JPS6250118B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による９α−ヒドロキシアンド
ロスト−４−エン−３・17−ジオン（以下「９α
−OH−4AD」と略す）の製造方法に関するもの
である。詳しくは、突然変異株の微生物による９
α−OH−4ADの製造方法に関するものである。

９α−OH−4ADは９位にヒドロキシル基（以
下「OH」と略すことがある）が存在する故に有
機合成反応で９α位にハロゲン原子を導入しやす
く、またC₉〜C₁₁間二重結合導入を経て11β位に
OHを導入しやすい。コルチコイド（副腎皮質ホ
ルモン）の大部分は11β位にOHを有するし、９
α位にハロゲン原子を持つと活性が極めて高くな
る事を考えると、９α−OH−4ADはコルチコイ
ド製造の重要な前駆体である。

微生物により９α−OH−4ADを製造する方法
は既に幾つか知られている。それらの中の大部分
はアンドロスト−４−エン−３・17−ジオン（以
下4ADと略称する）の９α位にヒドロキシル基を
導入するもので例えば米国特許第3065145号およ
び同3116220号各明細書などにより知られてい
る。

一方、ステロール類より直接９α−OH−4AD
を製造するものとしては特開昭52−54093号公報
が知られている。ここではミコバクテリウム属
〔以下「M.」と略記する〕に属するM.フオーツイ
タムの突然変異株を使用している。

今般、本発明者等はM.バツカエ（vaccae）に
属する突然変更株を用い９α−OH−4ADをステ
ロール類より多量生産させる事に成功し本発明に
倒達した。

すなわち、本発明の要旨はステロール類を基質
にして、M.バツカエ（vaccae）MCI−1104号菌
又はM.バツカエMCI−1117号菌を培養すること
を特徴とする９α−OH−4ADの製造方法に存す
る。

以下に本発明を詳細に説明する。

従来知られているM.バツカエに属する微生物
（以下「野生株」という）は、９α−OH−4AD
の分解酵素を充分に有していて、通常の培養を行
つたのではステロール類より９α−OH−4ADの
生成はみられない。

従つて、本発明で用いられる突然変異株M.バ
ツカエMCI−1104号菌及び同MCI−1117号菌は、
野生株の有する９α−OH−4ADの分野酵素が欠
失または低活性化したものであり、このような突
然変異株は、通常の培養条件下において９α−
OH−4ADを多量に生成する点で明白に野生株と
区別される。

前者の菌株は、M.バツカエATCC23034号菌を
親株とし、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンによる処理により得られた。

後者の菌株は、M.バツカエATCC23004号菌を
親株とし、紫外光による処理により得られた。

本菌株は、微生物工業技術研究所に次の番号で
寄託されている。

微生物 微工研菌寄 M.バツカエMCI−1104号菌 第4741号 M.バツカエMCI−1117号菌 第4754号 M.バツカエMCI−1104号菌および M.バツカエMCI−1117号菌はいずれもM.バツカ
エに属する親株より得られた突然変異株であるか
ら、当然M.バツカエに属するものと考えられる
し、且つ、特開昭52−54093号公報に記載される
既知の９α−OH−4AD生産突然変異株M.フオー
ツイタム（Fortuitum）NRRLB−8119号菌とは
分類学上別のものであることが明白である。

本発明で基質として用いられるステロール類と
は、各種ステロール、そのＣ−３エステル、エー
テル誘導体またはそれらの酸化中間体を総合して
ステロール類と称す。各種ステロールとは、ベル
ヒドロシクロペンタノフエナントレン核のＣ−３
にヒドロキシル基を、通常Ｃ−５に二重結合を、
Ｃ−17に炭素数８ないし10個の鎖式の側鎖を有
し、場合によつてはＣ−７、Ｃ−８、Ｃ−９(11)等
に二重結合を有してもよい。

このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β−シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α−シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロールおよびβ−シト
ステロールである。

また各種ステロールの３β水酸基と硫酸等の無
機酸または脂肪酸等の有機酸とのＣ−３エステル
誘導体も本発明方法の原料として使用される。

このようなＣ−３エステル誘導体としては、コ
レステリルオレエート、コレステリルパルミテー
ト、コレステリルサルフエート等が挙げられる。
さらに、たとえば各種ステロールの３β水酸基に
アルキレンオキシドを付加させる方法等により得
られるＣ−３エーテル誘導体も本発明方法の原料
として使用される。

このようなＣ−３エーテル誘導体としてはポリ
オキシエチレンコレステリルエーテル等が挙げら
れる。

上記した各種ステロールのＣ−３エステル誘導
体を含有する羊毛脂（ウールワツクス）、ラノリ
ン、およびラノリンの加水分解で得られるコレス
テロールを含有するウールアルコールおよびウー
ルアルコールにエチレンオキシドを反応させて得
られる。Ｃ−３エーテル誘導体であるポリオキシ
エチレンラノリンアルコールエーテルも本発明方
法の原料として使用されることはいうまでもな
い。

魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油さら
に植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール油
などのステロール含有天然物および加工物も同様
に本発明方法の原料として使用される。

さらに各種ステロールまたはそのＣ−３エステ
ルもしくはエーテル誘導体の酸化中間体も本発明
方法の基質として使用される。このような酸化中
間体としては各種ステロール、そのＣ−３エステ
ル、Ｃ−３−エーテル誘導体の４−エン−３−オ
ン又は１・４−ジエン−３−オン誘導体が挙げら
れるが、具体的には、たとえば、コレスト−４−
エン−３−オン、コレスタ−４・22−ジエン−３
−オン、３β−ヒドロキシ−23・24−ビスノルコ
ル−５−エン−22−オイツクアシツド、３−オキ
ソ−23・24−ビスノルコル−４−エン−22−オイ
ツクアシツド（以下「4BN」と略す）、３−オキ
ソ−プレグナ−４・17（20）ジエン−20−カルボ
ン酸、３−オキソ−プレグナ−４・17（20）ジエ
ン−20−カルボン酸メチル、３β−ヒドロキシ−
アンドロスト−５−エン−17−オン、4AD等であ
る。

本発明方法で使用される培地には、炭素源、窒
素源および無機物が適宜添加される。

炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフイン、
α−オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；大豆油、綿実油等のグ
リセリド、油脂；澱粉、麦芽糖、シヨ糖、ブドウ
糖、ラムノース等の糖類があげられる。炭素源、
窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養源
としては、ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシ
ロース糖蜜を含む糖蜜類；バガス、コーンコブ、
アルフアルフア、コーンステイープリカー、デイ
ステイラーズソルブル、味液、魚粉、フスマ、肉
エキス、酵母、酷母エキス、ポテトエキス、麦芽
エキス、グルテン、ペプトン、グルタミン酸塩、
アスパラギン、グリシン、カゼイン、カゼイン分
解物、スキムミルク、大豆粕・菜種粕・ゴマ粕・
亜麻仁粕・綿実粕等の植物油脂粕および丸大豆、
菜種、ゴマ、亜麻仁・綿実等の油種子・油果実が
あげられる。

無機物としては、硫安、塩安などの窒素源；リ
ン酸水素二カリウム等のカリウムおよびリン源；
鉄、銅、マグネシウム、マンガン、コバルト、亜
鉛、カルシウム等の塩類；糖蜜等天然物の灰化物
があげられる。その他必要に応じてビタミン類を
添加することもできる。

培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。

消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。

界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
であり、培地中に添加されることが望ましい。界
面活性剤としては、非イオン系及び陰イオン系の
ものが好ましい。具体的にはたとえば、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノステアレート、ソルビ
タンモノパルミテート、ポリエチレングリコール
モノステアレートなどを挙げることができる。

培養温度は通常20〜40℃であるが、培養温度は
25〜35℃付近が最適である。

培地のPHは通常５〜10に調整されるが、６〜９
が好ましい。本発明で使用する微生物がM.属に
属するものなので周知のように10付近のPHにも耐
えられる。

本発明方法の原料であるステロール類は培地と
共に殺菌されるのが一般的であるが、培養開始
後、培地に添加されてもよい。また分割添加も可
能である。この場合、乾燥殺菌あるいは湿熱殺菌
後そのまま添加されるか、あるいはジメチルホル
ムアミド等の溶媒に溶解して添加されるか、ある
いは超音波処理により微細に分散懸濁して懸濁液
として添加される。また、界面活性剤を同時に添
加すると基質ステロール類等の乳化が促進される
ので好ましい。

培養時間は特に制限されないが、通常、原料ス
テロール類等添加後２日目頃から９α−OH−
4ADの生産量が急増する。その後は、培養時間と
共に徐々に９α−OH−4ADの生産量が増加する
が20日以上培養するのは工業的意味が薄い。

培養終了後、培溶液中に蓄積したアンドロスタ
ン系化合物は既知の方法で採取、分離精製されう
る。たとえば培養液から９α−OH−4ADを数培
量の酢酸エチルなどの水と混和しにくい有機溶媒
で抽出し、抽出液から溶媒を留去したのち、得ら
れたステロイド混合物を多孔性樹脂、シリカゲ
ル、アルミナ等を吸着剤とし、石油エーテル、ベ
ンゼン、クロロホルム、エーテル、アセトン、メ
タノール・酢酸エチル等を溶離剤として使用する
カラムクロマトグラフイにより、９α−OH−
4ADを分離することができる。

しかし通常は培養条件を適当に選んで培養し、
かつ適当な抽出溶媒を選択する事により培養液の
溶媒抽出液中で９α−OH−4ADが主体を占めれ
ば、クロマト操作する事なく溶媒抽出液から溶媒
留去後、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサンな
どに溶解させて再結晶を繰り返して９α−OH−
4ADの純結晶を得る事が出来る。

本発明によれば、安価なステロール類より９α
−OH−4ADを収率良く製造することが可能であ
る。

以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されない。

なお、以下の実施例に於て、９α−OH−4AD
の定量はガスクロマトグラフイにより行つた。

また、以下の実施例に於て、パーセントは重量
による。

実施例 １ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、M.バツカエMCI−1104号菌を１白金耳
接種し、30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振
盪条件で48時間種培養する。この種培養液２mlを
丸大豆磨砕物5.0％、酵母1.5％、K₂HPO₄0.15
％、大豆油0.5％、MgSO₄・7H₂O0.1％、シリコ
ンオイル（信越化学社商標KM−70）0.1％、コレ
ステロール2.0％および水からなる本培養培地50
ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む500
ml肩付きフラスコ10本に接種する。本培養は30℃
で、120往復／分、振幅７cmの往復盪条件で行
い、培養開始後200時間目に培養を停止し、培養
液を全て併せ酢酸エチル１で２回抽出する。

この抽出液をあわせて菌体などの不溶物を過
後、ステロイド含量をガスクロマトグラフイーで
分析した結果は、４α−OH−4ADが0.83ｇ生産
されていた。

実施例 ２ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、M.バツカエMCI−1104号菌を１白金耳接
種し30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条
件で48時間種培養する。この種培養液20mlを脱脂
大豆磨枠物4.0％、酵母2.0％、大豆油1.0％、米ぬ
か1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.1％、コレステロール1.0％および水より
なる本培養培地50ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気
殺菌）を含む500ml容肩付フラスコ10本に接種す
る。本培養は30℃で100往復／分、振盪７cmの往
復振盪条件で行い、培養開始後192時間目に培養
を停止し、培養液を全部あわせて酢酸エチル1.5
で抽出する。この抽出液中に、９α−OH−
4ADが0.52ｇ存在していた。

実施例 ３ 実施例１において基質コレステロールの代り
に、β−シトステロール（90％）、β−シトステ
ロールとカンペステロールの２：１混合物、ステ
イグマステロール、コレスト−４−エン−３−オ
ン、コレステリルオレエートおよび4BNを用いた
事を除いては実施例１を繰り返す。蓄積された９
α−OH−4ADの量を表１に示す。

表 １ ９α−OH−4AD（ｇ） β−シトステロール 0.62 β−シトステロール＋カンペステロール 0.58 ステイグマステロール 0.10 コレスト−４−エン−３−オン 0.70 コレステリルオレエート 0.05 4BN 0.15 実施例 ４ 実施例１において本培養培地に、綿実粕4.0
％、大豆油1.0％、カゼイン2.0％、K₂HPO₄0.2％
NaNO₃0.2％、MgSO₄・7H₂O0.01％、コレステロ
ール2.0％および水よりなる培地を用いた事を除
いては実施例１を繰返す。

培養液を酢酸エチル抽出したその溶媒中には９
α−OH−4ADが0.88ｇ存在していた。

実施例 ５ 実施例１において、使用する微生物をM.バツ
カエMCI−1104号菌に代り、同MCI−1117号菌を
用いたことを除いては実施例１を繰り返す。その
結果は９α−OH−4ADが1.15ｇ生産されてい
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ステロール類を基質にして、ミコバクテリウ
   ム・バツカエMCI−1104号菌又はミコバクテリウ
   ム・バツカエMCI−1117号菌を培養することを特
   徴とする９α−ヒドロキシアンドロスト−４−エ
   ン−３・17−ジオン（以下「９α−OH−4AD」
   と略す）の製造方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の微生物による９
   α−OH−4ADの製造方法において、ステロール
   類が、ステロール、そのＣ−３エステル誘導体、
   Ｃ−３エーテル誘導体またはそれらの酸化中間体
   からなる群から選ばれたものであることを特徴と
   する方法。