JPS6247518B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物による９α―ヒドロキシ―アン
ドロスト―４―エン―３，17―ジオン（以下９α
―OH―4ADと略す）の製造方法に関するもので
ある。詳しくは、コリネバクテリウム・エクイ
（以下Ｃ、エクイと略す）に属する微生物を用
い、アンドロスト―４―エン―３，17―ジオン
（以下4ADと略す）を基質として、９α―OH―
4ADを製造する事を骨子とするものである。 微生物により4ADを９α―OH―4ADに転換さ
せる方法は、古くからいくつか知られている。例
えばノカルデイア スピーシズ（Nocardia sp.）
〔ドツドソン（Dodson）ら、ジヤーナル、オブ、
アメリカン ケミカル ソサイアテイー、83巻、
4631頁（1961年）米国参照〕、シリンドロカーボ
ン・ラデイシコーラ（Cylindrocarpon
radicicola）〔米国特許第3065146号および同
3080298号各明細書参照〕、アスコチータ・リニコ
ーラ（Ascochytalinicola）〔米国特許第3116220
号明細書参照〕などを用いる方法がそれである。
しかしながら、これらの技術は今日まで実用化さ
れていない。 今般本発明者らは、従来の文献に記載のない属
であるC.エクイを用いると、4ADから従来の常
識を破る高濃度・高収率で９α―OH―4ADを生
成畜積させる事ができることを見出し本発明に到
達した。 すなわち、本発明の要旨は、アンドロスト―４
―エン―３，17―ジオンを基質としてコリネバク
テリウム・エクイに属する微生物を用い、９α―
OH―4ADを製造することを特徴とする９α―ヒ
ドロキシ ステロイドの製造方法に存する。 以下に本発明を詳細に説明する。 4ADから９α―OH―4ADへの転換について使
用するC.エクイ（equi）に属する菌としては、
ATCC 6939、7698、7699、10146、21107、
21280、21329、21521および21690号各菌ならびに
IAM1038号菌が知られている。その転換反応は
増殖菌体（growing cells）の状態でも休止菌体
（resting cells）の状態でもどちらでもよい。休
止菌体の場合は不溶物を含まぬ培地で培養し、遠
心分離などに菌を集菌し、4ADを含む緩衝液、生
理的食塩水、水などに再び懸濁して転換反応を行
なう。反応中に撹拌が必要で、場合によつては通
気も必要である。 次に増殖菌体を用いる場合について詳述する
と、炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じ
てビタミン等の栄養素を含む培地を殺菌し、これ
にC.エクイを接種して振盪培養ないしは通気撹
拌培養を行なう。用いられる培地は次のようなも
のである。 炭素源としては、たとえば、ｎ―パラフイン、
α―オレフイン、キシレン等の炭化水素；メタノ
ール、エタノール、グリセリン、高級アルコール
等のアルコール類；コハク酸、酢酸、高級脂肪酸
等の有機酸およびその塩；澱粉、麦芽糖、シヨ
糖、ブド糖、ラムノース等の糖類；アマニ油、大
豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パー
ム油、魚油、牛脂、タロー油脂などの油脂類があ
げられる。炭素源、窒素源およびその他の栄養物
質を含む天然栄養源としては、たとえばアマニ油
脂、脱脂大豆粕、ナタネ油粕などの植物油脂粕
類；ハイテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシロース
糖蜜を含む糖蜜類；バガス、コーンコブ、アルフ
アルフア、コーンステイープリカー、デイステイ
ラーズソルブル、味液、魚粉、フスマ、肉エキ
ス、酵母、酵母エキス、ポテトエキス、麦芽エキ
ス、グルテン、ペプトン、グルタミン酸塩、アス
パラギン、グリシン、カゼイン、カゼイン分解
物、スキムミルクがあげられる。 また、培地に添加される無機物としては例えば
硫安、塩安などの窒素源；リン酸水素二カリウム
等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等の
塩類；糖蜜等天然物の灰化物があげられる。その
他必要に応じてビタミン類を添加することもでき
る。 培地の組成は用いる菌類の種類に応じて選ばれ
るが、炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマ
グネシウムは培地成分として不可欠である。 消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すれ
ばよい。具体的にはポリオキシアルキレングリコ
ールなどが挙げられるが必ずしも消泡剤を添加す
る必要はない。 界面活性剤はステロール類の乳化剤として有効
である場合が多い。界面活性剤としては、非イオ
ン系及び陰イオン系のものが好ましい。具体的に
はたとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ステアレート、ソルビタンモノパルミテート、ポ
リエチレングリコールモノステアレートなどを挙
げることができる。 増殖菌体、休止菌体を問わず反応温度は通常20
〜40℃であるが、28〜37℃付近が最適である。 反応液（緩衝液、培地など）のPHは通常５〜10
に調整されるが、６〜９が好ましい。 菌濃度が低いと、この転換反応は進まないの
で、C.属菌の濃度は１×10⁹／ml以上、のぞまし
くは１×10¹⁰／ml以上になるよう調整するか、培
養する事がのぞましい。 本発明方法の原料である4ADは培地と共に殺菌
したり、また培養開始後、培地に添加してもよ
い。また分割添加も可能である。この場合、乾燥
殺菌あるいは湿熱殺菌後そのまま添加するか、あ
るいはジメチルホルムアミド、メタノール等の溶
媒に溶解して溶液として添加するか、あるいは超
音波処理により微細に分散懸濁液として添加す
る。その際、界面活性剤を同時に添加すると4AD
の分散がより促進される場合が多い。 転換に要する時間は、菌濃度、温度、PHなどに
より一律には云いがたいが、通常７日以内、早い
ときは１〜２日で反応停止した方がよい場合が多
い。通常生成した９α―OH―4ADは時間が経過
しすぎるとさらに分解を受けて減少するので、そ
の生成量を時間と共に定量し、減少しはじめたら
熱殺菌、酸・アルカリ添加、有機溶媒添加などに
より停止する必要がある。 4ADから９α―OH―4ADに転換する酵素、即
ち９α位水酸化酵素は、一般に誘導酵素と考えら
れるから、C.エクイの種培養の段階で少量の
4ADを添加し、酵素を誘導しておいた方がのぞま
しい。 転換反応終了後、培養液中等に生成した９α―
OH―4ADは既知の方法で採取、分離精製されう
る。例えば、培養液から９α―OH―4ADを数培
量の酢酸エチルなどの水と混和しにくい有機溶媒
で抽出し、抽出液から溶媒を留去させたのち、得
られた粗９α―OH―4ADは多孔性樹脂、シリカ
ゲル、アルミナ等を吸着剤とし、石油エーテル、
ベンゼン、クロロホルム、エーテル、アセトン、
メタノール、酢酸エチル等を溶離剤とするカラム
クロマトグラフイーにより、９α―OH―4ADの
分解物、基質4AD、他のステロイド等から分離さ
れうる。 しかし、通常９α―OH―4ADが主体となす場
合は、クロマト操作する事なく、アセトン、ヘキ
サン、シクロヘキサンなどに溶解させて再結晶を
繰り返せば９α―OH―4ADの純結晶を得る事が
できる。 本発明方法で基質として用いられる4ADは、通
常はステロール類を基質にして、微生物により生
産されるものである。4ADは、前述したように単
離したものを基質としてもよいが、またステロー
ル類を基質にして、微生物により生産された反応
液をそのまま用いてもよい。 次に4AD生産微生物により、ステロール類より
4ADを生産させ、これにC.エクイを接種して９
α―OH―4ADを培地中に生成させる方法につい
て詳述する。 先ずステロール類より4ADを生産させるのに用
いられる微生物は既知の4AD生産菌ならいずれで
もよい。そのような微生物としては、例えばミコ
バクテリウム パラフオーツイタムコンプレツク
スMCI―0807号菌（昭和53年４月17日付特許出願
「アンドロストー４―エン―３，17―ジオンの製
造方法」参照）、同MCI―0801号菌、同MCI―
0802号菌（特願昭52―124188号明細書参照）、ノ
カルデイア アリエナMCI―0710号菌、同MCI―
0711号菌（特願昭52―133225号明細書参照）、ミ
コバクテリウム フオーツイタムNRRLB―8153
号菌（特開昭52―105289号公報参照）、ミコバク
テリウムスピーシズNRRL Ｂ―3805号菌（米国
特許第3759791号明細書参照）、同NRRL―Ｂ―
3683号菌（米国特許3684657号明細書参照）など
の4ADの生産突然変異株が知られている。4AD生
産には必ずしも突然変異株を使用する必要はな
い。例えば特開昭49―25192号公報に示されるよ
うに、デヒドロエピアンドロステロン（以下
DHAと略す）を原料としてアースロバクター・
シンプレツクスIAN 1660号菌のような非突然変
異株を使用して4ADを緩衝液中ないしは培地中に
製造させたものでもよい。 ここでステロール類とは各種ステロールまたは
それらの酸化中間体を総合してステロール類と称
す。各種ステロールとはペルヒドロシクロペンタ
ノフエナントレン核のＣ―３位にヒドロキシル基
を、通常Ｃ―５位に二重結合を、Ｃ―17位に炭素
数８ないし10個の鎖式の側鎖を有し、場合によつ
てはＣ―７、Ｃ―８、Ｃ―９（11）等に二重結合
を有してもよい。 このような各種ステロールとしては、コレステ
ロール、スチグマステロール、カンペステロー
ル、β―シトステロール、エルゴステロール、ブ
ラツシカステロール、フコステロール、ラノステ
ロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロ
ール、ジヒドロアグノステロール、α―シトステ
ロール等が挙げられる。好ましいステロールはコ
レステロール、カンペステロール、スチグマステ
ロールおよびシトステロールである。 魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油、さ
らに植物油の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール
油などのステロール含有天然物および加工物も同
様に原料として使用される。 さらに各種ステロールの酸化中間体も基質とし
て使用される。このような酸化中間体としては各
種ステロールの４―エン―３―オン又は１，４―
ジエン―３―オン誘導体等が挙げられるが、具体
的には、たとえば、コレスト―４―エン―３―オ
ン、コレスタ―１，４―ジエン―３―オン、コレ
スタ４，22―ジエン―３―オン、22，23―ビスノ
ルコラ―５―コレニツクアシツド―３―β―ol，
22，23―ビスノルコル―４―エン―３―オン―22
―オイツクアシツド、プレグネノロン、プロゲス
テロン、DHA等である。 培養方法は4AD生産をさせている間は4AD生産
菌の最適の条件で培養し、C.エクイを接種した
後は、C.エクイの最適条件で培養した方がのぞ
ましい。従つて4AD醗酵中にPHが極端にかたよつ
た場合などには、C.エクイの接種時に、酸・ア
ルカリを添加する事によりPHを７付近に調整しな
おしてもよいし、その方が良い場合が多い。 C.エクイを接種する時期は、通常4AD生産が
始まつたばかりの時に行なうより、むしろ4AD生
産が最高値に近くなつてから行なつた方が結局９
α―OH―4AD生産量が多くなる。 C.エクイの接種の際、4AD醗酵を熱処理など
で必ずしも停止する必要はない。4AD醗酵が未だ
進んでいるところへC.エクイを接種し、そのま
ま両菌が混合培養されている状態でも4ADから９
α―OH―4ADが多量生産される。 このように二段培養が可能であるが、培地に関
しては4AD生産菌にとつて最適な培地で4AD生産
醗酵を行ない、それに通常は新成分を加える必要
なく、C.エクイを接種して９α―OH―4ADを生
成させて何らさしつかえない。ただ4AD醗酵後
C.エクイの十分な生育には栄養不十分と思われ
る時には、C.エクイ接種の前後に肉エキス、脱
脂大豆、NH₄NO₃などの新成分を殺菌して培養液
に添加してもよい。 4AD生産醗酵に用いる培地は、4AD生産菌とし
て何れを使うかによつて異なるが、原則として
C.エクイ用の培地として前述した培地成分がす
べて使用可能である。 C.エクイの培養液の接種量は対4AD生産菌培
養液あたり通常0.1〜30％位でのぞましくは１〜
15％である。 本発明の生産物９α―OH―4ADは各種ステロ
イド類製造の中間体として重要な意義をもつ物質
である。本物質から各種性ホルモンに誘導しうる
ばかりでなく、９α位に水酸基を有するが故に、
微生物反応によらず有機化学反応で容易に11β位
に高収率で水酸基を導入し得るという大きな優位
点を有する。それ故本物質は通常11β位に水酸基
を有するコルチコイド（副賢皮質ホルモン）の製
造原料として重要な物質である。 本発明によれば９α―OH―4ADを培地中に例
えば最高0.5％以上という高濃度で生成させる事
ができる。またステロールから4AD、4ADから９
α―OH―4ADの二段の反応を醗酵法で有利に行
うことにより、安価なステロール類より９α―
OH―4ADを安価に生成することを可能にした。 以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例に限定されない。なお、以下の実施例におい
て、９α―OH―4AD、および他のステロイドの
定量は、ガスクロマトグラフイーにより行なつ
た。また以下の実施例において、パーセントは重
量による。 実施例 １ グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、食塩0.5％および水よりなる種培地（PH7.0）
を、500ml肩付コルベンに100ml分注し、120℃、
20分間蒸気殺菌する。これにC.エクイ（equi）
ATCC21329号菌を１白金耳接種し、30℃で120往
復／分、振幅７cmの往復振盪機で52時間培養す
る。この種培養液４mlを、綿実粕4.0％、酵母1.5
％、大豆油1.5％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.1ｇおよび水よりなる本培養培地
50ml（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む
500ml肩付きフラスコ１本に接種する。本培養は
30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で
行い、培養開始後30時間目に殺菌済4AD（粉末）
1.5ｇを無菌的に添加する。その後さらに培養を
続け、4AD添加後64時間で培養を停止し、培養液
を200mlの酢酸エチルで抽出する。この抽出液中
の９α―OH―4ADをガスクロマトグラフイーで
分析した結果、509mgの９α―OH―4ADの存在
が確認された。原料4ADは殆ど存在しなかつたの
で、カラムクロマトグラフイーにかける事なく、
アセトン〜ヘプタン系より再結晶した結果、約
400mgの純９α―OH―4ADの結晶を得ることが
できた。 一方、前述と同じ組成でただ最初から1.5ｇの
4ADを含有した本培養培地50mlを500ml肩付フラ
スコ中で調製する。これを蒸気殺菌後、前述の種
培養を同量同時に接種する。これを途中に4ADの
添加することなく同一条件で培養した後、94時間
で培養を停止する。この培養液を200mlの酢酸エ
チルで抽出し、その中の９α―OH―4AD含量を
測定した結果、423mgの９α―OH―4ADの存在
する事が確認された。 実施例 ２ グルコース1.0％、肉エキス0.3％、ペプトン1.0
％、食塩0.5％、4AD0.02％および水よりなる種
培地（PH7.0）を500ml肩付コルベンに100ml分注
し、120℃、20分間蒸気殺菌する。これにC.エク
イ（equi）ATCC21329号菌を１白金耳接種し、
30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪機で48
時間培養する。この種培養をすべてあわせ、冷却
遠心分離にて菌を沈降させ集菌する。生理的食塩
水にて２回洗浄後、菌体を1.0％の4ADを含有す
る燐酸緩衝液（PH7.5、１／２０Ｍ）25mlに懸濁する。 この懸濁液25mlを500ml肩付フラスコ３本に入
れ、種培養と同一条件にて振盪する。７、12、27
時間振とう後、200mlの酢酸エチルで抽出し、抽
出液中の９α―OH―4AD含量を測定した結果を
表１にかかげる。一方種培地に4ADを添加せず種
培養し、その後は全く同様の事をくりかえした結
果を表１にあわせてかかげる。

【表】 実施例 ３ 実施例２と同様にしてC.エクイ（equi）
ATCC21329号菌を種培養した。この種培養２ml
を、脱脂大豆粉4.0％、糖蜜4.0％、酵母2.0％、
K₂HPO₄0.25％、MgSO₄・7H₂O0.1％、澱粉2.5
％、大豆油1.0％、4AD1.0％および水よりなる本
培養培地50mlを含む500ml肩付フラスコ（PH7.0、
120℃、20分間蒸気殺菌）に接種する。30℃、120
往復／分、７cm振幅の条件で培養し50時間で培養
を停止する。その後酢酸エチル200mlで全ての培
養液を抽出したところ、抽出液中に405mgの９α
―OH―4ADの存在が確認された。一方4ADを添
加しない同様組成の本培養培地50mlを含む500ml
肩付コルベン（PH7.0、120℃、20分間蒸気殺菌）
２本に上述の種培養液２mlずつを接種して培養を
開始し、30時間目に500mgの4ADをとかした２ml
のジメチルホルムアミドを各コルベンに添加し
た。その後さらに１本は41.5時間目に培養を停止
し、200mlの酢酸エチルで培養液を抽出したとこ
ろ抽出液中に400mgの９α―OH―4ADの存在を
確認した。他の１本は4AD添加後65.5時間培養し
た後、200mlの酢酸エチルで抽出したところ、９
α―OH―4AD量は既に減少し、275mgの９α―
OH―4ADが確認された。 実施例 ４ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコに分注し、120℃で15分間蒸気
殺菌後、ミコベクテリウム パラフオーツイタム
コンプレツクスMCI―0807号菌（微工研申請書
受理番号4476号）を１白金耳接種し、30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で48時間種培
養する。この種培養液２mlを丸大豆磨砕物4.0
％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄・
7H₂O0.1％、コレステロール1.0％および水から
なる本培養培地100mlを含む500ml肩付きフラスコ
（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）５本に接種す
る。本培養は30℃で、120往復／分、振幅７cmの
往復振盪条件で行う。培養開始後200時間目にPH
を無菌的に７付近に調整し、さらにここに実施例
１と同様にして種培養したC.equi ATCC21329号
菌８mlを接種する。接種後、同一振とう条件で30
℃で48時間培養を継続する。培養停止後培養液を
全て併せ、２の酢酸エチルで抽出し、抽出液中
のステロイド含量を測定した結果９α―OH―
4AD1.06ｇ、コレステロール0.35ｇ、4AD0.07
ｇ、20α―ヒドロキシ―プレグン―４―エン―３
―オン0.18ｇの存在が確認された。 実施例 ５ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付フラスコに分注し、120℃で15分間蒸気殺
菌後、ミコバクテリウム パラフオーツイタム
コンプレツクスMCI―0807号菌を１白金耳接種し
30℃で120往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で
48時間種培養する。この種培養液20mlを綿実粕
4.0％、酵母1.5％、大豆油1.0％、NaNO₃0.2％、
K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.01％、コレステ
ロール2.0％および水よりなる本培養地800ml（PH
7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）を含む６容肩付
フラスコ２本に接種する。本培養は30℃で100往
復／分、振幅７cmの往復振盪条件で行い、培養開
始後240時間目に１本は熱殺菌せずにPHを７付近
に調整し、それと同時に実施例２と同様にして種
培養したC.equi ATCC 21329号菌を50ml接種す
る。もう１本は120℃、30分の蒸気殺菌を施し、
冷却後、直ちにPHを７付近に調整後、同じC.equi
ATCC21329号菌の種培養を50ml接種する。接種
後同時２本のフラスコの培養を再開する。再開後
69.5時間で培養を中止し、各々のフラスコの培養
液を2.4の酢酸エチルで抽出した結果、C.equi
接種前熱殺菌した方は2.42ｇ、熱殺菌しない方は
2.88ｇの９α―OH―4ADが生成していた。 実施例 ６ グリセロール2.0％、丸大豆磨砕物2.0％、酵母
エキス1.0％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％および
水よりなる種培地（PH7.2に調整）100mlを含む
500ml肩付コルベンを120℃、20分間蒸気殺菌す
る。これにミコバクテリウム パラフオーツイタ
ム コンプレツクスMCI―0807号菌を１白金耳接
種する。接種後、30℃で120往復／分、振幅７cm
の往復振盪条件で68時間種培養する。この種培養
液４mlを脱脂大豆磨砕物4.0％、酵母1.5％、大豆
油1.0％、NH₄NO₃0.1％、MgSO₄0.1％、
K₂HPO₄0.1％花王アトラス社製ノニオン界面活性
剤商標“Tween―60”0.05％、表２のステロール
類2.0％および水よりなる本培養培地50mlに接種
する。接種後30℃で120往復／分、７cm振幅の条
件で培養する。240時間培養後、実施例２と同様
にして培養したC.エクイ（equi）ATCC21329号
菌の種培養液４mlを接種する。同時にNH₄NO₃50
mg、酵母エキス200mgを含んだ殺菌水５mlを添加
する。そしてPHを７付近に調整する。このあとさ
らに48時間培養を継続し48時間目に培養を停止
し、200mlの酢酸エチルで培養液からステロイド
を抽出する。この抽出液中の９α―OH―4ADの
量を表２にかかげる。

【表】 実施例 ７ グルコース1.0％、肉エキス1.0％、ペプトン1.0
％および水よりなる種培地（PH7.2）100mlを500
ml肩付きフラスコ２本に分注し、120℃で15分間
蒸気殺菌後、N.アリエナMCI―0710号菌（微工研
菌寄第4075号）およびMCI―0711号菌（微工研菌
寄第4076号菌）を夫々１白金耳接種し30℃で120
往復／分、振幅７cmの往復振盪条件で72時間種培
養する。この種培養液２mlを夫々丸大豆磨砕物
6.0％、グリセリン4.0％、K₂HPO₄0.15％、
NaNO₃0.2％、MgSO₄・7H₂O0.01％、コレステロ
ール1.0％、および水よりなる本培養培地(A)100ml
（PH7.0、120℃、20分間蒸気殺菌）を含む500ml肩
付フラスコ５本ずつに接種する。 本培養は30℃で120往復／分、振巾７cmの往復
振盪条件で行い、培養開始後180時間目に培養液
のPHを７付近に調整し、実施例２と同様に培養し
たC.エクイ（equi）ATCC21329号菌の種培養液
を１mlずつ接種する。接種後さらに24時間同じ振
とう条件で培養を継続する。その後培養液を５本
ずつ併せて２の酢酸エチルで抽出する。MCI―
0710号菌の抽出液中に９α―OH―4ADが240mg
生成されていた。一方MCI―0711号菌の抽出液中
には９α―OH―4ADが180mg生成されていた。 実施例 ８ グルコース1.0％、肉エキス0.5％、ペプトン0.5
％およびNaCl0.5％よりなる種培地（PH7.2）100
mlを500ml肩付きフラスコに分注し120℃で15分間
蒸気殺菌後、ミコバクテリウム スピーシーズ
NRRL Ｂ―3805号菌を１白金耳接種し30℃で120
往復／分、振巾７cmの往復振盪機上で48時間種培
養する。この種培養液２mlをコレステロール0.8
％、酵母エキス0.1％、肉エキス0.3％、ペプトン
0.5％、丸大豆磨砕物4.0％およびタロー油脂0.5％
からなる本培養培地50mlを含む500ml肩付フラス
コ（PH7.0、120℃で20分間蒸気殺菌）に接種す
る。本培養は種培養と同じ条件で培養する。150
時間目に実施例２と同様にして種培養したC.エ
クイ（equi）ATCC21329号菌の種培養液１mlを
接種する。接種後55時間目に200mlの酢酸エチル
で抽出したところ抽出液中に９α―OH―4ADが
122mg存在していた。 実施例 ９ グルコース1.0％、麦芽エキス0.3％、酵母エキ
ス0.3％、ペプトン0.5％、K₂HPO₄0.2％、
Na₂HPO₄0.2％および水よりなる種培地50ml容肩
付フラスコ（PH7.0、120℃、20分間殺菌）２本に
夫々アースロバクターシンプレツクス
（Arthrobaeter simplex）IAM1660号菌およびブ
レビバクテリウム リポリチカム
（Brevibacterium lipolyticum）IAM1398号菌を
接種し、30℃、120往復／分、７cm振幅の振盪条
件において24時間培養する。この培養液５mlを、
500mgのDHAおよび１／３０Ｍリン酸緩衝液50ml（PH 7.0）を含有する500ml肩付フラスコ（110℃、５
分間蒸気殺菌）に接種し、30℃で116時間、120往
復／分、７cm振幅の条件で振盪した。その後120
℃、20分間殺菌した。この段階で少量のサンプリ
ング結果から、緩衝液全量中にブレビバクテリウ
ム菌でDHA170mg、4AD301mg、アンドロスター
１，４―ジエン―３，17―ジオン（ADDと略
す）17mg、アースロバクター菌でDHA194mg、
4AD273mg、ADD13mg存在していたのが確認され
た。殺菌後の液に、実施例２と同様にして種培養
したC.エクイ（equi）ATCC21329号菌を４mlず
つ接種する。接種後30℃で38時間同じ振盪条件で
９α―OH―4ADへの転換を行なわせる。38時間
後に200mlの酢酸エチルでステロイドを抽出す
る。その結果、ブレビバクテリウム菌の抽出液中
に240mg、アースロバクター菌の抽出液中に220mg
の９α―OH―4ADが存在していた。 実施例 10 実施例１に於て、微生物として、C.エクイ
（equi）ATCC21329号菌に代えて、C.エクイ サ
ブスピーシーズ・ムシラギノーサス（C.equi
subsp.mucilaginosus）ATCC21521号菌を用いた
事を除いては、実施例１を繰り返す。 その結果、4ADを途中添加した場合は470mgの
９α―OH―4AD、一方、4ADを培地作成時に添
加した場合は505mgの９α―OH―4ADが培養液
抽出液（酢酸エチル200ml）中に存在している事
が確認された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アンドロスト―４―エン―３，17―ジオン
   （以下4ADと略す）を基質としてコリネバクテリ
   ウム・エクイに属する微生物を用い、９α―ヒド
   ロキシ―アンドロスト―４―エン―３，17―ジオ
   ンを製造することを特徴とする９α―ヒドロキシ
   ステロイドの製造方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の方法において、
   微生物がコリネバクテリウム・エクイ
   ATCC21329号菌であることを特徴とする方法。 ３ 特許請求の範囲第１項ないしは第２項のいず
   れかに記載の方法において、4ADがステロール類
   を基質にして微生物により生産されたものである
   ことを特徴とする方法。 ４ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がミコバクテリウム属に属
   する4AD生産突然変異株であることを特徴とする
   方法。 ５ 特許請求の範囲第４項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がミコバクテリウム・パラ
   フオーツイタム・コンプレツクスに属する4AD生
   産突然変異株であることを特徴とする方法。 ６ 特許請求の範囲第５項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がミコバクテリウム・パラ
   フオーツイタム・コンプレツクスMCI―0807号菌
   であることを特徴とする方法。 ７ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がノカルデイア属に属する
   4AD生産突然変異株であることを特徴とする方
   法。 ８ 特許請求の範囲第７項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がノカルデイア・アリエナ
   に属する微生物であることを特徴とする方法。 ９ 特許請求の範囲第８項記載の方法において、
   4ADを生産する微生物がノカルデイア・アリエナ
   MCI―0710号菌であることを特徴とする方法。 １０ 特許請求の範囲第８項記載の方法におい
   て、4ADを生産する微生物がノカルデイア・アリ
   エナMCI―0711号菌であることを特徴とする方
   法。 １１ 特許請求の範囲第３項ないしは第１０項の
   いずれかに記載の方法において、ステロール類が
   ステロール、そのＣ―３エステル誘導体、Ｃ―３
   エーテル誘導体またはそれらの酸化中間体からな
   る群から選ばれたものであることを特徴とする方
   法。 １２ 特許請求の範囲第１項ないしは第１１項の
   いずれかに記載の方法において、使用するコリネ
   バクテリウム属に属する微生物をあらかじめ4AD
   含有培地にて培養し、酵素誘導をした後に使用す
   ることを特徴とする方法。