JPS6357437B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なステロイドおよびその製造方
法に関するものである。詳しくは、新規な微生物
により生産される新規なステロイドおよびその製
造方法に関するものである。 本発明者らは、コルチコイド（副腎皮質ホルモ
ン）の製造に工業的に有利な中間体の製造を目的
として鋭意研究してきたが、今般ステロール類を
基質にして、ミコバクテリウム（以下「M.」と
略す）属の突然変異株を用いる事により、下記の
如き構造を有する24―ノルコラ―１，４―ジエン
―３，22―ジオン、（以下「NCD」と略す）、お
よび、24―ノルコル―４―エン―３，22―ジオン
（以下「4NC」と略す）を培地中に多量生産させ
うる事を見いだした。 （式中、

【式】は

【式】または

【式】を表わす。以下の式においても同 様。） 本化合物は、例えば下記の如き方法で容易に女
性ホルモン類およびコルチコイド（副腎皮質ホル
モン）へ誘導しうる。それ故これらは極めて有用
なステロイド中間体である。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に係わる化合物は前記した化合物であ
る。この化合物は例えばステロール類を基質にし
て、M.属に属する突然変異株を培養することに
より製造できる。 ここで使用される微生物は、M.属に属し、
NCDまたは4NCを生産しうる微生物である。 勿論言うまでもないが、このような微生物は
NCDを生産物としても、4NCを生産物としても、
またNCDと4NC（両者をあわせて以下「NC」と
略す）を併産するものであつてもよい。 従来知られているM.属に属する微生物（以下
「野生株」という）は、ステロール類を基質とし
て培養を行つても、NCを多量生産することはな
い。 従つて、本発明で用いられる微生物は、NCを
生産する点で明白に野生株と区別される。 このような微生物は、通常、NC分解酵素また
はその先の代謝経路の酵素が欠失または弱化した
か、ステロール類からアンドロスト―４―エン―
３，17―ジオン（以下「4AD」と略す）または
アンドロスタ―１，４―ジエン―３，17―ジオン
（以下「ADD」と略す）への代謝経路上のどこか
の酵素が欠失または弱化し、代謝の主経路がNC
方向に変化してNCを蓄積させるようになつた突
然変異株であると推測される。 このような突然変異株としては、例えばM.パ
ラフオーツイタムコンプレツクス
（parafortuitum complex）MCI―1412号菌およ
びMCI―1414号菌を挙げることができる。両菌
株は、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
ATCC25790号菌〔＝M.ネオオーラム
（neoaurum）ATCC25790号菌〕を親株として、
紫外光およびニトロソグアニジンによる処理によ
り得られた。両菌株は、微生物工業技術研究に次
の如く寄託されている。

【表】 本菌の親株について詳述すると、親株
ATCC25790号菌は、M.に関する専門家達13名が
集つた抗酸菌分類国際研究班（International
Working Group on Mycobacterial
Taxonomy）の共同研究の結論として、M.パラ
フオーツイタムコンプレツクスに属するとされて
いる。〔斎藤肇、束村道雄らインターナシヨナル
ジヤーナルオブシステマテイツクバクテレオロジ
ー（Int.J.Syst.Bacteriol.）27巻、75〜85頁
（1977年、アメリカ）参照〕 この菌株ATCC25790号菌は、束村＃358号菌
（ATCC23366号菌）を基準菌株として設けた新種
M.オーラム（aurum）束村に、初め束村＃309号
菌として含められていた〔束村道雄、医学と生物
学、72巻、270〜273頁、1966年〕。その後、束村
氏は、M.オーラムの別種としてM.ネオオーラム
（neoaurum）束村を、束村＃3503号菌
（ATCC25795号菌）を基準菌核とし、創設した
が、この際ATCC25790号菌は依然としてM.オー
ラムに属するものとされていた。〔束村道雄、医
学と生物学、85巻、229〜233頁、1972年〕 しかし、最近の斎藤、束村らの文献（前出）に
よれば、ATCC25790号菌は、M.オーラムではな
くM.ネオオーラムの一員であるとされている
〔斎藤、束村ら、前出文献77頁図１参照〕。さら
に、同じ文献では、M.パラフオーツイタム束村、
M.オーラム束村、M.ネオオーラム束村、M.デイ
エルンホフエリー ペニツクアンドユーハツ
（diernhoferi Bonicke＆Juhasz）および“カナ
ザワストレインズ”（“Kanazawa Strains”）は
相互に極めて近縁関係にあり、現段階では区別で
きないとして、この５種は分散しておかずにM.
パラフオーツイタムコンプレツクスとして一括し
て取り扱うよう結論づけている。 束村らも別な文献でほぼ同様な結論に達し、
M.オーラムおよびM.ネオオーラムはM.パラフオ
ーツイタムコンプレツクスの一員としてか、また
は、M.パラフオーツイタムの亜種とするとして
いる。〔ジヤーナルオブジエネラルマイクロバイ
オロジー（Journal of General Microbiology）
98巻511〜517頁、（1977年、イギリス）参照〕 M.パラフオーツイタムコンプレツクスの一般
的性質および近縁同類との比較は斎藤肇（結核、
50巻、402頁、1975年）斎藤ら（前出、80〜81頁、
1977年）および束村ら（前出、515頁、1977年）
を参照されたい。 以上の如く親株ATCC25790号菌〔ツカムラ
（Tsukamura）＃309〕の分類学的位置は、この
方面の最高権威者の結論に従い、M.パラフオー
ツイタムコンプレツクスに属するものとするのが
妥当である。 M.パラフオーツイタムコンプレツクスはグラ
ム陽性、抗酸性、非運動性、非胞子形成の桿菌で
あり、迅速発育性、暗発色性抗酸菌（rapid
growing scotochromogenic mycobacteria）あ
るいはルニヨン（Runyon）の群抗酸菌に属す
る。 一方この親株ATCC25790号菌により分離した
突然変異株MCI―0617号菌は親株に比し、前者
が寒天培地上で粗面の（rough）集落を形成する
点以外に菌学的な相違は殆どなかつたし、さらに
親株が既述の如く、M.パラフオーツイタムコン
プレツクスに属するので突然変異株MCI1412号
菌およびMCI―1414号菌はM.パラフオーツイタ
ムコンプレツクスに属すると考えられる。 これらの分類群の比較についてはバーギーの便
覧第８版〔“Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology ed.8”，695〜696
頁、ウイリアム＆ウイルキンスカンパニー
（Williams＆Wilkins Co.，）1974年、アメリカ〕、
斎藤肇（前出、402頁、1975年）、斎藤ら（前出、
80〜81頁、1977年）および束村ら（前出、515頁、
1977年）の文献を参照されたい。 本発明で基質として用いられるステロール類と
は、各種ステロール、そのＣ―３エステル、エー
テル誘導体またはそれらの酸化中間体を総合して
ステロール類と称す。各種ステロールとはペルヒ
ドロシクロペンタノフエナントレン核のＣ―３に
ヒドロキシル基を、通常Ｃ―５に二重結合を、Ｃ
―17に炭素数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、
場合によつてはＣ―７，Ｃ―８，Ｃ―９(11)等に二
重結合を有してもよい。シクロペンタノフエナン
トレン核が飽和のこともある。 このような各種ステロールとしとは、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β―シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α―シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロールおよびβ―シト
ステロールである。 また各種ステロールの3β水酸基と硫酸等の無
機酸または脂肪酸等の有機酸とのＣ―３エステル
誘導体も本発明方法の原料として使用される。 このようなＣ―３エステル誘導体としては、コ
レステリルオレエート、コレステリルパルミテー
ト、コレステリルサルフエート等が挙げられる。
さらに、たとえば各種ステロールの3β水酸基に
アルキレンオキシドを付加させる方法等により得
られるＣ―３エステル誘導体も本発明方法の原料
として使用される。 このようなＣ―３エーテル誘導体としてはポリ
オキシエチレンコレステリルエーテル等が挙げら
れる。 上記した各種ステロールのＣ―３エステル誘導
体を含有する羊毛脂（ウールワツクス）、ラノリ
ンおよびラノリンの加水分解で得られる、コレス
テロールを含有するウールアルコールおよびウー
ルアルコールにエチレンオキシドを反応させて得
られる、Ｃ―３エーテル誘導体であるポリオキシ
エチレンラノリンアルコールエーテルも本発明方
法の原料として使用されることはいうまでもな
い。 魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さ
らに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール
油などのステロール含有天然物および加工物も同
様に本発明方法の原料として使用される。 さらに各種ステロールまたはそのＣ―３エステ
ルもしくはエーテル誘導体の酸化中間体も本発明
方法の基質として使用される。このような酸化中
間体としては各種ステロール、そのＣ―３エステ
ル、Ｃ―３エーテル誘導体の４―エン―３―オン
又は１，４―ジエン―３―オン誘導体が挙げられ
るが、具体的には、たとえば、コレスト―４―エ
ン―３―オン、コレスタ―１，４―ジエン―３―
オン、コール酸、リトコール酸、ケノデオキシコ
ール酸等である。 本発明方法で使用される培地には、炭素源、窒
素源および無機物が適宜添加される。 炭素源としては、たとえば、炭化水素；メタノ
ール、エタノール、等のアルコール類；コハク
酸、酢酸等の有機酸およびその塩；大豆油、綿実
油等のグリセリド、油脂；澱粉、麦芽糖、シヨ
糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類があげられ
る。炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含
む天然栄養源としては、ハイテスト糖蜜およびキ
シロース糖蜜を含む糖蜜類；バガス、コーンコ
ブ、アルフアルフア、コーンステイープリカー、
デイステイラーズソルブル、味液、漁粉、フス
マ、肉エキス、酵母、酵母エキス、ポテトエキ
ス、麦芽エキス、グルテン、ペプトン、グルタミ
ン酸塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、カ
ゼイン分解物、スキムミルク、大豆粕、菜種粕、
ゴマ粕、亜麻仁粕、綿実粕等の植物油脂粕および
丸大豆、菜種、ゴマ、亜麻仁、綿実等の油種子、
油果実があげられる。 この培地組成のうち、グリセリドまたはそれを
含有する天然物の添加効果は大きい。 グリセリドとしては、モノ、ジおよびトリグリ
セリドのいずれでもよい。このようなグリセリド
としては例えばトリミリスチン、トリパルミチ
ン、トリステアリン、α，β―ジステアリン、α
―モノオレインなどをあげる事が出来る。 グリセリドを含有する天然物としては、例え
ば、アマニ油、エノ油、大豆油、オリーブ油、大
豆レシチン、トウモロコシ油、落花生油、ツバキ
油、ヤシ油、ゴマ油、ナタネ油、綿実油、パーム
油、牛脂、魚油、丸大豆、綿実、アマニゴマ、ナ
タネ、落花生、トウモロコシ、サフラワー、米ぬ
か、などがあげる事が出来る。 グリセリドまたはそれを含有する天然物の培地
中への添加量は通常グリセリドとして0.1〜10重
量％、好ましくは0.3〜７重量％、さらに好まし
くは0.5〜４重量％となるよう培地に添加される。 無機物としては硫安、塩安などの窒素源；リン
酸水素二カリウム等のカリウムおよびリン源；
鉄、銅、マグネシウム、マンガン、コバルト、亜
鉛、カルシウム等の塩類；糖蜜等天然物の灰化物
があげられる。その他必要に応じてビタミン類を
添加することもできる。 培地の組成は用いる菌類の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。 消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。 界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
であり、培地中に添加されることが望ましい。界
面活性剤としては、非イオン系及び陰イオン系の
ものが好ましい。具体的にはたとえば、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ソルビ
タンモノパルミテート、ポリエチレングリコール
モノステアレートなどを挙げることができる。 培養温度は通常20〜40℃であるが、培養温度は
30℃〜35℃付近が最適である。 培地のPHは通常５〜10に調整されるが、６〜９
が好ましい。本発明で使用する微生物がM.属に
属するものなので周知のように10付近のPHにも耐
えられる。 本発明方法の原料であるステロール類は培地と
共に殺菌されるのが一般的であるが、培養開始
後、培地に添加されてもよい。また分割添加も可
能である。この場合、乾燥殺菌あるいは湿熱殺菌
後そのまま添加されるか、あるいはジメチルホル
ムアミド等に溶解して溶液として添加されるか、
あるいは超音波処理により微細に分散して懸濁液
として添加される。また、界面活性剤を同時に添
加すると基質ステロール類等の乳化が促進される
ので好ましい。 培養時間は特に制限されないが、通常、原料ス
テロール類等添加後３日目頃からNCの生産量が
急増する。その後は、培養時間と共に徐々にNC
の生産量が増加するが20日以上培養するのは工業
的意味が薄い。 培養終了後、培養液中に蓄積したNCは既知の
方法で採取、分離精製されうる。たとえば培養液
からNCを数倍量の酢酸エチルなどの水と混和し
にくい有機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒を留去
すると粗NCが得られる。NCD，4NC、基質ステ
ロール類または副生物を相互に分離する必要があ
る場合には、多孔性樹脂、シリカゲル、アルミナ
等を吸着剤とし、石油エーテル、ベンゼン、クロ
ロホルム、エーテル、アセトン、メタノール、酢
酸エチル等を溶離剤として使用するカラムクロマ
トグラフイにより、上記生成物を分離することが
できる。 単離したNCD又は4NCを夫々精製するには、
例えばエタノールなど適当な溶媒で再結晶を繰り
返せばよい。 以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されない。 なお以下の実施例に於て、ステロール類および
その誘導体、NC、残存ステロール類および副生
ステロイドの定性および定量はガスクロマトグラ
フイーにより行つた。 また以下の実施例に於て、パーセントは重量に
よる。 実施例 １ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.パラフオーツイタムコンプレツクス
MCI1412号菌を１白金耳接種し30℃で120往復／
分、振巾７cmの往復振盪条件で72時間種培養す
る。この種培養液２mlを脱脂大豆粉4.0％、魚粕
2.0％，K₂HPO₄0.2％，NaNO₃0.2％，MgSO₄・
7H₂O0.1％、大豆油1.0％（PH7.0，120℃20分間殺
菌）コレステロール0.8％および水からなる本培
養地50ml（PH7.0，120℃で20分間蒸気殺菌）を含
む500ml肩付フラスコ10本に接種する。 本培養は30℃で120往復／分、振巾７cmの往復
振盪条件で行い、培養開始後160時間目に培養を
停止し、培養液を全て併せて酢酸エチル２で２
回抽出する。 その抽出液を併せて菌体などの不溶物を過
後、その抽出液の一部をヘキサン：酢酸エチル＝
１：１の溶媒にて薄層クロマトグラフイーにて展
開する。展開後RF0.54および0.76に紫外光吸収を
有する部分をかきとり、夫々を酢酸エチルにて抽
出する。 抽出後得られた２つの粗ステロイド物質を再び
薄層クロマトグラフイーにかけ同様に抽出する。 この抽出液から結晶を析出させ、再結晶して物
質Ａ（m.p.220.6〜223.1℃）を約500mg、物質Ｂを
約10mg、物質Ａを機器分析したところ次の如き結
果を得た。 IR ν^KB〓_nax；1705，1650cm^-1 MS ｍ／ｅ；340（M⁺） 325（Ｍ―CH₃） 297（Ｍ―COCH₃） 268（Ｍ―CHCH₃COCH₃） 147 122 43（COCH₃） NMR（CDCl₃）； 7.07ppm（1H，ｄ，Ｊ＝8.0Hz） 6.25〃 （1H，ｄ，ｄ，Ｊ＝8.0，1.0Hz） 6.07〃 （1H，br，Ｓ，） 2.09〃 （3H，Ｓ，） 1.22〃 （3H，Ｓ，） 1.12〃 （3H，ｄ，Ｊ＝7.0Hz） 0.77〃 （3H，Ｓ，） これらのデータより、物質Ａは、NCD（＝24―
ノルコラ―１，４―ジエン―３，22―ジオン）で
あると同定された。この純結晶を標準品として培
養液の酢酸エチル抽出液中のNCDを定量した結
果、1.37ｇのNCDが存在していた事が判明した。 この物質Ａ即ちNCDから有機化学的に還元し
て物質Ｃを得た。 即ち、物質A150mgとトリス（トリフエニルホ
スフイン）ロジウム（）―クロリド20mgをベン
ゼン10mlに溶解し、水素気流中にて室温で４時間
反応させた。反応液を前出の薄層クロマトグラフ
イーで展開し、R_F0.76に相当する部分をかき取
り、酢酸エチルにて抽出後再結晶させ、物質Ｃを
得た。 この物質Ｃは次の如き分析結果を得た。 IR ν^KB〓_nax；１，705，1655cm^-1 MS Ｍ／ｅ；342（M⁺） 327 299 271 147 124 43 NMR（CDCl₃）； 5.74ppm（1H，Ｓ，） 2.10〃 （3H，Ｓ，） 1.19〃 （3H，Ｓ，） 1.14〃 （3H，ｄ，Ｊ＝7.0Hz） 0.75〃 （3H，Ｓ，） この結果より物質Ｃは4NC即ち、24―ノルコ
ル―４―エン―３，22―ジオンであると同され
た。 一方物質Ｂは完全に精製しきれなかつたが薄層
クロマトグラフイー上にて物質Ｃと同一のRF及
び硫酸発色（黄褐色）を示し、さらに赤外線吸収
スペクトラムが一致した。 従つて培養液中に生成した物質Ｂは、4NCで
あると確認された。 培養液の酢酸エチル抽出液中の4NCの量を定
量すると酢酸エチル中に70mgの4NCが存在して
いた事が確認された。 実施例 ２ 実施例１において原料ステロイドとしてコレス
テロールの代りに下記表１に掲げる各種ステロイ
ドを用いた事を除いては実施例１を繰り返す。

【表】 実施例 ３ 実施例１において本培養培地に丸大豆磨砕物
6.0％、酵母1.0％、K₂HPO₄0.25％、MgSO₄・
7H₂O0.1％およびコレステロール2.0％を含む培
地を使用した事を除いては実施例１を繰り返す。 酢酸エチル中にNCD2.6ｇ，4NC0.1ｇの存在が
確認された。 実施例 ４ 実施例１において本培養にグルコース1.0％肉
エキス1.0％、ペプトン1.0％、花王アトラス社界
面活性剤商標名“Tween―80”0.5％、綿実粕1.0
％、コレステロール1.0％、各種濃度のなたね油
および水よりなる培地800mlを含む５容肩付フ
ラスコ10本を用い、種培養20ml接種後30℃，100
往復／分、振巾７cmの振盪条件で150時間本培養
を行なつた事を除いては実施例１を繰り返す。
各々のフラスコの酢酸エチル抽出液（1.6）を
分析した結果について表２に示す。

【表】 実施例 ５ 使用菌株にMCI―1414号菌を用いた事を除い
ては、実施例１の培養を繰り返す。培養停止後、
培養液を併せて２の酢酸エチルで２回抽出した
が、抽出液中にNCD0.38ｇ，4NC0.04ｇが存在し
ていた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中、【式】は【式】または 【式】を表わす。）で示される24―ノルコ ラ―１，４―ジエン―３，22―ジオンまたは24―
   ノルコル―４―エン―３，22―ジオン。 ２ ステロール類を基質にして、24―ノルコラ―
   １，４―ジエン―３，22―ジオンまたは24―ノル
   コル―４―エン―３，22―ジオンを生産する能力
   を有するミコバクテリウム属に属する突然変異株
   を培養し、24―ノルコラ―１，４―ジエン―３，
   22―ジオンまたは24―ノルコル―４―エン―３，
   22―ジオンを生産することを特徴とするステロイ
   ドの製造方法。 ３ 特許請求の範囲第２項記載のステロイドの製
   造方法において、ステロール類が、ステロール、
   そのＣ―３エステル誘導体、Ｃ―３エーテル誘導
   体またはそれらの酸化中間体からなる群から選ば
   れたものであることを特徴とする方法。 ４ 特許請求の範囲第２項または第３項記載のス
   テロイドの製造方法において、微生物がミコバク
   テリウム・パラフオーツイタムコンプレツクスに
   属するものであることを特徴とする方法。 ５ 特許請求の範囲第４項記載のステロイドの製
   造方法において、微生物がミコバクテリウム・ネ
   オオーラムに属するものであることを特徴とする
   方法。 ６ 特許請求の範囲第４項記載のステロイドの製
   造方法において、微生物がミコバクテリウム・パ
   ラフオーツイタムコンプレツクスMCI 1412号菌
   であることを特徴とする方法。 ７ 特許請求の範囲第４項記載のステロイドの製
   造方法において、微生物がミコバクテリウム・パ
   ラフオーツイタムコンプレツクスMCI 1414号菌
   であることを特徴とする方法。 ８ 特許請求の範囲第２項ないしは第７項のいず
   れかに記載のステロイドの製造方法において、
   0.1重量％以上のグリセリドを含有する培地を用
   いることを特徴とする方法。