JPH013199A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPH013199A JPH013199A JP62-159149A JP15914987A JPH013199A JP H013199 A JPH013199 A JP H013199A JP 15914987 A JP15914987 A JP 15914987A JP H013199 A JPH013199 A JP H013199A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hhgf
- antibody
- present
- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、モノクローナル抗体、詳しくは各種の肝疾患
のスクリーニング並びに診断及びヒト肝細胞増殖因子（
ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ ：ｈＨＧＦ）の精製等に有用な新規なモノ
クローナル抗体に関する。
のスクリーニング並びに診断及びヒト肝細胞増殖因子（
ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆ
ａｃｔｏｒ ：ｈＨＧＦ）の精製等に有用な新規なモノ
クローナル抗体に関する。
従来の技術
ｈＨＧＦは、本発明者である金山らにより、劇症肝炎患
者の血液から分離精製された蛋白性物質である（Ｅ、Ｇ
ｏｈｄａ ｅｔ ａｌ、、Ｅｘｐ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ
、。
者の血液から分離精製された蛋白性物質である（Ｅ、Ｇ
ｏｈｄａ ｅｔ ａｌ、、Ｅｘｐ、 Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ
、。
１６６．１３９−１５６ （’１９８６）；Ｈ。
Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ、、 Ｂｉｏｍｅｄ、Ｒ
ｅｓ、、６．２３１−２３７ （１９８５）；特願昭６
１−１６６４９５号等参照）。
ｅｓ、、６．２３１−２３７ （１９８５）；特願昭６
１−１６６４９５号等参照）。
かかるｈＨＧＦは、肝細胞の増殖を著明に促進する活性
を有し、血中におりるその活性は、劇症肝炎の病態、殊
に昏睡度の変動と密接に関連して変動し、回復期には低
下することが知られている。
を有し、血中におりるその活性は、劇症肝炎の病態、殊
に昏睡度の変動と密接に関連して変動し、回復期には低
下することが知られている。
１肌ｕ算伏見史ユ点１ゑ酒思焉
本発明者らは、ｈＨＧＦが、例えば急性肝炎、慢性肝炎
、肝硬変、劇症肝炎等の各種肝疾患の治療薬ないしは肝
切除術後の治療薬として、更に臨床サンプルにおけるそ
の測定が、それら肝疾患のスクリーニング並びに診断な
いしは病態把握等に、それぞれ有用であることを既に見
出している。
、肝硬変、劇症肝炎等の各種肝疾患の治療薬ないしは肝
切除術後の治療薬として、更に臨床サンプルにおけるそ
の測定が、それら肝疾患のスクリーニング並びに診断な
いしは病態把握等に、それぞれ有用であることを既に見
出している。
しかしながら、かかるｈＨＧＦの製造ないしは精製工程
は、前記報告にもある通り、極めて彪大且つ複雑であり
、その収量の低さからも、上記技術分野への提供に大ぎ
な問題を残している。
は、前記報告にもある通り、極めて彪大且つ複雑であり
、その収量の低さからも、上記技術分野への提供に大ぎ
な問題を残している。
更に、ｈＨＧＦの測定は、前記報告のパイオアッセイ（
生物学的検定法）による活性量としての測定技術が確立
されているに過ぎず、かかる方法では操作性及び精度に
劣ることはもとより、常に測定値（活性）に干渉する成
分の存在を考慮する必要かあることから、上記目的の、
斯界の要求に到底添うものではなく、かかる技術的課題
の克服が望まれている。
生物学的検定法）による活性量としての測定技術が確立
されているに過ぎず、かかる方法では操作性及び精度に
劣ることはもとより、常に測定値（活性）に干渉する成
分の存在を考慮する必要かあることから、上記目的の、
斯界の要求に到底添うものではなく、かかる技術的課題
の克服が望まれている。
本発明は、之等の技術的課題をよく解決するものであり
、上記所望の技術を達成するための新規な抗体を提供す
ることをその目的とする。
、上記所望の技術を達成するための新規な抗体を提供す
ることをその目的とする。
問題点を解決するための手段
本発明によれば、ｈＨＧＦに特異的な反応性を有するモ
ノクローナル抗体が提供される。
ノクローナル抗体が提供される。
本発明抗体の利用によれば、ｈＨＧＦの免疫学的精製手
段並びにｈＨＧＦの免疫学的測定手段が提供される。
段並びにｈＨＧＦの免疫学的測定手段が提供される。
本発明抗体は、ｈＨＧＦに特異的な反応性を有する、即
ち特異的な結合性を有することをその最大の特徴として
あり、かかる抗体には、ｈＨＧＦの肝細胞増殖活性を阻
害ないしは圀止するタイプの抗体が包含される。
ち特異的な結合性を有することをその最大の特徴として
あり、かかる抗体には、ｈＨＧＦの肝細胞増殖活性を阻
害ないしは圀止するタイプの抗体が包含される。
以下、本発明抗体の製造法につぎ詳述する。
本発明抗体は、ＩＩＨＧＦを免疫抗原として使用して、
通常の抗体の製造方法に準じて製造することができる。
通常の抗体の製造方法に準じて製造することができる。
上記方法において、用いられる免疫抗原としてのｈＨＧ
Ｆは、前述の通り公知である。
Ｆは、前述の通り公知である。
本発明抗体の製造においては、必ずしもｈＨＧＦの精製
標品を用いる必要はなく、これを含む粗製品を使用する
ことも可能である。上記本発明抗体の製造方法は、より
具体的には、例えば上記免疫抗原としてのｈＨＧＦで免
疫した吐乳動物の形質細胞（免疫細胞〉を、吐乳動物の
形質細胞肝細胞と融合させてハイブリドーマ（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ）を作成し、これより上記ｈＨＧＦをｈ２識
する抗体を産生ずるクローンを選択し、該クローンより
目的とする抗体（モノクローナル抗体）を得る方法を好
ましく例示できる。
標品を用いる必要はなく、これを含む粗製品を使用する
ことも可能である。上記本発明抗体の製造方法は、より
具体的には、例えば上記免疫抗原としてのｈＨＧＦで免
疫した吐乳動物の形質細胞（免疫細胞〉を、吐乳動物の
形質細胞肝細胞と融合させてハイブリドーマ（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ）を作成し、これより上記ｈＨＧＦをｈ２識
する抗体を産生ずるクローンを選択し、該クローンより
目的とする抗体（モノクローナル抗体）を得る方法を好
ましく例示できる。
上記方法において免疫抗原、叩ちｈＨＧＦで免疫される
吐乳動物としては、特に限定されないか、細胞融合に使
用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、一般には、マウス、ラット等が有利に使用
される。
吐乳動物としては、特に限定されないか、細胞融合に使
用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するの
が好ましく、一般には、マウス、ラット等が有利に使用
される。
免疫は一般的方法により、例えば上記ｈＨＧＦを吐乳動
物に静脈内投与もしくは腹腔内注射等により投与するこ
とにより行なわれる。より具体的には、ｈＨＧＦをＰＢ
Ｓや生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、これを所望に
より通常のアジュバントを併用して、動物に２〜２１日
毎に数回投与し、総投与量が約１〜１００μｇ／動物程
度になるようにするのが好ましい。また、上記投与に際
しては通常の担体（シュレッパー）を採用することもで
きる。免疫細胞としては、上記ｈ ｌ−Ｉ Ｇ Ｆの最
終投与の約３日後に摘出した牌細胞を使用するのが好ま
しい。
物に静脈内投与もしくは腹腔内注射等により投与するこ
とにより行なわれる。より具体的には、ｈＨＧＦをＰＢ
Ｓや生理食塩水等で適当な濃度に希釈し、これを所望に
より通常のアジュバントを併用して、動物に２〜２１日
毎に数回投与し、総投与量が約１〜１００μｇ／動物程
度になるようにするのが好ましい。また、上記投与に際
しては通常の担体（シュレッパー）を採用することもで
きる。免疫細胞としては、上記ｈ ｌ−Ｉ Ｇ Ｆの最
終投与の約３日後に摘出した牌細胞を使用するのが好ま
しい。
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての吐乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の細胞株
、例えばｐ３ （ｐ３／Ｘ６３−Ａｑ８）（Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６，４９５−４９７（１９７５））、ｐ３−Ｕ
ｌ （ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｊｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の細胞株
、例えばｐ３ （ｐ３／Ｘ６３−Ａｑ８）（Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６，４９５−４９７（１９７５））、ｐ３−Ｕ
ｌ （ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｊｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。
８１、１−７ （１９７８） ）、Ｎ５−１ （Ｅｕｒ
。
。
Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６．５１１−５１９ （１
９７６） ）、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ、旦、４０５−
４１５（１９７６））、５Ｐ２１０ （Ｎａｔｕｒｅ、
２７６゜２６９−２７０ （１９７８））、ＦＯ（Ｊ。
９７６） ）、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ、旦、４０５−
４１５（１９７６））、５Ｐ２１０ （Ｎａｔｕｒｅ、
２７６゜２６９−２７０ （１９７８））、ＦＯ（Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ、、 ３５．１−２１ （
１９８０） ）、Ｘ６３．６．５．３．（Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、１２３゜１５４８−１５５０ （１９７９）
）、３１９４（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４８，３１３
−３２３（１９７８））等や、ラットにおけるＲ２１０
（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１−１３３ （１９７９
））等の骨髄腫細胞等が使用される。
１９８０） ）、Ｘ６３．６．５．３．（Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、１２３゜１５４８−１５５０ （１９７９）
）、３１９４（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４８，３１３
−３２３（１９７８））等や、ラットにおけるＲ２１０
（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１−１３３ （１９７９
））等の骨髄腫細胞等が使用される。
上記免疫細胞と形質細胞肝細胞との融合反応は、基本的
には公知の方法、例えばマイルスタインら（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ ｅｔ ａｌ、）の方法（Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ、、７３．３−４．６ （１９８１） ）等
に〈（」じて行ない１ｑる。より具体的には上記融合反
応【、Ｊ２、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培
地中で行なわれる。融合促進剤としては通常用いられる
もの、例えばポリエチレングリコール（ＰＦＧ）、セン
ダイウィルス（ＨＶ Ｊ ）等が使用され、更に所望に
より融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の
補助剤を添加使用することもできる。
には公知の方法、例えばマイルスタインら（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ ｅｔ ａｌ、）の方法（Ｍ ｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ、、７３．３−４．６ （１９８１） ）等
に〈（」じて行ない１ｑる。より具体的には上記融合反
応【、Ｊ２、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培
地中で行なわれる。融合促進剤としては通常用いられる
もの、例えばポリエチレングリコール（ＰＦＧ）、セン
ダイウィルス（ＨＶ Ｊ ）等が使用され、更に所望に
より融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の
補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞と形質細胞肝細胞との使用比は、通常の方法と
変りかなく、例えば形質細胞肝細胞に対し、免疫細胞を
約１〜１０倍程度用いればよい。上記融合時の培地とし
ては、例えば上記形質細胞腫細胞株の増殖に使用される
如きＲＰＭＩ−１６／ｌ○培地、ＭＦＭ培地、その他こ
の種の細胞培養に使用される通常の各種培地を利用でき
、通常は牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清補液を抜いてお
くのがよい。融合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞と
の所定量を上記培地内でよく混合し、予め３７°Ｃ程度
に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６
０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０％（Ｗ／
Ｖ）の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。
変りかなく、例えば形質細胞肝細胞に対し、免疫細胞を
約１〜１０倍程度用いればよい。上記融合時の培地とし
ては、例えば上記形質細胞腫細胞株の増殖に使用される
如きＲＰＭＩ−１６／ｌ○培地、ＭＦＭ培地、その他こ
の種の細胞培養に使用される通常の各種培地を利用でき
、通常は牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血清補液を抜いてお
くのがよい。融合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞と
の所定量を上記培地内でよく混合し、予め３７°Ｃ程度
に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６
０００程度のものを、通常培地に約３０〜６０％（Ｗ／
Ｖ）の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。
以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去す
る操作を繰返すことにより所望のハイブリトーマが形成
される。
る操作を繰返すことにより所望のハイブリトーマが形成
される。
得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びデミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間性なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行な
われる。
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びデミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間性なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行な
われる。
該産生株の検索は、例えばＦＬＩＳＡ法［’Ｅｎｃ＋ｖ
ａｌｌ、 Ｅ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
、７０゜４１９−４３９ （１９８０））、プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オクタ日ニー （０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種
々の方法〔［ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」
、（株）Ｒ＆Ｄプランニング発行、ｐＩ）３０〜５３、
昭和５７年３月５日）に従って行なわれる。尚、上記検
索における抗原としては前記ｈＨＧＦ標品を好ましく使
用できる。
ａｌｌ、 Ｅ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、
、７０゜４１９−４３９ （１９８０））、プラーク法
、スポット法、凝集反応法、オクタ日ニー （０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用いられている種
々の方法〔［ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」
、（株）Ｒ＆Ｄプランニング発行、ｐＩ）３０〜５３、
昭和５７年３月５日）に従って行なわれる。尚、上記検
索における抗原としては前記ｈＨＧＦ標品を好ましく使
用できる。
かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液
体窒素中で長期間保存可能である。
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液
体窒素中で長期間保存可能である。
該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採
取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、或いはバイブリド一マをこれと適合性の
ある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。
取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培
養上清として、或いはバイブリド一マをこれと適合性の
ある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る
方法等が採用される。
薄石の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、後
者の方法は、抗体の大最生産に適している。
者の方法は、抗体の大最生産に適している。
更に、上記により得られる抗体は、塩析法、グル濾過法
、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の精製手段
により精製することもできる。
、アフィニティクロマトグラフィー等の通常の精製手段
により精製することもできる。
かくして得られる本発明抗体は、これを利用して、例え
ば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー等の通
常の免疫学的精製手段により、ｈＨＧＦを簡易且つ特異
的に精製できる。
ば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラフィー等の通
常の免疫学的精製手段により、ｈＨＧＦを簡易且つ特異
的に精製できる。
更に、本発明抗体の利用によれば、放射免疫測定法（Ｒ
ＩＡ＞、酵素免疫測定法（Ｅ ＩＡ） 、凝集法等の通
常の免疫学的手段により、高感度、高精度に且つ高い特
異性をもってｈＨＧＦを簡易に測定することができる。
ＩＡ＞、酵素免疫測定法（Ｅ ＩＡ） 、凝集法等の通
常の免疫学的手段により、高感度、高精度に且つ高い特
異性をもってｈＨＧＦを簡易に測定することができる。
かかる本発明抗体を利用した、精製系並びに測定系の設
定、その改変ないし応用は、当業者にとり自明である。
定、その改変ないし応用は、当業者にとり自明である。
発明の効果
本発明によれば、ｈＨＧＦの特異抗体が提供される。該
抗体の利用によれば、ｈＨＧＦの免疫学的精製手段によ
る精製が可能であり、その製造に際して極めて有用であ
る。また本発明抗体の利用によれば、ｈＨＧＦの免疫学
的測定手段が提供され、これは殊に臨床サンプルのｈＨ
ＧＦの測定に利用され、これによって各種の肝疾患のス
クリーニング並びに診断ないしは病態の把握等を極めて
有効に行なうことができる。
抗体の利用によれば、ｈＨＧＦの免疫学的精製手段によ
る精製が可能であり、その製造に際して極めて有用であ
る。また本発明抗体の利用によれば、ｈＨＧＦの免疫学
的測定手段が提供され、これは殊に臨床サンプルのｈＨ
ＧＦの測定に利用され、これによって各種の肝疾患のス
クリーニング並びに診断ないしは病態の把握等を極めて
有効に行なうことができる。
実 施 例
以下、本発明を更に詳しく説明するため参考例、実施例
及び試験例を挙げる。
及び試験例を挙げる。
参考例１− （ｈＨＧＦの製造〉
ｈＨＧＦは、金円らの方法（ＥＸｐ、 Ｃｅ１ｌＲｅｓ
９，１６６．１３９−１５０（１９８６）；特願昭６１
−１６６４−９５号〕に従い、劇症肝炎の患者血漿から
単離、精製した。
９，１６６．１３９−１５０（１９８６）；特願昭６１
−１６６４−９５号〕に従い、劇症肝炎の患者血漿から
単離、精製した。
肝細胞増殖活性（以下、ｒＨＧＦ活性」と略記する）も
、上記報告の方法に従った。
、上記報告の方法に従った。
上記ｈＨＧＦのＨＧＦ活性は、加熱処理（８０°Ｃ１１
０分間）及び酵素処理（０，１ｍＭ＋ｎＱトリプシン、
３７°Ｃ，３０分間及び０．１ｍＭｍＱキモトリプシン
、３７°Ｃ１３０分間）により失活する。
０分間）及び酵素処理（０，１ｍＭ＋ｎＱトリプシン、
３７°Ｃ，３０分間及び０．１ｍＭｍＱキモトリプシン
、３７°Ｃ１３０分間）により失活する。
また、０．５Ｍ酢酸、０．１Ｍｌ酸緩衝液（ｐＨ４，０
＞、同（ｐＨ５，０＞ 、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４＞及び０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，５）の
いずれの処理（４°Ｃ，２０時間〉によっても安定であ
る。
＞、同（ｐＨ５，０＞ 、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４＞及び０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，５）の
いずれの処理（４°Ｃ，２０時間〉によっても安定であ
る。
上記ｈＨＧＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥ （上記文献に記載の
方法に準じた。但し１２％分前分離を用い、染色は銀染
色によった）によれば、非還元条件下で、該ｈＨＧＦは
、分子量的８８０００及び約８３０００の２本のバンド
として泳動された。
方法に準じた。但し１２％分前分離を用い、染色は銀染
色によった）によれば、非還元条件下で、該ｈＨＧＦは
、分子量的８８０００及び約８３０００の２本のバンド
として泳動された。
また還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥによれば、分子ｊ
ｉ５６０００〜６５０００及び３２０００〜３５０００
の両グループにメインバンドを与えた。
ｉ５６０００〜６５０００及び３２０００〜３５０００
の両グループにメインバンドを与えた。
このことより、ｈＨＧＦは、之等がジスルフィド結合に
より結合した蛋白性物質であり、上記の分子型はいずれ
も実質的にｈＨＧＦとして同一であると推定された。
より結合した蛋白性物質であり、上記の分子型はいずれ
も実質的にｈＨＧＦとして同一であると推定された。
実施例１ 〈抗体の製造〉
■ 上記参考例１で得たｈＨＧＦｏ、 ＯＩＩＩＩＬ／
＋ｒ＋Ｑの生理食塩水溶液を、等量のフロイント 〕ン
プリート アジュバント（Ｆ ｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ、 ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、 ＤｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ ＵＳ
Ａ）と混和し、懸濁させた。得られた懸濁液の上記ｈＨ
ＧＦ２μｑ含有分を、Ｂａ１ｂ ／Ｃ系マウスに皮下投
与した。２週間目に、同波のｈＨＧＦ２μｑ含有分を同
様に投与し、更に３週間後、生理食塩水に溶解させたｈ
）−ＩＧＦの２μＱを腹腔内投与した。最終投与の４日
後に牌臓を摘出し、牌細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。
＋ｒ＋Ｑの生理食塩水溶液を、等量のフロイント 〕ン
プリート アジュバント（Ｆ ｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ、 ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、 ＤｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ ＵＳ
Ａ）と混和し、懸濁させた。得られた懸濁液の上記ｈＨ
ＧＦ２μｑ含有分を、Ｂａ１ｂ ／Ｃ系マウスに皮下投
与した。２週間目に、同波のｈＨＧＦ２μｑ含有分を同
様に投与し、更に３週間後、生理食塩水に溶解させたｈ
）−ＩＧＦの２μＱを腹腔内投与した。最終投与の４日
後に牌臓を摘出し、牌細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で
３回洗浄した。
マウス骨髄腫細胞株Ｐ ３−Ｕ １ （Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 。
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 。
旦１．１−７ （１９７８））を同様に洗浄後、その１
×１０７個と上記牌細胞１×１０８個とを５０ｎ＋Ｃ１
遠心管に入れ混合した。２００ＸＧ、５分遠心後、上清
をパスツールピペットで除去した。
×１０７個と上記牌細胞１×１０８個とを５０ｎ＋Ｃ１
遠心管に入れ混合した。２００ＸＧ、５分遠心後、上清
をパスツールピペットで除去した。
３７℃に保温したポリエチレングリコール１５００（ベ
ーリンガーマンハイム山之内社製）５０％ （Ｗ／ Ｖ
） ヲ含むＲＰＭＩ−１６４０溶液１ ｍＱを１分間
を要して滴下し、次いで３７°Ｃに保温したＦＣ８を含
まないＲＰＭＩ−１６４０溶液１鵬を加えて１分間放置
し、次に同波２ｍＱを加えて２分間放置し、更に同波４
ｍＱを加えた。４分間放置後、３７°Ｃに保温した１５
％ＦＣ３゜０．０５ｇ力価／Ｑ Ｆｔｔｃ’Ｗストレ
プトマイシン、６００００Ｕ／Ｑ−ペニシリンＧカリウ
ム、５４ｍｇ／Ｑ−ゲンタマイシン及び１ｍＭピルベー
トを含有するＲＰＭＩ−１６４０（以下これを「完全Ｒ
ＰＭＩＪという）の８ｍＱを加え、２００ＸＧで５分間
遠心分離した。
ーリンガーマンハイム山之内社製）５０％ （Ｗ／ Ｖ
） ヲ含むＲＰＭＩ−１６４０溶液１ ｍＱを１分間
を要して滴下し、次いで３７°Ｃに保温したＦＣ８を含
まないＲＰＭＩ−１６４０溶液１鵬を加えて１分間放置
し、次に同波２ｍＱを加えて２分間放置し、更に同波４
ｍＱを加えた。４分間放置後、３７°Ｃに保温した１５
％ＦＣ３゜０．０５ｇ力価／Ｑ Ｆｔｔｃ’Ｗストレ
プトマイシン、６００００Ｕ／Ｑ−ペニシリンＧカリウ
ム、５４ｍｇ／Ｑ−ゲンタマイシン及び１ｍＭピルベー
トを含有するＲＰＭＩ−１６４０（以下これを「完全Ｒ
ＰＭＩＪという）の８ｍＱを加え、２００ＸＧで５分間
遠心分離した。
上清を除去し、３７°Ｃに保温した完全ＲＰＭＩに、牌
細胞ｌＸ１０”個／ｍＱとなるように！！：濁し、２４
穴のマイクロプレート（コースタ−社）に１ｍＱずつ分
注し、３７°Ｃ下に５％炭酸ガスインキュベーター内で
培養した。２４時間後１．０Ｘ１０−’Ｍピポキサンチ
ン、４．ＯＸｌｏ−７Ｍアミノプテリン及び１．６Ｘ１
０−５Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下ｒＨＡ
下培地」という＞１ｍＱを各ウェルに添加した。以後上
清の半分を第２．３及び４日日にそれぞれ新しいＨＡＴ
培地に代え、第６日目に同様に上清の半分を、１．０Ｘ
１０−’Ｍヒポキサンチン及び１．６×１０−５Ｍチミ
ジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下「１丁培地」という
）に代えた。以後、完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。
細胞ｌＸ１０”個／ｍＱとなるように！！：濁し、２４
穴のマイクロプレート（コースタ−社）に１ｍＱずつ分
注し、３７°Ｃ下に５％炭酸ガスインキュベーター内で
培養した。２４時間後１．０Ｘ１０−’Ｍピポキサンチ
ン、４．ＯＸｌｏ−７Ｍアミノプテリン及び１．６Ｘ１
０−５Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下ｒＨＡ
下培地」という＞１ｍＱを各ウェルに添加した。以後上
清の半分を第２．３及び４日日にそれぞれ新しいＨＡＴ
培地に代え、第６日目に同様に上清の半分を、１．０Ｘ
１０−’Ｍヒポキサンチン及び１．６×１０−５Ｍチミ
ジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下「１丁培地」という
）に代えた。以後、完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。
かくして得られるハイブリド−マを、限界希釈法により
クローニングした。即ちハイブリドーマ３×１０２個及
びＢａ１ｂ ／ＣＣママウス胸腺細胞１Ｘ１０８を含む
ように調製した１０％ＦＣ３加ＲＰＭＩ−１６４０培地
の２０ｍＱを用いて、ハイブリドーマ３個／ウェルとな
るように９６ウエルのプレートに播き、培養した。増殖
してくるハイブリドーマを同様にハイブリドーマ１個／
ウェルとしてクローニングし、更に増殖してくるハイブ
リドーマを同様にハイブリドーマ０．３個／ウェルとし
てクローニングした。
クローニングした。即ちハイブリドーマ３×１０２個及
びＢａ１ｂ ／ＣＣママウス胸腺細胞１Ｘ１０８を含む
ように調製した１０％ＦＣ３加ＲＰＭＩ−１６４０培地
の２０ｍＱを用いて、ハイブリドーマ３個／ウェルとな
るように９６ウエルのプレートに播き、培養した。増殖
してくるハイブリドーマを同様にハイブリドーマ１個／
ウェルとしてクローニングし、更に増殖してくるハイブ
リドーマを同様にハイブリドーマ０．３個／ウェルとし
てクローニングした。
目的の抗体を産生するクローンは、免疫原に用いたｈＨ
ＧＦを抗原とするＥＬＩＳＡ法により検索した。
ＧＦを抗原とするＥＬＩＳＡ法により検索した。
かくして、所望の反応特異性を有する本発明のモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ（クローンＮＯ，
０ＡＬ−Ｈ−２−１４＞を得た。
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ（クローンＮＯ，
０ＡＬ−Ｈ−２−１４＞を得た。
■ 上記■て得られたクローンＮｏ、０ＡＩ−１１−２
−１４を、完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸カスインキュ
ベーター中で、３７°Ｃにて４８時間培養した。培養液
を遠心分離（３０００ｐｐｍ 、１０分）して、目的の
モノクローナル抗体（以下これをｒｈｌ−２−１４Ｊと
いう）を含む培養上清を得た。
−１４を、完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸カスインキュ
ベーター中で、３７°Ｃにて４８時間培養した。培養液
を遠心分離（３０００ｐｐｍ 、１０分）して、目的の
モノクローナル抗体（以下これをｒｈｌ−２−１４Ｊと
いう）を含む培養上清を得た。
尚、上記抗体のサブクラスはＩｇＧ＋であった。
これはオフタロニーキット＜ ｓ ｅｒｏｔｅｃ社製）
を用いて確認された。
を用いて確認された。
■ 前記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−ｔ」−２−１
４の１×１０６個を、予めブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ
、Ａ １ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を接
種しておいた３ａｌｂ ／ｃ系マウスに腹腔内投与した
。
４の１×１０６個を、予めブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ
、Ａ １ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を接
種しておいた３ａｌｂ ／ｃ系マウスに腹腔内投与した
。
１０〜１４日後、蓄積した腹水を採取し、本発明抗体を
含む腹水を得た。この抗体の濃度は、約０．２〜５ｍＭ
ｍＧであった。
含む腹水を得た。この抗体の濃度は、約０．２〜５ｍＭ
ｍＧであった。
該腹水より、ＩＱＧ精製キット（ＭＡＰＳＫｉｔ；バイ
オ・ラッド社製〕を用いて、精製抗体Ｈ−２−１４を得
た。
オ・ラッド社製〕を用いて、精製抗体Ｈ−２−１４を得
た。
試験例１
９６ウエルプレートの各ウェルに、免疫原として用いた
ｈＨＧＦの１５０ｍＭ ＮａＣＱ及び０．０４％Ｎａ
Ｎ３含有２０ｍＭトリス塩酸溶液（８，６μＱ／１０ｍ
２＞を加え、４°Ｃで２４時間放置した。洗浄後、２．
５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を各ウェルに２００μＱづつ入
れ、４℃で２４時間以上放置してブロックし、抗原を不
溶化したプレートを得た。
ｈＨＧＦの１５０ｍＭ ＮａＣＱ及び０．０４％Ｎａ
Ｎ３含有２０ｍＭトリス塩酸溶液（８，６μＱ／１０ｍ
２＞を加え、４°Ｃで２４時間放置した。洗浄後、２．
５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を各ウェルに２００μＱづつ入
れ、４℃で２４時間以上放置してブロックし、抗原を不
溶化したプレートを得た。
次いで、上記各ウェルに、実施例１の■で得た上清の倍
々希釈液各１００μＱを添加し、室温下に、１．５時間
振盪した。
々希釈液各１００μＱを添加し、室温下に、１．５時間
振盪した。
各ウェルを洗浄後、パーオキシダーゼで標識したヤギ抗
（マウスＩ ＱＭ＋Ｉ ＣＯＧ＞抗体（ジャックソン（
Ｊ ａｃｋｓｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｒｅｓｃａｒｃｈ
Ｌ ａｂ、 ）社製、Ｘ５０００）１００μＱを加え
、室温、振盪下に１．５時間放置し、洗浄後、オルト−
フェニレンジアミン（２５ｍ（１／ １０ｍＱ＞溶液１
００μ（！を加えて、２０〜３０分間放置後、２Ｎ
Ｈ２ＳＯ４１００μＱを添加１ノで反応を停止させた。
（マウスＩ ＱＭ＋Ｉ ＣＯＧ＞抗体（ジャックソン（
Ｊ ａｃｋｓｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｒｅｓｃａｒｃｈ
Ｌ ａｂ、 ）社製、Ｘ５０００）１００μＱを加え
、室温、振盪下に１．５時間放置し、洗浄後、オルト−
フェニレンジアミン（２５ｍ（１／ １０ｍＱ＞溶液１
００μ（！を加えて、２０〜３０分間放置後、２Ｎ
Ｈ２ＳＯ４１００μＱを添加１ノで反応を停止させた。
得られた反応液の４．９２ ｎｍでの吸光度を、クイタ
ーチック・マルチスキャン（フローラボラトリーズ社製
）により測定した。
ーチック・マルチスキャン（フローラボラトリーズ社製
）により測定した。
その結果を第１図に示す。
図において横軸は本発明抗体を含む培養上清の希釈倍数
を、縦軸はＯＤ ４９２を示す。
を、縦軸はＯＤ ４９２を示す。
試験例２（ウェスタン・プロッティング）この試験は、
タウビンら（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ、）の方法
に準じた（ ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、△Ｃａｄ、ＳＣｉ
、 ＵＳＡ 。
タウビンら（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ、）の方法
に準じた（ ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、△Ｃａｄ、ＳＣｉ
、 ＵＳＡ 。
７６．４３５０−４３５４．（１９７９））。
即ち、ｈＨＧＦを５ＤＳ−ＰＡＧＦ （参考例１に記載
）後、ゲルをニトロセルロース膜と合せ、ゲルのある側
を一極、ニトロセルロース膜のある側を子種として電流
を流し、ゲル上で泳動された蛋白質をニトロセルロース
膜にブロンｊ〜した。プロットされた二ｌ〜ロセルロー
ス膜を２％８３△含有ＰＢＳ液に浸してブロッキングを
行なった後、−次抗体として前記実施例１の■で得た精
製抗体Ｈ−２’−１４を反応させた。洗浄後、二次抗体
とするパーオキシダーゼで標識したヤギ抗（マウスＩ
ＱＭ＋ＪΩＧ）抗体（ジャックソン社製）を添加して、
２％ＢＳΔ含右ＰＢＳ液中で反応させた。
）後、ゲルをニトロセルロース膜と合せ、ゲルのある側
を一極、ニトロセルロース膜のある側を子種として電流
を流し、ゲル上で泳動された蛋白質をニトロセルロース
膜にブロンｊ〜した。プロットされた二ｌ〜ロセルロー
ス膜を２％８３△含有ＰＢＳ液に浸してブロッキングを
行なった後、−次抗体として前記実施例１の■で得た精
製抗体Ｈ−２’−１４を反応させた。洗浄後、二次抗体
とするパーオキシダーゼで標識したヤギ抗（マウスＩ
ＱＭ＋ＪΩＧ）抗体（ジャックソン社製）を添加して、
２％ＢＳΔ含右ＰＢＳ液中で反応させた。
次いて５０ｍＭ＋−リス塩酸（ＤＨ７，５＞＋０．２Ｍ
ＮａＣＱ液を用いてニトロセルロース膜を洗浄後、
ワーキング溶液［５０ｍＭ ＋へリス塩酸（ｐＨ７，５
）＋０．２Ｍ ＮａＣＱの３１＋ｎＱ、３ｍＣＪ／ｒ
ｎＱ４−クロロナフトールのメタノール溶液の５１ＴＩ
Ｑ及び３０％ト１２０２水溶液の２５μＱの混合液コを
加えて、発色させた。
ＮａＣＱ液を用いてニトロセルロース膜を洗浄後、
ワーキング溶液［５０ｍＭ ＋へリス塩酸（ｐＨ７，５
）＋０．２Ｍ ＮａＣＱの３１＋ｎＱ、３ｍＣＪ／ｒ
ｎＱ４−クロロナフトールのメタノール溶液の５１ＴＩ
Ｑ及び３０％ト１２０２水溶液の２５μＱの混合液コを
加えて、発色させた。
上記ウェスタン・プロッティングの結果を第２図に示す
。
。
第２図にｄ３いて、（１）の３レーンは、非）至元条件
下のＳ Ｄ Ｓ−Ｐ Ａ Ｇ Ｅでの結果を、（２〉の
３レーンは還元条件下での結果を夫々示し、各結果にお
けるレーンΔは参考例１で得たｈＨＧＦを、レーンＢ及
びレーンＣは参考例１と同様にして１ｎた別ロツｌ〜の
ｈＨＧＦを夫々示す。
下のＳ Ｄ Ｓ−Ｐ Ａ Ｇ Ｅでの結果を、（２〉の
３レーンは還元条件下での結果を夫々示し、各結果にお
けるレーンΔは参考例１で得たｈＨＧＦを、レーンＢ及
びレーンＣは参考例１と同様にして１ｎた別ロツｌ〜の
ｈＨＧＦを夫々示す。
該図より、本発明抗体Ｈ−２−１／Ｉは、ロットの別を
問わず、非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＦにより泳動さ
れたｈＨ’ＧＦ（２本のバンド共）に反応性を有し、ま
た還元条件下のｈ ｌ−Ｉ Ｇ Ｆには反応しないこと
が確認された。
問わず、非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＦにより泳動さ
れたｈＨ’ＧＦ（２本のバンド共）に反応性を有し、ま
た還元条件下のｈ ｌ−Ｉ Ｇ Ｆには反応しないこと
が確認された。
試験例３（吸収試験）
抗原（ｈＨＧＦ液）と抗体（実施例１の■で得たＨ−２
−１４を含む培養上清の１０倍希釈液）とを、３７°Ｃ
で一夜反応させた。この溶液に、プロティン△を同相化
したゲル（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、）社製）
を添加し、プロティンＡにモノクローナル抗体を結合さ
せ、遠心分離してこのゲルを落し、上清を回収した（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ。
−１４を含む培養上清の１０倍希釈液）とを、３７°Ｃ
で一夜反応させた。この溶液に、プロティン△を同相化
したゲル（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、）社製）
を添加し、プロティンＡにモノクローナル抗体を結合さ
せ、遠心分離してこのゲルを落し、上清を回収した（Ｊ
、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、２６０．７２１９”７２２’５（１９８’
５’））。
５’））。
この上清のＨＧＦ活性を、参考例１に準じて１２５１−
ｄＵｒｄ取込み（［３ｉｏｃｈｃｍ、 、 ２３ 。
ｄＵｒｄ取込み（［３ｉｏｃｈｃｍ、 、 ２３ 。
６２９５＋−６２９９（１９８４，））により調べた。
結果を第３図に示す。
図において、横軸はＨＧＦ活性測定に供した上記上清（
サンプル）の量（μＱ）を、縦軸は１２５■−ｄＵｒｄ
の取込み量（ＣＩ）ｍ Ｘｌ ０−４：サンプル非添加
時のブランク値を引いた結果）を夫々示し、図中曲線（
１）は上記試験の結果を、曲線（２）は上記試験におい
て抗体の代りに同量のＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた
対照の結果を人々示す。
サンプル）の量（μＱ）を、縦軸は１２５■−ｄＵｒｄ
の取込み量（ＣＩ）ｍ Ｘｌ ０−４：サンプル非添加
時のブランク値を引いた結果）を夫々示し、図中曲線（
１）は上記試験の結果を、曲線（２）は上記試験におい
て抗体の代りに同量のＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた
対照の結果を人々示す。
上記試験結果から、本発明抗体１−（−２−１／ｌは、
ｈＨＧＦに特異な反応性を有する抗体であることが判る
。
ｈＨＧＦに特異な反応性を有する抗体であることが判る
。
第１図は抗体希釈による、本発明抗体とｈＨＧＦとの反
応性を調べた結果を示すグラフである。 第２図はウェスタン・プロッティングによる、本発明抗
体とｈＨＧＦとの反応性を調べた結果を示す図面でおる
。 第３図は吸収試験による、本発明抗体とｈＨＧＦとの反
応性を調べた結果を示すグラフである。 （以 」二 ） 手続補正間（方式） １ 事件の表示 昭和６２年特許願第１５９１４９号 ２ 発明の名称 モノクローナル抗体 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大 工 原 恭 （ばか２名） ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鶴ビル昭和６３年６月
８日 （発送臼：昭和６３年６月２８日） ６ 補正の対象 明細書中「図面の簡単な説明」の欄 補正の内容 １ 明細書中箱２３頁第２〜４行に１第２図・・・であ
る。」とあるを次の通り訂正する。 「 第２図はウェスタン・プロッティングによる、本発
明抗体とｈＨＧＦとの反応性を調べた結果を示す図面に
代る写真である。」（以 上）
応性を調べた結果を示すグラフである。 第２図はウェスタン・プロッティングによる、本発明抗
体とｈＨＧＦとの反応性を調べた結果を示す図面でおる
。 第３図は吸収試験による、本発明抗体とｈＨＧＦとの反
応性を調べた結果を示すグラフである。 （以 」二 ） 手続補正間（方式） １ 事件の表示 昭和６２年特許願第１５９１４９号 ２ 発明の名称 モノクローナル抗体 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大 工 原 恭 （ばか２名） ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鶴ビル昭和６３年６月
８日 （発送臼：昭和６３年６月２８日） ６ 補正の対象 明細書中「図面の簡単な説明」の欄 補正の内容 １ 明細書中箱２３頁第２〜４行に１第２図・・・であ
る。」とあるを次の通り訂正する。 「 第２図はウェスタン・プロッティングによる、本発
明抗体とｈＨＧＦとの反応性を調べた結果を示す図面に
代る写真である。」（以 上）
Claims (1)
- １ ヒト肝細胞増殖因子に特異な反応性を有することを
特徴とするモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62159149A JPS643199A (en) | 1987-06-25 | 1987-06-25 | Monoclonal antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62159149A JPS643199A (en) | 1987-06-25 | 1987-06-25 | Monoclonal antibody |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH013199A true JPH013199A (ja) | 1989-01-06 |
| JPS643199A JPS643199A (en) | 1989-01-06 |
| JPH0560359B2 JPH0560359B2 (ja) | 1993-09-02 |
Family
ID=15687329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62159149A Granted JPS643199A (en) | 1987-06-25 | 1987-06-25 | Monoclonal antibody |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS643199A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE222603T1 (de) * | 1992-05-18 | 2002-09-15 | Genentech Inc | Hepatozytwachstumfaktor variante |
| US5316921A (en) * | 1992-05-18 | 1994-05-31 | Genentech, Inc. | Single-chain hepatocyte growth factor variants |
| US5328837A (en) * | 1992-05-18 | 1994-07-12 | Genentech, Inc. | Hepatocyte growth factor protease domain variants |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045534A (ja) * | 1983-08-22 | 1985-03-12 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 肝実質細胞増殖因子 |
| JPH0635480B2 (ja) * | 1985-08-23 | 1994-05-11 | 大塚製薬株式会社 | 肝実質細胞増殖因子 |
-
1987
- 1987-06-25 JP JP62159149A patent/JPS643199A/ja active Granted
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