JPH01117800A - グリセロール定量法 - Google Patents
グリセロール定量法Info
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- JPH01117800A JPH01117800A JP63247252A JP24725288A JPH01117800A JP H01117800 A JPH01117800 A JP H01117800A JP 63247252 A JP63247252 A JP 63247252A JP 24725288 A JP24725288 A JP 24725288A JP H01117800 A JPH01117800 A JP H01117800A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、グリセロール又はグリセロール類似体の定量
方法に係る。 グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）ｆｆ素は、臨
床診断のための血清トリグリセライドの分析の如き生化
学分析および化粧品製造用ジヒドロキシアセトンの製造
に有用である。しかし乍ら、ＧＤＨの源は比較的少しし
か知られておらず然も、従来公知で利用されている全て
のＧ ｌ） Ｈ酵素は、不安定であり、室温で溶液中２
日間以下の半減期を有するものである。たとえ凍結乾燥
された粉末であっても低温で貯蔵することが提唱されて
いる。 ある種の好熱性微生物が、室温又は高温下において溶液
中で長期間安定であるＧＤＨ酵素を生産することが知見
された。 従って、本発明は、下記のアミノ酸組成：当量数／サブ 一乙互ノｌ−Ｌニュ上−１見呈去 アスパルテート ２８．３ ± 、８ス
レオニン ２２．７ ｉ 、３セ
リ ン １８．５
± 、５グルタメート ４
４．５ ± 、７ブロリン １７
．７ ± １，４グリシン ２７
．０ ± 、１アラニン ４９．
９ ±２．８システィン げ バ リ ン ２９，８
± 、８メブーオニン １ イソロイシン ２８．３ ± １０イ
シン ３３．１ ±２．１ヂロシ
ン １１．８ ± 、１フエニル
アラニン １１．８ ± 、９ヒスチジン
１０．５ ± 、３リ ジ
ン ２７゜７ ±
、５トリプトフアン ２Ｉ アルギニン ７．０ ± 、３率
推 定 及び （ｂ） Ｎ末端アミノ酸配列：ＡＩａ’ＡＩａ Ｇｌ
ｕＴｈｒ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ａｌａ”ｔｙｓ Ｔｙｒ Ｖａｌを
有し、５０ｍ Ｍのリン酸カリウムと１０ｍ Ｍのβ−
メルカプトエタノールと０．１ｍＭのフェニルメチルス
ルホニルフルオライド・（ＰＭＳＦ）とから成るｆ）Ｈ
６，８の緩衝溶液中３ｑ／Ｉｄ、の溶液として２０℃で
貯蔵された場合、４日間以上の活性半減期（ａＣｔｉＶ
ｅ ｈａｌｆ −１ｉｆｅ）を有するグリセロールデヒ
ドロゲナーゼ酵素製剤を促供するものである。この酵素
を以下“耐熱性ＧＤト１酵素′°と略称する。 本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼは、バチルスス
フアロサーモフィラスＲ３９３菌株の好熱性微生物又は
その好熱性Ｇ Ｄ ）（酵素を生産し得る誘導金（ｄｅ
ｒｉｖａｔｉｖｅ）もしくは変異菌（ｍｕｔａｎｔ）を
培養し、次いで細胞を破壊して細胞破砕片から該酵素を
分離することにより生産され得る。前記誘導菌又は前記
変異菌としてＳＣ７と記されたものを例示し得る。これ
らの菌株は、スコツトランド、アバーディーンのナショ
ナルコレクションインダストリアル バクテリア（ＮＣ
ＩＢ）に、登録番−号Ｎ ＣＩ Ｂ １１４００及びＮ
ＣＩ Ｂ １１４０１として既に寄託されており、そ
れぞれ工業技術院微生物工業技術研究所（以下微工研と
称する）に微生物受託番号ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、４９８３
及び４９８４として寄託されている。 これらは、以下の諸性質により同定され得る。 （以下余白） Ｒ３９３（ＮＣＩＢ １１４００）
５Ｃ７（ＮＣＩＢ １１４０１）〈寄託受託ＴＩＱＩ’
ＥＩ？Ｎ−ＰＮ０．４９８３） （寄託受託番号
１’ＥＲ）ｌ−ＰＮｏ、 ４９８４ ）コロニー外観
半透明、ｌｆ’Ｊり上がった球 Ｒ３９３と
同じであるもつ、胞子形成能 ３７”Ｃ上ｖｅ（ゆっくり、２−３日）５５℃ 斗ｖｅ ６０℃ ＋ｖｅ ７０℃ −ｖｅ （１印凸苺） 発 醇 ユ」し−旦」シーアドニ
トール ＷＷ ＋＋エスクリン
−−−−−アラビノース −一
一一 ゲキストリン −一一−−デキストＵ−ス
Ａ／Ｇ ＷＷ ＷＷダルジット
−−−− エリスリット −一一一 ガラクトース −−−−−グリセＯ−ル
＋＋ 十−←グリコーゲン
−一一一 イノシトール ｗｗ ｗｗイヌリン
−一一一 ラクトース −−−− レブロース −−ＷＷ マルトース −−−− マンノース ｗｗ ｗｗラフィノー
ス −−−− ラムノース −一一一 サツカロース ＋Ｗ ＋＋ザリヂン
−−−−スターチ
−−−− ソルビトール Ｗ−ＷＷ トレハロース −−ＷＷ キシＯ−ス −−−− マンニトール ＋Ｗ ＋＋ペフトン＋
Ｅ】でのＪ艮 ６０℃で２４時間。最終濃度５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣＮま
で塩化ナトリウムに耐性を有する。 ｍ−−１ カタラーゼ ＋ オキシターゼ ＋ 硝酸塩還元酵素 − 亜硝酸塩還元酵素 − 更に、本発明の菌株は、下記試験に示される、バチルス
ステアロサーモフィラスＮ ＣＩ Ｂ １１２７０（又
は他の好熱性桿菌）の清澄を抑制し得るバクテリオシン
の生産により確認され得る。 約１０乃至２０コ〇ニー／プレートを含有して一晩培養
された希釈プレートを調製する。（ｑられるコロニーを
２時間クロロホルム蒸気に露らして殺菌し、次いでプレ
ートに通気してクロロホルムを除去する。マツトゲロー
ス（ｍａｔ ｏｒｏｗｔｈ）を形成するに充分な濃度の
Ｎ ＣＩ Ｂ １１２７Ｇ懸濁液でこれらを浸潤し、６
０℃で一晩培養する。Ｒ８９３又はＳＣ７の１つの死滅
コロニーは、Ｎ ＣＩ Ｂ １１２７０によって形成さ
れたマット中の非酸１ （、ｎｏ−ｇｒｏｗｔｈ）明瞭
域で囲まれている。この抑制を惹起するバクテリオシン
因子はサーモシンと呼称され、分子壊約１３．０００ダ
ルトンの耐熱性グリコプロティンであることが判明した
。 これらの菌株は、前記サーモシン用コードと考えられ得
る約３ミリオンダルトンの大きさのプラスミツドを含有
している。 Ｇ Ｄ Ｈ生産能を保持する誘導菌および変異株は、環
境圧力調整（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｒｅｓｓ
ｕｒｅ）の如き標準方法によって製造され得るか、又は
、培養中に自然に発生し得る。これらは、プロパン−１
，２−ジオール（Ｇ Ｄ Ｈ用物質であって、耐熱性桿
菌によって通常生産されるグリｔ？［ｌキナーゼ用物質
ではない）とクロラムフェニコールとで培養し、次いで
トリフェニルテトラゾリウムクロライドで染色すること
により同定され得る。 これらの菌株およびその誘導菌株もしくは変異株は、一
般に、グリセロール又はグリセロール類を欠く培地にお
いてさえもＧＤＨ酵素を生産する。 しかし乍ら、最大の生産量を得るためには、培養基は、
通常少なくとも０．０５ｆｆｉ １％以上好ましくは４
．０ｆｆｉ１％以下のグリセロール又はグリセロール類
を含有している。最も好ましくは、培ｉｌｌは０．１乃
至１．Ｏ１１％のグリセロール又はグリセロール類を含
有している。ここにいうグリセロール類とは、多官能Ｃ
３アルコール特に２つの水酸基を含有する多官能Ｃ３ア
ルコールを包含するものであり、例えばグリセリン酸、
１−一又はＤ−グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセ
トン、３−メルカプトプロパン−１，３−ジオール、プ
ロパン−１，３−ジオール又はプロパン−１，２−ジオ
ールを指称する。 いずれの場合に於いても、培養基は、天然物から得られ
た栄養源例えばペプトン、ｔｓ母氷解物。 牛肉エキス、カゼイン氷解物等を含有する複合培地か、
又は無機および簡単な有機の栄養源を含有する一定の塩
培地でよい。 培地は、微生物が生長する温度、典型的には４０〜６５
℃特に５０〜６５℃、及びｐＨ５〜８に調整される。又
、培地は好気性下又は嫌気性下に調整され得るが、しか
し乍ら好気性下に調整されることが好ましい。最適の培
養期間がある（その後生産量は低下する）ように思われ
る。最適の培養期間は、使用される菌株及び培養条件に
依存し、実験によって求められなければならない。しか
し乍ら、１０乃至２０時間の培養期間が適当であること
が判明した。 Ｉｌｌ胞Ｔｉ１ＩＩ晴は、通常の技術例えば音波処理、
小モゲナイゼション又は酵素処理等により行い得る。 その後、通常のＮ素単龍および精製技術が行なわれ、例
えばイオン−交換クロマトグラフィー、リン酸カルシウ
ムでの分別、ＴａＩ！Ｉアンモニウム又は有機溶媒（例
えば１０〜２０ｖ ／ ｖ％濃度のエタノール）を使用
する沈澱、デキストラン。アガロース又はアガロースポ
リアクリルアミド上でのゲル戸過、及び／又はヌクレオ
チド誘導細胞間質又はスルホンｌＩ置換クロロトリアゾ
ニル（“プロジオン″−商標名）染料での親和クロマト
グラフィー（ａｆｆｉｎｉｔＶ ＣｈｒＯＩａｔＯ！１
ｌｒａｐｈＶ）等で行なわれる。 上記した氏り上２ ステアロサーモフィラスの菌株から
生産された耐熱性ＧＤ）−ｊｉｆｆ素は、典型的に、そ
れぞれの分子ｍが約６０，０００の４つの等しい又は同
じようなサブ−ユニットから成り、全分子量が約２４０
，０００±３０，０００ダルトンである構造を有する。 下記分析方法により均質化して試験すると、該酵素は、
３０℃、ｐ）１８．５で、蛋白質１１Ｉ１１当り少なく
とも５単位通常１０〜３０１１１位の比活性度を有して
いる。類似の基質に対して同じような条件上で試験する
と、グリセロール（１００％）に対する活性度（Ｖｍａ
ｘ）は次のとおりである。 ３−メルカプト−プロパン−１，３−ジオール４９％プ
ロパン−１，３−ジオール １６％ プロパン−１，２−ジオール１６５％ 活性は高濃度ＮＨ４イオンにより阻害される。プロテア
ーゼによる破壊を避けるために、酵素を低温（約４℃）
で精製することが好ましい。しかし乍ら、−坦精製した
俵は、酵素を室温で保存することが好ましい。 本発明による酵素製剤は、粗な細胞抽出物又は部分的に
若しくは高度に精製された製剤である。 該製剤は、凍結乾燥物又は他の固形物形態として、又は
分析されるべきグリセロールのレベルに応じて０．１〜
５０単位／ｍｌ含有する水溶液として提供され得る。 Ｉｆｆ’素製剤は、血清および培養基を含む広範囲のサ
ンプル中の、既に存在しているか又はアルカリ加水分解
又は酵＃（例えばリパーゼ）作用によりグリセライドか
ら放出されるグリセロール又はグリセロール類を定量す
るために使用され得る。 更に、本発明の別の観点によれば、サンプル中のグリセ
ロール又はグリセロール類を定量するための方法が提供
される。該方法は、少なくとも７のｐＨ好ましくは８〜
８．８のｐｌ−１の緩衝溶液中で、サンプルをグリセＯ
−ルデヒドＬ１ゲナーゼ酵素製剤及びニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に混合し、約３４０ｎ
ｍの光学密度の増加を測定することから成る。次いで、
光学密度の増加率又は最終光学密度を標準溶液によって
得られたそれらと比較することにより、グリセロールが
埠出される。増加率（ΔＯＤ ）を使用する場合には
、Δ０Ｄ３４ｏの値が０．０６−０．１２／分の範囲に
なるように、サンプルと標準とを希釈することが好まし
い。 分析を下記式に基づいて行なう。 グリセロール十ＮＡＤ旦ＤＨ→ ジヒドロキシアセトン十Ｎ Ａ Ｄ Ｈこの反応に基づ
〈従来の分析に於いては、使用されるｐｔｌ値が高く（
少なくとも９、通常１０〜１１）、ジヒドロキシアセト
ンがエノールニ量体を形成して酵素に関連のないＮＡＤ
の化学的還元を進行させるため、口触反応による不正確
さを伴うという欠点があった。本発明の分析に於いては
、低ＯＨの使用のため口触反応が避けられる。更に、緩
衝系がこの副反応の割合に影響を及ぼすことが知見され
た。この故に、緩衝剤は、アミン特にトリエタノールア
ミン／ＨＣＩＩ衝剤であることが好ましい。勿論、リン
酸塩の如き他の緩衝剤も使用し得る。炭酸塩／重炭酸塩
を使用し得るが、むしろ適当ではない。Ｔ１離のアンモ
ニウムイオンは、上記した阻止効果のため避けるべきで
ある。 このように、本発明の酵素製剤は、試験キットの一部と
して有利に提供され得る。このキットは、乾燥物通常凍
結乾燥粉又は水溶液としてのＮ素を含有し、又、ｐＨ８
〜８．８の緩衝溶液とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）とを含有する。キットは、更に、標準
グリセリン溶液及びグリセリドから遊離グリセリンを放
出するためのアルカリ性ＫｏＨ若しはリパーゼ溶液を任
意に含有する。 酵素が水溶液として存在する場合、その濃度は、キット
の使用目的に応じて０．１〜５０単位／ｍｌの範囲で広
く変更し得、１種以上の酵素溶液が、サンプル中の異な
るグリセロールレベルを網羅、するために、提供され得
る。１ｉａｒ剤は、アミン特にトリエタノールアミン！
１衝剤であることが好ましく、約８．５のＥ）Ｈを有し
ていることが好ましい。 ＮＡＤ溶液は適当な濃度であればよく、典゛型的に１０
■／ｍｌの濃度である。 本発明の種々の観点の典型的具体例を実施例により詳説
する。実施例に於いて使用する培地は次のとおりである
。 バチルス ステアロサーモフィラス（ＢＳ）培地
９／ｆＪトリブチイツクミートダイジエスト（バクト
ドリブトン）２ＯＮ？−母エキス
１０ＦｅＣｊ！３−６Ｈ２
００，０１４ ＭｎｃＮ ２−４１−１．、０
０．０３に２Ｓ０４２．６ ＭｑＳ０４ ・７Ｈ２００，５４ クエン酸
０・６４Ｎａ２ＨＰＯ４−２１−１２０６，
４ 弯１Ｂ−ミｉ塊 呈
！二り下記の点において上記と異なる。 トリプトン ２．０酵母エ
キス ５０に２ＳＯ４６，０ 泡止め剤（ＲＤ泡止め剤）２．５ １ＯＮ−ＮａＯＨｔ’ ｌ）Ｈ７，１＋０．１ ニ、３
１１ＴＳＢＺ五ニ トリプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌ ４２） 、 １７．０
；ソーヤペプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌ４４） 、 ３．
０ ；グリコース。 ２．５； ＮａＣｊ 、 ５．０：
Ｋ ２ トｌＰＯ４、２，５： 及びアガー（Ｏ
ｘｏｉｄ Ｎｏ ： １）、 １５．０を含有する（
９／ｎ）。量的ＤＨは７．３である。 立旦土１１ ＮａＨＰＯ４２１−１２０，３，１２： Ｎ８４
Ｃｊ 。 ５．０４： ＫＣｊ 、 ０．３７： Ｎ ａ２８０４
争１０Ｈ２０゜３．２２：クエン酸−水和物、 ０．
４２ ： ７ ｎ ０ 、０．００２；ＦｅＣＪ１３
中 ６ ト１２ ０．０２７；Ｍ ｎ
Ｃｊｌ ２ ・ ４ Ｎ２ ０゜０．０
１ ； Ｃｕ Ｃｊｌ ２ ・２ Ｎ２０．０．００
０８５；ＣｏＣｆＪ２ ・６Ｈ２０，０，００２４：
１１３８０３ 。 ０．０００３１ ： ＭＱＯ，ｏ、ｏｓ： ｃａｃｏ
３．０．０１及びＮａ２ＭｏＯ４’ ２Ｈ２０，０，０
０２４をＨＣＩＪ中に溶解＜ｇ／ｊ）。最終濃度は培地
１ρ当り０．２９５ｄＲＩＪ度である。ＤＨを７．３に
調整。 使用する基本的菌株は、Ｒ８９３と記される菌株（Ｎ
ＣＩ １３１１４００および寄託受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ
Ｎ Ｏ，４９８３として寄託済み）である。誘導菌株
は次のようにして・得られる。 回転培養器中６０℃、１５０ｒｐｍで一晩培養された、
０．４ｒＪ／ １００ｍのグリセロールを含有するＢＳ
培地中のＲ８９３の２００１ｄ１Ｂどうフラスコ液体培
養から、いくつかのＴＳＢアガーの希釈プレートを調整
した。５０〜１００のコロニーを含む皿の複製プレート
を、ベルベヂンパッド（ｖｅｌｖｅｔｉｎｅ ｐａｄ）
を使用して調整した。次いで、最初のプレートを２時間
クロ
方法に係る。 グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）ｆｆ素は、臨
床診断のための血清トリグリセライドの分析の如き生化
学分析および化粧品製造用ジヒドロキシアセトンの製造
に有用である。しかし乍ら、ＧＤＨの源は比較的少しし
か知られておらず然も、従来公知で利用されている全て
のＧ ｌ） Ｈ酵素は、不安定であり、室温で溶液中２
日間以下の半減期を有するものである。たとえ凍結乾燥
された粉末であっても低温で貯蔵することが提唱されて
いる。 ある種の好熱性微生物が、室温又は高温下において溶液
中で長期間安定であるＧＤＨ酵素を生産することが知見
された。 従って、本発明は、下記のアミノ酸組成：当量数／サブ 一乙互ノｌ−Ｌニュ上−１見呈去 アスパルテート ２８．３ ± 、８ス
レオニン ２２．７ ｉ 、３セ
リ ン １８．５
± 、５グルタメート ４
４．５ ± 、７ブロリン １７
．７ ± １，４グリシン ２７
．０ ± 、１アラニン ４９．
９ ±２．８システィン げ バ リ ン ２９，８
± 、８メブーオニン １ イソロイシン ２８．３ ± １０イ
シン ３３．１ ±２．１ヂロシ
ン １１．８ ± 、１フエニル
アラニン １１．８ ± 、９ヒスチジン
１０．５ ± 、３リ ジ
ン ２７゜７ ±
、５トリプトフアン ２Ｉ アルギニン ７．０ ± 、３率
推 定 及び （ｂ） Ｎ末端アミノ酸配列：ＡＩａ’ＡＩａ Ｇｌ
ｕＴｈｒ Ｖａｔ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ａｌａ”ｔｙｓ Ｔｙｒ Ｖａｌを
有し、５０ｍ Ｍのリン酸カリウムと１０ｍ Ｍのβ−
メルカプトエタノールと０．１ｍＭのフェニルメチルス
ルホニルフルオライド・（ＰＭＳＦ）とから成るｆ）Ｈ
６，８の緩衝溶液中３ｑ／Ｉｄ、の溶液として２０℃で
貯蔵された場合、４日間以上の活性半減期（ａＣｔｉＶ
ｅ ｈａｌｆ −１ｉｆｅ）を有するグリセロールデヒ
ドロゲナーゼ酵素製剤を促供するものである。この酵素
を以下“耐熱性ＧＤト１酵素′°と略称する。 本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼは、バチルスス
フアロサーモフィラスＲ３９３菌株の好熱性微生物又は
その好熱性Ｇ Ｄ ）（酵素を生産し得る誘導金（ｄｅ
ｒｉｖａｔｉｖｅ）もしくは変異菌（ｍｕｔａｎｔ）を
培養し、次いで細胞を破壊して細胞破砕片から該酵素を
分離することにより生産され得る。前記誘導菌又は前記
変異菌としてＳＣ７と記されたものを例示し得る。これ
らの菌株は、スコツトランド、アバーディーンのナショ
ナルコレクションインダストリアル バクテリア（ＮＣ
ＩＢ）に、登録番−号Ｎ ＣＩ Ｂ １１４００及びＮ
ＣＩ Ｂ １１４０１として既に寄託されており、そ
れぞれ工業技術院微生物工業技術研究所（以下微工研と
称する）に微生物受託番号ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、４９８３
及び４９８４として寄託されている。 これらは、以下の諸性質により同定され得る。 （以下余白） Ｒ３９３（ＮＣＩＢ １１４００）
５Ｃ７（ＮＣＩＢ １１４０１）〈寄託受託ＴＩＱＩ’
ＥＩ？Ｎ−ＰＮ０．４９８３） （寄託受託番号
１’ＥＲ）ｌ−ＰＮｏ、 ４９８４ ）コロニー外観
半透明、ｌｆ’Ｊり上がった球 Ｒ３９３と
同じであるもつ、胞子形成能 ３７”Ｃ上ｖｅ（ゆっくり、２−３日）５５℃ 斗ｖｅ ６０℃ ＋ｖｅ ７０℃ −ｖｅ （１印凸苺） 発 醇 ユ」し−旦」シーアドニ
トール ＷＷ ＋＋エスクリン
−−−−−アラビノース −一
一一 ゲキストリン −一一−−デキストＵ−ス
Ａ／Ｇ ＷＷ ＷＷダルジット
−−−− エリスリット −一一一 ガラクトース −−−−−グリセＯ−ル
＋＋ 十−←グリコーゲン
−一一一 イノシトール ｗｗ ｗｗイヌリン
−一一一 ラクトース −−−− レブロース −−ＷＷ マルトース −−−− マンノース ｗｗ ｗｗラフィノー
ス −−−− ラムノース −一一一 サツカロース ＋Ｗ ＋＋ザリヂン
−−−−スターチ
−−−− ソルビトール Ｗ−ＷＷ トレハロース −−ＷＷ キシＯ−ス −−−− マンニトール ＋Ｗ ＋＋ペフトン＋
Ｅ】でのＪ艮 ６０℃で２４時間。最終濃度５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣＮま
で塩化ナトリウムに耐性を有する。 ｍ−−１ カタラーゼ ＋ オキシターゼ ＋ 硝酸塩還元酵素 − 亜硝酸塩還元酵素 − 更に、本発明の菌株は、下記試験に示される、バチルス
ステアロサーモフィラスＮ ＣＩ Ｂ １１２７０（又
は他の好熱性桿菌）の清澄を抑制し得るバクテリオシン
の生産により確認され得る。 約１０乃至２０コ〇ニー／プレートを含有して一晩培養
された希釈プレートを調製する。（ｑられるコロニーを
２時間クロロホルム蒸気に露らして殺菌し、次いでプレ
ートに通気してクロロホルムを除去する。マツトゲロー
ス（ｍａｔ ｏｒｏｗｔｈ）を形成するに充分な濃度の
Ｎ ＣＩ Ｂ １１２７Ｇ懸濁液でこれらを浸潤し、６
０℃で一晩培養する。Ｒ８９３又はＳＣ７の１つの死滅
コロニーは、Ｎ ＣＩ Ｂ １１２７０によって形成さ
れたマット中の非酸１ （、ｎｏ−ｇｒｏｗｔｈ）明瞭
域で囲まれている。この抑制を惹起するバクテリオシン
因子はサーモシンと呼称され、分子壊約１３．０００ダ
ルトンの耐熱性グリコプロティンであることが判明した
。 これらの菌株は、前記サーモシン用コードと考えられ得
る約３ミリオンダルトンの大きさのプラスミツドを含有
している。 Ｇ Ｄ Ｈ生産能を保持する誘導菌および変異株は、環
境圧力調整（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｒｅｓｓ
ｕｒｅ）の如き標準方法によって製造され得るか、又は
、培養中に自然に発生し得る。これらは、プロパン−１
，２−ジオール（Ｇ Ｄ Ｈ用物質であって、耐熱性桿
菌によって通常生産されるグリｔ？［ｌキナーゼ用物質
ではない）とクロラムフェニコールとで培養し、次いで
トリフェニルテトラゾリウムクロライドで染色すること
により同定され得る。 これらの菌株およびその誘導菌株もしくは変異株は、一
般に、グリセロール又はグリセロール類を欠く培地にお
いてさえもＧＤＨ酵素を生産する。 しかし乍ら、最大の生産量を得るためには、培養基は、
通常少なくとも０．０５ｆｆｉ １％以上好ましくは４
．０ｆｆｉ１％以下のグリセロール又はグリセロール類
を含有している。最も好ましくは、培ｉｌｌは０．１乃
至１．Ｏ１１％のグリセロール又はグリセロール類を含
有している。ここにいうグリセロール類とは、多官能Ｃ
３アルコール特に２つの水酸基を含有する多官能Ｃ３ア
ルコールを包含するものであり、例えばグリセリン酸、
１−一又はＤ−グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセ
トン、３−メルカプトプロパン−１，３−ジオール、プ
ロパン−１，３−ジオール又はプロパン−１，２−ジオ
ールを指称する。 いずれの場合に於いても、培養基は、天然物から得られ
た栄養源例えばペプトン、ｔｓ母氷解物。 牛肉エキス、カゼイン氷解物等を含有する複合培地か、
又は無機および簡単な有機の栄養源を含有する一定の塩
培地でよい。 培地は、微生物が生長する温度、典型的には４０〜６５
℃特に５０〜６５℃、及びｐＨ５〜８に調整される。又
、培地は好気性下又は嫌気性下に調整され得るが、しか
し乍ら好気性下に調整されることが好ましい。最適の培
養期間がある（その後生産量は低下する）ように思われ
る。最適の培養期間は、使用される菌株及び培養条件に
依存し、実験によって求められなければならない。しか
し乍ら、１０乃至２０時間の培養期間が適当であること
が判明した。 Ｉｌｌ胞Ｔｉ１ＩＩ晴は、通常の技術例えば音波処理、
小モゲナイゼション又は酵素処理等により行い得る。 その後、通常のＮ素単龍および精製技術が行なわれ、例
えばイオン−交換クロマトグラフィー、リン酸カルシウ
ムでの分別、ＴａＩ！Ｉアンモニウム又は有機溶媒（例
えば１０〜２０ｖ ／ ｖ％濃度のエタノール）を使用
する沈澱、デキストラン。アガロース又はアガロースポ
リアクリルアミド上でのゲル戸過、及び／又はヌクレオ
チド誘導細胞間質又はスルホンｌＩ置換クロロトリアゾ
ニル（“プロジオン″−商標名）染料での親和クロマト
グラフィー（ａｆｆｉｎｉｔＶ ＣｈｒＯＩａｔＯ！１
ｌｒａｐｈＶ）等で行なわれる。 上記した氏り上２ ステアロサーモフィラスの菌株から
生産された耐熱性ＧＤ）−ｊｉｆｆ素は、典型的に、そ
れぞれの分子ｍが約６０，０００の４つの等しい又は同
じようなサブ−ユニットから成り、全分子量が約２４０
，０００±３０，０００ダルトンである構造を有する。 下記分析方法により均質化して試験すると、該酵素は、
３０℃、ｐ）１８．５で、蛋白質１１Ｉ１１当り少なく
とも５単位通常１０〜３０１１１位の比活性度を有して
いる。類似の基質に対して同じような条件上で試験する
と、グリセロール（１００％）に対する活性度（Ｖｍａ
ｘ）は次のとおりである。 ３−メルカプト−プロパン−１，３−ジオール４９％プ
ロパン−１，３−ジオール １６％ プロパン−１，２−ジオール１６５％ 活性は高濃度ＮＨ４イオンにより阻害される。プロテア
ーゼによる破壊を避けるために、酵素を低温（約４℃）
で精製することが好ましい。しかし乍ら、−坦精製した
俵は、酵素を室温で保存することが好ましい。 本発明による酵素製剤は、粗な細胞抽出物又は部分的に
若しくは高度に精製された製剤である。 該製剤は、凍結乾燥物又は他の固形物形態として、又は
分析されるべきグリセロールのレベルに応じて０．１〜
５０単位／ｍｌ含有する水溶液として提供され得る。 Ｉｆｆ’素製剤は、血清および培養基を含む広範囲のサ
ンプル中の、既に存在しているか又はアルカリ加水分解
又は酵＃（例えばリパーゼ）作用によりグリセライドか
ら放出されるグリセロール又はグリセロール類を定量す
るために使用され得る。 更に、本発明の別の観点によれば、サンプル中のグリセ
ロール又はグリセロール類を定量するための方法が提供
される。該方法は、少なくとも７のｐＨ好ましくは８〜
８．８のｐｌ−１の緩衝溶液中で、サンプルをグリセＯ
−ルデヒドＬ１ゲナーゼ酵素製剤及びニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に混合し、約３４０ｎ
ｍの光学密度の増加を測定することから成る。次いで、
光学密度の増加率又は最終光学密度を標準溶液によって
得られたそれらと比較することにより、グリセロールが
埠出される。増加率（ΔＯＤ ）を使用する場合には
、Δ０Ｄ３４ｏの値が０．０６−０．１２／分の範囲に
なるように、サンプルと標準とを希釈することが好まし
い。 分析を下記式に基づいて行なう。 グリセロール十ＮＡＤ旦ＤＨ→ ジヒドロキシアセトン十Ｎ Ａ Ｄ Ｈこの反応に基づ
〈従来の分析に於いては、使用されるｐｔｌ値が高く（
少なくとも９、通常１０〜１１）、ジヒドロキシアセト
ンがエノールニ量体を形成して酵素に関連のないＮＡＤ
の化学的還元を進行させるため、口触反応による不正確
さを伴うという欠点があった。本発明の分析に於いては
、低ＯＨの使用のため口触反応が避けられる。更に、緩
衝系がこの副反応の割合に影響を及ぼすことが知見され
た。この故に、緩衝剤は、アミン特にトリエタノールア
ミン／ＨＣＩＩ衝剤であることが好ましい。勿論、リン
酸塩の如き他の緩衝剤も使用し得る。炭酸塩／重炭酸塩
を使用し得るが、むしろ適当ではない。Ｔ１離のアンモ
ニウムイオンは、上記した阻止効果のため避けるべきで
ある。 このように、本発明の酵素製剤は、試験キットの一部と
して有利に提供され得る。このキットは、乾燥物通常凍
結乾燥粉又は水溶液としてのＮ素を含有し、又、ｐＨ８
〜８．８の緩衝溶液とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）とを含有する。キットは、更に、標準
グリセリン溶液及びグリセリドから遊離グリセリンを放
出するためのアルカリ性ＫｏＨ若しはリパーゼ溶液を任
意に含有する。 酵素が水溶液として存在する場合、その濃度は、キット
の使用目的に応じて０．１〜５０単位／ｍｌの範囲で広
く変更し得、１種以上の酵素溶液が、サンプル中の異な
るグリセロールレベルを網羅、するために、提供され得
る。１ｉａｒ剤は、アミン特にトリエタノールアミン！
１衝剤であることが好ましく、約８．５のＥ）Ｈを有し
ていることが好ましい。 ＮＡＤ溶液は適当な濃度であればよく、典゛型的に１０
■／ｍｌの濃度である。 本発明の種々の観点の典型的具体例を実施例により詳説
する。実施例に於いて使用する培地は次のとおりである
。 バチルス ステアロサーモフィラス（ＢＳ）培地
９／ｆＪトリブチイツクミートダイジエスト（バクト
ドリブトン）２ＯＮ？−母エキス
１０ＦｅＣｊ！３−６Ｈ２
００，０１４ ＭｎｃＮ ２−４１−１．、０
０．０３に２Ｓ０４２．６ ＭｑＳ０４ ・７Ｈ２００，５４ クエン酸
０・６４Ｎａ２ＨＰＯ４−２１−１２０６，
４ 弯１Ｂ−ミｉ塊 呈
！二り下記の点において上記と異なる。 トリプトン ２．０酵母エ
キス ５０に２ＳＯ４６，０ 泡止め剤（ＲＤ泡止め剤）２．５ １ＯＮ−ＮａＯＨｔ’ ｌ）Ｈ７，１＋０．１ ニ、３
１１ＴＳＢＺ五ニ トリプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌ ４２） 、 １７．０
；ソーヤペプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌ４４） 、 ３．
０ ；グリコース。 ２．５； ＮａＣｊ 、 ５．０：
Ｋ ２ トｌＰＯ４、２，５： 及びアガー（Ｏ
ｘｏｉｄ Ｎｏ ： １）、 １５．０を含有する（
９／ｎ）。量的ＤＨは７．３である。 立旦土１１ ＮａＨＰＯ４２１−１２０，３，１２： Ｎ８４
Ｃｊ 。 ５．０４： ＫＣｊ 、 ０．３７： Ｎ ａ２８０４
争１０Ｈ２０゜３．２２：クエン酸−水和物、 ０．
４２ ： ７ ｎ ０ 、０．００２；ＦｅＣＪ１３
中 ６ ト１２ ０．０２７；Ｍ ｎ
Ｃｊｌ ２ ・ ４ Ｎ２ ０゜０．０
１ ； Ｃｕ Ｃｊｌ ２ ・２ Ｎ２０．０．００
０８５；ＣｏＣｆＪ２ ・６Ｈ２０，０，００２４：
１１３８０３ 。 ０．０００３１ ： ＭＱＯ，ｏ、ｏｓ： ｃａｃｏ
３．０．０１及びＮａ２ＭｏＯ４’ ２Ｈ２０，０，０
０２４をＨＣＩＪ中に溶解＜ｇ／ｊ）。最終濃度は培地
１ρ当り０．２９５ｄＲＩＪ度である。ＤＨを７．３に
調整。 使用する基本的菌株は、Ｒ８９３と記される菌株（Ｎ
ＣＩ １３１１４００および寄託受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ
Ｎ Ｏ，４９８３として寄託済み）である。誘導菌株
は次のようにして・得られる。 回転培養器中６０℃、１５０ｒｐｍで一晩培養された、
０．４ｒＪ／ １００ｍのグリセロールを含有するＢＳ
培地中のＲ８９３の２００１ｄ１Ｂどうフラスコ液体培
養から、いくつかのＴＳＢアガーの希釈プレートを調整
した。５０〜１００のコロニーを含む皿の複製プレート
を、ベルベヂンパッド（ｖｅｌｖｅｔｉｎｅ ｐａｄ）
を使用して調整した。次いで、最初のプレートを２時間
クロ
【１ホルム蒸気に露して殺菌した。次いで、これら
を、６０℃で一晩培養すればマットグロースを生起する
に充分な濃度のバチルス カルトリ升カス ３． ｃａ
ｌｄｏｌ ｔｉｃＩＪｓ 懸濁液を含む水分の多いア
ガーで浸潤した。複製プレートもまた６０℃で一晩培養
し、次いで１％（Ｖ／Ｖ）の１．２．−プロパンジオー
ルと １．５％（Ｗ／Ｖ）のクロラムフェニコールの水
溶液とで噴霧した。 次いでプレートを更に１時間６０℃で培養し、ｐＨ７，
５の１Ｍリン酸カリウム緩衝液中１０％トリーフェニル
テトラゾリウムクロライド溶液で噴霧した。 殺菌したプレートと複製プレートとを比較し、阻止の最
大域をもち且つ深いピンク色に着色された単一のコ１コ
ニ−を複製プレートから新しいプレートに移し、次いで
一晩培養した。これらのプレートを一規定生理食塩水中
に懸濁して４％（Ｖ／Ｖ）グリセロール含有の２００ｄ
Ｂ Ｓ培地に接種し、シェーカー上で６０℃１５０ｒ
、 ｐ、 ｍで一晩（１６時間）培養した。細胞を４℃
で２０分間１３，０００ｇの遠心分離で集積し、β−メ
ルカプト−エタノール とを含有するｐＨ７．５の１００ｍＭ）−リスーＨＣＪ
１１００ｒＲ１中に懸濁し、再び２０分間１３，０００
ｇで遠心分離した。同じ緩衝溶液５０ｍを用いて第２回
目の洗滌を行い、前記と同じｐ）−１７．５の１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｊ２０ｄ中に懸濁し、サンプルを水浴中
でできるだけ冷却して１分間の音波処理を２回施した。 各サンプルをＧＤＨ活性および乾燥量４に対してチエツ
クした。最大の活性度と細胞マス（ｃｅｌｌｍａｓ ）
とを示す単離物を保留し、ＳＣ７ （ＮＣ１１３ １
１４０１、寄託受託番号ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．４９８４）
と記した。 ＧＤＨ生産能をもつ変異菌は、通常の環境圧力調整技術
（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｌｌｒＣＳＳｕｒｅ
ｔＱｃｈｎｉＱｕｅ）によって発生し得、１・記したＷ
素を生産することが判明した。 典型的な突然変異実験に於いて、ＳＣ７菌株を成長する
ために使用されるＢＳ培地のサンプルをアミノ酸分析し
た。このことから、菌株は、主として、アミノ酸即ちア
スパラギン酸．グルタミン酸．アラニン、セリーンおよ
びグリシンを同化するものであることが判った。従って
、アスパラギン酸５ｍＭ，グルタミン酸５ｍｊｙｊ，ア
ラニンｓｍＭ，セリーン２ｍＭ，グリシン１ｍＭおよび
ビオチン（Ｕ９／Ｊｌ ）とグリセロール（２９／Ｊ）
とを含有するＣＣＩ培地を調整した。この培地を介する
ＳＣ７のいくつかの連続的移転の後、培地をＴＳＢアガ
ー上に載置すると形態学上の変異菌が発生することが認
められた。単一のコロニーを単離するとＧＤＨを生産す
ることが認められたが、ＢＳ培地での培養における８０
７形態への復帰の割合が高いので、生ｆＪ量を算出する
ことは困難であった。 立」Ｌ１迭 ＧＤＨ活性度に対する分析を次の方法で行なった。本明
細書中の活性度は、この分析によって測定された活性度
である。 基本試ｌｉ： （ｉ） ０．２５Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｊｌ
（ｐＨ ８．５） （ｉｉ） １Ｍグリセロール （ｉｉｉ） １０ａｙ／ａｅＮＡＤ（二＝＋ヂンアミ
ドアデニンジヌクレオチド） ８２０６００μｍ，トリエタノールアミン−ＨＣｊｌ溶
液２００μＪ１．ＮＡＤ溶液２５μｍおよび分析すべき
サンプル５〜２００μｍを、つぼ（ ｃｕｖｅｔｔｃ）
（通路１α）内で混合した。３０’Ｃに予め平行させ
た後、１００μｍのグリセロール溶液を加えて反応を生
起させた。 ＮＡＤの還元を、スペクトル光度計手段で検知し、３４
０ｎｍの溶液の吸収を観察することにより求めた。水又
は試薬ブランクのいずれかを使用した。単位を、Δ０Ｄ
３４゜が０．０６〜１．２７分の範囲になるように希釈
して３０℃で１分間当りに形成されるＮＡＤＨのμｍｏ
ｌで示した。 比較のため、トリエタノールアミン、リン酸塩及び炭酸
塩／重炭酸塩から成るｐＨ８、８，５。 ９及び９．５の緩衝溶液中５０μｇのサンプル（約０．
５Ｕ／ｌｄ）および酵素を含まない（ブランクを決定す
るため）５０μｍの０．５Ｍジヒドロキシアセトンを使
用してこの方法を繰り返した。結果（ΔＯＤ ）を
第１表に示す。 第１表 ｐＨ８ｐＨ８，５吐（９ＤＨ９，５ この第１表から、゛ブランク″は低ｐＨ及びトリエタノ
ールアミン緩衝溶液中で非常に減じられていることが判
る。サンプル反応は低ｐＨで減じているが、ｐ１４８で
も充分である。 友１亘ユ ４００ｍのフラスコ中で４９ ／Ｊのグリセロースを含
有するＢＳ培地（上記で定義した） １００＃ｌｉ２
中で、Ｂ、ステアロサーモフィラスＲ８９３を６０℃で
１２〜１６時間２００ｒｐｍで浸とうしながら生長させ
た。 得られたｉｍ物質を集積し、ＧＤＨ活性の分析を行った
。酵素の収率は８単位／ｇ乾燥細胞であり、０．０３単
位／１１Ｅ１！培地であることが判明した。 友旌亘ユ グリセロールを含有させずに、実施例１と同様に行うと
、酵素の生産量は２単位／ｇ乾燥細胞（ｏ、ｏｉ単位／
Ｉｄ培地）であった。 Ｘｌ」し口り史Ａ Ｂ、ステアロサーモフィラスＳＣ７菌株を用いて実施例
１及び２を繰り返した。生産量はそれぞれ０．１４単位
／ＩＩＩｅ培地及ヒｏ、ｏ３単位／＃Ｉｉ！培地ｒ ア
クた。 塞」１１互 Ｂ、ステアロサーモフィラスＳＣ７の１１の種培地を、
４ｇ／ｆＪのグリセロールを含有する撹拌ＢＳｔ８養地
中で６０℃で調整した。これを同様の２０１種培地の種
づけのために使用した。 グリセロールを含有しない４００ｊの変性ＢＳ培地が６
０℃で入っている４００４１培地容器を、前記２０１種
培地で種づけをした。培地が光学密度０．８を有するま
で、６０℃、１．０±０．２の調整ｐＨ，１分に３００
ｆＪの空気の通気、及び２５０ｒｐｍの撹拌下で微生物
の生長を続けた。 ５００ｇ／ρの水溶性グリセロール２０．１１を１時間
あたり１．５〜１．６ ｊＩの比率で６００ｎｍの光学
密度が１．３〜１．４に達するまで加えた。総培養時間
が１９時間に達した後、培地を室温まで冷却し、細胞を
デ・ラバル遠心分離機（ＤｅＬａｖａｌｃｅｎｔｒｉｆ
ｕｏｅ）で採取した。細胞をリン酸塩緩衝液（ＫＨ２Ｐ
０４ ５３４ ｇ ／ Ｎ ａ２ Ｈ
Ｐ ０４ ７６１９ ｔｒ２００ｐに調合する
）で洗滌する。８．０単位／３湿潤細胞（３５℃１位／
ｇ乾燥細胞）の比活性示す細胞の総最終生産呈は湿った
状態で約１６Ｋｇ（乾燥状態で４Ｋｇ）であり、４００
ｊ培地あたり１２８，０００単位の総収黴であった。 １１璽ヱ（精製） Ｂ、ステアロサーモフィラスＲ８９３の湿潤細胞ベース
ト４０ｇを４０ｍ Ｍリン酸カリウム（ＫＰ）。 （ｐｌ−１６，８） １５０ｄで懸濁する。２０にサ
イクル７秒で５×１分間の超音波処理により細胞を破砕
する。３０，０００ｇで２０分間遠心分離して細胞破砕
物を除去する。４０ｍ Ｍ Ｋ Ｐ （１）Ｈ６，８）
で新たにプレー平衡させたＤＥＡＥ−セルローズ（ＤＥ
５２：ワットマン バイオケミカルズ社製）で細胞抽出
物をクロマトグラフにかけた。細胞抽出物を１時間に６
０ｍの割合で１１０ｄのカラム（１４Ｘ３．２ ａＲ）
に導入し、酵素を直線状に変わる４０から４００ｍ Ｍ
Ｋ Ｐ（１）Ｈ６，８）のリン酸塩濃度勾配で、１時
間に２５ａｅの割合で総ｆｆｉ ８００ｍを使用して溶
離する。グリセロール デヒドロゲナーゼは１５０から
２５０ｍ Ｍリン酸塩の濃度の間に溶離される。活性分
画を集め、１０ｍ Ｍ Ｋ Ｐ （ＤＩ−１６，８）で
透析する。さらに活性力を５０威（６ｘ ３２ｃｒＲ）
のトリアジン染料−アガローゼカラム（例えば、英国特
許出願番号３５０５／ ７Ｂに記載）に１時間１００ｍ
の割合で導入する。前記カラムは、セファローズ４Ｂ（
商標名）に１．０〜２．Ｏｑｄｙｅ／ｊセファローゼの
割合で結合したプロジオン（商標名）レッドＩ−ＩＥ
−３Ｂ又はプロジオンレッド ＨＥ−７Ｂ （プロジオ
ンレッド誘導体、カラーインデックスＮ ｏ、 ０１１
８１５９）から構成されている（英国特許出願番号第３
５０５／７８参照）。カラムを１０ｍＭ ＫＰ（ｐＨ
６，８）２００＋＋ｅｔ’洗１１ｔ６゜酵素を １．ｏ
ｍＭ ＫＰ（ｐＨ６，８）中ＩＭ ＫＣＪ） １
００ｍで溶離する。 或いは又、グリセロール デヒドロゲナーゼを、それぞ
れｐＨ６，８又は７．５テ１０ｍＭ ＫＰのイオン強
度でプロジオン グリーンＨＥ−４ＢＤ／セファ【］−
ゼ４Ｂ又はプロジオン レッドＨＥ−３Ｂ／セファＯ−
ゼ４Ｂに吸収させ得る。緩［ｉＷ？液でカラムを洗滌後
、酵素を、４ｍ１ｖｊのＮＡＩ）を含有する１０ｍＭ
ＫＰ ｐＨ６，８又は７．５でそれぞれｗｊＷＩシ得
、活性酵素を集め、限外ろ過Ｉｌ！ （アミコンフラツ
トベット Ｐ Ｍ １Ｇ＞で５１ｄのｍまで濃縮する。 次に濃縮された酵素をゲルろ過するために交差結合アガ
Ｏ−ゼーポリアクリルアミド共重合体（スウェーデン国
、ＬＫＢ社製：ウルトロゲルＡｃＡ３４）の５００ｄカ
ラム（１００Ｘ ２．５ＣｒＲ）へ１時１ｍ ９ｍの割
合で導入・する。５０ｍＭ Ｋ Ｐ （ｐ）１６．８
）を展開溶媒とし、分子量２４０． Ｇｏｏ±３０，０
００のグリセロールデヒドロゲナーゼを採取する。プー
ルした活性分画をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけると５８． Ｇｏｏ±ｓ、ｏｏｏにギ一たん白
質帯が出現する。最終精製酵素は５〜１０単位／＋９の
比活性を有している。顕著な各１製段階での比活性を表
２に示す。 第２表 ロ 比活性（単位／ｌ１１９） 細胞抽出物 ９４
０．０３ＤＥ５２プール ７３
０．２３プロジオン−セファローゼプール ６
５ ２．１ＡＣΔ具プール
５５ ７．８丈】１１Ｌ ＳＣ７菌株（実施例５）の細胞ペーストを使用して実施
例６と同様におこなう。各段階の比活性を表３に示す。 衷ＪＵ１旦 酵素はＤＥＡＥセルロースの古いサンプルやＥＤＡＥデ
キストランゲル（セファデックス−商標名）とは結合せ
ず、新しい懸濁ＤＥＡＥセルロースと結合することが知
見された。ここでは、ＤＥＡＥ−セルロースを使用しな
いこと以外は実施例７と同様に行なう。ｐＨ７，５の３
０ｍＭ ＫＰで細胞抽出物を希釈し、次に３０ｍＭ
ＫＰ、 Ｉ）ｌ−１７，５でプレー平衡させたＤＥ
ＡＥ−デキストランゲル（ｔ？ファデックスＡ−５０−
ファルマシア）の１１０ｄカラムへ１分に６０ｍの割合
で通す。 カラムを通過した活性酵素溶液を次に実施例６と同様に
トリアジン−７ガロースカラムへ導入する。各段階の比
活性を表３に示す。 第３表 実施例７ 実施例８ 単位 ＳＯ活性 単位 ｓｐ話性 （単位／ＩＩｔｇ） （単位／■）
を、６０℃で一晩培養すればマットグロースを生起する
に充分な濃度のバチルス カルトリ升カス ３． ｃａ
ｌｄｏｌ ｔｉｃＩＪｓ 懸濁液を含む水分の多いア
ガーで浸潤した。複製プレートもまた６０℃で一晩培養
し、次いで１％（Ｖ／Ｖ）の１．２．−プロパンジオー
ルと １．５％（Ｗ／Ｖ）のクロラムフェニコールの水
溶液とで噴霧した。 次いでプレートを更に１時間６０℃で培養し、ｐＨ７，
５の１Ｍリン酸カリウム緩衝液中１０％トリーフェニル
テトラゾリウムクロライド溶液で噴霧した。 殺菌したプレートと複製プレートとを比較し、阻止の最
大域をもち且つ深いピンク色に着色された単一のコ１コ
ニ−を複製プレートから新しいプレートに移し、次いで
一晩培養した。これらのプレートを一規定生理食塩水中
に懸濁して４％（Ｖ／Ｖ）グリセロール含有の２００ｄ
Ｂ Ｓ培地に接種し、シェーカー上で６０℃１５０ｒ
、 ｐ、 ｍで一晩（１６時間）培養した。細胞を４℃
で２０分間１３，０００ｇの遠心分離で集積し、β−メ
ルカプト−エタノール とを含有するｐＨ７．５の１００ｍＭ）−リスーＨＣＪ
１１００ｒＲ１中に懸濁し、再び２０分間１３，０００
ｇで遠心分離した。同じ緩衝溶液５０ｍを用いて第２回
目の洗滌を行い、前記と同じｐ）−１７．５の１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｊ２０ｄ中に懸濁し、サンプルを水浴中
でできるだけ冷却して１分間の音波処理を２回施した。 各サンプルをＧＤＨ活性および乾燥量４に対してチエツ
クした。最大の活性度と細胞マス（ｃｅｌｌｍａｓ ）
とを示す単離物を保留し、ＳＣ７ （ＮＣ１１３ １
１４０１、寄託受託番号ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．４９８４）
と記した。 ＧＤＨ生産能をもつ変異菌は、通常の環境圧力調整技術
（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｌｌｒＣＳＳｕｒｅ
ｔＱｃｈｎｉＱｕｅ）によって発生し得、１・記したＷ
素を生産することが判明した。 典型的な突然変異実験に於いて、ＳＣ７菌株を成長する
ために使用されるＢＳ培地のサンプルをアミノ酸分析し
た。このことから、菌株は、主として、アミノ酸即ちア
スパラギン酸．グルタミン酸．アラニン、セリーンおよ
びグリシンを同化するものであることが判った。従って
、アスパラギン酸５ｍＭ，グルタミン酸５ｍｊｙｊ，ア
ラニンｓｍＭ，セリーン２ｍＭ，グリシン１ｍＭおよび
ビオチン（Ｕ９／Ｊｌ ）とグリセロール（２９／Ｊ）
とを含有するＣＣＩ培地を調整した。この培地を介する
ＳＣ７のいくつかの連続的移転の後、培地をＴＳＢアガ
ー上に載置すると形態学上の変異菌が発生することが認
められた。単一のコロニーを単離するとＧＤＨを生産す
ることが認められたが、ＢＳ培地での培養における８０
７形態への復帰の割合が高いので、生ｆＪ量を算出する
ことは困難であった。 立」Ｌ１迭 ＧＤＨ活性度に対する分析を次の方法で行なった。本明
細書中の活性度は、この分析によって測定された活性度
である。 基本試ｌｉ： （ｉ） ０．２５Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｊｌ
（ｐＨ ８．５） （ｉｉ） １Ｍグリセロール （ｉｉｉ） １０ａｙ／ａｅＮＡＤ（二＝＋ヂンアミ
ドアデニンジヌクレオチド） ８２０６００μｍ，トリエタノールアミン−ＨＣｊｌ溶
液２００μＪ１．ＮＡＤ溶液２５μｍおよび分析すべき
サンプル５〜２００μｍを、つぼ（ ｃｕｖｅｔｔｃ）
（通路１α）内で混合した。３０’Ｃに予め平行させ
た後、１００μｍのグリセロール溶液を加えて反応を生
起させた。 ＮＡＤの還元を、スペクトル光度計手段で検知し、３４
０ｎｍの溶液の吸収を観察することにより求めた。水又
は試薬ブランクのいずれかを使用した。単位を、Δ０Ｄ
３４゜が０．０６〜１．２７分の範囲になるように希釈
して３０℃で１分間当りに形成されるＮＡＤＨのμｍｏ
ｌで示した。 比較のため、トリエタノールアミン、リン酸塩及び炭酸
塩／重炭酸塩から成るｐＨ８、８，５。 ９及び９．５の緩衝溶液中５０μｇのサンプル（約０．
５Ｕ／ｌｄ）および酵素を含まない（ブランクを決定す
るため）５０μｍの０．５Ｍジヒドロキシアセトンを使
用してこの方法を繰り返した。結果（ΔＯＤ ）を
第１表に示す。 第１表 ｐＨ８ｐＨ８，５吐（９ＤＨ９，５ この第１表から、゛ブランク″は低ｐＨ及びトリエタノ
ールアミン緩衝溶液中で非常に減じられていることが判
る。サンプル反応は低ｐＨで減じているが、ｐ１４８で
も充分である。 友１亘ユ ４００ｍのフラスコ中で４９ ／Ｊのグリセロースを含
有するＢＳ培地（上記で定義した） １００＃ｌｉ２
中で、Ｂ、ステアロサーモフィラスＲ８９３を６０℃で
１２〜１６時間２００ｒｐｍで浸とうしながら生長させ
た。 得られたｉｍ物質を集積し、ＧＤＨ活性の分析を行った
。酵素の収率は８単位／ｇ乾燥細胞であり、０．０３単
位／１１Ｅ１！培地であることが判明した。 友旌亘ユ グリセロールを含有させずに、実施例１と同様に行うと
、酵素の生産量は２単位／ｇ乾燥細胞（ｏ、ｏｉ単位／
Ｉｄ培地）であった。 Ｘｌ」し口り史Ａ Ｂ、ステアロサーモフィラスＳＣ７菌株を用いて実施例
１及び２を繰り返した。生産量はそれぞれ０．１４単位
／ＩＩＩｅ培地及ヒｏ、ｏ３単位／＃Ｉｉ！培地ｒ ア
クた。 塞」１１互 Ｂ、ステアロサーモフィラスＳＣ７の１１の種培地を、
４ｇ／ｆＪのグリセロールを含有する撹拌ＢＳｔ８養地
中で６０℃で調整した。これを同様の２０１種培地の種
づけのために使用した。 グリセロールを含有しない４００ｊの変性ＢＳ培地が６
０℃で入っている４００４１培地容器を、前記２０１種
培地で種づけをした。培地が光学密度０．８を有するま
で、６０℃、１．０±０．２の調整ｐＨ，１分に３００
ｆＪの空気の通気、及び２５０ｒｐｍの撹拌下で微生物
の生長を続けた。 ５００ｇ／ρの水溶性グリセロール２０．１１を１時間
あたり１．５〜１．６ ｊＩの比率で６００ｎｍの光学
密度が１．３〜１．４に達するまで加えた。総培養時間
が１９時間に達した後、培地を室温まで冷却し、細胞を
デ・ラバル遠心分離機（ＤｅＬａｖａｌｃｅｎｔｒｉｆ
ｕｏｅ）で採取した。細胞をリン酸塩緩衝液（ＫＨ２Ｐ
０４ ５３４ ｇ ／ Ｎ ａ２ Ｈ
Ｐ ０４ ７６１９ ｔｒ２００ｐに調合する
）で洗滌する。８．０単位／３湿潤細胞（３５℃１位／
ｇ乾燥細胞）の比活性示す細胞の総最終生産呈は湿った
状態で約１６Ｋｇ（乾燥状態で４Ｋｇ）であり、４００
ｊ培地あたり１２８，０００単位の総収黴であった。 １１璽ヱ（精製） Ｂ、ステアロサーモフィラスＲ８９３の湿潤細胞ベース
ト４０ｇを４０ｍ Ｍリン酸カリウム（ＫＰ）。 （ｐｌ−１６，８） １５０ｄで懸濁する。２０にサ
イクル７秒で５×１分間の超音波処理により細胞を破砕
する。３０，０００ｇで２０分間遠心分離して細胞破砕
物を除去する。４０ｍ Ｍ Ｋ Ｐ （１）Ｈ６，８）
で新たにプレー平衡させたＤＥＡＥ−セルローズ（ＤＥ
５２：ワットマン バイオケミカルズ社製）で細胞抽出
物をクロマトグラフにかけた。細胞抽出物を１時間に６
０ｍの割合で１１０ｄのカラム（１４Ｘ３．２ ａＲ）
に導入し、酵素を直線状に変わる４０から４００ｍ Ｍ
Ｋ Ｐ（１）Ｈ６，８）のリン酸塩濃度勾配で、１時
間に２５ａｅの割合で総ｆｆｉ ８００ｍを使用して溶
離する。グリセロール デヒドロゲナーゼは１５０から
２５０ｍ Ｍリン酸塩の濃度の間に溶離される。活性分
画を集め、１０ｍ Ｍ Ｋ Ｐ （ＤＩ−１６，８）で
透析する。さらに活性力を５０威（６ｘ ３２ｃｒＲ）
のトリアジン染料−アガローゼカラム（例えば、英国特
許出願番号３５０５／ ７Ｂに記載）に１時間１００ｍ
の割合で導入する。前記カラムは、セファローズ４Ｂ（
商標名）に１．０〜２．Ｏｑｄｙｅ／ｊセファローゼの
割合で結合したプロジオン（商標名）レッドＩ−ＩＥ
−３Ｂ又はプロジオンレッド ＨＥ−７Ｂ （プロジオ
ンレッド誘導体、カラーインデックスＮ ｏ、 ０１１
８１５９）から構成されている（英国特許出願番号第３
５０５／７８参照）。カラムを１０ｍＭ ＫＰ（ｐＨ
６，８）２００＋＋ｅｔ’洗１１ｔ６゜酵素を １．ｏ
ｍＭ ＫＰ（ｐＨ６，８）中ＩＭ ＫＣＪ） １
００ｍで溶離する。 或いは又、グリセロール デヒドロゲナーゼを、それぞ
れｐＨ６，８又は７．５テ１０ｍＭ ＫＰのイオン強
度でプロジオン グリーンＨＥ−４ＢＤ／セファ【］−
ゼ４Ｂ又はプロジオン レッドＨＥ−３Ｂ／セファＯ−
ゼ４Ｂに吸収させ得る。緩［ｉＷ？液でカラムを洗滌後
、酵素を、４ｍ１ｖｊのＮＡＩ）を含有する１０ｍＭ
ＫＰ ｐＨ６，８又は７．５でそれぞれｗｊＷＩシ得
、活性酵素を集め、限外ろ過Ｉｌ！ （アミコンフラツ
トベット Ｐ Ｍ １Ｇ＞で５１ｄのｍまで濃縮する。 次に濃縮された酵素をゲルろ過するために交差結合アガ
Ｏ−ゼーポリアクリルアミド共重合体（スウェーデン国
、ＬＫＢ社製：ウルトロゲルＡｃＡ３４）の５００ｄカ
ラム（１００Ｘ ２．５ＣｒＲ）へ１時１ｍ ９ｍの割
合で導入・する。５０ｍＭ Ｋ Ｐ （ｐ）１６．８
）を展開溶媒とし、分子量２４０． Ｇｏｏ±３０，０
００のグリセロールデヒドロゲナーゼを採取する。プー
ルした活性分画をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけると５８． Ｇｏｏ±ｓ、ｏｏｏにギ一たん白
質帯が出現する。最終精製酵素は５〜１０単位／＋９の
比活性を有している。顕著な各１製段階での比活性を表
２に示す。 第２表 ロ 比活性（単位／ｌ１１９） 細胞抽出物 ９４
０．０３ＤＥ５２プール ７３
０．２３プロジオン−セファローゼプール ６
５ ２．１ＡＣΔ具プール
５５ ７．８丈】１１Ｌ ＳＣ７菌株（実施例５）の細胞ペーストを使用して実施
例６と同様におこなう。各段階の比活性を表３に示す。 衷ＪＵ１旦 酵素はＤＥＡＥセルロースの古いサンプルやＥＤＡＥデ
キストランゲル（セファデックス−商標名）とは結合せ
ず、新しい懸濁ＤＥＡＥセルロースと結合することが知
見された。ここでは、ＤＥＡＥ−セルロースを使用しな
いこと以外は実施例７と同様に行なう。ｐＨ７，５の３
０ｍＭ ＫＰで細胞抽出物を希釈し、次に３０ｍＭ
ＫＰ、 Ｉ）ｌ−１７，５でプレー平衡させたＤＥ
ＡＥ−デキストランゲル（ｔ？ファデックスＡ−５０−
ファルマシア）の１１０ｄカラムへ１分に６０ｍの割合
で通す。 カラムを通過した活性酵素溶液を次に実施例６と同様に
トリアジン−７ガロースカラムへ導入する。各段階の比
活性を表３に示す。 第３表 実施例７ 実施例８ 単位 ＳＯ活性 単位 ｓｐ話性 （単位／ＩＩｔｇ） （単位／■）
Claims (8)
- （１）サンプルとグリセロールデヒドロゲナーゼ酵素製
剤とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとを緩衝溶
液中で混合することによりサンプル中のグリセロール又
はグリセロール類似体を定量する方法に於いて、５０ｍ
Ｍのリン酸カリウムと１０ｍＭのβ−メルカプトエタノ
ールと０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオラ
イドとからなるｐＨ６．８の緩衝溶液中３ｍｇ／ｍｌの
溶液として２０℃で貯蔵した場合に該グリセロールデヒ
ドロゲナーゼ酵素製剤が４日間以上の活性半減期を有し
、かつ、前記緩衝溶液のｐＨが７〜８．８であることを
特徴とする前記定量方法。 - （２）前記緩衝溶液のｐＨが８〜８．８であることを特
徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （３）前記緩衝溶液がトリエタノールアミン／塩酸緩衝
溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 - （４）前記グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素製剤が、
３０℃で蛋白質１ｍｇ当り少なくとも５単位の比活性度
を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - （５）前記グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素製剤の酵
素活性量が０．１乃至５０単位／ｍｌであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （６）前記グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素がバチル
スステアロサーモフィラスＮＣＩＢ１１４００、ＮＣＩ
Ｂ１１４０１又はそれらのグリセロールデヒドロゲナー
ゼ生産誘導菌株若しくは変異菌株から得られることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （７）前記グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素製剤が、
使用前に凍結乾燥物又はその他の固体形態で保存される
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の方法
。 - （８）前記酵素製剤がキットの一部であることを特徴と
する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
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1988
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7651837B2 (en) | 2001-05-31 | 2010-01-26 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Method for detecting and identifying microorganism causative of infection |
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| IL57369A (en) | 1982-09-30 |
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| JPH0117674B2 (ja) | 1989-03-31 |
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| DE2920764C2 (ja) | 1988-02-04 |
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