JPH0133160B2

JPH0133160B2 -

Info

Publication number: JPH0133160B2
Application number: JP26585485A
Authority: JP
Inventors: Yoshuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1985-11-26
Publication date: 1989-07-12
Also published as: JPS62126973A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、バシルス属細菌による新規なマルト
ース生成アミラーゼに関するものである。〔従来技術〕澱粉からマルトースを生成する酵素として、澱
粉の作用様式と生産物の種類により、種々のもの
が知られている。β−アミラーゼは、大豆、麦
芽、小麦などの植物やバシルス属細菌より生産さ
れる｛アミラーゼシンポジウム、６巻、39頁
（1971）、アグリカルチヤーバイオロジカルケ
ミストリー（Agriculture Biological
Chemistry）38巻、1023（1974）、同40巻、1515頁
（1976）など｝が知られている。この酵素は、澱
粉をその非還元性末端から厳格にエクソ型でマル
トース単位で加水分解し、生成マルトースはβ−
型である。アスペルギルスオリーゼ
（Aspergillus oryzae）や、ある種の細菌や放線
菌の生産するα−アミラーゼの中に、澱粉からマ
ルトースを比較的多く生成するものはあるが、こ
れらの酵素はエンド型の分解機作をもつた酵素で
あり、マルトースの他に、グルコース、マルトト
リオース、その他のオリゴ糖を多量に生成する。最近、H.OuttrupとB.E.Normanは、バシルス
ステアロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）の生産する新規なマルトー
ス生成酵素について報告している｛第35回デトモ
ルドスターチコンベンシヨン（35th
Detmold Starch Convention1984年４月25日〜
27日）｝。この酵素は、澱粉の非還元性未端からエ
キソ型でマルトースを生成するが、生成マルトー
スはα−型であることβ−アミラーゼのように、
厳格にマルトース単位で加水分解するものではな
く、反応初期には、マルトテトラオース（G4）、
マルトトリオース（G3）、マルトース（G2）の
他に、少量のマルトペンタオース（G5）やマル
トヘキサオース（G6）も生成すること、シヤー
デインガー（Shardinger）デキストリンをマル
トースとグルコースに分解すること、及びマルト
トリオースをマルトースとグルコースに分解する
と報告されている。このため、この酵素による澱
粉分解物中には６〜８％のグルコースが含まれ
る。〔目的及び効果〕本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生
成するアミラーゼ生産菌を求めて、広く微生物の
検索を行つてきた結果、土壌中より分離し、バシ
ルス・ガテリウム（Bacillus megaterium）と同
定した細菌が新規で、且つ耐熱性のマルトース生
成酵素を生産することを認めた。本酵素は、澱粉
を、その非還性末端からマルトース単位で加水分
解すると考えられるが、生成糖はα−型であるこ
とを、生成物の変旋光及びガスクロマトグラフに
よる分析により確認した。本酵素はアミロペクチ
ンのα−１，６−グルコシド結合は分解すること
ができないため、リミツトデキストリンを残す
が、アミロペクチンのマルトースへの分解率は、
β−アミラーゼの場合に比べて、２〜３％高く、
より分岐結合（α−１，６−グリコシド結合）近
くまで分解できるものと考えられる。また、反応
初期には、マルトース以外の生成物は観察され
ず、マルトトリオースに対する親和性が小さいた
め、最終反応物中には、グルコースは殆んど存在
しないなど、新規な酵素と考えられた。本発明者
は、この酵素をアミラーゼG2と命名した。以下に、本酵素の性質の詳細を記載する。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その
非還元性末端からマルトース単位で加水分解す
る。生成糖はα−マルトースであることからα
−アミラーゼの一種と考えられるが、エンド型
の分解作用を示さず、アミロペクチン、グリコ
ーゲンからはリミツトデキストリンを残す。サ
イクロデキストリンを分解せず、またマルトト
リオースの分解力も弱い。生成糖がα−型であ
ることを除けば、植物や細菌のβ−アミラーゼ
に似ているが、アミロペクチンやこれを含む澱
粉に対する分解限度は２〜３％で高い。 (2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約60℃であ
る（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適PH；約３〜約11の広いPH
範囲に作用する。最適PHは約７〜7.5である
（0.05Mリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の下で
作用、（第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱までは
失活が認められない。60℃10分間の加熱で約10
％失活し、65℃10分間の加熱で約70％失活し、
そして、60℃10分間の加熱で90％以上失活した
（第１図ｃ）。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下、室温（30℃）
で３時間放置後、酸存活性を測定した。その結
果、PH4.5〜８の範囲で安定であつた（第１図
ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンによる熱安定性の
増加は認められなかつた。 (7) 阻害剤；本酵素は、１×10^-3MのHgCl₂、
AgNO₃、CuSO₄、NiSO₄により、それぞれ約
85％、約75％、約70％、約60％阻害された。ま
た、１×10^-3Mのｐ−クロロマーキユリベンゾ
エートにより約70％阻害れた。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養液の上澄か
ら、硫安分画、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー、同カラムによる再ロマト
グラフイーとバイオゲルA0.5ｍによるカラム
クロマトグラフイーにより、デイスク電気泳動
的に均一まで精製することができる。 (9) 分子量；セフアデツクスＧ−200により測定
した分子量は約60000であつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液に溶解させ
た２％可溶性澱粉0.5mlに、適量の酵素を加え、
水で全量１mlとし、40℃で反応させる。この条
件で、１分間に1μモルのグルコースに相当す
る還元力を生成する酵素量を１単位とした。以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れている、植物起源のβ−アミラーゼ、バシルス
属細菌のβ−アミラーゼ及びバシルスステアロ
サーモフイラスのマルトース生成アミラーゼと比
較した結果は、第１表に示す通りである。すなわち、植物系β−アミラーゼ及びバシルス
属のβ−アミラーゼはβ−マルトースのみを生成
するのに対し、本発明の酵素はα−マルトースの
みを生成する。バシルスステアロサーモフイラ
スのアミラーゼは、本発明の酵素と同様α−マル
トースを生成するが、反応初期には、マルトテト
ラオースやマルトトリオース及び微量のマルトヘ
キサオースやマルトペンタオースを生成すると報
告されている。従つて、これら酵素は本発明の酵
素とは本質的に異なつている。また、最適PH、最
適温度、分子量などの酵素的性質においても差が
認めらめることから、本発明の酵素は新規な酵素
ということができる。本発明は、この知見に基づ
いてなされたものである。〔構成〕すなわち、本発明は、澱粉を、その非還元性末
端からα−マルトースを生成するバシルス属由来
新規アミラーゼに関するものである。本発明の酵素を生産する例示菌として、バシル
スメガテリウム（Bacillus megaterium）を挙
げる。本菌の菌学的性質は下記に示す通りであ
り、微工研究菌寄第7978号として、工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；巾0.7〜1.3×2.4〜5.0μ、通常、２個以
上連なり、短鎖状に生成する。グラム陰性。 (2) 胞子；両末端近くに２個。胞子をもつ細胞の
ふくらみは殆んど認められない。 (3) 生育；好気的に生育。嫌気下では殆んど生育
は認められない。 (4) 肉汁；混濁、沈降する。 (5) 肉汁寒天；生育良好、表面なめらか、淡褐色
を示すが、色素の生成なし。

【表】 (6) グルコース肉汁寒天；肉汁培地よりよく生育
する。 (7) グルコース硝酸塩寒天；よく生育する。表面
なめらか。淡褐色を示す。 (8) チロシン寒天；褐色色素を生成する。 (9) グルコース・アスパラギン寒天；かなりよく
生育する。 (10) ポテト；生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。 (11) クエン酸の利用；陽性。 (12) 澱粉の加水分解；陽性。 (13) アセチルカルビノール；生成しない。 (14) ゼラチン；分解する。 (15) ミルク；凝固し、ペプトン化する。 (16) 硝酸塩の還元；陽性。 (17) カタラーゼ；陽性。 (18) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−ソルビトール、マルトース、蔗糖など
を利用し、いずれもガスを生成することなく生
産する。 (19) 最適性育温度；40℃前後。 (20) 最高生育温度；約50℃。 (21) 死滅温度；100℃、20分間の加熱でも死滅
しない。以上の菌学的性質について、バージエイスマ
ニユアルオブデタミネーテイブバクテリオ
ロジー（Bergey′s Mannual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版（ザウイ
リアムスアンドウイルキンスカンパニー
（The Williams and wilkins Company）、1957
年及び1974年）を参照し、本菌をバシルスメガ
テリウム（Bacillus megaterium）Ｇ−２と命名
した。バシルスメガテリウムG2を培養して、アミ
ラーゼG2を生産するための一般的培養は、次の
ようにして行われる。培養は、通常、液体培地による通気、撹拌培養
により行われる。窒素源としては、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、カゼイン、コーンステイ
ープリカー、大豆粕など、通常、微生物の培養に
際し、よく用いられる有機窒素源、あるいはこれ
に補足する窒素源して、塩化アンモン、リン酸ア
ンモン、硝酸塩などの無機窒素源が用いられる。
炭素源としては、澱粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シユークロスなどが使用され
る。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好気的に行
われる。アミラーゼG2は、菌体外に生産される酵母で
あるので、培養終了後、濾過または遠心分離によ
り除菌し、上澄液を回収する。培養上清液は、必要により濃縮し、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析による
か、または、アセトン、イソプロパノール、エタ
ノール、メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵
素を沈澱物として収得し、乾燥、保存する。アミラーゼG2を用いて、沈粉を糖化する反応
は、次のようにして行う。澱粉は、先ず、酸または澱粉液化酵素α−アミ
ラーゼにより液化される。澱粉の液化度（DE）
は、マルトースの収量に著しく影響し、液化度の
小さい液化澱粉を使用する方が収量よくマルトー
スが得られる。（DEは固形分中の還元力をグルコ
ースとして表わした百分率）。基質濃度は、通常、
５〜40％、反応PHは５〜８、温度は50〜60℃で行
われる。本酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコ
シド結合を分解することができないので、アミロ
ペクチン、あるいはこれを含む澱粉又はその派生
物を基質として用いるときには、α−１，６−グ
ルコシド結合を分解するイソアミラーゼやプルラ
ナーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼの存在
下で反応を行うと、糖化反応を促進し、収量よく
マルトースを製造することができる。次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。実施例１大豆タンパク２％、米ぬか２％、K₂HPO₄0.3
％、MgSO₄・7H₂O0.1％、可溶性澱粉２％、
CaCl₂1×10^-3M、MnCl₂1×10^-4M、CuSO₄2.5×
10^-5M、FeCl₂2.5×10^-5M、ラウリル硫酸ナトリ
ウム2.5×10^-2％からなる培地（PH7.0）30mlを200
ml容三角フラスコに入れ、120℃で15分殺菌後、
バシルスメガテリウム（微工研菌寄第7978号）
を接種し、30℃で３日間振盪培養（160rpm）し
た。培養後、遠心分離して得た上澄液について、
生産されたアミラーゼG2活性を測定した結果、
培地１ml当り、9.0単位であつた。実施例２実施例１で得られた培養上澄液に、硫安を８％
飽和になるように添加し、生成した沈澱物を遠心
分離機により回収し、水に溶解し、１×10^-3Mの
Ｌ−システインを含む蒸留水に対し、一夜透析し
たものを澱粉糖化用酵素液とした（酵素の回収率
は約82％であつた）。可溶性澱粉、短鎖アミロース（DP17）、アミロ
ペクチン（トウモロコシ製）、グリコーゲン（カ
キ製）各20mgに、アミラーゼを６×10^-3単位加
え、全量２mlとし、PH７、40℃で、３日間反応を
おこなつた。反応後、糖化液の糖組成を液体クロ
マトグラフ法により測定した結果は、第２表に示
す通りであつた。

【表】実施例３ DE5.81の液化ポテト澱粉各100mgに、トリス緩
衝液（PH7.0）0.04M、アミラーゼG2または麦芽
βアミラーゼを液化澱粉固形分ｇ当り、それぞれ
１、３、５、10、15、20、30単位を加え、60℃で
３日間反応を行つた。反応後、糖化液の糖組成を
分析した結果は、第２図に示す通りであり、β−
アミラーゼ（黒丸）に比べアミラーゼ（白丸）は
分解力が優れ、約２％マルトースの収量が高かつ
た。実施例４ DE1.43の液化澱粉１ｇに、アミラーゼ2Gを５
単位と、クレブシラニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）の生産するプルラナーゼ（ナガセ
生化学より入手することができる）を、１、２ま
たは３単位加え、PH７、55℃で３日間反応を行つ
た。反応後、糖化液の糖組成を分析した結果は第
３表に示す通りであつた。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G2の最適温度、最適PH、熱安定性とPH安定性を
示している。第２図は、DE5.81の液化ポテト澱
粉をアミラーゼG2と麦芽β−アミラーゼで糖化
したときの酵素量とマルトース生成率の関係を示
している。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有するバチルス属に属
する微生物由来の新規なアミラーゼG2。 (1) 作用：澱粉を、その非還元末端から切断し、
α−マルトースのみを生成する。マルトトリオ
ースの分解力が弱い。 (2) 最適PH：7.0〜7.5 (3) 最適温度：60℃ (4) 分子量：約60000