PT89683B - Processo para a preparacao de imunoconjugados de antraciclina comportando novos ligandos - Google Patents

Description

DOMÍNIO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos imunoconjugados de antraciclina e aos métodos para a sua preparação. Mais particularmente a presente invenção refere-se a imunoconjugados constituídos por um anticorpo reactivo com uma população celular seleccionada para ser eliminada, possuindo esse anticorpo diversas moléculas citotóxicas de antraciclina covalentemente ligadas à sua estrutura. Cada molécula de antraciclina é conjugada com o anticorpo através de um elemento de união (ligador), estando a antraciclina ligada a esse elemento de união através de uma ligação acil-hidrazona sensível aos ácidos na posição 13-ceto da antraciclina. Um aspecto preferencial da presente invenção refere-se a um imunoconjugado de adriamicina em que a adriamicina é acoplada ao elemento de união através de uma ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto. 0 elemento de

união contém adicionalmente uma ponte dissulfeto ou tioéter como parte do acoplamento do anticorpo ao imunoconjugado. Por outro lado, de acordo com a presente invenção, são sintetizados novos derivados aci1-hidrazona da antraciclina e utilizados para a preparação dos imunoconjugados da presente invenção.

A ligação acil-hidrazona sensível aos ácidos dos imunoconjugados da presente invenção permite a libertação da antraciclina a partir do imunoconjugado no ambiente acídico externo ou interno da célula alvo. Em consequência os imunoconjugados e os métodos da presente invenção são úteis em sistemas para o fornecimento de fármacos mediados por anticorpos para a aniquilação preferencial de uma população seleccionada de células no tratamento de doenças tais como os cancros ou outros tumores, infecções virais não citocidas ou outras infecções patogénicas e nos casos de doenças autoimunes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As antraciclinas são compostos antibióticos que exibem actividade citotóxica. Diversos estudos demonstraram que as antraciclinas podem eventualmente aniquilar células de acordo com diversos mecanismos incluindo: 1) intercalação das moléculas do fármaco no ADN de uma célula inibindo consequentemente a síntese de ácido nucleico dependente do ADN; 2) produção pelo fármaco de radicais livres os quais reagem depois com as macromoléculas celulares de modo a danificarem as células ou 3) interacções das moléculas do fármaco com a membrana celular [ver, por exemplo, C. Peterson e colaboradores, Transport And Storage Of Anthracyclines In Experimental Systems And Human Leukemia, em Anthracycline Antibiotics In Câncer Therapy, F.M. Muggia e colaboradores (ed.s), p. 132 (Martinus Nijhoff Publishers 1982); ver também, N.R. Bachur, Free Radical Damage, id. at pp. 97-102], Devido ao seu potencial citotóxico as antraciclinas têm sido utilizadas no tratamento de diversos tipos de cancro tais como a leucémia, o carcinoma da mama, o carcinoma do pulmão, o adenocarcinoma dos ovários e sarcomas [ver, por exemplo, P.H. Wiernik, Current Status Of Adriamycin And Daunomycin In Câncer Treatment, em Anthracyclines: Current

Status And New Developments, S.T. Crooke e colaboradores (eds.), pp. 273-94 (Academic Press 1980)]. As antraciclinas vulgarmente utilizadas englobam a adriamicina e a daunomicina.

Embora estes compostos possam ser úteis eventualmente no tratamento de neoplasmas e de outros estados de doença em que se deseje eliminar uma população celular seieccionada, a sua eficácia terapêutica é frequentemente limitada pela toxicidade dependente da dose que é um factor associado à sua administração. Por exemplo, no tratamento de tumores, a mielossupressão e a cardiotoxicidade constituem efeitos secundários adversos típicos [ver S.T. Crooke, Goals For Anthracycline Analog Development At Bristol Laboratories, Anthracyclines: Current Status And New Developments, supra, na p. 11]. Em consequência têm sido

feitas tentativas, no tratamento de tumores, para melhorar os efeitos terapêuticos desses compostos através da ligação de antraciclinas a anticorpos dirigidos contra antígenos associados aos tumores. Por este processo o fármaco pode ser fornecido ou dirigido ao local do tumor e os seus efeitos secundários tóxicos sobre as células normais de todo o corpo podem ser diminuídos. Os imunoconjugados constituídos pelas antraciclinas adriamicina (ADM) ou daunomicina (DAU) acopladas a anticorpos policlonais ou monoclonais dirigidos contra antígenos associados a tumores são conhecidos na especialidade [ver, por exemplo, J. Gallego e colaboradores, Preparation Of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity, Int. J. Câncer, 33, pp. 737-44 (1984) e R. Arnon e colaboradores, In Vitro And In Vivo Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies, Immunological Rev., 62, pp. 5-27 (1982)].

As abordagens mais frequentemente utilizadas para o acoplamento de uma antraciclina a um anticorpo têm utilizado uma ligação ao radical amino-açúcar das antraciclinas. Por exemplo, o radical amino-açúcar é oxidado por tratamento com periodato de sódio e é directamente acoplado aos resíduos de lisina no anticorpo através da formação de uma base de Schiff [ver, por exemplo, E. Hurwitz e colaboradores, The Covalent Binding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodies, With Retention Of Both Drug And Antibody Activities, Câncer Res., 35, pp. 1182-86 (1975)]. Em alternativa, as antraciclinas têm sido ligadas aos

anticorpos através de uniões, mediadas por uma carbo-di-imida, do radical amino-açúcar das antraciclinas aos grupos carboxilo do anticorpo [ver, por exemplo, E. Hurwitz e colaboradores, supra]. Além disso, as antraciclinas também

têm sido ligadas	aos	anticorpos por	interligação do radical
amino-açúcar do	fármaco e dos grupos	amino	do anticorpo com
glutaraldeído [	ver,	por exemplo,	M.	Belles-Isles e
colaboradores,	In	Vitro Activity	Of	Daunomycin-Anti-

-AlphaFetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells, Br. J. Câncer, 41, pp. 841-42 (1980)]. Todavia, estudos com imunoconjugados cujo radical amino-açúcar da molécula da antraciclina foi modificado por ligação ao anticorpo indicam uma perda de actividade citotóxica do fármaco conjugado [ver, por exemplo, R. Arnon e colaboradores, supra, at pp. 7-8], Por outro lado, estudos de análogos das antraciclinas indicam que as modificações das antraciclinas nos seus radicais amino-açúcar têm como consequência uma diminuição da actividade citotóxica do fármaco análogo comparativamente com o fármaco original [ver, por exemplo, K. Yamamoto e colaboradores, Antitumor Activity Of Some Derivatives Of Daunomycin At The Amino And Methyl Ketone Functions, J. Med. Chem., 15, pp. 872-75 (1972)].

Foram ainda preparados outros imunoconjugados em que a antraciclina conhecida pela designação daunomicina foi ligada directamente a um anticorpo na posição 14 do átomo de carbono (C-14) do fármaco. Contudo, a actividade citotóxica selectiva desses imunoconjugados em relação às células tumorais não foi facilmente reproduzível· e apenas se revelou

consistente	para uma	concentração de	20	pg/ml	[ver, J.
Gallego e	colaboradores,	supra].
	0	pedido de	patente japonesa	nQ	274658	revela e
descreve	a	conjugação	de uma antraciclina	a um	anticorpo

através de uma união acil-hidrazona na posição 13-ceto. Esta conjugação foi realizada utilizando métodos que implicam a transformação do anticorpo e subsequente reacção desse derivado com uma antraciclina. Estes métodos não são aconselháveis uma vez que a transformação do anticorpo implica reacções não específicas indesejáveis obtendo-se muito fracas proporções antraciclina:anticorpo.

De acordo com o primeiro método tratou-se o anticorpo com uma carbo-di-imida em presença de hidrazina para proporcionar um derivado do anticorpo de grupo hidrazido o qual reagiu depois com a antraciclina de tal modo que essa antraciclina ficou directamente ligada à estrutura do anticorpo. Todavia, os imunoconjugados resultantes são propensos a agregação das moléculas do anticorpo. Por outro lado, uma vez que este método exige a existência de grupos ácido carboxílico na molécula do anticorpo cujo número é limitado, estes imunoconjugados exibem fracas proporções antraciclina:anticorpo (aproximadamente 1,1-1,3).

segundo método implica a reacção do anticorpo com o anidrido succínico para proporcionar um derivado amidácido do anticorpo. A seguir faz-se reagir este derivado com hidrazina para proporcionar um derivado do anticorpo hidrazídico o qual se faz reagir depois com uma antraciclina, o composto daunomicina. Esta segunda abordagem apresenta o inconveniente de essa reacção do derivado do anticorpo com a hidrazina ser de tipo não específico, conduzindo à produção de uma mistura de diferentes derivados do anticorpo para além do desejado derivado hidrazídico. Deste modo, tal como indicado na memória descritiva da patente n^Q 274658, a proporção molar entre a antraciclina e o anticorpo é bastante fraca (aproximadamente 1, ver o pedido de patente japonesa, página 264, coluna 1).

Finalmente, existem outras hidrazonas de antraciclinas reveladas e descritas por G.L. Tong e colaboradores, J. Med. Chem., 21, pp. 732-37 (1978); T. Smith e colaboradores, J. Med. Chem., 21, pp. 280-83 (1978); e R.T.C. Brownlee e colaboradores, J. Chem. Soc., pp. 659-61 (1986). Ver também o pedido de patente norte americana n° 4112217 o qual revela e descreve bis-hidrazonas de daunomicina e de adriamicina.

De acordo com outros estudos, as antraciclinas têm sido ligadas a veículos portadores com elevado peso molecular tais como, o dextrano ou o ácido poliglutâmico com o objectivo de se potenciar a actividade citotóxica e de se reduzir a toxicidade do fármaco [ver, por exemplo, R. Arnon e colaboradores, supra, na pág. 5 e E. Hurwitz e colaboradores, Soluble Macromolecules As Carriers For Daunorubicin, J. Appl. Biochem,, 2, pp. 25-35 (1980)]. Estas antraciclinas ligadas ao veículo portador têm sido também covalentemente

ligadas aos anticorpos dirigidos contra os antígenos associados aos tumores para formarem imunoconjugados que encaminhem o fármaco citotóxico especificamente para as células tumorais. Por exemplo, a adriamicina tem sido ligada a um desses anticorpos anti-tumor através de uma ponte carboximetil-dextrano de uma hidrazida em que a molécula da adriamicina foi ligada a um derivado de hidrazina de grupo carboximetil-dextrano na cadeia lateral do grupo carbonil em C-L3 do anel da tetraciclina da adriamicina para formar uma hidrazona. 0 anticorpo foi depois ligado ao derivado de dextrano-hidrazida com glutaraldeido para proporcionar um conjugado adriamicina-dextrano-anticorpo [ver, R. Arnon e colaboradores, Monoclonal Antibodies As Carriers For

Immunotargeting of Drugs, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, R.W. Baldwin e colaboradores (eds.), pp. 365-83 (1985) e E. Hurwitz e colaboradores, A Conjugate Of Adriamycin And Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells In Vitro, Ann. N.Y. Acad. Sei., 417, pp. 125-36 (1983)].

Contudo, a utilização de veículos portadores impõe algumas desvantagens. Por exemplo, os imunoconjugados que contêm veículos portadores são de dimensões bastante grandes e são rapidamente removidos pelo sistema reticuloendotelial in vivo [ver, por exemplo, R.O. Dillman e colaboradores, Preclmical Trials With Combinations And Conjugates Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin, Câncer Res., 46, pp. 4886-91 (1986)]. Esta rápida remoção dos imunoconjugados que

contêm um veículo pode eventualmente não ser vantajosa para fins terapêuticos uma vez que o fármaco conjugado pode eventualmente nunca atingir o seu local pretendido de acção, isto é, o grupo seleccionado de células que se pretende aniquilar. Por outro lado, a presença de um veículo de elevado peso molécular pode afectar negativamente a estabilidade do imunoconjugado e demonstrou-se já que reduz a actividade de ligação do anticorpo ao conjugado [ver, por exemplo, M.J. Embleton e colaboradores, Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents, em Monoclonal Antibodies For Câncer

Detection And Therapy, R.W. Baldwin e colaboradores (eds.), pp. 323-24 (1985)]. Além disso, em estudos com células tumorais, não houve qualquer evidência de que os monoconjugados que contêm veículos de elevado peso molécular sejam capazes de se localizarem em células tumorais in vivo. Comparar com C.H.J. Ford e colaboradores, Localization And Toxicity Study Of A Vindesine-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Câncer, Br. J. Câncer, 47, 35-42 (1983). 0 qual demonstra a localização de conjugados fármaco-anticorpo conjugados directamente em células tumorais in vivo.

Deste modo, revelou-se e descreveu-se a conjugação de antraciclinas com anticorpos pela utilização de ligações e veículos específicos. Conforme evidenciado antes a utilização destes imunoconjugados impõe desvantagens distintas que dependem da ligação ou do veículo específicos utilizados.

SUMàRIQ DA INVENÇÃO

Em consequência a presente invenção proporciona

uma nova variante química para a ligação de diversas moléculas de antraciclina citotóxica, através de um elemento de união, a um anticorpo dirigido contra um população celular seieccionada que constitui o alvo que se pretende aniquilar. Em conformidade com a presente invenção cada molécula de antraciclina é ligada a um anticorpo através de um elemento de união sendo a antraciclina ligada a esse elemento de união através de uma ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto da antraciclina de modo a proporcionar os novos imunoconjugados da presente invenção. Por exemplo, uma variante preferencial da presente invenção implica a síntese de um novo derivado adriamicina-hidrazona (ADM-HZN) que foi depois condensado com um anticorpo tiolado, resultando daí o acoplamento da antraciclina ao anticorpo através de um elemento de união. A ligação acil-hidrazona formada na posição C-13 da adriamicina (ADM) serve como local para o acoplamento da ADM ao elemento de união. Além disso, existe uma ponte dissulfeto contida no elemento de união que constituí o local de acoplamento ao anticorpo. De acordo com outra variante preferencial efectuou-se a redução do derivado ADM-HZN de modo a gerar um grupo sulfidrilo e efectuou-se a condensação do novo derivado de hidrazona resultante com um anticorpo transformado por maleimida. Este procedimento originou a formação de um elemento de união que possuí uma ligação acil-hidrazona que constituí o local do acoplamento desse elemento de união ã posição C-13 da ADM e que possuí uma ligação tioéter contida no elemento de união fazendo parte do acoplamento desse

elemento de união ao anticorpo. Como é evidente a partir destas variantes a presente invenção proporciona novos derivados de acil-hidrazona a partir de antraciclinas úteis para a preparação dos imunoconjugados da presente invenção.

Os imunoconjugados da presente invenção possuem proporções molares antraciclina:anticorpo compreendidas aproximadamente entre 4 e 10 e ambos retêm a actividade do anticorpo e citotóxica do fármaco que permite aniquilar as células alvo seleccionadas. A ligação hidrazona sensível aos ácidos que existe no local do acoplamento da antraciclina ao elemento de união do imunoconjugado e adicionalmente as pontes dissulfeto ou tioéter contidas nesse elemento de união de acordo com as variantes preferenciais da presente invenção, são idealmente adequadas para a libertação do fármaco activo sob condições redutoras e acídicas tais como aquelas tipicamente existentes no interior de uma célula, por exemplo, em vesículas lisossómicas.

Os imunoconjugados da presente invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas tais como as que incorporam uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um imunoconjugado da presente invenção e um veículo portador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se também a métodos para o fornecimento selectivo de fármacos citotóxicos a uma população seleccionada de células alvo que se pretende eliminar e refere-se ainda a métodos para o tratamento de um mamífero, por um processo farmaceuticamente aceitável, utilizando uma quantidade

L farmaceuticamente eficaz de uma composição da presente invenção.

De forma vantajosa, os imunoconjugados, as composições farmacêuticas e os métodos agora descritos e revelados proporcionam um processo útil de abordagem para o encaminhamento de fármacos antraciclínicos citotóxicos para uma população seleccionada de modo a conseguir-se a aniquilação preferencial dessas células alvo no tratamento de doenças tais como os cancros e outros tumores, infecções virais não citócidas ou outras infecções patogénicas e ainda no caso de doenças autoimunes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa uma forma esquemática da síntese do novo derivado ADM-HZN utilizado para a preparação dos imunoconjugados da presente invenção.

A Figura 2 representa uma forma esquemática da síntese dos imunoconjugados de uma das variantes da presente invenção em que um anticorpo monoclonal (MAB) (ou ACM) foi primeiro tiolado utilizando-se alternativamente SPDP (propionato de N-succinimidil-3-(2-piridil-ditio) ou 2-IT (2-iminotiolano) e depois fez-se reagir o anticorpo tiolado com ADM-HZN para proporcionar um imunoconjugado da presente invenção, com uma ligação hidrazona na posição 13-ceto do composto ADM e uma ligação dissulfeto contidas no elemento de união.

permi te

A Figura 3 representa um diagrama de dispersão que comparar um número de grupos tiol reactivos

substituídos no anticorpo monoclonal (proporção SH/MAB) com a proporção molar final ADM/MAB conseguida nos imunoconjugados produzidos pela condensação dos anticorpos monoclonais 5E9 e 3A1, tiolados com o composto SPDP, com o derivado ADM-HZN.

A Figura 4 representa um diagrama de dispersão que permite comparar a proporção SH/MAB com a proporção molar final ADM/MAB conseguida nos imunoconjugados produzidos pela reacção dos anticorpos 5E9 e 3A1, tiolados com o composto 2-IT, com o derivado ADM-HZN.

A Figura 5 representa um diagrama de dispersão que mostra a relação entre a proporção molar ADM/MAB e o rendimento protéico dos imunoconjugados da presente invenção preparados utilizando alternativamente anticorpos tiolados com o composto SPDP ou os anticorpos tiolados com o composto

2-IT.

A Figura 6 representa um diagrama de dispersão que permite comparar a proporção molar ADM/MAB em função do rendimento protéico obtido nas preparações de imunoconjugados utilizando anticorpos monoclonais tanto do isotipo IgGi (por exemplo, 5E9 e 3A1) como do isotipo IgG2, (por exemplo, L6). Estes anticorpos foram tiolados com o composto SPDP.

A Figura 7 representa também um diagrama de dispersão que permite comparar a proporção molar ADM/MAB em função do rendimento protéico dos imunoconjugados que possuem anticorpos dos isotipos IgG^ ou IgG2 (tal como na Figura 6) com a excepção desses anticorpos terem sido tiolados com o composto 2-IT.

X

A Figura 8 representa um gráfico das curvas de ligação dos dois imunoconjugados da presente invenção comparadas com as curvas de ligação dos respectivos anticorpos monoclonais não conjugados.

A Figura 9 representa um cromatograma obtido por croamtografia em líquido de elevada pressão (CLEP) que demonstra a estabilidade de um imunoconjugado da presente invenção para valores de pH compreendidos entre 4 e 7. Este cromatograma demonstra a sensibilidade aos ácidos da ligação acil-hidrazona da presente invenção, conforme indicado pela libertação acrescida do composto ADM livre a partir do imunoconjugado à medida que o pH se torna mais acídico.

A Figura 10 representa um cromatograma obtido por CLEP que demonstra a libertação do radical ADM a partir de um imunoconjugado da presente invenção após tratamento com o composto DTT.

A Figura 11 representa um gráfico da citotóxicidade selectiva dos imunoconjugados da presente invenção em relação à linha de células de Daudi utilizando-se para o efeito um ensaio de formação de colónias em gelose macia. Estes imunoconjugados foram preparados utilizando anticorpos tiolados com o composto 2-IT.

A Figura 12 representa um gráfico da citotoxicidade selectiva dos imunoconjugados da presente invenção em relação às células Namalwa e a potência acrescida dos imunoconjugados comparativamente com o composto ADM livre, utilizando-se para o efeito um ensaio de diluição limitativo.

A Figura 13 representa um gráfico da citotoxicidade selectiva dos imunoconjugados da presente invenção relativamente às células de Daudi utilizando-se para o efeito o ensaio de formação de colónias em gelose macia. No caso presente os imunoconjugados foram preparados utilizando anticorpos tiolados com o composto SPDP.

A Figura 14 representa um gráfico da citotoxicidade selectiva de outro imunoconjugado da presente invenção em que se utilizou o composto SPDP com agente de tiolação. Este imunoconjugado foi citotóxico para as células de Namalwa e de Daudi positivas em antígeno mas não foi citotóxico para as células HSB-2 negativas em antígeno, utilizando-se para o efeito um ensaio de formação de colónias em gelose macia.

A Figura 15 representa o diagrama de citotoxicidade selectiva dos imunoconjugados 5E9 e 3A1 da presente invenção em relação a uma linha celular do carcinoma do cólon humano (5E9+, 3A1-), utilizando-se para o efeito um ensaio de formação de colónias.

A Figura 16 representa um gráfico sobre a falta de tooxicidade em relação às células de Daudi, dos imunoconjugados preparados por acoplamento do composto ADM aos anticorpos monoclonais através de um elemento de união dipeptídico leu-ala.

A Figura 17 representa esquematicamente a síntese de um imunoconjugado da presente invenção em que o novo derivado ADM-HZN da presente invenção foi reduzido e depois

reagiu com um anticorpo tratado com SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofeni1)butirato) para proporcionar um imunoconjugado que possuí um elemento de união cora uma ponte tioéter contida na sua estrutura.

A Figura 18 representa um gráfico da citotoxicidade de um imunoconjugado da presente invenção que possuí, para além da ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto, uma ponte tioéter contida no seu elemento de união.

Esse imunoconjugado demonstrou uma maior potência relativamente ao composto ADM livre sobre as células de

Namalwa, utilizando-se para o efeito um ensaio de 3 incorporação de H-timidina.

A Figura 19 representa um gráfico da citotoxicidade em relação às células HSB-2 do imunoconjugado da Figura 18, utilizando-se para o efeito o mesmo ensaio de 3 incorporação de H-timidina.

A Figura 20 representa um gráfico da citotoxicidade selectiva de um imunoconjugado da presente invenção em relação às células positivas em antígeno comparativamente com células negativas em antígeno, utilizando-se para o efeito o ensaio de incorporação de H-timidina, possuindo esse imunoconjugado, para além da ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto, uma ponte tioéter contida no seu elemento de união.

A Figura 21 representa um gráfico da actividade anti-tumor in vivo de imunoconjugado da presente invenção sobre as xenoenxertias de células tumorais de Daudi de origem

ί ί

humana em murganhos. Esse imunoconjugado demonstrou uma maior actividade anti-tumor do que aquela que é observável quando se utiliza uma dose equivalente do composto ADM livre.

A Figura 22 representa um gráfico da actividade anti-tumor in vivo do composto ADM sobre as xenoenxertias de células tumorais de Daudi de origem humana em murganhos ao longo do tempo e para doses variáveis desse composto ADM, utilizando-se um esquema de tratamento de tipo Q7Dx3 e administração intravenosa (i.v.).

A Figura 23 representa um gráfico da actividade anti-tumor in vivo de um imunoconjugado da presente invenção sobre as xenoenxertias das células tumorais de Daudi de origem humana em murganhos comparativamente com a actividade anti-tumor de uma dose optimizada de composto ADM livre (administrada por via intravenosa segundo um esquema de tratamento de tipo Q7Dx3 e para uma dose mg/kg/inj.). Esse imunoconjugado demonstrou actividade anti-tumor.

A Figura 24 representa sob a forma de um quadro a actividade anti-tumor in vivo do composto ADM sobre as xenoenxertias de células tumorais de Ramos de origem humana em murganhos, recorrendo-se à administração por via intravenosa mas variando o esquema e as doses de tratamento.

A Figura 25 representa um gráfico da actividade anti-tumor in vivo do composto ADM sobre as xenoenxertias de células tumorais de Ramos de origem humana em murganhos ao longo do tempo e segundo doses variáveis do composto ADM, de 10-11 uma maior c

utilizando-se o esquema de tratamento por injecção única e administração por via intravenosa.

A Figura 26A representa um gráfico da actividade anti-tumor in vivo de um imunocoonjugado da presente invenção sobre xenoenxertias de células tumorais de Ramos de origem humana em murganhos comparativamente com a actividade anti-tumor de uma dose optimizada de composto ADM livre (administrado por via intravenosa segundo um esquema de tratamento de tipo QlDxl, sendo a dose de 16-18 mg/kg/inj). Esse imunoconjugado demonstrou uma maior actividade anti-tumor do que o composto ADM livre.

A Figura 26B representa a actividade anti-tumor in vivo do imunoconjugado ao longo do tempo para doses diferentes de conjugado, demonstrando que o efeito anti-tumor do conjugado é de natureza dependente da dosagem. As dosagens dos imunoconjugados testados nas Figuras 26A e B estão referenciadas em termos de antraciclina existente no conjugado, estando os correspondentes valores do anticorpo entre parenteses.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Para que a presente invenção agora descrita e revelada possa ser mais completamente compreendida apresenta-se seguidamente a memória descritiva pormenorizada.

A presente invenção refere-se imunoconjugados de antraciclina, novos antraciclina-acil-hidrazona, métodos para a sua preparação, composições farmacêuticas e métodos para o fornecimento de a novos derivados de antraciclinas citotóxicas a uma população seleccionada de células que se deseja eliminar, para o tratamento de doenças tais como cancros e outros tumores, infecções virais não citocidas e outras infecções patogénicas e ainda doenças de tipo autoimune. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a imunoconjugados constituídos por um anticorpo dirigido contra uma população de células seleccionadas, possuindo esse anticorpo diversas moléculas de antraciclina ligadas à sua estrutura. As moléculas da antraciclina encontram-se covalentemente ligadas ao anticorpo de tal modo que se forma um elemento de união entre cada molécula de fármaco e o anticorpo, ficando esse elemento de união acoplada à antraciclina por uma ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto da antraciclina. Este processo pode ser realizado progressivamente, através da formação inicial de um novo derivado de tipo antraciclina-hidrazona o qual se faz reagir depois com um anticorpo de especificidade adequada [ver, por exemplo, R.R. Hardy, Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry” em Handbook Of Experimental Immunology, Volume 1: Immunochemistry, D.M. Weir e colaboradores (eds.), pp. 31.4-31.12 (4th Ed. 1986) para uma discussão sobre técnicas convencionais de acoplamento de anticorpos]. 0 comprimento do elemento de união que liga os componentes antraciclina e anticorpo do imunoconjugado pode variar tanto quanto o ponto de acoplamento desse elemento de união à antraciclina se encontre sob a forma de uma ligação acil-hidrazona na posição

pode conter outra ligação tal como uma ligação de tipo dissulfeto, tioéter, amida, carbamato, éter ou éster, segundo o seu comprimento e situada entre os pontos de acoplamento desde o fármaco até ao anticorpo.

As antraciclinas que constituem os imunoconjugados da presente invenção podem ser eventualmente qualquer tipo de antraciclinas que contenham um grupo certo na posição 13 do átomo de carbono (C-13). Essas antraciclinas englobam, sem que isso constitua qualquer limitação, a adriamicina, a daunomicina, a detorrubicina, a carminomicina, a idarrubicina, a epirrubicina, a esorrubicina, a 4'-THP-adriamicína, a AD-32 e a 3'-desamino-3'-(3-ciano-4morfolinil)-doxorrubicin (ver A.M. Casazza, Experimental Studies On New Anthracyclines em Adriamycin: Its Expanding Role In Câncer Treatment, M. Ogawa e colaboradores (eds.), pp. 439-52 (Excerpta Medica 1984)].

Os anticorpos que constituem os imunoconjugados da presente invenção podem ser eventualmente quaisquer anticorpos reactivos com uma população celular específica que se pretende eliminar ou aniquilar. Como exemplos desses anticorpos refere-se, sem que isso constitua qualquer limitação, os anticorpos que se ligam a antígenos associados a tumores tais como os antígenos existentes nos carcinomas, melanomas, linfomas, sarcomas ósseos ou dos tecidos moles e ainda no caso de outros tumores, anticorpos que se ligam a antígenos associados a vírus ou a outros agentes patogénicos

e ainda anticorpos que se ligam a antígenos da superfície de células anormais. Estes anticorpos podem ser eventualmente de tipo policlonal ou de preferência podem ser de tipo monoclonal e podem ser produzidos utilizando-se técnicas bem conhecidas na especialidade [ver, por exemplo, R. A. DeWeger e colaboradores, Eradication Of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambucii-Antibody Complexes, Immunological Rev., 62, pp. 29-45 (1982) (anticorpos policlonais específicos de tumores produzidos e utilizados em conjugados) e M. Yeh e colaboradores, Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sei., 76, pp. 2927-31 (1979) e J. P. Brown e colaboradores, Structural Characterization Of Human Melanoma

Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (No.2), pp. 539-46 (1981) (anticorpos produzidos monoclonais específicos de tumores)]. Por exemplo, é possível utilizar o anticorpo monoclonal L6 específico para as células do carcinoma do pulmão humano ou o anticorpo monoclonal 791T/36 específico para as células do sarcoma osteogénico. por outro lado, é possível utilizar eventualmente anticorpos não internalizantes ou de preferência anticorpos internalizantes. 0 termo anticorpo utilizado na presente memória descritiva engloba as moléculas de anticorpo intacto ou fragmentos que contenham a região de ligação activa da molécula do anticorpo, por exemplo, os fragmentos Fab ou F(ab')2- No caso de se utilizar anticorpos monoclonais, esses anticorpos podem ser, sem que isso ί

ιconstitua qualquer limitação, de natureza humana ou provenientes de murganhos ou ainda anticorpos quiméricos.

Deste modo, os anticorpos dos imunoconjugados da presente invenção actuam de modo a fornecerem moléculas de antraciclina à população celular particular com as quais o anticorpo é reactivo. Por exemplo, um anticorpo dirigido contra um antígeno existente à superfície de células tumorais ligar-se-à e fornecerá as suas antraciclinas a esses células tumorais ou um anticorpo dirigido contra uma proteína de um vírus da imunodeficiência humana (VIH) que provoca a SIDA fornecerá as suas antraciclinas citotóxicas às células infectadas com o VIH. A libertação do fármaco no interior ou no local da população celular particular com a qual reage esse anticorpo tem como consequência a preferencial dessas células particulares. Deste modo evidente que os imunoconjugados da presente invenção úteis para o tratamento de quaisquer doenças em que pretenda eliminar uma população celular específica, possuindo essa população celular um antígeno à superfície das células o qual permite a ligação do imunoconjugado. As doenças para as quais são úteis os imunoconjugados da presente invenção englobam, sem que isso constitua qualquer limitação, cancros e outros tumores, infecções virais não citocidas ou outras infecções patogénicas tais como a SIDA, herpes, CMV (citomegalovírus), VEB (vírus de Epstein Barr) e PEES (pan-encefalite esclerosante subaguda) e artrite reumatóide.

Sem que haja qualquer fundamento teórico, admiteaniquilação é

são se

-se que as moléculas de antraciclina ligadas ao anticorpo, isto é, sob a forma do imunoconjugado da presente invenção, são fornecidas às células alvo que se pretente aniquilar através da especificidade do anticorpo e por isso podem eventualmente entrar na célula através do mesmo percurso endocítico que conduz à internalização dos anticorpos e ligandos não conjugados ligados à membrana [ver, por exemplo, I. Pastan e colaboradores, Pathway Of Endocytosis, em Endocytosis, I. Pastan e colaboradores (eds.), pp. 1-44 (Plenum Press 1985)]. Uma vez no interior da célula, as vesículas endocíticas que contêm o imunoconjugado fundem-se com os lisossomas primários para formarem lisossomas secundários [ver, por exemplo, M.J. Embleton e colaboradores, supra, na p. 334]. Uma vez que as moléculas de antraciclina estão ligadas ao anticorpo do imunoconjugado através de ligações aci1-hidrazona sensíveis aos ácidos, a exposição do imunoconjugado ao ambiente ácido das vesículas endocíticas e dos lisossomas origina a libertação da antraciclina a partir do imunoconjugado. Por outro lado, admite-se que a antraciclina libertada seja um fármaco relativamente não modificado susceptível de proporcionar uma actividade citotóxica total. Deste modo, a ligação hidrazona do imunoconjugado, sensível aos ácidos, é altamente, vantajosa para a libertação do fármaco citotóxico no interior das células alvo, aumentando a citotoxicidade do imunoconjugado relativamente a essas células. Em alternativa, é possível clivar a ligação hidrazona sob condições acídicas e /

redutoras no ambiente imediato externo ou envolvente das células alvo, por exemplo, no local do tumor, podendo eventualmente o fármaco libertado ser absorvido pelas células tumorai s.

Os imunoconjugados da presente invenção e os métodos para a sua preparação são exemplificados pelos

aspectos	preferências	segundo os quais a	adriamicina	da
classe	das	antraciclinas foi conjugada	com diversos
anticorpos.
	Em	primeiro	lugar, sintetizou-se	o derivado	de

adriamicina-hidrazona numa reacção em dois passos. Deixou-se reagir o reagente heterobifuncional SPDP (propionato de N-succinimidi1-3-(2-piridilditio) com hidrazina para proporcionar uma hidrazida de 3-(2-piridil-ditio)-propionilo e depois fez-se reagir esta hidrazida com o cloridrato de adriamicina (ADM-HC1) para proporcionar um novo derivado de ADM de grupo aci1-hidrazona, contendo um radical dissulfeto protegido por um grupo piridilo. Eventualmente é possível utilizar um catalisador ácido tal como o ácido trifluoro-acético para facilitar a formação da hidrazona. 0 derivado que se formou designa-se por cloridrato de adriamicina com 13-{3-(2-piridil-ditio)propionil}-hidrazona (ADM-HZN) (ver Figura 1).

Depois fez-se reagir o novo derivado de ADM-hidrazona com um anticorpo raonoclonal que havia sido préviamente tiolado com o composto SPDP e depois efectuou-se a redução ou a tiolação com o composto 2-IT (2-iminotiolano) com o anticorpo monoclonal acoplado à posição C-13 de uma ligação acil-hidrazona, adicionalmente uma ponte acoplado ao anticorpo (ver (ver Figura 2). 0 imunoconjugado com moléculas de ADM conjugadas por meio de um elemento de união cada molécula de ADM através de contendo esse elemento de união dissulfeto através da qual ficou Figura 2).

Outro aspecto da presente invenção implica a síntese de outro novo derivado de adriamicina-hidrazona em que o composto ADM-HZN anteriormente descrito foi ainda tratado com os agentes redutores DTT (ditiotreitol) ou tributil-fosfina, para proporcionar o composto 13—{3—

-(mercapto-propionil)}adriamicina-hidrazona (ver a Figura 17). Depois fez-se reagir este derivado com um anticorpo monoclonal ao qual se havia acoplado grupos maleimida, por exemplo, fazendo reagir o anticorpo com o composto SMPB (butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenilo)). Conforme se mostra na Figura 17 formou-se um imunoconjugado que possuí um elemento de união acoplado por uma ligação hidrazona à posição C-13 de cada molécula de ADM e possuindo também uma ponte tioéter como parte do seu acoplamento ao anticorpo. Deste modo é evidente que o elemento de união que liga o fármaco e o anticorpo pode ser eventualmente formado por diversos constituintes e uniões na medida em que essas uniões incluam a ligação hidrazona sensível aos ácidos na posição 13-ceto da antraciclina.

Também é evidente que a presente invenção

proporciona novos derivados de ligação aci1-hidrazona das antraciclinas que contenham uma posição 13-ceto possuindo as fórmulas' gerais I,II ou III:

em que:

Formula representa um grupo CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 ou

CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

R representa um grupo de fórmula geral ou em que χ = Η, NO2 ou halogéneo;

R representa um grupo OCH3 ou OH ou o átomo de hidrogénio;

R representa um grupo NH2, NHCOCF3, 4-morfolinilo, 3-ciano-4-morfolinilo, 1-piperidinilo, 4-metoxi-l-piperidinilo, benzil-amina, dibenzil-amina, cianometil-amina ou l-ciano-2-metoxi-etil-amina;

R^{4 5} representa um grupo OH ou O-THP ou um átomo de hidrogénio; R^ representa um grupo OH ou um átomo de hidrogénio, desde /

5 que R nao represente o grupo OH quando R representar o grupo OH ou O-THP; e n representa um inteiro compreendido entre 1 e 10 inclusivé;

em que:

R representa um grupo CH3, CH2OH, CHgOCO(CH2)3CH3 ou

CH₂OCOCH(OC₂H₅)2;

R representa um grupo OCH3 ou OH ou um átomo de hidrogénio;

R representa um grupo NH2, NHCOCF3, 4-morfolinilo, 3-ciano-4-morfolinilo, 1-piperidinilo, 4-metoxi-l-piperidinilo, benzil-amina, dibenzil-amina, cianometil-amina ou l-ciano-2-metoxi-eti1-amina;

R representa um grupo OH ou O-THP ou um átomo de hidrogénio;

representa um grupo OH ou um átomo de hidrogénio, desde que R não represente o grupo OH quando R representar o grupo OH ou O-THP; e n representa um inteiro compreendido entre 1 e 10 inclusivé; e

em que:

r! representa um grupo CH3,

CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

R representa um grupo de formula ch₂oh geral

CH₂OCO(CH₂)3CH3 ou

4-x ou em que x = H, N0₂ ou halogéneo;

r3 representa um grupo OCH3 ou OH ou um átomo de hidrogénio;

7

R e R representam independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, arilo, arilo substituído, aralquílo 4 7 ou aralquílo substituido; ou R , R e N conjuntamente formam um anel que possuí entre 4 e 7 lados, podendo esse anel ser eventual e facultativamente substituído;

R^ representa um grupo OH ou O-THP ou um átomo de hidrogénio; representa um grupo OH ou um átomo de hidrogénio, desde

que eX não represente o grupo OH quando representar o grupo OH ou O-THP; e n representa um inteiro compreendido entre 1 e 10 inclusivé.

Os compostos da classe antraciclina-acil-hidrazonas anteriormente revelados representam novos intermediários para a preparação dos iraunoconjugados da presente invenção e são exemplificados pelos compostos ADM-HZN e 13 -(3-(mercaptopropioni1)}adriamicina, descritos respectivamente nas variantes preferenciais apresentadas nesta memória descritiva.

Conforme se pode concluir das fórmulas anteriores, ç>s intermediários de grupo aci1-hidrazona da presente invenção englobam as hidrazonas seleccionadas entre diversas antraciclinas conhecidas tais como a adriamicina, a daunomicina e a carminomicina. Além disso, esses intermediários englobam as acil-hidrazonas transformadas em locais específicos da estrutura da antraciclina (por exemplo, os compostos 4'-THP-adriamicina-hidrazona e . 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfoiinil)adriamicina-hidrazona). Estes últimos intermediários podem ser sintetizados transformando primeiro a antraciclina para proporcionar um análogo desejado e utilizando depois esse análogo para a preparação do intermediário hidrazona da presente invenção. Os análogos de antraciclina conhecidos englobam aqueles que se encontram descritos nas patentes norte-americanas n^cs 4464529 e 4301277 designados por (3'-desamino-3'-(4-morfoiinil)- ou 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfoiinil)-antraciclina) , nas l

X

patentes norte-americanas n⁵ s

4202967 e

4314054 designados por (3'-desamino-3'-(1-piperdinil)- ou 3'-desamino-3'-(4-metoxi-l-piperidinii)-antracilina), na patente norte-americana n^s 4250303 designados por (N-benzil- ou N,N-dibenzil-antraciclina), na patente norte-americana n⁵ 4591637 designados por (N-metoximetil- ou N-cianometil-antraciclina) e na patente norte-americana n^Q 4303785 (análogos de antraciclinas de grupo acetal). Estes conhecidos análogos de antraciclina podem ser submetidos a reacções conforme descrito antes (ver a Figura 1) para proporcionar novas acil-hidrazonas as quais podem ser depois conjugadas com um anticorpo de uma especificidade desejada conforme descrito na presente memória descritiva.

Em alternativa, é possível produzir primeiro um intermediário de acil-hidrazona não transformado de acordo com a presente invenção, tal como descrito na presente memória descritiva, a partir de uma antraciclina não transformada tal como a adriamicina, a daunoraicina ou a carminomicina e depois é possível transformar este novo intermediário de modo a proporcionar uma nova aci1-hidrazona substituída conforme desejado. Por exemplo, o composto ADM-HZN pode ser submetido a uma transformação no seu radical amino-açúcar por aminação redutora com 2,2'-oxidiacetaldeído em conformidade com o procedimento descrito na patente norte-americana n^Q 4464529 para proporcionar o composto 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfolinil)adriamicina-hidrazona. De modo idêntico é possível submeter o composto ADM-HZN a uma /

transformação no seu radical amino-açúcar para proporcionar novos derivados de acil-hidrazona tais como os compostos 3'-desamino-3'-(4-morfolinil)-ADM-hidrazona (ver a patente norte-americana n² 4301277), 3'-desamino-3'-(1-piperdinii)-ADM-hidrazona (ver a patente norte-americana n^a 4202967), 3'-desamino-3'-(4-metoxi-l-piperdinil)-ADM-hidrazona (ver a patente norte-americana n^s 4314054), N-benzi1-ADM-hidrazona e

N,N-dibenzi1-ADM-hidrazona (ver a patente norte-americana n^a 4250303) ou N-metioxi-metil-ADM-hidrazona e N-cianometil-ADM-hidrazona (ver a patente norte-americana n^a 4591637). Além disso, o composto ADM-HZN pode ser transformado na posição R⁵ das fórmulas I-III conforme descrito na patente norte-americana n^Q4303785 para proporcionar derivados da hidrazona de grupo acetal tais como o composto 4'-THP-ADM-hidrazona.

Faz-se observar que estes novos procedimentos para a transformação dos compostos acil-hidrazonas da presente invenção pode utilizar como materiais de partida hidrazonas de antraciclinas diferentes do composto ADM tais como a daunomicina ou a carminomicina, para proporcionar novos compostos tais como N-benzil-daunomicina-hidrazona ou 3'-desamino-3'-(4-morfolinil)carminomicina-hidrazona , os quais se consideram também englobados no âmbito da presente invenção.

A avaliação dos imunoconjugados antraciclina-anticorpo preparados de acordo com a presente invenção demonstrou que esses imunoconjugados retinham a actividade de ligação do anticorpo e exibiam um poder de aniquilação celular, orientado pelo anticorpo, tanto para as células de linfomas como de carcinomas, sobre condições de ensaio diversificadas. Deste modo, as células que possuem o antígeno para o qual se dirigiu o anticorpo do conjugado foram aniquiladas eficientemente pela antraciclina ao passo que as células que não possuíam o antígeno adequado não foram aniquiladas. Na realidade, em diversas experiências descobriu-se que a antraciclina fornecida pelo anticorpo era mais potente do que quantidades equivalentes de antraciclina não conjugada. As diferenças existentes entre os mecanismos de incorporação existentes nas células tumorais e os mecanismos de transporte intracelular podem ser eventualmente responsáveis pelas diferenças de potência observadas entre a acção do fármaco livre e a acção do fármaco conjugado com o anticorpo.

Por outro lado, estudos efectuados utilizando xenoenxertias de tumores humanos em murganhos demonstraram a capacidade dos imunoconjugados da presente invenção para inibirem o crescimento de tumores in vivo, proporcionando em alguns casos a completa regressão do tumor. Demonstrou-se que os imunoconjugados possuíam uma potência maior e inibiam o crescimento do tumor de uma forma mais intensa do que a antraciclina não conjugada. Além disso, os imunoconjugados foram tolerados pelos animais num grau muito mais elevado do que o fármaco livre, sendo esses imunoconjugados pelo menos 10 vezes menos tóxicos do que apenas a antraciclina não conjugada.

As propriedades de ligação e de citotoxicidade dos imunoconjugados aparentemente da presente invenção um aperfeiçoamento em imunoconjugados referenciados na literatura nos quais as antraciclinas foram directamente ligadas ao anticorpo através do radicai amino-açúcar da antraciclina. Esses imunoconjugados ligados ao radical amino-açúcar continham frequentemente menores proporções molares entre antraciclina e anticorpo e exibiam uma citotoxicidade reduzida em relação ao fármaco livre e exibiam reduzidas propriedades de ligação representam relação aos colaboradores, colaboradores, ao anticorpo [ver, por exemplo, R. Arnon e Immunological Rev., 62, supra; E. Hurwitz e Câncer Res., 35, supra; e R. Yamamato e colaboradores, supra]. Por outro lado, os estudos de estabilidade efectuados sobre os imunoconjugados da presente invenção indicaram que a antraciclina foi libertada a partir dos imunoconjugados sob condições redutoras e acídicas semelhantes às que existem num ambiente celular. Assim, a retenção da elevada actividade citotóxica do fármaco que se observou com os imunoconjugados descritos na presente memória descritiva pode ser explicada pelo facto de ter sido fornecido às células alvo um fármaco relativamente não modificado.

Além disso, foi possível optimizar as condições de reacção de modo a conseguir-se proporções molares antraciclina:anticorpo aproximadamente compreendidas entre 4 e 10, utilizando-se para o efeito vários anticorpos de diferentes isótipos. A quantidade de proteína recuperada após a condensação com o derivado ADM-HZN caiu extraordinariamente quando se tentou alcançar proporções molares superiores a 10. Admite-se que a limitação principal para se obterem imunoconjugados com proporções molares superiores a 10 se deva à solubilidade reduzida dos conjugados em solução aquosa e à associação física da antraciclina com a proteína.

Os estudos agora efectuados in vivo demonstrativos de uma melhor actividade anti-tumor dos imunoconjugados da presente invenção relativamente ao fármaco livre e também demonstrativos da sua reduzida toxicidade sistémica, indicam um índice terapêutico acrescido para esses conjugados. Deste modo, a presente invenção engloba também as composições, combinações e métodos farmacêuticos para o tratamento de doenças tais como os cancros e outros tumores, infecções virais não citocidas ou outras infecções patogénicas e ainda doenças de tipo autoimune. Mais particularmente, a presente invenção engloba métodos para o tratamento de doenças em mamíferos que consistem em administrar ao mamífero hospedeiro pelo menos um imunoconjugado que contenha uma antraciclina por um processo farmaceuticamente aceitável.

Em alternativa, as variantes dos métodos da presente invenção englobam a administração simultânea ou sequencialmente de diversos imunoconjugados diferentes, isto é, imunoconjugados que sejam portadores de diferentes antraciclinas ou de diferentes anticorpos, para utilização em métodos quimioterapêuticos combinados. Por exemplo, de acordo com um dos seus aspectos a presente invenção pode

eventualmente implicar a utilização de diversos imunoconjugados de antraciclina em que varie a especificidade do componente anticorpo do conjugado, isto é, utiliza-se diversos imunoconjugados possuindo cada um deles um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno ou a locais ou a epítopes diferentes do mesmo antígeno presente na população celular visada. 0 componente antraciclina destes imunoconjugados pode eventualmente ser o mesmo ou pode variar. Por exemplo, esta variante pode talvez ser especialmente útil no tratamento de alguns tumores em que as quantidades dos diversos antígenos à superfície de um tumor são desconhecidas ou em que a população celular do tumor é heterogénea no que diz respeito à expressão antigénica, quando se pretender garantir que uma quantidade suficiente de fármaco é encaminhada para todas as células tumorais no local do tumor. A utilização de diversos conjugados portadores de especificidades antigénicas ou de epítopes diferentes para o tumor aumenta a possibilidade de se obter uma quantidade suficiente de fármaco no local do tumor. Além disso, este aspecto é importante para se conseguir um elevado grau de especificidade para o tumor uma vez que é pequena a probabilidade de o tecido normal possuir também todos os antígenos associados ao tumor [cf., I. Hellstrom e colaboradores, Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity, J. Immunol., 127 (No. 1), pp. 157-60 (1981) ] .

/

Em alternativa é possível utilizar diversos imunoconjugados diferentes em que apenas varia o componente antraciclina do conjugado. Por exemplo, é possível ligar um anticorpo particular ao composto adriamicina para formar um imunoconjugado e é possível ligar esse anticorpo ao composto daunomicina para formar um segundo imunoconjugado. Ambos os conjugados podem ser depois administrados a um hospedeiro que se pretenda tratar, indo esses conjugados localizar-se devido às especificidades do anticorpo, no locai da população celular seleccionada que se pretende eliminar. Ambos os fármacos serão depois libertados nesse local. Este aspecto pode eventualmente ser bastante importante sempre que houver alguma incerteza tal como a resistência ao fármaco por parte de uma população celular particular, por exemplo, de um tumor, uma vez que este método permite a libertação de diversos fármacos diferentes no local ou no interior das células alvo. Um aspecto adicional abrange a conjugação de mais do que uma antraciclina com um anticorpo particular para proporcionar um imunoconjugado portador de uma variedade de diferentes moléculas de antraciclina distribuídas pela sua superfície - todas elas ligadas ao anticorpo através de uma ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto. A administração do imunoconjugado desta variante tem como consequência a libertação de diversos fármacos diferentes no local ou no interior das células alvo.

Os imunoconjugados de antraciclina da presente invenção podem ser administrados sob a forma de composições /

farmacêuticas uti1i zando-se modo s convencionais de ou de administração incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, a administração intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou a administração directa no local de uma população celular seleccionada tal como, por exemplo, num tumor. É preferível a administração intravenosa. Além disso, para o tratamento in vivo, pode eventualmente ser útil utilizar imunoconjugados que incorporem fragmentos anticorpos tais como os fragmentos Fab ou F(ab')2 anticorpos quiméricos.

As composições farmacêuticas da presente invenção que incorporam os imunoconjugados de antraciclina podem ser apresentadas eventualmente segundo uma ampla variedade de formas de dosagem incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, as formas de dosagem no estado sólido, semi-sólido e líquido tais como os comprimidos, as pílulas, os pós, as soluções ou suspensões no estado líquido, os supositórios, as microcápsulas ou as microvesícuias poliméricas, os lipossomas e as soluções injectáveis ou administráveis por infusão. A forma preferencial depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As composições farmacêuticas podem eventualmente incorporar também veículos convencionais farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na especialidade tais como as proteínas do soro, por exemplo, a albumina do soro humano, substâncias tampão tais como os fosfatos, água ou sais ou electrólitos.

modo mais eficaz de administração e o regime de dosagem para as composições de imunoconjugados da presente invenção dependem da gravidade e da evolução da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tratamento e ainda da opinião do médico assistente. Em consequência, as dosagens dos imunoconjugados e de quaisquer outros compostos administrados concomitantemente devem ser tituladas de acordo com o paciente individual. Todavia, uma dose eficaz de imunoconjugado de antraciclina de acordo com a presente invenção pode conter o componente antraciclina numa 2 quantidade compreendida entre 1 e 100 mg/m e o componente 2 anticorpo numa quantidade entre 500 e 5000 mg/m .

Seguidamente apresenta-se alguns exemplos com o objectivo de proporcionar uma melhor compreensão da invenção descrita na presente memória descritiva. Faz-se observar que estes exemplos têm apenas fins ilustrativos e não pretendem de forma alguma limitar o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1 exemplo seguinte demonstra a produção de um novo imunoconjugado de antraciclina de acordo com a presente invenção em que o fármaco é ligado directamente a um anticorpo monoclonal através de uma ligação hidrazona na posição 13-ceto do fármaco.

O aspecto particular descrito neste exemplo implica a conjugação do composto ADM com um anticorpo monoclonal para proporcionar um imunoconjugado que possuí um elemento de união com uma ligação aci1-hidrazona no seu ponto de acoplamento à molécula do composto ADM do imunoconjugado, <3 possuindo ainda esse elemento de união uma ponte dissulfeto como parte do seu acoplamento ao anticorpo. Esta variante proporciona também um novo derivado de acil-hidrazona e de

ADM (ADM-HZN).

SÍNTESE DE UM DERIVADO DE ADRIAMICINA-HIDRAZONA

Como passo inicial para a preparação do imunoconjugado da presente invenção sintetizou-se primeiro um derivado de ADM-hidrazona conforme a seguir se indica: preparou-se uma solução de 0,3 ml de hidrazina 1 M, isto é, NHgNHg em álcool isopropílico e adicionou-se a uma solução arrefecida de SPDP (70 mg, 0.22 mmol) em 3 ml de THF (tetra-hidrofurano). Depois de se agitar durante 20 minutos à temperatura de 0°C extraiu-se o produto com CHgClg, lavou-se com uma solução salina e secou-se sobre K2CO3. O resíduo obtido após a evaporação dos solventes foi submetido a cromatografia sobre alumina neutra (5% de MeOH, 95% de CH2CI2) para proporcionar 21 mg (41%) de hidrazida de 3—(2— -piridilditio)-propionilo (composto 2 na Figura 1).

Dissolveu-se esta hidrazida e cloridrato de adriamicina (obtido em Sanraku Inc., Japão) (48 mg; 0,083 mmol) em 5 ml de MeOH e depois agitou-se ao abrigo da luz e à temperatura ambiente durante 6 dias. A evolução da reacção foi verificada por cromatografia de camada fina de fase inversa (CCF) (MeOH:H2O = 2:1, contendo 3% p/v de NH4OAC). Decorrido este período evaporou-se o solvente e submeteu-se o resíduo a cromatografia em coluna C^g (MeOH:H2O = 3:2, contendo 3% p/v de NH4OAC). Procedeu-se à combinação das fracções e

liofilizou-se e depois removeu-se o excesso de NH4OAC sob pressão reduzida. Dissoiveu-se o resíduo em MeOH e provocou-se a precipitação por adição de acetonitrilo para proporcionar 45 mg (72%) de cloridrato de adriamicina-13-(3-(2-piridilditio)propionil}-hidrazona, composto adiante designado por ADM-HZN (composto 4 na Figura 1). Este composto ADM-HZN exibe as características seguintes:

p.f. > 125°,	a côr	torna-se mais escura e mal definida;	RMN
(acetona	dè, -)	1,25 (s,3H,J=6Hz),	1,77	(m,1H)	t	2,06
(m,1H), 2,30	(m,1H)	, 2,53 (d,1H,J=15Hz)	, 2 , 89	-3 , 18	(m	, 6H) ,
3,71 (m,1H),	3,85	(m,1H), 3,97 (m,1H),	4,07	(s,3H)		4, 78
(s,2H), 5,21	(m,1H), 5,58 (t,1H,J=7Hz)	, 7,12	(m,1H)	t	7, 64
(d,1H,J=8Hz),	7, 75	(m,2H), 7,90	(t,1H,J	= 8Hz) ,		7, 98
(d,1H,J=8Hz),	8,37 (d,1H,J=4Hz), 10,50 (	s, 1H) ,	10,52	(S	, 1H) ,
14,19 (slr.,1H); IV	(KBr) 3438, 1674, 1618, 1579, 1419	/	1286,
1016, 988, 698 cm’1	; EM-BAR (glicerol)	m/e 755	(M+l)	t	737,
645, 625, 609

TIOLAÇÁO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Antes de se fazer reagir o composto ADM-HZN, preparado conforme anteriormente descrito, com um anticorpo monoclonal com interesse, esse anticorpo teve que ser tiolado, isto é, houve que introduzir grupos sulfidrilo reactivos na molécula do anticorpo.

Os anticorpos monoclonais utilizados foram: 1) 5E9, um anticorpo IgGi reactivo com o receptor da transferrina em todas as células humanas em divisão e interreactivo com vários tipos histológicos de células

monoclonais	5E9	e T33A1
de Culturas	Tipo	(ATCC).
puri ficados	a	partir
murganhos	da	estirpe
procedimento	de	C.
Purification	Of	Mouse

cancerosas; 2) T33A1 (adiante designado por 3A1), um anticorpo IgG^ reactivo com o antígeno das células T humanas de 40Kd e existente também em diversas leucemias das células

T; 3) G28.5, um anticorpo IgGg reactivo com o antígeno das células B humanas de 50Kd e reactivo também com os linfomas das células B humanas; 4) G28.1, um anticorpo IgGi reactivo com o antígeno das células B humanas de 39Kd e reactivo também com os linfomas das células B; e 5) L6, um anticorpo reactivo com um antígeno glicolipídico nos carcinomas das células alveolares do pulmão humano.

Os hibridomas que segregam os anticorpos oram obtidos na Colecção Americana s correspondentes anticorpos foram partir de fluído ascítico produzido em estirpe BALB/c em conformidade com o ? C. Bruck e colaboradores, One-Step

Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic

Fluid By DEAE-Affigel Blue Chromatography, J. Immun. Methods, 5b, pp. 313-19 (1982). Os anticorpos purificados G28.5, G28.1 e L6 foram proporcionados pelos Drs. J. Ledbetter e I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA) . Os hibridomas que segregam os anticorpos monoclonais L6 e G28.5 foram depositados na instituição ATCC em 6 de Dezembro de 1984 e 22 de Maio de 1986 respectivamente, correspondendo-lhes na instituição ATCC os números de acesso HB 8677 e HB 9110. O anticorpo monoclonal G28.1 é um dos diversos anticorpos conhecidos na especialidade pelo facto de ser

reactivo com um epítope principal do antígeno CD37 e foi devidamente caracterizado por A.J. Michael (ed.), Leukocyte Typing III, Oxford University Press (U.K. 1987). Existem diversos destes anticorpos anti-CD37 que se encontram comercialmente disponíveis.

Efectuou-se a tiolação de qualquer destes anticorpos com o composto SPDP conforme se indica a seguir: dissolveu-se uma quantidade de SPDP (Pierce Chemical Co., IL) (50 mM) em etanol e adicionou-se a uma solução do anticorpo monoclonal seleccionado, por exemplo, 5E9 (5-10 mg/ml) em PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2) para proporcionar uma concentração final compreendida entre 5 e 10 mM. Efectuou-se a incubação da mistura de reacção durante 30 minutos à temperatura de 30°C. Separou-se o composto SPDP que não reagiu do anticorpo transformado pelo SPDP por cromatografia de filtração sobre gel utilizando-se uma coluna de tipo PD-10 (Pharmacia). Os grupos de protecção tiopiridilo foram removidos por redução com DTT em excesso. Fez-se passar os anticorpos reduzidos através de uma coluna de tipo PD-10 e utilizou-se os anticorpos que continham tiol livre para condensação com o derivado ADM-HZN ( ver a Figura 2).

Os grupos tiol reactivos também foram introduzidos na proteína do anticorpo utilizando o composto 2-IT: misturou-se o anticorpo (5-10 mg/ml em 50 mM de trietilamina, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA a pH 8,0) com o composto 2-IT (Pierce Chemical Co., IL) até à concentração final de 5-10 mM. Deixou-se a reacção prosseguir durante 90 minutos à

temperatura de 4 C e depois procedeu-se à separação dos anticorpos tiolados utilizando-se uma coluna de tipo PD-10 equilibrada com NaCl 2M/PBS.

Determinou-se o número de grupos tiol reactivos incorporados nos anticorpos utilizando-se o composto DTNB (ácido 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzóico) (E412 ⁼ 14150) em conformidade com o procedimento descrito por G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, pp. 70-77 (1959).

CONJUGAÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS TIOLADOS

COM O COMPOSTO ADM-HZN

Posteriormente efectuou-se diversas conjugações em que os anticorpos monoclonais tiolados conforme anteriormente descrito foram individualmente acoplados ao composto ADM-HZN (ver a Figura 2).

Dissolveu-se o composto ADM-HZN em metanol e adicionou-se esta solução aos anticorpos tiolados com SPDP em PBS ou aos anticorpos tiolados com o composto 2-IT em NaCl 2M/PBS. De acordo com uma experiência típica, adicionou-se 10 equivalentes do composto ADM-HZN aos anticorpos monoclonais contendo entre 10 e 20 grupos tiol reactivos. Deixou-se incubar a reacção de conjugação durante a noite à temperatura de 4°C. Centrifugou-se a mistura de reacção a 10000 x g e depois o composto ADM conjugado foi separado do composto ADM que não reagiu, através de uma passagem por uma coluna de tipo PD-10. Determinou-se a quantidade de antraciclina conjugada ligada ao anticorpo por análise de absorvência a 495 nm (Ε4θ5=8030). Determinou-se a quantidade

de proteína do anticorpo por absorvância a 280 nm (1 mg/ml = =1,4 unidades de D.O.). Para se corrigir a sobreposição da absorvância do composto ADM a 280 nm, recorreu-se à expressão seguinte:

^A280 ^- (°-^{72 x a}495) Anticorpo (mg/ml) = -------------------1,4

Submeteu-se os imunoconjugados a análises para a determinação da presença de composto ADM não conjugado ou de derivados do composto ADM por análise por CLEP. A CLEP foi efectuada utilizando uma coluna Phenomenex carregada com esferas IB-SIL C18 de 5 micra. Aplicou-se os compostos ADM-HCl não conjugado, ADM-HZN (0.1 μπιοΙθΞ) ou os imunoconjugados contendo entre 0,5 e 5 μπιοίεε de equivalente do fármaco a uma coluna e efectuou-se a eluição com o metanol e com fosfato de amónio 10 mM, a pH 4,5 (70:30) com um débito de 1,5 mi/minuto. Todos os imunoconjugados produzidos continham quantidades não significativas (< 1%) de fármaco não conjugado conforme verificado por análise por CLEP.

CARACTERIZAÇÃO DOS IMUNOCONJUGADOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Os imunoconjugados assim produzidos ficaram constituídos por moléculas do composto ADM conjugadas na posição 13-ceto com um elemento de união que formou uma ponte entre o fármaco e o respectivo anticorpo monoclonal. Por outro lado, a adição do anticorpo monoclonal com grupos tiol livres ao derivado ADM-HZN o qual continha uma ponte dissulfeto protegida por grupos tiopiridilo conduziu à

formação de uma ponte dissulfeto no elemento de união que faz a ligação do composto ADM aos anticorpos (ver a Figura 2). Os imunoconjugados produzidos de acordo com esta variante englobam, sem que isso constitua qualquer limitação, os imunoconjugados 5E9-ADM-7.5, 3A1-ADM-7.0, L6-ADM-9.0 e G28.1-ADM-9.0, em que a primeira parte da designação representa o anticorpo monoclonal utilizado para formar o conjugado, a segunda parte da designação representa a antraciclina ligada ao anticorpo e a parte numérica da designação representa a proporção molar ADM/anticorpo no imunoconjugado particular.

As proporções molares ADM/anticorpo conseguidas de acordo com esta variante dependem do número de grupos tiol introduzidos no anticorpo monoclonal e da quantidade de derivado ADM-HZN introduzido no anticorpo tiolado. Os diagramas de dispersão das Figuras 3 e 4 mostram que se atingiu proporções molares ADM/anticorpo compreendidas entre 3 e 4 quando se efectuou a condensação do composto ADM-HZN com qualquer dos anticorpos monoclonais 5E9 ou 3A1 contendo aproximadamente oito grupos tiol. Tipicamente, adicionou-se nestas reacções o composto ADM-HZN numa quantidade 10 vezes em excesso molar em relação à proteína. As proporções ADM/anticorpo aumentaram para valores entre 8 e 10 nos casos em que se utilizou anticorpos possuindo entre 18 e 25 grupos tiol. Não foram observadas diferenças significativas nas proporções ADM/anticorpo quando se utilizou os compostos SPDP ou 2-IT para tiolar o anticorpo monoclonal (comparar as Figuras 3 e 4). Todavia, os rendimentos protéicos finais após

a conjugação do fármaco com o anticorpo foram aparentemente de algum modo superiores com anticorpos tiolados com o composto SPDP comparativamente com os anticorpos tiolados com o composto 2-IT (ver a Figura 5). Obteve-se frequentemente rendimentos protéicos compreendidos entre 50 e 80% no caso dos anticorpos tiolados com o composto SPDP, por exemplo, com os anticorpos 5E9 e 3A1, ao passo que foram obtidos rendimentos compreendidos entre 20 e 50% no caso dos mesmos anticorpos tiolados com o composto 2-IT. Além disso, foram obtidos rendimentos ligeiramente melhores na preparação dos imunoconjugados utilizando anticorpos monoclonais do isotipo IgGl tais como os anticorpos 5E9 e 3A1 para conjugações efectuadas com os compostos SPDP ou 2-IT (ver as Figuras 6 e

7)

Determinou-se a actividade de ligação dos imunoconjugados da presente invenção recorrendo a um ensaio de competição que implicou a utilização do anticorpo marcado

5 6 com I. Preparou-se suspensões com células (1 x 10 ) respectivamente positivas em antígenos e negativas em antígenos em 0,1 ml de meio RPMI 1640 contendo 2% de SBF e misturou-se com 0,1 ml de soluções de imunoconjugados ou de anticorpos monoclonais não conjugados diluídas sequencialmente em série de razão 2 para concentrações cujo valor inicial era de 50 μ9/ιυ1. Efectuou-se a incubação dessas suspensões celulares, em duplicado, sob agitação à temperatura de 4°C durante 1 hora. Depois, efectuou-se a lavagem das células duas vezes e com elas preparou-se uma /

Ζsuspensão em 0,1 ml de meio contendo o anticorpo homólogo marcado com

125.

na proporção de 5 pg/ml (actividade especifica compreendida entre 1-50 x 10 cpm/pg de proteina do anticorpo). Efectuou-se a incubação das amostras à temperatura de 4°C durante 1 hora e depois foram colocadas sobre 0,15 ml de uma mistura 1:1 constituída por ftalato de dibutilo:fatlato de dinonilo arrefecida para a temperatura de 4°C. Efectuou-se a centrifugação das amostras a 10000 x g durante 1 minuto à temperatura de 4°C e determinou-se a contagem de impulsos provenientes das células (agregado) utilizando um computador de raios gama de tipo LKB.

A retenção da actividade de imunoconjugados da presente invenção encontra-se demonstrada no Quadro 1 seguinte.

ligação dos

Quadro 1

Estimativa da Afinidade de Ligação Relativa Após a Conjugação de ADM-HZN

			[ it 1a	[Tt]b	=K conj
Inibidor	Proporção Molar	Sinal	x10~9M	x10~9M	xlO7 L/M

—	—	5E9- I -	-	3, 2
		„,Λ 125
—	—	3A1- I -	—	5,1

Ligador SPDP

5E9-ADM	3 , 5	5E9-	125	4,2	3, 4	2,6
	4,0			6,7	2,1	1,0
	4 , 9			4,2	4,0	3,0
	6, 8			4,2	2,1	1,6
	8,5			ο,ι	2,1	0,7
3A1-ADM	2,6	3A1-	125	4,2	1, 3	1,5
	3,3			1, 3	1,3	5, 1
	4,2			8,3	1,3	0, 8
	6,7			7, 3	1,3	0,9
	Ligador 2-IT
5E9-ADM	5,6	5E9-	125	4,1	4,0	3,1
	6,7			4,7	4,0	2,7
3A1-ADM	6,0	3A1-	125	4,0	1,3	1,6

^a[It] = Concentração molar do conjugado de anticorpo que proporciona 50% de inibição do anticorpo ^b [ T-j- ] = Concentração molar do anticorpo que proporciona 50% de inibição do anticorpo localizador.

K_conj ⁼ Foram calculadas as afinidades relativas (K) utilizando a fórmula:

K conj = [T_t]K_Ab localizador.

[it]

K_Ab θ ^a constante de equilíbrio do MAb (ou AcM) não conjugado determinada por análise de Scatchard.

Conforme se mostra no quadro, os imunoconjugados de 5E9 preparados utilizando o composto SPDP e possuindo proporções molares compreendidas entre 3,5 e 8,5 retiveram mais de 80% da sua actividade de ligação original comparativamente com o anticorpo 5E9 não conjugado. Os imunoconjugados de 5E9 preparados utilizando o composto 2-IT retiveram também elevadas actividades de ligação. Os imunoconjugados de 3A1 preparados utilizando o composto SPDP demonstraram alguma perda de actividade de ligação do anticorpo. De um modo geral, a conjugação do composto ADM com estes e outros anticorpos originou a perda de actividade de ligação do anticorpo segundo graus relativamente pequenos.

A Figura 8 mostra as curvas de ligação de dois imunoconjugados da presente invenção, 5E9-ADM-7.5 e 3A1-ADM-7.0, comparativamente com as curvas de ligação dos anticorpos monoclonais 5E9 e 3A1 não conjugados. Para se obter estas curvas os imunoconjugados foram incubados à temperatura de 4°C em 0,1 ml de meio de crescimento completo contendo 1 χ 10θ células alvo HSB-2 positivas em antígenos. Decorrida 1 hora efectuou-se a lavagem das células no referido meio e procedeu-se à incubação durante mais 30 minutos em 0,1 ml de meio contendo uma diluição 1:40 de anti-IgG do murganho conjugado num caprino marcado com FITC (Boehringer-Mannheim). As células foram depois analisadas num analisador celular por fluorescência de tipo Coulter Epics V. Comparou-se a fluorescência da superfície celular com a

conjugados diluídos de modo semelhante. Tal como a Figura indica, a actividade de ligação de cada um dos imunoconjugados foi conservada conforme se demonstra pelo facto de a concentração de imunoconjugado que foi necessária para saturar as células positivas em antígenos ser no máximo maior do que o dobro da diluição correspondente à concentração necessária para o anticorpo não conjugado. Verificou-se que as diferenças nos níveis dos patamares de intensidade de fluorescência entre os anticorpos não conjugados e os imunoconjugados era devida à ligação reduzida do reagente secundário anti-IgG de murganho conjugado em caprino e marcado com FITC ao imunoconjugado comparativamente com o anticorpo não conjugado.

Estudou-se a estabilidade de um imunoconjugado de acordo com esta variante - um conjugado L6-ADM - para diversos valores de pH compreendidos no intervalo entre 4,0 e 7,0 por análise por CLEP. Efectuou-se a incubação do conjugado L6-ADM-9.0 em soluções de tampões fosfato para cada um dos valores de pH indicados durante 24 horas à temperatura de 37°C. Depois aplicou-se cada uma dessas soluções a uma coluna CLEP e determinou-se a quantidade de fármaco não conjugado. Conforme se mostra na Figura 9, o único produto detectado decorridas 24 horas de incubação para diferentes valores de pH exibiu um tempo de retenção na coluna semelhante ao do composto padrão ADM-HC1. A quantidade de material libertado do imunoconjugado decorridas 24 horas aumentou quando o valor do pH diminuiu de 7 para 4. 0 controlo não tratado representa a cromatografia do conjugado armazenado à temperatura de -20°C em tampão fosfato para o valor de pH 7,4. Admite-se deste modo que o imunoconjugado possua um grupo de acoplamento sensível aos ácidos o qual origina a libertação do composto ADM a partir da proteína do anticorpo. Estes resultados são consistentes com a existência de uma ligação hidrazona que une o composto ADM ao elemento de união tal como descrito na Figura 2.

De acordo com a variante deste exemplo, efectuou-se o acoplamento do composto ADM ao anticorpo através de um elemento de união que continha também uma ponte dissulfeto (ver a Figura 2). Em consequência deve ser possível libertar o radical ADM por redução de um imunoconjugado desta variante utilizando o composto DTT. Sendo assim, tratou-se o conjugado L6-ADM, especificamente L6-ADM-9.0, com o composto DTT 10 vezes em excesso, efectuou-se a incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos e aplicou-se a uma coluna de CLEP. As experiências com os compostos padrão ADM«HC1 e ADM-HZN foram efectuadas simultaneamente encontrando-se indicados na Figura 10 os picos obtidos por cromatografia. 0 conjugado L6-ADM-9.0 não apresentou qualquer pico detectável de fármaco não conjugado antes da adição de DTT. A análise por CLEP demonstrou o aparecimento de um pico único que exibiu um tempo de retenção em coluna semelhante ao do composto ADM-HC1 ao contrário do derivado ADM-HZN (ver a Figura 10). A quantidade de composto ADM libertado após o tratamento com DTT foi de aproximadamente de 99% da quantidade equivalente inicial de ADM ligado ao anticorpo. O resultados experimentais indicados nas Figuras 9 e 10 demonstram que o radical de tipo ADM é libertado a partir dos imunoconjugados da presente invenção sob condições fisiológicas, isto é, condições acidicas e redutoras, típicas do ambiente celular.

ACTIVIDADE CITOTOXICA DOS IMUNOCONJUGADOS DA

PRESENTE INVENÇÃO

Os imunoconjugados da presente invenção foram testados in vitro para determinação da citotoxicidade utilizando-se diversos sistemas de ensaio. De acordo com um ensaio de formação de colónias em gelose macia deixou-se crescer células de Daudi (linfoma de Burkítt) (fenotipo: 5E9 + , 3A1-), obtidas na instituição ATCC, em meio completo [meio RPMI 1640 contendo 10% de soro de bovino fetal]. Procedeu-se à exposição de 1 χ 10⁵ células em 1 ml de meio durante 1,5 horas a soluções diluídas sequencialmente de imunoconjugados 5E9-ADM ou 3A1-ADM ou de composto ADM não conjugado. Para cada diluição efectuou-se as determinações em triplicado. Os controlos consistiram em células tratadas de modo idêntico mas não expostas aos fármacos. As células foram depois lavadas e com elas preparou-se uma suspensão em meio RPMI 1640 contendo 15% de SBF e 0,3% de gelose (Marine Colloid). Depois colocou-se 1 ml da suspensão celular (1 x

10' células) sobre uma camada de gelose a 0,4% em placas de microtitulação de 6 cavidades (Costar). Efectuou-se

C e procedeu-se à marcação das colónias resultantes com 0,5 ml de p-iodo-nitrotetrazólio violeta na concentração de 1 mg/ml (Sigma) durante 48 horas. Efectuou-se a contagem das colónias utilizando um analisador de imagem Optimax 40-10 e determinou-se a inibição de formação de colónias comparando com o controlo não tratado os valores observáveis com células tratadas com fármaco ou tratadas com imunoconjugado.

A Figura 11 compara a actividade citotóxica do conjugado 5E9-ADM, especificamente 5E9-ADM-7.5 e do conjugado 3A1-ADM, especificamente 3A1-ADM-7.0, após 1,5 horas de exposição sobre uma linha de células de Daudi (linfoma de Burkitt) positivas em antígeno 5E9 e negativas em antígeno 3A1. Estes dois imunoconjugados foram preparados por tiolação com o composto 2-IT. A comparação das curvas de tipo dose/resposta mostra que o conjugado 5E9-ADM-7.5 que reteve 93% da actividade de ligação original relativamente às células alvo portadoras de antígeno (ver a Figura 8) foi significativamente mais doloroso do que o conjugado de controlo não ligante 3A1-ADM-7.0.

Utilizou-se um ensaio de diluição limitativo, o qual proporciona uma medida do logaritmo de células aniquiladas, para se testar a actividade farmacológica citotóxica dos dois imunoconjugados anteriormente referidos, utilizando-se um formato de exposição mais longo (24 horas). Este ensaio foi efectuado utilizando células de Namalwa (fenotipo: 5E9+, 3A1-) essencialmente conforme descrito por

M. Colombatti e colaboradores, Selective Killing Of Target Cells By Antibody-Ricin A Chain Or Antibody-Gelonin Hybrid Molecules: Comparison Of Cytotoxic Potency And Use In Immunoselection Procedures, J. Immunol., 131, pp. 3091-95 (1983). Essas células obtidas na instituição ATCC foram incubadas pelos imunoconjugados durante 22 horas e depois foram lavadas e a seguir determinou-se o logaritmo do número de células aniquiladas. Calculou-se o logaritmo do número de células aniquiladas tomando como base os valores de eficiência em placa estimados relativamente à porção de cavidades sem crescimento para as concentrações celulares limitadoras.

Conforme se mostra na Figura 12, o conjugado 5E9-ADM-7.5 originou uma aniquilação celular a que corresponde um logaritmo 1-2 vezes superior, para as concentrações testadas, comparativamente com o conjugado 3A1-ADM-7.0 não ligante. Mediu-se uma aniquilação celular até valores correspondentes a um logaritmo 5 vezes superior, para a dose mais elevada de conjugado 5E9-ADM-7.5. Além disso, apesar de ter sido detectada actividade citotóxica para o imunoconjugado de 3A1 não ligante, o nível de citotoxicidade foi menor do que para uma quantidade equivalente de composto ADM não conjugado. Contudo, a actividade do imunoconjugado de 5E9, para várias concentrações, foi superior à de uma dose equivalente de composto ADM livre.

Conforme especificado antes, os imunoconjugados 5E9-ADM-7.5 e 3A1-ADM-7.0 foram sintetizados utilizando o tiolação.

provas da preparados instituição ATCC composto 2-IT como agente de tiolação. Observou-se também citotoxicidade imunoespecífica com imunoconjugados que foram preparados utilizando o composto SPDP como agente de A Figura 13 mostra a actividade citotóxica selectiva dos imunocojugados 5E9-ADM e 3A1-ADM preparados utilizando o composto SPDP como agente de tiolação, em células de Daudi, recorrendo-se para o efeito ao ensaio anteriormente descrito de formação de colónias em gelose macia. Na Figura 14 apresenta-se outras citotoxicidade selectiva dos imunoconjugados utilizando o composto SPDP, em que o imunoconjugado G28.1-ADM-9.0 foi testado sobre duas linhas celulares positivas em antígenos G28.1, designadamente as linhas celulares de

Daudi e Namalwa e sobre uma linha celular de leucémia das células T humanas negativas em antígenos G28.1, designada por HSB-2, recorrendo-se para o efeito a um ensaio de formação de colónias em gelose macia. As células HSB-2 foram obtidas na conforme se mostra na Figura, o imunoconjugado foi citotóxico em relação às duas linhas celulares positivas em antígeno mas não foi citotóxica em relação à linha celular negativa em antígeno.

Observou-se uma aniquilação preferencial em células positivas em antígenos por acção do imunoconjugado 5E9-ADM-7.5, num ensaio de formação de colónias utilizando a linha celular do carcinoma do cólon humano dependente de fixação designada por HCT116, obtida como oferta do Dr. M. Brattain [Bristol-Baylor Labs, Houston, Tx].

As culturas em monocamada das células do carcinoma foram removidas dos balões de cultura com tripsina-EDTA (GIBCO) e procedeu-se à sua lavagem e posterior passagem através de uma agulha de calibre 22 para proporcionar uma única suspensão celular. Diluiu-se em série os conjugados

5E9-ADM-7.5 ou 3A1-ADM-7.0 ou o composto ADM não conjugado em 5

0,2 ml de meio contendo 1 x 10 células de carcinoma. Cada diluição foi efectuada em triplicado. Os controlos foram estabelecidos com base em células não tratadas ou tratadas com anticorpos. As células foram incubadas durante 3 horas e lavadas uma vez com o referido meio e depois colocou-se em ~ 3 placas de microtitulaçao de 12 cavidades (Costar) 1 x 10 células em 1 ml de meio. As placas foram incubadas durante 7-10 dias à temperatura de 37°C e foram fixadas com metanol absoluto durante 10 minutos. Procedeu-se à coloração das colónias com violeta de cristal e efectuou-se a contagem utilizando um analisador de imagem Optimax 40-10. Conforme se mostra na Figura 15 observou-se maior citotoxicidade quando as células do carcinoma foram expostas ao conjugado 5E9-ADM-7.5 comparativamente com os valores observáveis quando foram expostas ao conjugado 3A1-ADM-7.0.

Uma vez que existem muitos relatórios que demonstraram que o composto ADM ligado ao anticorpo no radical amino-açúcar do fármaco originava imunoconjugados que exibiam uma perda significativa de actividade farmacológica testou-se a citotoxicidade dos imunoconjugados preparados por acoplamento do composto ADM ao anticorpo no radical amino57

-açúcar do fármaco através de um ligador dipeptídico leu-ala, utilizando o já conhecido sistema de ensaio de formação de colónias em gelose macia. Conforme se mostra na Figura 16, nenhum dos conjugados ligados a peptídos 5E9-ADM-4.0 ou 3A1-ADM-3.9 demonstrou ser citotóxico nas células de Daudi. 0 derivado ADM-leu-ala utilizado para a preparação dos conjugados foi menos poderoso segundo um valor cujo logaritmo é 2 vezes inferior comparativamente com as quantidades equivalentes do composto ADM não conjugado.

EXEMPLO 2

Este exemplo descreve a preparação de um imunoconjugado de antraciclina de acordo com a presente invenção em que o composto ADM é conjugado com um anticorpo monoclonal através de um elemento de união que possui uma ligação acil-hidrazona no seu local de acoplamento à molécula do composto ADM e que adicionalmente possui uma ponte tioéter como parte do seu acoplamento ao anticorpo. Esta variante proporciona também um novo derivado acil-hidrazida de ADM.

PREPARAÇÃO DE IMUNQCONJUGADOS QUE POSSUEM UMA PONTE TIOÉTER CONTIDA NO ELEMENTO DE UNIÃO

Fez-se reagir o anticorpo monoclonal 5E9 (2,5 mg em 2,5 ml de solução salina tamponada com fosfato) com SMPB (butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenilo) (59,5 pg em 100 μΐ de tetra-hidrofurano) à temperatura de 30°C durante 30 minutos ajustou-se o valor do pH para 6,0 utilizando tampão de citrato de sódio. Fez-se passar a mistura através de uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) para separar dos

materiais que não reagiram o anticorpo contendo o composto maleimida. Depois dissolveu-se o derivado ADM-HZN (1 mg), preparado conforme descrito no Exemplo 1, em 1 ml de uma mistura de MeOH/H2O (9:1) e fez-se reagir 0,5 μπιοΙθΞ de ADM-HZN com 0,5 çmoles de tri-n-butil-fosfina numa mistura 4:1 constituída por acetona:água para proporcionar um novo composto ADM-HZN reduzido (ver a Figura 17). Decorridos 10 minutos adicionou-se uma solução 0,1 M de enxofre em toiueno para destruir a fosfina remanescente. A seguir misturou-se o composto ADM-HZN reduzido com um anticorpo 5E9 que continha o composto maleimida. Os imunoconjugados assim produzidos foram purificados por passagem através de uma coluna de filtração em gel PD-10. Em alguns casos, quando a redução do solvente toiueno não foi completa, separou-se uma camada de solvente orgânico, arrastando alguma proteína da mistura de reacção. Utilizou-se uma corrente de ar suave para remoção do solvente e removeu-se a proteína desnaturada centrifugando a mistura durante 2 minutos a 16000 x g. Depois filtrou-se sobre gel o sobrenadante límpido que continha os imunoconjugados e procedeu-se à sua análise em meio PBS para o valor de pH 7,4. Determinou-se a proporção molar ADM/anticorpo por espectrofotometria utilizando os valores DO28O ^{e DO}495 conforme descrito no Exemplo 1. Uma reacção típica proporcionou imunoconjugados para valores das proporções molares compreendidos entre 3 e 4.

ACTIVIDADE CITOTOXICA DOS IMUNOCONJUGADOS QUE POSSUEM

UMA PONTE TIOÉTER

Submeteu-se diversos imunoconjugados preparados de acordo com a variante deste exemplo a testes para determinação da sua citotoxicidade relativamente a linhas celulares tumorais positivas em antígenos e negativas em antígenos, para efeitos comparativos, recorrendo-se para o 3 efeito a um ensaio de incorporação de H-timidina o qual permite medir a inibição de síntese de ADN de acordo com este ensaio foram efectuadas diluições dos imunoconjugados ou do composto ADM não conjugado em meio completo e introduziu-se

100 μΐ de cada diluição em cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades. Cada diluição foi efectuada em triplicado. Com as células tumorais preparou-se uma suspensão no referido meio e depois introduziu-se em cada cavidade 100 μΐ contendo 1 χ 10⁵ células. Procedeu-se à incubação dessas células durante 24 horas à temperatura de

37°C em atmosfera húmida contendo 5% de CO2. Adicionou-se a 3 cada cavidade 50 μΐ contendo (6- H]-timidina (1 μθί) (New England Nuclear, 15Ci/mmole) e procedeu-se à incubação durante 4 horas à temperatura de 37°C. Efectuou-se a transferência das células para placas de microtitulação (Millipore) e propiciou-se a precipitação com ácido tricloro-acético a 25%, frio (ATC). Os precipitados foram lavados 10 vezes com ATC a 5%, frio. Procedeu-se à secagem dos filtros e ao seu vazamento e efectuou-se a secagem por cintilação em líquido Econofluor (New England Nuclear). Todas as ι

-fcontagens foram corrigidas por subtracção das unidades de contagem correspondentes ao ruído ambiente.

Um imunoconjugado de acordo com esta variante, designado por 5E9-ADM-3.9, foi altamente citotóxico para as células de Namalwa e HSB-2 positivas em antígeno 5E9 (ver a Figura 18). 0 imunoconjugado foi mais potente do que as concentrações equivalentes do composto ADM não conjugado.

Noutra experiência descobriu-se que o imunoconjugado 3A1-ADM-6.0, para concentrações do composto ADM inferiores a 0,1 μg/ml era citotóxico relativamente às células HSB-2 positivas em antígenos 3A1 mas não era citotóxico em relação às células de Namalwa negativas em antígenos 3A1 (ver a Figura 20). Para concentrações mais elevadas a citotoxicidade do imunoconjugado foi praticamente a mesma para as duas linhas celulares.

EXEMPLO 3

ACTIVIDADE ANTI-TUMOR IN VIVO DOS IMUNOCONJUGADOS DA PRESENTE INVENÇÃO

Seguidamente foram efectuados testes sobre a actividade anti-tumor in vivo dos imunoconjugados da presente invenção.

Mais particularmente testou-se a capacidade dos imunoconjugados para inibir o crescimento de tumores do linfoma B humano em murganhos.

Induziu-se tumores sólidos primários de Daudi e de Ramos (linfoma de Burkitt) em murganhos rapados da estirpe BALB/c por inoculação subcutânea (s.c.) de células linfóides

mantidas em cultura tecidual. A linha celular de Ramos foi obtida na instituição ATCC. Os tumores de Daudi e de Ramos foram depois sequencialmente incutidos in vivo em fêmeas de murganho da estirpe BALB/c (nu/nu) com 4 a 6 semanas de idade com uma massa compreendida entre 20 e 25 gramas (Harlan 7

Sprague-Dawley), utilizando-se 1 x 10 células tumorais/0,1 ml em meio PBS para implantação por via subcutânea no flanco dos murganhos. Ambas as linhas tumorais exibiram uma taxa de 3 crescimento linear entre 200 e 4000 mm . O tempo médio para que um tumor duplicasse o seu volume durante o período de crescimento exponencial foi de 6,9+0,8 dias para os tumores de Daudi e foi de 4,4 + 0,6 dias para os tumores de Ramos. Os volumes tumorais (V) foram calculados pela forma seguinte:

c x 1'

V=em que c = comprimento (mm) e 1 = largura (mm).

Quando os volumes tumorais atingiram 400-600 mm , 3 no caso dos tumores de Daudi, e 250-400 mm , no caso dos tumores de Ramos, os murganhos foram distribuídos aleatoriamente por grupos de 5-10 animais para tratamento com o composto ADM-HC1 (isto é, fármaco livre), com os imunoconjugados de ADM da presente invenção, com o anticorpo monoclonal não conjugado ou com uma mistura do anticorpo monoclonal e de composto ADM. Demonstrou-se a especificidade de aniquilação celular comparando a actividade anti-tumor obtida com os imunoconjugados testados (isto é, cujo componente anticorpo é reactivo com as células tumorais que

se pretende aniquilar) relativamente à actividade que se obtém utilizando os conjugados não ligantes (isto é, os conjugados que não são reactivos com essa população tumoral). A mistura de anticorpo mais fármaco livre constituiu um controlo demonstrativo da necessidade de um acoplamento covalente do fármaco ao anticorpo.

Os resultados foram expressos em termos de inibição do crescimento tumoral (T-C) ou retardamento da duplicação tumoral (RDT) o qual foi estimado a partir do retardamento no tempo de duplicação do volume tumoral (TDVT) quando se procedeu à comparação de curvas de crescimento dos grupos tratados com as curvas dos grupos de controlo não inoculados. Calculou-se o valor RTD utilizando a forma seguinte:

T-C

RTD=----------TDVT x 3, 3 em que T = tempo (número de dias) para que os tumores num 3 grupo tratado atinjam 3000 mm , C = tempo (dias) para que os tumores num grupo de controlo atinjam 3000 mm e TDVT (tempo de duplicação do volume tumoral) = tempo (dias) para que o volume dos tumores nos murganhos de controlo (não tratados) 3 aumente de 1500 para 3000 mm . Cada ponto representa o volume médio de um tumor no grupo experimental.

Nestes estudos efectuou-se a comparação da actividade anti-tumor dos imunoconjugados do composto ADM em tumores de Daudi ou de Ramos relativamente a: a) actividade /

obtida quando se utiliza o fármaco livre segundo uma dose, via de administração e esquema temporal equivalentes e b) a actividade obtida quando se utiliza o fármaco livre administrado segundo a sua dose, via e esquema temporal optimos.

Em todos os estudos agora descritos, efectuou-se o tratamento com o composto ADM«HC1 adicionando 50-100 X DMSO ao fármaco em pó, diluindo o fármaco dissolvido em PBS até se obter uma dosagem particular (mg/kg/inj) no dia da injecção e inoculando-o no interior do murganho portador do tumor quer por via intravenosa (i.v., veia da cauda) quer por via intraperitoneal (i.p.). Os imunoconjugados utilizados nestes estudos foram preparados conforme descrito no Exemplo 1 e todos eles retiveram mais do que 90% da actividade original de ligação do anticorpo. Especificamente, utilizou-se os anticorpos monoclonais 5E9 e G28.1 como componente anticorpo dos imunoconjugados nestes estudos. Os imunoconjugados de ADM foram armazenados à temperatura de 4°C em PBS e utilizados antes de decorridas duas semanas após a sua preparação. Todos os imunoconjugados testados e bem assim os controlos de anticorpos não conjugados foram administrados por via intraperitoneal (i.p.).

Por outro lado, tal como utilizado na presente memória descritiva, a notação correspondente ao esquema de tratamento Q7Dx3 identifica um esquema de tratamento em que cada murganho do grupo desse fármaco recebeu 3 injecções cada uma delas espaçada de 7 dias, isto é, uma injecção semanalmente durante 3 semanas. De modo idêntico, a notação

Q5Dx2 identifica um esquema de tratamento em que os murganhos desse grupo receberam um total de 2 injecções de fármaco ou de conjugado com um intervalo de 5 dias. A notação QlDxl identifica uma injecção única. Assim, as notações dos esquemas de tratamento são definidas de tal modo que o primeiro número da notação indica o intervalo temporal (em dias) das injecções e o último número representa a quantidade total de injecções de cada esquema de tratamento.

Consequentemente avaliou-se primeiro a actividade anti-tumor dos imunoconjugados de ADM da presente invenção comparativamente com a actividade do fármaco livre ADM-HC1 segundo uma dose, via de administração e esquema de tratamento idênticos ou equivalentes. Comparou-se a actividade anti-tumor, sobre os tumores de Daudi, de um imunoconjugado 5E9-ADM especificamente designado por 5E9-ADM-1.8 (razão molar = RM = 1,8 moléculas de ADM/MAB) com a actividade de a) composto ADM«HC1 não conjugado segundo uma dose de fármaco idêntica (4,1 mg/kg/inj), b) anticorpo monoclonal 5E9 segundo uma dose de anticorpo idêntica (630 ^m9/kg/inj), c) uma mistura de anticorpo 5E9 mais o composto ADM-HC1 (4,1 mg ADM + 630 mg 5E9) e d) um imunoconjugado não ligante designado por L6-ADM-8.6 (4,1 mg/kg/inj ADM) como elemento de controlo.

Os murganhos (5 murganhos/grupo) foram doseados por via intraperitoneal (i.p.) aos 20° e 25° dias após a implantação do tumor (isto é, segundo um esquema de tipo

Q5Dx2) quando as dimensões iniciais do tumor atingiram 3 valores entre 800 e 1100 mm . A dose utilizada nesta experiência representou a dose máxima tolerada (DMT), i.p. para o fármaco livre, isto é, a dose do fármaco administrada por uma via qualquer determinada ou segundo um esquema determinado que origina um valor DL]_q (dose letal para 10% dos animais) (ver o Quadro 1 seguinte).

Tal como a Figura 21 indica, obteve-se uma actividade anti-tumor significativa com o conjugado 5E9-ADM. Por outro lado, esta actividade anti-tumor foi maior do que aquela que é observável para uma dose equivalente de fármaco livre. Tal como o Quadro 4 seguinte indica, 3 dos 5 murganhos tratados com o conjugado exibiram uma completa regressão dos tumores (curas) o que corresponde a um valor RTD>1,5. Pelo contrário, o composto ADM«HC1 e o anticorpo 5E9 não conjugado e ainda o conjugado não ligante L6-ADM não exibiram qualquer actividade anti-tumor. Observou-se alguma inibição do crescimento tumoral utilizando o composto ADM-HCi misturado com o anticorpo 5E9, mas este efeito foi transitório e representou apenas um valor RTD = 0,2 estatisticamente insignificante.

Nesta experiência doseou-se o fármaco livre a 4,1 ^rag/kg/inj devido à toxicidade associada ao fármaco livre quando administrado intraperitonealmente (i.p.) segundo doses superiores a 4-5 mg/kg. Para estes fracos valores das doses tanto o composto ADM livre como as misturas do composto ADM mais o anticorpo monoclonal foram inactivos. Todavia, ί-Υ.

conforme a Figura 21 evidencia, mesmo para esta fraca dose, o imunoconjugado de ADM ainda se mostrou activo na inibição do crescimento tumoral.

Seguidamente procurou-se determinar a actividade anti-tumor dos imunoconjugados de ADM sobre os tumores de Daudi comparativamente com a actividade anti-tumor obtida quando se utiliza o fármaco não conjugado administrado na sua dose, via de administração e esquema óptimos. Por essa razão houve que determinar inicialmente a dose, a via de administração e o esquema de administração do composto ADM-HC1 livre que proporcionava uma actividade máxima anti-tumor sobre as células de Daudi. Para este estudo de optimização os murganhos foram tratados com o composto ADM-HCl utilizando-se diferentes dosagens, esquemas e vias de administração. 0 intervalo entre inoculações dependeu do esquema de tratamento utilizado. Depois determinou-se os valores RTD conforme se descreve a seguir.

Os resultados deste estudo de optimização encontram-se resumidos no Quadro 2 seguinte. Conforme se observa no Quadro 2, o esquema Q7Dx3 aplicado intravenosamente (i.v.) proporcionou uma resposta anti-tumor óptima, tanto em termos de retardamento do crescimento tumoral como em termos de taxas de regressão tumoral para doses correspondentes a 11 mg/kg/inj, que foi também o valor da DMT para o fármaco quando se utilizou o esquema Q7Dx3 com administração intravenosa (i.v.).

Quadro 2

Anti-tumor do Composto ADM-HCl

Xenoenxertos de Tumores de Daudi

Sobre os

Actividade

Dose (mg/kg)— Inibição Tumoral— Toxicidade⁰

Esquema	mj	cum	T-C	RC	Curas	RTD	M/T	(%)
A)			via	i . v.
QlDxl	20	20	-	-	-	-	7/7	(100)
	18	18	-	-	-	-	6/8	( 75)
	15	15	-	-	-	-	7/7	(100)
	12	12	—	-	-	-	7/7	(100)
Q7Dx3	12	36	>62	1	3	>2,0	4/8	( 50)
	11	33	28	0	3	1,1	2/8	( 25)
	11	33	>42	0	4	>1,3	2/10	( 20)
	11	33	21	1	0	0, 7	0/8
	10	30	18	0	1	0, 7	0/8
	10	30	13	0	1	0,8	0/8
	10	30	27	0	3	0, 8	0/7
	9	27	23	0	1	0,9	0/10
	5	15	6,2	2	0	0, 18	1/9	( ii)
B)			Via	i .p.
Q5Dx2	4,5	9		0	0	0	0/5
	4,1	8,2	0	0	0	0	1/5
	4,5	9	2,2	0	0	0, 1	0/8
	5 , 5	11	2,2	0	0	0, 1	0/8
Q8Dx2	13	26	-	-	-	-	7/7	(100)
	10	20	-	-	-	-	8/8
	5	10	-	-	-	-	3/8	( 37)

Q4Dx3 5 15

Q7Dx3 10 30

15

6/9 ( 67)

8/8 (100) 6/9 ( 67)

Resultados dos grupos de um fármaco individual.

^T-C: representa o retardamento temporal em dias para o grupo tratado com fármaco (T) até atingir 3000 mrt? comparativamente com os controlos não tratados (C).

Regressão completa (CR): redução temporária do volume do tumor abaixo das dimensões palpáveis do tumor.

Curas: regressão completa sem qualquer evidência de novo desenvolvimento tumoral.

Q —Μ/T: número total de mortes relativamente ao número total de animais de um grupo. As mortes originadas pelo fármaco foram registadas até 55 dias após a última dose de fármaco.

A actividade anti-tumor do fármaco livre sobre as células tumorais de Daudi está também representada na Figura 22. Utilizando o esquema Q7Dx3 por administração intravenosa (i.v.) foi possível inibir significativamente o crescimento das xenoenxertias de tumores de Daudi por um processo dependente da dose respectivamente para os valores de 9, 10 ou 11 mg/kg/injecção, após tratamento com o composto ADM-HCl. os murganhos de controlo não foram tratados. A inibição do crescimento tumoral (T-C) para o valor da DMT que foi de 11 mg/kg/inj., ocorreu em 28 dias o que corresponde a um valor

RTD de 1,1.

Efectuou-se também o teste de diversos esquemas em que se utilizou a administração intraperitoneal (i.p.). Conforme referido antes, determinou-se a DMT do composto ADM-HCl por via intraperitoneal (i.p.) correspondendo a um valor entre 4 e 5 mg/kg/inj. Conforme se pode observar no Quadro 2B, o fármaco livre é inactivo nas células de Daudi para a sua DMT quando administrado por via peritoneal (i.p.). Deste modo, determinou-se que a actividade óptima anti-tumor para o fármaco livre se obtem por administração intravenosa (i.v.) em que a DMT é de 11 mg/kg/inj, uma dose de fármaco que inibe o desenvolvimento das células dos tumores de Daudi.

A partir destas experiências determinou-se consequentemente que a dose óptima de composto ADM-HCl para a actividade anti-tumor no que se refere aos tumores de Daudi foi de aproximadamente 11 mg/kg/inj, verificando-se também que o esquema óptimo é o esquema de tipo Q7Dx3 e que a via

óptima de administração é a via intravenosa (i.v.).

Seguidamente efectuou-se a comparação da actividade anti-tumor, sobre tumores de Daudi, dos imunoconjugados de ADM da presente invenção com a actividade anti-tumor do fármaco livre ADM-HC1 administrado sob condições óptimas, conforme anteriormente determinado. Comparou-se um imunoconjugado G28.1-ADM designado especificamente por G28.l-ADM-7.6 (RM = 7,6 de fármaco/MAB) doseado segundo um esquema de administração Q5Dx2 por via intraperitoneal (i.p.) com o composto ADM-HC1 doseado a 10, 11 e 12 mg/kg/inj segundo um esquema de administração Q7Dx3 por via intravenosa (i.v.). Conforme se mostra na Figura 23 e no Quadro 3 a seguir indicados, o fármaco livre foi activo originando um atraso de 28 dias no desenvolvimento tumoral para uma dose de 11 mg/kg (a sua DMT) exibindo dois murganhos em oito uma completa regressão tumoral (curas). Para a dose mais elevada testada (18,7 mg de ADM, Q5Dx2, i.p.), o imunoconjugado foi bem tolerado (não houve mortes nem perda de peso) e exibiu uma actividade anti-tumor ligeiramente superior à do fármaco livre constatando-se que três em oito animais tratados apresentavam uma completa regressão tumoral. Novamente se verificou que não existia qualquer actividade anti-tumor associada ao imunoconjugado de L6 não ligante, ao anti-corpo G28.1 não conjugado ou a uma mistura de anti-corpo G28.1 não conjugado mais o composto ADM-HC1. Assim, determinou-se que os imunoconjugados do composto ADM inibiam o desenvolvimento tumoral mais intensamente do que aquilo que

era possível conseguir utilizando o fármaco não conjugado na sua dose e esquema de administração intravenosa (i.v.) ou intraperitoneal (i.p.) óptimos.

/

Quadro 3

Actividade Anti-Tumor do Conjugado MAB (ou AcM)-ADM (Q5Dx2; i.p.) Comparativamente Com o Composto ADM-HC1 em Condições Óptimas (Q7Dx3; i.v.) Sobre Xenoenxertias de Tumores de Daudi

Dose ADM	(mg/kg)— MAB (ou Ac)	Inibição Tumoral —	Q Toxicidade
M) T-C	RC	Curas	RTD	M/T (%)
ADM-HC1	Q7Dx3;	i.v.
12		>33	3	3	>1,5	2/8
11		28	0	2	>1,1	0/8
10		18	0	1	0,8	0/8
G28 . 1	-ADM (7,6)	Q5Dx2;	i.p.
18, 7	700	>31	0	3	>1,5	0/8
8,1	300	3	0	0	0,1	0/8
4,4	165	1	0	0	0	0/8
L6-ADM (5,5)	Q5Dx2;	i.p.
18, 7	965	7	0	0	0,3	0/8
8,1	415	0	0	0	0	0/8
G28 . 1	+ ADM	Q5Dx2;	i.p.
4,5	700	6	0	0	0,2	0/8
G28.1		Q5Dx2;	i.p.
	700	2	0	0	0,1	0/8

* ver a legenda do Quadro 2.

ί

Ο Quadro 4 resume a actividade anti-tumor que se obtem utilizando preparações diferentes de imunoconjugados de

5E9 e de G28.1 sobre xenoenxertias de tumores de Daudi em murganhos atímicos. Obteve-se de forma consistente a mais elevada taxa de resposta para doses de anticorpo correspondentes a 500 mg/kg ou superiores. Para estes valores das doses obteve-se a actividade anti-tumor utilizando conjugados possuindo proporções molares compreendidas entre 1,8 e 8,6. Aparentemente a actividade anti-tumor é dependente da dose do anti-corpo em vez de depender da dose do fármaco conjugado, conforme evidenciado pelo facto de à medida que aumentou a dose de anticorpo monoclonal haver um acréscimo correspondente tanto do valor RTD, isto é, da inibição do desenvolvimento tumoral como das taxas de regressão. Em todas as experiências não foi observada qualquer actividade anti-tumor com os conjugados L6-ADM não ligantes que foram testados em paralelo com doses equivalentes de fármaco conjugado e de anticorpo (resultados não apresentados). Além disso, este quadro ilustra a potência acrescida dos imunoconjugados da presente invenção comparativamente com o fármaco livre, o qual foi inactivo em doses equivalentes desse fármaco (comparar com o Quadro 2 anterior).

Quadro 4

Actividade Anti-Tumor dos Imunoconjugados de ADM Sobre as

Xenoenxertias de Tumores de Daudi

Conj ugado-RM	Dose Cura	(mg/kg)	T-Cb (Dias)	Curas	RTD
MAB(ou	AcM)	ADM
5E9-ADM-4.2d	200		4	10	0/7	0.5
5E9-ADM-8.6	260		8.2	8	0/5	0.3
5E9-ADM-4.2d	500		5	17	1/7	0.8
5E9-ADM-5.4	1110		22.8	31	2/5	1.4
5E9-ADM-4.2d	1200		18.3	>61	2/7	>1.5f
5E9-ADM-1.8	1260		8.2	>39	3/5	>1.5
G28.l-ADM-4.9	200		4	8	0/7	0.4
G28.l-ADM-7.6®	330		8.8	1	0/7	0
G28.l-ADM-7.6®	600		16	3	0/7	0.1
G28.l-ADM-4.2	1110		16.8	>37	2/3	>1 . 7
G28.l-ADM-4.9	1200		21.4	>56	2/7	>1.5f
G28.l-ADM-7.6®	1400		37.4	31	3/8	1.3
Esquema de Ad	.: Q5Dx2	Via :	i.p. RM: razão	molar	entre

moléculas de fármaco/MAB (ou AcM) ^bT-C: representa o retardamento temporal em dias para o grupo tratado com fármaco (T) até atingir 3000 mn? comparativamente com os controlos não tratados (C).

'Curas: curas/número de animais tratados. ^5E9-ADM-4 . 2 testado em três doses.

'G28.l-ADM-7.6 testado em três doses.

'mortes no grupo de controlo.

Quadro 5 seguinte demonstra a reduzida toxicidade conseguida utilizando os imunoconjugados de ADM da presente invenção comparativamente com o fármaco não conjugado. Conforme se conclui, os imunoconjugados foram pelo menos 10 vezes menos tóxicos do que o composto ADM livre administrado intraperitonealmente (i.p.).

Toxicidade do e do Conjugado MAB (ou AcM)

Portadores de Tumores

Quadro

Composto ADM Livre

-ADM em Murganhos Rapados

ADM (mg/kg)^C %

Composto	N	Esquema de Ad.	Via	inj	Cumulativa	M/T Morte
ADM	4	QlDxl	i . v.	18	18	14/32	44
ADM	3	QlDxl	i . v.	16	16	3/31	10
ADM	1	QlDxl	i . v.	14	14	0/8	0
ADM	1	Q2Dx2	i . v.	15	30	7/7	100
ADM	2	Q2Dx2	i . v.	12	24	10/12	83
ADM	1	Q2Dx2	i . v.	10	20	3/5	60
ADM	1	Q2Dx2	i . v.	8	16	1/5	20
ADM	1	Q3Dx2	i . v.	16	32	8/8	100
ADM	1	Q3Dx2	i . v.	14	28	7/8	88
ADM	1	Q3Dx2	i . v.	12	24	6/8	75
ADM	1	Q4Dx2	i . v.	14	28	6/7	86
ADM	2	Q4Dx2	i . v.	12	24	7/15	47
ADM	1	Q4Dx2	i . v.	10	20	2/8	25
ADM	1	Q7Dx3	i . V .	12	36	4/8	50
ADM	3	Q7Dx3	i . V .	11	33	4/26	15
ADM	3	Q7Dx3	i . V .	10	30	0/24	0

ADM	1	Q8Dx2	i ·Ρ·	13	26	7/7	100
ADM	1	Q8Dx2	i.p.	10	20	8/8	100
ADM	1	Q8Dx2	i ,p.	5	10	3/8	38
ADM	1	Q4Dx3	i . p.	5	15	6/9	67
ADM	1	Q5Dx2	i ,p.	5, 5	11	0/8	0
ADM	1	Q5Dx2	i . p.	4,1	8, 2	1/5	20
G28.1-ADM	1	Q5Dx2	i -p.	27, 2	55,4	0/8	0
	1	Q5Dx2	i.p.	18, 7	37, 4	0/8	0
G28.1-ADM	1	QlDx4	i .p.	24	96	3/8	38
	1	QlDx4	i.p.	14	64	0/8	0
GE28.1-ADM	1	QlDx4	i.p.	10,5	42	0/5	0
L6-ADM	1	QlDx4	i.p.	31	124	1/8	13
	1	QlDx4	i.p.	18,6	74	0/8	0
Murganhos ^N = Número	portadores de tumores de experiências	de Daudi	ou de	Ramos
CADM = Quantidade administrada,	livre ou	conjugada com	MAB

(ou AcM) ^D/T = # mortes/total tratado

Finalmente a Figura 26A e o Quadro 6 representam a actividade anti-tumor dos conjugados G28.1-ADM sobre tumores de Ramos em seres humanos. Neste caso comparou-se também o efeito anti-tumor dos imunoconjugados sobre os tumores de Ramos com o efeito observado utilizando o composto ADM-HCl livre sob condições que proporcionam resultados óptimos os quais foram préviamente determinados e correspondiam a uma injecção de uma dose única de 16-18 mg/kg/inj (ver as Figuras 24 e 25). Para a dose mais elevada de imunoconjugado que foi testada (10,6 mg/kg), a actividade anti-tumor do conjugado foi superior à actividade obtida utilizando o fármaco livre segundo uma dose de 18 mg/kg (25% de letalidade) em 0,5 RTD e a actividade do composto ADM*HC1 segundo uma dose de 16 mg/kg (12% de letalidade) foi superior em 1,0 RTD. O conjugado administrado segundo esta dose foi bem tolerado verificando-se não haver mortes nem perda de peso em todos os animais tratados. Verificou-se também que a actividade anti-tumor do conjugado G28.1-ADM era dependente da dose conforme se mostra na Figura 26B. Deste modo, a diminuição da dose de conjugado teve como consequência decréscimos do valor RTD e do número de regressões completas. 0 conjugado L6-ADM (não ligante) administrado segundo uma dose comparável (10,6 mg/kg) foi inactivo.

Actividade Anti-Tumor do Conjugado MAB(ou AcM)-ADM (QlDx4;

i.p.) Comparativamente Com o Composto ADM*HC1 em Condições

Óptimas (QlDxl; i.v.) Sobre Xenoenxertias de Tumores de Ramos

Quadro 6

Dose ADM	(mg/kg)— MAB(ou AcM	Inibição tumoral—	RTD	Toxicidade0
) T-C	RC	Curas	M/T	(%)
	ADM-HC1	Q7Dx3;	i.v.
18		8	0	0	0, 5	2/8	( 25)
16		5	0	0	0, 3	1/8	( 12)
G28 .	1-ADM (4.8)	QlDx4;	i.p.
10,6	600	10, 5	0	1	1,1	0/5
5, 3	300	5	0	0	0,5	0/5
2, 6	150	3,5	0	1	0,4	0/5
L6-ADM (7.9)	QlDx4;	i.p.
18, 2	600					2/5	( 40)
10,6	360	0	0	1	0	0/5

a , ~ dose por injecção \er a legenda do Quadro 2

Q ver a legenda do Quadro 2

Os exemplos anteriores demonstram a preparação de novos imunoconjugados de antraciclina em que se efectuou a conjugação de um fármaco de uma antraciclina citotóxico com um anticorpo através de uma nova ponte aci1-hidrazona sensível aos ácidos. Esses imunoconjugados retêm simultaneamente a actividade de ligação do anticorpo (isto é, a especificidade para as células alvo) e a actividade farmacológica citotóxica e permitem a libertação do fármaco livre não modificado sob condições acídicas e redutoras típicas do ambiente celular das células alvo. Demonstrou-se a actividade anti-tumor desses conjugados tanto in vitro como in vivo e verificou-se que era superior à actividade que se obtinha com a antraciclina livre não conjugada. Além disso, esses imunoconjugados foram tolerados in vivo em muito maiores quantidades do que o fármaco não conjugado. Sendo assim, os imunoconjugados da presente invenção exibem um melhor índice terapêutico (actividade anti-tumor relativamente à toxicidade) pelo que são particularmente úteis para o fornecimento de fármacos citotóxicos a uma população celular seleccionada para a aniquilação preferencial dessas células no tratamento de doenças tais como os cancros e outros tumores, infecções virais não citocidas e outras infecções patogénicas e ainda no caso de doenças autoimunes.

Embora se tenha descrito e revelado diversos aspectos e variantes da presente invenção, é evidente que essa descrição básica pode ser alterada para proporcionar outras variantes nas quais se utilize os imunoconjugados e os métodos da presente invenção. Por essa razão faz-se observar que o âmbito da presente invenção fica muito melhor definido pelas reivindicações anexas do que pelos aspectos específicos anteriormente apresentados a título de exemplo.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. - Processo para a preparação de um imunoconjugado comportando cerca de 4 a 10 moléculas de antraciclina ligadas a um anticorpo reactivo com uma população celular escolhida que deve ser morta, caracterizado pelo facto de se ligar um grupo ceto no átomo de carbono em posição 13 e de ligar ao anticorpo através de um ligando unido por covalência, através de uma ligação de acil-hidrazona na posição 13-ceto, à antraciclina.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o ligando comportar adicionalmente uma ligação dis84 sulfureto ou tio-éter.
3. 3. - Processo para a preparação de un imunoconjugado que comporta pelo menos uma molécula de antraciclina com um grupo ceto no átomo de carbono em posição 13 ligado por meio de um ligando a um anticorpo reactivo com uma população celular escolhida que deve ser morta, caracterizado pelo facto de se unir o ligando ã antraciclina por covalência através de uma ligação de acil-hidrazona na posição 13-ceto da antraciclina e de se incluir, adicionalmente, uma ligação dissulfureto ou tio-éter.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher a molécula de antraciclina no grupo constituído por adriamicina, daunomicina, detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, esorubicina, 4'-THP-adria micina, AD-32 e 3 ' -desamino-3 ¹ - (3-ciano-'4-morfolinil) -doxorubicina.
5. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de a antraciclina ser adriamicina ou daunomicina.
6. 6.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser reac tivo para células de tumor.

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7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser reactivo com um antigénio associado com carcinomas, melanomas, linfomas ou sarcomas do tecido ósseo ou dos tecidos moles.
8. 8.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser reactivo com o antigénio CD37 que se encontra em linfomas de células B.
9. 9.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser um anticorpo monoclonal
10. 10.- Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser 5E9, 3A1, L6, G28.1 ou G28.5 e como antraciclina a adriamicina,