蓋をし、３０分間攪拌しながら５０℃でインキュベートした。次に、１２０μＬの反応混合物を新しい９６穴平底プレートに移し、吸光度／光散乱を４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度／光散乱は卵黄除去に比例する。

卵黄微小布見本アッセイ
全自動食器洗浄用洗剤を本書の他の箇所で記載するように調製した。用いた装置は、ニューブランズウィック・イノーバ４２３０シェーカー／インキュベーター及びスペクトラマックス（３４０型）ＭＴＰリーダーを含む。ＭＴＰは、コースター社から得た（９０１７型）。染料含有熟成卵黄見本（ＣＳ‐３８）を試験材料センターから得た。微小布見本を０．２５インチの円に切断する前に、繊維を水で洗浄した。一の微小布見本を、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。試験洗剤を、５０℃で平衡化した。１９０μｌの洗剤溶液を、微小布見本を含むＭＴＰの各ウェルへ添加した。この混合液に、１０μｌの希釈酵素溶液を加えた。ＭＴＰを粘着ホイルでシールし、３０分間攪拌しながら恒温槽に置いた。インキュベーション後、各ウェルから１００μｌの溶液を新しいＭＴＰへ移した。このＭＴＰをスペクトラマックスＭＴＰリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。ブランクコントロールの他、微小布見本及び洗剤を含むが酵素を含まないコントロールも含めた。

「３Ｋ」布見本固定
このタイプの微小布見本を下記の固定法を用いて前処理を行った。１０リットルビーカーに、８リットルの蒸留水を入れ、８０ｍｌの３０％過酸化水素としゃくで良く混ぜた。４０枚のＥＭＰＡ１１６布見本を、均一な固定が確実となるよう、その溶液に加える前に広げて扇型にした。しゃくを使い、この布見本を溶液中で、最初の５分は連続して、残り２５分は時折、全体で３０分間旋回させた。固定工程の後、この溶液を捨て、布見本は、各回約６リットルの蒸留水で６回濯いだ。濯ぎの後、布見本を紙タオルの上に置き、乾燥させた。風乾した布見本を、エクスパルジョン・プレス上の１／４インチ円状金型を用いて丸くくり抜いた。最後に、単一の微小布見本を、全表面領域を暴露するため、９６穴ＭＴＰの各ウェルに垂直に置いた（すなわち、ウェルの底に平たく置くのではない）。

「予洗」布見本
このタイプの微小布見本を、周囲温度で２０分間脱イオン水中で予洗した。予洗工程の後、布見本を紙タオルの上に置き、乾燥させた。風乾した布見本を、エクスパルジョン・プレス上の１／４インチ円状金型を用いて丸くくり抜いた。最後に、一の微小布見本を、全表面領域を暴露するため、９６穴ＭＴＰの各ウェルに垂直に置いた（すなわち、ウェルの底に平たく置くのではない）。

洗剤
北アメリカ（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）の強力液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤について、あらかじめ計量された液体洗剤（ガラスボトル中）を９５℃２時間水浴に置くことにより熱不活性化を行った。北アメリカ（ＮＡ）及び日本（ＪＰＮ）の強力顆粒洗濯（ＨＤＧ）洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は８時間で、西ヨーロッパ（ＷＥ）のＨＤＧ洗剤は５時間であった。ＮＡ及びＷＥ全自動食器洗浄用（ＡＤＷ）洗剤の熱不活性化のインキュベーション時間は８時間であった。洗剤を地元のスーパーマーケットから購入した。不活性化された割合（パーセント）を正確に測定するため、洗剤を溶かして５分以内に、熱未処理及び熱処理洗剤の両方を解析した。酵素活性を、ＡＡＰＦアッセイにより試験した。

洗剤のワーキング溶液を熱不活性化ストックから作製した。全ての洗剤は、商業的に購入した洗剤であった。水硬度（６ｇｐｇまたは１２ｇｐｇ）の適切な量及び緩衝液を、所望の条件（表１−１）と適合するように洗剤溶液に添加した。溶液をボルテックスまたはボトルを反転して混合した。

［表１−１］

微小布見本上の対照セリン・プロテアーゼ及びその変異体の染み抜き性能を、ＭＴＰスケールの市販の洗剤（Ｃａｌｇｏｎｉｔ ５ ｉｎ １）中で測定した。用いた試薬は、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０または５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７緩衝液、中度の水硬度で３：１ Ｃａ：Ｍｇ（ＣａＣｌ_２：ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）、６ｇｐｇに希釈された１５０００グレイン／ガロン（ｇｐｇ）ストック、２ＢＭＩ（血液／ミルク／インク）布見本／プレート、ＣＦＴにより処理されたＥＭＰＡ−１１６ ＢＭＩ綿布見本であった。あらかじめ濯ぎ、穴当たり二個の布見本を丸くくり抜いた。また、ＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ Ｃｏｌｄの既製洗剤を熱不活性化し、その中のプロテアーゼ活性が欠損したことを確認した。

［表１−２］

恒温槽を、所望の温度（１６℃または３２℃）でセットした。１０ｐｐｍ以下の酵素のマスター希釈プレートから１０μＬのサンプルを、上に列記した１９０μＬのワーキング洗剤溶液を含むＢＭＩ２−布見本プレートに添加した。その容量を、アッセイ・プレート中の変異体が０．５ｐｐｍの最終濃度となるように調節した。プレートを、直後にｉＥＭＳインキュベーターに移し、１４００ｒｐｍで振とうしながら３０分間所与の温度でインキュベートした。インキュベーション後、１００μＬの上清を、新しい９６穴プレートに移し、４０５ｎｍ及び／または６００ｎｍでの吸光度をＭＴＰリーダーで測定した。一個または二個の微小布見本及び洗剤を含むが、プロテアーゼ・サンプルが添加されていないコントロールウェルも試験に含めた。４０５ｎｍの測定値は、より高い値を提供し、色素除去を記録する一方、６００ｎｍの測定値は、濁度及び洗浄を記録する。

全ての微小布見本アッセイ法での染み抜き活性の計算：
得られた吸光度の値を、（実質的に酵素のない）ブランクの値で補正し、加水分解活性の測定値を提供した。各サンプル（変異体）について性能指数を計算した。この性能指数を、同じタンパク質濃度の変異体の性能（実際値）と標準酵素の性能（理論値）とで比較した。加えて、標準酵素のラングミュアの方程式のパラメーターを用いて、理論値を計算することが出来る。

酵素及び技術
それらの対照セリン・プロテアーゼ変異体のサンプルを、ＭＴＰプレートで増殖した培養のフィルターろ過された培養液から得た。用いた設備は、バイオメックＦＸロボット（ベックマン・クルター）、スペクトラマックスＭＴＰリーダー（３４０型、モレキュラー・ディバイシーズ）、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（サーモ／ラボシステムズ）、Ｆ底ＭＴＰ（コースター９０１７型、インキュベーション後に反応プレートを測定するために用いた）及びＶ底ＭＴＰ（グレイナー６５１１０１、上清の前希釈に用いた）であった。このアッセイにおいて、前記プロテアーゼは基質を加水分解し、基質から色素及び不溶性粒子を遊離する。従って、濁度の比率は酵素活性の測定値である。

Ｅ．プロテアーゼ及びそれらの変異体の相対比活性度
プロテアーゼ変異体を識別するため、基質としてｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて、見掛けの相対比活性度を計算した。これにより、変異体対野生型または標準プロテアーゼの比較及びランク付けが出来た。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質についての比活性度を、上述のアッセイを用いて、各サンプルの測定ＴＣＡ値でタンパク質分解活性を割ることにより算出した。これらの値を用いて、相対比活性度を計算した（変異体の比活性度／対照プロテアーゼの比活性度）。

Ｆ．食器洗浄性能
プロテアーゼ変異体の性能を、種々の自動食器洗浄条件下で試験した。食器洗浄洗剤の組成物を以下の表で示す。これらの洗剤は、ｗｆｋ試験材料（ｗｗｗ．ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ．ｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ／）が市販し、それらのｗｆｋ試験材料の指示が参考にされる。これらの洗剤は、プロテアーゼ変異体の分析を可能にするため、酵素の存在のない資源に由来した。

［表１−３］

［表１−４］

各々の汚れのタイプ（卵黄、ひき肉と卵、及び卵とミルク）の調製プロトコールを、下記に提供する。個々のタイプの汚れを試験皿に塗る前に、皿を徹底的に洗浄した。前の試験に由来するいくらかのしつこい汚れの残余が、皿上に未だある可能性があるため、この洗浄が特に必要とされた。新しい皿も、初めて試験に使用される前に三度の完全な洗浄が施された。

ステンレス・スチール上の卵黄汚れの調製
これらの実験に用いるステンレス・スチールシート（１０ｘ１５ｃｍ、片面つや消し）を高アルカリ性商業用洗剤（例えば、ＥＣＯＬＡＢ（登録商標）洗剤、ヘンケル）を含む洗剤で、９５℃の実験室食器洗浄機で完全に洗浄し、きれいで油のないシートを用意した。これらのシートを使用開始前にデバリング（ｄｅｂｕｒｒｅｄ）した。卵黄で汚れをつける前に、これらのシートを８０℃で３０分間熱キャビネット中で乾燥させた。汚れを付ける前は、塗布する表面に何も接触しないようにした。また、水あかまたは毛羽立ちが表面にないものを試験に用いた。汚れをつける前に冷却シートの重さを量った。

約１０〜１１個のタマゴの卵黄と卵白を分離して、試験用に用いる卵黄を調製した（２００ｇの卵黄）。この卵黄をフォークでガラスビーカー中で撹拌し、卵黄の懸濁液を均一に混ぜた。この黄身を裏ごし（約０．５ｍｍメッシュ）し、核粒子及びあらゆる卵殻断片を取り除いた。

平刷毛（２．５”）を用いて、２．０±０．１ｇの卵黄の懸濁液を、約１ｃｍの卵黄を塗布しない縁を残すようにして（必要に応じて粘着テープを使用した）、ステンレス・スチールシートの各々のツヤ消し面側の１４０ｃｍ^２のエリアに可能な限り均一に塗布した。汚れを付けたシートを、平置きにして（シートの縁に液滴を形成させないように）、室温で４時間（最大２４時間まで）乾燥させた。

卵黄タンパク質を変性させるため、これらのシートをその後３０秒間、沸騰している脱イオン水の中に入れた（必要に応じて保持用具を用いた）。その後、このシートを８０℃で３０分間再度乾燥させた。乾燥及び冷却の後、これらのシートの重量を測定した。重量を測定した後、洗浄試験に用いる前に、このシートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、相対湿度４０〜６０％）。試験の精度のために、１０００±１００ｍｇ／１４０ｃｍ^２の卵黄（変性後の卵黄）を含むシートのみを試験に用いた。洗浄試験を行った後、これらのシートを８０℃で３０分間、熱キャビネット内で乾燥し、冷却の後、再度重さを量った。洗浄性能のパーセンテージを洗浄により除去された卵黄の重量（ｍｇ）を、シートに塗られた変性卵黄の重量（ｍｇ）で割り、１００を掛けて算出した。

磁器プレート上のひき肉及び卵の汚れの調製
これらの実験において、ＥＮ５０２４２、フォーム１４９５、Ｎｏ．０２１９で一致したデザートプレート（Ａｒｚｂｅｒｇ、直径１９ｃｍ、白、施釉）を用いた。合計重量が２２５ｇの豚及び牛の赤身肉（５０：５０比率）を細かく切断し、保冷した。この混合物を肉挽き機に２度かけた。３５℃以上の温度は避けた。その後、この２２５ｇのひき肉を、７５ｇの卵（卵黄及び卵白を含む）と混合した。この調製物を使用前に−１８℃で３ヶ月まで凍結させた。豚肉と牛肉が置換可能なことから、豚肉を用いることができない場合、１００％の牛肉を用いた。

ひき肉と卵の混合物（３００ｇ）を室温に戻し、８０ｍｌの滅菌水と混合した。この混合物を泡だて器を用いて２分間均等になるように混ぜた。その後、周囲に約２ｃｍの汚れを塗布しない場所を残して、各白磁器プレートのそれぞれにひき肉／卵／水混合物の３ｇを、フォークを使って塗布した。適用量は、１１．８±０．５ｍｇ／ｃｍ^２であった。これらのプレートを予備加熱した熱キャビネット内において、１２０℃で２時間乾燥させた。プレートを冷却した直後に、それらは使用可能な状態であった。

食器洗浄試験の後、これらのプレートに（エタノール中に１％で調製した）ニンヒドリン溶液をスプレーし、ひき肉タンパク質の残留をよりよく同定出来るようにした。呈色反応を促進するために、これらのプレートを熱キャビネット中で１０分間、８０℃で加熱した。洗浄性能の評価は、ＩＫＷフォトカタログ（ＩＫＷ−ドイツ化粧品、洗面用品、香水及び洗剤組合（ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））を参照して、ひき肉の残留の呈色反応を目視で行った。

ステンレス・スチール上の卵／ミルク汚れの調製
これらの実験に用いるステンレス・スチールシート（１０ｘ１５ｃｍ、片面つや消し）を高アルカリ性商業用洗剤で、９５℃の実験室食器洗浄機で完全に洗浄し、油を除去し、シートを洗浄した。これらのシートを、セルロースの布で磨き、乾燥させた。汚れを付ける前は、塗布する表面に何も接触しないようにした。また、水あかまたは毛羽立ちが表面にないものを試験に用いた。汚れをつける前に、これらのシートを８０℃で３０分間熱キャビネットに置いた。汚れをつける前に冷却シートの重さを量った。

生の全卵の卵黄及び卵白（３〜４個の卵、約１６０ｇ／卵）をボウルの中に入れ、泡だて器でかき混ぜた。その後、５０ｍｌのセミスキムミルク（１．５％脂肪、超高温殺菌、均一に混ぜてあるもの）をこの混合物に添加した。このミルク及び卵を泡をたてないように混合した。平刷毛を用いて、塗布のバランスをチェックしながら、１．０±０．１ｇの卵／ミルク混合物をステンレス・スチールシートのつや消し面側に均一に塗布した。これらのシートの短い側の縁に約１．０ｃｍの塗布しない部分を残した。これらの汚れたシートを平置きし（シートの縁に液滴を形成しないように）、室温で４時間（最大２４時間）乾燥させた。

これらのシートをその後３０秒間、沸騰している鉱物除去水の中に入れた（必要に応じて保持用具を用いた）。その後、これらのシートを８０℃で３０分間再度乾燥させた。乾燥及び冷却の後、これらのシートの重量を測定した。重量を測定した後、洗浄試験に用いる前に、これらのシートを少なくとも２４時間放置した（２０℃、相対湿度４０〜６０％）。試験の精度のために、１９０±１０ｍｇの卵黄／ミルクを含むシートのみを試験に用いた。

洗浄試験を行った後、これらのシートを８０℃で３０分間、熱キャビネット内で乾燥し、冷却の後、再度重さを量った。洗浄性能のパーセンテージを洗浄により除去された卵黄／ミルクの重量（ｍｇ）を、シートに塗られた卵黄／ミルクの重量（ｍｇ）で割り、１００を掛けて算出した。

洗浄設備及び条件
洗浄試験は、上述のように調製された汚れた食器及びステンレス・スチールシートを含む、自動食器洗浄機（ミーレＧ６９０ＳＣ型）において行った。所定の量の洗剤を用いた。試験温度は、５０℃であった。水硬度は、２１^ｏＧＨ（ドイツ硬度）であった。上述のように、洗浄後、ひき肉で汚したプレートを０〜１０のスケールに写真で格付けされたカタログを用いて目視評価した。ここで、「０」は完全に汚れているプレートを意味し、「１０」はきれいなプレートを意味する。これらの値は、酵素含有洗剤のシミまたは汚れ除去（ＳＲ）能力に相当する。卵黄または卵黄／ミルクで汚した後に洗浄されたステンレス・スチールプレートは、洗浄後に残留する汚れの量を決めるために重量測定に基づいて分析した。変異体プロテアーゼを、一回の洗浄当たり０〜３０ｍｇ／活性タンパク質のレベルで試験を行った。

Ｇ．エグリンＣ阻害アッセイ
本明細書で記載するように、セリン・プロテアーゼ濃度及び比活性度を阻害剤を有する滴定により測定した。ヒル医用チスイヒル（ｔｈｅ ｌｅｅｃｈ Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のエグリンｃは、ズブチリシン及びＡＳＰプロテアーゼの強力結合のタンパク質阻害剤であり（Ｈｅｉｎｚ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、８７５５−６６ページ、１９９２年）、従って、酵素濃度を測定するために用いることが出来る。それは、比活性度の計算が可能であることを意味する。簡潔に、当業者は、エグリンｃのいくつかの既知濃度によりもたらされた酵素阻害の量を測定する。この情報から、完全阻害に必要とされるエグリンｃの濃度が計算される。これはサンプル内の酵素濃度と等価である。

プロテアーゼ活性を、上述の色原体のＡＡＰＦアッセイを用いて測定した。エグリンｃの遺伝子を、標準分析法により大腸菌で合成及び発現した。その特性及び阻害能力は、シグマから購入したエグリンｃと等しかった。エグリンｃストック溶液の濃度を、既知の比活性度のバチルス・レンタス・ズブチリシンのサンプルの阻害を測定することで算出した。次に、較正されたエグリンｃサンプルを、ズブチリシン変異体の濃度及び比活性度を測定するために用いた。これらの値を、標準化された９６穴酵素ストック・プレートを作製するために用いた。変異体の全てを、共通の濃度に希釈した。

Ｈ．性能指数
この性能指数を、同じタンパク質濃度の変異体の性能（実際値）と標準または対照プロテアーゼの性能（理論値）とで比較した。加えて、標準プロテアーゼの結合曲線（すなわち、ラングミュアの方程式）のパラメーターを用いて、理論値を計算することが出来る。１より大きい性能指数（ＰＩ）（ＰＩ＞１）は、標準（例えば、野生型）と比較してより優れた変異体であり、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は、標準と同じ性能の変異体を示し、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、標準より悪い変異体を示す。従って、このＰＩは、好ましい変異体の他に、所定の環境で用いるには望ましくない変異体も示す。

実施例２
Ｂ．ズブチリス内でのＢＰＮ’プロテアーゼの生産
この実施例で、Ｂ．ズブチリス内でＢＰＮ’プロテアーゼを生産するために行った実験を説明する。Ｂ．ズブチリスへのプラスミドｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’の形質転換を、当該技術分野で知られるように行った（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／１４４９０を参照されたい。）。以下に記載するＤＮＡ配列（ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッド・リーダー、ＢＰＮ’プロ（ｐｒｏ）及びＢ．アミロリケファシエンス由来のＢＰＮ’成熟ＤＮＡ配列）は、ＢＰＮ’前駆体タンパク質をコードする。

ＧＴＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＴＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＡＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＴＴＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＴＴＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＧＧＣＧＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴＴＡＣＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＡＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＧＣＡＣＧ
ＴＴＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡ（配列番号１）。

上の配列では、太字は成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを、標準フォントはリーダー配列（ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッド・リーダー）、及び下線を付したものはプロ配列（ＢＰＮ’）を示す。ＢＰＮ’前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ａｐｒＥ−ＢＰＮ’ハイブリッド・リーダー、ＢＰＮ’プロ及びＢＰＮ’成熟ＤＮＡ配列）を以下に示す。この配列では、太字及び下線を付したものは成熟ＢＰＮ’プロテアーゼを示す。

ＶＲＳＫＫＬＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳＴＳＳＡＱＡＡＧＫＳＮＧＥＫＫＹＩＶＧＦＫＱＴＭＳＴＭＳＡＡＫＫＫＤＶＩＳＥＫＧＧＫＶＱＫＱＦＫＹＶＤＡＡＳＡＴＬＮＥＫＡＶＫＥＬＫＫＤＰＳＶＡＹＶＥＥＤＨＶＡＨＡＹＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＹＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ（配列番号２）
ＢＰＮ’発現ベクター（ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’）の構築
ＰＣＲ断片は、ｐＪＨ１０１ターム（ｐＪＨ１０１ ｔｅｒｍ）を用いたＴＧＯポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を伴う標準条件を用いて得た。プラスミドｐＪＨ１０１は、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入された以下の断片を有するｐＪＨ１０１（Ｆｅｒｒａｒｉ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５４巻、１５１３−５ページ、１９８３年）に相当する。

ＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＣＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＧＧＡＴＧＣＣＴＧＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＡＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＡＡＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡＣＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＧＡＧＴＣＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＴＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＡＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＡＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＴＡＣＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＧＡ
ＴＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＴＴＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＴＴＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＧＧＣＧＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴＴＡＣＧＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧＧＴＡＡＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＣＧＴＡＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＧＴＴＣＡＡＴＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＴＴＴＣＣＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＧＴＡＡＣＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＧＧＣＡＴＴ
ＣＧＴＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣ（配列番号３）。

この断片は、融合シグナル配列（初めのＢ．ズブチリスのａｐｒＥシグナル配列の８アミノ酸の後、第９番目のアミノ酸から始まるＢ．アミロリケファシエンスのＢＰＮ’シグナル配列を含む）を有するＢＰＮ’遺伝子を含む。この断片は、以下のプライマーを用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。ＡＫ０４−１４： ＧｔｃｃｔｃｔｇｔｔａａｃＴＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＴＡＣ（配列番号４）ＢＰＮ’成熟遺伝子の３’末端とアニーリングし、翻訳停止コドンの下流に、ＨｐａＩ部位を導入する。及びＡＫ０４−２１．１： ＴＴＡＴＧＣＧＡＧｇｃｔａｇｃａａａａｇｇａｇａｇｇｇｔａａａｇａｇｔｇａｇａａｇｃ（配列番号５）ＢＰＮ’シグナル配列の５’末端とアニーリングし、５’末端にＮｈｅＩ部位を導入する。

この反応から得られたＰＣＲ断片を、標準条件下で、キアゲンＰＣＲ洗浄キットで洗浄した。標準条件下で制限酵素ＮｈｅＩ及びＨｐａＩを用いた洗浄断片の消化後、それをＬＡＴプロモーター（ＵＳ２００６／００１４２６５で記載されるｐＨＰＬＴ−ＶＡＡｃ１、図３Ａを参照されたい）を含むＮｈｅＩ／ＨｐａＩ消化ベクターへライゲーションした。

続いて、ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ライゲーション混合物を、参考により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／１４４９０で説明されるように、Ｂ．ズブチリス（ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ））に形質転換した。ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ベクター（図３Ｂを参照されたい）を宿すＢ．ズブチリス形質転換体の選択的増殖を、２０ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含む、２５ｍｌのＭＢＤ培地（ＭＯＰＳに基づく合成培地）含有の振とうフラスコで行った。形質転換細胞のインキュベーションにより、タンパク質分解活性を持つ分泌ＢＰＮ’プロテアーゼが生産された。ゲル分析をヌーページ・ノベックス１０％ビス‐トリス・ゲル（ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ １０％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログＮｏ．ＮＰ０３０１ＢＯＸ）を用いて行った。分析のためのサンプルを調製するため、２容量の上清を、１容量の１Ｍ ＨＣｌ、１容量の４ｘＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログＮｏ．ＮＰ０００７）、及び１％ＰＭＳＦ（２０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、その後に７０℃で１０分間加熱した。次に、各サンプルの２５μＬを、１０μＬのシーブループラス２プレ−ステインド・タンパク質基準（ＳｅｅＢｌｕｅ ｐｌｕｓ ２ ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログＮｏ．ＬＣ５９２５））と共にゲル上に載せた。この結果は、この実施例に記載のＢＰＮ’クローンニング法により、Ｂ．ズブチリスで生産される活性ＢＰＮ’が生じることを明確に示した。

実施例３
ＢＰＮ’部位評価ライブラリー及び多重変異ライブラリーの作製
この実施例で、ＢＰＮ’変異体の構築を説明する。

ＢＰＮ’部位評価ライブラリー（ＳＥＬ）の構築
前記ＢＰＮ’発現カセットを含むｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ベクターを、テンプレートＤＮＡとして用いた。このベクターは特有のＢｇｌＩＩ制限部位を含み、これをＳＥＬ構築で用いた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）（脱塩、５０ｎｍｏｌスケール）により合成され、表７−１に列記するプライマーを、ライブラリーの作製に用いた。

ＢＰＮ’ＳＥＬを構築するため、三回のＰＣＲ増幅を行った。そのうちの初めの二回は、成熟ＢＰＮ’ＤＮＡ配列に目的の成熟コドンを導入するための変異誘発ＰＣＲである。三回目のＰＣＲは、成熟ＢＰＮ’配列に所望の変異コドンを有するｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’発現ベクターを構築するために、初めの二回の変異誘発ＰＣＲの産物を融合するためのＰＣＲである。変異誘発の方法は、コドン特異的変異アプローチに基づくものである。この方法において、特異的に設計され、変異されるコドンの配列に対応するトリプレットＤＮＡ配列（Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ及びＳ＝ＣまたはＧを伴うＮＮＳ）をコードする２５から４５のヌクレオチドの長さを持つフォーワード及びリバース・オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特異的ＤＮＡトリプレット中で全ての可能な変異が同時に生産される生産工程を行う。これは、特異的ＢＰＮ’成熟コドンにヌクレオチドを無作為に組み込むことを保証するものである。プライマー名（表３−１参照）に記載の数は、特異的ＢＰＮ’成熟コドンの位置に対応する。ＳＥＬを構築するために使用される二個の追加プライマーは、ＢｇｌＩＩ制限部位に隣接して位置するｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’ＤＮＡ配列の一部分と共にＢｇｌＩＩ制限部位を含んだ。

各ＳＥＬの構築は、ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマー及び特異的ＢＰＮ’リバース変異誘発プライマーを用いた二回の主要ＰＣＲ増幅により開始した。二回目のＰＣＲ増幅では、ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマー及び特異的ＢＰＮ’フォーワード変異誘発プライマー（フォーワード及びリバース変異誘発プライマーについて同等のＢＰＮ’成熟コドンの位置）を使用した。成熟ＢＰＮ’配列内の変異の導入は、フィンザイムズ・フュージョン・ハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（フィンザイムズ、カタログＮｏ．Ｆ−５３０Ｌ）を用いて行った。全てのＰＣＲ増幅は、ポリメラーゼと共に供給されたフィンザイムのプロトコールに従って行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。

主要ＰＣＲ１について：
ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマー及び特異的ＢＰＮ’リバース変異誘発プライマー−共に１μＬ（１０μＭ）、
及び主要ＰＣＲ２について：
ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマー及び特異的ＢＰＮ’フォーワード変異誘発プライマー−共に１μＬ（１０μＭ）、
５ｘフュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ＨＦ緩衝液 １０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 １μＬ
フュージョンＤＮＡポリメラーゼ ０．７５μＬ（２単位／μＬ）
ＤＭＳＯ、１００％ １μＬ
ｐＨＰＬＴ−ＢＰＮ’テンプレートＤＮＡ １μＬ（０．１−１ｎｇ／μＬ）
蒸留オートクレーブ水 ５０μＬ以下
ＰＣＲは、ＭＪリサーチ（ロケーション（Ｌｏｃａｔｉｏｎ））ＰＴＣ−２００ペルチャー・サーマルサイクラーを用いて、次のＰＣＲプログラムで完成した。３０秒９８℃、３０Ｘ（１０秒９８℃、２０秒５５℃、１分７２℃）及び５分７２℃。この反応により、長さで約２〜３ｋＢの二個の断片が得られ、これらは目的のＢＰＮ’成熟コドンの周囲に約３０ヌクレオチド塩基が重なるものである。断片を、上述の二個の断片及びフォーワードとリバースＢｇｌＩＩプライマーを用いた三回目のＰＣＲ反応で融合させた。この融合ＰＣＲ反応は以下のように実施した。

ｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＦＷプライマー及びｐＨＰＬＴ−ＢｇｌＩＩ−ＲＶプライマー−共に１μＬ（１０μＭ）、
５ｘフュージョンＨＦ緩衝液 １０μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 １μＬ
フュージョンＤＮＡポリメラーゼ ０．７５μＬ（２単位／μＬ）
ＤＭＳＯ、１００％ １μＬ
主要ＰＣＲ１反応ミックス １μＬ
主要ＰＣＲ２反応ミックス １μＬ
蒸留オートクレーブ水 ５０μＬ以下
ＰＣＲプログラムは次の通りであった。ＭＪリサーチ（登録商標）ＰＴＣ−２００ペルチャー・サーマルサイクラーを用いて、３０秒９８℃、３０Ｘ（１０秒９８℃、２０秒５５℃、２：０５分７２℃）及び５分７２℃。

増幅された直線の４．８Ｋｂ断片を、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）キアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（カタログＮｏ．２８１０６）を用いて精製し、融合断片の両端に付着端を作製するためにＢｇｌＩＩ制限酵素で消化した。消化反応は以下のものを含んだ。

−３５μＬ 精製直線ＤＮＡ断片
−４μＬ ＲＥＡＣＴ（登録商標）３緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））
−１μＬ ＢｇｌＩＩ、１０単位／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））
反応条件：１時間、３０℃。

ＢｇｌＩＩで消化し、精製した断片のライゲーションにより、所望の変異を含む環状及び多重結合ＤＮＡ生産物が得られた。これらを続けて、コンピテント・バチルス・ズブチリスへ直接形質転換した。

−３０μＬ 精製ＢｇｌＩＩ消化ＤＮＡ断片
−８μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）カタログＮｏ．４６３００−０１８）
−１μＬ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１単位／μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）カタログＮｏ．１５２２４−０１７）
反応条件：１６−２０時間、１６℃
本明細書に参照により組み込まれるＷＯ０２／１４４９０で記載されるように、ライゲーション混合物をＢ．ズブチリス（ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ））の形質転換に用いた。各ライブラリーについて、９６単一コロニーを採取し、配列分析（ベースクリア（ＢａｓｅＣｌｅａｒ））及びスクリーニングの目的のために、ネオマイシン及び１．２５ｇ／Ｌの酵母エキスを含むＭＯＰＳ培地中で増殖させた。ライブラリー数は、１〜２７５に及んだ。各数は、無作為に変異させられた成熟ｂｐｎ’配列のコドンを表わす。各ライブラリーは、最高１９のＢＰＮ’変異体を含んだ。

［表３−１］

ＢＰＮ’多重変異ライブラリーの構築
合成ＢＰＮ’多重変異ライブラリー（または組み合わせライブラリー）を、Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ及びＢｉｏｋｅにより生産した。各合成ＢＰＮ’多重変異ライブラリーは、成熟配列の二以上の選択コドンが特異的ＤＮＡ配列と無作為に置き換わったＢＰＮ’遺伝子の混合物を含んでいた。例えば、成熟配列のコドン２２をＴｈｒ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒをコードするＤＮＡトリプレット、コドン２６をＶａｌ、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＴｙｒをコードするＤＮＡトリプレット、コドン３１をＩｌｅ、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＡｓｎをコードするＤＮＡトリプレット及びコドン４８をＡｌａ、Ｇｌｕ、ＨｉｓまたはＡｓｐをコードするＤＮＡトリプレットと無作為に置換するような方法で、ＢＰＮ’組み合わせライブラリーを設計できた。この実施例で、組み合わせライブラリーは、最高２５６のＢＰＮ’組み合わせ変異体を含む。しかしながら、代表的なＢＰＮ’多重変異ライブラリーは、最高で何千もの特有のＢＰＮ’変異体遺伝子を含むことができた。末端ＡｖａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（例えば、野生型ＢＰＮ’を参照されたい）を有する多重変異ライブラリーの断片を、ＡｖａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製した後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（カタログＮｏ．１５２２４−０２５）を用いたリガーゼ反応でｐＨＰＬＴベクターへ、粘着末端の一般的なクローニングのためにメーカーが推奨するように、クローン化した。野生型ＢＰＮ’ＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片：
ＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧ ＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣ ＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧ ＡＴＣＡＣＧＴＡＧＣ ＡＣＡＴＧＣＧＴＡＣ ＧＣＧＣＡＧＴＣＣＧ
ＴＧＣＣＴＴＡＣＧＧ ＣＧＴＡＴＣＡＣＡＡ ＡＴＴＡＡＡＧＣＣＣ ＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡ ＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣ ＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴ
ＣＡＡＡＴＧＴＴＡＡ ＡＧＴＡＧＣＧＧＴＴ ＡＴＣＧＡＣＡＧＣＧ ＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣ ＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴ ＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧ
ＴＡＧＣＡＧＧＣＧＧ ＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧ ＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧ ＡＡＡＣＡＡＡＴＣＣ ＴＴＴＣＣＡＡＧＡＣ ＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣ
ＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡ ＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣ ＡＣＡＧＴＴＧＣＧＧ ＣＴＣＴＴＡＡＴＡＡ ＣＴＣＡＡＴＣＧＧＴ ＧＴＡＴＴＡＧＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧ ＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴ ＴＡＣＧＣＴＧＴＡＡ ＡＡＧＴＴＣＴＣＧＧ ＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴ ＴＣＣＧＧＣＣＡＡＴ
ＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴ ＣＡＴＴＡＡＣＧＧＡ ＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧ ＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡ ＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣ ＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡ
ＴＧＡＧＣＣＴＣＧＧ ＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴ ＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧ ＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣ ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴ ＡＡＡＧＣＣＧＴＴＧ
ＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴ ＣＧＴＡＧＴＣＧＴＴ ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧ ＧＴＡＡＣＧＡＡＧＧ ＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣ ＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡ
ＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡ ＣＣＣＴＧＧＴＡＡＡ ＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧ ＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴ ＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣ ＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡ ＡＧＣＧＴＡＧＧＡＣ ＣＴＧＡＧＣＴＴＧＡ ＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡ ＣＣＴＧＧＣＧＴＡＴ
ＣＴＡＴＣＣＡＡＡＧ ＣＡＣＧＣＴＴＣＣＴ ＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＣＧＧＧＧＣＧＴＡ ＣＡＡＣＧＧＴＡＣＧ ＴＣＡＡＴＧＧＣＡＴ
ＣＴＣＣＧＣＡＣＧＴ ＴＧＣＣＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡ ＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡ ＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣ ＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡ
ＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧ ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡ ＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡ ＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴ ＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧ
ＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴ ＧＡＴＣＡＡＣＧＴＡ ＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧ ＣＴＣＡＧＴＡＡＧＴ ＴＡＡＣＡＧＡＧＧＡ ＧＧＡＴＴＴＣＣＴ
ＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣ ＣＧＴＴＴＴＴＴＴＡ ＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴ ＧＧＡＧＡ （配列番号５５９）
このリガーゼ反応混合物を形質転換するため、ライブラリーＤＮＡ（ｐＨＰＬＴ内でクローン化されたＢＰＮ’ライブラリー断片混合物）をＴｅｍｐｌｉＰｈｉキット（アマシャム、カタログＮｏ．２５−６４００）を用いて増幅した。この目的のために、１μＬのリガーゼ反応混合物をＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットに付属のサンプル緩衝液５μＬと混合し、９５℃で３分間加熱して、ＤＮＡを変性させた。この反応物を冷却させるために氷上に２分間置き、その後、簡単に遠心沈殿させた。次に、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットに付属の反応緩衝液５μＬ及びｐｈｉ２９ポリメラーゼ０．２μＬを添加して、この反応物をＭＪリサーチＰＣＲマシーン内で３０℃、４時間、インキュベートした。ｐｈｉ２９酵素は前記ＰＣＲマシーンで、６５℃で１０分間、インキュベートすることにより、反応中で熱不活性化させた。

このライブラリーの形質転換のために、０．１μＬのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅反応生産物を５００μＬのコンピテントＢ．ズブチリス細胞（ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ΔａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ、ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ））と混合した後、３７℃で１時間激しく撹拌した。次に、１００μＬと５００μＬのアリコートを２０ｐｐｍのネオマイシン及び０．５％スキムミルクを含むＨＩアガー・プレート上に載せた。

次の表は、本発明で用いた単置換のいくつかを列記したものである。

［表３−２］

ＢＰＮ’変異体を含む粗酵素サンプルの調製
ＢＰＮ’変異体タンパク質を、３７℃で、６８時間９６穴ＭＴＰ内のＢ．ズブチリス形質転換体をＭＢＤ培地（ＭＯＰＳに基づく合成培地）内で増殖させることにより生産した。ＭＢＤ培地は、実質的に当該技術分野で知られている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１１９巻、７３６−７４７ページ、１９７４年を参照されたい）方法により作製したが、基の培地（ｔｈｅ ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）からＮＨ_４Ｃｌ_２、ＦｅＳＯ_４、ＣａＣｌ_２を除き、３ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４を用いた。また、基の培地は、６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌグルコース及び１％ソイトーン（ｓｏｙｔｏｎｅ）が補充されている。微量栄養素は、４００ｍｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ_２及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムを１リットル中に含む、１００Ｘストック溶液として作製した。

実施例４
ＢＰＮ’変異体のＬＡＳ安定性
この実施例で、ＬＡＳが存在する状態における種々の単置換のＢＰＮ’変異体及び多置換のＢＰＮ’変異体の安定性を評価するために行った実験を説明する。実施例１で記載する前記方法を用いて、高温（４５℃）でＬＡＳが存在する状態におけるインキュベーションの前後でＡＡＰＦ活性を測定することにより、ＬＡＳ安定性を測定した。以下の表の結果は、変異体ＢＰＮ’の安定性が野生型ＢＰＮ’酵素と比較される相対的安定性値として示される。特に、相対的安定性は、変異体の残存活性と野生型の残存活性との比率である。１より大きい値は、ＬＡＳが存在する状態におけるより高い安定性を示す。

表４−１は、野生型ＢＰＮ’と比較した、ＢＰＮ’変異体の相対的安定性値を含む。本発明の開発中に測定されたように、野生型ＢＰＮ’と比べ、多数のＢＰＮ’変異体はＬＡＳが存在する状態において明らかにより高い安定性を有していた。特に、試験された９２のＢＰＮ’部位のＬＡＳ安定性アッセイにおいて、４０の部位（４３％）が悪く（有害）、５２の部位（５７％）が優れていた（有益）。さらに、試験された１５０８の変異体のうち、９６（６％）はより優れて（上昇）、１９６（１３％）は中性（同等）、１２１６（８１％）はより劣って（低下）いた。

［表４−１］

［表４−２］

実施例５
ＢＰＮ’変異体の比活性度
この実施例で、ＢＰＮ’及びＢＰＮ’変異体の相対比活性度を測定するために行った実験を説明する。実施例１で記載する前記方法を用いて、ＡＡＰＦに対する比活性度を測定した。表５−１において、結果は、ＢＰＮ’変異体の活性度が野生型ＢＰＮ’の活性度と比較される相対比活性度として示される。特に、相対比活性度は、変異体の比活性度と野生型の比活性度との比率である。１より大きい値（ＰＩ＞１）は、ＡＡＰＦ基質に対するより高い比活性度を示す。

［表５−１］

実施例６
ＢＰＮ’変異体データの比較評価
この実施例で、ＢＰＮ’及びＢＰＮ’変異体のタンパク質発現、染み抜き活性、ＬＡＳ安定性及びＡＡＰＦ活性（目的の特性の試験）を測定するために行った実験の結果を説明する。実施例１で記載する前記方法を用いて、結果を得た。全体として説明するように、ＢＰＮ’変異体の機能性を性能指数（ＰＩ）として数量化した。これは、変異体対親タンパク質の性能の比率である。本明細書で使用するＰＩの等級付けは、上昇変異（Ｕｐ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＰＩ＞１．０）、中性変異（Ｎｅｕｔｒａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＰＩ＞０．５）、非有害変異（Ｎｏｎ−ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＰＩ＞０．０５）及び有害変異（Ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＰＩ≦０．０５）を含む。「組み合わせ可能な変異」は、変異体が少なくとも一の特性について性能指数値＝０．５、また全ての特性について性能指数値＞０．０５を有する変異である。組み合わせ可能な変異は、一以上の所望の特性について適切な性能指標を有するタンパク質を提供するために組み合わすことが出来る変異である。変異が起こる位置は以下のように分類される。非制限的な位置には、少なくとも一の特性について≧２０％の中性変異がある。また、制限的な位置には、活性及び安定性について＜２０％の中性変異がある。

これらのデータは、任意のズブチリシンを操作する際に使用される。操作されるズブチリシンが、特定の位置でのズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸とは異なるアミノ酸を有する場合であっても、このデータは、ＢＰＮ’野生型アミノ酸への置換を含む最良の選択の置換の同定により、所望の特性を改変する、少なくとも一の置換を同定する際に使用される。

表６−１は、ズブチリシンＢＰＮ’の２７５の位置での５，００４の変異体の性能指数値（Ｐｉ）を提供する。０．０５以下の性能指標は、０．０５に固定し、表中で太字のイタリック体で示した。さらに、安定性の測定値について、安定性アッセイにおける活性の性能指数が０．０５以下だった場合、関連する安定性の性能指数は０．０５に固定した。

［表６−１］

組み合わせ可能な変異：
表６−２に、２７５の位置について組み合わせ可能な変異を有するズブチリシンＢＰＮ’変異体（２，９０７）を列記する。これらの変異体は、少なくとも一の特性について性能指数値≧０．５、また両方の特性について性能指数値＞０．０５を有する。

［表６−２］

実施例７
変異体プロテアーゼ・データの比較評価
この実施例で、ＢＰＮ’、ＧＧ３６（ＧＣＩ−Ｐ０３６）及び変異体プロテアーゼの洗浄性能、ＬＡＳ安定性、ＡＡＰＦ活性及びタンパク質含有量（目的の特性の試験）を測定するために行った実験の結果を比較する。全体として説明するように、変異体の機能性を性能指数（ＰＩ）として数量化した。これは、変異体対対照プロテアーゼの性能の比率である。本明細書で使用するＰＩの等級付けは、上昇変異（ＰＩ＞１．０）、中性変異（ＰＩ＞０．５）、非有害変異（ＰＩ＞０．０５）、及び有害変異（ＰＩ≦０．０５）を含む。

生産的な部位は、任意の特性について少なくとも一の上昇変異を有するものである。生産的で、非制限的な部位には、≧２０％の中性変異（ＰＩ＞０．５）があり、（タンパク質発現の他に）試験された任意の特性について少なくとも一の上昇変異（ＰＩ＞１．０）がある。下記の表７−１において、生産的で、非制限的な部位の定義を満たす変異体についての結果を、上昇変異（ＰＩ＞１）の定義を満たす、試験された変異体のパーセンテージ（％）として示す。

［表７−１］

高度に生産的な部位は、タンパク質発現（ＴＣＡアッセイ）以外の少なくとも一の特性について≧２０％の上昇変異（ＰＩ＞１）がある。下記の表７−２において、高度に生産的な位置の定義を満たす変異体についての結果を、上昇変異（ＰＩ＞１）の定義を満たす、試験された変異体のパーセンテージ（％）として示す。

［表７−２］

制限的な部位は、活性及び安定性について２０％未満の中性変異がある。下記の表７−３において、制限的な部位の定義を満たす変異体についての結果を、中性変異（ＰＩ＞０．５）の定義を満たす、評価された変異体のパーセンテージ（％）として示す。

［表７−３］

つまり、本発明の開発中に測定されたように、二の対照ズブチリシンの成熟領域内における１０の位置は、活性及び安定性について制限的な位置である。従って、二の対照ズブチリシンの成熟領域内における残りの２６５の位置は、活性及び安定性について非制限的な位置（≧２０％の中性変異）である。

実施例８
Ｂ．ズブチリスにおけるプロテアーゼ生産
この実施例で、Ｂ．ズブチリス内で種々のプロテアーゼを生産するために行った実験を説明する。特に、ＧＧ３６及びＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌのための発現ベクターを有するＢ．ズブチリスの形質転換で用いる前記方法を提供する。当該技術分野（例えば、ＷＯ０２／１４４９０を参照されたい）で知られるように、形質転換を行った。

ＧＧ３６プロテアーゼ生産
この実施例で、Ｂ．ズブチリス内でＧＧ３６（本明細書でＢ．レンタス・ズブチリシンともいう）を生産するために行った実験を提供する。発現プラスミドｐＡＣ−ＧＧ３６ｃｉは、コンセンサスａｐｒＥプロモーター及びＢＰＮ’転写ターミネーターの制御の下、ａｐｒＥシグナル配列の８番目のコドンで融合した、ＧＧ３６のコドン改良遺伝子（ｔｈｅ ＧＧ３６ ｃｏｄｏｎ−ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｅｎｅ）を用いて組み立てた。下記に提供する配列において、太字でイタリック体のフォントはコンセンサスａｐｒＥプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線のあるフォントはプロ配列を示し、太字のフォントはＧＧ３６成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを示す。また、下線のあるイタリック体のフォントはＢＰＮ’ターミネーターを示す。ＧＧ３６成熟プロテアーゼのコーディング領域は、クローン化の目的のため、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限部位に隣接する。

ａｔｃｔｃａａａａａａａｔｇｇｇｔｃｔａｃｔａａａａｔａｔｔａｃｔｃｃａｔｃｔａｔｔａｔａａｔａａａｔｔｃａｃａｇａａｔａｇｔｃｔｔｔｔａａｇｔａａｇｔｃｔａｃｔｃｔｇａａｔｔｔｔｔｔｔａａａａｇｇａｇａｇｇｇｔａａａｇａｇｔｇａｇａａｇｃａａａａａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｇｔｃｇｃｇｔｃｇａｃｃｇｃａｔｔｇｃｔｇａｔｔｔｃｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔａｇｃｔｃａｔｃｃａｔｃｇｃａｔｃｃｇｃｔｇｃｔｇａａｇａａｇｃａａａａｇａａａａａｔａｔｔｔａａｔｔｇｇｃｔｔｔａａｔｇａｇｃａｇｇａａｇｃｔｇｔｃａｇｔｇａｇｔｔｔｇｔａｇａａｃａａｇｔｔｇａｇｇｃａａａｔｇａｃｇａｇｇｔａｇｃｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｔｃｇａａａｔｔｇａａｔｔｇｃｔｔｃａｔｇａａｔｔｔｇａａａｃｇａｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｔａａｇｃｃｃａｇａａｇａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇｔｔａｇａｇｃｔｃｇａｔｃｃａｇｃｔａｔｔｔｃｔｔａｔａｔｔｇａａｇａｇｇａｔｇｃａｇａａｇｔａａｃｔａｃａａｔｇｇｃｇｃａａｔｃｇｇｔａｃｃａｔｇｇｇｇａａｔｔａｇｃａｇａｇｔａｃａａｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｃａｃａｔａａｃｃｇｔｇｇａｔｔｇａｃａｇｇｔｔｃｔｇｇｔｇｔａａａａｇｔｔｇｃｔｇｔｃｃｔｔｇａｔａｃｃｇｇｔａｔｔｔｃｃａｃｔｃａｔｃｃａｇａｃｔｔａａａｔａｔｔｃｇｔｇｇｔｇｇａｇｃｔａｇｃｔｔｔｇｔａｃｃａｇｇｇｇａａｃｃａｔｃｃａｃｔｃａａｇａｔｇｇｃａａｔｇｇａｃａｔｇｇｃａｃｔｃａｔｇｔｔｇｃｃｇｇｃａｃａａｔｃｇｃｇｇｃｔｃｔｔａａｃａａｔｔｃａａｔｔｇｇｔｇｔｔｃｔｔｇｇｃｇｔａｇｃｇｃｃａａｇｃｇｃａｇａａｃｔａｔａｃｇｃｔｇｔｔａａａｇｔａｔｔａｇｇａｇｃａａｇｃｇｇｔｔｃａｇｇｃｔｃｔｇｔｃａｇｃｔｃｔａｔｔｇｃｃｃａａｇｇａｔｔｇｇａａｔｇｇｇｃａｇｇｇａａｃａａｔｇｇｃａｔｇｃａｃｇｔｔｇｃｔａａｔｃｔｔａｇｔｔｔａｇｇａｔｃｔｃｃｔｔｃｇｃｃａａｇｔｇｃｃａｃａｃｔｔｇａｇｃａａｇｃｔｇｔｔａａｔａｇｃｇｃｇａｃｔｔｃｔａｇａｇｇｃｇｔｔｃｔｔｇｔｔｇｔａｇｃｇｇｃｃｔｃｔｇｇａａａｔｔｃａｇｇｔｇｃａｇｇｃｔｃａａｔｃａｇｃｔａｔｃｃｇｇｃｃｃｇｔｔａｔｇｃｇａａｃｇｃｔａｔｇｇｃａｇｔｃｇｇａｇｃｔａｃｔｇａｃｃａａａａｃａａｃａａｃｃｇｃｇｃｃａｇｃｔｔｔｔｃａｃａｇｔ
ａｔｇｇｃｇｃａｇｇｇｃｔｔｇａｃａｔｔｇｔｃｇｃａｃｃａｇｇｔｇｔａａａｃｇｔｇｃａｇａｇｃａｃｔｔａｃｃｃａｇｇｔｔｃａａｃａｔａｔｇｃｃａｇｃｔｔａａａｃｇｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｃｔａｃｔｃｃｔｃａｔｇｔｔｇｃａｇｇｔｇｃｇｇｃｔｇｃａｃｔｔｇｔｔａａａｃａａａａｇａａｃｃｃａｔｃｔｔｇｇｔｃｃａａｔｇｔａｃａａａｔｃｃｇｃａａｔｃａｔｃｔｔａａｇａａｔａｃｇｇｃａａｃｔａｇｃｔｔａｇｇａａｇｃａｃａａａｃｔｔｇｔａｔｇｇａａｇｃｇｇａｃｔｔｇｔｃａａｔｇｃａｇａａｇｃｔｇｃａａｃｔｃｇｔｔａａａａｇｃｔｔａａｃｔｃｇａｇａｔａａａａａａｃｃｇｇｃｃｔｔｇｇｃｃｃｃｇｃｃｇｇｔｔｔｔｔｔａｔ （配列番号５６０）
ＧＧ３６前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、下記に提供する。この配列において、太字は成熟ＧＧ３６プロテアーゼを示す。

ＭＲＳＫＫＬＷＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡＡＥＥＡＫＥＫＹＬＩＧＦＮＥＱＥＡＶＳＥＦＶＥＱＶＥＡＮＤＥＶＡＩＬＳＥＥＥＥＶＥＩＥＬＬＨＥＦＥＴＩＰＶＬＳＶＥＬＳＰＥＤＶＤＡＬＥＬＤＰＡＩＳＹＩＥＥＤＡＥＶＴＴＭＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号５６１）。

成熟ＧＧ３６プロテアーゼ（配列番号５６２）のアミノ酸配列を、本明細書で記載の変異体ライブラリーを作製する基礎として用いた。

ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ（配列番号５６２）。

プラスミドｐＡＣ−ＧＧ３６ｃｉのエレメントは、ｐＵＢ１１０＝プラスミドｐＵＢ１１０由来のＤＮＡ断片（ＭｃＫｅｎｚｉｅ他、Ｐｌａｓｍｉｄ、第１５巻、９３−１０３ページ、１９８６年）、ｐＢＲ３２２＝プラスミドｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片（Ｂｏｌｉｖａｒ他、Ｇｅｎｅ、第２巻、９５−１１３ページ、１９７７年）、ｐＣ１９４＝プラスミドｐＣ１９４由来のＤＮＡ断片（堀の内他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５０巻、８１５−８２５ページ、１９８２年）を含む。前記プラスミドは、次を特徴とする。すなわち、Ｂ．ズブチリスのためのオリジン（Ｏｒｉ）＝ｐＵＢ１１０に由来する複製開始点、ＣＡＴ＝ｐＣ１９４に由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＭＢ１オリジン（ｏｒｉｇｉｎ）＝ｐＢＲ３２２に由来する複製開始点、ｂｌａ＝ｐＢＲ３２２に由来するβ‐ラクタマーゼ、ショート（Ｓｈｏｒｔ）ａｐｒＥプロモーター＝コンセンサス転写プロモーター、シグナルペプチド＝シグナルペプチド、プロ・ペプチド（Ｐｒｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ）＝ＧＧ３６プロ領域、ＧＧ３６ｃｉ成熟ペプチド＝（この研究で発現された各変異体のコーディング領域と置き換えられている）成熟ＧＧ３６、ＢＰＮ’ターミネーター＝ズブチリシンＢＰＮ’由来の転写ターミネーターである。

ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ（ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲＩＭＥズブチリシン）プロテアーゼの生産
この実施例で、Ｂ．ズブチリス内でＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ（ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲＩＭＥズブチリシンとして市販される。また、「ＦＮＡ」ともいう。）を生産するために行った試験を説明する。発現プラスミドｐＡＣ−ＦＮＡｒｅは、コンセンサスａｐｒＥプロモーター及びＢＰＮ’転写ターミネーターの制御の下、ａｐｒＥシグナル配列の８番目のコドンで融合した、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ遺伝子を用いて組み立てた。下記に提供する配列において、太字でイタリック体のフォントはコンセンサスａｐｒＥプロモーターを示し、標準フォントはシグナル配列を示し、下線のあるフォントはプロ配列を示し、太字のフォントはＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを示す。また、下線のあるイタリック体のフォントはＢＰＮ’ターミネーターを示す。ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ成熟プロテアーゼのコーディング領域は、クローン化の目的のため、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限部位を含む。

ｇａａｔｔｃａｔｃｔｃａａａａａａａｔｇｇｇｔｃｔａｃｔａａａａｔａｔｔａｔｔｃｃａｔｃｔａｔｔａｔａａｔａａａｔｔｃａｃａｇａａｔａｇｔｃｔｔｔｔａａｇｔａａｇｔｃｔａｃｔｃｔｇａａｔｔｔｔｔｔｔａａａａｇｇａｇａｇｇｇｔａａａｇａｇｔｇａｇａａｇｃａａａａａａｔｔｇｔｇａｇａａｇｃａａａａａａｔｔｇｔｇｇａｔｃａｇｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｇｔｔａａｔｃｔｔｔａｃｇａｔｇｇｃｇｔｔｃｇｇｃａｇｃａｃａｔｃｃａｇｃｇｃｇｃａｇｇｃｔｇｃａｇｇｇａａａｔｃａａａｃｇｇｇｇａａａａｇａａａｔａｔａｔｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔａａａｃａｇａｃａａｔｇａｇｃａｃｇａｔｇａｇｃｇｃｃｇｃｔａａｇａａｇａａａｇａｃｇｔｃａｔｔｔｃｔｇａａａａａｇｇｃｇｇｇａａａｇｔｇｃａａａａｇｃａａｔｔｃａａａｔａｔｇｔａｇａｃｇｃａｇｃｔａｇｃｇｃｔａｃａｔｔａａａｃｇａａａａａｇｃｔｇｔａａａａｇａａｔｔｇａａａａａａｇａｃｃｃｇａｇｃｇｔｃｇｃｔｔａｃｇｔｔｇａａｇａａｇａｔｃａｃｇｔａｇｃａｃａｃｇｃｇｔａｃｇｃｇｃａｇｔｃｃｇｔｇｃｃａｔａｔｇｇｃｇｔａｔｃａｃａａａｔｔａａａｇｃｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇｃａｃｔｃｔｃａａｇｇｃｔａｃａｃｃｇｇｔｔｃａａａｔｇｔｔａａａｇｔａｇｃｇｇｔｔａｔｃｇａｃａｇｃｇｇｔａｔｃｇａｔｔｃｔｔｃｔｃａｔｃｃａｇａｔｃｔｔａａａｇｔａｇｃａｇｇｃｇｇａｇｃｃａｇｃａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｇａａａｃａａａｔｃｃｔｔｔｃｃａａｇａｃａａｃａａｃｔｃｔｃａｃｇｇａａｃａｃａｃｇｔｔｇｃｔｇｇｔａｃｃｇｔｔｇｃｇｇｃｔｃｔｔａａｔａａｃｔｃａａｔｃｇｇｔｇｔａｔｔａｇｇｃｇｔｔｇｃｇｃｃａａｇｃｇｃａｔｃａｃｔｔｔａｃｇｃｔｇｔａａａａｇｔｔｃｔｃｇｇｃｇｃｃｇａｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃｃａａｔａｃａｇｃｔｇｇａｔｃａｔｔａａｃｇｇａａｔｃｇａｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｇｃａａａｃａａｔａｔｇｇａｃｇｔｔａｔｔａａｃａｔｇａｇｃｃｔｃｇｇｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｇｇｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔａａａａｇｃｇｇｃａｇｔｔｇａｔａａａｇｃｃｇｔｔｇｃａｔｃｃｇｇｃｇｔｃｇｔａｇｔｃｇｔｔｇｃｇｇｃａｇｃｃｇｇｃａａｃｇａａｇｇｃａｃｔｔｃｃｇｇｃａｇｃｔｃａａｇｃａｃａｇｔｇｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｇｔａａａｔａｃｃｃｔｔｃｔｇｔｃａｔｔｇｃａｇｔａｇｇｃｇｃｔｇｔｃｇａｃａｇ
ｃａｇｃａａｃｃａａａｇａｇｃａｔｃｔｔｔｃｔｃａａｇｃｇｔａｇｇａｃｃｔｇａｇｃｔｃｇａｔｇｔｃａｔｇｇｃａｃｃｔｇｇｃｇｔａｔｃｔａｔｃｃａａａｇｃａｃｇｃｔｔｃｃｔｇｇａａａｃａａａｔａｃｇｇｃｇｃｇｔｔｇａａｃｇｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｃａｃｇｔｔｇｃｃｇｇａｇｃｃｇｃｇｇｃｔｔｔｇａｔｔｃｔｔｔｃｔａａｇｃａｃｃｃｇａａｃｔｇｇａｃａａａｃａｃｔｃａａｇｔｃｃｇｃａｇｃｔｃｔｃｔａｇａａａａｃａｃｃａｃｔａｃａａａａｃｔｔｇｇｔｇａｔｔｃｔｔｔｃｔａｃｔａｔｇｇａａａａｇｇｇｃｔｇａｔｃａａｔｇｔａｃａｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｃａｇｔａａａａｃｔｃｇａｇａｔａａａａａａｃｃｇｇｃｃｔｔｇｇｃｃｃｃｇｃｃｇｇｔｔｔｔｔｔａｔ （配列番号５６３）。

ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下記に提供する。この配列において、太字は成熟ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌプロテアーゼを示す。

ＭＲＳＫＫＬＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳＴＳＳＡＱＡＡＧＫＳＮＧＥＫＫＹＩＶＧＦＫＱＴＭＳＴＭＳＡＡＫＫＫＤＶＩＳＥＫＧＧＫＶＱＫＱＦＫＹＶＤＡＡＳＡＴＬＮＥＫＡＶＫＥＬＫＫＤＰＳＶＡＹＶＥＥＤＨＶＡＨＡＹＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ（配列番号５６４）。

成熟ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌプロテアーゼのアミノ酸配列を、本明細書で記載の変異体ライブラリーを作製する基礎として用いた。

ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ （配列番号５６５）。

プラスミドｐＡＣ−ＦＮＡｒｅのエレメントは、ｐＵＢ１１０＝プラスミドｐＵＢ１１０由来のＤＮＡ断片（ＭｃＫｅｎｚｉｅ他、ｐｌａｓｍｉｄ、第１５巻、９３−１０３ページ、１９８６年）、ｐＢＲ３２２＝プラスミドｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片（Ｂｏｌｉｖａｒ他、Ｇｅｎｅ、第２巻、９５−１１３ページ、１９７７年）、ｐＣ１９４＝プラスミドｐＣ１９４由来のＤＮＡ断片（堀の内他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５０巻、８１５−８２５ページ、１９８２年）を含む。プラスミドは、次を特徴とする。すなわち、Ｂ．ズブチリスのためのオリジン（Ｏｒｉ）＝ｐＵＢ１１０に由来する複製開始点、ＣＡＴ＝ｐＣ１９４に由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＭＢ１オリジン（ｏｒｉｇｉｎ）＝ｐＢＲ３２２に由来する複製開始点、ｂｌａ＝ｐＢＲ３２２に由来するβ‐ラクタマーゼ、ショート（Ｓｈｏｒｔ）ａｐｒＥプロモーター＝コンセンサス転写プロモーター、シグナルペプチド＝シグナルペプチド、プロ・ペプチド＝ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌプロ領域、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ成熟ペプチド＝（この研究で発現された各変異体のコーディング領域と置き換えられている）成熟ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ、ＢＰＮ’ターミネーター＝ズブチリシンＢＰＮ’由来の転写ターミネーターである。

実施例９
酵素変異体の発現
この実施例は、形質転換したＢ．ズブチリスの種々の組み換え酵素を発現するために用いる方法を説明する。

ズブチリシン−２ｍｌスケール
ＢＰＮ’−Ｙ２１７ＬまたはＧＧ３６の発現ベクターを含むＢ．ズブチリス・クローンを、グリセロール・ストックから２００μｌのＬＢ培地＋２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む９６穴培養プレート（ＢＤ、３５３０７５）へ、スチール９６穴レプリケーター（ｓｔｅｅｌ ９６−ｗｅｌｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ）を用いて複製し、加湿された囲い内で、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。一晩培養した後の２００μｌアリコートを、５ｍｌプラスチック培養試験管内で２０００μｌの合成培地＋２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールに植菌するために用いた。前記培養培地は、ＭＯＰＳ緩衝液に基づき、主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを有し、堅調な細胞増殖のための１％のソイトーンで補強した、強化半合成培地を用いた。培養試験管を、３７℃で６０時間、２２０ｒｐｍでインキュベートした。このインキュベーションに続き、培養液を８０００ｘＲＣＦより高速で遠心分離機にかけた。上清溶液を、保管のための１５ｍｌのポリプロピレン円錐管にデカントした。それ以上の精製または濃縮は行わなかった。上清ストックを、長期安定性のために４０％のプロピレングリコール最終濃度に配合し、４℃で保存した。

実施例１０
酵素変異体の生産
この実施例は、酵素荷電地位及び組み合わせ荷電ライブラリーの生産を説明する。

酵素荷電地位
目的の物理的特性の範囲にわたる複数のタンパク質変異体を、存在するライブラリーまたは当該技術分野で既知の部位特異的変異誘発技術（例えば、米国特許出願シリアル番号第１０／５７６，３３１号、１１／５８１，１０２号及び１１／５８３，３３４号を参照されたい）により作成したライブラリーから選択する。次に、この特定したプローブタンパク質のセットを目的の試験において解析した。

例示的なプロテアーゼ荷電地位変異体を次の表に示し、本明細書で記載するように解析した。これらの表において、荷電の変化は野生型酵素と比較される。

［表１０−１］

［表１０−２］

酵素組み合わせ荷電ライブラリー
Ｂ．レンタス・ズブチリシン（＝ＧＧ３６）組み合わせ荷電ライブラリーの生産
組み合わせ荷電ライブラリー（ＣＣＬ）を生産するために、コドン改良ＧＧ３６遺伝子（ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ−ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＧＧ３６ ｇｅｎｅ）を含むｐＡＣ−ＧＧ３６ｃｉプラスミドを、ＤＮＡ２．０社に送った。また、それらを形質転換のためのバチルス・ズブチリス株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）と共に提供した。加えて、表１０−３に示すＧＧ３６プロテアーゼ中の四部位の各々での位置ライブラリー（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）の生産をＤＮＡ２．０社に依頼した。変異体は、９６穴プレート中のグリセロールストックとして供給された。

ＧＧ３６ ＣＣＬを、四個のよく分配し、表面に露出した、活性部位外の非荷電極性アミノ酸残基を同定することにより設計した。これらの残基は、Ｓｅｒ−８５、Ｇｌｎ−１０７、Ｓｅｒ−１８２及びＡｓｎ−２４２（ＢＰＮ’の番号による残基８７、１０９、１８８及び２４８）である。８１の構成要素の組み合わせライブラリー（Ｇ−１からＧ−８１）を、各部位での三個の可能性、すなわち、野生型、アルギニンまたはアスパラギン酸の全ての組み合わせを作ることにより作製した。

［表１０−３］

Ｂ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬの生産
ＣＣＬの生産のために、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ遺伝子を含むｐＡＣ−ＦＮＡｒｅプラスミドを、ＤＮＡ２．０社（メンロパーク、カリフォルニア州）に送った。また、それらを形質転換のためのバチルス・ズブチリス株（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ΔｓｐｏＩＩＥ、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）と共に提供した。表１０−４に示す四個のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌプロテアーゼ部位の各々での位置ライブラリーの生産をＤＮＡ２．０社に依頼した。変異体は、９６穴プレート中のグリセロールストックとして供給された。

ズブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ組み合わせ荷電ライブラリーを、四個のよく分配し、表面に露出した、活性部位外の非荷電極性アミノ酸残基を同定することにより設計した。これらの残基は、Ｓｅｒ−８７、Ａｓｎ−１０９、Ｓｅｒ−１８８及びＳｅｒ−２４８である。８１の構成要素の組み合わせライブラリー（Ｆ−１からＦ−８１）を、各部位での三個の可能性、すなわち、野生型、アルギニンまたはアスパラギン酸の全ての組み合わせを作ることにより作製した。

［表１０−４］

実施例１１
変異体ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ及びＧＧ３６ズブチリシンの性能
実施例１で記載するように、この実施例は、洗濯及び自動食器洗浄の両方の用途における、様々な市場地勢（例えば、異なるｐＨ、Ｔ及び／または水硬度）を代表する洗剤中のＢＭＩ微小布見本及び焼き卵アッセイにおけるＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ及びＧＧ３６変異体の試験を説明する。

上述の観察結果は、ズブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ及びＧＧ３６のような、他のセリンプロテアーゼにも当てはまる。例えば、図２Ａ及び２Ｂは、熱不活性化された既製のＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ洗剤を用いた北米洗濯条件下での洗浄性能におけるＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ及びＧＧ３６のそれぞれの最適荷電を示す。左のＹ軸は、微小布見本の洗浄性能を表し、数値が高いほどより優れたＢＭＩ汚れ除去能力を持つことを示す。右側のＹ軸は、親分子（塗つぶされていない符号）と比べた変異体の洗浄性能（塗りつぶされた符号）として定義される性能指標を表す。横方向の線は、前記アッセイのノイズを含まない２または３のいずれかの標準偏差での性能指標を示す。ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ荷電組み合わせライブラリー（ＣＣＬ）は、親ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌと比べ荷電の変化がゼロでの最適な荷電を示し、ＧＧ３６ ＣＣＬは、親ＧＧ３６と比べ荷電の変化がー２での最適な荷電を示す。

図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ及び５Ｂは、最適荷電の位置が、洗剤配合、ｐＨ、温度及び水硬度及び洗剤濃度によるイオン強度により決定される溶液環境の関数であることを示す。例えば、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬの最適荷電は、北米の洗濯条件下のゼロから、西欧及び日本の洗濯条件下でのより大きいプラスの荷電に劇的にシフトする。さらに、最適荷電が液体洗濯洗剤配合物及び顆粒（粉末）洗濯洗剤配合物の両方にも観察される。同様に、自動食器洗浄（ＡＤＷ）用洗剤（例えば、Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ Ｃａｌｇｏｎｉｔ ４０℃、１２ｇｐｇ、ｐＨ１０）中のＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ ＣＣＬ及びＧＧ３６ ＣＣＬの両方においても、酵素基質としての焼き卵に対して最適荷電が観測された。

本発明の開発中に測定されたように、異なる洗剤中でのプロテアーゼ荷電変異体（例えば、ＧＧ３６、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ等）の洗浄性能は、ワーキング溶液のｐＨ及び伝導率に大きく影響される。最終の伝導率は、イオン強度の測定値であり、水硬度、洗剤濃度及び組成物に依存する。例えば、ｐＨ１０．６及び３．０ｍＳ／ｃｍの伝導率で実施した場合、欧州及び北米ＡＤＷ洗剤下では、焼き卵の汚れに対するＧＧ３６変異体及びＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ変異体の洗浄性能に相関がある。特に、荷電変異体の洗浄性能は、与えられたｐＨ及び伝導率が同じ場合に良い相関関係を示す。この発見により、ｐＨ及び伝導率が一致する別の洗剤をそれらの結果から推定するために、所与の洗剤を用いて酵素性能をスクリーニングすることが可能となる。同様に、似たようなワーキングｐＨ及び伝導率を示す洗剤をそれらの結果から推定するために、ｐＨ及び伝導率が一致する緩衝液中の酵素性能をスクリーニングすることが可能となる。

［表１１−１］

［表１１−２］

実施例１２
ＬＡＳ及びキレート安定性
この実施例では、陰イオン界面活性剤及びキレート剤の一または両方を含む反応培地中のタンパク質荷電及び安定性の関係を決定することを説明する。ストレス及びアンストレス・サンプルのプロテアーゼ活性を測定するために、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いた。ＢＯＤＩＰＹデンプン・アッセイを用いて、ストレス及びアンストレス・サンプルのアルファ・アミラーゼ活性を測定した。ストレス・プレートからの残留ＬＡＳ及びＥＤＴＡは、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはＢＯＤＩＰＹデンプン・アッセイに影響しない。

ＬＡＳ／ＥＤＴＡ安定性
用いた試薬は、対照緩衝液、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ８．０及びストレス緩衝液５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＡＳ（ドデシルベンゼン−スルホン酸、ナトリウム塩、シグマＤ−２５２５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含む。酵素変異体（２０ｐｐｍ）を、対照またはストレス緩衝液のいずれかを含む９６穴非結合性平底プレートへ１：２０で希釈し、混合した。対照プレートを室温でインキュベートする一方、ストレス・プレートを直ちに、３７℃で（試験した酵素の安定性に依存して）３０−６０分間置いた。インキュベーションに続き、プロテアーゼの酵素活性をｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡアッセイを用いて測定した。残りのまたは残存活性の割合は、ストレス・サンプルの反応速度を対照サンプルの反応速度で割ったものに等しい。親酵素及び変異体は、対照緩衝液中で６０分間安定であることがわかった。

図６は、８０の変異体を含むライブラリーについて、ＬＡＳ／ＥＤＴＡの安定性を親ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌと比べた正味荷電の変化の関数として示す。親ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ分子に関するいくつかの正味荷電を測定するため、前記ライブラリーを、実施例２で記載する方法に従って設計し、構築した。この図より明らかなように、親ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌと比べたマイナス荷電（−４まで）の蓄積は、組み合わされたＬＡＳ／キレート安定性に有益である。これは、複合の液体洗濯環境でのタンパク質の安定性を改良するために、タンパク質の物理的特性、この場合、正味荷電を最適化する例を示す。

実施例１３
ＢＰＮ’多重変異ライブラリー（ＭＭＬ）変異体の染み抜き性能
本明細書で上述するように、親タンパク質としてのＢＰＮ’を用いて、ＢＰＮ’多重変異ライブラリー（または組み合わせライブラリー）を、ＧｅｎｅａｒｔまたはＤＮＡ２．０により生産した。上述するように、ＢＰＮ’変異体タンパク質も生産した。培養上清のタンパク質濃度を、実施例１で記載するようにＴＣＡの沈殿から測定した。変異体の染み抜き性能を、後の修飾を伴う実施例１で記載の方法を用いて、ｐＨ８／１６℃、ｐＨ７／１６℃及びｐＨ８／３２℃でＥＭＰＡ １１６布見本（ＢＭＩ汚れ、ＣＦＴ）についての洗濯の適用で試験した。用いた試験洗剤は、熱不活性化したＴＩＤＥ（登録商標） ２Ｘ Ｃｏｌｄ洗剤（プロクター・アンド・ギャンブル）であった。商業用洗剤配合物の熱不活性化は、非酵素性成分の特性を保持する一方、任意のタンパク質成分の内因的な酵素活性を破壊する役目をする。あらかじめ計量された量の液体洗剤（ガラスボトル中）を９５℃で２時間水浴に置くことにより洗剤の熱不活性化を行った。洗剤を地元のスーパーマーケットから購入した。不活性化された割合（パーセント）を正確に測定するため、洗剤を溶かして５分以内に、熱未処理洗剤及び熱処理洗剤の両方を解析した。酵素活性を、ＡＡＰＦアッセイにより試験した。ＢＰＮ’変異体の機能性を性能指数（Ｐｉ）（すなわち、親ＢＰＮ’と比べた変異体の性能の比率）として数量化した。結果を表１３−１に示す。一以上のＢＭＩ染み抜き性能試験及び／またはＴＣＡの沈殿の０．５以上のＰｉ値を示すＢＰＮ’変異体は、改良された洗浄利点及び／または発現を示した。性能指数が０．０５以下だった場合、０．０５に固定し、表中で太字のイタリック体で示した。０．０５以下のＴＣＡタンパク質性能指数を有する全ての変異体について、全ての値を０．０５で固定した。この表中の「ＮＤ」は、「測定値なし」を示す。

［表１３−１］

実施例１４
ＢＰＮ’の二部位変異体の染み抜き性能
親タンパク質としてのＢＰＮ’を用いて、二部位変異体（ｔｗｏ ｓｉｔｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）を、位置２１７及び２２２（ＢＰＮ’の番号付け）で融合ＰＣＲを用いて生産した。上述のように、ＢＰＮ’変異体タンパク質を生産した。培養上清のタンパク質濃度を、実施例１で記載するようにＴＣＡの沈殿から測定した。変異体の染み抜き性能を、実施例１で記載の方法を用いて、熱不活性化したＴＩＤＥ（登録商標）２Ｘ Ｃｏｌｄ（プロクター・アンド・ギャンブル）中のｐＨ８／１６℃でＥＭＰＡ １１６布見本（ＢＭＩ汚れ、ＣＦＴ）についての洗濯の適用で試験した。ＢＰＮ’変異体の機能性を性能指数（Ｐｉ）（すなわち、ＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌと比べた変異体の性能の比率）として数量化した。結果を表１４−１に示す。ＢＭＩ染み抜き性能試験及び／またはＴＣＡの沈殿の０．５以上のＰｉ値を示すＢＰＮ’変異体は、改良された洗浄利点及び／または発現を示した。

［表１４−１］

実施例１５
Ｂ．ズブチリスにおけるＡＳＰプロテアーゼの生産
この実施例では、Ｂ．ズブチリスで６９Ｂ４プロテアーゼ（本明細書で「ＡＳＰ」、「Ａｓｐ」及び「ＡＳＰプロテアーゼ」及び「Ａｓｐプロテアーゼ」とも言う）を生産するために行った実験は、米国特許出願第１０／５７６，３３１号で説明され、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。簡潔に、バチルス種に適合したコドン使用頻度を有する、下記のＤＮＡ配列（合成ＡＳＰ ＤＮＡ配列）は、野生型ＡＳＰ前駆体タンパク質をコードする。

ＡＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＡＣＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣＧＡＴＣＴＧＧＧＧＴＴＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＧＴＴＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＧＡＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＣＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＣＴＧＴＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＣＴＡＧＡＡＣＧＡＴＧＴＴＣＧＡＣＧＴＡＡＴＴＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＣＡＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＣＧＡＣＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＧＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡＣＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＣＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＧＣＣＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧ
ＡＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＡＧＣＣＴＴＴＴＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＣＡＡＧＡＡＣＧＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＴＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＡＡＴＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＣＧＴＡＣＣＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡ（配列番号５６６）
上の配列では、太字は成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡを、標準フォントはリーダー配列を、また下線を付したものはＮ末端及びＣ末端プロ配列を示す。

セルロモナス属株６９Ｂ４（ＤＳＭ９８３３１６０３５）に由来する成熟セリン・プロテアーゼ酵素は、１８９のアミノ酸長であり、以下で示すようなＨｉｓ３２、Ａｓｐ５６及びＳｅｒ１３７から成る触媒三体（ａ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）を有する（触媒三体は、太字の下線で示す）。

ＦＤＶＩＧＧＮＡＹＴ ＩＧＧＲＳＲＣＳＩＧ ＦＡＶＮＧＧＦＩＴＡ ＧＨＣＧＲＴＧＡＴＴ ＡＮＰＴＧＴＦＡＧＳ
ＳＦＰＧＮＤＹＡＦＶ ＲＴＧＡＧＶＮＬＬＡ ＱＶＮＮＹＳＧＧＲＶ ＱＶＡＧＨＴＡＡＰＶ ＧＳＡＶＣＲＳＧＳＴ
ＴＧＷＨＣＧＴＩＴＡ ＬＮＳＳＶＴＹＰＥＧ ＴＶＲＧＬＩＲＴＴＶ ＣＡＥＰＧＤＳＧＧＳ ＬＬＡＧＮＱＡＱＧＶ
ＴＳＧＧＳＧＮＣＲＴ ＧＧＴＴＦＦＱＰＶＮ ＰＩＬＱＡＹＧＬＲＭ ＩＴＴＤＳＧＳＳＰ（配列番号５６７）
実施例１６
ＡＳＰ組み合わせ変異及び多重変異ライブラリーの生産
この実施例で、ＡＳＰの組み合わせ変異及び多重変異ライブラリーを構築するために用いた方法を記載する。ＡＳＰの組み合わせ変異の構築は、米国特許出願シリアル番号第１０／５７６，３３１号に記載される。

多重変異ライブラリーの構築
反応で用いるプライマー濃度以外はストラタジェンＱＣＭＳキットに従って多重変異ライブラリーを構築した。具体的には、１μＬのメチル化された精製ｐＵＣ１８−ＡＳＰプラスミド（約７０ｎｇ）を、１５μＬの滅菌蒸留水、１．５μＬのｄＮＴＰ、２．５μＬの１０×緩衝液、１μＬの酵素ブレンド及び１．０μＬの変異体プライマー混合物と混合した（合計で、１００ｐｍｏｌのプライマー濃度になる）。このプライマー混合物を、１８の変異体プライマーのそれぞれ１０μＬ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）を用いて調製した。先行の変異誘発で、ストラタジェンにより推奨されるように、このライブラリーに５０ｎｇの各プライマーを添加したところ、より少ない変異を得た。従って、前記操作手順は、変異誘発の段階において各反応中に１００ｐｍｏｌのプライマーを含むように変更されている。サイクル条件は、薄壁の０．２ｍＬＰＣＲチューブを用いたＭＪリサーチＰＴＣ２−２００サーモサイクラーで、９５℃を１分、次に、９５℃を１分、５５℃を１分及び６５℃を１２分のサイクルを３０サイクル行った。反応生産物を、ＱＣＭＳキットに付属の１μＬのＤｐｎＩを用いて、３７℃で一晩インキュベートして消化した。さらに０．５μＬのＤｐｎＩを添加し、１時間反応物をインキュベートした。

続いて、ライブラリーＤＮＡ（変異誘発された一本鎖ｐＵＣ１８−ＡＳＰ生産物）を、電気穿孔法によりエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（インビトロジェン、カタログＮｏ．Ｃ４０４０−５２、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＴＯＰ１０Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）Ｅ．Ｃｏｌｉ，ｄａｍ＋）に導入し、形質転換された細胞を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むアガープレート上で選択育成を行い、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内にＡＳＰ多重変異ライブラリーを得た。（数千のうちの数十の）コロニーを採取し、キアゲン・スピン・ミニピレップＤＮＡキット（カタログＮｏ．２７１０６）を用いて、キアゲンによるマニュアルに従った方法で、プラスミドＤＮＡを調製した。このミニピレップＤＮＡを、キットに付属の５０μＬのキアゲンＥＢ緩衝液で溶出した。

ミニプレップＤＮＡを、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ制限酵素を用いて消化した。ＡＳＰライブラリー断片混合物（ＰｓｔＩ×ＨｉｎｄＩＩＩ）をゲル精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（カタログＮｏ．１５２２４−０２５）を用いたリガーゼ反応で、インビトロジェンによる粘着末端のクローニングのためのプロトコルで推奨されるように、４１５４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ×ＰｓｔＩ ｐＨＰＬＴベクター断片内でクローン化した。他のアプローチにおいて、合成ＡＳＰライブラリー断片をＧｅｎｅＡｒｔにより生産した。これらのＡＳＰライブラリー断片も、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、リガーゼ反応により、４１５４塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ×ＰｓｔＩ ｐＨＰＬＴベクター断片内で精製及びクローン化した。

このリガーゼ反応混合物を直接バチルス細胞内に形質転換するため、ライブラリーＤＮＡ（ｐＨＰＬＴ内でクローン化されたＡＳＰライブラリー断片混合物）をＴｅｍｐｌｉＰｈｉキット（アマシャム、カタログＮｏ．２５−６４００）を用いて増幅した。この目的のために、１μＬのリガーゼ反応混合物をＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットに付属のサンプル緩衝液５μＬと混合して、９５℃で３分間加熱して、ＤＮＡを変性させた。この反応物を冷却させるために氷上に２分間置き、その後、簡単に遠心沈殿させた。次に、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉキットに付属の反応緩衝液５μＬ及びｐｈｉ２９ポリメラーゼ０．２μＬを添加して、この反応物をＭＪリサーチＰＣＲマシーン内で３０℃、４時間、インキュベートした。ｐｈｉ２９酵素を前記ＰＣＲマシーンで、６５℃で１０分間、インキュベートすることにより、反応中で熱不活性化させた。

ライブラリーをバチルス内に形質転換するために、０．１μＬのＴｅｍｐｌｉＰｈｉ増幅反応生産物を、５００μＬのコンピテントＢ．ズブチリス細胞（△ａｐｒＥ、△ｎｐｒＥ、ｏｐｐＡ、△ｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、△ａｍｙＥ：：（ｘｙｌＲ，ｐｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ）と混合し、その後、１時間、３７℃で激しく振とうし、この１００μＬ及び５００μＬを２０ｐｐｍの硫酸ネオマイシン（シグマ、カタログＮｏ．Ｎ−１８７６、ｍｇ当り７３２μｇのネオマイシンを含む）及び０．５％スキムミルクを含むＨＩ−アガープレートに蒔いた。ライブラリーから９５のクローンを配列決定のために採取した。

１４％のクローンだけが、骨格（親）配列（Ｒ０１４Ｉ−Ａ０６４Ｋ−Ｔ０８６Ｋ−Ｔ１１６Ｅ−Ｒ１２３Ｆを有するＡＳＰ）と同じであったという点で変異誘発は成功し、約３％のクローンが更なる変異を有していた。残りの配列決定されたクローン（７２％）は全てが変異体で、これらのうちの約９４％が特有の変異体であった。このライブラリーの配列決定の結果を以下の表１６−１に示す。

［表１６−１］

実施例１７
複数特性についての有害な変異の相関
この実施例で、任意の特性についての有害な変異は、特性同士の相関にかかわらず、あらゆる他の特性についての有害な変異と相関があるという、法則を例証する。本明細書で示すように、わずかな数の位置のみが（５〜１０％）、全ての特性において悪くなる変異を有していた。これらの位置はタンパク質の折りたたみを定義し、進化において保存されている。このことは、任意の特性について有益な変異を同定することは、その特性について真の予測可能なスクリーニングを必要とするが、任意の特性について有害である可能性の高い変異の同定は、本明細書で提供する方法を含むが、これらに限られない、任意のスクリーニングを用いることで達成出来ることを示唆している。

変異体酵素を、本明細書及び米国特許出願シリアル番号第１０／５７６，３３１号、１０／５８１，０１４号、１１／５８１，１０２号及び１１／５８３，３３４号に記載の方法のように生産した。これらの文献は参照により全体が本明細書に援用される。以下に示す表は、二の特性の各々について５％ｗｔより高い活性を有する変異体の数と、５％より低い活性を有する変異体の数を、二の特性についての相関係数と共に対比較を行ったものである。この実施例で用いたアッセイ系は上記の出願にも提供されている。本明細書で用いる特性は、ＡＳＰについてのカゼイン活性（ＣＡＳ）、ケラチン活性（ＫＥＲ）、ＡＡＰＦ活性（ＡＡＰＦ）、ＬＡＳ安定性（ＬＡＳ）及び熱安定性、並びにＡＣＴについての過酸形成（ＰＡＦ）及び過酸分解性（ＰＡＤ）である。

ケラチン加水分解アッセイ
このアッセイ系で用いた化学物質及び試薬溶液は、以下である。

ケラチン ＩＣＮ９０２１１１
洗剤：１．６ｇの洗剤を１０００ｍｌの水に溶解した（ｐＨ＝８．２）。１０，０００ｇｐｇのＣａＣｌ_２／ＭｇＣｌ_２０．６ｍｌの他、１１９０ｍｇのＨＥＰＥＳも加え、それぞれ硬度と緩衝液濃度を６ｇｐｇと５ｍＭとした。ｐＨをＮａＯＨで８．２に調整した。

ピクリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）
シグマＰ−２２９７（５％水溶液）
試薬Ａ：４５．４ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ（メルク６３０８）及び１５ｍｌの４Ｎ ＮａＯＨを共に溶解し、最終容量１０００ｍｌとした（必要な場合は加熱）
試薬Ｂ：３５．２ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・１Ｈ_２Ｏ（メルク６３４６）及び０．６ｇのＮａ_２ＳＯ_３（メルク６６５７）を共に溶解し、最終容量１０００ｍｌとした。

方法：
インキュベーションの前に、ケラチンを、一度に少量ずつ１００μｍの篩にかけた。次に、１０ｇの１００μｍ未満のケラチンを、室温で少なくとも２０分間、ｐＨを規則的に８．２に調節しながら洗剤溶液中で撹拌した。最後に、この懸濁液を、室温で２０分間遠心分離した（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）、ＧＳＡモーター、１３，０００ｒｐｍ）。この手順を再度繰り返した。最後に、湿った沈殿物を洗剤中に懸濁し、総容量２００ｍｌとし、この懸濁液をピペットによる秤量のあいだ撹拌した。インキュベーションの前に、ＭＴＰを、Ｂｉｏｈｉｔマルチチャンネルピペットと１２００μｌ（２００μｌを６分注する。チップ内にケラチンが付着することを防ぐため出来るだけ速く分注した。）チップを用いて、ウェル当たり２００μｌの基質で満たした。次に、１０μｌのフィルターろ過した培地をＭＴＰを含む基質に加えた。このプレートをテープで覆い、恒温槽に置き、２０℃で３時間３５０ｒｐｍ（ニューブランスウィックイノーバ４３３０）でインキュベートした。インキュベーションに続き、このプレートを３０００ｒｐｍで３分間遠心分離（シグマ６Ｋ１５遠心分離機）した。この恒温槽から第一のプレートを取り出す１５分前に、５０ｍｌの試薬Ａ当たり１ｍｌのＴＮＢＳ溶液を混合してＴＮＢＳ試薬を調製した。

ＭＴＰをウェル当たり６０μｌのＴＮＢＳ試薬Ａで満たした。インキュベートしたプレートから、１０μｌをＴＮＢＳ試薬Ａを含むＭＴＰに移した。このプレートをテープで覆い、室温及び５００ｒｐｍでベンチシェーカー（ＢＭＧサーモスター）内で２０分間振とうした。最後に、２００μｌの試薬Ｂをウェルに添加し、シェーカーで１分間混合し、ＭＴＰリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。

ケラチンの加水分解活性の計算
得られた吸光度の値を、ブランク（酵素のない基質）の値で補正し、加水分解活性の測定値を提供した。各サンプル（変異体）について性能指数を計算した。この性能指数を、同じタンパク質濃度の変異体の性能（実際値）と標準酵素の性能（理論値）とで比較した。加えて、標準酵素のラングミュアの方程式のパラメーターを用いて、理論値を計算することが出来る。１より大きい性能指数（ＰＩ）（ＰＩ＞１）は、標準（例えば、野生型）と比較してより優れた変異体であり、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は、標準と同じ性能の変異体を示し、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、標準より悪い変異体を示す。従って、このＰＩは、好ましい変異体の他に、所定の環境で用いるには望ましくない変異体も示す。

ジメチルカゼイン加水分解アッセイ（９６穴）
このアッセイ系で用いた化学物質及び試薬溶液は、以下である。

ジメチルカゼイン（ＤＭＣ）：シグマＣ−９８０１
ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０：シグマＰ−８０７４
ＰＩＰＥＳ緩衝液（酸を含まない）：１５．１ｇのシグマＰ−１８５１を約９６０ｍｌの水に溶かす。４Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調節する。１ｍｌの５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を添加して容量を１０００ｍｌにする。ＰＩＰＥＳ及びＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０の最終濃度はそれぞれ５０ｍＭ及び０．００５％である
ピクリルスルホン酸（ＴＮＢＳ）：シグマＰ−２２９７（５％水溶液）
試薬Ａ：４５．４ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ（メルク６３０８）及び１５ｍｌの４Ｎ ＮａＯＨを共に溶解し、最終容量１０００ｍｌとした（必要に応じて加熱する）。

試薬Ｂ：３５．２ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・１Ｈ_２Ｏ（メルク６３４６）及び０．６ｇのＮａ_２ＳＯ_３（メルク６６５７）を共に溶解し、最終容量１０００ｍｌとした。

方法：
基質を調節するために、４ｇのＤＭＣを４００ｍｌのＰＩＰＥＳ緩衝液に溶解した。フィルターろ過した培養上清をＰＩＰＥＳ緩衝液で希釈して、対照の最終濃度が育成プレート中２０ｐｐｍにした。その後、１０μｌの希釈した各上清をＭＴＰのウェル中にある２００μｌの基質に添加した。このＭＴＰプレートをテープで覆い、数秒振とうして、攪拌を行わずに２時間３７℃のオーブンに置いた。

このオーブンから第一のプレートを取り出す約１５分前に、５０ｍｌの試薬Ａ当たり１ｍｌのＴＮＢＳ溶液を混合してＴＮＢＳ試薬を調製した。ＭＴＰをウェル当たり６０μｌのＴＮＢＳ試薬Ａで満たした。インキュベートしたプレートを数秒振とうして、１０μｌをＴＮＢＳ試薬Ａを含むＭＴＰに移した。このプレートをテープで覆い、室温及び５００ｒｐｍでベンチシェーカー（ＢＭＧサーモスター）中で２０分間振とうした。最後に、２００μｌの試薬Ｂをウェルに添加して、シェーカーで１分混合し、ＭＴＰリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。

ジメチルカゼイン加水分解活性の計算
得られた吸光度の値を（実質的に酵素のない）ブランクの値で補正した。得られた吸光度は、加水分解活性の測定値である。サンプルの（任意の）比活性度は測定したタンパク質の濃度で吸光度を割ることにより計算した。

熱安定性アッセイ
このアッセイは、緩衝された培養上清の加熱前後のジメチルカゼイン（ＤＭＣ）加水分解に基づいている。ＤＭＣ加水分解アッセイで説明したものと同じ化学物質及び試薬溶液を用いた。

方法：
フィルターろ過された培養上清を、（増殖プレート中のコントロールの濃度に基づき）ＰＩＰＥＳ緩衝液中で２０ｐｐｍに希釈した。その後、５０μｌの各希釈上清を空のＭＴＰのウェルに入れた。このＭＴＰプレートを、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカーＨＴ（サーモ・ラボシステムズ）中で６０℃、４００ｒｐｍで９０分間、インキュベートした。このプレートを氷上で５分間冷却した。その後、１０μｌの溶液をウェル当たり２００μｌのＤＭＣ基質を含む新しいＭＴＰに添加した。このＭＴＰをテープで覆い、数秒間振とうした後、攪拌を行わずに２時間３７℃のオーブン内に置いた。ＤＭＣ加水分解アッセイで用いたものと同じ検出方法を用いた。

熱安定性の計算：
サンプルの残存活性を最終の吸光度と初期の吸光度の比率で示す。これらの吸光度はブランクで補正されている。

以下の表で示すように、相関があるとされた特性は（相関係数＞０．５）、ＡＳＰについてのＣＡＳ、ＫＥＲ及びＡＡＰＦだけである。他の全ては相関していなかった（相関係数＜０．３）。特性が相関していなかったという事実にも関わらず、変異が二の特性について有害であろうという可能性は、偶然期待されたものよりも非常に高かった。表１７−１は、観察された変異体の数及び可能性に基づいて期待された変異体の数の計算による割合を提供する。１より大きい数は正の相関を示し、１未満の数は負の相関を示す。

［表１７−１］

［表１７−２］

［表１７−３］

［表１７−４］

［表１７−５］

［表１７−６］

Claims (12)

1. バチルス・ズブチリシンの単離ズブチリシン変異体であって、前記ズブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有し、Ｇ１２８Ａ−Ｙ２１７Ｑの置換の組み合わせを含む成熟形であり、前記位置が配列番号２で示すＢ．アミロリケファシエンス・ズブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の成熟形の位置に対応する、前記単離ズブチリシン変異体。
2. 請求項１に記載の単離ズブチリシン変異体をコードする単離核酸。
3. 請求項２に記載の核酸を含む発現ベクター。
4. 請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
5. 請求項１に記載の単離ズブチリシン変異体を含む洗浄組成物。
6. 前記洗浄組成物が洗濯用洗剤である、請求項５に記載の洗浄組成物。
7. 前記洗濯用洗剤が、冷水用洗剤、低ｐＨ用洗剤または小型洗剤である、請求項６に記載の洗濯用洗剤。
8. バチルス・ズブチリシンのズブチリシン変異体を生産する方法であって、
   ａ）請求項１のズブチリシン変異体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、及び
   ｂ）ズブチリシン変異体の生産に適した条件下で、前記形質転換された宿主細胞を培養し、ズブチリシン変異体を生産する工程
   を含む、前記方法。
9. 生産されたズブチリシン変異体を採取する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記宿主細胞がバチルス種である、請求項８に記載の方法。
11. 前記バチルス種がＢ．ズブチリスである、請求項１０に記載の方法。
12. 繊維を含む表面及び／または物を、請求項１に記載の単離ズブチリシン変異体を含む洗浄組成物と接触させる工程を含む、洗浄方法。

Images