JPH01216964A - 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法 - Google Patents
新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法Info
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- JPH01216964A JPH01216964A JP63041375A JP4137588A JPH01216964A JP H01216964 A JPH01216964 A JP H01216964A JP 63041375 A JP63041375 A JP 63041375A JP 4137588 A JP4137588 A JP 4137588A JP H01216964 A JPH01216964 A JP H01216964A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般式［Ｉ）
（式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
リン誘導体、及びそれを基質として用いることを特徴と
する血清コリンエステラーゼ活性の測定法に関する。
リン誘導体、及びそれを基質として用いることを特徴と
する血清コリンエステラーゼ活性の測定法に関する。
本発明の新規コリン誘導体を用いる測定法は、血清コリ
ンエステラーゼ活性を正確かつ簡便に測定することがで
き、血清中のコリンエステラーゼを測定するための臨床
検査用測定法として極めて− 有用である。
ンエステラーゼ活性を正確かつ簡便に測定することがで
き、血清中のコリンエステラーゼを測定するための臨床
検査用測定法として極めて− 有用である。
３．２ 従来の技術
−膜内に、例えば肝障害を有する患者の血清中のコリン
エステラーゼ（以下ＣｈＥと記す）１１度は低下し、他
方、例えば腎障害を有する患者のＣｈＥ１度は上昇する
ことが知られている。従って、これら思考の血清中のＣ
ｈＥ活性を測定することにより、これら疾患の診断がｒ
ｉｌ能であり、血清中のＣｈＥ活性を正確に測定できる
測定法は臨床検査に使用し得る。
エステラーゼ（以下ＣｈＥと記す）１１度は低下し、他
方、例えば腎障害を有する患者のＣｈＥ１度は上昇する
ことが知られている。従って、これら思考の血清中のＣ
ｈＥ活性を測定することにより、これら疾患の診断がｒ
ｉｌ能であり、血清中のＣｈＥ活性を正確に測定できる
測定法は臨床検査に使用し得る。
従来、血清中のＣｈＥ活性の測定法としては、合成基質
を使用する種々の方法が報告され、ま々日常の臨床検査
に実用化されているものもある。
を使用する種々の方法が報告され、ま々日常の臨床検査
に実用化されているものもある。
それら測定法の例をあげると、ガス分析法、ｐＨメータ
ー法、ｐＨ指示薬比色法、チオコリン発色法、酵素法、
ＵＶ法等がある。
ー法、ｐＨ指示薬比色法、チオコリン発色法、酵素法、
ＵＶ法等がある。
ａ）、ガス分析法（Ｒ，Ａｉｍｏｎ： Ｐｆｌｕｇｅｒ
ｓ Ａｒｃｈ。
ｓ Ａｒｃｈ。
Ｇｅｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ、、 ２３３．４８７ （１９
３３） ）は合成基質としてアセチルコリンを用い、Ｃ
ｈＥの酵素作用で生成した酢酸により炭酸水素ナトリウ
ムから発生する炭酸ガスを定量する方法である。
３３） ）は合成基質としてアセチルコリンを用い、Ｃ
ｈＥの酵素作用で生成した酢酸により炭酸水素ナトリウ
ムから発生する炭酸ガスを定量する方法である。
ｂ）、ｐＨメーター法（Ｈ，０，Ｈｉｃｈｅｌ ： Ｊ
、 Ｌａｂ、 ＆Ｃｌ１ｎ、 Ｗｅｄ、、 ３４．１５
６４ （１９４９） ）もガス分析法と同様に、合成基
質としてアセデルコリンを用い、ＣｈＥの酵素作用によ
って生じた酢酸によるｐＨの変化をｐＨメーターで測定
する方法である。
、 Ｌａｂ、 ＆Ｃｌ１ｎ、 Ｗｅｄ、、 ３４．１５
６４ （１９４９） ）もガス分析法と同様に、合成基
質としてアセデルコリンを用い、ＣｈＥの酵素作用によ
って生じた酢酸によるｐＨの変化をｐＨメーターで測定
する方法である。
Ｃ）、ｐＨ指示薬比色法はｐＨメーター法とは異なり、
合成基質としてアセチルコリンを用い、ＣｈＥにより生
じた酢酸によるｐＨの変化を、指示薬の分子吸光度によ
り測定する方法で、指示薬としてフェノールレッド〔高
橋浩、柴田進：医学と生物学、２追、９６．（１９５１
））、ブロムチモールブルー（Ｈ，Ｇ、 Ｂ１ｎ５ ｅ
ｔ ａｌ ： Ａｍｅｒ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
合成基質としてアセチルコリンを用い、ＣｈＥにより生
じた酢酸によるｐＨの変化を、指示薬の分子吸光度によ
り測定する方法で、指示薬としてフェノールレッド〔高
橋浩、柴田進：医学と生物学、２追、９６．（１９５１
））、ブロムチモールブルー（Ｈ，Ｇ、 Ｂ１ｎ５ ｅ
ｔ ａｌ ： Ａｍｅｒ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
Ｐａｔｈ、、３０．１８１ （１９５８））、ｍ−ニト
ロフェノール〔佐々木匡秀：臨床病理、１２．５５５
（１９６４））などが使用されている。
ロフェノール〔佐々木匡秀：臨床病理、１２．５５５
（１９６４））などが使用されている。
ｄ）、チオコリン法（Ｐ、 Ｇａｒｒｙ： Ｊ、 Ｃｌ
１ｎ、 Ｃｈｅｗ、。
１ｎ、 Ｃｈｅｗ、。
エユ、＋２）、９１ （１９６５））は基質としてアセ
チルチオコリン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリ
ン等が使用されている。これら基質はＣｈＥの酵素作用
でチオコリンを生成し、それが５．５′−ジチオビス−
２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して黄色を生じ
る。この黄色の吸光度を比色計で測定する方法である。
チルチオコリン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリ
ン等が使用されている。これら基質はＣｈＥの酵素作用
でチオコリンを生成し、それが５．５′−ジチオビス−
２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して黄色を生じ
る。この黄色の吸光度を比色計で測定する方法である。
ｅ）、酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明他；臨床病
理、■、７５１ （１９７７））とオルソトルオイルコ
リン（特開昭５４−１３８５３３）などを基質として用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼよりベタインに変化させ、その時生成する過酸化
水素の作用により、ペルオキシダーゼの存在下で４−ア
ミノアンチピリンをフェノールなどと酸化的縮合反応さ
せて発色させる方法である。
理、■、７５１ （１９７７））とオルソトルオイルコ
リン（特開昭５４−１３８５３３）などを基質として用
い、ＣｈＥの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼよりベタインに変化させ、その時生成する過酸化
水素の作用により、ペルオキシダーゼの存在下で４−ア
ミノアンチピリンをフェノールなどと酸化的縮合反応さ
せて発色させる方法である。
「）、ＵＶ法には２種類があり、１つは−、 ＫａｌＯ
Ｗのベンゾイルコリン（Ｗ、 Ｋａｌｏｗ ａｎｄに、
Ｇｅｎｅｔ ；Ｃａｎａｄ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ＆ Ｐｈｙｏｉｏｌ、 、 ３５ 、３３９（１９
５７））を基質とする方法であり、もう１つはｐ−ヒド
ロキシベンゾイルコリン〔特開昭５７−１１０１９８、
特開昭５８−１２９９９９）を基質とする方法である。
Ｗのベンゾイルコリン（Ｗ、 Ｋａｌｏｗ ａｎｄに、
Ｇｅｎｅｔ ；Ｃａｎａｄ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 ＆ Ｐｈｙｏｉｏｌ、 、 ３５ 、３３９（１９
５７））を基質とする方法であり、もう１つはｐ−ヒド
ロキシベンゾイルコリン〔特開昭５７−１１０１９８、
特開昭５８−１２９９９９）を基質とする方法である。
前者はＣＩ−ＩＥの酵素作用によって基質が加水分解し
、その基質が減少するのを測定波長２４Ｏｎ−で追跡し
ていく方法である。後者は、ＣｈＥの酵素作用によって
生成するｐ−ヒト０キシ安息香酸を、補酵素Ｎ Ａ Ｄ
Ｐ Ｈの存在下でｐ−ヒトＯキシ安息香酸水酸化酵素
の酵素作用に付し、その−時にＮＡＤＰＨが酸化されＮ
ＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長３４０ｎ−で
測定追跡する方法である。
、その基質が減少するのを測定波長２４Ｏｎ−で追跡し
ていく方法である。後者は、ＣｈＥの酵素作用によって
生成するｐ−ヒト０キシ安息香酸を、補酵素Ｎ Ａ Ｄ
Ｐ Ｈの存在下でｐ−ヒトＯキシ安息香酸水酸化酵素
の酵素作用に付し、その−時にＮＡＤＰＨが酸化されＮ
ＡＤＰに変化する際の吸光度の減少を波長３４０ｎ−で
測定追跡する方法である。
３．３ 発明が解決しようとする問題点これらの測定
法には種々の問題点があり、測定値の不正確さの原因に
なっている。即ち、例えばガス分析法（２）、ｐＨメー
ター法（ハ）は、操作が煩雑で多数の検体を処理するこ
とができないなど実用上の問題がある。ｐＨ指示薬比色
法（ハ）は、操作も簡便で多数の検体を処理することも
できるが、反応時間が長く、反応中にもＤＨが一定でな
く、低値と高値で再現性があまり良くないなどの欠点が
ある。
法には種々の問題点があり、測定値の不正確さの原因に
なっている。即ち、例えばガス分析法（２）、ｐＨメー
ター法（ハ）は、操作が煩雑で多数の検体を処理するこ
とができないなど実用上の問題がある。ｐＨ指示薬比色
法（ハ）は、操作も簡便で多数の検体を処理することも
できるが、反応時間が長く、反応中にもＤＨが一定でな
く、低値と高値で再現性があまり良くないなどの欠点が
ある。
また上述した（２）〜（ロ）の方法は、いずれもアセチ
ルコリンを基質として用いる方法であり、アセチルコリ
ンは非酵素的加水分解を起しやすく、また基質特異性も
あまりないので、基質そのものに問題がある。
ルコリンを基質として用いる方法であり、アセチルコリ
ンは非酵素的加水分解を起しやすく、また基質特異性も
あまりないので、基質そのものに問題がある。
チオコリン法ゆは反応性に優れ、感度が高く、操作も簡
単で多数の検体を処理することができるとともに初速文
法でも測定できるなど優れた点もあるが、呈色が黄色で
あるため血清中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなチオール基を有する化合物の影響も
まぬがれえないし、さらにｌ’Ｆｔそのものが不安定で
あり、測定値の誤差原因になっている。
単で多数の検体を処理することができるとともに初速文
法でも測定できるなど優れた点もあるが、呈色が黄色で
あるため血清中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなチオール基を有する化合物の影響も
まぬがれえないし、さらにｌ’Ｆｔそのものが不安定で
あり、測定値の誤差原因になっている。
酵素法（ｅ）は呈色が赤色になるので、血清中のビリル
ビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処理することも
できるが、発色系の試薬として使用するフェノールや４
−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮抗阻害作用を
有するので、それらの使用量が非常に限定され、十分な
発色が難しい。またこれらの酵素法は過酸化水素を利用
する方法であり、一般に過酸化水素を経由する定量法は
血清中のビリルビンヤアスコルビン酸などの還元性物質
による影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解などで
生じるコリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを基質
として用いた酵素法の場合は、非酵素的加水分解も問題
になっているなど種々問題がある。
ビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処理することも
できるが、発色系の試薬として使用するフェノールや４
−アミノアンチピリンがＣｈＥに対して拮抗阻害作用を
有するので、それらの使用量が非常に限定され、十分な
発色が難しい。またこれらの酵素法は過酸化水素を利用
する方法であり、一般に過酸化水素を経由する定量法は
血清中のビリルビンヤアスコルビン酸などの還元性物質
による影響はまぬがれえないし、リン脂質の分解などで
生じるコリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを基質
として用いた酵素法の場合は、非酵素的加水分解も問題
になっているなど種々問題がある。
ＵＶ法（ｒ）でベンゾイルコリンを基質として使用する
縁、にａｌｏｗの方法は直接基質の減少を測定している
ので測定原理は単純明快であるが、測定波長が２４０ｎ
ｍであるため血清成分の干渉を受けやすく、ベンゾイル
コリンの非酵素的加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの
至適ｐＨで反応が行われていない。また測定波長として
基質の吸収曲線のスロープの所が使われており、これに
より波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなるなど
問題がある。
縁、にａｌｏｗの方法は直接基質の減少を測定している
ので測定原理は単純明快であるが、測定波長が２４０ｎ
ｍであるため血清成分の干渉を受けやすく、ベンゾイル
コリンの非酵素的加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの
至適ｐＨで反応が行われていない。また測定波長として
基質の吸収曲線のスロープの所が使われており、これに
より波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなるなど
問題がある。
ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを基質とするＵＶ法は
、はぼ至適、ＤＨで反応が行えるし、過酸化水素−発色
系における欠点を除くことができ、チオコリン法の欠点
もな（、さらに多数の検体処理が可能な自動分析装置に
適した優れたＣｈＥ活性測定法であるが、使用する補酵
素ＮＡＤＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一
定の品質を維持および管理するのが雛しいし、また酵素
としてｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やプロトカテ
キュｌｌｌ−３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、
測定値の誤差要因が多い。
、はぼ至適、ＤＨで反応が行えるし、過酸化水素−発色
系における欠点を除くことができ、チオコリン法の欠点
もな（、さらに多数の検体処理が可能な自動分析装置に
適した優れたＣｈＥ活性測定法であるが、使用する補酵
素ＮＡＤＰＨは高価な試薬であり、安定性も悪いので一
定の品質を維持および管理するのが雛しいし、また酵素
としてｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やプロトカテ
キュｌｌｌ−３，４−ジオキシゲナーゼなどを使用し、
測定値の誤差要因が多い。
以上、述べたごとく、従来のＣｈＥの酵素活性測定法に
は種々の問題があり、測定値の誤差の原因になっている
。
は種々の問題があり、測定値の誤差の原因になっている
。
３．４ 問題を解決するための手段
我々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し本発明に到
達した。即ち、新規化合物である６−アセドキシメチル
ー２−ナフトイルコリンアイオダイド（以下ＡＭＮＣＩ
と略称する）を合成し、かかる化合物を基質として用い
るＵＶ法によるＣｈＥ活性測定について検討した所、測
定波長として約３３５〜約３５５ｎｉの波長を使用する
ことができ、非酵素的加水分解に対して極めて安定であ
り、血清中のＣｈＥ、特にプソイドコリンエステラーゼ
と特異的に反応し、従ってＡＭＮＣＩを用いることによ
り極めて正確に再現性よく血清中のＣｈＥ活性を測定す
ることが可能であり、その他種々の利点を有する測定が
可能になることを知見し本発明に到達した。
達した。即ち、新規化合物である６−アセドキシメチル
ー２−ナフトイルコリンアイオダイド（以下ＡＭＮＣＩ
と略称する）を合成し、かかる化合物を基質として用い
るＵＶ法によるＣｈＥ活性測定について検討した所、測
定波長として約３３５〜約３５５ｎｉの波長を使用する
ことができ、非酵素的加水分解に対して極めて安定であ
り、血清中のＣｈＥ、特にプソイドコリンエステラーゼ
と特異的に反応し、従ってＡＭＮＣＩを用いることによ
り極めて正確に再現性よく血清中のＣｈＥ活性を測定す
ることが可能であり、その他種々の利点を有する測定が
可能になることを知見し本発明に到達した。
即ち、本発明は一般式（Ｉ）
（式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
リン誘導体、及び該新規コリン誘導体を基質として用い
ることを特徴とするコリンエステラーゼ活性の測定法で
ある。
リン誘導体、及び該新規コリン誘導体を基質として用い
ることを特徴とするコリンエステラーゼ活性の測定法で
ある。
一般式（Ｉ）のＸとしては、例えば沃素、塩素、臭素、
フッ素などのハロゲン原子が挙げられる。
フッ素などのハロゲン原子が挙げられる。
かかる新規コリン誘導体は２．６−シメチルナフトイル
カルボキシレートを還元し６−ヒドロキシメチルナフト
イック酸を得、次いで６−ヒド０キシメチル基のヒドロ
キシ基をアセチル化し、２−ジメチルアミノエタノール
と反応せしめ、保護基を脱離した後、ヨウ化メチル等の
ハロゲン化メチルと反応することにより合成できる。
カルボキシレートを還元し６−ヒドロキシメチルナフト
イック酸を得、次いで６−ヒド０キシメチル基のヒドロ
キシ基をアセチル化し、２−ジメチルアミノエタノール
と反応せしめ、保護基を脱離した後、ヨウ化メチル等の
ハロゲン化メチルと反応することにより合成できる。
次に、新規コリン誘導体ＡＭＮＣＩを用いる本発明のＣ
ｈＥ活性の測定法について説明する。
ｈＥ活性の測定法について説明する。
第１図にＡＭＮＣＩ（２）と６−アセドキシメチルー２
−ナフトイック酸０のＵｖスペクトルを示した。ＡＭＮ
ＣＩがＣｈＥの作用で加水分解するとコリンと６−７セ
トキシメチルー２−ナフトイック酸を生成する。コリン
は波長３００ｎ−以上ではＵｖ膜吸収ない。６−アセド
キシメチルー２−ナフトイック酸は波長３３５ｎ−以上
ではＵ■吸収はほとんどない。一方、ＡＭＮＣＩは波長
３５５ ｎｌ以下でＵ■吸収する。したがって、ＵＶ法
によりＣｈＥ活性を測定する方法においてＡＭＮＣＩを
基質として使用し、測定波長３′３５から３５５ ｎｇ
＋で反応を追跡することができ、この場合他の血清成分
の干渉を受けることが少ない。従って基質のＡＭＮＣＩ
の減少を正確に追跡することができ、ＣｈＥ活性を正確
に測定することが可能である。
−ナフトイック酸０のＵｖスペクトルを示した。ＡＭＮ
ＣＩがＣｈＥの作用で加水分解するとコリンと６−７セ
トキシメチルー２−ナフトイック酸を生成する。コリン
は波長３００ｎ−以上ではＵｖ膜吸収ない。６−アセド
キシメチルー２−ナフトイック酸は波長３３５ｎ−以上
ではＵ■吸収はほとんどない。一方、ＡＭＮＣＩは波長
３５５ ｎｌ以下でＵ■吸収する。したがって、ＵＶ法
によりＣｈＥ活性を測定する方法においてＡＭＮＣＩを
基質として使用し、測定波長３′３５から３５５ ｎｇ
＋で反応を追跡することができ、この場合他の血清成分
の干渉を受けることが少ない。従って基質のＡＭＮＣＩ
の減少を正確に追跡することができ、ＣｈＥ活性を正確
に測定することが可能である。
また、後述する如＜、ＡＭＮＣＩは多くの優れた利点を
有する。
有する。
従って、−数式＋Ｉ）の新規コリン誘導体を用いたＣｈ
Ｅ活性測定払として、例えば次の測定法が提供される。
Ｅ活性測定払として、例えば次の測定法が提供される。
即ち、ＣｈＥを含む検体と一数式＋Ｉ）で表わされる新
規コリン誘導体とを混合し、次いで吸光度、特に波長約
３３５〜約３５５ ｒｖでの吸光度を測定することによ
りＣｈＥ活性を測定する方法である。
規コリン誘導体とを混合し、次いで吸光度、特に波長約
３３５〜約３５５ ｒｖでの吸光度を測定することによ
りＣｈＥ活性を測定する方法である。
前述の賛、にａｔｏｗのＵＶ法では測定波長が２４０ｎ
ｍであるので初期吸収において血清成分の干渉を大きく
受けるが、本発明の測定波長約３３５から約３５５１ｍ
ではあまり干渉を受けないので至適な測定条件が容易で
ある。また賛、にａｌｏｗのＵＶ法で基質として使用し
ているベンゾイルコリンは、１／１５ＭＩＪ：／酸緩衝
液ｐＨ７，４０中で２３０ ｎｍ附近に極大吸収をもら
、測定波長である２４０ｎｍではスロープである。これ
は波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなる。本発
明の新規基質ＡＭＮＣＩは３３５ ｎｍ附近に極大吸収
をもち、測定波長をピークに設定する事ができる。この
事は分析装四の波長精度の問題から発生する分子吸光係
数の違いなどが非常に小さくなり測定値の機種間差など
が非常に小さくなることを示している。
ｍであるので初期吸収において血清成分の干渉を大きく
受けるが、本発明の測定波長約３３５から約３５５１ｍ
ではあまり干渉を受けないので至適な測定条件が容易で
ある。また賛、にａｌｏｗのＵＶ法で基質として使用し
ているベンゾイルコリンは、１／１５ＭＩＪ：／酸緩衝
液ｐＨ７，４０中で２３０ ｎｍ附近に極大吸収をもら
、測定波長である２４０ｎｍではスロープである。これ
は波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなる。本発
明の新規基質ＡＭＮＣＩは３３５ ｎｍ附近に極大吸収
をもち、測定波長をピークに設定する事ができる。この
事は分析装四の波長精度の問題から発生する分子吸光係
数の違いなどが非常に小さくなり測定値の機種間差など
が非常に小さくなることを示している。
またベンゾイルコリンは、基質濃度５０μＨ以上では基
質阻害が生じて、十分な基質濃度で反応を行うことがで
きず、経時的直線範囲が狭く、高単位の活性まで測定す
ることができない。本発明の新規基質は、基質濃度３０
０μＨまで基質阻害が生じなく、反応系では十分な基質
濃度で反応を行うことができる。（第８図参照）。
質阻害が生じて、十分な基質濃度で反応を行うことがで
きず、経時的直線範囲が狭く、高単位の活性まで測定す
ることができない。本発明の新規基質は、基質濃度３０
０μＨまで基質阻害が生じなく、反応系では十分な基質
濃度で反応を行うことができる。（第８図参照）。
更に、この新規基質ＡＭＮＣＩは非酵素的加水分解に対
して非常に安定である。たとえばｐＨが８．０の２５０
■Ｈトリス−マレイン酸緩衝液中３７℃の条件下で６０
分間ではほとんど加水分解は起きなかった（第６図参照
）。この結果は測定中非酵素的加水分解は無視でき、正
確にＣｈＥ活性を測定することができることを示してい
る。
して非常に安定である。たとえばｐＨが８．０の２５０
■Ｈトリス−マレイン酸緩衝液中３７℃の条件下で６０
分間ではほとんど加水分解は起きなかった（第６図参照
）。この結果は測定中非酵素的加水分解は無視でき、正
確にＣｈＥ活性を測定することができることを示してい
る。
ｐＨを一定に保持するための緩衝剤として、バルビター
ル酸塩、リンＷｉ塩、ピロリン酸塩、グリシン、グリシ
ルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなど
が使用できる。上記以外の緩衝剤でもｐＨ７，５〜１０
．０の間において緩衝能を維持できるものであれば用い
ることが可能である。
ル酸塩、リンＷｉ塩、ピロリン酸塩、グリシン、グリシ
ルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなど
が使用できる。上記以外の緩衝剤でもｐＨ７，５〜１０
．０の間において緩衝能を維持できるものであれば用い
ることが可能である。
ＣｈＥに対するＡＭＮＣＩのに露値はベンゾイルコリン
と同程度で２５０＋ｅＨトリス−マレイン酸緩衝液（１
）Ｈ８，Ｏ）では約５Ｘ１０−”（１／２０ｘ１０−３
）霞０１／ｌである（第８図参照）。
と同程度で２５０＋ｅＨトリス−マレイン酸緩衝液（１
）Ｈ８，Ｏ）では約５Ｘ１０−”（１／２０ｘ１０−３
）霞０１／ｌである（第８図参照）。
ＡＭＮＣＩのに■値が十分小さいので、本発明の測 ゛
定法の反応系では十分な基質濃度で反応を行うことがで
き、経時的直線範囲が広くなり、高単位の活性まで十分
測定が可能である。
定法の反応系では十分な基質濃度で反応を行うことがで
き、経時的直線範囲が広くなり、高単位の活性まで十分
測定が可能である。
ＡＭＮＣＩを基質として用いた場合、２５０ｍＮトリス
−マレイン酸緩衝液ではＣｈＥの至適ｐＨは８．０附近
であった（第４図参照）。前述のごとく、ＡＭＮＣＩは
ｐＨ８，０で非酵素的加水分解安定性があるので、本発
明の測定法はＣｈＥの至適ｐＨで反応を行うことができ
る。
−マレイン酸緩衝液ではＣｈＥの至適ｐＨは８．０附近
であった（第４図参照）。前述のごとく、ＡＭＮＣＩは
ｐＨ８，０で非酵素的加水分解安定性があるので、本発
明の測定法はＣｈＥの至適ｐＨで反応を行うことができ
る。
ＣｈＥには血清中に存在するプソイドＣｈＥと赤血球中
に存在するツルーＣｈＥの二種が知られている。通常臨
床検査で測定されているのは血清中プソイドＣｈＥであ
るが、血清中にツルーＣｈＥが混入している場合がある
ので、検査目的としてはプソイドＣｈＥのみ選択的に反
応する基質が望ましい。本発明の方法に用いるＡＭＮＣ
ＩはプソイドＣｈＥとは良く反応するが、ツルーＣｈＥ
とはほとんど反応しない非常に特異性の高い基質である
。
に存在するツルーＣｈＥの二種が知られている。通常臨
床検査で測定されているのは血清中プソイドＣｈＥであ
るが、血清中にツルーＣｈＥが混入している場合がある
ので、検査目的としてはプソイドＣｈＥのみ選択的に反
応する基質が望ましい。本発明の方法に用いるＡＭＮＣ
ＩはプソイドＣｈＥとは良く反応するが、ツルーＣｈＥ
とはほとんど反応しない非常に特異性の高い基質である
。
本発明のＣｈＥＩ定法の具体的方法は、後述する実施例
に示されており、通常のＵＶ法の手順を採用することが
できる。
に示されており、通常のＵＶ法の手順を採用することが
できる。
３．５ 発明の効果
本発明のＣｈＥ活性測定法は種々の点で従来法の問題点
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。
（１） 測定系の反応機構が単純明快で、測定値の誤
差原因が非常に少ない。
差原因が非常に少ない。
＋２１ ピークの波長（３３５ｎｍ＞で測定可能であ
る。
る。
（３） 基質に用いる本発明のＡＭＮＣＩが非酵素的
加水分解に対し安定なので、測定値の再現性が非常に良
い。
加水分解に対し安定なので、測定値の再現性が非常に良
い。
（４１ＡＭＮＣＩはプソイドＣｈＥに対して、基質特異
性が高い。
性が高い。
（５） 検体ごとに検体ブランクをたてる必要がない
ので簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理するこ
とが可能である。
ので簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理するこ
とが可能である。
＋６１ Ａ Ｍ Ｎ ＣＩが安定なので、至適ｐＨ（
８，０〜８．２）での反応が可能である。
８，０〜８．２）での反応が可能である。
（Ｄ 基質阻害がなく、十分な基ｖ！濃度で反応するこ
とができる。
とができる。
（８） 高単位まで測定可能である。
以上のごとく、本発明のＣｈＥ活性測定法は従来法の有
する問題点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣＩ
−ＩＥ活性測定に充分貢献できるものである。従って本
発明のＣｈＥ活性測定法は、正常人、肝疾患患者、胃障
害を有する患者等の血清中のＣｈＥ活性を測定する方法
として、極めて有用である。
する問題点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨床検査のＣＩ
−ＩＥ活性測定に充分貢献できるものである。従って本
発明のＣｈＥ活性測定法は、正常人、肝疾患患者、胃障
害を有する患者等の血清中のＣｈＥ活性を測定する方法
として、極めて有用である。
３．６ 実施例
以下に実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれによって限定されるものではない。
、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１６−アセドキシメチルー２−ナフトイルコリン
アイオダイド（ＡＭＮＣＩ） の合成法 ２．６−ナフタレンジカルポ酸２１．６９と塩化チオニ
ル２８．５ｇとピリジン１滴を乾燥ベンゼン２０ＯＩＩ
Ｉｅ中で２時間還流を行い溶媒を濃縮して２，６−ナフ
トイルクロライド２３ＳＦを得る。
アイオダイド（ＡＭＮＣＩ） の合成法 ２．６−ナフタレンジカルポ酸２１．６９と塩化チオニ
ル２８．５ｇとピリジン１滴を乾燥ベンゼン２０ＯＩＩ
Ｉｅ中で２時間還流を行い溶媒を濃縮して２，６−ナフ
トイルクロライド２３ＳＦを得る。
これを乾燥メタノール５００ｄ中で２時間還流を行い沈
澱物を濾集し２．６−シメチルナフタレンジカルボキシ
レート１９５Ｆを得た。これを５０％１タノール５００
ＩＩｄｌに懸濁しＮａＢＨ４３０ｇを加え還元を行い６
−ヒドロキシメチル−２−ナフトイック酸１２ｇを得る
。これに無水酢酸１１．９ｄ！とｍ硫酸１滴を加え３０
分還流を行い６−アセドキシメヂルー２−ナフトイック
酸１０りを得る。
澱物を濾集し２．６−シメチルナフタレンジカルボキシ
レート１９５Ｆを得た。これを５０％１タノール５００
ＩＩｄｌに懸濁しＮａＢＨ４３０ｇを加え還元を行い６
−ヒドロキシメチル−２−ナフトイック酸１２ｇを得る
。これに無水酢酸１１．９ｄ！とｍ硫酸１滴を加え３０
分還流を行い６−アセドキシメヂルー２−ナフトイック
酸１０りを得る。
融点 １８８−１９０℃
元素分析値 Ｃ１４Ｈ１２０４（Ｉｌｌ、Ｗ、 ２４４
．２５０）実測値（％） Ｃ：６９．０３ Ｈ：
４．８３計算値（％） Ｃ：６８．８５ Ｈ：
４．９５６−アセドキシメチルー２−ナフトイック酸
８．４ｇと塩化チオニル５．４ｅとピリジン１滴を乾燥
トルエン１５０ａｔ中で３０分間還流し、冷却した後、
濾過を行い溶媒を減圧留去し、６−アセドキシメチルー
２−ナフトイルクロライド８．５ｇを得た。これを乾燥
トルエン５０ｄに溶解し、この溶液を、２−ジメチルア
ミノエタノール７ｍを乾燥トルエン１５０Ｍ１に溶解し
た液に５〜１０℃に冷却しながら滴下した。滴下後、室
温で一晩撹拌し、反応させた後、水及び飽和食塩水で洗
浄しトルエン相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶
媒を減圧留去し、８．５ｇの油状物を得た。これをアセ
トン２００ｄに溶解し、ヨウ化メチル３．７ｇの酢酸エ
チル５０ｍ溶液を加え冷却放置し、析出した結晶を濾集
し、アセトンで洗浄後五酸化リン上で真空乾燥し、６−
アセドキシメチルー２−ナフトイルコリンアイオダイド
（ＡＭＮＣＩ）１０．２ｇを得た。この結晶はシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノ−ル：酢酸：水
＝４：１：２）上で単一スポット（Ｒ，−０，３６）を
与えた。
．２５０）実測値（％） Ｃ：６９．０３ Ｈ：
４．８３計算値（％） Ｃ：６８．８５ Ｈ：
４．９５６−アセドキシメチルー２−ナフトイック酸
８．４ｇと塩化チオニル５．４ｅとピリジン１滴を乾燥
トルエン１５０ａｔ中で３０分間還流し、冷却した後、
濾過を行い溶媒を減圧留去し、６−アセドキシメチルー
２−ナフトイルクロライド８．５ｇを得た。これを乾燥
トルエン５０ｄに溶解し、この溶液を、２−ジメチルア
ミノエタノール７ｍを乾燥トルエン１５０Ｍ１に溶解し
た液に５〜１０℃に冷却しながら滴下した。滴下後、室
温で一晩撹拌し、反応させた後、水及び飽和食塩水で洗
浄しトルエン相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶
媒を減圧留去し、８．５ｇの油状物を得た。これをアセ
トン２００ｄに溶解し、ヨウ化メチル３．７ｇの酢酸エ
チル５０ｍ溶液を加え冷却放置し、析出した結晶を濾集
し、アセトンで洗浄後五酸化リン上で真空乾燥し、６−
アセドキシメチルー２−ナフトイルコリンアイオダイド
（ＡＭＮＣＩ）１０．２ｇを得た。この結晶はシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ブタノ−ル：酢酸：水
＝４：１：２）上で単一スポット（Ｒ，−０，３６）を
与えた。
融点 １８２〜１８４℃
元素分析値 ０１９Ｈ２４Ｎ Ｏ４１（Ｉｌ、Ｗ、 ４
５７．３１２ ）実測値（％） Ｃ： ４９．７２
Ｈ： ５．３６ Ｎ ： ３．０６計算値（Ｘ）
Ｃ： ４９．９０８ ： ５．２９ Ｎ ： ３
．０６Ｕ、Ｖ、スペクトルおよび１．Ｒスペクトルをそ
れぞれ第１図と第２図に示した。
５７．３１２ ）実測値（％） Ｃ： ４９．７２
Ｈ： ５．３６ Ｎ ： ３．０６計算値（Ｘ）
Ｃ： ４９．９０８ ： ５．２９ Ｎ ： ３
．０６Ｕ、Ｖ、スペクトルおよび１．Ｒスペクトルをそ
れぞれ第１図と第２図に示した。
実施例２
血清ＣｈＥ活性測定法
（１１２５Ｃ）ｇ＋Ｈトリス−マレイン酸緩衝液ＯＨ８
，０（２５℃） （り 検体 （３１１，３−Ｈ基質（ＡＭＮＣＩ ）液（１）の緩衝
液２．０ｍに検体０．１０ｄを加え２〜１０分間程分間
子℃で予加湿し、それに（３）の基質液０．５−を加え
、同時にストップウォッチをスタートさせ正確に２０秒
、８０秒の３３５ ｎｍにおける吸光度を測定し１分間
当りの吸光度変化を求める。第３図はタイムコースを示
した。
，０（２５℃） （り 検体 （３１１，３−Ｈ基質（ＡＭＮＣＩ ）液（１）の緩衝
液２．０ｍに検体０．１０ｄを加え２〜１０分間程分間
子℃で予加湿し、それに（３）の基質液０．５−を加え
、同時にストップウォッチをスタートさせ正確に２０秒
、８０秒の３３５ ｎｍにおける吸光度を測定し１分間
当りの吸光度変化を求める。第３図はタイムコースを示
した。
検体はコンセーラＩ（日永製薬社製）を使用した。Ｃｉ
Ｅ活性値は下記の式により計算される。
Ｅ活性値は下記の式により計算される。
１）ΔＱ、 Ｄ／ｗｉｎは測定波長３３５ ｎ１ｌｌに
おける１分間当りの吸光度の変化母。
おける１分間当りの吸光度の変化母。
２）波長３３５ｎｌにおける分子吸光係数は、１１９５
である。
である。
上式より使用した血清は４６１ （ＩＬＪ＃り単位であ
った。第３図に示したごとく、ＣｈＥ単位６９０（ＩＵ
／ｊ）では７分間経時的にタイムラグのない直線を示し
た。これは自動分析装置が使用可能なことを示している
。
った。第３図に示したごとく、ＣｈＥ単位６９０（ＩＵ
／ｊ）では７分間経時的にタイムラグのない直線を示し
た。これは自動分析装置が使用可能なことを示している
。
実施例３
実施例２の（１）の緩衝液のｐＨを７．６から８．４ま
で変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適ｐＨを求め
た。緩衝液のｐＨ以外は全て実施例２に従った。その結
果を第４図に示した。この条件下では至適ｐＨは８．０
であった。
で変化させ、この方法におけるＣｈＥの至適ｐＨを求め
た。緩衝液のｐＨ以外は全て実施例２に従った。その結
果を第４図に示した。この条件下では至適ｐＨは８．０
であった。
実施例４
実施例２の（１）の緩衝液濃度を５ＱｍＨから３００５
Ｍまで変化させ、この方法における最適緩ｌｌｌ１１度
を求めた。緩衝液の濃度以外は全て実施例２に従った。
Ｍまで変化させ、この方法における最適緩ｌｌｌ１１度
を求めた。緩衝液の濃度以外は全て実施例２に従った。
その結果を第５図に示した。この条件下では最適緩衝液
濃度は２００１Ｍから３００１８であった。
濃度は２００１Ｍから３００１８であった。
実施例５
実施例２の（１）の緩衝液２．０ａｅに（３）の基質液
０．５−を加え、３７℃の保温セルに入れ、波長３３５
ｎ■における吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非
酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６図に示
したごとく、６０分まではほとんど安定であった。基質
ＡＭＮＣＩは至適ｐＨ８，０において安定であるので、
検体ごとの試薬ブランクを測定する必要はない。
０．５−を加え、３７℃の保温セルに入れ、波長３３５
ｎ■における吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非
酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６図に示
したごとく、６０分まではほとんど安定であった。基質
ＡＭＮＣＩは至適ｐＨ８，０において安定であるので、
検体ごとの試薬ブランクを測定する必要はない。
実施例６
実施例２の測定法に従い、基質特異性を調べた。
検体として、プソイドＣｈＥ （シグマ社）１０Ｕ／ｄ
、 ツルーＣｈＥ （ジグｖ社）１０Ｕ／ａｎ使用した
。プソイドＣｈＥの吸光度の減少速度（ΔＥ／ｗｉｎ）
は０．０４７０、ツルーＣ１−ＩＥのそれは０．０００
５であった。反応性は、吸光度の減少速度から判断する
とプソイドＣｈＥ １に対してツルー〇ｈＥは約０．
０１であった。このことは、基ＷＡＭＮＣＩの特異性が
非常に高い事を示している。
、 ツルーＣｈＥ （ジグｖ社）１０Ｕ／ａｎ使用した
。プソイドＣｈＥの吸光度の減少速度（ΔＥ／ｗｉｎ）
は０．０４７０、ツルーＣ１−ＩＥのそれは０．０００
５であった。反応性は、吸光度の減少速度から判断する
とプソイドＣｈＥ １に対してツルー〇ｈＥは約０．
０１であった。このことは、基ＷＡＭＮＣＩの特異性が
非常に高い事を示している。
実施例７
実施例２に従い、血清の希釈率と酵素活性の関係を調べ
た（第７図）。血清希釈は５％アルブミンを含む生理食
塩水で行った。第７図に示したごとく、血清希釈と酵素
活性は原点を通過する直線的な比例関係にありＣｈＥ活
性が低単位から高単位まで幅広く測定できることが明ら
かになった。
た（第７図）。血清希釈は５％アルブミンを含む生理食
塩水で行った。第７図に示したごとく、血清希釈と酵素
活性は原点を通過する直線的な比例関係にありＣｈＥ活
性が低単位から高単位まで幅広く測定できることが明ら
かになった。
実施例８
実施例２の（３１の基質液を適宜希釈して用い、Ｌｉｎ
ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットより、本基質に対す
るにｍ値を求めたところ５×１０−５１１１０１／１で
あった（第８図）。このことから基質（ＱＣｈＥに対す
る親和性は高（、この反応系に十分な適応性を備えてい
ることが明らかになった。
ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットより、本基質に対す
るにｍ値を求めたところ５×１０−５１１１０１／１で
あった（第８図）。このことから基質（ＱＣｈＥに対す
る親和性は高（、この反応系に十分な適応性を備えてい
ることが明らかになった。
第１図はａ）ＡＭＮＣＩ（濃度１０ＣＩＨ）およびｂ）
６−アセドキシメチルー２−ナフトイック酸（１１度１
００μＨ）の２５０ｍ）ｌトリスルマレイン酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０（２５℃）中のＵ、■スペクトルを示す。 第２図はＡＭＮＣＩの１．Ｒスペクトルを示す。 第３図はＡＭＮＣＩを基質とした場合の血清中のＣｈＥ
活性によるタイムコースを示す。 第４図はＣｈＥの至適ｐＨを示す。 第５図はＣｈＥ活性におよぼすｔ１ｖｊ７ＩＨ１度の影
響を示す。 第６図はＡＭＮＣＩの非酵素的加水分解安定性を示す。 第７図は血清希釈と酵素活性との関係を示す。 第８図はＳ−ＶカーブとＬｔｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂｕ
ｒｋプロットを示す。
６−アセドキシメチルー２−ナフトイック酸（１１度１
００μＨ）の２５０ｍ）ｌトリスルマレイン酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０（２５℃）中のＵ、■スペクトルを示す。 第２図はＡＭＮＣＩの１．Ｒスペクトルを示す。 第３図はＡＭＮＣＩを基質とした場合の血清中のＣｈＥ
活性によるタイムコースを示す。 第４図はＣｈＥの至適ｐＨを示す。 第５図はＣｈＥ活性におよぼすｔ１ｖｊ７ＩＨ１度の影
響を示す。 第６図はＡＭＮＣＩの非酵素的加水分解安定性を示す。 第７図は血清希釈と酵素活性との関係を示す。 第８図はＳ−ＶカーブとＬｔｎｅｗｅａｖｅｒ −Ｂｕ
ｒｋプロットを示す。
Claims (2)
- （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
リン誘導体。 - （２）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
リン誘導体を基質として用いることを特徴とする血清コ
リンエステラーゼ活性の測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63041375A JPH0662521B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法 |
| US07/311,329 US4983756A (en) | 1988-02-24 | 1989-02-15 | Novel choline derivative and method for detemining serum cholinesterase activity using the same |
| DE3905861A DE3905861A1 (de) | 1988-02-24 | 1989-02-24 | Neues cholinderivat und verfahren zur bestimmung von serum-cholinesterase-wirksamkeit unter verwendung desselben |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63041375A JPH0662521B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01216964A true JPH01216964A (ja) | 1989-08-30 |
| JPH0662521B2 JPH0662521B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=12606666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63041375A Expired - Lifetime JPH0662521B2 (ja) | 1988-02-24 | 1988-02-24 | 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4983756A (ja) |
| JP (1) | JPH0662521B2 (ja) |
| DE (1) | DE3905861A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH11228587A (ja) * | 1998-02-12 | 1999-08-24 | Nippon Chem Ind Co Ltd | 光学活性なホスフィンオキシドカルボン酸及びその製造方法 |
| ATE331809T1 (de) | 1998-11-23 | 2006-07-15 | Proteome Sciences Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur schmerzbehandlung |
| US20070287991A1 (en) * | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Mckay William F | Devices and methods for detection of markers of axial pain with or without radiculopathy |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL142872C (ja) * | 1963-03-28 | |||
| JPS5337696A (en) * | 1976-08-26 | 1978-04-06 | Omnium Chimique Sa | Hexahydrocantinonee6 derivative |
| GB2096989B (en) * | 1978-04-17 | 1983-04-20 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Choline derivatives and a process for their preparation |
| IT1156840B (it) * | 1978-06-27 | 1987-02-04 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Acil derivati della carnitina |
| JPS5935599B2 (ja) * | 1980-12-25 | 1984-08-29 | 株式会社 シノテスト研究所 | コリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| US4582855A (en) * | 1981-11-12 | 1986-04-15 | American Hospital Supply Corporation | Aromatic and esters of hydroxypropylamines |
| JPH0236237B2 (ja) * | 1982-01-26 | 1990-08-16 | Toyo Boseki | Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu |
| JPS58170744A (ja) * | 1982-03-31 | 1983-10-07 | Sagami Chem Res Center | 光学活性な１−（６−メトキシ−２−ナフチル）−２−（アルコキシカルボニル）アミノ−１−プロパノン |
| JPS6452742A (en) * | 1987-04-27 | 1989-02-28 | Syntex Pharma Int | Omega-quaternary ammonium alkyl ester and thioester of acidic non-steroidal antiinflammatory |
| JPH0796529B2 (ja) * | 1987-07-27 | 1995-10-18 | 三井東圧化学株式会社 | 光学活性化合物 |
-
1988
- 1988-02-24 JP JP63041375A patent/JPH0662521B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-15 US US07/311,329 patent/US4983756A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-24 DE DE3905861A patent/DE3905861A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3905861A1 (de) | 1989-08-31 |
| DE3905861C2 (ja) | 1992-01-30 |
| US4983756A (en) | 1991-01-08 |
| JPH0662521B2 (ja) | 1994-08-17 |
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