JPH01222800A - 核酸を検出する方法、それに用いる器具およびキット - Google Patents
核酸を検出する方法、それに用いる器具およびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は核酸の検出方法に関する。さらに詳しくは濾過
によって改良されたハイブリダイゼーション法による核
酸の検出方法に関する。本発明はまた、その方法に用い
る器具およびキット（ｋｉｔ）に関する。
によって改良されたハイブリダイゼーション法による核
酸の検出方法に関する。本発明はまた、その方法に用い
る器具およびキット（ｋｉｔ）に関する。
［従来の技術］
本発明の方法に用いるサンドイッチハイブリダイゼーシ
ョン（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｌｏｎ
）法は欧州特許第７９１３９号明細書に記載されており
、溶液ハイブリダイゼーション（ｓｏｌｕｔｉｏｎｈｙ
ｂｒｌｄｌｚａｔｌｏｎ）法の基本原理はたとえば英国
特許第２１８９４０３号明細書に記載されている。溶液
ハイブリダイゼーション法は、溶液相 （ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）中で、標的（ｔａｒ
ｇｅｔ）核酸とハイブリダイズしうる少なくとも２種類
の互いに非相同な （ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）プ
ローブ（ｐｒｏｂｅ）を用いることによって行われる。
ョン（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｌｏｎ
）法は欧州特許第７９１３９号明細書に記載されており
、溶液ハイブリダイゼーション（ｓｏｌｕｔｉｏｎｈｙ
ｂｒｌｄｌｚａｔｌｏｎ）法の基本原理はたとえば英国
特許第２１８９４０３号明細書に記載されている。溶液
ハイブリダイゼーション法は、溶液相 （ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）中で、標的（ｔａｒ
ｇｅｔ）核酸とハイブリダイズしうる少なくとも２種類
の互いに非相同な （ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）プ
ローブ（ｐｒｏｂｅ）を用いることによって行われる。
プローブのうち少なくとも１種類は検出されうる標識（
ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ １ａｂｅｌ）を与えられている
かまたは与えられうる検出（ｄａｔｏｃｔｏｒ）プロー
ブ、および少なくとも１種類は固体担体に固定されてい
るもう一方のコンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｏｎｔ）に
、親和性ベア（ａｆ’ｆ’１ｎｉｔｙ ｐａｉｒ）を形
成することにより付着（ａｔｔａｃｈ） Ｌうる捕獲（
ｃａｐｔｕｒｌｎｇ）プローブである。
ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ １ａｂｅｌ）を与えられている
かまたは与えられうる検出（ｄａｔｏｃｔｏｒ）プロー
ブ、および少なくとも１種類は固体担体に固定されてい
るもう一方のコンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｏｎｔ）に
、親和性ベア（ａｆ’ｆ’１ｎｉｔｙ ｐａｉｒ）を形
成することにより付着（ａｔｔａｃｈ） Ｌうる捕獲（
ｃａｐｔｕｒｌｎｇ）プローブである。
本発明の方法においては、溶液ハイブリダイゼーション
法において、修飾されたプライマー（ｍｏｄｌｆ’ｌｅ
ｄ ｐｒｉｍａｒ）を検出プローブまたは捕獲プローブ
として用いることも可能である。修飾されたプライマー
をハイブリダイゼーションに用いることについては、英
国特許出願第８８０５８８１号明細書に記載されている
。この方法においては標的核酸のそれぞれの鎖（ｏｐｐ
ｏｓｉｔｅｐｏｔａｒｌｔｔｅｓ）に相補的（ｃｏｍｐ
ｌｃｖｅｎｔａｒｙ）な２種類の修飾されたプライマー
を用いる。
法において、修飾されたプライマー（ｍｏｄｌｆ’ｌｅ
ｄ ｐｒｉｍａｒ）を検出プローブまたは捕獲プローブ
として用いることも可能である。修飾されたプライマー
をハイブリダイゼーションに用いることについては、英
国特許出願第８８０５８８１号明細書に記載されている
。この方法においては標的核酸のそれぞれの鎖（ｏｐｐ
ｏｓｉｔｅｐｏｔａｒｌｔｔｅｓ）に相補的（ｃｏｍｐ
ｌｃｖｅｎｔａｒｙ）な２種類の修飾されたプライマー
を用いる。
さらに、標的核酸と選択的にハイブリダイズでき、前記
のプライマーに相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）でない、
少なくとも１種類の核酸プローブが必要である。修飾さ
れたプライマーが検出プローブとして作用するばあい、
すなわち検出されうる標識を与えられているかまたは与
えられうるばあい、前記の選択的プローブは、溶液ハイ
ブリダイゼーション法における捕獲プローブとして、親
和性ペアまたは反応性ペア（ｆｅａｃｔｌｏｎ ｐａｉ
ｒ）の片方を与えられているかまたは与えられうるちの
である。修飾されたプライマーが捕獲プローブとして作
用するばあい、選択的プローブは検出プローブとして作
用する。このばあい、検出されうる標識を与えられてい
るかまたは与えられうるちのである。
のプライマーに相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）でない、
少なくとも１種類の核酸プローブが必要である。修飾さ
れたプライマーが検出プローブとして作用するばあい、
すなわち検出されうる標識を与えられているかまたは与
えられうるばあい、前記の選択的プローブは、溶液ハイ
ブリダイゼーション法における捕獲プローブとして、親
和性ペアまたは反応性ペア（ｆｅａｃｔｌｏｎ ｐａｉ
ｒ）の片方を与えられているかまたは与えられうるちの
である。修飾されたプライマーが捕獲プローブとして作
用するばあい、選択的プローブは検出プローブとして作
用する。このばあい、検出されうる標識を与えられてい
るかまたは与えられうるちのである。
この方法においては、修飾されたプライマーは、あらか
じめ１本鎖にされた標的核酸の相補鎖とハイブリダイズ
される。そののち、混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）はポリメ
ラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｏ）の存在下でインキュベ
ートされる。ポリメラーゼは、鋳型すなわち標的核酸分
子を認識し、ポリメラーゼによってプライマーは数千塩
基から成る鎖にまで伸長しうる。要すれば、ばあいに応
じて求められる感度を獲得するのに要求される数の標的
核酸分子のコピーかえられるまで重合（ｐｏｌｙｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）反応をくり返す。それぞれのコピーは
１つの修飾されたプライマーを持つ。
じめ１本鎖にされた標的核酸の相補鎖とハイブリダイズ
される。そののち、混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）はポリメ
ラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｏ）の存在下でインキュベ
ートされる。ポリメラーゼは、鋳型すなわち標的核酸分
子を認識し、ポリメラーゼによってプライマーは数千塩
基から成る鎖にまで伸長しうる。要すれば、ばあいに応
じて求められる感度を獲得するのに要求される数の標的
核酸分子のコピーかえられるまで重合（ｐｏｌｙｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）反応をくり返す。それぞれのコピーは
１つの修飾されたプライマーを持つ。
標的核酸が一本鎖ＲＮＡであるばあいには、第一段階（
ｌｎＨ１ａｌ ｐｈａｓｅ）において逆転写酵素（ｆｅ
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｌｐｔａｓｅ）を用い、そ
の働きでｃＤＮＡ鎖がはじめに調製される。重合反応の
のち、修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、選択的プローブとの間でハイブリダイゼーション
が行われる。
ｌｎＨ１ａｌ ｐｈａｓｅ）において逆転写酵素（ｆｅ
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｌｐｔａｓｅ）を用い、そ
の働きでｃＤＮＡ鎖がはじめに調製される。重合反応の
のち、修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、選択的プローブとの間でハイブリダイゼーション
が行われる。
サンドイッチハイブリダイゼーション法は、標的核酸と
ハイブリダイズしうる少なくとも２種類の互いに非相同
なプローブを用いて行われる。プローブのうちの１種類
は固体担体に固定されている捕獲プローブ、およびその
他は検出されうる標識を与えられているかまたは与えら
れうる検出プローブである。さらに、修飾されたプライ
マーが検出プローブとして作用する固体担体ハイブリダ
イゼーション（ｓｏｌｉｄ ｃａｒｒｉｅｒｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ）法を用いることも可能である（英国
特許出願第８８０５８８１号明細書参照）。このばあい
に用いる核酸プローブは、標的核酸と選択的にハイブリ
ダイズする能力をもち微小粒子に固定されている。サン
ドイッチハイブリダイゼーション法においても溶液ハイ
ブリダイゼーション法においても、固体担体（フィルタ
ー、デイツプスティック（ｄｌｐｓｔｉｃｋ）、マイク
ロタイタープレー） （ａｉｃｒｏｔｌｔｒｅ ｐｌａ
ｔｅ）など）に結合したハイブリッドを注意深く洗浄す
ることによって、標的核酸、捕獲プローブおよび検出プ
ローブ間に形成されたハイブリッドから過剰な検出プロ
ーブは分離される。微小粒子を固体担体として用いるば
あいは、溶液ハイブリダイゼーション法についての出版
物、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）、１４巻・５０３７〜５０
４８頁（ｌ９８Ｂ）およびサンドイッチハイブリダイゼ
ーション法に関する欧州特許ｔ３２０５５ａ２号明細書
に記載されているように、遠心分離し、数回粒子を洗浄
することによって分離が行われる。また、クロマトグラ
フィーカラム内に微小粒子を充填し、カラムから過剰な
検出プローブを溶出することも可能である（英国特許第
２１６９４０２号明細書参照）。修飾されたプライマー
を用いるばあい、分離はサンドイッチハイブリダイゼー
ション法および溶液ハイブリダイゼーション法における
ばあいと同様の方法によって行われる。
ハイブリダイズしうる少なくとも２種類の互いに非相同
なプローブを用いて行われる。プローブのうちの１種類
は固体担体に固定されている捕獲プローブ、およびその
他は検出されうる標識を与えられているかまたは与えら
れうる検出プローブである。さらに、修飾されたプライ
マーが検出プローブとして作用する固体担体ハイブリダ
イゼーション（ｓｏｌｉｄ ｃａｒｒｉｅｒｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ）法を用いることも可能である（英国
特許出願第８８０５８８１号明細書参照）。このばあい
に用いる核酸プローブは、標的核酸と選択的にハイブリ
ダイズする能力をもち微小粒子に固定されている。サン
ドイッチハイブリダイゼーション法においても溶液ハイ
ブリダイゼーション法においても、固体担体（フィルタ
ー、デイツプスティック（ｄｌｐｓｔｉｃｋ）、マイク
ロタイタープレー） （ａｉｃｒｏｔｌｔｒｅ ｐｌａ
ｔｅ）など）に結合したハイブリッドを注意深く洗浄す
ることによって、標的核酸、捕獲プローブおよび検出プ
ローブ間に形成されたハイブリッドから過剰な検出プロ
ーブは分離される。微小粒子を固体担体として用いるば
あいは、溶液ハイブリダイゼーション法についての出版
物、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）、１４巻・５０３７〜５０
４８頁（ｌ９８Ｂ）およびサンドイッチハイブリダイゼ
ーション法に関する欧州特許ｔ３２０５５ａ２号明細書
に記載されているように、遠心分離し、数回粒子を洗浄
することによって分離が行われる。また、クロマトグラ
フィーカラム内に微小粒子を充填し、カラムから過剰な
検出プローブを溶出することも可能である（英国特許第
２１６９４０２号明細書参照）。修飾されたプライマー
を用いるばあい、分離はサンドイッチハイブリダイゼー
ション法および溶液ハイブリダイゼーション法における
ばあいと同様の方法によって行われる。
【発明が解決しようとする課屈］
同一容器において２回以上の濾過を行うことによる本発
明の目的は、ハイブリダイゼーション法の実施をスピー
ドアップすることと容易にすることである。さらには、
ハイブリダイゼーションの感度、再現性（ｆｅｐｒｏｄ
ｕｃｌｂｌｌ １ｔｙ）および経済性を改良することで
ある。従来の手順では、とくに試料が多量の不溶性の生
物学的不純物を含むばあいには、ハイブリダイゼーショ
ン混合物から固体担体としての粒子を分離するのにいく
つかの問題が生じていた。たとえば、遠心分離法におい
ては測定すべきハイブリッドからこれらの不純物を分離
することができず、前記不純物は粒子とともにハイブリ
ダイゼーション溶液から分離される。さらに、洗浄を繰
り返すため、粒子の一部が遠心管（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅ）の壁および洗浄容器に付着するので損失される。ま
たり、ロマトグラフィー力ラムの使用は、とくにルーテ
ィンな（ｆｏｕｔｌｎｅ）アッセイにおいては、時間が
かかり、めんどうで、また高価である。
明の目的は、ハイブリダイゼーション法の実施をスピー
ドアップすることと容易にすることである。さらには、
ハイブリダイゼーションの感度、再現性（ｆｅｐｒｏｄ
ｕｃｌｂｌｌ １ｔｙ）および経済性を改良することで
ある。従来の手順では、とくに試料が多量の不溶性の生
物学的不純物を含むばあいには、ハイブリダイゼーショ
ン混合物から固体担体としての粒子を分離するのにいく
つかの問題が生じていた。たとえば、遠心分離法におい
ては測定すべきハイブリッドからこれらの不純物を分離
することができず、前記不純物は粒子とともにハイブリ
ダイゼーション溶液から分離される。さらに、洗浄を繰
り返すため、粒子の一部が遠心管（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ
ｅ）の壁および洗浄容器に付着するので損失される。ま
たり、ロマトグラフィー力ラムの使用は、とくにルーテ
ィンな（ｆｏｕｔｌｎｅ）アッセイにおいては、時間が
かかり、めんどうで、また高価である。
［課ツを解決するための手段］
本発明によれば、前記の問題は以下に述べる方法によっ
て解決することができる。すなわち、ハイブリダイズさ
れたもしくはハイブリダイズされていない核酸試料を容
器に濾過して入れる（ｆ’１１ｔｅｒ Ｉｎｔｏ）か、
または標的核酸分子のコピーを容器に濾過して入れる。
て解決することができる。すなわち、ハイブリダイズさ
れたもしくはハイブリダイズされていない核酸試料を容
器に濾過して入れる（ｆ’１１ｔｅｒ Ｉｎｔｏ）か、
または標的核酸分子のコピーを容器に濾過して入れる。
前者のばあい、容器内で試料中に存在している可能性の
ある標的核酸が要すれば（あらかじめハイブリダイズさ
れていないばあい）ハイブリダイズされ、容器内の粒子
またはハイブリダイゼーションののち容器に加えられた
粒子に、核酸プローブの介在によって固定される。後者
のばあいは、容器内で、要すれば（あらかじめそのコピ
ーがハイブリダイズされていないばあい）標的核酸分子
のコピーがハイブリダイズされ、容器内の粒子またはハ
イブリダイゼーションののちに容器に加えられた粒子に
、修飾されたプライマーの介在によって固定される。こ
の修飾されたプライマーは標的核酸分子のコピーの重合
に用いたものである。そののち粒子を濾過し、同一容器
において好ましい回数（３〜６回）洗浄し、ばあいに応
じた適切な方法によって標的核酸を検出する方法である
。検出は、直接、粒子から標識をアッセイしてもよいし
、溶出処理ののち、上清から標識をアッセイすることに
よって行ってもよい。前記の、直接、標識をアッセイす
る方法には粒子が付着したフィルターから標識をアッセ
イする方法も含まれる。
ある標的核酸が要すれば（あらかじめハイブリダイズさ
れていないばあい）ハイブリダイズされ、容器内の粒子
またはハイブリダイゼーションののち容器に加えられた
粒子に、核酸プローブの介在によって固定される。後者
のばあいは、容器内で、要すれば（あらかじめそのコピ
ーがハイブリダイズされていないばあい）標的核酸分子
のコピーがハイブリダイズされ、容器内の粒子またはハ
イブリダイゼーションののちに容器に加えられた粒子に
、修飾されたプライマーの介在によって固定される。こ
の修飾されたプライマーは標的核酸分子のコピーの重合
に用いたものである。そののち粒子を濾過し、同一容器
において好ましい回数（３〜６回）洗浄し、ばあいに応
じた適切な方法によって標的核酸を検出する方法である
。検出は、直接、粒子から標識をアッセイしてもよいし
、溶出処理ののち、上清から標識をアッセイすることに
よって行ってもよい。前記の、直接、標識をアッセイす
る方法には粒子が付着したフィルターから標識をアッセ
イする方法も含まれる。
粒子への標的核酸の固定は、たとえば、粒子に固定され
た核酸プローブとハイブリダイズさせるかもしくは粒子
に固定されうるプローブと標的核酸をハイブリダイズさ
せることによって、あらかじめ標的核酸とハイブリダイ
ズさせた核酸プローブを粒子に固定させることによって
、または修飾されたプライマーによって重合された標的
核酸分子のコピーをそのプライマーを介して粒子に固定
することなどによって行われる。
た核酸プローブとハイブリダイズさせるかもしくは粒子
に固定されうるプローブと標的核酸をハイブリダイズさ
せることによって、あらかじめ標的核酸とハイブリダイ
ズさせた核酸プローブを粒子に固定させることによって
、または修飾されたプライマーによって重合された標的
核酸分子のコピーをそのプライマーを介して粒子に固定
することなどによって行われる。
本発明の方法を用いることによって、試料中に存在する
不溶性の生物学的不純物を好都合に除去することができ
る。遠心分離法およびクロマトグラフ法に対するこの方
法の利点は洗浄の簡便さと迅速性である。さらに洗浄液
中にただちにかつ完全に粒子が再び懸濁されるのでこの
洗浄は効果的である。同一容器で濾過を行うために遠心
分離法において常におこる粒子の損失が防がれる。この
ことからこの方法の感度および再現性が改良される。
不溶性の生物学的不純物を好都合に除去することができ
る。遠心分離法およびクロマトグラフ法に対するこの方
法の利点は洗浄の簡便さと迅速性である。さらに洗浄液
中にただちにかつ完全に粒子が再び懸濁されるのでこの
洗浄は効果的である。同一容器で濾過を行うために遠心
分離法において常におこる粒子の損失が防がれる。この
ことからこの方法の感度および再現性が改良される。
さらに本発明は、本発明の方法に用いる器具およびキッ
トに関する。器具は適当な方法で前処理された粒子（固
体担体）、該粒子が収容されたまたは収容可能な容器部
および容器部に着脱自在に接続された少なくとも１つの
フィルターを有するフィルター部からなる。容器として
はシリンジが好ましい。さらに好ましくは使い捨てシリ
ンジがよい。フィルターとしては標的核酸、検出プロー
ブおよび捕獲プローブ、ならびにハイブリッドは通すが
、不溶性の生物学的不純物および粒子は通さないものを
選ぶ。フィルターはまた、フィルターシステムであって
もよい。フィルターシステムとは、たとえば、前もって
粒子を中に入れたフィルターカセット（ｆ’１ｌｔｏｒ
ｃａｓｓｅｔｔｅ）であってもよい◎キットには、適
当な方法で前処理された粒子を入れる容器、容器に装着
（接続）したまたは装着（接続）しうる少なくとも１つ
のフィルター、および粒子を含む前記器具に加えて、適
切に前処理されたプローブおよびばあいに応じて必要と
されるプライマーが含まれる。キットにはこの方法に必
要な他の試薬、たとえば検出プローブを検出するのに用
いられる試薬などが含まれてもよい。
トに関する。器具は適当な方法で前処理された粒子（固
体担体）、該粒子が収容されたまたは収容可能な容器部
および容器部に着脱自在に接続された少なくとも１つの
フィルターを有するフィルター部からなる。容器として
はシリンジが好ましい。さらに好ましくは使い捨てシリ
ンジがよい。フィルターとしては標的核酸、検出プロー
ブおよび捕獲プローブ、ならびにハイブリッドは通すが
、不溶性の生物学的不純物および粒子は通さないものを
選ぶ。フィルターはまた、フィルターシステムであって
もよい。フィルターシステムとは、たとえば、前もって
粒子を中に入れたフィルターカセット（ｆ’１ｌｔｏｒ
ｃａｓｓｅｔｔｅ）であってもよい◎キットには、適
当な方法で前処理された粒子を入れる容器、容器に装着
（接続）したまたは装着（接続）しうる少なくとも１つ
のフィルター、および粒子を含む前記器具に加えて、適
切に前処理されたプローブおよびばあいに応じて必要と
されるプライマーが含まれる。キットにはこの方法に必
要な他の試薬、たとえば検出プローブを検出するのに用
いられる試薬などが含まれてもよい。
本発明の方法が適用できるもっとも重要なハイブリダイ
ゼーション法を以下に詳細に述べる。
ゼーション法を以下に詳細に述べる。
しかしなから、本発明による方法の用途については以下
に述べた方法に限定されるものではない。当業者が他の
ハイブリダイゼーション法にも本発明の方法の原理を応
用することができるのは明らかである。
に述べた方法に限定されるものではない。当業者が他の
ハイブリダイゼーション法にも本発明の方法の原理を応
用することができるのは明らかである。
［実施例］
１ 濾過によって改良された溶液ハイブリダイゼーショ
ン法 ハイブリダイゼーションは溶液中ですでに記載されたよ
うな条件下で行われる（英国特許箱２１［１９４０３号
明細書参照）。ハイブリダイゼーションが行われたのち
、反応溶液は濾過される。
ン法 ハイブリダイゼーションは溶液中ですでに記載されたよ
うな条件下で行われる（英国特許箱２１［１９４０３号
明細書参照）。ハイブリダイゼーションが行われたのち
、反応溶液は濾過される。
その際、ハイブリッド、過剰の検出プローブおよび捕獲
プローブはフィルターを通り抜けるが、ハイブリダイゼ
ーション溶液中に存在する可能性のある、あらゆる不、
溶性の生物学的不純物は残される。要すれば、フィルタ
ー中に残存しているハイブリッドは核酸を含まないハイ
ブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐことによ
って回収できる。そののち、この方法で用いた親和性ペ
アをもとに選択した条件下で、ハイブリッドが粒子に固
定される。
プローブはフィルターを通り抜けるが、ハイブリダイゼ
ーション溶液中に存在する可能性のある、あらゆる不、
溶性の生物学的不純物は残される。要すれば、フィルタ
ー中に残存しているハイブリッドは核酸を含まないハイ
ブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐことによ
って回収できる。そののち、この方法で用いた親和性ペ
アをもとに選択した条件下で、ハイブリッドが粒子に固
定される。
別の方法としてはハイブリダイゼーションを濾過ののち
に行うことができる。このばあい、ハイブリダイゼーシ
ョンの前に粒子を加えることはハイブリダイゼーション
の動力学 （ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に不利益な影響を及ぼす可能性が
あるので、ハイブリダイゼーションが終わるまで粒子を
加えないのがもっとも都合がよい。
に行うことができる。このばあい、ハイブリダイゼーシ
ョンの前に粒子を加えることはハイブリダイゼーション
の動力学 （ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に不利益な影響を及ぼす可能性が
あるので、ハイブリダイゼーションが終わるまで粒子を
加えないのがもっとも都合がよい。
固定したのち、濾過によって粒子はハイブリダイゼーシ
ョン溶液から分離される。洗浄液をフィルターを通して
、好ましい回数（３〜６回）濾過することによって過剰
な検出プローブは粒子から洗い流される。
ョン溶液から分離される。洗浄液をフィルターを通して
、好ましい回数（３〜６回）濾過することによって過剰
な検出プローブは粒子から洗い流される。
ハイブリッドの検出のつぎの工程は、ばあいに応じて選
択された検出方法によって決まる。
択された検出方法によって決まる。
放射活性検出プローブを用いたばあい、測定は粒子また
はフィルターから直接行うことができる。また、検出プ
ローブはたとえば水酸化ナトリウムを用いて粒子から分
離することができる。
はフィルターから直接行うことができる。また、検出プ
ローブはたとえば水酸化ナトリウムを用いて粒子から分
離することができる。
水酸化ナトリウムによる溶出は、アッセイの感度を増加
するさらなる洗浄として働く。溶出は濾過によって容易
に行われる。酵素的検出方法を用いるばあいは、反応の
のち染色液を粒子から分離して測定する。
するさらなる洗浄として働く。溶出は濾過によって容易
に行われる。酵素的検出方法を用いるばあいは、反応の
のち染色液を粒子から分離して測定する。
前記方法の一例を一連の第１ａ図〜第１ｇ図を用いて説
明する。この例ではシリンジを用いてハイブリダイゼー
ション溶液が濾過される。
明する。この例ではシリンジを用いてハイブリダイゼー
ション溶液が濾過される。
この方法の工程を以下に述べる。
工程ａ（第１ａ図参照）検出プローブ（ｌ）、捕獲プロ
ーブ（２および標的核酸（３）のハイブリダイゼーショ
ンが独立した容器内で行われる。
ーブ（２および標的核酸（３）のハイブリダイゼーショ
ンが独立した容器内で行われる。
工程ｂ（第１ｂ図参照）要すれば、粒子（４）をシリン
ジ（６）に加え、フィルター（５）をシリンジに接続す
る。
ジ（６）に加え、フィルター（５）をシリンジに接続す
る。
工程Ｃ（第１ｃ図参照）ハイブリダイゼーション溶液を
シリンジに吸い込む。
シリンジに吸い込む。
工程ｄ（第１ｄ図参照）要すれば、核酸を含まないハイ
ブリダイゼーション溶液（７）をフィルターを通して吸
い込むことによってフィルターをすすぐ。
ブリダイゼーション溶液（７）をフィルターを通して吸
い込むことによってフィルターをすすぐ。
工程ｅ（第１ｅ図参照）親和性ペアの形成に都合のよい
条件下でハイブリッドが粒子に固定される。
条件下でハイブリッドが粒子に固定される。
工程ｆ（第１ｆ図参照）シリンジからハイブリダイゼー
ション溶液を出す（ｅｍｐｔｙ）ことによってハイブリ
ダイゼーション溶液を粒子から分離し、洗浄液（ｅ）を
用いてシリンジ中の粒子からハイブリダイズされていな
い検出プローブを洗い流す。
ション溶液を出す（ｅｍｐｔｙ）ことによってハイブリ
ダイゼーション溶液を粒子から分離し、洗浄液（ｅ）を
用いてシリンジ中の粒子からハイブリダイズされていな
い検出プローブを洗い流す。
工程ｇ（第１ｇ図参照）検出プローブは粒子から溶離液
（ｅ １ ｕ ｅ ｎ ｔ ） ［９）中に溶出され、
上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）から検出プローブを検
出する。
（ｅ １ ｕ ｅ ｎ ｔ ） ［９）中に溶出され、
上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）から検出プローブを検
出する。
あるいは、工程ｇは粒子またはフィルターから直接、検
出プローブをアッセイする工程に置き換えることができ
る。
出プローブをアッセイする工程に置き換えることができ
る。
キットには少なくとも２種類の互いに非相同な標的核酸
とハイブリダイズしうるプローブが含まれる。プローブ
のうち少なくとも１種類は標識を与えられているかまた
は与えられうる検出プローブ、および少なくとも１種類
はもう一方のコンポーネントに親和性を有するサイト（
ｓｉｔｅ）またはコンポーネントを備えたまたはもう一
方のコンポーネントに親和性を有するコンポーネントを
与えられうる捕獲プローブである。
とハイブリダイズしうるプローブが含まれる。プローブ
のうち少なくとも１種類は標識を与えられているかまた
は与えられうる検出プローブ、および少なくとも１種類
はもう一方のコンポーネントに親和性を有するサイト（
ｓｉｔｅ）またはコンポーネントを備えたまたはもう一
方のコンポーネントに親和性を有するコンポーネントを
与えられうる捕獲プローブである。
さらに、キットには少なくとも１つのフィルター、前記
フィルターを備えているかまたは前記フィルターを接続
しうる容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一
方のコンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含ま
れる。
フィルターを備えているかまたは前記フィルターを接続
しうる容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一
方のコンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含ま
れる。
２ 修飾されたプライマーを検出プローブとして用いる
、濾過によって改良された溶液ハイブリダイゼーション
法 すでに述べたように（英国特許出願第 ８８０５８８１号明細書参照）、標的核酸のそれぞれの
鎖に相補的な、検出されうる標識を与えられているかま
たは与えられうる２種類のプライマーを用いて標的核酸
分子をコピーする。そののち、修飾されたプライマーを
もつ標的核酸分子のコピーと捕獲プローブとの間でハイ
ブリダイゼーションを行う。捕獲プローブは標的核酸分
子のコピーと選択的にハイブリダイズでき、もう一方の
コンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコンポ
ーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネントに親
和性を有するコンポーネントを与えられうる。前記方法
において用いられる、修飾されたプライマーに捕獲プロ
ーブは相同であってはならない。ハイブリダイゼーショ
ン溶液は容器、好ましくはシリンジに濾過して入れられ
、そこでハイブリッドが粒子に°固定される。要すれば
フィルターを洗浄し、そののち適当な条件下でハイブリ
ッドが粒子に固定される。濾過してからハイブリダイゼ
ーションを行うばあいは、ハイブリダイゼーションのの
ちにのみ粒子を加えるのが好ましい。
、濾過によって改良された溶液ハイブリダイゼーション
法 すでに述べたように（英国特許出願第 ８８０５８８１号明細書参照）、標的核酸のそれぞれの
鎖に相補的な、検出されうる標識を与えられているかま
たは与えられうる２種類のプライマーを用いて標的核酸
分子をコピーする。そののち、修飾されたプライマーを
もつ標的核酸分子のコピーと捕獲プローブとの間でハイ
ブリダイゼーションを行う。捕獲プローブは標的核酸分
子のコピーと選択的にハイブリダイズでき、もう一方の
コンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコンポ
ーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネントに親
和性を有するコンポーネントを与えられうる。前記方法
において用いられる、修飾されたプライマーに捕獲プロ
ーブは相同であってはならない。ハイブリダイゼーショ
ン溶液は容器、好ましくはシリンジに濾過して入れられ
、そこでハイブリッドが粒子に°固定される。要すれば
フィルターを洗浄し、そののち適当な条件下でハイブリ
ッドが粒子に固定される。濾過してからハイブリダイゼ
ーションを行うばあいは、ハイブリダイゼーションのの
ちにのみ粒子を加えるのが好ましい。
前記固定ののち、好ましい回数（３〜６回）濾過して粒
子を洗浄することによってハイブリダイゼーション溶液
および過剰な修飾されたプライマーから粒子を分離する
。検出は直接、粒子またはフィルターからか、または修
飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーを粒子
から溶出し、上清から標識をアッセイすることによって
検出を行うことができる。 ゛キットには、標的
核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されうる標識を与
えられているかまたは与えられうる２種類のプライマー
、核酸プローブ、すなわち標的核酸と選択的にハイブリ
ダイズでき、もう一方のコンポーネントに親和性を有す
るサイトもしくはコンポーネントを備えたまたはもう一
方のコンポーネントに親和性を有するコンポーネントを
与えられうる、前記の修飾されたプライマーに相同でな
い捕獲プローブが含まれる。さらに、前記キットには少
なくとも１つのフィルター、前記フィルターを備えてい
るかまたは前記フィルターを接続しうる容器、好ましく
はシリンジ、および前記のもう一方のコンポーネントが
あらかじめ固定された粒子が含まれる。
子を洗浄することによってハイブリダイゼーション溶液
および過剰な修飾されたプライマーから粒子を分離する
。検出は直接、粒子またはフィルターからか、または修
飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーを粒子
から溶出し、上清から標識をアッセイすることによって
検出を行うことができる。 ゛キットには、標的
核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されうる標識を与
えられているかまたは与えられうる２種類のプライマー
、核酸プローブ、すなわち標的核酸と選択的にハイブリ
ダイズでき、もう一方のコンポーネントに親和性を有す
るサイトもしくはコンポーネントを備えたまたはもう一
方のコンポーネントに親和性を有するコンポーネントを
与えられうる、前記の修飾されたプライマーに相同でな
い捕獲プローブが含まれる。さらに、前記キットには少
なくとも１つのフィルター、前記フィルターを備えてい
るかまたは前記フィルターを接続しうる容器、好ましく
はシリンジ、および前記のもう一方のコンポーネントが
あらかじめ固定された粒子が含まれる。
３ 修飾されたプライマーを捕獲プローブとして用いる
、濾過によって改良された溶液ハイブリ。
、濾過によって改良された溶液ハイブリ。
ダイゼーション法
標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、もう−方のコ・ン
ボーネントに親和性を有するサイトもしくはコンポーネ
ントを備えたまたはもう一方のコンポーネントに親和性
を有するコンポーネントを与えられうる２種類のプライ
マーを用いて、すでに述べた手順（英国特許出願第８８
０５６８１号明細書参照）で標的核酸分子をコピーする
。修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーと
、そのコピーと選択的にハイブリダイズでき、検出され
うる標識を与えられているかまたは与えられうる検出プ
ローブとの間でハイブリダイゼーションが行われる。検
出プローブはこの方法に用いられる修飾されたプライマ
ーに相同であってはならない。ハイブリダイゼーション
溶液は容器、好ましくはシリンジに濾過して入れ、要す
ればフィルターを洗浄し、修飾された′プライマーをも
つ標的核酸分子のコピーを粒子に固定する。濾過したの
ちに７１イブリダイゼーシヨンを行うばあい、ノ１イブ
リダイゼーションののちにのみ容器に粒子を加えるのが
好ましい。
ボーネントに親和性を有するサイトもしくはコンポーネ
ントを備えたまたはもう一方のコンポーネントに親和性
を有するコンポーネントを与えられうる２種類のプライ
マーを用いて、すでに述べた手順（英国特許出願第８８
０５６８１号明細書参照）で標的核酸分子をコピーする
。修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーと
、そのコピーと選択的にハイブリダイズでき、検出され
うる標識を与えられているかまたは与えられうる検出プ
ローブとの間でハイブリダイゼーションが行われる。検
出プローブはこの方法に用いられる修飾されたプライマ
ーに相同であってはならない。ハイブリダイゼーション
溶液は容器、好ましくはシリンジに濾過して入れ、要す
ればフィルターを洗浄し、修飾された′プライマーをも
つ標的核酸分子のコピーを粒子に固定する。濾過したの
ちに７１イブリダイゼーシヨンを行うばあい、ノ１イブ
リダイゼーションののちにのみ容器に粒子を加えるのが
好ましい。
固定ののち、好ましい回数（３〜６回）濾過して洗浄す
ることによってハイブリダイゼーション溶液および過剰
な検出プローブから粒子を分離し、前記１に述べたよう
な方法で検出が行われる。
ることによってハイブリダイゼーション溶液および過剰
な検出プローブから粒子を分離し、前記１に述べたよう
な方法で検出が行われる。
キットには、標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、もう
一方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくは
コンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネン
トに親和性を有するコンポーネントを与えられうる２種
類のプライマー、核酸プローブ、すなわち標的核酸と選
択的にハイブリダイズでき、検出されうる標識を与えら
れているかまたは与えられうる、修飾されたプライマー
に相同でない検出プローブが含まれる。これらに加えて
、キットには、少なくとも１つのフィルター、前記フィ
ルターを備えているかまたは前記フィルターを接続しう
る容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一方の
コンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含まれる
。
一方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくは
コンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネン
トに親和性を有するコンポーネントを与えられうる２種
類のプライマー、核酸プローブ、すなわち標的核酸と選
択的にハイブリダイズでき、検出されうる標識を与えら
れているかまたは与えられうる、修飾されたプライマー
に相同でない検出プローブが含まれる。これらに加えて
、キットには、少なくとも１つのフィルター、前記フィ
ルターを備えているかまたは前記フィルターを接続しう
る容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一方の
コンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含まれる
。
４ 濾過によって改良されたサンドイツナノ１イブリダ
イゼーシヨン法 互いにプレハイブリダイズされた（ｐｒｅ−ｈｙｂｒｌ
ｄｉｚｏｄ）または好ましくはハイブリダイズされてい
ない標的核酸分子および検出プローブを含むハイブリダ
イゼーション溶液を、不溶性の生物学的不純物を除くた
めに濾過する。要すれば、核酸を含まないハイブリダイ
ゼーション溶液でフィルターをすすぐことによってフィ
ルター中に残存している標的核酸分子を回収することが
できる。そののち、標的核酸と粒子に固定された捕獲プ
ローブとの間でハイブリダイゼーションが行われる。プ
レハイブリダイゼーションが行われていなか９たばあい
、標的核酸と検出プローブとの間でハイブリダイゼーシ
ョンが同時に行われる。最終的に、濾過によってハイブ
リダイゼーション溶液から粒子が分離され、前記の溶液
ハイブリダイゼーション法と同様に、直接、粒子からか
、または粒子から溶出してえられた上清から検出が行わ
れる。
イゼーシヨン法 互いにプレハイブリダイズされた（ｐｒｅ−ｈｙｂｒｌ
ｄｉｚｏｄ）または好ましくはハイブリダイズされてい
ない標的核酸分子および検出プローブを含むハイブリダ
イゼーション溶液を、不溶性の生物学的不純物を除くた
めに濾過する。要すれば、核酸を含まないハイブリダイ
ゼーション溶液でフィルターをすすぐことによってフィ
ルター中に残存している標的核酸分子を回収することが
できる。そののち、標的核酸と粒子に固定された捕獲プ
ローブとの間でハイブリダイゼーションが行われる。プ
レハイブリダイゼーションが行われていなか９たばあい
、標的核酸と検出プローブとの間でハイブリダイゼーシ
ョンが同時に行われる。最終的に、濾過によってハイブ
リダイゼーション溶液から粒子が分離され、前記の溶液
ハイブリダイゼーション法と同様に、直接、粒子からか
、または粒子から溶出してえられた上清から検出が行わ
れる。
一連の第２ａ図〜第２ｆ図を用いて、シリンジを用いる
方法を説明する。
方法を説明する。
工程ａ（第２ａ図参照）要すれば、あらかじめ捕獲プロ
ーブ（２）が固定された粒子（４）をシリンジ（６）中
に導入する。さらにフィルター（５）を取り付ける。
ーブ（２）が固定された粒子（４）をシリンジ（６）中
に導入する。さらにフィルター（５）を取り付ける。
工程ｂ（第２ｂ図参照）標的核酸（３）および検出プロ
ーブ（ｌ）を含むハイブリダイゼーション溶液をシリン
ジ中に吸い込む。
ーブ（ｌ）を含むハイブリダイゼーション溶液をシリン
ジ中に吸い込む。
工程Ｃ（第２ｃ図参照）要すれば、核酸を含まないハイ
ブリダイゼーション溶液（′７）をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐ。
ブリダイゼーション溶液（′７）をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐ。
工程ｄ（第２ｄ図参照）ハイブリダイゼーションを行う
。
。
工程ｅ（第２ｅ図参照）シリンジから７１イブリダイゼ
ーシヨン溶液を出すことによって粒子をノーイブリダイ
ゼーション溶液から分離し、洗浄液（ｅ）を用いてシリ
ンジ中の粒子から７１イブリダイズされていないプロー
ブを洗い流す。
ーシヨン溶液を出すことによって粒子をノーイブリダイ
ゼーション溶液から分離し、洗浄液（ｅ）を用いてシリ
ンジ中の粒子から７１イブリダイズされていないプロー
ブを洗い流す。
工程ｆ（第２ｒ図参照）検出プローブを粒子から溶離液
（９）中へ溶出し検出プローブを上清から検出する。
（９）中へ溶出し検出プローブを上清から検出する。
前記の方法は例示にすぎず、これによって当業者は別の
応用方法を考案することができるであろう。あらかじめ
粒子およびフィルターが取り付けられているばあいには
工程ａは完全に省略することができる。工程Ｃの前に標
的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさせ、ブレノ
＼イブリダイゼーションを行うことが可能である。
応用方法を考案することができるであろう。あらかじめ
粒子およびフィルターが取り付けられているばあいには
工程ａは完全に省略することができる。工程Ｃの前に標
的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさせ、ブレノ
＼イブリダイゼーションを行うことが可能である。
溶液ハイブリダイゼーション法と同様、工程ｆを粒子か
ら直接検出プローブをアッセイすることに置き換えるこ
とができる。
ら直接検出プローブをアッセイすることに置き換えるこ
とができる。
前記方法に用いるキットには標的核酸とハイブリダイズ
しつる、少なくとも２種類の互いに非相同なプローブが
含まれ、そのうちの少なくともＩ Ｐ！類は検出されう
る標識を与えられているかまたは与えられうる検出プロ
ーブ、および少なくとも１種類は粒子に固定されている
捕獲プローブである。さらにキットには少なくとも１つ
のフィルター、前記フィルターを備えているかまたは前
記フィルターを接続しうる容器、好ましくはシリンジ、
および前記の捕獲プローブがあらかじめ固定された粒子
が含まれる。
しつる、少なくとも２種類の互いに非相同なプローブが
含まれ、そのうちの少なくともＩ Ｐ！類は検出されう
る標識を与えられているかまたは与えられうる検出プロ
ーブ、および少なくとも１種類は粒子に固定されている
捕獲プローブである。さらにキットには少なくとも１つ
のフィルター、前記フィルターを備えているかまたは前
記フィルターを接続しうる容器、好ましくはシリンジ、
および前記の捕獲プローブがあらかじめ固定された粒子
が含まれる。
５ 修飾されたプライマーを検出プローブとして用いる
、濾過によって改良された固体担体ハイブリダイゼーシ
ョン法 標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されうる標識
を与えられているかまたは与えられうる２種類のプライ
マーを用いて標的核酸分子をコピーする。核酸溶液を容
器、好ましくはシリンジ中へ濾過して入れ、要すれば核
酸を含まないハイブリダイゼーション溶液でフィルター
を洗浄する。修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子
のコピーと、粒子に固定され前記コピーと選択的にハイ
ブリダイズしうる核酸プローブとの間でハイブリダイゼ
ーションが行われる。
、濾過によって改良された固体担体ハイブリダイゼーシ
ョン法 標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されうる標識
を与えられているかまたは与えられうる２種類のプライ
マーを用いて標的核酸分子をコピーする。核酸溶液を容
器、好ましくはシリンジ中へ濾過して入れ、要すれば核
酸を含まないハイブリダイゼーション溶液でフィルター
を洗浄する。修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子
のコピーと、粒子に固定され前記コピーと選択的にハイ
ブリダイズしうる核酸プローブとの間でハイブリダイゼ
ーションが行われる。
核酸プローブは修飾されたプライマーに相同であっては
ならない。つぎに、好ましくは３〜６回濾過して洗浄す
ることによってハイブリダイゼーション溶液および過剰
な修飾されたプライマーから粒子を分離する。検出は、
直接、粒子から行うか、修飾されたプライマーをもつ標
的核酸分子のコピーを溶出し、上清から標識をアッセイ
することによって行われる。
ならない。つぎに、好ましくは３〜６回濾過して洗浄す
ることによってハイブリダイゼーション溶液および過剰
な修飾されたプライマーから粒子を分離する。検出は、
直接、粒子から行うか、修飾されたプライマーをもつ標
的核酸分子のコピーを溶出し、上清から標識をアッセイ
することによって行われる。
キットには標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出さ
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる２種
類のプライマー、核酸プローブすなわち標的核酸と選択
的にハイブリダイズでき、粒子に固定され、かつ前記の
修飾されたプライマーに相同でない捕獲プローブを含む
。
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる２種
類のプライマー、核酸プローブすなわち標的核酸と選択
的にハイブリダイズでき、粒子に固定され、かつ前記の
修飾されたプライマーに相同でない捕獲プローブを含む
。
さらにキットには少なくとも１つのフィルター、前記フ
ィルターを備えているかまたは前記フィルターを接続し
つる容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一方
のコンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含まれ
る。
ィルターを備えているかまたは前記フィルターを接続し
つる容器、好ましくはシリンジ、および前記のもう一方
のコンポーネントがあらかじめ固定された粒子が含まれ
る。
つぎに実施例にもとづいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない
。
るが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない
。
実施例１
（バンデックスーアビジン濾過法（Ｐａｎｄｅｘ−ａｖ
ｉｄｉｎ ｆ’１ｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に
よる溶液ハイブリダイゼーション法におけるハイブリッ
ドの回収） 原料 アビジンをコートしたポリスチレン粒子（エピコン・ア
ビジンポリスチレン・アッセイ・パーティクル（Ｅｐｉ
ｃｏｎ Ａｖｌｄｌｎｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ａｓ５
ａｙＰａｒｔ ｉｃｌθｓ）：商品名、パンデックスラ
ボラトリーズ社（Ｐａｎｄｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、 Ｉｎｃ、）製１アメリカ合衆国（ＵＳＡ））を
固体担体（粒子）として用いた。粒子径は平均０．８虜
で、サイズが小さく、溶液中に均等に分布される。粒子
は５％（Ｖ／Ｖ）懸濁液として入手できる。遊離のアビ
ジンを除くために粒子を音波処理し、使用前に１度洗浄
した。
ｉｄｉｎ ｆ’１ｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に
よる溶液ハイブリダイゼーション法におけるハイブリッ
ドの回収） 原料 アビジンをコートしたポリスチレン粒子（エピコン・ア
ビジンポリスチレン・アッセイ・パーティクル（Ｅｐｉ
ｃｏｎ Ａｖｌｄｌｎｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ａｓ５
ａｙＰａｒｔ ｉｃｌθｓ）：商品名、パンデックスラ
ボラトリーズ社（Ｐａｎｄｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、 Ｉｎｃ、）製１アメリカ合衆国（ＵＳＡ））を
固体担体（粒子）として用いた。粒子径は平均０．８虜
で、サイズが小さく、溶液中に均等に分布される。粒子
は５％（Ｖ／Ｖ）懸濁液として入手できる。遊離のアビ
ジンを除くために粒子を音波処理し、使用前に１度洗浄
した。
ハイブリダイゼーション溶液の濾過および固体担体粒子
の溶液からの分離のために、孔径０．４５ 庫のポリビ
ニルジフルオリドフィルター（ミレックスーエイチヴイ
１３（旧ｆｌｅｘ−ＨＶＩ３ ） ：商品名、ミリポ
ア（旧１１１ｐｏｒｅ）社製）を用いた。
の溶液からの分離のために、孔径０．４５ 庫のポリビ
ニルジフルオリドフィルター（ミレックスーエイチヴイ
１３（旧ｆｌｅｘ−ＨＶＩ３ ） ：商品名、ミリポ
ア（旧１１１ｐｏｒｅ）社製）を用いた。
ハイブリッドを、洗浄に都合のよい１ ｍｌの使い捨て
シリンジ中の粒子に固定した。
シリンジ中の粒子に固定した。
ハイブリダイゼーション
標的ＤＮＡとしてＥｃｏＲＩ酵素を用いて直線化したプ
ラスミドｐＢＲ−３２２を用いた。検出プローブとして
は３２ｐで標識さ、れたプラスミドｐＫＴＨ１３００を
用いた。捕獲プローブとしてはフォトビオチン化された
（ ｐｈｏｔｏｂｌｏｔｌｎｙｌａｔｅｄ）ファージａ
ｌＫＴ）１１３０１および１３０２を用いた。検出プロ
ーブおよび捕獲プローブの調製は、ジャーナル・オブφ
バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｌｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ） 、５巻、２１ｆ７〜２７７頁（ｌ
９８７）に記載されている。ハイブリダイゼーションを
、以下の量の試薬を含む１２０μｇの溶液中で行った。
ラスミドｐＢＲ−３２２を用いた。検出プローブとして
は３２ｐで標識さ、れたプラスミドｐＫＴＨ１３００を
用いた。捕獲プローブとしてはフォトビオチン化された
（ ｐｈｏｔｏｂｌｏｔｌｎｙｌａｔｅｄ）ファージａ
ｌＫＴ）１１３０１および１３０２を用いた。検出プロ
ーブおよび捕獲プローブの調製は、ジャーナル・オブφ
バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｌｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ） 、５巻、２１ｆ７〜２７７頁（ｌ
９８７）に記載されている。ハイブリダイゼーションを
、以下の量の試薬を含む１２０μｇの溶液中で行った。
標的ＤＮＡ １０８．１０９または１０ｍ）分子、放射
活性プローブ４．８ｘ １０’ ｃｐｓ ｓすなわち７
Ｘ１０８分子ならびにビオチン化ＩＫＴＨ１３０１およ
び１３０２各１．Ｘ１Ｇ”分子。さらに、ハイブリダイ
ゼーション溶液は塩化ナトリウム０．６Ｍ 、リン酸ナ
トリウム２０ｍＭ、 ＥＤＴＡ １ｍＭおよびドデシル
硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳという）０．１％を含ん
でいた。ハイブリダイゼーション時間は３時間、温度は
６５℃であった。
活性プローブ４．８ｘ １０’ ｃｐｓ ｓすなわち７
Ｘ１０８分子ならびにビオチン化ＩＫＴＨ１３０１およ
び１３０２各１．Ｘ１Ｇ”分子。さらに、ハイブリダイ
ゼーション溶液は塩化ナトリウム０．６Ｍ 、リン酸ナ
トリウム２０ｍＭ、 ＥＤＴＡ １ｍＭおよびドデシル
硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳという）０．１％を含ん
でいた。ハイブリダイゼーション時間は３時間、温度は
６５℃であった。
ハイブリッドの回収
音波処理し、１回洗浄したバンデックス アビジン粒子
の５％懸濁液２０μｇを１ ｍｌの使い捨てシリンジに
導入した。そののち、ミレックス・エイチヴイ１３・フ
ィルターユニットをシリンジに取り付け、反応溶液１２
０μｇをシリンジ中に吸い込んだ。
の５％懸濁液２０μｇを１ ｍｌの使い捨てシリンジに
導入した。そののち、ミレックス・エイチヴイ１３・フ
ィルターユニットをシリンジに取り付け、反応溶液１２
０μｇをシリンジ中に吸い込んだ。
フィルターからハイブリッドをすすぐためにＤＮＡを含
まないハイブリダイゼーション溶液１２０μｇをさらに
シリンジ中に吸い込んでシリンジの総容量を２６０μｇ
とした。
まないハイブリダイゼーション溶液１２０μｇをさらに
シリンジ中に吸い込んでシリンジの総容量を２６０μｇ
とした。
ハイブリッドの粒子への固定は「エンド−オーバー−エ
ンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ） Ｊ混合装置（シリ
ンジを付けたプレート（ｐｌａｔｅ）またはディスク（
ｄｌｓｃ）を回転させることによって混合する装置）に
おいて３７℃、１５分間で行った。固定ののち、塩化ナ
トリウム１５ｍＬクエン酸ナトリウム１．５ｍＭおよび
ＳＤＳ ０．２％を含む洗浄溶液で、温度は５０℃で粒
子を洗浄した。はじめに、シリンジいっば６に（ｌｍｌ
）洗浄溶液を吸い込み、すばやく溶液を出すことによっ
て５回粒子を洗浄した。さらに、１回につき２分間、１
ｍｌの洗浄溶液を作用させて、２回洗浄した。洗浄し
たのち、水酸化ナトリウム０．２ＭおよびＥＤＴＡｌｍ
Ｍを含む溶液１２５μｇをシリンジ中に吸い込むことに
よってハイブリッドから検出プローブを溶出させた。溶
液を室温で５分間作用させ、そののち同じ処理をもう１
回くり返した。アクアゾールシンチレーション液（Ａｑ
ｕａｓｏｌｓｃｌｎｔｌｌｌａｔｉｏｎ １１ｑｕ１ｄ
：商品名、デニポン（ＤｕＰｏｎｔ）社製）２ｍｌを
水酸化ナトリウム上清に加え、それらの放射活性をベー
ターカウンターを用いて測定した。
ンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ） Ｊ混合装置（シリ
ンジを付けたプレート（ｐｌａｔｅ）またはディスク（
ｄｌｓｃ）を回転させることによって混合する装置）に
おいて３７℃、１５分間で行った。固定ののち、塩化ナ
トリウム１５ｍＬクエン酸ナトリウム１．５ｍＭおよび
ＳＤＳ ０．２％を含む洗浄溶液で、温度は５０℃で粒
子を洗浄した。はじめに、シリンジいっば６に（ｌｍｌ
）洗浄溶液を吸い込み、すばやく溶液を出すことによっ
て５回粒子を洗浄した。さらに、１回につき２分間、１
ｍｌの洗浄溶液を作用させて、２回洗浄した。洗浄し
たのち、水酸化ナトリウム０．２ＭおよびＥＤＴＡｌｍ
Ｍを含む溶液１２５μｇをシリンジ中に吸い込むことに
よってハイブリッドから検出プローブを溶出させた。溶
液を室温で５分間作用させ、そののち同じ処理をもう１
回くり返した。アクアゾールシンチレーション液（Ａｑ
ｕａｓｏｌｓｃｌｎｔｌｌｌａｔｉｏｎ １１ｑｕ１ｄ
：商品名、デニポン（ＤｕＰｏｎｔ）社製）２ｍｌを
水酸化ナトリウム上清に加え、それらの放射活性をベー
ターカウンターを用いて測定した。
結果
結果を第１表に示す。
［以下余白］
第 １ 表
［注］
＊ｌ 分子数
Ｈｃｐｓは３つの平行測定の平均値であり、試料を含ま
ないばあい（Ｏ５ａｂｌｅ）のシグナル（５７ａｃｐｍ
）を特異的ｅｐＨから引いている。
ないばあい（Ｏ５ａｂｌｅ）のシグナル（５７ａｃｐｍ
）を特異的ｅｐＨから引いている。
実施例２
（濾過法によるサンドイッチハイブリダイゼーション法
における微小粒子上のハイブリッドの回収） 試薬 サンドイッチハイブリダイゼーション試薬はナイセリア
ゴノロアエ（Ｎｅｌｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａｅ）の４．２キロベース（ｋｂ）の潜在（ｃｒｙｐｔ
ｉｃ）プラスミド（ｐＪＤｌ）からえた（コーク（Ｋｏ
ｒｃｈ）シー、ハゲブロム（Ｉｌａｇｂｌｏｗ）ピーお
よびノーマーク（Ｎｏｒｓａｒｋ）ニス、ナイセリア
ゴノロアエにおけるシークエンスースベシフィックＤＮ
Ａモデイフィケーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｏｃ
ｉｆ’ｉｃ ＤＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ’Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ％ １５５巻、１
３２４〜１３３２頁（ｌ９８３）参照）。ｐＢＲ３２２
にナイセリア ゴノロアエの潜在プラスミドを含む組み
換えプラスミドＰｌｏｌ／ｐＵ旧を標的核酸として用い
た。プラスミドｐＡＴ１５３にナイセリア ゴノロアエ
の潜在プラスミドの １．３キロベースの旧ｎｆｌ−Ｔ
ａｑｌ断片（ｆ’ｒａｇｍｅｒｌｔ）を含む組み換えプ
ラスミドｐＫＴＨ１３８ｇを捕獲プローブとして用いた
。Ｍ１３ ＊ｐｌＧファージにおいてそれぞれの鎖に１
．７キロベースのＩＩ ｉ ｎ ｒ Ｉ−旧ｎｆｌ断片
を含む組み換えファージ■ＫＴ）Ｉ１３６９およびａＫ
ＴＩ１１３７０を検出プローブとして用いた。ＥｃｏＲ
ｌで直線化された標的ＤＮＡ （Ｐｌｏｔ／ｐＵＭｌ）
を用いた。
における微小粒子上のハイブリッドの回収） 試薬 サンドイッチハイブリダイゼーション試薬はナイセリア
ゴノロアエ（Ｎｅｌｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａｅ）の４．２キロベース（ｋｂ）の潜在（ｃｒｙｐｔ
ｉｃ）プラスミド（ｐＪＤｌ）からえた（コーク（Ｋｏ
ｒｃｈ）シー、ハゲブロム（Ｉｌａｇｂｌｏｗ）ピーお
よびノーマーク（Ｎｏｒｓａｒｋ）ニス、ナイセリア
ゴノロアエにおけるシークエンスースベシフィックＤＮ
Ａモデイフィケーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｏｃ
ｉｆ’ｉｃ ＤＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ’Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ％ １５５巻、１
３２４〜１３３２頁（ｌ９８３）参照）。ｐＢＲ３２２
にナイセリア ゴノロアエの潜在プラスミドを含む組み
換えプラスミドＰｌｏｌ／ｐＵ旧を標的核酸として用い
た。プラスミドｐＡＴ１５３にナイセリア ゴノロアエ
の潜在プラスミドの １．３キロベースの旧ｎｆｌ−Ｔ
ａｑｌ断片（ｆ’ｒａｇｍｅｒｌｔ）を含む組み換えプ
ラスミドｐＫＴＨ１３８ｇを捕獲プローブとして用いた
。Ｍ１３ ＊ｐｌＧファージにおいてそれぞれの鎖に１
．７キロベースのＩＩ ｉ ｎ ｒ Ｉ−旧ｎｆｌ断片
を含む組み換えファージ■ＫＴ）Ｉ１３６９およびａＫ
ＴＩ１１３７０を検出プローブとして用いた。ＥｃｏＲ
ｌで直線化された標的ＤＮＡ （Ｐｌｏｔ／ｐＵＭｌ）
を用いた。
標識
検出プローブとして用いたファージａ＋ＫＴＨ１３６９
およびａＫＴＨ１３７０をＤＮＡポリメラーゼＩのフレ
ノウ（Ｋｌｅｎｏｖ）断片を用いてプライマーを伸長す
ることによって［α Ｐ］ｄＣＴＰ （アマルシャム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、イギリス（Ｕ、に、））で
約ｔＯＳｃｐｓ／μｇの比活性を標識した。微小粒子に
結合したプラスミドＤＮＡ ｍの定量のトレーサー（ｔ
ｒａｃｅｒ）として用いたプラスミドｐＫＴＨ１３６８
はニックトランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌ
ａｓｌｏｎ）によって〔α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで約１０
” ｃｐｓ／μｇの比活性を標識した。
およびａＫＴＨ１３７０をＤＮＡポリメラーゼＩのフレ
ノウ（Ｋｌｅｎｏｖ）断片を用いてプライマーを伸長す
ることによって［α Ｐ］ｄＣＴＰ （アマルシャム
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、イギリス（Ｕ、に、））で
約ｔＯＳｃｐｓ／μｇの比活性を標識した。微小粒子に
結合したプラスミドＤＮＡ ｍの定量のトレーサー（ｔ
ｒａｃｅｒ）として用いたプラスミドｐＫＴＨ１３６８
はニックトランスレーション（ｎｉｃｋ ｔｒａｎｓｌ
ａｓｌｏｎ）によって〔α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで約１０
” ｃｐｓ／μｇの比活性を標識した。
微小粒子への捕獲プローブのカップリング（ｃｏａｐｌ
ｉｎｇ） 捕獲プローブを表面上に二級水酸基 （ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｒｏｕｐｓ
）をもつ均一ポリスチレン微小粒子（粒径（ｅ） ：
４．５ａｎ）に付けた（ａｔｔａｃｈｅｄ）。ｐ−
トルエンスルホニルクロリド（ｌ）−ｔｏｌｕｅｎｅｓ
ｕｌｆ’ｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）０．２９ｇ（
ｌ，５ｓｍｏｌ）およびピリジン６０μ４７ （ｅ，７
５麿■ｏｆ）をアセトン１ｍｌ中の粒子３０ｍｇに加え
、室温で２０時間、「エンド−オーバー−エンド」でイ
ンキュベートすることによって粒子の表面の水酸基を活
性化した。
ｉｎｇ） 捕獲プローブを表面上に二級水酸基 （ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｒｏｕｐｓ
）をもつ均一ポリスチレン微小粒子（粒径（ｅ） ：
４．５ａｎ）に付けた（ａｔｔａｃｈｅｄ）。ｐ−
トルエンスルホニルクロリド（ｌ）−ｔｏｌｕｅｎｅｓ
ｕｌｆ’ｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）０．２９ｇ（
ｌ，５ｓｍｏｌ）およびピリジン６０μ４７ （ｅ，７
５麿■ｏｆ）をアセトン１ｍｌ中の粒子３０ｍｇに加え
、室温で２０時間、「エンド−オーバー−エンド」でイ
ンキュベートすることによって粒子の表面の水酸基を活
性化した。
アセトン中の水の濃度を増加しなから洗浄することによ
って粒子を水溶液に移した。最終的に０．２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ９，５）で１度、粒子を洗浄し、つぎに同緩
衝液中に３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁した。
って粒子を水溶液に移した。最終的に０．２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ９，５）で１度、粒子を洗浄し、つぎに同緩
衝液中に３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁した。
プラスミドｐＫＴＨ１ａ８８を水酸化ナトリウム０．２
Ｍ中で５分間煮沸することによって変性させ断片化した
。ｐＫＴＨ１３８８１０Ｍｇを活性化した粒子（ｂｅａ
ｄｓ） １ ｔａｇとともに０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）の７５μｇ中で室温で１８時間、「エンド−
オーバー−エンド」混合装置でインキュベートした。粒
子を溶液から遠心分離法によって分離した。カップリン
グされたＤＮＡ量を、トレーサーとして用いた標識され
たｐ Ｋ Ｔ ｔｌ１３６８の放射活性を用いて定量し
た。未反応のｐ−トルエンスルホニル基を１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）で、室温、４時間でブロック
（ｂｌｏｃｋ）した。粒子は塩化ナトリウム０．１Ｍお
よび５ＤＳ０．０１％を含む０．０５Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に３０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、
＋４℃で保存した。
Ｍ中で５分間煮沸することによって変性させ断片化した
。ｐＫＴＨ１３８８１０Ｍｇを活性化した粒子（ｂｅａ
ｄｓ） １ ｔａｇとともに０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）の７５μｇ中で室温で１８時間、「エンド−
オーバー−エンド」混合装置でインキュベートした。粒
子を溶液から遠心分離法によって分離した。カップリン
グされたＤＮＡ量を、トレーサーとして用いた標識され
たｐ Ｋ Ｔ ｔｌ１３６８の放射活性を用いて定量し
た。未反応のｐ−トルエンスルホニル基を１Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）で、室温、４時間でブロック
（ｂｌｏｃｋ）した。粒子は塩化ナトリウム０．１Ｍお
よび５ＤＳ０．０１％を含む０．０５Ｍ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）に３０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、
＋４℃で保存した。
ハイブリダイゼーションおよびハイブリッドの回収
ハイブリダイゼーション反応は１ｍｌの使い捨てシリン
ジ中で行った。シリンジにはミレツクスーエイチヴイ１
３フィルターユニット（実施例１のフィルターと同様）
を接続し、１回のアッセイにつき捕獲プローブ３．７Ｘ
１０ｍ）分子（Ｂｌｆｍｏｌ）に対応する粒子１ ｍ
ｇを導入した。１回の反応につき検出プローブとして、
３２Ｐで標識されたｍＫＴＨ１３８９および１ＫＴＨ１
３７Ｇの２Ｘ１０８分子、３０００００ｃｐｉ（ｅ，３
ｆ’１ｏｌ）を用いた。塩化ナトリウム０．８Ｍ 、ク
エン酸ナトリウム８０１Ｍ、ｐＨ７，［ｉ（４Ｘ５ＳＣ
）、リン酸ナトリウム２０ａＭおよびＳＯ８０，２５％
を含む反応溶液７０μｇ１検出プローブならびに以下の
表に示した量の標的ＤＮＡをシリンジ中に吸い込んだ。
ジ中で行った。シリンジにはミレツクスーエイチヴイ１
３フィルターユニット（実施例１のフィルターと同様）
を接続し、１回のアッセイにつき捕獲プローブ３．７Ｘ
１０ｍ）分子（Ｂｌｆｍｏｌ）に対応する粒子１ ｍ
ｇを導入した。１回の反応につき検出プローブとして、
３２Ｐで標識されたｍＫＴＨ１３８９および１ＫＴＨ１
３７Ｇの２Ｘ１０８分子、３０００００ｃｐｉ（ｅ，３
ｆ’１ｏｌ）を用いた。塩化ナトリウム０．８Ｍ 、ク
エン酸ナトリウム８０１Ｍ、ｐＨ７，［ｉ（４Ｘ５ＳＣ
）、リン酸ナトリウム２０ａＭおよびＳＯ８０，２５％
を含む反応溶液７０μｇ１検出プローブならびに以下の
表に示した量の標的ＤＮＡをシリンジ中に吸い込んだ。
標的ＤＮＡをすすぐために、さらにＤＮＡを含まないハ
イブリダイゼーション溶液３０μｇをフィルターを通し
てシリンジ中に吸い込み、シリンジ中の総量を１００μ
ｇとした。ハイブリダイゼーション時間は５時間、温度
は６５℃であった。ハイブリダイゼーションののち、粒
子を５回、５５℃で０．ｌＸ５ＳＣ、ＳＤＳ ０．２％
を用いてフィルターを通して溶液を吸い込むことによっ
て洗浄した。洗浄ののち、ハイブリッドの溶出および検
出はすでに述べた方法と同様に行った（実施例１参照）
。
イブリダイゼーション溶液３０μｇをフィルターを通し
てシリンジ中に吸い込み、シリンジ中の総量を１００μ
ｇとした。ハイブリダイゼーション時間は５時間、温度
は６５℃であった。ハイブリダイゼーションののち、粒
子を５回、５５℃で０．ｌＸ５ＳＣ、ＳＤＳ ０．２％
を用いてフィルターを通して溶液を吸い込むことによっ
て洗浄した。洗浄ののち、ハイブリッドの溶出および検
出はすでに述べた方法と同様に行った（実施例１参照）
。
結果
結果を第２表に示す。
［以下余白］
第 ２ 表
［注］
＊ｌ 分子数
Ｈｃｐ■は４つの平行測定の平均値であり、試料を含ま
ないばあいのシグナル（９０ｃｐｍ）を特異的ｅｐｌか
ら引いている。
ないばあいのシグナル（９０ｃｐｍ）を特異的ｅｐｌか
ら引いている。
実施例３
（修飾されたプライマーを検出プローブとして用いる、
パンデックスーアビジン濾過法による溶液ハイブリダイ
ゼーション法におけるハイブリッドの回収） 原料および試薬 固体担体、フィルターおよび容器は実施例１と同様のも
のを用いた。
パンデックスーアビジン濾過法による溶液ハイブリダイ
ゼーション法におけるハイブリッドの回収） 原料および試薬 固体担体、フィルターおよび容器は実施例１と同様のも
のを用いた。
この実施例において、標的核酸はサイトメガロｆｙ （
ルス（ｃＭＶ、 ＡＤ １６９、ＡＴＣＣＶＲ−５３８
）ゲノム（ｇｅｎｏｏ＋ｅ）の１２．３キロベース（ｋ
ｂ）断片を含む組み換えプラスミド（ｐＢＲ３２２／Ｃ
ＭＶ ｌｌ１ｎｄＩ［［Ｌ）であった。
ルス（ｃＭＶ、 ＡＤ １６９、ＡＴＣＣＶＲ−５３８
）ゲノム（ｇｅｎｏｏ＋ｅ）の１２．３キロベース（ｋ
ｂ）断片を含む組み換えプラスミド（ｐＢＲ３２２／Ｃ
ＭＶ ｌｌ１ｎｄＩ［［Ｌ）であった。
用いた２つの検出プライマー（Ｐａ（塩基配列＝５−Ｇ
ＡＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＧ）およ
びＰｂ （塩基配列： ５’−ＡＧＣＴＣＴ ＴＴＣＣ
ＣＧ ＧＣＣＴＧＧ ＣＴ）、第３図参照）は、２０ヌ
クレオチド長を有しており、オートメーション化された
合成装置 （ｓｙｔｈｅｓｌｚｅｒ）を用いた標準法により合成し
た。
ＡＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＧ）およ
びＰｂ （塩基配列： ５’−ＡＧＣＴＣＴ ＴＴＣＣ
ＣＧ ＧＣＣＴＧＧ ＣＴ）、第３図参照）は、２０ヌ
クレオチド長を有しており、オートメーション化された
合成装置 （ｓｙｔｈｅｓｌｚｅｒ）を用いた標準法により合成し
た。
なお、これら検出プライマーは１１１ヌクレオチド離れ
たＣＭＶ−特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔ）上の２つの領域
に対応（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）する０２つの選択的捕
獲プローブ（Ｓｌ（塩基配列：５゛−ＡＣＧ ＴＣＧ
ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＧＣＣＧ）および８２（塩
基配列；５°−ＡＴＧ ＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＧＴ）、第３図参照）は、２本の鎖（ＡおよびＢ１第
３図参照）それぞれにおいて前記２つの検出プライマー
間にある領域を認識した。
たＣＭＶ−特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔ）上の２つの領域
に対応（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）する０２つの選択的捕
獲プローブ（Ｓｌ（塩基配列：５゛−ＡＣＧ ＴＣＧ
ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＧＣＣＧ）および８２（塩
基配列；５°−ＡＴＧ ＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣ
ＣＧＴ）、第３図参照）は、２本の鎖（ＡおよびＢ１第
３図参照）それぞれにおいて前記２つの検出プライマー
間にある領域を認識した。
ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｋｌｎａｓｅ）とガンマ（ｇａｍｍａ）−３２Ｐ−
ＡＴＰとを用いた既知の反応にしたがって、検出プライ
マーＰａおよびｐｂの５°末端が°４ Ｘ １０９ ａ
ｐｍｌｔｌ ｇの比活性（ｓｐｅｃｔｒｅ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）を有するまテ３２Ｐテ標識した（マニアチス（
Ｍａｎｉａｔｌｓ）ら、モレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリ−・マニュア ２ル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）。
ｄｅｋｌｎａｓｅ）とガンマ（ｇａｍｍａ）−３２Ｐ−
ＡＴＰとを用いた既知の反応にしたがって、検出プライ
マーＰａおよびｐｂの５°末端が°４ Ｘ １０９ ａ
ｐｍｌｔｌ ｇの比活性（ｓｐｅｃｔｒｅ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）を有するまテ３２Ｐテ標識した（マニアチス（
Ｍａｎｉａｔｌｓ）ら、モレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリ−・マニュア ２ル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｌｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）。
コールド・スプリングφハーバ−・ラボラトリ−（ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ） 、（ｌ９８２）参照）。
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ） 、（ｌ９８２）参照）。
ビオチン化ヌクレオチドをリレイ（Ｒ１１ｅｙ） ら、
ＤＮＡ 、 ５（４）、 ３３３〜３３７頁（ｌ９８Ｂ
）の記載にしたがって、ビオ（ｂｉｏ）１１−ｄＵＴＰ
（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ１ｅｓ
ｓ以下ＢＲＬという）社製およびターミナルトランスフ
ェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆ’ｅｒａｓｅ
、プロメガ０バイオチツク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｌｏ
ｔｅｃｈ）社製）を用いて捕獲ブローブの３°末端に加
えた。
ＤＮＡ 、 ５（４）、 ３３３〜３３７頁（ｌ９８Ｂ
）の記載にしたがって、ビオ（ｂｉｏ）１１−ｄＵＴＰ
（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ１ｅｓ
ｓ以下ＢＲＬという）社製およびターミナルトランスフ
ェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆ’ｅｒａｓｅ
、プロメガ０バイオチツク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｌｏ
ｔｅｃｈ）社製）を用いて捕獲ブローブの３°末端に加
えた。
標的プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて直線化し
た。
た。
ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちフレノウ（ｋｌｅｎｏｖ
）断片はベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｌｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）から入手した。
）断片はベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｌｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）から入手した。
標的ＤＮＡのコピー
標的ＤＮＡをそれぞれ０．１０４．１０６および１０８
分子（それぞれ０．２Ｘ１Ｇ 、２Ｘｔｏ お
よび２ Ｘ １０” ｍｏｌと対応する）含む４種の異
なった反応混合液を組み立てて用いた。
分子（それぞれ０．２Ｘ１Ｇ 、２Ｘｔｏ お
よび２ Ｘ １０” ｍｏｌと対応する）含む４種の異
なった反応混合液を組み立てて用いた。
加えて、これらすべての４つの反応混合液に、総ｆｆ１
５０μβ中に２つのプライマーをそれぞれｚｐａｏｌず
つ、４種のデオキシヌクレオシド三リンＭ （ｄＡＴＰ
、 ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）をツレツレ０
．５ｄずつ、１０ｉＭ）リス−塩酸緩衝液（Ｔｒｌｓ−
ＣＬ）（ｐ１１７．５）、ｌＯＩＩＭＭｇＣｐ２．５０
ｍＭ ＮａＣｊ！および１０ｍＭジチオスレイトール（
ｄｌｔｈｌｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有させた。
５０μβ中に２つのプライマーをそれぞれｚｐａｏｌず
つ、４種のデオキシヌクレオシド三リンＭ （ｄＡＴＰ
、 ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ）をツレツレ０
．５ｄずつ、１０ｉＭ）リス−塩酸緩衝液（Ｔｒｌｓ−
ＣＬ）（ｐ１１７．５）、ｌＯＩＩＭＭｇＣｐ２．５０
ｍＭ ＮａＣｊ！および１０ｍＭジチオスレイトール（
ｄｌｔｈｌｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有させた。
反応混合液を１００℃まで２分間加熱したのち、３７℃
で５分間インキュベートし、さらにＤＮＡポリメラーゼ
１μＩ （ｌ単位と等価）を加えた。
で５分間インキュベートし、さらにＤＮＡポリメラーゼ
１μＩ （ｌ単位と等価）を加えた。
ついで、反応混合液を再び３７℃で１００分間インキュ
ベートた。
ベートた。
加熱（ｂｏｌｌｌｎｇ）に続く検出プライマーのアニー
リングおよび添加したＩ）ＮＡポリメラーゼとの３７℃
でのインキュベーションにより、ＤＮＡ合成サイクルが
構成される。このサイクルを１６回繰り返した。
リングおよび添加したＩ）ＮＡポリメラーゼとの３７℃
でのインキュベーションにより、ＤＮＡ合成サイクルが
構成される。このサイクルを１６回繰り返した。
ハイブリダイゼーション
最終サイクル後、サンプルを再び１００℃まで加熱した
のち、選択的捕獲プローブ１ｏｐｉｏｌを０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ！、２ ＋ａＭ ＥＤＴＡ 、 ２０ｄリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７，５）および０．１％ＳＤＳとともに
加え、容量を１００μｇまで増量した（なお、前記濃度
は最終濃度を示す）。ハイブリダイゼーション時間は１
時間、温度は５０℃であった。
のち、選択的捕獲プローブ１ｏｐｉｏｌを０．９Ｍ Ｎ
ａＣｌ！、２ ＋ａＭ ＥＤＴＡ 、 ２０ｄリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７，５）および０．１％ＳＤＳとともに
加え、容量を１００μｇまで増量した（なお、前記濃度
は最終濃度を示す）。ハイブリダイゼーション時間は１
時間、温度は５０℃であった。
ハイブリッドの回収
実施例１と同様にパンデックスーアビジン粒子を１ ｍ
ｌの使い捨てシリンジ中に導入し、ミレックスーエイチ
ヴイ１３フィルターユニットをシリンジに装着した。反
応液１００μｇをシリンジ中に吸い込んだ。フィルター
を通してハイブリッドをすすぐためにさらにＤＮＡを含
まないハイブリダイゼーション溶液１２０μｇをシリン
ジ中に吸い込み、シリンジ中の総量を２４０μｇとした
。ハイブリッドの粒子への固定および粒子の洗浄は実施
例１と同様に行なった。洗浄ののち、修飾されたプライ
マーをもつ標的核酸分子のコピーを実施例１と同様に検
出した。
ｌの使い捨てシリンジ中に導入し、ミレックスーエイチ
ヴイ１３フィルターユニットをシリンジに装着した。反
応液１００μｇをシリンジ中に吸い込んだ。フィルター
を通してハイブリッドをすすぐためにさらにＤＮＡを含
まないハイブリダイゼーション溶液１２０μｇをシリン
ジ中に吸い込み、シリンジ中の総量を２４０μｇとした
。ハイブリッドの粒子への固定および粒子の洗浄は実施
例１と同様に行なった。洗浄ののち、修飾されたプライ
マーをもつ標的核酸分子のコピーを実施例１と同様に検
出した。
結果
結果を第３表に示す。
［以下余白］
第 ３ 表
［注］
零１ 測定値（２回）の平均値
＄２ ＮＤ−検出不可能（バックグラウンドの活性平
均値の２倍よりも放射活性が少 ない） 実施例４ （修飾されたプライマーを捕獲プローブとして用いる、
バンデックスーアビジン濾過法による溶液ハイブリダイ
ゼーション法におけるハイブリッドの回収） 用いた標的ＤＮＡ 、原料および試薬は、下記の例外を
除いては実施例３と同じものであった。
均値の２倍よりも放射活性が少 ない） 実施例４ （修飾されたプライマーを捕獲プローブとして用いる、
バンデックスーアビジン濾過法による溶液ハイブリダイ
ゼーション法におけるハイブリッドの回収） 用いた標的ＤＮＡ 、原料および試薬は、下記の例外を
除いては実施例３と同じものであった。
捕獲プライマー（ＰａおよびＰｂ１第１図参照）の５°
末端を３２Ｐで標識する代わりに、ビオチン残基で修飾
した。この化学的修飾法は、コレット（ｃｈｏｌｌｅｔ
）およびカワシマ、ヌクレイツク・アシッズ拳リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
１３．１５２９〜１５４１頁（ｌ９８５）に記載されて
いる既知の方法にしたがって行なった。また、２つの選
択的プローブ（Ｓ＋および８２％第３図参照）を、この
ばあいには検出プローブとして作用するように５°末端
において標識した。比活性は、それぞれ約２ ｘ １１
０９ａｐ／ｕ ｇおよび約２．５Ｘ １１０９ｃｐ／μ
ｇであった◇ 実施例３と同様に標的ＤＮＡのコピーおよびハイブリダ
イゼーションを行った。だだし、ビオチン化捕獲プライ
マーの悉加量は、１０倍量、すなわち反応混合液あたり
２Ｏｐｍｏｌずつであった。
末端を３２Ｐで標識する代わりに、ビオチン残基で修飾
した。この化学的修飾法は、コレット（ｃｈｏｌｌｅｔ
）およびカワシマ、ヌクレイツク・アシッズ拳リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
１３．１５２９〜１５４１頁（ｌ９８５）に記載されて
いる既知の方法にしたがって行なった。また、２つの選
択的プローブ（Ｓ＋および８２％第３図参照）を、この
ばあいには検出プローブとして作用するように５°末端
において標識した。比活性は、それぞれ約２ ｘ １１
０９ａｐ／ｕ ｇおよび約２．５Ｘ １１０９ｃｐ／μ
ｇであった◇ 実施例３と同様に標的ＤＮＡのコピーおよびハイブリダ
イゼーションを行った。だだし、ビオチン化捕獲プライ
マーの悉加量は、１０倍量、すなわち反応混合液あたり
２Ｏｐｍｏｌずつであった。
実施例３と同様に１６サイクル行ったのち、試料を１０
０℃まで加熱し、３２Ｐ標識化プローブＳ１およびＳ２
をそれぞれ０．５ａｍｏ’ｌずつ加えた。
０℃まで加熱し、３２Ｐ標識化プローブＳ１およびＳ２
をそれぞれ０．５ａｍｏ’ｌずつ加えた。
実施例３と同じ条件下でハイブリダイゼーシヨンを行っ
た。
た。
そののち、実施例３と同様にハイブリッドをパンデック
スーアビジン粒子上に集め （ｅｏｌｌｏｃｔ） 、洗浄およびｓ２Ｐ活性を測定し
た。
スーアビジン粒子上に集め （ｅｏｌｌｏｃｔ） 、洗浄およびｓ２Ｐ活性を測定し
た。
結果を第４表に示す。
［以下余白］
第 ４ 表
［注］
＊１ 測定値（２回）の平均値
＄２ ＮＤ−検出不可能
［発明の効果］
本発明によれば、核酸試料を容器に濾過して入れ同一容
器において濾過をくり返すことにより、核酸を検出する
方法の実施を容易にかつスピードアップし、さらに核酸
検出の感度、再現性および経済性を改良しうるという効
果を奏する。また、従来の技術では取り除くことが困難
であった多量の生物学的不純物を含む試料の核酸のアッ
セイを行うばあい、めんどうな予備処理の工程を必要と
したが、本発明の方法によればそのような工程なしに核
酸のアッセイを行うことが可能である。
器において濾過をくり返すことにより、核酸を検出する
方法の実施を容易にかつスピードアップし、さらに核酸
検出の感度、再現性および経済性を改良しうるという効
果を奏する。また、従来の技術では取り除くことが困難
であった多量の生物学的不純物を含む試料の核酸のアッ
セイを行うばあい、めんどうな予備処理の工程を必要と
したが、本発明の方法によればそのような工程なしに核
酸のアッセイを行うことが可能である。
さらに、本発明の器具およびキットは、核酸のアッセイ
の実施を容易ならしめるという効果を奏する。
の実施を容易ならしめるという効果を奏する。
第１ａ図〜第１ｇ図はシリンジを用いて、濾過によって
改良された溶液ハイブリダイゼーション法を行う手順を
示す。 第２ａ図〜第２ｆ図はシリンジを用いて、濾過によって
改良されたサンドイッチハイブリダイゼーション法を行
う手順を示す。 第３図は実施例３および４で用いた修飾されたプライマ
ー（ＰａとＰｂ）および選択的プローブ（Ｓ＋ と８２
）の検出すべき標的核酸上における相対部位（上段）な
らびに該修飾されたプライマーおよび該選択的プローブ
それぞれの塩基配列（下段）である。ラインＡおよびＢ
は両方向に続く２本の標的核酸鎖を示す。プライマー（
ＰａとＰｂ）上の矢印は重合プロセスにおける伸長方向
を示す。 （図面の主要符号） （ｌ）：検出プローブ （２）：捕獲プローブ （３）二標的核酸 （４）二粒 子 （５） 、フィルター （６）：シリンジ （刀：核酸を含まないハイブリダイ ゼーション溶液 特許出願人 オリオンーユヒチュメ・オニ第３図 ５２ ： ５’−ＡＴＧ ＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＧＴォ１８図 牙１ｂ図 第１Ｃ第１を
図１ 第１ｅ四 □ ！ 「
改良された溶液ハイブリダイゼーション法を行う手順を
示す。 第２ａ図〜第２ｆ図はシリンジを用いて、濾過によって
改良されたサンドイッチハイブリダイゼーション法を行
う手順を示す。 第３図は実施例３および４で用いた修飾されたプライマ
ー（ＰａとＰｂ）および選択的プローブ（Ｓ＋ と８２
）の検出すべき標的核酸上における相対部位（上段）な
らびに該修飾されたプライマーおよび該選択的プローブ
それぞれの塩基配列（下段）である。ラインＡおよびＢ
は両方向に続く２本の標的核酸鎖を示す。プライマー（
ＰａとＰｂ）上の矢印は重合プロセスにおける伸長方向
を示す。 （図面の主要符号） （ｌ）：検出プローブ （２）：捕獲プローブ （３）二標的核酸 （４）二粒 子 （５） 、フィルター （６）：シリンジ （刀：核酸を含まないハイブリダイ ゼーション溶液 特許出願人 オリオンーユヒチュメ・オニ第３図 ５２ ： ５’−ＡＴＧ ＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧ
ＣＣＧＴォ１８図 牙１ｂ図 第１Ｃ第１を
図１ 第１ｅ四 □ ！ 「
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ハイブリダイズされた、もしくはハイブリダイズさ
れていない核酸試料を容器に濾過して入れ、該核酸試料
があらかじめハイブリダイズされていないばあいは該容
器内で標的核酸をハイブリダイズし、容器内の粒子、も
しくはハイブリダイゼーションののちに容器に加えた粒
子に核酸プローブの介在によって固定するか、または標
的核酸分子のコピーを容器に入れ、該コピーがあらかじ
めハイブリダイズされていないばあいは該容器内で標的
核酸分子のコピーをハイブリダイズし、容器内の粒子、
もしくはハイブリダイゼーションののちに容器に加えた
粒子に該標的核酸分子のコピーの重合に用いた修飾され
たプライマーの介在によって固定し、そののち粒子を濾
過し、該容器において粒子を洗浄し、標的核酸を検出す
ることを特徴とするハイブリダイゼーション法により核
酸を検出する方法。 ２ 直接、粒子から標識をアッセイすることによって標
的核酸を検出することを特徴とする請求項１記載の方法
。 ３ 溶出処理ののち、上清から標識をアッセイすること
によって標的核酸を検出することを特徴とする請求項１
記載の方法。 ４ 核酸試料を容器に濾過して入れ、該容器内で粒子に
固定された核酸プローブもしくは粒子に固定されうるプ
ローブと標的核酸をハイブリダイズさせるか、標的核酸
とハイブリダイズされた核酸プローブを粒子に固定させ
るか、または標的核酸分子のコピーを該標的核酸分子の
コピーの重合に用いた修飾されたプライマーの介在によ
って粒子に固定し、そののち粒子を濾過し、該容器にお
いて粒子を洗浄し、標的核酸を検出することを特徴とす
る請求項１記載の方法。 ５ 容器がシリンジであることを特徴とする請求項１記
載の方法。 ６（ａ）標的核酸と捕獲プローブおよび検出プローブと
の間でハイブリダイゼーションを行い、 （ｂ）ハイブリダイゼーション溶液を濾過し、 （ｃ）ハイブリッドを粒子に固定し、 （ｄ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｅ）ハイブリダイズされていない検出プローブを粒子
から洗い流し、 （ｆ）標的核酸を検出することを特徴とする請求項１記
載の方法。 ７ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含まな
いハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐこ
とによってフィルター中に残存しているハイブリッドを
回収することを特徴とする請求項６記載の方法。 ８（ａ）ハイブリダイゼーション溶液を濾過し、 （ｂ）標的核酸と捕獲プローブおよび検出プローブとの
間でハイブリダイゼーションを行い、 （ｃ）粒子を加え、 （ｄ）粒子にハイブリッドを固定し、 （ｅ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｆ）ハイブリダイズされていない検出プローブを粒子
から洗い流し、 （ｇ）標的核酸を検出することを特徴とする請求項１記
載の方法。 ９ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含まな
いハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐこ
とによってフィルター中に残存している標的核酸分子を
回収することを特徴とする請求項８記載の方法。 １０（ａ）ハイブリダイゼーションを行い、 （ｂ）ハイブリダイゼーション溶液をシリンジ中に吸い
込み、 （ｃ）ハイブリッドをシリンジ中の粒子に固定し、 （ｄ）ハイブリダイゼーション溶液をシリンジから出し
、 （ｅ）ハイブリダイズされていない検出プローブをシリ
ンジ中の粒子から洗い流し、 （ｆ）標的核酸を検出することを特徴とする請求項５ま
たは６記載の方法。 １１ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐことを特徴と
する請求項１０記載の方法。 １２ 粒子、容器部およびフィルター部からなるハイブ
リダイゼーション法による核酸のアッセイに用いる器具
。 １３ 容器がシリンジであることを特徴とする請求項１
２記載の器具。 １４ 少なくとも１種類は検出されうる標識を与えられ
ているかまたは与えられうる検出プローブ、および少な
くとも１種類はもう一方のコンポーネントに親和性を有
するサイトもしくはコンポーネントを備えたまたはもう
一方のコンポーネントに親和性を有するコンポーネント
を与えられうる捕獲プローブである、標的核酸とハイブ
リダイズでき、互いに非相同な少なくとも２種類のプロ
ーブ、少なくとも１つのフィルター、該フィルターを備
えているかまたは該フィルターを接続しうる容器、およ
び前記のもう一方のコンポーネントがあらかじめ固定さ
れた粒子を含んでなることを特徴とするハイブリダイゼ
ーション法による核酸分子のアッセイに用いるキット。 １５（ａ）標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出さ
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる２種
類のプライマーを用いて標的核酸分子をコピーし、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、該コピーと選択的にハイブリダイズでき、もう一
方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコ
ンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネント
に親和性を有するコンポーネントを与えられうる、修飾
されたプライマーに相同でない捕獲プローブとの間でハ
イブリダイゼーションを行い、 （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液を濾過し、 （ｄ）ハイブリッドを粒子に固定し、 （ｅ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｆ）過剰な修飾されたプライマーを粒子から洗い流し
、 （ｇ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項１記載の方法。 １６ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐ
ことによってフィルター中に残存しているハイブリッド
を回収することを特徴とする請求項１５記載の方法。 １７ （ａ）標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出
されうる標識を与えられているかまたは与えられうるプ
ライマーを用いて標的核酸分子をコピーし、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを含む溶液を濾過し、 （ｃ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、該コピーと選択的にハイブリダイズでき、もう一
方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコ
ンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネント
に親和性を有するコンポーネントを与えられうる、修飾
されたプライマーに相同でない捕獲プローブとの間でハ
イブリダイゼーションを行い、 （ｄ）粒子を加え、 （ｅ）ハイブリッドを粒子に固定し、 （ｆ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｇ）過剰な修飾されたプライマーを粒子から洗い流し
、 （ｈ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項１記載の方法。 １８ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐ
ことによって修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子
のコピーを回収することを特徴とする請求項１７記載の
方法。 １９ （ａ）コピーを行い、 （ｂ）ハイブリダイゼーションを行い、 （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液をシリンジ中に吸い
込み、 （ｄ）ハイブリッドをシリンジ中の粒子に固定し、 （ｅ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｆ）過剰な修飾されたプライマーを粒子から洗い流し
、 （ｇ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項５または１５記載
の方法。 ２０ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐことを特徴と
する請求項１９記載の方法。 ２１ 標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されう
る標識を与えられているかまたは与えられうる２種類の
プライマー、核酸プローブすなわち標的核酸と選択的に
ハイブリダイズでき、もう一方のコンポーネントに親和
性を有するサイトもしくはコンポーネントを備えたまた
はもう一方のコンポーネントに親和性を有するコンポー
ネントを与えられうる、修飾されたプライマーに相同で
ない捕獲プローブ、少なくとも１つのフィルター、該フ
ィルターを備えているかまたは該フィルターを接続しう
る容器、および前記のもう一方のコンポーネントがあら
かじめ固定された粒子を含んでなることを特徴とするハ
イブリダイゼーション法による核酸の検出に用いるキッ
ト。 ２２（ａ）標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、もう一
方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコ
ンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネント
に親和性を有するコンポーネントを与えられうる２種類
のプライマーを用いて標的核酸分子をコピーし、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、該コピーに選択的にハイブリダイズでき、検出さ
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる、修
飾されたプライマーに相同でない検出プローブとの間で
ハイブリダイゼーションを行い、 （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液を濾過し、 （ｄ）ハイブリッドを粒子に固定し、 （ｅ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｆ）過剰な検出プローブを粒子から洗い流し、 （ｇ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項１記載の方法。 ２３ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐ
ことによってフィルター中に残存しているハイブリッド
を回収することを特徴とする請求項２２記載の方法。 ２４ （ａ）標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、もう
一方のコンポーネントに親和性を有するサイトもしくは
コンポーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネン
トに親和性を有するコンポーネントを与えられうる２種
類のプライマーを用いて標的核酸分子をコピーし、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを含む溶液を濾過し、 （ｃ）核酸を含まないハイブリダイゼーション溶液でフ
ィルターをすすぐことによってフィルター中に残存する
修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーを回
収し、 （ｄ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、該コピーと選択的にハイブリダイズでき、検出さ
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる、修
飾されたプライマーに相同でない検出プローブとの間で
ハイブリダイゼーションを行い、 （ｅ）粒子を加え、 （ｆ）ハイブリッドを粒子に固定し、 （ｇ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｈ）過剰な検出プローブを粒子から洗い流し、 （ｌ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項１記載の方法。 ２５ （ａ）コピーを行い、 （ｂ）ハイブリダイゼーションを行い、 （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液をシリンジ中に吸い
込み、 （ｄ）ハイブリッドをシリンジ中の粒子に固定し、 （ｅ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｆ）過剰な検出プローブを粒子から洗い流し、 （ｇ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項５または２２記載
の方法。 ２６ ハイブリッドを粒子に固定する前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐことを特徴と
する請求項２５記載の方法。 ２７ 標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、もう一方の
コンポーネントに親和性を有するサイトもしくはコンポ
ーネントを備えたまたはもう一方のコンポーネントに親
和性を有するコンポーネントを与えられうる少なくとも
２種類のプライマー、核酸プローブすなわち標的核酸と
選択的にハイブリダイズでき、検出されうる標識を与え
られているかまたは与えられうる、修飾されたプライマ
ーに相同でない検出プローブ、少なくとも１つのフィル
ター、該フィルターを備えているかまたは該フィルター
を接続しうる容器、および前記のもう一方のコンポーネ
ントがあらかじめ固定された粒子を含んでなることを特
徴とするハイブリダイゼーション法による核酸の検出に
用いるキット。 ２８（ａ）標的核酸分子および検出プローブを含むハイ
ブリダイゼーション溶液を濾過し、 （ｂ）検出プローブ、標的核酸分子および粒子に固定さ
れた捕獲プローブとの間でハイブリダイゼーションを行
い、 （ｃ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｄ）過剰な検出プローブを粒子から洗い流し、 （ｅ）標的核酸を検出することを特徴とする請求項１記
載の方法。 ２９ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐ
ことによってフィルター中に残存している標的核酸分子
を回収することを特徴とする請求項２８記載の方法。 ３０ 濾過する前に標的核酸分子と検出プローブをプレ
ハイブリダイズし、工程（ｂ）におけるハイブリダイゼ
ーションをさきに形成されたハイブリッドと捕獲プロー
ブとの間でのみ行うことを特徴とする請求項２８記載の
方法。 ３１ （ａ）標的核酸および検出プローブを含むハイブ
リダイゼーション溶液をシリンジ中に吸い込み、 （ｂ）ハイブリダイゼーションを行い、 （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液をシリンジから出し
、 （ｄ）ハイブリダイズされていないプローブをシリンジ
中の粒子から洗い流し、 （ｅ）標的核酸を検出することを特徴とする請求項５ま
たは２８記載の方法。 ３２ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルターをすすぐことを特徴と
する請求項３１記載の方法。 ３３ 直接、粒子から検出プローブをアッセイすること
によって標的核酸を検出することを特徴とする請求項６
、８、１０、２２、２４、２５、２８、３０または３１
記載の方法。 ３４ 粒子から検出プローブを溶出し、上清から検出プ
ローブをアッセイすることによって標的核酸を検出する
ことを特徴とする請求項６、８、１０、２２、２４、２
５、２８、３０または３１記載の方法。 ３５ 少なくとも１種類は検出されうる標識を与えられ
ているかまたは与えられうる検出プローブ、およびその
他は粒子に固定された捕獲プローブならびに少なくとも
１つのフィルター、該フィルターを備えているかまたは
該フィルターを接続しうる容器、および前記の捕獲プロ
ーブがあらかじめ固定された粒子を含んでなることを特
徴とするハイブリダイゼーション法による核酸の検出に
用いるキット。 ３６（ａ）標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出さ
れうる標識を与えられているかまたは与えられうる２種
類のプライマーを用いることによって標的核酸分子をコ
ピーし、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを含む溶液を濾過し、 （ｃ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーと、該コピーと選択的にハイブリダイズでき、粒子に
固定され、修飾されたプライマーに相同でない核酸プロ
ーブとの間でハイブリダイゼーションを行い、 （ｄ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｅ）過剰な修飾されたプライマーを粒子から洗い流し
、 （ｆ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項１記載の方法。 ３７ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液でフィルターをすすぐ
ことによってフィルター中に残存する修飾されたプライ
マーをもつ標的核酸分子のコピーを回収することを特徴
とする請求項３６記載の方法。 ３８ （ａ）コピーを行い、 （ｂ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを含む溶液をシリンジ中に吸い込み、 （ｃ）ハイブリダイゼーションを行い、 （ｄ）粒子をハイブリダイゼーション溶液から分離し、 （ｅ）過剰な修飾されたプライマーを粒子から洗い流し
、 （ｆ）修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピ
ーを検出することを特徴とする請求項５または３６記載
の方法。 ３９ ハイブリダイゼーションを行う前に、核酸を含ま
ないハイブリダイゼーション溶液をフィルターを通して
吸い込むことによってフィルター巾に残存する修飾され
たプライマーをもつ標的核酸分子のコピーを回収するこ
とを特徴とする請求項３８記載の方法。 ４０ 直接、粒子から標識をアッセイすることによって
修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子のコピーを検
出することを特徴とする請求項１５、１７、１９、３６
または３８記載の方法。 ４１ 粒子から溶出し、上清から標識をアッセイするこ
とによって修飾されたプライマーをもつ標的核酸分子の
コピーを検出することを特徴とする請求項１５、１７、
１９、３６または３８記載の方法。 ４２ 標的核酸のそれぞれの鎖に相補的な、検出されう
る標識を与えられているまたは与えられうる２種類のプ
ライマー、核酸プローブすなわち標的核酸と選択的にハ
イブリダイズでき、粒子に固定され、前記の修飾された
プライマーに相同でない捕獲プローブ、少なくとも１つ
のフィルター、該フィルターを備えているまたは該フィ
ルターを接続しうる容器、および前記のもう一方のコン
ポーネントがあらかじめ固定された粒子を含んでなるこ
とを特徴とする核酸の検出に用いるキット。 ４３ 容器がシリンジであることを特徴とする請求項４
２記載のキット。
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