JPH01246295A - 新規なリンカーを有するアントラサイクリン・イムノコンジュゲート及びその製造方法 - Google Patents

新規なリンカーを有するアントラサイクリン・イムノコンジュゲート及びその製造方法

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JPH01246295A
JPH01246295A JP1030083A JP3008389A JPH01246295A JP H01246295 A JPH01246295 A JP H01246295A JP 1030083 A JP1030083 A JP 1030083A JP 3008389 A JP3008389 A JP 3008389A JP H01246295 A JPH01246295 A JP H01246295A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は新規なアントラサイクリン−イムノコンジュゲ
−）　（５ｗｍ５ｓ　ｏ　ｅ　ｏ％ｊｓｇａｔａａｃ免
疫学的結合体〕）免疫学的結合体性に関する。より特に
は、本発明は絶滅すべき対象に選ばｎた細胞集団に対し
て反応性の抗体から成り、而して抗体がその構造に共有
結合的にリンクしている複数個の細胞阻害性アントラサ
イクリン分子を有していることを特徴とするイムノコン
ジュゲートに関する。各アントラサイクリン分子はリン
カ−アームを介して抗体にコンジュゲートして８す、ア
ントラサイクリ／は、アントラサイクリンの１３−ケト
位置の（酸の作分て分裂する）酸感受性アシルヒドラゾ
ン結合を介して、そのリンカ−に結合している。本発明
の好ましい忠様は、アドリアマイシンか１３−ケト位置
のアシルヒドラゾン結合を介してり／カーアームに付着
しているアドリアマイシン・イムノコンジュゲートに関
する。リンカ−は、イムノコンジュゲートへの抗体付層
部分として、ジスルフィド又はチオエーテル結合を更に
有している。更に本発明によれば、新規なアントラサイ
クリンのアシルヒドラゾン誘導体が合成され、本発明の
イムノコンジュゲートの製造に用いられる。
本発明のイムノコンジュゲートの酸感受性のアシルヒド
ラゾン結合は、標的細胞の酸性の外因性又は内在的環境
で、イムノコンジュゲートからアントラサイクリ／の放
出を可能にしている。本発明のイムノコンジュゲート及
び方法は従って、疾病例えば癌及び他の腫瘍、非細胞破
壊性ウィルス又は他の病原体的感染、及び自己免疫性疾
患の治療で、選ばれた細胞集団の選択的減殺用の抗体媒
介医薬供給システムで有用である。
〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉アント
ラサイクリンは細胞阻害活性（細胞毒性）を有する抗生
物質化合物である。研究結果からアンドラサイクリンは
１）この薬の分子が細胞のＤＮＡ中にインターカレーシ
ョンしてＤＮＡ依存性の核酸合成を阻害する：２）この
薬が遊離基を産出し、これが次に剛胞の巨大分子と反応
して細胞を損害させる；又は３）この薬の分子と細胞膜
との相互作用を含めた多数のさまざまの機構で細胞を減
殺するように作用することが示されている〔例えば、Ｃ
，Ｐａｔｇｒｓｏ％ａｔ　　ａＬ、＋　−Ｔｒａｎｓｐ
ｏｒｔ　　ａｎｄ　　Ｓｔｏｒａｇｅ　　ｏｆＡｎｔｈ
ｒｃＬｃｙｅｌｉｓｒｓ　　ｉｓ　　Ｅｚｐｇｒｉｍａ
ｎｔａｊ　　５ｙｓｔｅｔｎａａｔ　ａｔ、（ａｄ、５
）ｐＡ　３２　（ＡｆｃＬｙｔｓｓ％ａ　Ｎ１ｊｈｏｆ
ｆＰ１Ｌｂｌｉｓｈｅｒｓ　　１９８２　）　；及び、
Ｎ、Ｒ，Ｂａｃにｓｒ。
＠Ｆｒｏｇ　Ｒａｄｉｃａｌ　ｌ）ａｍａｇ−”ｉｄ、
ｐｐ、９７−１０２　参照〕。その細胞阻害能からアン
トラサイクリ／はさまざまの癌例えば白血病、乳癌、肺
癌、卵巣腺癌、及び肉腫の治療に用いられている〔例え
ば、ｐ、ｍ、ｙｔｇｒ％４ｋ・＠Ｃｓｒｒｍｓｔ　　５
ｔａｔｓｂａ　　ｏｆ　　Ａｄｒｉａｍｙｅｉｎ　　ａ
ｎｄＤａｓｓｏｔｎｙｃｉｎ　　＜ｓ　　Ｃ’ａｎｃａ
ｒ　　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　　”　　。
ｐｐ、２７３　９４　（Ａｃａｄａｍｔａ　Ｐｒｅｓｓ
　　１９８０　）参照〕。
広（用いられているアントラサイクリンにはアドリアマ
イシンとダウノマイシンがある。
絶滅すべき対象に選ばれた細胞集団がきまっている新生
物及び他の疾病の治療でこれらの化合物が有用であるが
、その治療上の効能がしばしばその投与に関連する用量
に依存する毒性によって制限される。例えば腫瘍の治療
では骨髄抑制と心筋毒性が典型的な有害な副作用である
〔ｓ、Ｔ。
Ｃｒｏｏｋｅｓ″Ｇｏａｌｓ　　ｆｒｆ　Ａｓｔｈｒａ
ｃｙａＬｉｓａ　　ＡｎａｌｏｇＤｇｑｓｍｌｏｐｔｎ
ａ＊ｔ　ａｔ　Ｅｒｔｓｔｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｍｓ　”　。
Ａｎｔｈｒａａｙｒ：１ｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒａｎｔ　　
５ｔａｔｓａ　　ａｎｄ　Ｎｅｗ治療では腫瘍に付随す
る抗原に対抗する抗体にアントラサイクリンを結合して
これらの化付物の治療上の効能を改善する試みが行なわ
れている。この方法で薬を腫瘍部位に供給又は艷集中し
”体内の正常細胞へのその有害な副作用を低減できる。
腫瘍に付随する抗原に対する多クローン性又は単クロー
ン性抗体と結合したアントラサイクリ／、アドリアマイ
シン（ＡＤＨ）又はダウノマイシｙ（ＤＡＵ）は当莱者
に知られている〔例えば、Ｌｃａｔｔａｇｏ　　ａｔ　
ａｔ、。
”　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｆｏｕｒ　　
Ｄａｓｓｏｍｙａｔｎ　−ＭｏｓｏｃＬｏｎａｔ　Ａｓ
ｔｔｂｏｄｙ　７９１　Ｔ／　３６　Ｃｏｓｊｓｇａｔ
ｅａＩＩ’ｉｔｈ　　Ａｓｔｉ−Ｔｓｒｎｏｘｒ　Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ”＋１ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃａｒ＊３３、ｐ
ｐ、７３７−４４（１９８４）及びＲ，Ａｒｎｏ％−Ｃ
ａ１．、−　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ａｓｄ　ｉｎ　Ｖｉｖ
ｏ　Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆＣｏ外ｊｓｇａｔｅａ　　
げ　Ｄａｓｓｏｍｙａ　ｉｓ　　Ｗｉ　ｔん　Ａｓｔ　
ｉ−ＴｓｍｏｒＡｓｔｉｂｏｄｉｅａ”　、Ｉｔｎｍｓ
ｓｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｍｖ、ｅ　６２　。
ｐｐ、５−２７（１９８２）参照〕。
アントラサイクリ／を抗体に付層させるのに最も多（用
いられる方法はアントラサイクリンのアミノ糖部分の連
鎖（結合）を利用することである。例えばアミノ糖を過
沃素酸ナトリウム処理で酸化して、シック塩基生成によ
って抗体上のりシン残基に直接付着させる〔例えば、Ｅ
、Ｈ５ｒｖｉ　ｔｇｇｔ　ａに、、”Ｔｈｅ　Ｃｏｖａ
ｌａｎｔ圧ｉｓｄｉｎｇ　　ｏｆ　Ｄａｓｎｏｍｙ　−
ｅｉｆ＆　ａｎｄ　　Ａｄｒｉａｍｙｏｉｎ　　ｔｏ　
　Ａｎｔｉｂｏｄｉｍｓ、ｊｌ’ｉｔルＲｅｔｅｎｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｔｈ　Ｄｒ％Ｌｇ　ａｎｄ　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙＡｃｔｉｖｉｔｉａａ　”　、Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒａａ、＊　３５　＋　ｐｐＡ　１８２−８６（１９７
５）参照〕。別の方法ではアントラサイクリンのアミノ
糖の抗体のカルボキシル基へのカルボジイミド媒介Ｍ会
を介してアントラサイクリンを抗体に結合する〔例えば
、Ｅ、Ｈｓｒｗｉｔｚ　ａｔ　ａｌ、、ａｕｐｒα参照
〕Ｏそしてアントラサイクリ／のアミノ糖と抗体上のア
ミノ基のグルタルアルデヒドを用いた架橋結合でアント
ラサイクリンを抗体にリンクすることもできる〔例えば
、Ｍ、Ｅ、Ｈ，、−ＩｓＬｇｓ　　ａｔ　　ａｌ、ｅ　
”　ｓ％Ｖｉｔｒｏ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆＤｃｓ
ｓｏｍｙｃｉｓ　　−Ａｎｔｉ　−Ａｌｐ五ａ　　Ｆｅ
ｔｏｐｒｏｔａｉｎＣｏｎｊｘｇａｔａ　　ｏｓ　Ｍｏ
％ｓｓ　ｌｌａｐａｔｏｍａ　　Ｃａ１１ｍ　”　。
照〕。然し、抗体への結合でアントラサイクリｙのアミ
ノ糖部分を修飾したイムノコンジュゲートについての研
究はコンジュゲートした薬（アントラサイクリン）の細
胞阻害活性が低下したことを示し又いる〔例えば、Ｒ、
Ａ　ｙ−％Ｏ％ａｔ　ａｌ、、ａｕｐｒａｅｐｐ、７　
８参照〕。更にアントラサイクリン類似体の研究はその
アミノ糖でのアントラサイクリンの修飾が母体の医薬に
比して医薬類似体の細胞阻害活性の減少を生ずることを
示している〔例えば、Ｋ、Ｙａｍａｍｏｔ。
ａｔ　ａｌ、、”Ａｓｔｉｔｕｍｏｒ　Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ　ｏｆ　ＳｏｍｅＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　　ｏｆ　
Ｄａｕｎｏｒｎｙｃｉｓ　ａｔ　Ｔｈｅ　Ａｍ１ｓ。
ａｎｄ　Ｍｅｔｈｙｌ　Ｋｇｔｏｎｍ　Ｆｔｎｃｔｔｏ
ｓａ”、Ｊ、Ｍｇｄ。
Ｃｈａｍ、、１５．ｐｐ、８７２−７５（１９７２）参
照〕。
アントラサイクリンの１４−炭素（Ｃ−Ｘ４）位置で直
接抗体に結合したアントラサイクリ／、ダウノマイシン
の更に別のイムノコンジュゲートも製造されている。然
し、腫瘍細胞に対するこれらのイムノコ／シュゲートの
選択的な細胞阻害活性は容易に再現できず、２０μ？／
成の濃度に３いてのみ一員して再現された（　ＬＧａＬ
Ｌａｇｏ　　ａｔ　　ａＬ、＊ａｓアｒａ　参照〕。
日本特許出願昭５９−２７４６５８号（特開昭６１−１
５５３４４号）は４３−ケト−アシルヒドラゾ／結合を
介しての抗体へのアントラサイクリンのコンジュゲート
形成を開示している。このコンジュゲート形成は抗体の
誘導体を形成して次に誘導体をアントラサイクリンと反
応させる方法によって達成される。抗体の誘導体形成は
望ましからざる非特異的反応を伴ない、極めて低いア／
トラサイクリン：抗体比が得られるのでこのような方法
は望ましくない。
第１の方法では、ヒドラジンの共存下で抗体をカルボジ
イミドで処理してヒドラジド抗体誘導体として、これを
次にアントラサイクリンと反応させて、アントラサイク
リ／を抗体構造に直接リンクした。然し得られたイムノ
コ／シュゲートは抗体分子が凝集する傾向かある。更に
この方法は仇体分子上にカルボ／酸基が必畳であるが、
その数が限られているので、これらのイムグツ／シュゲ
ートは低い（約１．１−１．３）のアントラサイクリン
：抗体比を有している。
第２の方法は抗体を無水コハク酸と反応させて抗体のア
ミド酸誘導体を得る。この誘導体を次にヒドラジンと反
応させて抗体ヒドラジド誘導体として、これを次にアン
トラサイクリン、ダウノマイシンと反応させた。抗体誘
導体とヒドラジンとの反応が特異的では無く、所望のヒ
ドラジド誘導体以外に、異なった抗体誘導体混合物を生
成するので、この第２の方法はめちゃめちゃである。従
って、特願昭５９−２７４６５８号に示されているよう
に、抗体に対するアントラサイクリンのモル比は極めて
低い（約１、日本特許出願公開公報合本２６４頁　第１
欄参照）。
最後に他のアントラサイクリンヒドラゾンがＧ、Ｌ、Ｔ
ｏ％ｇ（１９７８）；７’、Ｓｍｔｔん　ａｔ　　ａｌ
、、Ｊ、Ｍｇｄ、Ｃｈａｍ、。
２１、ｐｐ、２８０−８３（１９７８）；及びＲ，Ｔ、
Ｃ。
Ｂｒｏｗｎｉｅｓ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｊ、ｃに−ｍ、
ｓｏｅ、、ｐｐ、６　５９−６１（１９８６）に開示さ
れている。米国特許第４．１１２゜２１７号も参照され
たい、これはダウンマイシン及びアドリアマイシンのビ
スヒドラゾンを開示している。
他の研究では、細胞阻害活性の薬効を増し且つ薬の毒性
を低減するために、アントラサイクリンを高分子量キャ
リヤー例えばデキストラン又はポリグルタミン酸にリン
クさせている。〔例えばＲ，Ａｒｎｏｎ　ａｔ　ａｌ、
、５ｓｐｒａ、ｐ、　５及びＥ、Ｈｓｒｖｉｔｚ　ａｔ
　ｔｓＬ、、−５ｏｌｕｂｌｅ　Ｍａｅｒｏｍａｌｇｅ
ｓｌｍａａｓ　　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　　ｆｏｒ　　Ｄａ
ｓｓｏｒｕｂｉｃｉＸ、Ｊ、Ａｐｐｌ。
Ｂｉｏｃｈａｍ、、２．ｐｐ、２５　３５　（１９８０
）参照〕。これらのキャリヤーにリンクされたアントラ
サイクリンは腫瘍に付随する抗原に対抗する抗体とも共
有結合的に結合されていて、腫瘍細胞に特異性のある細
胞阻害性医薬を目的とするイムノコンジュゲートを形成
している。例えばカルボキシメチル−デキストランヒド
ラジド橋を介してアドリアマイシンがかかる１抗腫瘍”
抗体にリンクされてＳシ、−万アドリアマイシンのテト
ラサイクリン環のＣ−１３カルボニル側鎖でアドリアマ
イシン分子がカルボキシメチルデキストランのヒドラジ
ン誘導体にリンクされてヒドラゾンを形成していた。抗
体は次にグルタルアルデヒドを用いて、デキストランヒ
ドラジド誘導体にリンクされてアドリアマイシン−ｄ、
ｓ−抗体コンジュゲートが形成された〔Ｒ０Ａｒ％ｏｎ
　ａｔ　ａｌ、ｐ”Ｍｏ５ｏｃｌｏｎａＬ　Ａｓｔｉｂ
ｏｄｉｍｚ　ａｓＣａｒｒｉａｒａ　　ｆｏｒ　　Ｉｍ
ｔｎｓｓｏｔａｒ（Ｈｌｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｄｒｓｇｓ
−。
ａｌ、（ａｄｓ、）、ｐｐ、３６５−８３　（１９８５
）及びＥ。
１１ｓｒｖｉｔｚ　　ａｔ　　ａｌ、＊＠Ａ　　Ｃｏｎ
ｊｓｇｅｂｔｅ　　ｏｆ　　Δｄｒｉａｍｃｙｃｉｎａ
ｎｄ　Ｍｏ５ｏａＬｏｎａｌ　Ａｔ５ｔｉｂｏｄｉａａ
　　ｔｏ　Ｔルｙ−ｔＡｎｔｉｇｍｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｓ　　Ｈｕｍａｎ　ＮａｓｒｏｂｌａｓｔｏｎｃａＣａ
ｌｌｇ　　（％　　Ｖｉｔｒ−”、Ａ％％、Ｎ、Ｙ−Ａ
ａａｄ、Ｓｃｉ、＋４１７゜ｐｐ、１２５−３６（１９
８３）参照〕。
然しキャリヤーの使用はある徳の不利益を必然的に伴な
う。例えばキャリヤーを含有するイムノコ／シュゲート
はサイズが非常に人ぎくインビボで網内皮糸によって迅
速に除去される〔例えばＲ，０，Ｄｉｌ１ｍαｓ　ａｔ
　む、。
”　ＰｒｇｃＬｉ％１ｃｔｓｌ　　Ｔｒｉａｌｓ　　Ｗ
ｉｔル　Ｃｏｍｂｉｓａｔｉｏ舊ａａｆ！ｄ　Ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅｓ　　ｏｆ　Ｔ　１０１　　Ｍｏｎｏａｌｏ
ｎａｌＡｓｔｉｂｏｄｙ　ｃＬｎｄ　Ｄｏｚｏｒｓｂｉ
ａｉｎ”、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｍａ、ｅ４６、　ｐｐ、４
８８６−９１（１９８６）参照〕。キャリヤーを官有す
るイムノコノシュゲートがこのように迅速に除去される
ことは、コンジュゲート形成した医薬が意図された作用
部位、即ち減殺すべき対象の細胞群に全（到達しないの
で治療上役に立たない。更に、高分子量キャリヤーが存
在するとイムノコンジュゲートの安定性に負の作用な与
え、そしてコンジュゲートの抗体の結合活性の低下が示
されている〔例えば、Ｍ、Ｊ、ＥｍｂＬｇｔｏｎ　ａｔ
　ａｌ、ｍ”ＡｘｔｉｂｏｄｙＴａｒｇａｔｉｓｇ　ｏ
ｆ　Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ａｇｅｎｔｓ　”　。
ｐｐ、３２３−２４（１９８５）参照〕。更に腫瘍細胞
について検討しても、高分子量キャリヤーを含有するイ
ムノコ／シュゲートがインビボの腫瘍細胞に局存できる
という確証が無い。直接的にコンジュゲートした医薬−
抗体コンジュゲートの腫瘍細胞へのインビボでの局在化
を示しているＣ、Ｈ，Ｊ、Ｆｏｒｄ　　ａｔ　　ａｌ、
、”Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｓ　　ａｎｄＴｏｚｉｃｉ
ｔｙ　５ｔｓｄｙ　ｏｆ　ａ　Ｖｉｎｄａａｉｔ＊ａ−
Ａｎｔｉ−ＣＥＡＣｏｎｊｕｇａｔｅ　　ｉｓ　Ｐａｔ
ｉｅｎｔｓ　Ｈ７ｉｔ五Ａｄｖａ算ａｇｄＣａｎ６ｅｒ
　”　、　Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎａｍｒｒ　　４７　、３５
　４２（１９８３）と比較されたい。
このように特異的結合及びキャリヤーを使用する抗体へ
のアントラサイクリンのコンシュゲート形成が開示され
ている。上述したようにこれらのイムノコンジュゲート
の使用は使用した特異的結合又はキャリヤーに由来する
はっきりとした不利益を必然的に伴なっている。
〈課題を解決するための手段〉 本発明は、減殺の対象に選ばれた標的細胞集団に対抗す
るようになっている抗体１個当り、リンカ−アームを介
して複数個の細胞阻害性のアントラサイクリン分子をリ
ンクさせる新規な化学機構を提供する。本発明によれば
、各アントラサイクリ／はリンカ−アームを介して抗体
にリンクされて２す、アントラサイクリ／の１３−ケト
位置のアシルヒドラゾン結合によってアントラサイクリ
／はそのリンカ−に結合されていて、本発明の新規なイ
ムノコンジュゲートが形成されている。例えば本発明の
好ましい態様は新規なアドリアマイシン（＠ＡＤＭ″′
と略記する）ヒドラゾン訪導体（ＡＤＭ−ＨｚＮ”と略
記する）の合成を伴ない、これが次にチオール化した抗
体と縮合して、アンカーアームを介してのアントラサイ
クリンの抗体への付着を生じた。ＡＤＨのＣ−１３位置
に形成されたアシルヒドラゾン結合はＡＤＨのリンカ−
への付着部位として働ら（。更にリンカ−内には抗体の
付着部位としてジスルフィド結合が存在している。
第２の好ましい態様によれば、ＡＤＨ−ＨｚＮが還元さ
れてスルフヒドリル基を生じ、得られた新規なヒドラゾ
／訪導体がマレイミド誘導体となった抗体と縮合した。
これはＡＤＨのＣ−１３位置にり／カー付着部位として
のアシルヒドラジン結合を有するり／カーアームの形成
及びリンカ−内に抗体のリンカ−付着部分としてのチオ
エーテル結合の形成を生じる。これらの態様から明らか
なように、本発明は、本発明のイムノコンジュゲートの
製造に有用なアントラサイクリ／の新規なアシルヒドラ
ゾ７ｔｆ９導体を提供する。
本発明のイムノコンジュゲートは約４−１０のアントラ
サイクリ／：抗体モル比を有し、且つ標的として選ばれ
た細胞を減殺する抗体並びに細胞従性医薬（アントラサ
イクリ／）の活性を保持している。イムノコンジュゲー
トのりｙカーアームへのアントラサイクリ／の付着部位
にアル酸感受性のヒドラゾン結合、及び更に本発明の好
ましい態様のリンカ−アーム内のジスルフィド又はチオ
エーテル結合は、還元性及び酸性条件例えば細胞内例え
ばリソンーム小胞内で一般的に遭遇するかかる条件下で
、活性な医薬（アントラサイクリ／）の放出に理想的に
適しているものである。
本発明のイムノコンジュゲートは医薬組成物、例えば本
発明のイムノコンジュゲートの少なくとも１の医薬上有
効量と医薬上許容し得るキャリヤーよシ成る組成物とし
て使用される。本発明は又、減殺すべき所望の標的に選
ばれた細胞集団に細胞阻害性の医薬を選択的に供給する
方法並びに医薬上許容し得る方法で本発明の組成物の医
薬上有効量を補乳類の治療のために使用することも包含
するものである。
好ましくは、イムノコンジュゲート、医薬組成物及びこ
こに開示された方法は、疾病例えば癌及び他の腫瘍、非
細胞破壊性のウィルス性又は他の病原体性感染、及び自
己免役性疾恵の治療で、標的細胞を優先的に減殺する対
象に選ばれた細胞集団に細胞阻害性のアントラサイクリ
／医薬を命中させるための有用な方法を提供する。
式ｌは本発明のイムノコ／シュゲートの製造に使用する
新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体（ＡＤＨ−Ｈ
２Ｎ）の合成スキームを示す。
式２は単クローン性抗体（”ＭＡＥ’と略記）を先ず、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（′５ＰＤＰ″と略記）と２−イミノチオ
ラン（“２−ＪＴ”と略記）のいずれかでチオール化し
、次にＡＤＭ−ＨｚＮと反応させて、ＡＤＨの１３−ケ
ト位置にヒドラゾン結合とり／カーアーム内にジスルフ
ィド結合を有する本発明のイムノコンジュゲートを形成
する、本発明の第一の態様のイムノコンジュゲートを合
成するスキームを示す。
式３は本発明の新規なＡＩ）Ｍ−ＨｚＮ（誘導体）を先
ず還元して、次にこれをスクシンイミジル−４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチレート（“５ＭＰＥ″と略記
）処理した抗体と反応させて、その構造にチオエーテル
結合のあるリンカ−アームを有するイムノコンジュゲー
トを形成する本発明のイムノコンジュゲートの合成法の
スキームを示す。
ここに開示した発明をよシ完全に理解できるよ５に、以
下の詳細な説明を加える。
本発明は新規アントラサイクリン・イムノコンジュゲー
ト、新規なアントラサイクリンアシルヒドラゾン誘導体
、それらの製造方法、疾病例えば癌及び他の腫瘍、非細
胞破壊性のウィルス性又は他の病源体性感染、及び自己
免疫性疾患の治療で減殺すべき所望の選ばれた細胞集団
に細胞阻害性のアントラサイクリンを供給する医薬組成
物及びその方法に関する。より特には本発明は、選ばれ
た細胞集団に対抗するように定められた抗体で、その構
造にり／りしている（！数個のアントラサイクリン分子
を有する抗体から成るイムノコ／シュゲートに関する。
アントラサイクリン分子は共有結合的に抗体に結合され
ていて、％（アとトラサイクリン）医薬分子と抗体との
間にリンカ−アームが形成されていて、す／カーはアン
トラサイクリンの１３−ケト位置のアシルヒドラゾン結
合でアントラサイクリンに付着されている。この形成は
、先ず新規なアントラサイクリンヒドラゾ／誘導体を形
成し、次に適切な特異性を有する抗体と反応させる段階
的な方法で達成できる〔通常の抗体カッブリフグ法の詳
細については例えば、Ｒ，Ｒ，Ｈａｒｄｙ。
”Ｐｓｒｉｆｉａａｔｉｏｖｓ　ａｔｕｉ　Ｃｏｕｐｌ
ｉｎｇ　６／　ＦｌｓｏｒｇｓｃｚｎｔＰｒｏｔｅｉｓ
ａ　　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　　ｉｎ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｔ
ｍａｔｒｙ　　”　。
Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　Ｅｚｐｍｒｉｍｍ％ｔａｇ
　　Ｉｍｔｎｓｘｏｌｏｇｙ　　。
Ｖｏｌｕｍｅ　１　：　Ｉｎｍｓｓｏｃｈｍｍｉｌｎｍ
５ｓｏｃｈ、１Ｖａｉｒ　ａｔｃＬＪ、（ｇｄａ−）ｓ
ｊｌＦ−３１，４３１，１２（４ｔＡＥｄ。
１９８６）参照〕。リンカ−のアントラサイクリンへの
付着点がアントラサイクリンのＣ−１３位置のアシルヒ
ドラゾンの形である限り、イムノコ／シュゲートのアン
トラサイクリン及び抗体成分を結んでいるり／カーアー
ムの長さは変シ得る。υ７カーアームは更に別の結合、
例えばジスルフイド、チオエーテル、アミド、カルバメ
ート、エーテル又はエステル結合をアントラサイクリン
を抗体に付着させ℃いる点の間の全長に沿って有し得る
。
本発明のイムノコ／シュゲートを形成するアントラサイ
クリンは１３−炭素（Ｃ−１３）位置にケト基を有して
いる如何なるアントラサイクリンとなり得る。かかるア
ントラサイクリ／には、これに限定されるものでは無い
が、アドリアマイシン、ダウノマイシン、デトルビシ７
（ｄａｔｏｒ−ｘｂｉｅｉ％）、カルミノマイシン、イ
ーダルビシン（ｊｄαデ舊−ｂイｅｉｎ　）、エビルビ
シン（−ｐ（デ％ｂイＣ４ｎ）、エソルビシア（ｇｓｏ
ｒｓｂｉｅｉｎ）、４’−Ｔ　ＨＰ−アドリアマイシン
、ＡＤ−３２及び３′−デアミノ−３’−（３−シアノ
−４−モルホリニル）−ｆキソルビシン（ｄｏｚｅデ５
ｂｓｅｓ％）カする（　Ａ、Ｍ、Ｃａａａｇｚａ＊＠Ｅ
ｓｐａｒｉｍｍｓｔａＪ　５ｔｓｄｉａａ　ｏｓＥｚｐ
ａｎｃｔｉｎｇ　Ｒｏｔｓ　　＜ｓ　Ｃａ５Ｃｅｒ　Ｔ
ｒｅａｔｍｍｓｔ＋Ｍ。
Ｏｇａｗａ　　ａｔ　　ａｌ、（ａｄｓ、）、ｐｐ、４
３９−５２（３９−５２（Ｅｘｃｅｒｐｔａ　　１９８
４　）参照〕 本発明のイムノコ／シュゲートを形成する抗体は絶滅又
は減殺を望む特定の細胞集団に対して反応性の如何なる
抗体ともなシ得る。かかる抗体の例には、これに限定さ
れるものでは無いが腫瘍に付随する抗原例えば癌、黒色
腫、リンパ腫、骨及び軟質組織向＠並びに他の腫瘍で見
出される抗原と結合する抗体、ウィルス又は他の病原体
に付随する抗原と結合する抗体及び異状細胞表面抗原と
結合する抗体が包含される。これらの抗体は多クローン
性又は好ましくは単クローン性であって、当業界で充分
に確立されている方法で製造できる〔製造され、コンジ
ュゲートに用いられる腫瘍特異性の多クローン性抗体に
ついては）例えば、Ｒ９Ａ、Ｄａｊ／’ａｇａｒ　　ａ
ｔ　　ａｌ、＊”Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆＭｓ
ｒｔｎｍＬｙｎｓｐｈｏｍａ　　ａｎｄ、Ｍｍｌａｓｏ
ｍａ　Ｃａ１ｌｓ　　６ｙ　　Ｃｈｉｏｒａｔｎｂｓｃ
ｉトロ２、、、．２９−４５（１９８２）及び（製造さ
れた腫瘍特異性率クローン性抗体について）Ｍ、Ｙａｈ
　ａｔ　ａｌ。
ＣｇＨＳｓｒｆａｅｇ　　Ａｓｇｊｙｇｓａ　　ｏｆ　
　Ｈｓｍａｎ　　ＭａｌａｓｏｖｎａＩｄｅｎｔｉｆｉ
ｅｄ　ｂｙ　Ｍｏ５ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ
　、”Ｆｒｏｇ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７６、ｐｐ、２９２７
　３１（１９７９）及びノ、Ｐ、Ｂｒｏｖｙｎ　ａｔ　
ａｌ　、　、−５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｃｈａｒａａｔ
ｇｒｉｚａ−ｔ　ｉｏｎ　ｏ　ｆ　Ｈｓｕｓｇｓ　Ｈａ
　Ｅ　ａｎｏｍａ−Ａｍ　ａ　ｏｅ　ｉａ　ｔｇｄ　Ａ
ｓｔｉｇｅｓｐ　９７　Ｗｉｔｈ　Ｍｏｎｏｅｌｏｔｓ
ａ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’”　／。
Ｉｍｍ％ｎｏ１．．１２７（／１６２）＊Ｐｐ−５３９
４６（１９８１）参照〕。例えばヒトの肺癌細胞に特異
性のある単クローン性抗体Ｌ６、及び骨原性肉關胞に特
異性のある単クローン性抗体、７９１Ｔ／３６を使用す
る。更にインターナリゼーションされていない又は好ま
しくはインターナリゼーションされた抗体が用いられる
。ここで使用する用語“抗体”には完全な抗体分子又は
抗体分子の活性な結合領域を有するフラグメント例えば
Ｆｅ　ｂ又はＦ（αｂ′美　を包含するものとする。単
クローン性抗体を用いる時は、これに限定されるもので
は無いがマウス又はヒト起源の又はキメラ抗体と抗体が
ある。
従って本発明のイムノコンジュゲートの抗体は、抗体が
反応性である特定の細胞集団にアントラサイクリ／分子
を運ぶ役割を果す。例えば腫瘍細胞面に見出された抗原
に対抗するようになっている抗体はこれらの腫瘍細胞と
結合し且つそのアントラサイクリ／をこれらの腫瘍細胞
に供給するし、ＡＩＤＳを起こすヒトの免疫欠損ウィル
ス（ＨＩＶ）の蛋白質に対抗するようになっている抗体
はその細胞阻害性アントラサイクリンをＨＩＶ感染細胞
に供給する。抗体が反応する特定の細胞集団の内部又は
部位での医薬アンドラサイクリンの放出はこれらの特定
の細胞の優先的減殺を起こす。従って本発明のイムノコ
／シュゲートは、絶滅すべて特定の細胞集団が検出され
、細胞集団がイムノコンジュゲートと結合できる細胞面
抗原を有していると、如何なる疾病の治療にも有効であ
る。本発明のイムノコンジュゲートが有効な疾病には、
これに限定されるものでは無いが、癌及び池の腫瘍、非
細胞破壊性のウィルス性又は他の病原性感染例えばＡＩ
ＤＳ、ヘルペス、ＣＭＶ（サイトロメガロウイルス）、
ＥＢ〆（ニブスタイ／−バーウィルス）、及び５ＳＰＥ
（亜急性硬化性汎脳炎）、及び慢性関節リウマチが包含
される。
理論付けられていないが、抗体にり／りされているアン
トラサイクリン分子、即ち本発明のイムノコ／シュゲー
トの形のアントラサイクリ／は抗体特異性を媒介として
減殺すべて標的細胞に運ばれ、そして次に膜に結合した
コンシュゲート形成した抗体及びリガンドのイ／ターナ
リゼーショノに到る同一のエンドサイトシス的経路で細
胞内九人ることができると考えられている〔例えば、１
．Ｐａａｔａｎａｔ　　ａｌ、＊”Ｐａｔｈｗａｙ　ｏ
ｆ　Ｅｔｓｄｏｃｙｔｏａｉｇ”＋ＥｎｄＯｅ５／１０
８％ａ−１、Ｐａａｔａｎ　ａｔ　　ａｔｌ、（ａｄｓ
、）、ｐｐ、１−１−４４（Ｐｊｓｓｓ　Ｐｒｅｓｓ　
　１９８５）参照〕、細胞の内に入るや、イムノコンジ
ュゲートを含むエンドサイトシス小胞が１次すソソーム
と融合して２次リンソームを形成する〔例えば、Ｍ、Ｊ
、Ｅｍｂｌａｔｏｎ　ａｔ　ａＬ、＋ａｕｐｒａ＋ｐ、
　３３４参照〕０７／トラサイタリン分子はイムノコ／
シュゲートの抗体に酸感受性のアシルヒドラゾ／結合を
介して結合しているので、イムノコ／シュゲートのエン
ドサイトシス小胞及びリゾソームの酸性環境はイムノコ
／シュゲートからのアントラサイクリ／の放出を生じる
。さらに放出されたアントラサイクリ／は児全な細胞阻
害活性を発揮する殆んど変性されていない医薬（アント
ラサイクリン）と考えられる。
従ってイムノコンジュゲートの酸感受性のヒドラゾン結
合は標的細胞内で細胞阻害薬の放出にとって極めて好都
合でアリ、イムノコンジュゲートのこれらの細胞に対す
る細胞阻害性を増進する。
別の方法では、ヒドラゾン結合が標的細胞のすぐ傍らの
外部環境又はそれを取巻（酸性及び還元性条件、即ち腫
瘍の部位の条件で開裂して医薬アントラサイクリンを放
出してＩｎ瘍細胞にとりこまれても良い。
本発明のイムノコンジュゲート及びその製造方法を、ア
ントラサイクリン、アドリアマイシンをさまざまの抗体
とコノシュゲート形成された好ましい態様で例示する。
先ず新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体を２段反
応で合成した。ヘテロ２官能性試薬５ＰＡ）Ｅ（Ｎ−ス
クシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート）をヒドラジンと反応させて、３−（２−ピリジ
ルジテオ）プロピオニルヒドラジドを形成し、矢にヒド
ラジドをアドリアマイシン・ハイドロクロライド（ＡＤ
Ｍ−１：１ｃｔ）と反応させて、ピリジルで採掘したジ
スルフィド部分を持つＡＤＭの新規なアシルヒドラゾン
誘導体を形成した。酸触媒例えばトリフルオロ酢酸をヒ
ドラゾンの形成促進に使用できる。形成された誘導体は
アドリアマイシン１３−１３−（２−ピリジルジテオ）
プロピオニル）ヒドラゾン−ハイドロクロライド（ＡＤ
Ｈ−ＨｚＮ）と命名された（式１参照）。得られたイム
ノコンジュゲートは、アシルヒドラゾン結合で各ＡＤＨ
のＣ−１３位置に付着していて、更にリンカ−アームが
それによって抗体に付着しているジスルフィド結合を有
しているす／カーアームによって単クローン性抗体にコ
ンジュゲートされている（ｉ数個の）ＡＤＭ分子から成
る。（式２参照）。
本発明の第２の態様は、上述のＡＤＭ−ＨｚＮを更に還
元剤ジチオトレイトール（′″ＤＴＴ”と略称する）又
はトリブチルホスフィンで還元して１３−ｔ３−（メル
カプトプロピオニル））アドリアマイシンヒドラゾンと
した、第２の新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体
の合成を伴な５゜（式３参照）。この誘導体を例えば抗
体とスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレート（５ＭＰＥ’と略称する）との反応で、マ
レイミド基を付着させである単クローン性抗体と次に反
応させた。式３に示すように、ヒドラゾン結合で各ＡＤ
ＭのＣ−１３位置に付着して２り且つ抗体へのり７カー
アームの付着部分としてチオエーテル結合も有している
１７７カーアームを有するイムノコ／シュゲートが形成
された。従って、結合がアントラサイクリンの１３−ケ
ト位置の酸感受性のヒドラゾ／結合を有している限り、
医薬（アントラサイクリ／）と抗体を結合しているリン
カ−アームが複数個の構成分と結合とから成ることがで
きることは明らかである。
本発明は又、式１．　ＩＩ又は■を有する１３−ケトを
有するアントラサイクリ／の新規なアシルヒドラゾン誘
導体も提供することが仰られる： 但し： Ｒ１ｆ−ＩｃＨ，、ＣＢ、ＯＲ％ＣＨ，０ＣＯ（ＣＨ，
）、ＣＨ，又ｔｄＣＢ２０ＣＯＣＨ（ＱＣ，Ｈ，）ｔｆ
あシ；Ｒ１は （上式中でＸ＝、に、Ｎｏ、　　又はハロゲン）であり
；Ｒ”　ｒｒｉ、ｏｃｌｌｓ　、　ＯＨ又ハ水Ｚテアリ
；Ｒ４はＮＨ，、ＮＨＣＯＣＦ、、４−モルホリニル、
３−シアノ−４−モルホリニル、ｌ−ピペリジニル、４
−メ）キシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベ
ンジルアミン、シアンメチルアミン又は１−シアノ−２
−メトキシエチルアミであり； Ｒ１は０Ｒ１０−ＴＨＰ又は水素であシ；Ｒ”　Ｖｉ、
ＯＢ　５１ｄ水ｔｒあシ、ＲｓがＯＨ又１ｄＯ−ＴＨＰ
の場合にはＲ６はＯＨでは無いものとし；且つ餡は１乃
至ｌＯの整数である。
但し： Ｒ１はＣＢ８．ＣＨｐＨ，ＣＭ、０ＣＯ（ＣＢ、）、Ｃ
１ｌ、又ｄＣＥ、０ＣＯＣＨ（ＱＣ，Ｅｌ、）、　であ
、Ｑ　；Ｒ”　Ｆｉｏｃｔｔ、、　Ｏｔｉ　又ハ水ｇテ
アｐ　；Ｒ４はＮＨ，、ＮＥＣ０ＣＦ、、４−モルホリ
ニル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニ
ル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミ／
、ジベンジルアミン、シアノメチルアミン又はｌ−シア
ノ−２−メトキシェチルアミンであり； Ｂｓは０Ｈ１０−ＴＨＰ又ｕ水ＩＡ−ＴＭ）；Ｒ”　ｔ
ｒｉＯ＆　又ハ水Ｔ、テア’）、Ｒ１がＯＨ又は０−Ｔ
ＨＰの場合にはＲ６はＯｎでは無いものとし；且つ５は
１乃至１０の整数である。及び 但し； Ｒ１はＣＨ３、ＣＭ、ＯＨ％ＣＨ，０ＣＯ（ＣＨ，）、
ＣＨ，又はＣＭｔＯＣＯＣＨ（ＱＣ，Ｈ，）、であり；
Ｒ雪は （上式中でＸ、、、Ｈ，ＮＯ，又は）・ロゲン）であシ
；Ｒ３はＱＣＨ，、ＯＨ又は水素であり；Ｒ４及びＲ７
は独立して水素、アルキル、置換基を有するアルキル、
シクロアルキル、置換基を有するアルキル、アリール、
置換基を有するアリール、アラルキル又は置換基を有す
るアラルキルであるか；又はＲ４、Ｒ７及びＮが一緒に
なって４−７員環を形成して３す、而して該環は場合に
よっては置換基を有し得るものとする；Ｒ＊は０Ｒ１ｏ
−ｒＨｐ又は水素であシ；Ｒ６はＯＨ又は水素であり、
ＲｉがＯＨ又は０−ＴＨＰの場合にはＲ６はＯＨで無い
ものとし；且つ鴬はｌ乃至ｌＯの整数である。
上に開示したアントラサイクリンアシルヒドラゾｙ類は
本発明のイムノコンジュゲートの製造の新規な中間体を
戎わして２す、本明細書で述べる好ましい態様で示すよ
うに、ＡＤＭ−ＨｚＮ及び１３−１３−（メルカプトプ
ロピオニル））アドリアマイシンヒドラゾンでそれぞれ
代表されるものである。
上式から明らかなように、本発明のアシルヒドラゾン中
間体は多数の既知のアントラサイクリン例えばアドリア
マイシン、ダクノマイシン及びカルミノマイシ／のいず
れのヒドラゾンも包含する。更に、この中間体にはアン
トラサイクリン構造の特定の部位な銹導体に変えたもの
のアシルヒドラゾン（例えば４／−ｒ　ＨＰ−アドリア
マイシンヒドラゾン及び３′−デアミノ−３′−（３−
シアノ−４−モルホリニル）アドリアマイシンヒドラゾ
ン）を包含する。このような後者の中間体は、先ずアン
トラサイクリ／を誘導して所望の類似体を形成し、次に
その類似体を用いて本発明のヒドラゾン中間体を製造し
て合成することができる。公知のアントラサイクリ／類
似体には下記の特許に記載されたものが包含される：米
国特許第４，４６４，５２９号及び４，３０１．２７７
号（３′−デアミノ−３’−（４−モルホリニル）又は
３′−デアミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリニ
ル）アントラサイクリン類似体〕、同第４，２０２，９
６７号及び４．３１４，０５４号（３′−デアミノ−３
’−（１−ピペリジニル）又は３′−デアミノ−３’−
（４−メトキシ−１−ピペリジニル）アントラサイクリ
ン類似体）、同第４，２５０，３０３号（Ｎ−ベンジル
又はＮ、Ｎ−ジベンジルアントラサイクリ７類似体）、
同第４５９１．６３７号（Ｎ−メトキシメチル又１ｔＮ
−シアノメチル−アントラサイクリア類似体）。
及び同第４３０３．７８５号（アントラサイクリンのア
セタール類似体）。これらの公知のアントラサイクリ／
類似体は上述のように（式１呑照）反応させて新規なア
シルヒドラゾンをつ（ることができ、矢にこれを前記の
所望の特異性を有する抗体とコンジュゲートさせること
ができる。
別の方法では、誘導体でないアントラサイクリン例えば
アドリアマイシン、ダウノマイシン又はカルミノマイシ
ンから本発明の方法で誘導体の形になっていない本発明
のアントラサイクリンアシルヒドラゾン中間体を先ずつ
（つて、次にこの新規な中間体から次に所望の置換基を
有する新規なアシルヒドラゾンを＃直することかでざる
。例えば、米国特許用４，４６４．５２９号記載の方法
を用いて、ＡＤＭ−ＨｚＮを２，２′−オキシジアセト
アルデヒドを用いる還元的アミノ化によって、そのアミ
ノ糖部分を誘導体に変えて、３′−デアミノ−３′−（
３−シアノ−４−モルホリニル）アドリアマイシンヒド
ラゾンをつくることができる。同様にＡＤＭ−ＨｚＮは
アミノ糖部分を誘導体にして新規なアシルヒドラゾン誘
導体例えば３′−デアミノ−３’−（４−モルホリニル
）ＡＤＭヒドラゾ／（米国特許用４．３０１，２７７号
参照）、３′−デアミノ−３’−（１−ピペリジニル）
　ＡＩ）Ｍヒドラゾン（同第４，２０２，９６７号参照
）、３′−デアミノ−３’−（４−メトキシ−１−ピペ
リジニル）ＡＤＨヒドラゾン及びＮ、Ｎ−ジベンジルＡ
ＤＨヒドラゾ／（同第４，２５０．３０３号参照）、又
はＮ−メトキシメチルＡＤＨヒドラゾ／及びＮ−シアノ
メチルＡＤＭヒドラゾン（同第４，５９１．６３７号参
照）をつ（ることができる。更にＡＤＭ−ＨｚＮは式ｌ
−１０Ｈｓの位置を誘導化して、同第４，３０３．７８
５号記載のように、ヒドラゾンのアセタール誘導体例え
ば４’−ＴＨＰ−ＡＤＭヒドラゾ／をつ（ることかでき
る。
本発明のアシルヒドラゾ／を誘導体に変えるこれらの新
規な方法は、ＡＤＭ以外のアントラサイクリ／例えばダ
ウノマイシン又はカルミノマイシンのヒドラゾンを原料
物質として利用して本発明の範囲に属する新規な化合物
例えばＮ−ぺ／ジルダウノマイシ／ヒドラゾ／又は３′
−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）カルミノマイ
シンヒドラゾンの製造に利用でさることを理解されたい
。
不発明の方法で製造されたアントラサイクリン−抗体イ
ムノコ／シュゲートは、さまざまの検定条件下です／パ
腫及び癌細胞の両方に対してイムノコンジュゲートが抗
体結合活性を保持しており且つ抗体が指向する細胞の減
殺力を有することを示していた。従ってコノシュゲート
の抗体がそれに対向するようになっている（指向してい
る）抗原を有している細胞はアントラサイクリ／によっ
て効果的に減殺されて、適応する抗原を有していない細
胞ｔｉ減殺されなかった。事実、い（つかの実験では、
抗体によって４搬されたアントラサイクリンは等寸のコ
ンジュゲートを形成していないアントラサイクリンより
もより有効であることが判明した。腫瘍細胞への摂取機
構と細胞内輸送機構の差が遊離のアントラサイクリ／と
抗体にコンジュゲートしたアントラサイクリンの間で認
められた効力の差に対応するとみられる。
更に、マウスへのヒトの腫瘍異種移植を用いる研究は、
ある場合には完全な腫瘍後退に到るインビボの腫瘍生長
を阻止する本発明のイムノコンジュゲートの能力を示し
ている。このイムノコ／シュゲートは、コノシュゲート
していた（・アントラサイクリンよりも、より大きな効
力を有して２り且つより大巾に腫瘍生長を阻害すること
が示された。
更にこのイムノコンジュゲートはコンジュゲートしてい
ない医薬（アントラサイクリ／）単独よりも毒性がイ。
以下であって、遊離医薬よりも遥かに多量を動物が耐え
ることができた。本発明のイムノコ／シュゲートの結合
性及び細胞阻害注は、アントラサイクリンのアミノ糖部
分でアントラサイクリンが抗体に直接結合（リンク）し
ている文献に報告されているイムノコンジュゲートより
も遥かにすぐれていることが判明している。それらのア
ミノ糖結合イムノコ／シュゲートは多くは、遥かに低い
アントラサイクリンの抗体に対するモル比を有していて
且つ遊離のものよりも低下した細胞阻害性と低い抗体結
合性を有していた。〔例３５　、　ａｓｐｒａ；及びＲ
，Ｙａｍａｍａｔｏ　　ａｔ　ａｌ、ｒｓｔｐｒａ参照
〕。更参照元明のイムノコ／シュゲートについて行なっ
た安定性試験は、細胞環境でみもれる条件に類似した還
元性且つ酸性条件下でイムノコンジュゲートからアント
ラサイクリ／が放出されることを示した。従って本発明
のイムノコ／シュゲートで認められる高い細胞阻害性医
薬活性の保持は、標的細胞に殆んど変性されていない医
薬（アントラサイクリン）が与えられるという事実で説
明できる。
その上、反応条件を最適化して、異なるイソタイプのい
くつかの抗体を用いて、約４−１０のアントラサイクリ
ン：抗体モル比に達することができた。１０より大のモ
ル比を狙うと、ＡＤＨ−ＨｚＮ誘導体との縮合後に回収
される蛋白質の量が著るしく減る。１０より太ぎいモル
比を得る上での主要な限界はコンジュゲートの水溶液中
での低い溶解度とアントラサイクリ／の蛋白質との物理
的会合によることが判明した。
発明者のインビボ試験は、本発明のイムノコンジュゲー
トが遊離の医薬よりも遥かに大きな抗腫瘍活性並びにそ
の低い全身性毒性を示し、コンジュゲートについての増
加した治療指数を示している。従って本発明は疾病例え
ば癌及び他の腫瘍、非細胞破壊性ウィルス性又は他の病
原体性感染及び自己免疫性疾患の治療用の医薬組成物、
禄合体及び方法も対象としている。より特には、本発明
は少な（とも１のアントラサイクリンを含有するイムノ
コンジュゲートの医薬的有効蓋を医薬上許容し得る方法
で客体咽乳類に投与する咄乳類の疾病の治療方法を包含
する。
本発明の方法の別の態様として、同時又は逐次的に、複
数の異なるイムノコンジュゲート即ち異なるアントラサ
イクリンか異なる抗体を有するイムノコンジュゲートを
、複合化学療法で用いるために、投与することを伴なう
。例えば、コンジュゲートの抗体成分の特異性を変えて
複数種のアントラサイクリ／−イムノコンジュゲートを
使用する、即ちそれぞれが対象とするｉ″１Ｂ胞果団上
に存在する異なる抗原又は同一の抗原の異なる部位又は
エピトープに特異的に結合する抗体を有する複数値のイ
ムノコンジュゲートを使用することを伴なう。これらの
イムノコンジュゲートのアントラサイクリン成分は同一
でも異なっていても良い。例えば、腫瘍面上のさまざま
の抗原の量が不明又は腫瘍細胞集団が抗原発現が不均一
であるか又は、腫瘍部位のすべての腫瘍細胞に充分な量
の医薬を向けられることを確認したい時のある種の腫瘍
の治療ではこの態様が特に有用である。
腫瘍に対して異なる抗原又はエピトープ特異性を持つ複
数種のコンジュゲートの使用は、腫瘍部分に充分な医薬
（アノトラサイクリン）を到達させる可能性を増す。正
常な組織が腫瘍に付随する抗原と同一の抗原をすべて有
している可能性が小さいので、更にこの、預様は高度の
特異性を得るために重要である。（１，Ｈｅ１ｌｓｔｒ
ｏｔｙｃ　ａｔ　ａｌｌ”ｋｌｏｎｏａｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　Ｔｖｙｏ　Ｄａｔｇｔｍ
ｉｓｅｍｔａ６／　　Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｎｔｉｇｅ
ｎ　　ｐ　　９　７　　　Ａｃｔ　　Ｓｙｎｅｒｇｉｓ
ｔｉｃ−ａｌｌｙ　　ｉｎ　Ｃｏｔｎｐｌａｒｎｇｓｔ
−Ｄｇｐｇｎｄｇｎｔ　ＣｙｔｏｔｏｚｉＣ４ｔｙ’。
Ｊ、Ｉｍｍｖ、ｎｏｌ　、１２７　（４１）　、　ｐｐ
、　１５７　６０（１９８１）参照〕。
別の方法として、コンジュゲートのアントラサイクリン
成分だけを変えた複数種の異なるイムノコ／シュゲート
を使用する。例えば特定の抗体をアドリアマイシンにリ
ンクさせて第１のイムノコンジュゲートを形成し、そし
てダウノマイシンにり／りさせて第２のイムノコンジュ
ゲートを形成する。両コンジュゲートを次に治療すべき
容体に投与して、抗体の特異性によって減殺すべきもの
とされた対象の細胞集団の部位に局在化させる。両医薬
が次にその部位で放出される。特定の細胞集団例えば腫
瘍の医薬耐性が不確実である時には、この方法は標的細
胞部位又は内に複数棟の異なった医薬を放出できるので
、この態様は重要である。更なる態様では、２種以上の
アントラサイクリンを特定の抗体にコンジュゲートさせ
て、１３−ケトアシルヒドラゾ／結合を介して抗体にす
べてリンクしている一複数種の異なったアントラサイク
リフ分子をその表面に沿って有しているイムノコ／シュ
ゲートを形成する。この態様のイムノコンジュゲートの
投与Ｆｉ標的細胞の部位又は内部に複数種の異なった医
薬を放出する。
本発明のアントラサイクリン拳イムノコンジュゲートは
、これに限定されるものでは無いが、静脈、腹腔内、経
口、す／パ内又Ｆｉ選定された細胞集団の部位例えば腫
瘍に直接投与することを含めた通常の投与方法を用いる
医薬組成物の形で投与できる。静脈投与が好ましい。さ
らにインビボの処置では抗体フラグメント例えばＦ　ａ
　ｂ又ＦｉＦ（ａｈ’）、又はキメラ抗体から成るイム
ノコンジュゲートを用いることも有効である。
アントラサイクリン・イムノコ／シュゲートよシ成る・
・・本発明の医薬組成物はさまざまの用量形態で使用で
き、その形態には、これに限定されるものでは無いが、
固体、半固体及び液体の投与形態例えば錠剤、丸薬、粉
末、液体溶液又は懸濁液、生薬、高分子マイクロカプセ
ル又はマイクロ小胞、リボゾーム、及び注射用又は輸液
用溶液がある。
好ましい形態は投与形式及び治療上の用途によってきま
る。
これらの医薬組成物には当業者に知られている通常の医
薬上許容されているキャリヤー例えば血清蛋白質、例え
ばヒトの血清アルブミン、緩衝物質例えば燐酸塩、水又
は電解質の塩も包含されよう。
本発明のイムノコンジュゲートについての最も効果的な
投与方法及び用量指針は、疾病のはげしさとその期、患
者の健康状態と治療に対する応答及び主治医の判断によ
る。
それに従ってイムノコ／シュゲート及びその化合物のき
まった用量が個々の患者に投与されよう。然し一般に、
本発明のアントラサイクリン・イムノコ／シュゲートの
有効な用量は約１乃至約１００１ｎ９／　ｓ”のアント
ラサイクリン及び約５００−５０００１Ｗ／鴨２の抗体
の範囲である。
本明細曹に記載した発明をよυ良（理解させるために、
以下の実施例を示す。実施例は例示のためのみのもので
あって、如何なる意味でも本発明の範囲を限定するため
のものでは無い。
実施例１゜ 本実施例はアントラサイクリンの１３−ケト位置のアシ
ルヒドラゾン結合を介してアントラサイクリンが直接に
、単クローン性抗体にリンク（結合）している本発明に
よる新規なアントラサイクリン・イムノコンシュ’ｙ’
−トノｌｌａ法を示す。
本実施例に記載された態様は、ＡＤＨ（アドリアマイシ
ン）が単クローン性抗体にコンジュゲートして、イムノ
コンシュケートのＡＩ）Ｍ分子への付着点としてアシル
七ドラシン結合を有するりンカーアームを有するイムノ
コンジュゲートであって、リンカ−が更に抗体への付着
部分としてジスルフィド結合を有しているイムノコンジ
ュゲートの形成を伴なう。この態様ではＡＤＭの新規な
アシルヒドラゾ／誘導体（ＡＤＨ−ＨｚＮ）も与える。
アドリアマイシンヒドラゾンの合成 本態様のイムノコンジュゲートの製造の第一歩として、
ＡＤＭ−ヒドラゾン誘導体を下記のように先ず合成した
。
０．３成の１Ｍヒドラジン、即ちＮＨ，ＨＥ、、のイソ
プロピルアルコール浴液な３ＮのＴＨＦ（テトラヒドロ
フラン）中１）Ｓ　Ｐ　ＤＰ　（７ｏｍｑ、０．２２ミ
リモル（以下では”　ｒｒＪｄ　”と略記する）の冷溶
液に加えた。０℃で２０ｍ１９％撹拌後、生成物をＣＢ
、Ｃｔｔで抽出し、ブラインで洗浄し、　ＫｔＣＯ。
で乾燥した。温媒蒸発後、得られた生成物を中性アルミ
ナ上でクロマト分離しく５％　Ｍ、ＯＲ，９５％　ＣＢ
、Ｃｔ、　）、２１■（４１％）の３−（２−ピリジル
ジテオ）プロピオニルヒドラジド（式１の化合物２）を
得た。このヒドラジドとアドリアマイシンＥＣ１（日本
のＳαｎｒａｋｓ　１％Ｃ１から入手）（４８ｍ９．０
．０８３　ｔｎＭ　）を５　ｒｎｔＩ）Ｍ　ａ　（ＪＥ
Ｉ　Ｋ溶解し、暗所、室温で６日間撹拌した。反応は逆
相薄膜クロマトグラフィー（７’ＬＣ）（ＭｍＯｎ：　
ＨｚＯ’＝２　：　１−　３％ｗ／ｖ７１ｖ□、ＯＡｅ
含有）で追跡した。この後、溶媒を蒸発し、残渣をＣｔ
　Ｓカラム上でクロマト分離（ｋｈＯＨ：Ｈ，０−３，
２，３％　ｗ／　ｖ　ＮＨ＋ＯＡｃ　を有）した。７ラ
クシヨ７を合併して凍結乾燥し、過剰のＮＨ，ＯＡａ　
　を減圧下で除去した。残渣をＭｍＯｎに溶かしてアセ
トニトリルを加えて４５■（７２％）のアドリアマイシ
ン１３−（３−（２−ビリ゛　ジルジチオ）プロピオニ
ル）−ヒドラゾン・ハイドロクロライド、以後″’ＡＤ
Ｍ−ＨｚＮ”’　（式１の化合物４）と呼ぶ、を得た。
ＡＤＨ−ＨｚＮは次の特性を有していた：ｍｐ）１２５
°色が暗化して明確に測定されず、ＮＭＲ（アセトン−
ｄ６＋δ）１．２５　（ｚ　、３Ｈ，／−６Ｈｇ）、１
．７７（ｍ、ＩＨ）、２．０６（ｍ、１７１／）、２．
３０（ｍ。
ＩＨ）、２．５３（（！、ＩＨ，Ｊ−１５Ｈｇ）、２．
８９−３．１８（ｍ、６＃）、３．７１（ｖａ、ＩＨ）
、３．８５　（ｓ　、　ＩＨ）、３．９７（惧、ＩＨ）
、４．０７（番、３Ｈ）、４．７８（ｓ。
２Ｈ）、５．２１（ｍ、ＩＨ）、５．５８（ｔ、ｌＨ，
Ｊ−７Ｈ，）、７．１２（ｍ、ＩＨ）、７．６４　（ｄ
　、　Ｉ　Ｈ、Ｊ−８１１ｇ）、７．７５（ｆｌＬ、２
Ｈ）、７．９０　（ｔ　、　ＩＨ，Ｊ−８Ｈｚ）、７．
９８　（ｄ　、　ＩＨ，Ｊ−８Ｈｚ）、８．３７（ｄ、
１［、Ｊ−４Ｈｚ）、１０．５０（ａ、ＩＨ）、１０．
５２（ｓ、ＬＨ）、１４．１９　（ｂａ、ＩＨ）；　　
Ｉ　Ｒ（ＫＢデ）３４３８、　ｌ　６７４．１６１８．
１５７９．１４１９．１２８６．１０１６．９８８．６
９８ｃｒｒＬ−’　；ＦＡＢＭＳ　　（グリセロール）
惧／−７５５（ｎ＋１−）、７３７．６４５．６２５．
６０９゜上述のよ５にして調製したＡＤＨ−ＨｚＮ化合
物を対象の単クローン性抗体と反応させる前に、抗体を
チオール化する、即ち抗体分子に反応性のスルフヒドリ
ル基を導入する、必要があった。
使用した単クローン性抗体は：１）５Ｅ９、すべての分
裂ヒト細胞上のトラ／スフニリン受容体と反応性で多種
の組織学的タイプの癌細胞と又又反応性のＩｇＧ、抗体
；２）７’３３Ａ１（以後″３Ａ１”と呼ぶ）、４０Ｋ
ｄヒトＴ細胞抗原と反応性で、多数のＴ細胞白血病でも
発見された１、Ｇ、抗体；３）　　Ｇ２Ｂ、５．５０Ｋ
ｄヒトＢ細胞抗原と反応性で、ヒトＢ細胞す／パ腫とも
反応性のＩｙＧ＞抗体；４）Ｇ２８．１．５０Ｋｄヒト
ＢＭ胞抗原と反応性で、ＢＩｆＪＪ胞リンパ腫とも反応
性のＩ、Ｇ、抗体；及び５）Ｌ６、ヒトの非小細胞肺癌
腫上の糖脂質抗原と反応性の’（１’Ｑａであった。
５Ｅ９及びＴ３３ＡＩ抗体から分泌されたハイブリッド
−マはｔｈｅ　Ａｍａｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ５Ｌｔ
ｕｒｓ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し
た。Ｃ’、Ｂｒ５ｃｋ　　ａｔ　　ａｌ−、＠０％ｇ−
５ｔｅｐ　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　Ｍｏ
ｕｓｅ　　ＭｏｓｏｅｌｏｎａｌＡｓｔｉｂｏｄｉｇｘ
　Ｆｒｏｎ＆Ａｓａｉｔｉｅ　Ｆｌｓｉｄ　　ｂｖＤＥ
ＡＥ−ＡｆｆｉｇｍＬ　　Ｂｌｗａ　　Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐルｙ”、Ｊ、Ｉｍｍｘｘ。
Ｍａｔｈｏｄｓ、５ｂ　、ｐｐ、３１３−１９（１９８
２）の方法に従いＢＡＬＥ／、マウスでつ（られた腹水
流体からそれぞれの抗体を精製した。精製した０２８−
５、Ｇ２８．１、及びＬ６はＪ、Ｌａｄｂａｔｔａｒ及
び１．Ｂｇｌｌａｔｒｏｍ博士（Ｕｎｃ、ｏｇａｓ＋Ｓ
ｇａｔｔＬｇ、／ＦＡ）から提供された。Ｌ６及び０２
８．５抗体から分泌されたノ・イブリンドーマは１９８
４年１２月６日及び１９８６年５月２２日にＡＴＣＣア
クセショ７番号ＨＢ８６７７及び／７Ｂ９１］、０の下
にそれぞれＡＴＣＣに寄託された。Ｇ　２８．１単クロ
一ン性抗体はＣＤ３７抗原の主要エピトープと反応性で
あることが当業者に知られており、Ａ、Ｊ　、Ｍ　ｉ　
ｃんａｅｌ　　（ａｄ、）、Ｌｇ％ｋｏｅｙｔａＴｙｐ
ｉ％ｇ　　１１７，０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ　Ｐｒｇｓｓ（Ｕ、Ｋ。
１９８７）で特徴付けられている抗体の一つである。多
種のこのような抗−ＣＤ３７抗体は市場で入手でざる。
５ＰＤＰによるこれらの抗体のいずれのチオール化も次
のようにして実施した：エタノールに溶かした５Ｐ１）
Ｐ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｕ、ｒｌＬ
　）（５０ｍ＆　）をＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水、８
７．２）中の対象の単クローン性抗体例えば５Ｅ９（５
−１０■／ゴ）、に５−　ｉ　０　ｍＭの最終濃度とな
るように加えた。反応混合物を３０℃で３０ｍ１％培養
した。ＦＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用
いるゲル濾過クロマトグラフィーで未反応５ＰＤＰを５
ＰＤＰ誘導体化抗体から分離した。チオピリジル保ｎ基
は過剰のＤＴＴを用いる還元で除去した。還元した抗体
をＰＤ−１Ｏカラムを通し、遊離のチオール含有抗体な
ＡＤ、＋ｆ−ＨｚＮ訪導体との線導体用いた（式２参照
）。
２−ＪＴを用いても抗体蛋白質上に反応性チオール基が
導入された：　（ｐＨ８，０の５０惰Ｍ　トリエチルア
ミン、５０ｍＭ　Ｎａ１ｌ中の５＝ｌＱＴＶｙの）抗体
を５　１（ｈ＋ａ＃の最終濃度の２−ＩＴ　（Ｐｉｅｒ
ｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ＩＬ）と混合した。
反応は４℃で９（Ｊｍｉ％進行させ、チオール化した抗
体を２；’ｄ　　ＮａＣ１／ＰＢＳで平衡化したＦＤ−
１０カラムで分離した。
抗体に包含された反応性チオール基の数はＧ、Ｌ、Ｅｔ
−Ｃ１゜Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｅｈｍｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
＋８２　＃　ｐｐ、７０−７７（１９５９）の方法に従
って、ＤＴＮＢ　（５、５’−ジチオビス（２−ニトロ
安息香酸）（Ｅ４ｃｔ−１４１５０）を用いて測定した
。
上述のようにチオール化した単クローン性抗体をそれぞ
れＡＤＭ−ＨｚＮにリンクさせた、コンジュゲート形成
を次に実施した〔式２参照〕。
ＡＤＨをメタノールに溶かしＰＢＳ中の５ＰＤＰ−チオ
ール化抗体又は２ＪｆＮαＣｌ／Ｐ　Ｂ　Ｓ中の２−Ｊ
Ｔ−チオール化抗体に加えた。代表的反応では１０当量
のＡＤＨ−ＨｚＮを１０−２０個の反応性チオール基を
有する単クローン性抗体に加えた。コンジュゲート形成
反応物は１晩４℃で培養した。反応混合物を１０，０Ｏ
ＯＸＰで遠心分離し、次にコンジュゲート形成したＡＤ
Ｍを未反応ＡＤＨからＦＤ−１０カラムを通して分離し
た。抗体に結合したコンジュゲート形成したアントラサ
イクリンの蛍は４９５　ｎｒｎ（Ｌ’５−８０３０　）
の吸光度で測定した。抗体蛋白質の量は２８０　ｙｓｍ
（１■／成−Ｌ４０Ｄエニット）の吸光度で測定した。
２８０　ｎｍのＡＤＡｆ吸光度のオーバラップを補正す
るために次式を用いた： ＵＰＬＰ分析を用いてコンジュゲートしていないＡＤＭ
又はＡＤＭ誘導体の存在についてイムノコ／シュゲート
を分析した。ＥＰＬＰは５ミクロｙｌＢ−５ＩＬ　（１
’１８ビードな充填したＰｈａ％ｏｍａ外ａｚカラムを
用いて行なった。コンジュゲート形成していないＡＤＭ
−ＨＣｌ、ＡＤＡｆ−ＦＩＺＮ（０，１ｐｉｆ）、又は
０．５−５μＭのアントラサイクリ／当量を有するイム
ノコンジュゲートをカラムに加えてメタノール及び１０
常Ｍ燐酸アンモニウム、ア！７４．５　（７０：　３０
）を用い１．５１ｎＪ／ｍ＜％で溶離させた。生成した
イムノコンジュゲートはすべて目豆たぬ程度（＜１％）
の未コンジュゲート・アントラサイクリ／しかＨＰＬＰ
分析では含んでいなかった。
本発明のイムノコ／シュゲートの特徴 か（してＮＪＭｉ＆したイムノコンジュゲートはアント
ラサイクリンとそれぞれの単クローン性抗体との間のブ
リッジを形成しているリッカーアームに１３−ケト位置
でコンジュゲートを形成している複素側のＡＤＨ分子よ
り成る。更に遊離のチオール基を有する単クローン性抗
体をチオピリジルで保護したジスルフィド結合を有する
ＡＤＭ−ＨｚＮ誘導体に加えると、ＡＤＭを抗体に結び
つげているす７カーにジスルフィド結合が形成される（
式２参照）。本ＦＪａに従って調製されたイムノコ／シ
ュゲートには、これに限定されるものでは無いが、５Ｅ
９−ＡＬＣＭ−７，５，３／１ｌ−ＡＤＨ−７，０、Ｌ
６−ＡＤＨ−９，０及びＧ２８．ｘ−ＡＤＭ−９，０が
あり、最初の部分がコンジュゲートを形成した単クロー
ン性抗体を示し、次の部分が抗体にリンクしているアン
トラサイクリンを示し、数字はそれぞれのイムノコ／シ
ュゲートのＡＤＭ／抗体のモル比を示す。
このｄａに従って到達でざるＡＤＭ／抗体モル比は、単
クローン性抗体上に導入されたチオール基の数とチオー
ル化した抗体１個に対して加えたＡＤＨ−ＨｚＮ誘導体
の量によってきまった。図１及び２の分散ダイヤグラム
はほぼ８個のチオール基を有する５Ｅ９又は３，４１単
クロ一／性抗体のいずれかについてＡＤＨ−ＨｚＮを導
入した時に、３−４のＡＤＭ／抗体モル比か達成された
ことを示している。典型的にはこれらの反応で蛋白質に
対して１０倍モル過剰のＡＤＭ−ＢＺＮを加えた。１８
−２５個のチオール基を持ったこれらの抗体を用いると
ＡＤＭ／抗体比ｆ′１８−１０に増加した。単クローン
性抗体をチオール化するのに５ＰＤＰを用いても２−Ｉ
Ｔを用いてもＡＩ）Ｍ／抗体比に著るしい差ＦｉＱｌめ
られなかった（図１と２を比較）。然しアントラサイク
リンの抗体へのコンジュゲート形成後の最終蛋白質収率
は、２−ＪＴ−チオール化抗体に比して５ｐｎｐ−チオ
ール化抗体の万が若干高いことが判明した（図３参照）
。５ＰＤＰ−チオール化抗体例えば５Ｅ９及び３，４１
について５０−８０％の蛋白質収率が通常得られたが、
−万２−ｔｒを用いてチオール化した同一の単クローン
性抗体を用いると２０−５０％の収率が得られた。さら
に５ＰＤＰ又は２−ＩＴで行なったコンジュゲート形成
についてＩｇＧ、イソタイプの単クローン性抗体例えば
５Ｅ９及び３．（１を用いると若干良いイムノコンジュ
ゲート収率が得られた（図４及び５参照）。
本発明のイムノコンジュゲートの結合活性は１１２５　
橡ａ抗体を用いた競合的検定用いて決定した。代表的な
抗原陽性及び抗原陰性細胞（ＩＸＩＯ’）を２％　ＦＢ
Ｓを含むＲＰＭｌ　　１６４０の０．１１ｎ！、に懸濁
し、２倍に引紐１ｉ釈したコンジュゲート形成していな
い単りロー／性抗体の０．１成又は５０μｆ／ｍｌ　と
なるよつな濃度のイムノコ／シュゲートと混合した。二
つの細胞懸濁敢を混合しながら４℃でＩＡｙ培養した。
■胞を次に２回洗い、５μｆ／／ｒｔｔの１２５１−標
識化対応抗体（１５０Ｘ１０’　　ｃｐ惧／μを抗体蛋
白質からの特異的活性）を含有する０、１Ｍに懸濁した
。
試料を４℃でＩＡｒ培養し、４℃に冷却したジブチルフ
タレート：ジノニルフタレートの１：１混合物の０．１
５ｄにかぶせた。試料を１０，０ＯＯＸＰでｌｓｆ、４
℃で遠心分離し、ＬＫＢガンマ−カウンターを用いて細
胞結合カウント（ペレット）を測定した。本発明のイム
ノコンジュゲートの結合活性の保持は次の表１に示され
ている。
表に示されるように、５ＰＤＰを用いて調製し、３．５
乃至８．５の範囲のモル比を有する５Ｅ９イムノコンジ
ユゲートは、コンジュゲートしていない５Ｅ９に比して
その当初の結合活性の８０チ以上を保持していた。２−
ＪＴを用いてＥＷした５Ｅ９イムノコンジユゲートも高
い結合活性を保持していた。５ＰＤＰを用いて調製した
３Ａｌイムノコンジユゲートは抗体結合活性が若干低下
していることを示した。一般に、これら及び他の抗体へ
のＡＤＨのコンジュゲート形成は抗体結合活性の比較的
値かな低下しか生じなかった。
図６は本発明の２独のイムノコ／シュゲートの飽和曲線
を示す。コンジュゲートしていない５Ｅ９及び３，４１
単クロ一ン性抗体の飽和曲線と５Ｅ９−ＡＤＡｆ−７，
５及び３，４１−ＡＤＭ−７，０を比較した。これらの
曲線を得るには、ｌＸ１０６抗原陽性Ｈ５Ｂ−２ｄ的細
胞を含む０１ｌｒｆＬｌの完全生長培地中でイムノコン
ジュゲートを４℃で培養した。１ルデ後、細胞を２回培
地中で洗い、ＦＩＴＣ−標識化山羊抗マウスＩｇＧ（Ｂ
ｏａｈｒｉｎｇａｒ−ＭａｎｓｈｇｔＷＬ）の１＝４０
の稀釈を含む培地の０．１１１Ｌｔ中で更に３０ｍｔｔ
ｓｊ＠養した。細胞をＣｏＣｏ５１ｔ　Ｅｐｉｃｓ　Ｖ
　螢光細胞分析計で分析した。
細胞面壁光を同一に稀釈したコンジュゲートしていない
単クローン性抗体を用いて得た螢光と比較した。図示の
ように１抗原陽性細胞を飽和するのに必要なイムノコン
ジュゲートの濃度は、コンジュゲートしていない抗体が
必要とする濃度よりも多（ても％の稀釈率よシも大ぎく
はない事実から、それぞれのイムノコンジュゲートの結
合活性が保持されていた。コンジュゲートしていない抗
体とイムノコ／シュゲートの螢光強度の高原（飽和）濃
度の差は２次的なＦＩＴＣ山羊抗マウス試薬の未コンジ
ュゲート抗体に比して低いイムノコ／シュゲートへの結
合性に起因していることが判明している。
本態様のイムノコンジュゲート・・・・・Ｌ６−ＡＤＭ
コンジュゲートの・・・・・４．０乃至７．０の範囲の
、Ｈでの安定性をＨＰ　Ｌ　Ｃ分析’ｌ用イテ検討シタ
。Ｌ６−ＡＤＨ−９，０−１７ジユゲートを指示の、Ｈ
の燐酸塩緩衝液中３７℃で２４ルｒ培養した。各溶液を
次にＥＰＬＣカラムを通して、コンジュゲートしていな
い薬（アントラサイクリン）を定量した。
図７に示すよ５に、異なるｐｕで２４ｈｒ培養後検知さ
れた単一の生成物はＡＤＭ−ＨｚＮ純品のカラム保持時
間を有していた。２４時間後にイムノコンジュゲートか
ら放出された物質の量は、Ｈが７から４に低下するにつ
れて増加した。１未処理“対照はアｕ７．４の燐酸塩緩
衝液中に一２０℃で保存したコンジュゲートのクロマト
グラフを示す。イムノコンジュゲートが酸感受性の結合
基を有しておシ、これが抗体蛋白質からＡＤＨの放出を
起こすことが明らかにされた０これらの結果は、式２に
記載したようなＡＤＨをリンカ−アームに結びつけてい
るヒドラゾン結合の存在と一致している。
本実施例の態様によれば、ジスルフィド結合も有してい
るリンカ−アームを介してＡＤＨは抗体に付着している
（式２参照）。従ってＤＴＴを用いた本態様のイムノコ
／シュゲートの還元でＡＤＨ部分の放出が可能なはずで
ある。
そＣでＬ６−ＡＤＭコン）ユ）ｆ−ト、Ｌ６−ＡＤＭ−
ｇ、０゜を１０倍過剰の１）ＴＴで処理し、室温で１５
ｙ＋ｓｆｓ、　　培養しＨＰＬＣカラムにかけた。、４
ＤＭ−ＨＣｔ及びＡＤＭ−１１ＺＮ標準品を同時にカラ
ムにかけてクロマトグラフィーからのピークを図８に示
す。ＤＴＴ添加前にはＬｅ、−ＡＤＭ−９゜０はコンジ
ュゲートしていない薬品の検知できるピークを有してい
なかった。ＨＰＬＣ分析はＡＩ）ＡＩ−ＨｚＮ誘導体よ
りもＡＤＨ−１１Ｃｔに同一のカラム保持時間を有する
単−ピークの出現を示した。（図８参照）。ＤＴＴ処理
後、放出されたＡＤＭの量は抗体に結合していた原料Ａ
ＤＨ当量の約９９％であった。図７及び８に示した実験
データは本広様のイムノコンジュゲートからＡＤＨ様の
部分が、１生理的”条件、即ち細胞環境で典型的な酸性
及び還元性条件下で放出されることを示している。
本発明のイムノコ／シュゲートの細胞阻害活性本発明の
イムノコンジュゲートをさまざまの検定系を用いて細胞
ｌ５ｆｌＷ性についてインビトロで試験した。軟寒天コ
ロニー形成検定によれば、ＡＴＴから入手したＤａｘｄ
ｉ（バーキットリンパ腫）細胞（表現型：５Ｅ９＋、３
．（１−）を完全培地〔ＲＰＭＩ　　１６４０培地＋１
０％ウシ胎児血清）中で生成させた。ｌ！ｒＬｅの培地
中のＩ　Ｘ　１０’細胞を逐次的に稀釈した５Ｅ９−Ａ
ＤＭ又は３Ａ１−ＡＤＭイムノコンジュゲート又Ｆｉｗ
ンジュゲートしていないＡＤＨに１．５ｈｒさらした。
各稀釈について３回の測定を行なった。
対照はアントラサイクリ／等にふれさせない同様に処理
した細胞より成っていた。細胞を次に洗浄して、Ｉ５チ
ＦＢＳ及び０．３％アガロース（ＭｃＬｒｔｓｔ　Ｃｏ
１１ｏｉｄ）を含むＲＰＭＩ　　１６４０培地に懸濁し
た。細胞懸濁液の１ｍｅ（１ｘ　ｌｏ’　ａ胞）Ｔ６ウ
エルのマイクロタイタープレー）　（Ｃｏ５ｔａｒ）の
０．４％アガロース層を覆った。試料を７−１０日３７
℃で培養し、得られたコロニーを４８ｈｒ、ｐ−ヨード
ニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ）の１
’ｆｒＵ；／／Ｒｅの０．５ＪＭで染色した。コＯニー
をＯｐ　ｔ　１ｒｎａｚ　４０−１０イメージアナライ
ザーを用いて＝ｔａし、未処理対照に対してＡＤＨ処理
した又はイムノコンジュゲート処理した細胞を比較して
コロニー形成の阻害を測定した。
図９は、５Ｅ９抗原陽性で３，４１抗原陰性のバーキッ
トリンパ＠細胞系、Ｄａｘｄｉ　Ｋ１．５ｈｒ接触させ
た、　５Ｅ９−ＡＤＭコンジュゲート、５Ｅ９−ＡＤＨ
−７，５、及び３Ａ１−ＡＤＭコンジュゲート、３Ａ１
−ＡＤＨ−７，０゜の細胞阻害活性を比較している。こ
れらのイムノコンジュゲートはいずれも２−ＪＴでのチ
オールでＦｊｌＪした。用量−反応＠線を比較すると、
抗原を持つ標的細胞に対して当初の結合活性の９３％を
保持していた（図６参照）５Ｅ９−ＡＤＨ−’１５が、
非結合性の対照コンジュゲート、３Ａ１−ＡＤＨ−７，
０、よりも著しく薬効があることを示していた。
減殺細胞数の対数（ｌｏｇ　ｅａ＆ｌ　　ｋｉｌｌ　　
）の尺度を与える限界稀釈検定を、よシ長時間の接触法
（２４ｈｒ）を用いて、上記の２種のイムノコ／シュゲ
ートの細胞阻害薬効活性の試験に用いた。この検定はＡ
ｉ、Ｃｏｌｏｍｂαｔｔｔ　　ａ＠α１．。
５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｋｉｌｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｔａｒｇ
ｅｔ　Ｃａ１ｌａ　　ｂｙＡｖｓｔｉｂｏｄｙ−Ｒｉａ
ｉｓ　Ａ　Ｃんａｉｓ　　ｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　−
Ｇａｌｏｎｉｓ　　Ｈｙｂｒｉｄ　　Ｍｏ１ｅｃ１＆ｌ
ｅｓ：　　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｓｏｆ　Ｃｙｔｏｔｏｚ
ｉａ　Ｐｏｃｇｓａｙ　ａｎｄ　Ｕｓ＠　ｉｎ　Ｉｍｍ
ｓｎｏ−ｓｌｍｍ５ｎｏ−ｓ　Ｐｒｏｅｔｒｄｓｒｍａ
”、Ｊ、ｌｍｍ５ｎｏ１．ｓ　１３１゜ｐ、、３０９１
−９５（１９８３）で実質上記載されたようにしてＮａ
ｒｎａ　！　ｗａ細胞（表現型：５Ｅ９＋、３，４１−
）を用いて行なった。ＡＴＣＣから入手した細胞をイム
ノコンジュゲートと２２ルｒ培養し、洗浄してｌａｇ　
ｃａｌｌ　ｋｉｌｌを測定した。ｌｏｇ　ｃａｌｌ　　
ｋｉｌｌは限界細胞濃度で生成しないウェルの部分で見
積った集落形成率から算出した。
図１０に示すように５Ｅ９−ＡＩ）Ｍ−７，５は非結合
性３Ａ１−ＡＤＡｉ−７，０コンジユゲートに比して、
比較した濃度で（対数で１−２大きい）１−２大きいｌ
ｏｇｃａＬｌｋｉｌｌを生じた。５Ｅｇ−ＡＤＨ−７，
５の最高用量で５迄のＬｏｇ　ｃａｌｌ　　ｋｉｌｌが
６ｉす定された。更に非結合性３．（１イムノコンジユ
ゲートについて細胞阻害活性が検知されたが、細胞阻害
性のレベルは当量のコンジュゲートしていないＡＤＨよ
り低かった。然し５Ｅ９イムノコンジユゲートの活性は
、かなりの濃度で遊離ＡＤＭの当量用量より大であった
。
上述のように５Ｅ９−ＡＤＭ−７，５及び３Ａｌ−ＡＤ
Ｍ−７，０イムノコンジユゲートはチオール化剤として
２−ＩＴを用いて合成した。チオール化剤として５ＰＤ
Ｐを用いて調製したイムノコンジュゲートについても免
疫特異性の細胞阻害性が認められた。図１１Ｆｉ上述の
軟寒天コロニー形成（率）検定を用いてＤａｓｄｉ細胞
について行なった、チオール化剤として５ｐｎｐを用い
てつ（つた、５Ｅ９−ＡＤＭ及び３Ａｌ−ＡＤＭイムノ
コｙシュゲートの選択的細胞阻害活性を示す。更に５Ｐ
ＤＰを用いて’ＦＱＭ製したイムノコンジュゲートにつ
いての選択的細胞阻害性の証明として図１２が示されて
２υ、Ｇ２８．１−．４ＤＡｆ−ｇ、０イムノコ／シユ
ゲートが２８の６２８．１抗原陽性細胞系、Ｄａｓｄｉ
及びＡ’ａｍα１ｗａ、及びＧ２８．１抗原隘性ヒト細
胞白血病細胞系、ｌｌ５Ｂ−２について軟寒天コロニー
形成検定で試験された。Ｈ５Ｂ−２細胞はＡＴＣＣから
入手した。図示のようにイムノコンジュゲートは２植の
抗原陽性細胞系に対して細胞阻害性であるが、抗原陽性
細胞系については細胞阻害性でなかった。
イムノコ／シュゲート、５Ｅ９−ＡＤＭ−７，５、に依
る抗原陽性細胞の優先的減殺はＭ、Ｂデａｔｔａ体博士
〔Ｂｒ１ｓｔｏｌ−Ｅａｙｌｏｒ　ＬａｂｓｒＨｏｗａ
ｔｏｎｒＴｚ）　　から提供さｎた足場依存性ヒト結腸
癌腫細胞系、ＨＣＴ　１１６を用いたコロニー形成検定
（法）でも認められた。
癌腫細胞の単層培養をトリプシ／−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣ
Ｏ）を用いて取出し、洗浄し、２２−ゲージ（注射）針
を通して単一の細胞懸濁とした。５Ｅ９−ＡＤＭ−７，
５，３，４ｌ−ＡＤＨ−７，０又はコンジュゲートして
いないＡＤＨをＩＸ　ｌ　Ｏ’癌腫細胞を含む培地の０
．２νで逐次的に稀釈した。
各稀釈は３回行なった。対照は未処理又は抗体処理細胞
であった。細胞を３ｈデ培養し、培地中１回洗浄し、ｌ
ｘｔ［Ｉ　Ｘ　１０”細胞を１２ウエルのマイクロタイ
タープレート（Ｃｏａｔａｒ）に植えた。プレートを３
７℃で７−１０日培養して無水メタノールで１０ｍ＜ｓ
固定した。コロニーをクリスタルバイオレットで染色し
、　Ｏｐｔｉｍａｚ　４０　１０イメージアナライザー
でカウントした。図１３に示すよ５に、癌腫細胞を５Ｅ
９−ＡＤＭ−７，５と触れさせた方が、３，４１−ＡＤ
Ｍ−７，Ｑの場合よりも大きな細胞阻害性が認められた
。
ＡＤＨのアミノ楯で抗体に結合（す７り）しているＡＩ
）ＡＩは医薬活性の著るしい低下を示すイムノコンジュ
ゲートが形成されると多くの死文が示しているので、抗
体にｔｓｘ−ａｌａジペブテドリ７カーを介してＡＤＨ
のアミン糖部分でＡｌ）Ｍを付着させて調製したイムノ
コ／シュゲートの細胞阻害性を軟寒天コロニー形成検定
系で試験した。図１４に示すように５Ｂｇ−ＡＤＭ−４
，０及び３Ａ１−ＡＤＨ−３，９ペプチド結合コンジュ
ゲートはいずれもＤａ％ｄｉ細胞に対して細胞阻害性で
なかった。コアシュゲート形成に用いたＡＤＨ−Ｌｍｓ
−ａｔａｆｊ導体はコンジュゲートしていない当量用量
のＡＤＨよりも対数で約２薬効が低かった。
実施例２゜ この実施例は、ＡＤＭ分子への付着部位としてアシルヒ
ドラゾン結合を有してお９且っ更に抗体への付着部分と
してチオエーテル結合を有するリンカ−アームを介して
、ＡＤＨが単クローン性抗体にコンジュゲートしている
、本発明のアントラサイクリ／イムノコンジュゲートの
製造法を記載している。この態様はＡＤＨの新規なアシ
ルヒドラシト誘導体も提供する。
単クローン性抗体、５Ｅ９（２，５１ｍ燐酸塩緩衝食塩
水中の２．５■）を５ＡｆＰＢ（スクシンイミジル−４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー））（１００μ
ｔテトラヒドロ７うｙ中の５９．５μ？）と３０℃で３
０ｍ１％反応させた。
ｐｕはクエン酸ナトリウム緩衝剤で６．０に調節した。
混合物をＰＤ−１０ゲ／Ｌ／濾過カラム（Ｐｈａｒｒｎ
ａｃｉａ）を通して未反応物質からマレイミド含有抗体
を分離した。実施例１と同様に調製したＡＤＭ−ＥＺＮ
誘導体（１■）を１μＭａＯＨ／　Ｈｔｏ　（９：　１
　）に溶かした、０，５μＭｆ）ＡＩ）Ｍ−ＨｚＮを４
：ｌアセトン：Ｈ２Ｏ中の０．５μＭのトリー外−ブチ
ルホスフィンと反応させて新規な還元ＡＤＨ−ＨｚＮを
つくった。（式３参照）。ｌＱｍｉｓ後、硫黄の０．Ｉ
Ａｆ）ルエン浴液を加えて残ったホスフィ／をこわした
。還元Ａ　Ｄ　、＋ｆ　−ＨＺ　Ｎを次に５Ｅ９マレイ
ミド官有抗体と混合した。得られたイミノコンジュゲー
トをＦＤ−１０ゲル濾過カラムを通して精製した。トル
エン溶媒の除去が完全でない場合には、有機溶媒層が分
離して反応混合物から若干の蛋白質が浮遊した。溶媒の
除去にゆっくりとした空気流を用い、変性蛋白質は２ｍ
休、ｉｓ、ｏｏｏｘｙの遠心分離で除去した。イムノコ
／シュゲートを含む透明上澄み液を矢にゲル濾過し、Ｐ
ＢＳ中ｐＨ７，４で分析した。ＡＤＡｉ／抗体モル比は
実施例１と同様にＯＤ、８゜及びＵＤ、９．を用い分光
光度定量した。典型的な反応は３乃至４０モル比を有す
るイムノコンジュゲートを生じた。
害活性 本実施例の態様で調製したイムノコ／シュゲートを、Ｄ
ＮＡ合成の阻害を測る３ｕ−チミジン包含検定を用いて
、抗Ｊｇ、場性対抗原陰性腫瘍細胞系に対しての細胞阻
害性につい℃試験した。この検定法によれば、イムノコ
ンジュゲートはコンジュゲートしていないＡＤＨの稀釈
を完全培地中で行ない、各稀釈の１００μｔを９６−ウ
ェルのマイクロタイタープレートのウェルに加えた。各
稀釈は３回行なった。＠筋細胞を培地に懸濁し、Ｉ　Ｘ
　１０’個の細胞を含む１００μｔを次に各ウェルに加
えた。細胞は２４五デ、３７℃で５％ＣＯ２湿度雰囲気
で培養した。１μ　Ｃｉ〔６−ｓＨ〕−チミジ；ｙ　（
Ｎｏｖ　Ｅ％ｇｌａ％ｄ　Ｎｓｃ　Ｌ　ｅａｒ、　１５
　Ｃｉ　／ｍｕ）の５０マイクロリツトルを各ウェルに
加え、４Ａｒ。
３７℃で培養した。細胞をＭｉＬｌｉｔｉｔａｒ　ａｔ
　ｐｌａｔｅｓ（ＭＮｌｉｐｏｒａ）に移し２５　％　
Ｎ　）リクロロ酢ｐ（Ｔ（、’Ａ）で沈でんさせた。沈
でんを１０回５％冷ＴＣＡで洗った。
フィルターを乾燥し、パンチしてＥｅｏｎｏｆＬｓｏデ
液体シンチレーショ／流体（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｎｓｃｔｍａｒ）でカウントした。カウント数はすべて
バックグランドカウントを引いて補正した。
本態様のイムノコ／シュゲート・・・・・５Ｅ９−ＡＤ
Ｍ−３，９・・・・・は５Ｅ９抗原陽性Ｎａｍａ　ｌ　
ｗａ及びＨ５Ｅ−２細胞に対して高度に細胞阻害性であ
った（図１５参照）。イムノコノシュゲートは当量濃度
のコンジュゲートしていないＡＤＨよりも薬効が大きか
った。別の実験では３Ａ１−ＡＤＡｆ−６，０イムノコ
ンジエゲートは０．１μｆ／ｒｔｔｌ　　ＡＤＭよシも
低い濃度では３Ａ１−抗原陽性なｔｌｓＢ−２細胞に対
しては細胞阻害性であったが、３Ａ１抗原陰性の１’ｌ
ａｍα１ｓｕａ細胞に対しては細胞阻害性でなかったこ
とが判明した（図１７３照）。より高い４度ではイムノ
コンジュゲートの細胞阻害性は両細胞系に対してほぼ同
一であった。
実施例３６ 本発明のイムノコンジュゲートのインビボ抗腫筋活性本
発明のイムノコンジュゲートを次にインビボで抗腫瘍活
性について試験した。より特にはイムノコンジュゲート
をマウス中でのヒ）　Ｂ　ＩＪ　／パｆｉｌｆ！瘍の生
長阻止能について試験した。
組織培養維持リンパ球細胞の皮下的（、，６，）接種で
ＢＡＬＢ／ａヌードマウスに原発性Ｄａ１Ｌｄｉ及びＲ
ａｍａｎ（パーキラ）　ＩＪンパ腫）の固い腫瘍をつ（
り出した。
Ｒ６ｍ０　Ｒ細胞系はＡＴＣＣから入手でざる。Ｄａｘ
ｄｉ及びＲｅｔｍｏｓ　＠瘍ｆ′１２０−２５）の体重
の４−６週の年令のメスのＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｅ　（
ｎｕ／　ｎｕ　）　マウス（１Ｉａｒｌａ％Ｓｐｒａｇ
ｓａ−ＤｃＬｖＬａｙ）中を、マウスの側腹位への皮下
移植にｌＸｌ０’腫瘍雌胞１０．１　ｍｌ　　Ｐ　Ｂ　
Ｓを用いて、インビボで逐次的に通過させた。両腫瘍系
は２００乃至４０００朋５の直線的生長速度を示した。
指数的生長時の中位の腫瘍の容積倍化時間はＤａｓｄｉ
腫瘍については６．９±０．８日、Ｒａｍｏａ　ｇ瘍に
ついては４．４±０．６日であった。腫瘍容積（Ｆ）は
次式で求めた： 但しＬは長さ（間）、セしてＷは巾（朋）である。
腫瘍容積がＤａｗｄｉ　Ｗｉｆｌｔで４００−６００＋
ｔｎ”に、Ｒａｍｏｓ　苅４％で２５０−４００ｍｒｍ
”に達した時、５−１０匹の群にランダムに区分して、
ＡＤＭ−ＨＣ１Ｃ即ち遊離薬）、本発明のＡＤＭ−イム
ノコンジュゲート、コンジュゲートしていない単クロー
ン性抗体及び単りローン性抗体士、伝りの混合物を用い
る処置に用いた。細胞減殺の特異性は試験したイムノコ
／シュゲート（即ちその抗体成分が減殺すべき庫瘍細胞
と反応性である）を用いて得られた抗腫瘍活性を、非結
合性コンジュゲート（即ち、腫瘍集団と反応性では無い
コンジュゲート）を用いた時のものと比較して示された
。
処理群の生長曲線を未接種対照と比較した時の腫瘍容積
倍化時間の遅れ（ＴＶＤＴ）から見積った腫瘍生長阻害
（Ｔ−Ｃ）又は腫瘍倍化の遅れ（ＴＤＤ）として結果を
示した。ＴＤＤｆｉ久式を用いて算出した：但しＴ−時
間（処理群の腫瘍が３０００正３に達するための日数）
、Ｃ＝待時間対照群の腫瘍が３０００１３に達するため
の日数９、及びＴＶＤＴ　（腫瘍容積倍化時間）−時間
（対照（未処Ｑ）のマウスのｆＪ１５ｒｇ積が１５００
から３０００ｐｔｍｊＫ増塀するための日数）であった
。各点は実験群の中位の１Ｍ瘍容積を示している。
これらの試験では、Ｄａｗｄｉ又はＲａｍａｎ　ｉ濱瘍
についてのＡＤＭ−イムノコンジュゲートの抗腫瘍活性
をα）当世用量、（同じ）投与方法及びスケジュールで
遊離の薬（ＡＤＨ）を用いて得られた結果、及びｂ）最
適用量、投与方法及びスケジュールで与えた遊離の薬で
得られた活性と比較した。
ここに示したすべての試験で、ＡＩ）Ｍ−１１ｃｔでの
処理では注射する日に粉末のＡＤＨ−ＨＣ’ｔニ５０−
１００　λＤＭＳＯを加え特定された用量のη／に９／
ｉｎｊじｉｎｊ”とは１回の注射量を指す）にＰＢＳに
溶解、稀釈して腫瘍を持ったマウスに静脈的Ｋ（ｓ、υ
３尾静脈〕又は腹腔内Ｋ　（ｔ−ｐ、）接１した。これ
らの試験に用いたＡ　Ｄ　！ば一イムノコンジュゲート
は実施例１０方法でル・４壊し、当初の抗体結合活性の
９０多以上すべて保持していた。特には単クローン性抗
体５Ｅ９及びＧ２８．ｌをこれらの試験のイムノコンジ
ュゲートの抗体成分として使用した。ＡＤＭ−イムノコ
ンジュゲ−トはＰＢＳ中４℃で保存し、調製後２週間以
内に用いた。
すべての試験したイムノコノシュゲート並びにコンジュ
ゲートシていない対照抗体はｉ、ｐ、投与した。
更に使用した処置スケジュールの記号＠Ｑ７Ｄｚ３”は
この群の各マウスは３回注射を受け、各注射は７日おき
、即ち週に１回注射を受けた。同様に＠Ｑ５Ｄｚ２”は
マウスが５日おいて２回薬又はコンジュゲートの注射を
全体として受ける処置スケジュールを示している。Ｑｌ
ｌ）ｚｌは１回の注射を指す。従ってここで定義した処
置スケジュールでは、最初の数字が注射の間隔（日数）
を示し、終りの数字がスケジュール当りの全体の注射回
数を示している。
それで本発明のＡＤＨ−イムノコンジュゲートの抗ＭＪ
Ｊ％活性を先ず、対応する又は当量用量、投与方法及び
スケジュールで遊離のＡＤＨ−ＨＣｔと比較した。５Ｅ
９−ＡＤＨイムノコンジュゲート、５Ｅ９−ＡＤＨ−１
，８（モル比−ＭＲ−１，８ＡＤＭ分子／ＭＡＢ）のＤ
ａｘｄｔ　ＤＨへの抗腫瘍活性を、Ｇ）対応する薬用量
での（４，１１ｎ９／／Ｃｌｉ’／　５ｎｉ）のコンジ
ュゲートしていないＡＤＭ−ＨＣｌＳｂ）　　対応する
抗体用ｆｉ　（６３０Ｆｎ９／ｒＣ９／　ｉｔ＊ｊ）で
の５Ｅ９単クロ一ン性抗体、ｅ）５Ｅ９抗体＋ＡＤＭ−
ＨＣ１の混合物（４，１ｍ９ＡＤＭ＋６３０ダ　５Ｅ９
）、及びｄ）対照としての非結合性イムノコンジュゲー
ト、Ｌ６−ＡＤＭ−８，６（４，１■／に９／イｎｊ　
ＡＤＭ　）の活性と比較した。
当初の腫瘍サイズが８００乃至１１００正６の範囲の時
の、腫瘍移植後２０日と２５日に、マウス（５マウス／
群）に（即ちＱ５Ｄｚ２スケジュールで）　ｉ−ｐ、投
与した。この実験に用いた用量は遊離の薬についての最
大許容用量（ＭＴＤ）、ｔ、ｐ、即ち所足のルート又は
スケジュールで投与した用量がＬＤｌｏ（動物の１０％
の死亡）を招く（表２参照）。
図１８に示すように、５Ｅ９−ＡＤＭコンジュゲートで
着るしい抗腫瘍活性が得らｎた。更にこの抗腫瘍活性は
遊離の薬の当量用量で認められるものよりも大きかった
。セして衣４に示すようにコンジュゲートで処置した５
匹のマウスのうちの３匹は先金な腫瘍の後退（治癒）を
有していて、これは〉１．５ＴＤＤに相当した。これに
反して、ＡＤｈｆ−ＨＣｔ及びコンジュゲートしていな
い５Ｅ９並びにＬ６−ＡＤＭ非結合性コンジュゲートは
抗腫瘍活性を示さなかった。ＡＤＨ−ＨＣ１＋５Ｅ９混
合物を用いると若干の腫瘍生長１震害が認められた。然
しこの効果は一時的なもので、統計上不充分な０，７．
ＴＤＤを示していた。
この実験では４−５　ｍ９７に９以上の用量での遊離薬
のｉ、ｐ。
投与に付随する毒性のために遊離の薬は４．１　ｍ９７
に９／ｉｎｊで投与した。この低い用量で遊離ＡＤＭ及
びＡＤＭ＋率クローり性抗体の混合物はいずれも不活性
であった。然し図１８が明らかにするように、このよう
な低い用量でもＡＤＭイムノコンジュゲートは腫瘍生長
阻止になお活性であった。
次に、最適の用量、投与方法及びスケジュールで投与し
たコンジュゲートしていない薬を用いて得られた抗腫瘍
活性と比較したＤａｓｄｉ腫瘍でのＡＤＨ−イムノコン
ジュゲートの抗腫瘍活性を求めることとした。従って先
ずＤα％ｄｉ細胞に対して最大の抗腫瘍活性となる遊離
ＡＤＨ−ＨＣｔの用量、投与方法及びスケジュールをき
める必要があった。
この最適化検討のために異なる投与方法、用量及びスケ
ジュールでマウスにＡＤＨ−ＥＣｔを用いた。接種間隔
は使用した処置スケジュールによってきまった。仄に上
述のようにして’ｆ’ＤＤ値馨求めた。
この最適化伎討の結果は表２に要約されている。表２か
ら明らかなように、ｉ、シ、投与Ｑ７Ｄｚ３スケジュー
ルが、腫瘍生長遅れ及び腫瘍後退速夏の両方で示した最
適の抗腫瘍応答を１１η／に９／ｓ幻で与え、これはＱ
７Ｄｚ３　　スフ−ジュール、ｉ、ｖ、を用いたこの薬
についてのＭＴＤでもあった。
遊離の楽ＡＤＭ−１１ｃｔ　　のＤａｕｄｓ腫瘍細胞で
の抗＠瘍活性は図１９にも示しである。ｉ、υ、投４Ｑ
７Ｄｚ３スケジュールを用いると、ＡＤＡｆ−Ｈ（：’
ｌ　　で処置後、９．１０又は１１■／に９／１％ｊで
用量に依存した形でＤａｘｄｉ腫瘍異種移植の生長が著
るしく阻害された。対照マウスは未処置であった。ＭＴ
Ｄ、１１ダ／に９／　ｉｓｊ、での腫瘍生長阻害＜ｒ−
ｃ）は２８日であり、これは１．１ＴＤＤに相当してい
た。
（、ｐ投与を用いるスケジュールについても検討した。
上述のようにＡ　Ｄ　Ａｉ　−ＥＣ４，ｉ、ｐ、、のＭ
ＴＤは４−５　ｍ９７に９／休ｊであるときめられた。
表２Ｂ）から明らかなように、ｉ、ｐ、投与ではそのＭ
ＴＤで遊ＩＪＡＤＡｆ−ＨＣｔはＤａｓｔｄｉ細胞に不
活性であった。従って（、Ｖ、投与ではＭＤＴが１１ｒ
ｎ９／彎／　ｓｓｊである、Ｄａｓｄｉ腫瘍細胞の生長
阻害を示す用量、が遊離ＡＤＭ−ＨＣ１の最適抗腫瘍活
性が得られるものとぎめた。
従って、これらの実験からＤａｘｄｔ　＠瘍についての
抗腫瘍活性上の最適ＡＤＨ−ＨＣｔ用量は約１　ｘｒｖ
／ｋｙ／　ｉｎｊであり、最適スケジュールはＱ７Ｄｚ
３であり、最適投与ルートはｉ、ｔ＋、であるときまっ
た。
次に本発明のＡＤＭ−イムノコンジュゲートのＤａｘｄ
ｉ腫瘍についての抗腫瘍活性を、上できめた最適条件下
で投与した遊離薬ＡＤＭ−ＨＣＬの抗腫瘍活性と比較し
た。６２８．１−ＡＤＨイムノコンジエゲートＧ２８．
ｌ−ＡＤＭ−７，６（ＭＲ＝７．６医薬（ＡＤＭ）／Ｍ
ＡＥ　）、Ｑ　５　Ｄｚ　２スケジユール、１−ｐ−で
投薬して、Ｑ７Ｄｚ３スケジュール、ｉ、ν、で１０．
１１及び１２ダ／に９／ｓ幻で投与したＡＤＭ−Ｈｃｌ
と比較した。図２０及び表３に示すように、遊ｇｆＬ薬
ＡＤＭ−ＨＣ１ｈ活性で、ＩＩＲＩ！７／Ｑ（そのＭＴ
Ｉ））では８匹のツウ−２９２匹が完全な腫瘍後退（治
癒）を生じ、２８日の腫瘍生長の遅れを示した。最高の
試験用量（１８，７ｍ９，４ｆｆｉ。
Ｑ　５　Ｄｚ　２、ｉ、ｐ−）でイムノコ／シュゲート
は良好な耐性であって（死亡無（、体重減少無く）、処
置した８匹のうち３匹が完全な腫瘍後退を示して遊離薬
よりも若干高い抗腫瘍活性を示した。更に非結合性Ｌ６
−イムツコ／シュゲート、コンジュゲートしていないＧ
２８．１又はコンジュゲートしていないＧ２８．Ｉ＋Ａ
ＤＭ−ＨＣｌの混合物については抗腫瘍活性がなかった
。それでＡＤＭ−イムノコ／シュゲートは、最適用量及
びスケジュール、イ、τ、又はｔ、ｐ、でのコンジュゲ
ートしていない医薬（ＡＤＨ−ＨＣｌ　）を用いて達成
されるよシもまり人ぎな程度に腫瘍生長を阻害すると紬
調した。
表　　　３ Ｄａへｄｉ種瘍典橿移櫃について最適化、４ＤＭ−ＨＣ
ｌ（Ｑ７Ｉ）ｚ３；　ｉ、ｖ、）と比較したＭＡＢＩン
ジュゲートＡＩ）Ｍ（Ｑ　５１に２　；　＝−ｐ−）　
ノ抗ａａ活性ＡＩ）ノ叙ｔ−ＨＣｌ　　　　　　Ｑ７＃
クレ３　；　　ｉ−ｖ。
４．５７００６０００．２　ｔ）／８ Ｇ２８．ｌ　　　Ｑ５Ｄｚ２；　ｉ、ｐ。
７００２０００．１０／８ 率　注記は表２参照 無胸腺マウスのＤａ１Ｌｄｉ腫瘍異種移植での異なる製
法の５Ｅ９及びＧ２８，１イムノコ／シユゲートを用い
て得られた抗腫瘍活性を表４に要約する。最高の反応速
度は一貫して５００η／に９以上の抗体用量であった。
この用量で、１．８乃至８．６０モル比を有するコンジ
ュゲートを用いて抗腫瘍活性が得られた。単クローン性
抗体用量を増すと、ＴＤＤ。
即ち腫瘍生長阻害、及び腫傷後退速度の両方でそれに対
応する増加があることから、抗腫瘍活性はコンジュゲー
トした医薬の用量よりも抗体用量に左右されるように見
えた。
（表示していないが）等しい抗体及びコンジュゲートし
た医薬の用量で平行的に試験した非結合性Ｌ６−ＡＤＨ
コ／シュゲートについてはすべての実験で抗腫良活性が
認められなかった。更にこの表は等量の医薬用量では不
活性の（衣２参照）遊離医薬（ＡＩ）Ｍ−ＨＣｌ　）に
比して本発明のイムノコンジュゲートの増大した薬効を
示している。
α　スケジ：ｘ−−ル：　Ｑ　５　Ｄｚ　２　　投与方
法：　＜、ｐ、　　ＭＲ：ＡＤＭ分子／ＭＡＢのモル比 ｂ　　Ｔ−Ｃ：未処置群（７′）と比較した医薬処置群
ＣＣ）の３ｏｏｏｍｍ”に達する日数の時間的遅れを示
す。
ｅ　　Ｃ＃ｆ”ｇ＋ｌ　　：治癒／処置動物数ｄ　　５
Ｅ９−ＡＤＡｆ−４，２は３種の用量で試験ａ　　Ｇ２
Ｂ、Ｉ−ＡＤＨ−７，６は３ｄの用量で試験ｆ　対照群
の死亡 表５はコンジュゲートしていない医薬に比して、本発明
のＡＤＭ−イムノコ／シュゲートを用いて達成された低
下した毒性を示している。表から明らかなようにイムノ
コンジュゲートはｉ、ｐ、投与した遊離ＡＤＭのイ。以
下の毒性であった。
図２２Ａ及び表６はヒトＲａｍａｎ　腫ｍについてのＧ
２８．１−ＡＤＨコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。
さらにＲａｍａｎ　＠ｆＱについてのイムノコンジュゲ
ートの抗腫瘍作用を、１６−Ｉ　１３ｍ９７に９／　ｉ
ｎｊの用量での単一注射投与であると先に定めた（表７
及び図２１参照）最適の結果を与える条件下で遊離のＡ
Ｄ、’ｄ　−ＥＩＣｔを用いて得られるものと比較した
。衣７はマウスでのヒトＲａｍａｎ＠瘍異８［移植での
ＡＤＭのインビボ抗腫瘍活性を１本投与で処置スケジュ
ールと用量を変えて試験した結果を示している。試験し
た最高のイムノコ／シュゲート用廿（１０，５ｍ９／に
９　）では、コンジュゲートの抗腫瘍活性は０．５　Ｔ
　ＤＤテ１３ｒｎ９／８Ｃ９（２５チ致死率）での遊離
薬を用いて得られる活性及び１、ＯＴ　ＤＤ−’ＣＩ　
６ｍ９／／Ｃ９（１２％致死率）Ｃ（７）ＡＤＨ−ＨＣ
ｔの活性よりもすぐれ（いた。この用量でコンジュゲー
トは処置動物Ｖｉ耐性があシ、体重減少及び死亡を示さ
なかった。図２２Ｂに示すようにＧ　２８．１−　ＡＤ
Ｍの抗腫瘍活性も用量依存的であることが判明した。従
ってコンジュゲート用量を減らすと、ＴＤＤ及び完全後
退数の減少を生じた。比較用せ（１０，６ｍ９／匈）で
Ｌ６−ＡＩ）Ｍ（非結合性）は不活性であった。
上記実施例は細胞阻害性医薬アントラサイクリンが新規
な酸感受性のアシルヒドラゾン結合を介して抗体にコン
ジュゲートしている新規なアントラサイクリン・イムノ
コ／シュゲートの製造法を示している。このイムノコン
ジュゲートは抗体結合活性（即ち標的細胞特異性）及び
細胞阻害性医薬の活性の両方を保持しており、標的細胞
の細胞環境で代表的な酸性及びＥ’２元性柔性条件下離
の未変性医薬（アントラサイクリ／）を放出する。これ
らのコンジュゲートの抗体結合活性はインビトロ及びイ
ンビボの両方で示されて２ｖ、そして遊離のコンジュゲ
ートし１いないアントラサイクリンで得られた活性より
も大であることが示されている。更にコンジュゲートし
ていないアントラサイクリ／に比してイムノコ／シュゲ
ートはインビボで遥かに大サナ耐性があった。従って本
発明のイムノコフジ１ゲートは増加した治療指数（抗腫
瘍活性／毒性）を示し、疾病例えば癌及び池の腫瘍、非
細胞破壊性のウィルス性又は他の病原体性感染及び自己
免疫性疾患の処置で、波光的に減殺すべ（選ばれた細胞
集団に対して細胞阻害性医薬を供給するのに特に有用で
ある。
本発明の態様のいくつかを示したが、本発明のイムノコ
ンジュゲートと方法を利用する他の態様を本発明の基本
構成から与えることができるのは明白である。従って本
発明の範囲は特許請求の範囲によって限定されるもので
あって、例示として示した態様から判断すべきでない。
【図面の簡単な説明】
図１は単クローン性抗体上に置換された反応性チオール
基の数（５１１／ＭＡＢ比）を５ＰＤＰチオール化５Ｂ
９及び３Ａｌ準クロ一ン法抗体とＡＤＮ−ＨｚＮの縮分
で製造したイムノコ／シュゲートが最終的に到達したＡ
ＤＡｉ／、＄ｆ　Ａ　Ｂモル比とを比較した分散ダイヤ
グラムである。 図２は２−ＩＴ−チオール化５Ｅ９及び３Ａ１抗体とＡ
　Ｉ）　Ｍ　−１１Ｚ　Ａ’の反応で製造したイムノコ
ンジュゲートが最終的に到達したＡＤＡｉ／ＭＡＢモル
比とＳＲ／ＭＡＢモル比とより成る分散ダイヤグラムで
ある。 図３は５ＰＤＰ−チオール化抗体か２−ＩＴ−チオール
化抗体かを用いて製造した本発明のイムノコ／シュゲー
トのＡＤＭ／ＭＡＢモル比と蛋白質収率との関係を示す
分散ダイヤグラムである。 図４はＩＱＧ、イソタイプ（例えば５Ｅ９及び３Ａ１）
かＩｇＧ、インタイブ（例えばＬ６）のいずれかの単ク
ローン性抗体を用いて製造したイムノコンジュゲートで
得られたＡＤＭ／ＭＡＢモル比対蛋白質収率から成る分
散ダイヤグラムを示す。 図５は抗体が２−ＪＴを用いてチオール化されている以
外は図４と同様なＩ、　Ｇ１及びＩ（ＩＣＱイソタイプ
の抗体な有するイムノコ／シュゲートのＡＤＭ／ＭＡＢ
モル比対蛋白質収率より成る分散ダイヤグラム乞示す。 図６は本発明の２′４のイムノコ／シュゲートの結合曲
線をそれぞれコンジュゲートしていない単クローン性抗
体の結合曲線と比較したグラフである。 図７は、Ｈ範囲４−７について本発明のイムノコ／シュ
ゲートの安定性を示す１１　Ｐ　Ｌ　Ｃクロマトグラフ
である。このクロマトグラムは本発明のアシルヒドラゾ
ン結合の酸感受性が、Ｈがより酸性になるにつれてイム
ノコ／シュゲートから放出される遊離ＡＤＨが増加する
ことで示されることを明らかにしている。 図８はＤＴＴ処理後、本発明のイムノコンジュゲートか
らのＡＤＭ部分の放出を示すＨＰＬＣクロマトグラムで
ある。 図９は軟寒天コロニー形成検定を用いた、本発明のイム
ノコ／シュゲートのＤａ１４ｄｉ細胞系に対する選択的
細胞阻害性を示すグラフである。これらのイムノコンジ
ュゲートは２−ＪＴ−チオール化抗体を用いて製造した
。 図１０は限界稀釈検定を用いた、本発明のイムノコンジ
ュゲートのＮａｍａ　ｌ　ｗａの細胞に対する選択的細
胞阻害性と、遊離ＡＤＨと比較してイムノコンジュゲー
トの増加した薬効を示すグラフである。 図１１は軟寒天コロニー形成検定を用いた本発明のイム
ノコンジュゲートのｆ）ａｒｂｄｉ細胞に対する選択的
細胞阻害性を示すグラフである。この場合、イムノコン
ジュゲートは５ＰＤＰ−チオール化抗体を用〜・て製造
した。 図１２は軟摩天コロニー形成検定を用いた本発明の５ｐ
ｎｐをチオール化剤として用い℃製造した別のイムノコ
ンジュゲートの選択的細胞阻害性を示すグラフである。 このイムノコ／ジュア−トは抗原陽性のＤａ＊ｄｉ及び
Ｎａｍａ　ｌ　ｗａ　＠胞に対しては細胞阻害性であっ
たが、抗原陰性のＨ５Ｂ−２細胞には阻害性では無かっ
た。 図１３はヒトの結腸癌腫細胞系（５Ｅ９＋、３．（１−
）罠対する本発明の５Ｅ９及び３Ａ１イムノコンジユゲ
ートの、コロニー形成検定を用いた。選択的細胞阻害性
を示すグラフである。 図１４はＬａｗ−ａｈａジペプチドリフカーを介してＡ
ＤＭのアミノ糖残基で単クローン性抗体にＡＤＨを付着
させてつくったイムノコ／シュゲートのＤａｔｂｄｉ　
細胞に対して細胞阻害性が欠けていることを示すクラブ
である。 図１５は１３−ケトアシルヒドラゾ／結合以外に、その
り／カーアーム内にチオエーテル結合を有する本発明の
イムノコンジュゲートの細胞阻害性を示すグラフである
。３Ｈ−チミジン包含検定を用いるとイムノコンジュゲ
ートは遊離ＡＩ）ＭよシもＮａｍａ１ｗａ細胞に対して
より大きな効力な示した。 図１６ｔｌｉ図１５のイムノコンジュゲートの、同一の
ｓＨ−チミジン包含検定を用いた、Ｈ５Ｂ−２ｍ胞に対
する細胞阻害性を示す。 図１７は、３〃−チミジン包含検定を用いた、本発明の
イムノコ／シュゲートの、抗原陽性対抗原陰性の細胞に
対する細胞阻害性を示すグラフである。イムノコ／シュ
ゲートは１３−ケトアシルヒドラゾン結合の外に、その
リンカ−アームにチオエーテルを有している。 図１８はマウスのヒトＤａｕｄｉ腫瘍異棟移植への本発
明のイムノコ／シュゲートのインビボ活性を示すグラフ
である。イムノコンジュゲートは当量用量の遊離ＡＤＨ
を用いた時よりも遥かに大さい抗腫瘍活性を示した。 図１９はＱ　７　’Ｄｚ　３　　処置スケジュール及び
ｉ、ν、投与を用いたＡＩ）Ｍ用量を変えた経時的なマ
ウスのヒトＤａｗｄｉ腫瘍異種移植についてのＡＤＭの
インビボ抗腫逼活性を示すグラフである。 図２０は最適化した遊離ＡＤＭ（Ｑ７Ｄｚ３　スケジュ
ールで１Ｏ−１ｌＷ／／に９／　ｉｎｊの用量でｉｓ、
投与）の抗腫瘍活性と比較した。本発明のイムノコンジ
ュゲートのマウスでのヒトＩ）５％ｄｉ腫瘍異種移植に
ついてのインビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。イム
ノコンジュゲートの方が遥かに大きな抗腫瘍活性を示し
た。 図２１は単一注射スケジュール及びｉ、ｇ、投与を用い
て、ＡＤＨの用量を変えたマウスのヒトＲａｍ・８肺瘍
異植移植についての経時的なＡＤＭのイ／ビボ抗頼瘍活
性を示すグラフである。 図２２Ａは最適化した遊離ＡＩ）Ｍ　（Ｑ　Ｉ　Ｄｚｌ
スケジュールで１６−１８■／に９／（９％ｊでイ、シ
、投与）の抗腫瘍活性と比較した、本発明のＡＤ、’ｄ
　−Ｇ　２８．１−１’ムノコンジュゲ−トのマウスへ
のヒ）Ｒａｍａｎ　　（ヒトＢ細胞リンパ＠）腫瘍異種
移植に対するインビボ抗腫瘍活性を示すグラフである。 図２２Ｂは本発明のＡＩ）Ｍ　−Ｇ　２８．１コンジユ
ゲートの抗腫瘍作用の用量依存性を示す、コンジュゲー
トの異なる用量でのイムノコンジュゲートの経時的なイ
ンビボ抗ａ瘍活性を示すグラフである。図２２Ａ及び２
２Ｂで用いたイムノコンジュゲートはカッコ内に与えた
抗体を示してあり、コンジュゲートしたアントラサイク
リンとして示しである。 （ＡＤＭ／ＭＡＢ）　モＩＬ　ヒト ＦＩＧ、　４− （ＡＤＭ／ＭＡＢ）−１ニルしこ （ｕｇ／ｍ１） ｍＡｕ、ｍＶ ＡＩＪｍＶ ロ０４−宕（ξ　（榊　で 」　０ぐア　リ岨ｊＪ　　　Ｍ−ＩＪＪｎｏｌｌ−、’
；づヲ儂ゾ ｒ＝ｔａ、１２ ロ＝＝コ３Ａｆ−ＡＤＭ−乙Ｏ 区Ｓ！コ５Ｅ９−ＡＤＭ−７，５ ヒ２タ≦シ］　糧づＬ　イノＴ；　灸き↑　θＢＦＩＧ
、１３ ０て＼θ ０口・１−Ｃ企；佛８ ３ｔ−ｔ−ｒａｒ　ｔ　＞　［’ｌｔ　’／。 ＦＩＧ、　１　ｇ Ｂ　数 Ｆ／Ｃｙ、ｌヲ 、を多礪亘、後日茅気 ＦＩＧ、λノ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、減殺する対象に選ばれた細胞集団に対して反応性の
    抗体にリンクした約４−１０個のアントラサイクリン分
    子から成り、各アントラサイクリンがＣ−１３位置にケ
    ト基を有し且つ抗体にリンカーアームを介して付着して
    おり、リンカーアームがアントラサイクリンのＣ−１３
    位置のアシルヒドラゾン結合でアントラサイクリンに共
    有結合的に結合していることを特徴とするイムノコンジ
    ユゲート。 ２、リンカーアームが更にジスルフィド結合又はチオエ
    ーテル結合を有する請求項１に記載のイムノコンジユゲ
    ート。 ３、減殺する対象に選ばれた細胞集団に対して反応性の
    抗体にリンカーアームを介して付着しているＣ−１３位
    置のケト基を有する少なくとも１個のアントラサイクリ
    ン分子から成り、リンカーアームがアントラサイクリン
    の１３−ケト位置のアシルヒドラゾン結合でアントラサ
    イクリンに共有結合的に結合しており且つ更にジスルフ
    ィド又はチオエーテル結合を有していることを特徴とす
    るイムノコンジユゲート。 ４、アントラサイクリンが、アドリアマイシン、ダウノ
    マイシン、デトルビシン、カルミノマイシン、イーダル
    ビシン、エピルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−
    アドリアマイシン、ＡＤ−３２及び３′−デアミノ−３
    ′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−デキソルビシ
    ンより成る群から選ばれたものである請求項１に記載の
    イムノコンジユゲート。 ５、アントラサイクリンがアドリアマイシン又はダウノ
    マイシンである請求項１又は３に記載のイムノコンジユ
    ゲート。 ６、抗体が腫瘍細胞に対して反応性である請求項１又は
    ３に記載のイムノコンジユゲート。 ７、抗体が、癌腫、黒色腫、リンパ腫、骨又は軟質組織
    肉腫に付随する抗原に対して反応性である請求項６に記
    載のイムノコンジユゲート。 ８、抗体が、Ｂ細胞リンパ腫で見出されるＣＤ３７抗原
    に対して反応性である請求項１又は３に記載のイムノコ
    ンジュゲート。 ９、抗体が単クローン性抗体である請求項１に記載のイ
    ムノコンジユゲート。 １０、抗体が単クローン性抗体５Ｅ９、３Ａ１、Ｌ６、
    Ｇ２８．１又はＧ２８．５であり且つアントラサイクリ
    ンがアドリアマイシンである請求項１又は３に記載のイ
    ムノコンジユゲート。 １１、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し： Ｒ＾１はＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿３ＣＨ＿３又はＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿
    ２Ｈ＿３）＿２であり；Ｒ＾２は ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （上式中でＸ＝Ｈ、ＮＯ＿２又はハロゲン）であり；Ｒ
    ＾３はＯＣＨ＿３、ＯＨ又は水素であり；Ｒ＾４はＮＨ
    ＿２、ＮＨＣＯＣＦ＿３、４−モルホリニル、３−シア
    ノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキ
    シ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルア
    ミン、シアノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキ
    シエチルアミンであり； Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰ又は水素であり；Ｒ＾６はＯ
    Ｈ又は水素であり、Ｒ＾５がＯＨ又はＯ−ＴＨＰの場合
    にはＲ＾６はＯＨでは無いものとし；且つｎは１乃至１
    ０の整数である、を有する化合物。 １２、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し： Ｒ＾１はＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿３ＣＨ＿３又はＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿
    ２Ｈ＿３）＿２であり；Ｒ＾３はＯＣＨ＿３、ＯＨ又は
    水素であり；Ｒ＾４はＮＨ＿２、ＮＨＣＯＣＦ＿３、４
    −モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−
    ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベン
    ジルアミン、ジベンジルアミン、シアノメチルアミン又
    は１−シアノ−２−メトキシエチルアミンであり； Ｒ＾３はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰ又は水素であり；Ｒ＾４はＯ
    Ｈ又は水素であり、Ｒ＾５がＯＨ又はＯ−ＴＨＰの場合
    にはＲ＾６はＯＨでは無いものとし；且つｎは１乃至１
    ０の整数である、を有する化合物。 １３、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し； Ｒ＾１はＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿３ＣＨ＿３又はＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿
    ２Ｈ＿５）＿２であり；Ｒ＾２は ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （上式中でＸ＝Ｈ、ＮＯ＿２又はハロゲン）であり；Ｒ
    ＾３はＯＣＨ＿３、ＯＨ又は水素であり；Ｒ＾４及びＲ
    ＾７は独立して水素、アルキル、置換基を有するアルキ
    ル、シクロアルキル、置換基を有するシクロアルキル、
    アリール、置換基を有するアリール、アラルキル又は置
    換基を有するアラルキルであるか；又はＲ＾４、Ｒ＾７
    及びＮが一緒になつて４−７員環を形成しており、而し
    て該環は場合によつては置換基を有し得るものとする；
    Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰ又は水素であり；Ｒ＾６はＯ
    Ｈ又は水素であり、Ｒ＾５がＯＨ又はＯ−ＴＨＰの場合
    にはＲ＾６はＯＨで無いものとし；且つｎは１乃至１０
    の整数である、を有する化合物。 １４、アドリアマイシン１３−｛３−（２−ピリジルジ
    チオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハイドロクロライ
    ド（ＡＤＭ−ＨＺＮ）。 １５、１３−｛３−（メルカプトプロピオニル）｝アド
    リアマイシンヒドラゾン。 １６、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し； Ｒ＾１はＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿３ＣＨ＿３又はＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿
    ２Ｈ＿５）＿２であり；Ｒ＾２は ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （上式中でＸ＝Ｈ、ＮＯ＿２又はハロゲン）であり；Ｒ
    ＾３はＯＣＨ＿３ＯＨ又は水素であり； Ｒ＾４及びＲ＾７は独立して、水素、アルキル、置換基
    を有するアルキル、シクロアルキル、置換基を有するシ
    クロアルキル、アリール、置換基を有するアリール、ア
    ラルキル又は置換基を有するアラルキルであるか；又は
    Ｒ＾４、Ｒ＾７及びＮが一緒になつて４−７員環を形成
    しており、而して該環は場合によつては置換基を有し得
    るものとする；Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰ又は水素であ
    り；Ｒ＾６はＯＨ又は水素であり、Ｒ＾５がＯＨ又はＯ
    −ＴＨＰの場合にはＲ＾６はＯＨでは無いものとする；
    且つｎは１乃至１０の整数である、を有する化合物の製
    造方法に於て、 ａ）ω−（Ｒ＾２ジチオ）カルボン酸のＮ−ヒドロキシ
    スクシンイミドエステルをヒドラジンと反応させてω−
    （Ｒ＾２ジチオ）カルボン酸ヒドラジドを形成し（但し
    Ｒ＾２は上の定義の通りである）；次に ｂ）該ヒドラジドを式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し； Ｒ＾１はＣＯＣＨ＿３、ＣＯＣＨ＿２ＯＨ、ＣＯＣＨ＿
    ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿２Ｈ＿５）＿２又はＣＯＣＨ＿２
    ＯＣＯ（ＣＨ＿２）＿３ＣＨ＿３であり；Ｒ＾３はＯＣ
    Ｈ＿３、ＯＨ又は水素であり；Ｒ＾４はＮＨ＿２、ＮＨ
    ＣＯＣＦ＿３、４−モルホリニル、３−シアノ−４−モ
    ルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピ
    ペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、シア
    ノメチルアミン又は１−シアノ−２−メトキシエチルア
    ミンであり； Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰ又は水素であり；且つＲ＾６
    はＯＨ又は水素であり、Ｒ＾５がＯＨ又はＯ−ＴＨＰの
    場合にはＲ＾６はＯＨで無いものとする、を有するアン
    トラサイクリンと反応させることを特徴とする式：▲数
    式、化学式、表等があります▼ を有する化合物の製造方法。 １７、該化合物を還元剤で処理して１３−｛３−（メル
    カプトプロピオニル）｝アントラサイクリンヒドラゾン
    を形成する追加工程を有する請求項１６に記載の方法。 １８、ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応させて３−
    （２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジドを形成
    し；且つｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを
    該ヒドラジドと反応させることを特徴とするアドリアマ
    イシン１３−｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニ
    ル｝−ヒドラゾン・ハイドロクロライドの製造方法。 １９、ａ）抗体をチオール化剤と反応させて；次にｂ）
    チオール化した抗体を請求項１１、１２又は１３に記載
    のアシルヒドラゾンと反応させることを特徴とする請求
    項１又は３に記載のイムノコンジユゲートの製造方法。 ２０、アシルヒドラゾンがＡＤＭ−ＨＺＮである請求項
    １９に記載の方法。 ２１、チオール化剤がＮ−スクシンイミジル−３−（２
    −ピリジルジチオ）プロピオネート又は２−イミノチオ
    ランである請求項１９に記載の方法。 ２２、ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応させて３−
    （２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジドを形成
    し；ｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを該ヒ
    ドラジドと反応させてアドリアマイシン１３−｛３−（
    ２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・ハ
    イドロクロライド（ＡＤＭ−ＨＺＮ）を形成し；且つ ｃ）減殺する対象に選ばれた細胞集団に対して反応性で
    あり、チオール基が付着されている抗体とＡＤＭ−ＨＺ
    Ｎを反応させることを特徴とする請求項１又は３に記載
    のイムノコンジユゲートの製造方法。 ２３、ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオネートをヒドラジンと反応させて、３
    −（２−ピリジルジチオプロピオニルヒドラジドを形成
    し；ｂ）アドリアマイシン−ハイドロクロライドを該ヒ
    ドラジドと反応させて、アドリアマイシン１３−｛３−
    （２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・
    ハイドロクロライド（ＡＤＭ−ＨＺＮ）を形成し； ｃ）該ＡＤＭ−ＨＺＮを還元剤で処理して、１３−｛３
    −（メルカプトプロピオニル）｝アドリアマイシンヒド
    ラゾンを形成し；次に ｄ）減殺する対象に選ばれた細胞集団に対して反応性で
    あり、マレイミド基が付着されている抗体と該ヒドラゾ
    ンを反応させることを特徴とする請求項１又は３に記載
    のイムノコンジユゲートの製造方法。 ２４、請求項１又は３に記載の少なくとも１のイムノコ
    ンジユゲートの医薬的有効量及び医薬上許容し得るキリ
    ヤーより成ることを特徴とする癌、非悪性腫瘍、非細胞
    破壊性ウイルム又は他の病源体的感染、及び自己免疫性
    疾患より成る群から選ばれた疾病の治療に有用な医薬上
    許容し得る組成物。
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