JPH0253034B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明は、新規なアミラーゼによるマルトース
の製造方法に関するものである。 〔従来技術〕 現在、マルトースは液化澱粉に植物、バシルス
起源のβ−アミラーゼを作用させるか、あるいは
アルペルギルス（Aspergillus）属などの微生物
の生産する糖化型α−アミラーゼを作用させるこ
とにより製造されている。これらの酵素はアミロ
ペクチンのα−１，６−グルコシド結合は分解す
ることができないため、アミロペクチンやこれを
含む液化澱粉からのマルトースの収量は、通常50
〜60％である。そして、これ以上に収量よくマル
トースを得るためには、α−１，６−グルコシド
結合を分解する、プルラナーゼやイソアミラーゼ
などのα−１，６−グルコシダーゼが併用され
る。 〔目的〕 本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生
成する新規なアミラーゼを求めて微生物の検索を
行つてきた結果、バシルス・メガテリウム
（Bacilus megaterium）と固定した細菌が澱粉
をその非還元性未端からマルトース単位で切断
し、α−マルトースを生成する新規なアミラーゼ
を生成することを認め、この酵素をアミラーゼ
G2と命名した。 本酵素と従来、マルトースを特異的に生成する
酵素として知られているβ−アミラーゼとの比較
は第１表に示す通りである。 両酵素の最も大きな違いは、β−アミラーゼが
β−マルトースを生成する加水分解を行うのに対
し、アミラーゼG2はα−マルトースを生成する
加水分解を行うことである。この切断様式の違い
のため、アミラーゼG2によりアミロペクチンま
たはこれを含む澱粉の糖化を行うとき、β−アミ
ラーゼに比べて２〜３％マルトース収量が高くな
ることがわかつた。しかし、この酵素はアミロペ
クチンのα−１，６−グルコシド結合を分解する
ことはできないため、澱粉からのマルトースの収
量は60％前後である。そして、これ以上に高い収
量でマルトースを得るためには、アミロペクチン
のα−１，６−グルコシド結合を分解するイソア
ミラーゼやプルラナーゼと併用する必要があつ
た。しかるに、本発明者は、先に発明した澱粉か
らマルトテトラオースを特異的に生成する新規な
アミラーゼG4（特許出願中）をアミラーゼG2と
併用して用いるとき、澱粉から70％以上の収量で
マルトースが得られることを認めた。本発明は、
この知見に基づいてなされたものである。

〔構成〕

本発明は、澱粉又はその派生物である液化澱粉
に、バシルス属細菌の生産するアミラーゼG2と
アミラーゼG4を作用させることを特徴とするマ
ルトースの製造方法に関するものである。 以下に、本発明の詳細を説明する。 先ず、本発明において使用されるアミラーゼ
G2とアミラーゼG4の酵素的性質を記載する。 (A) アミラーゼG2の酵素的性質 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリ
コーゲンのα−１，４−グルコシド結合を、
その非還元性未満からマルトース単位で加水
分解する。生成糖はα−マルトースであるこ
とからα−アミラーゼの一種と考えられる
が、エンド型の分解作用を示さず、アミロペ
クチン、グリコーゲンからはリミツトデキス
トリンを残す。サイクロデキストリンを分解
せず、またマルトトリオースの分解力も弱
い。生成糖がα−型であることを除けば、植
物や細菌のβ−アミラーゼに似ているが、ア
ミロペクチンやこれを含む澱粉に対する分解
限度は２〜３％高い。 (2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約60℃で
ある（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適PH；約３〜約11の広い
PH範囲に作用する。最適PHは約７〜7.5であ
る（0.05Mリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の
下で作用、（第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）
の下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱ま
では失活が認められない。60℃10分間の加熱
で約10％失活し、65℃10分間の加熱で約70％
失活し、そして、60℃10分間の加熱で90％以
上失活した（第１図ｃ）。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下、室温（30℃）
で３時間放置後、残存活性を測定した。その
結果、PH4.5〜８の範囲で安定であつた（第
１図ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンによる熱安定性
の増加は認められなかつた。 (7) 阻害剤；本酵素は、１×10^-3MのHgCl₂、
AgNO₃、CuSO₄、NiSO₄により、それぞれ
約85％、約75％、約70％、約60％阻害され
た。また、１×10^-3Mのｐ−クロロマーキユ
リベンゾエートにより約70％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養液の上澄か
ら、硫安分画、DEAE−セフアロースカラム
クロマトグラフイー、同カラムによる再クロ
マトグラフイーとバイオゲルA0.5ｍによる
カラムクロマトグラフイーにより、デイスク
電気泳動的に均一まで精製することができ
る。 (9) 分子量；セフアデツクスＧ−200により測
定した分子量は約60000であつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液に溶解さ
せた２％可溶性澱粉0.5mlに、適量の酵素を
加え、水で全量１mlとし、40℃で反応させ
る。この条件で、１分間に1μモルのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素量を１
単位とした。 以上の酵素的性質について、従来、知られて
いる植物起源のβ−アミラーゼ及びバシルス属
のβ−アミラーゼはβ−マルトースのみを生成
するのに対し、アミラーゼG2はα−マルトー
スのみを生成する。バシルス ステアロサーモ
フイラス（Bacillus stearothermophilus）の
アミラーゼはアミラーゼG2と同様に、α−マ
ルトースを生成するが、反応初期には、マルト
テトラオースやマルトトリオース、及び微量の
マルトヘキサオースやマルトペンタオースを生
成すると報告されている。従つて、これら酵素
はアミラーゼG2とは本質的に異なつた酵素と
いうことができる。また、最適PH、最適温度、
分子量などの性質においても差が認めらること
から、アミラーゼG2は新規な酵素ということ
ができる。 (B) アミラーゼG4の酵素的性質 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリ
コーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラ
オースを主成分とする分解物に分解する。本
酵素はエンド型の分解様式を持つα−アミラ
ーゼの一種であり、液化澱粉に作用すると
き、約65〜75％の収量でマルトテトラオース
が得られる。 (2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約50℃で
ある（第２図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適PH；約４〜約12の広い
範囲に作用する。最適作用PHは約６〜8.5で
ある（0.05M酢酸またはリン酸緩衝液、１％
可溶性澱粉の下で作用、（第２図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.1Mトリス緩衝液（PH7.0）の
下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱で約
40％失活し、55℃、10分間の加熱で約85％失
活した〔第２図ｃ〕。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下で、室温（25
℃）で３時間放置後、残存活性を測定した。
その結果、PH６〜９の範囲で安定であつた
〔第２図ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンが存在すると
き、熱安定性の増加は認められた〔第２図ｃ
の破線〕。 (7) 阻害剤；本酵素は、５×10^-3MのHgCl₂、
CuSO₄、ZnSo₄、AgNO₃、により、それぞ
れ約100％、約95％、約50％、約30％阻害さ
れた。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上
澄液から、硫安分画、DEAE−セフアロース
（Sepharose）カラムクロマトグラフイーと
バイオゲル（Biogel）、A0.5ｍカラムクロマ
トグラフイー及び同ゲルによる再クロマトグ
ラフイーにより、電気泳動的に均一まで精製
することができる。 (9) 分子量；バイオゲル（Biogel）A0.5ｍを
用いたゲル濾過法により測定した分子量は約
１万であつた。 (10) 力価測定法；0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に溶解させた２％可溶性澱粉0.5mlに、適量
の酵素を加え、水で全量１mlとし、40℃で反
応させる。この条件で、１分間に1μモルの
グルコースに相当する還元力を生成する酵素
量を１単位とした。 以上の酵素的性質について、シユードモナス
スツツツエリのマルトテトラオース生成アミラ
ーゼと比較すると(1)最適作用PHは、アミラーゼ
G4はPH６〜8.5の広いPH範囲にあるのに対し、
シユードモナス スツツツエリの酵素はPH８付
近にあること、(2)アミラーゼG4を澱粉に作用
させたとき、約65〜70％の収量でマルトテトラ
オースを得られるのに対し、シユードモナナ
スツツツエリの酵素の場合は約55％であるこ
と、(3)アミラーゼG4の分子量は１万前後にあ
るのに対し、シユードモナス スツツツエリの
酵素は、48000と58000にある〔バイオケミスト
リーアンドバイオフイジツクス アクタ
（Biochemistry and Biophysics Acta）566
巻、88頁（1979）〕など、アミラーゼG4とシユ
ードモナス スツツツエリの酵素とは、澱粉か
らのマルトテトラオースの収量、最適作用PH、
分子量などの性質において顕著な違いのあるも
のであり、新規な酵素ということができる。 アミラーゼG2を生産する例示菌としては、バ
シルス メガテリウム（Bacillus megaterium）
Ｇ−２を挙げる。この菌株は微工研菌寄第7978号
として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。また、アミラーゼG4を生産する例
示菌として、バシルス サーキユランス
（Bacillus circilans）G4を挙げる。この菌株は微
工研菌寄第820号として、微生物工業技術研究所
に寄託されている。これら微生物の菌学的性質は
下記に示す通りである。 (A) アミラーゼG2生産菌の菌学的性質 (1) 形態；巾0.7〜1.3×2.4〜5.0μ、通常２個以
上連なり、短鎖状に生成する。グラム陰性。 (2) 胞子；両末端近くに２個。胞子をもつ細胞
のふくらみは殆んど認められない。 (3) 生育；好気的に生育。嫌気下では殆もど生
育は認められない。 (4) 肉汁；混濁、沈降する。 (5) 肉汁寒天；生育良好、表面なめらか、淡褐
色を示すが、色素の生成なし。 (6) グルコース肉汁寒天；肉汁培地よりよく生
育する。 (7) グルコース硝酸塩寒天；よく生育する。表
面なめらか。淡褐色を示す。 (8) チロシン寒天；褐色色素を生成する。 (9) グルコース・アスパラギン寒天；かなりよ
く生育する。 (10) ポテト；生育良好、表面なめらかで、淡褐
色を示す。培地中に褐色色素を生成する。 (11) クエン酸の利用；陽性。 (12) 澱粉の加水分解；陽性。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) ゼラチン：分解する。 (15) ミルク；凝固し、ペプトン化する。 (16) 硝酸塩の還元；陽性。 (17) カタラーゼ；陽性。 (18) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ
−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−ソルビトール、マルトース、
蔗糖などを利用し、いずれもガスを生成する
ことなく生酸する。 (19) 最適生育温度；40℃前後。 (20) 最高生育温度；約50℃。 (21) 死滅温度；100℃、20分間の加熱でも死
滅しない。 以上の菌学的性質について、バージエイス
マニユアル オブ デタミネーテイブ バクテ
リオロジー（Bergey′sMannual of
Determinative Bacteriology）の第７版及び
第８版（ザ ウイリアムス アンド ウイルキ
ンス カンパニー（The Williams and
Wilkins Company）、1957年及び1974年）を参
照し、本菌をバシルス メガテリウム
（Bacillusmegaterium）の菌株と同定するのが
適当と考えられ、本菌株をバシルス メガテリ
ウムＧ−２と命名した。 (B) アミラーゼG4生産菌の菌学的性質 (1) 形態；桿菌、0.5〜１×５〜6μ、運動性な
し、グラム陰性。 (2) 胞子；通常、未端近くに１個、胞子嚢のふ
くらみは認められない。 (3) 肉汁；混濁、沈降する。 (4) 肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺
及び表面凹凸あり。 (5) グルコース肉汁寒寒天；生育良好、淡黄〜
淡褐色。 (6) グルコース硝酸寒天；生育悪い。 (7) ポテト；生育良好、乳白色に生育。 (8) グルコース・アスパラギン寒天；生育あま
り良くない。淡黄〜黄褐色。 (9) チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐
色。 (10) ミルク；ゆつくり凝固、ペプトン化。 (11) インドール；生成しない。 (12) カタラーゼ；生成する。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) 硫化水素；生成しない。 (15) クエン酸；利用する。 (16) 硝酸塩の還元；陰性。 (17) クエン酸；利用する。 (18) 食塩肉汁；８％食塩含有培地までよく生
育し10％食塩でも少し生育する。 (19) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アラビ
ノース、Ｄ−リボース、マルトース、シユー
クロス、澱粉などから酸を生成するが、ガス
の生成はない。Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノ
ース、Ｌ−ソルボースの利用性は良くない。 (20) 最適生育温度；26℃前後。 (21) 最高生育温度；約60℃ (22) 死滅温度；100℃、で30分間加熱しても
死滅しない。 以上の菌学的性質について、バージエイス
マニユアル オブ デタミネーテイブ バクテ
リオロジー（Bergey′s Mamnual of
Determinative Bacteriology）の第７版及び
第８版〔ザ ウイリアムス アンド ウイルキ
ンス カンパニー（The Williams and
Wilking Company）〕、（1957年及び1974年）
を参照し、本菌をバシルス サーキユランス
（Bacillus circulans）の一種と同定し、バシル
ス サーキユランスＧ−４と命名した。 アミラーゼG2及びアミラーゼG4を生産するた
めの培養は、通常、液体培地により通気、撹拌培
養より行われる。培地の窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、コーン
ステイープ リカー、大豆粕など、通常、微生物
の培養に際し、よく用いられる有機窒素源、及び
これに補足する窒素源として、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、硝酸塩などの無機窒素
源が用いられる。炭素源としては、澱粉、デキス
トリン、マルトース、グルコース、シユークロス
などが使用される。培養は、PH５〜９、温度20〜
60℃で好気的に行われる。 アミラーゼG2及びG4は、いずれも菌体外に生
産される酵母であるので、培養終了後、濾過また
は遠心分離により除菌し、上澄液を回収する。 培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムによる塩析によるか、ま
たは、アセトン、イソプロパノール、エタノー
ル、メタノールなどの有機溶剤を加えて、酵素を
沈澱物として収得し、乾燥、保存する。 アミラーゼG2及びアミラーゼG4を組合せて行
う澱粉の糖化反応は、次のようにして行う。 澱粉は、通常、あらかじめ酸または液化型α−
アミラーゼにより液化される。液化度はマルトー
スの収量に影響し、なるべく低DEであることが
望ましい。通常、DE5以下の液化澱粉が使用され
る。基質濃度は、通常５〜40％で行われ、反応
は、通常PH５〜８、温度は40℃〜60℃で行われ
る。アミラーゼG4はカルシウムイオンの存在に
より熱安定化されるので、糖化に際し、通常５×
10^-4〜２×10^-2M程度のカルシウム塩が添加され
る。 アミラーゼG2とアミラーゼG4は同時に澱粉に
作用させるのが望ましいが、あらかじめ、アミラ
ーゼG2で糖化し、反応途中でアミラーゼG4を添
加して反応を継続するか、あるいは、最初、アミ
ラーゼG4で反応を開始し、次いでアミラーゼG2
を添加して反応を行なう。 次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ (1) アミラーゼG2の生産 大豆タンパク２％、米ヌカ２％、
K₂HPO₄0.3％、MgSO₄・7H₂O0.1％、可溶性
澱粉２％、CaCl₂1×10^-3M、MnCl₂1×10^-4M、
CuSO₄2.5×10^-5M、FeCl₂2.5×10^-5M、ラウリ
ル硫酸ナトリウム2.5×10^-2％からなる培地
（PH7.0）30mlを200ml容三角フラスコに入れ、
120℃で15分間殺菌後、バシルス メガテリウ
ム（微工研菌寄第7978号）を接種し、30℃で３
日間振盤培養（160rpm）した。培養後、遠心
分離して得た上澄液について、生産されたアミ
ラーゼG2活性を測定した結果、培地１ml当り、
9.0単位であつた。 (2) アミラーゼG4の生産 ポリペプトン１％、リン酸２カリ0.3％、硫
酸マグネシウム（７水塩）0.1％、可溶性澱粉
１％からなる培地30mlを200容三角フラスコ
に入れ、120℃で10分殺菌したのち、バチルス
サーキユランスG4（微工研条寄第820号）を
接種し、30℃で４日間振盤培養（160rpm）し
た。 培養後、遠心分離して得た上澄液について、
生産されたアミラーゼG4を測定した結果、培
地１ml当り、6.4単位であつた。 バシルス・ズブチルスのα−アミラーゼを用い
て、常法により液化した、DE4.2のポテト液化澱
粉１ｇ（固形分として）に、アミラーゼG4を４
単位、又は／及びアミラーゼG2を４単位、
CaCl₂5×10^-3M量を加え、水で全量10mlとし、PH
７付近、50℃で20時間反応を行つた。反応後、糖
化糖中の糖組成を液体クロマトグラフイ法により
測量した。得られた結果は第２表に示す通りであ
つた。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G2の最適PH、最適温度、熱安定性とPH安定性を
示している。第２図ａ，ｂ，ｃとｄはそれぞれア
ミラーゼG4の最適PH、最適温度、熱安定性とPH
安定性を示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 澱粉又はその派生物に、バシルス属細菌の生
   産するアミラーゼG2とアミラーゼG4を作用させ
   ることを特徴とするマルトースの製造方法。