JPH0117679B2

JPH0117679B2 -

Info

Publication number: JPH0117679B2
Application number: JP4509978A
Authority: JP
Inventors: Yukio Imada; Katsuhiko Takahashi
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1978-04-17
Filing date: 1978-04-17
Publication date: 1989-03-31
Also published as: JPS5510A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はアンドロスト−４−エン−３，17−ジ
オン（以下「4AD」と略記する）の製造方法に
関するものである。詳しくは、突然変異株の微生
物による4ADの製造方法に関するものである。

ミコバクテリウム（Mycobacterium）（以下
「M.」と略記する）属に属する微生物を用いてス
テロール類より4ADを製造する方法は既に知ら
れている。その１つの方法は、キレート剤または
ニツケル、コバルトなどの阻害剤を用いる方法
で、例えば特公昭42−10862号公報、同46−17951
号公報、特開昭52−145593号公報、特公昭50−
11998号公報などに記載されている。また、もう
１つの方法は突然変異株を用いる方法で、米国特
許第3684657号および同3759791号各明細書ならび
に特開昭52−105289号公報などに記載されてい
る。

本発明者等は、アンドロスタン系化合物を多量
蓄積する新規な製造方法を開発すべく鋭意研究を
進めた結果、M.属に属する微生物で、既知の方
法の微生物とは異なる種の突然変異株を用いれば
ステロール類より4ADを含むアンドロスタン系
化合物の蓄積することを見出し、既に特願昭52−
124188号として出願した。

しかしながら、その出願に例示された二菌株は
ステロール類からアンドロスタ−１，４−ジエン
−３，17−ジオン（以下「ADD」と略記する）
を主生産物として得るには好適であつたが、アン
ドロスタン系化合物のなかで多くの男性ホルモ
ン、蛋白同化ホルモンや降圧利尿剤スピロノラク
トンの製造のためにより好適な4ADを選択的に
製造するという目的には不十分なものであつた。

今般、本発明者等は4ADを選択的に生成する
突然変異株の分離に怒力し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨はステロール類を基質
にして、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
（parafortuitum complex）に属する突然変異株
でアンドロスト−４−エン−３，17−ジオンの
１，２位脱水素酵素、９位水酸化酵素及び17位還
元酵素からなる群から選ばれる、アンドロスト−
４−エン−３，17−ジオンの分解酵素が低活性化
又は欠失している微生物を培養することを特徴と
する4ADの製造方法に存する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明方法で使用される微生物は、M.パラフ
オーツイタムコンプレツクスに属する突然変異株
である。

従来知られているM.パラフオーツイタムコン
プレツクスに属する所謂タイプカルチヤーの微生
物（以下「野生株」という）は、アンドロスタン
系化合物の分解酵素を有していて、キレート剤ま
たはニツケル、コバルトなどの阻害剤の存在下な
どの特殊な条件下ではステロール類よりADD、
さらに微量ながら4ADおよび17β−ヒドロキシア
ンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン（＝１−
デヒドロテストステロン）（以下「DHT」と略記
する）などのアンドロスタン系化合物を生成す
る。

しかしながら、阻害剤なしの通常の培養下で
4AD等アンドロスタン系化合物の生成がみられ
るという文献は未だ見あたらない。

これに対し、本発明方法で使用する突然変異株
は、キレート剤またはニツケル、コバルトなどの
阻害剤が存在しない通常の培養条件下においてス
テロール類より4ADを多量に生成する点で明白
に野生株と区別される。

また、特願昭52−124188号に記載されている
M.パラフオーツイタムコンプレツクスMCI−
0801号菌及び同MCI−0802号菌とは、同一培養
条件下でADDに比較して4ADを多量に生産する
点で明白に区別される。

本発明方法で使用する突然変異株は、突然変異
処理後4ADを唯一の炭素源とする寒天培地に於
い生育の遅い又は全く生育しない菌株を分離する
事により得られる。従つて、本発明で用いられる
M.パラフオーツイタムコンプレツクスの突然変
異株は、4ADを唯一の炭素源とする培地におい
て親株に比しはるかに生育が遅れる。例えば、
4ADを唯一炭素源とする培地にて親株と突然変
異株を同時に同一菌量で培養開始した場合、突然
変異株の菌数は親株が指数（対数）増殖期に入つ
ている時に通常親株の菌数の半分以下である。

このような菌株が4ADを蓄積する原因として
は、主に、親株に比し4AD酸化・還元酵素が欠損ない
し減少した為、4ADで代謝が中断して4ADを
蓄積する。

即ち、もともと低い活性の酵素はそのままで
あつたとしても、強い活性を発現する4AD酸
化・還元酵素が残存していない為、ステロール
類の分解が4ADで停止し4ADを蓄積する。

欠損ないし減少される酵素としては、親株に
存在する4ADの１，２位脱水素酵素（4AD→
ADD）、9α位水酸化酵素（4AD→9α−OH−
4AD）〔9α−OH−4ADとは、9α−ヒドロキシ
アンドロスト−４−エン−３，17−ジオンを表
わす〕、17位還元酵素（4AD→テストステロ
ン）があげられる。

親株に比し4AD酸化・還元酵素の量は変ら
なくても酵素の発現が抑制された為、反応平衡
が4AD側に傾いた為4ADを蓄積する。

ステロール類の分解経路を構成する或る段階
の酵素反応が抑制された為、ステロール類の分
解経路が4AD経由側に変化し、4ADの分解が
速になつて4ADを蓄積する。

などが考えられる。

このような突然変異株としては、例えばM.パ
ラフオーツイタムコンプレツクスMCI−0807号
菌を挙げることができる。この菌株は、M.パラ
フオーツイタムコンプレツクスATCC25790号菌
〔＝M.ネオオーラム（neoaurum）ATCC25790号
菌〕を親株とし、紫外光による処理あるいはＮ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
による処理を繰り返して得られた。

本菌株は、微生物工業技術研究所に次の番号で
寄託されている。

微生物 M.パラフオーツイタムコンプレツクスMCI−
0807号菌微工研菌寄第4476号本菌の親株について詳述すると、親株
ATCC25790号菌は、M.に関する専門家達13名が
集つた抗酸菌分類国際研究斑（International
Working Group on Mycobacterial
Taxonomy）の共同研究の結論として、M.パラ
フオーツイタムコンプレツクスに属するとされて
いる。〔斉藤肇、束村道雄らインターナシヨナル
ジヤーナルオブシステマテイツクバクテレオロジ
ー（Int.J.Syst.Bacteriol.）27巻、75〜85頁
（1977年、アメリカ）参照〕この菌株ATCC25790号菌は、初め束村＃309号
菌とし、束村＃358号菌（ATCC23366号菌）を基
準菌株として設けた新種M.オーラム（aurum）
束村に含められていた。〔束村道雄、医学と生物
学、72巻、270〜273頁、1966年〕その後、束村氏
は束村＃3503号菌（ATCC25795号菌）を基準菌
株とし、M.オーラムの別種としてM.ネオオーラ
ム（neoaurum）束村を創設したが、
ATCC25790号菌はM.オーラムに属するとされて
いた。〔束村道雄、医学と生物学、85巻、229〜
233頁、1972年〕しかし、最近の斉藤、束村らの文献（前出）に
よれば、ATCC25790号菌は、M.オーラムではな
くM.ネオオーラムの一員であるとされている。
〔斉藤、束村ら、前出文献77頁図１参照〕さらに、
同じ文献の中で、M.属の分類に関してM.パラフ
オーツイタム束村、M.オーラム束村、M.ネオオ
ーラム束村、M.デイエルンホフエリーベニツク
アンドユーハツ）（diernhoferi Bo″micke＆
Juhasz）および“カナザワストレインズ”
（“Kanazawa strains”）は相互に極めて近縁関
係にあり、現段階では区別できないとして、この
５種は分散しておかずにM.パラフオーツイタム
コンプレツクスとして一括して取り扱うよう結論
づけられている。

束村らも別な文献でほぼ同様な結論に達し、
M.オーラムおよびM.ネオオーラムはM.パラフオ
ーツイタムコンプレツクスの一員としてか、また
はM.パラフオーツイタムの亜種とするとしてい
る。〔ジヤーナルオブジエネラルマイクロバイオ
ロジー（Journal of General Microbiology）98
巻511〜517頁、（1977年、イギリス）参照〕 M.パラフオーツイタムコンプレツクスの一般
的性質および近縁同類との比較は斉藤肇（結核、
50巻、402頁、1975年）斉藤ら（前出、75巻、80
〜81頁、1977年）および束村ら（前出、515頁、
1977年）を参照されたい。

以上の如く親株ATCC25790号菌〔ツカムラ
（Tsukamura）＃309〕の分類学的位置は、この
方面の最高権威者の結論に従い、M.パラフオー
ツイタムコンプレツクスに属するものとするのが
妥当である。

M.パラフオーツイタムコンプレツクスはグラ
ム陽性、抗酸性、非運動性、非胞子形成の桿菌で
あり、迅速発育性、暗発色性抗酸菌（rapid
growing scotochromogenic mycobacteria）あ
るいはルニヨン（Runyon）の群抗酸菌に属す
る。

一方この親株ATCC25790号菌より分離した突
然変異株MCI−0807号菌は親株に比し、前者が
寒天培地上で粗面の（rough）集落を、後者が平
滑な（smooth）集落を形成する点以外に菌学的
な相違はなかつたし、さらに親株が既述の如く
M.パラフオーツイタムコンプレツクスに属する
ので突然変異株MCI−0807号菌はM.パラフオー
ツイタムコンプレツクスに属する。

故に当然の事ながら、この突然変異株は、米国
特許第3759791号明細書に4AD生産突然変異株と
して開示されたM.スピーシーズ（SP.）NRRL
Ｂ−3805号菌〔本菌株は特開昭52−105289号公報
にてM.バツカエ（vaccae）と同定されている〕
と異なる新規な菌であり、また特開昭52−105289
号公報に記載された、ADDおよび4AD生産突然
変異株NRRL Ｂ−8153号菌および同Ｂ−8154号
菌が属するM.フオーツイタム（fortuitum）およ
びM.フレイ（phlei）とも明らかに異なる。

これらの分類群の比較については、バーギーの
便覧第８版（“Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology ed.8”、695〜696
頁、ウイリアム＆ウイルキンスカンパニー
（Williams＆Wilkins Co.）、1974年、アメリカ）、
斉藤輩（前出、402頁、1975年）、斉藤ら（前出、
80〜81頁、1977年）および束村ら（前出、515頁、
1977年）の文献を参照されたい。

なお、MCI−0807号菌はNRRL Ｂ−3805号菌
と分類学的性質の他、ADD、4AD、9α−OH−
4ADの分解能力が異なり、前者がこれらを唯一
の炭素源としてわずかながら生育するのに、後者
は生育しないという相違点がある。

このように突然変異株MCI−0807号菌はM.パ
ラフオーツイタムコンプレツクスに属するものと
考えられるし、且つ、既知の4AD生産突然変異
株とは分類学上別のものであることが明白であ
る。

なお本菌は前述の如く、4ADを唯一の炭素源
としてわずかながら生育するし、ADDを基質に
して4ADを、また4ADを基質にしてADDをわず
かに生成するところをみると4AD←→ADD間の酵
素系は完全には不活性化されていないものと思わ
れる。

本発明で基質として用いられるステロール類と
は、各種ステロール、そのＣ−３エステル、エー
テル誘導体またはそれらの酸化中間体を総合して
ステロール類と称す。各種ステロールとは、ペル
ヒドロシクロペンタノフエナントレン核のＣ−３
にヒドロキシル基を、通常Ｃ−５に二重結合を、
Ｃ−17に炭素数８ないし10個の鎖式の側鎖を有
し、場合によつてはＣ−７、Ｃ−８(10)、Ｃ−９(11)
等に二重結合を有してもよい。

このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロールおよびβ−シト
ステロールである。

また各種ステロールの3β水酸基と硫酸等の無
機酸または脂肪酸等の有機酸とのＣ−３エステル
誘導体も本発明方法の原料として使用される。

このようなＣ−３エステル誘導体としては、コ
レステリルオレエート、コレステリルパルミテー
ト、コレステリルサルフエート等が挙げられる。
さらに、たとえば各種ステロールの3β水酸基に
アルキレンオキシドを付加させる方法等により得
られるＣ−３エーテル誘導体も本発明方法の原料
として使用される。

このようなＣ−３エーテル誘導体としては、ポ
リオキシエチレンコレステリルエーテル等が挙げ
られる。

上記した各種ステロールのＣ−３エステル誘導
体を含有する羊毛脂（ウールワツクス）、ラノリ
ン、およびラノリンの加水分解で得られるコレス
テロールを含有するウールアルコールおよびウー
ルアルコールにエチレンオキシドを反応させて得
られる、Ｃ−３エーテル誘導体であるポリオキシ
エチレンラノリンアルコールエーテルも本発明方
法の原料として使用されることはいうまでもな
い。

魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油さら
に植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール油
などのステロール含有天然物および加工物も同様
に本発明方法の原料として使用される。

さらに各種ステロールまたはそのＣ−３エステ
ルもしくはエーテル誘導体の酸化中間体も本発明
方法の基質として使用される。このような酸化中
間体としては、各種ステロール、そのＣ−３エス
テル、Ｃ−３−エーテル誘導体の４−エン−３−
オン又は１，４−ジエン−３−オン誘導体が挙げ
られるが、具体的には、たとえば、コレスト−４
−エン−３−オン、コレスタ−１，４−ジエン−
３−オン、コレスタ−４，22−ジエン−３−オン
等である。

本発明方法で使用される培地には、炭素源、窒
素源および無機物が適宜添加される。

炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、プロパンジオー
ル、ブタンジオール、高級アルコール等のアルコ
ール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸
およびその塩；大豆油、綿実油等のグリセリド、
油脂；澱粉、麦芽糖、シヨ糖、ブドウ糖、ラムノ
ース等の糖類があげられる。炭素源、窒素源およ
びその他の栄養物質を含む天然栄養源としては、
ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシロース糖蜜
を含む糖蜜類；バガス、コーンコブ、アルフアル
フア、コーンステイーブリカー、デイステイラー
ズソルブル、味液、魚粉、フスマ、肉エキス、酵
母、酵母エキス、ボテトエキス、麦芽エキス、グ
ルテン、ペプトン、グルタミン酸塩、アスパラギ
ン、グリシン、カゼイン、ガゼイン分解物、スキ
ムミルク、大豆粕・菜種粕・ゴマ粕・亜麻仁粕・
綿実粕等の植物油脂粕および丸大豆、菜種、ゴ
マ、亜麻仁・綿実等の油種子・油果実があげられ
る。

無機物としては、硫安、塩安などの窒素源；リ
ン酸水素二カリウム等のカリウムおよびリン源；
鉄、銅、マグネシウム、マンガン、コバルト、亜
鉛、カルシウム等の塩類；糖蜜等天然物に灰化物
があげられる。その他必要に応じてビタミン類を
添加することもできる。

培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。

消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが、必ずしも消泡剤を添加
する必要はない。

界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
であり、培地中に添加されることが望ましい。界
面界性剤としては、非イオン系及び陰イオン系の
ものが好ましい。具体的にはたとえば、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ソルビ
タンモノパルミテート、ポリエチレングリコール
モノステアレートなどを挙げることができる。

培養温度は通常20〜40℃であるが、培養温度は
30〜35℃付近が最適である。

培地のPHは通常５〜10に調整されるが、６〜９
が好ましい。本発明で使用する微生物がM.属に
属するものなので周知のように10付近のPHにも耐
えられる。

本発明方法の原料であるステロール類は培地と
共に殺菌されるのが一般的であるが、培養開始
後、培地に添加されてもよい。また分割添加も可
能である。この場合、乾燥殺菌あるいは湿熱殺菌
後そのまま添加されるか、あるいはジメチルホル
ムアミド等の溶解して溶液として添加されるか、
あるいは超音波処理により微細に分散懸濁して懸
濁液として添加される。また、界面活性剤を同時
に添加すると基質ステロール類等の乳化が促進さ
れるので好ましい。

培養時間は特に制限されないが、通常、原料ス
テロール類等添加後２ないしは３日目頃から
4ADの生産量が急増する。その後は、培養時間
と共に徐々に4ADの生産量が増加するが20日以
上培養するのは工業的意味が薄い。

培養終了後、培養液中に蓄積した4ADは既知
の方法で採取、分離精製されうる。たとえば、培
養液から4ADを数倍量の酢酸エチルなどの水と
混和しにくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒
を留去したのち、得られた粗4ADについて不溶
物を過後、メタノール、エタノール、テトラヒ
ドロフラン、シクロヘキサン、ヘキサン、アセト
ンなどから再結をくりかえすか、場合によつては
多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ等を吸着剤と
し、石油エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エ
ーテル、アセトン、メタノール・酢酸エチル等を
溶離剤として使用するカラムクロマトグラフイに
より精製された4ADを得ることができる。

4AD主生産突然変異株として米国特許第
3759791号明細書に記載されたM.スピーシーズ
NRRL Ｂ−3805号菌は、ステロール濃度0.1％で
0.4mg／ml以下の4AD生産が開示されているにす
ぎず、特開昭52−105289号公報に記載された
ADD、4AD生産突然変異株２株はいずれも4AD
収量に関する記載が全くない。

一方本発明によれば、副生物の少ない4ADを
収率良く製造することが可能であり、さらに従来
法にみられない高い基質濃度でそれに比例した収
率が得られる点で効果が大きい。

以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されない。

なお以下の実施例に於て、ステロール類および
4AD等のアンドロスタン系化合物の定性および
定量はガスクロマトグラフイにより行つた。また
以下の実施例に於て、パーセントは重量による。

実施例１グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0807号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間種培養
する。この種培養液２mlを丸大豆磨砕物4.0％、
NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1
％、コレステロール0.8％および水からなる本培
養培地100ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）
を含む500ml肩付きフラスコ５本に接種する。本
培養は30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪
条件で行い、培養開始後156時間目に培養を停止
し、培養液を全て併せ酢酸エチル２で２回抽出
する。

この抽出液をあわせて菌体などの不溶物を過
後、ステロイド含量をガスクロマトグラフイーで
分析した結果は、4AD1.25ｇ、ADD0.05ｇが生産
されていた。他にアンドロスタン系化合物が幾つ
か生成していたが、いずれも0.05ｇ以下であつ
た。

実施例２グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0807号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間培養す
る。この種培養液20mlを脱脂大豆磨砕物2.0％、
酵母2.0％、レシチン1.0％、NaNO₃0.2％、
K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1％、コレステ
ロール1.0％および水よりなる本培養培地800ml
（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容
肩付フラスコに接種する。本培養は30℃で100往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開
始後192時間目に培養を停止し、培養液を酢酸エ
チル2.4で抽出する。この抽出液中には
4AD1.73ｇ、ADD0.09ｇが生成していた。

実施例３実施例２において基質コレステロールの代り
に、β−シトステロールとカンペステロールの
２：１混合物、ステイグマステロール、コレスト
−４−エン−３−オン、コレスタ−１，４−ジエ
ン−３−オンおよびコレステリルオレエートを用
いた事を除いては実施例２を繰り返す。蓄積され
た主生成物4ADの量を表１に示す。

表１ 4AD （ｇ） β−シトステロール＋カンペステロール 1.21 ステイグマステロール 0.43 コレスト−４−エン−３−オン 0.94 コレスタ−１，４−ジエン−３−オン 0.25 コレステリルオレエート 0.09 参考例 MCI−0807号菌とその親株であるATCC25790
号菌との4ADを唯一の炭素源とする培地での生
育の一例は次の通りである。

4AD0.2％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、
KCl0.05％、MgSO₄・7H₂O0.01％（PH7.0）から
なる培地（120℃20分殺菌、10ml仕込／21mm×210
mm試験管）にATCC25790号菌およびMCI−0807
号菌を10⁶ずつ接種し、試験管振盪機上で30℃で
培養を行なつた。ATCC25790号菌は５日間培養
で明確に10⁷〜10⁸／mlの生育を示したが、MCI−
0807号菌は殆ど増殖せず10⁶／ml以下の菌数であ
つた。

また、上記の4AD唯一炭素源培地に寒天２％
を加え、無菌シヤーレ中に厚さ３mmの平板培地を
作つた。これに菌数50〜100個の菌濁濁液を塗布
した。ATCC25790号菌は４日後に明確なコロニ
ーを形成してくるが、MCI−0807号菌はコロニ
ーを殆ど形成せず生育してこない。

Claims

【特許請求の範囲】１ステロール類を基質にして、ミコバクテリウ
ム・パラフオーツイタムコンプレツクスに属する
突然変異株でアンドロスト−４−エン−３，17−
ジオンの１，２位脱水素酵素、９位水酸化酵素及
び17位還元酵素からなる群から選ばれる、アンド
ロスト−４−エン−３，17−ジオンの分解酵素が
低活性化又は欠失している微生物を培養すること
を特徴とするアンドロスト−４−エン−３，17−
ジオンの製造方法。２特許請求の範囲第１項記載の方法において、
ステロール類がステロール、そのＣ−３エステル
誘導体、Ｃ−３エーテル誘導体またはそれらの酸
化中間体から成る群から選ばれたものであること
を特徴とする方法。３特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
において、微生物が人工突然変異により得られた
ものであり且つアンドロスト−４−エン−３，17
−ジオンを唯一の炭素源とする培地において親株
に比して低下した生育を示す菌株であることを特
徴とする方法。４特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
かに記載の方法において、突然変異株がミコバク
テリウム・ネオオーラムに属するものであること
を特徴とする方法。５特許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれ
かに記載の方法において、突然変異株がミコバク
テリウム・パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI−0807号菌であることを特徴とする方法。