JPH0253035B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕 本発明は、バシルス属細菌の生産する新規なア
ミラーゼG2によるマルトースの製造方法に関す
るものである。 〔従来技術〕 澱粉からマルトースを生成する酵素として、植
物や微生物の生産するβ−アミラーゼ、あるいは
アスペルギルス オリーゼなどの糸状菌の生産す
るα−アミラーゼなど種々の酵素が知られてい
る。β−アミラーゼは、アミロースやアミロペク
チンの非還元性末端からβ−マルトースを規則的
に遊離する酵素であり、プルラナーゼ、インアミ
ラーゼなどのアミロペクチンの分岐結合（α−
１，６−グルコシド結合）を加水分解する酵素と
組合せて使用するとき、高い収量でマルトースを
製造することができる。一方、アスペルギルス属
などの糸状菌の生産するアミラーゼは、アミロー
スやアミロペクチンをエンド型で分解するため、
マルトースの他に、グルコース、マルトトリオー
ス、その他のオリゴ糖も多量副生する。 最近、H.OuttrupとB.E.Normanは、バシルス
ステアロサーモフイラス（Bacilus
stearothermophilus）の生産する新規なマルトー
ス生成酵素が澱粉の非還元性未端からキソ型で分
解し、α−マルトースを生成することを報告し
た。この酵素は、β−アミラーゼのように厳密に
マルトース単位で加水分解するものではなく、反
応初期には、マルトテトラオース（G4）、マルト
トリオース（G3）、マルトース（G2）の他に、
少量のマルトペンタオース（G5）やマルトヘキ
サオース（G6）も生成する。また、シヤーデイ
ンガー（Shardinger）デキストリンをマルトー
スとグルコースに分解し、マルトトリオースをマ
ルトースとグルコースに分解する。このため、こ
の酵素による澱粉分解物中には６〜８％のグルコ
ースが含まれる。 〔目的及び効果〕 本発明者は、澱粉からマルトースを特異的に生
成するアミラーゼ生産菌を求めて、広く微生物の
検索を行つてきた結果、土壌中より分離し、バシ
ルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）と
同定した細菌が新規で、且つ耐熱性のマルトース
生成酵素を生産することを認めた。本発明者はこ
の酵素をアミラーゼG2と命名した。 本酵素は、澱粉を、その非還元性末満からマル
トース単位で加水分解すると考えられるが、生成
糖はα−型であることを、生成物の変旋光及びガ
スクロマトグラフによる分析により確認した。本
酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコシド
結合を分解することはできないため、リミツトデ
キストリンを残すが、アミロペクチンのマルトー
スへの分解率は、β−アミラーゼの場合に比べ
て、２〜３％程度高く、より分岐結合近くまで分
解できるものと考えられる。本発明は、この知見
に基づいてなされたものである。 〔構成〕 すなわち、本発明は、バシルス属細菌の生産す
る新規なアミラーゼG2を、アミロース、アミロ
ペクチン、澱粉、又はこれらの部分分解物に作用
させることを特徴とするアミラーゼG2によるマ
ルトースの製造方法に関するものである。 以下に、本発明をより詳しく説明する。 本発明の酵素の性質の詳細は下記の示す通りで
ある。 (1) 作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンのα−１，４−グルコシド結合を、その
非還元性末端からマルトース単位で加水分解す
る。生成糖はα−マルトースであることからα
−アミラーゼの一種と考えられるが、エンド型
の分解作用を示せず、アミロペクチン、グリコ
ーゲンからはリミツクデキストリンを残す。サ
イクロデキストリンを分解せず、またマルトト
リオースの分解力も弱い。生成糖がα−型であ
ることを除けば、植物や細菌のβ−アミラーゼ
に似ているが、アミロペクチンやこれを含む澱
粉に対する分解限度は２〜３％高い。 (2) 作用温度範囲及び最適温度；１％可溶性澱
粉、0.05Mリン酸緩衝液の下で作用させたと
き、約75℃まで作用し、最適温度は約60℃であ
る（第１図ａ）。 (3) 作用PH範囲及び最適PH；約３〜約11の広いPH
範囲に作用する。最適PHは約７〜7.5である
（0.05Mリン酸緩衝液、１％可溶性澱粉の下で
作用、（第１図ｂ）。 (4) 熱安定性；0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）の
下で加熱した場合、50℃、10分間の加熱までは
失活が認められない。60℃ 10分間の加熱で約
10％失活し、65℃ 10分間の加熱で約70％失活
し、そして、60℃ 10分間の加熱で90％以上失
活した（第１図ｃ）。 (5) PH安定性；0.1M緩衝液の下、室温（30℃）
で３時間放置、残存活性を測定した。その結
果、PH4.5〜８の範囲で安定であつた（第１図
ｄ）。 (6) 安定化；カルシウムイオンによる熱安定性の
増加は認められなかつた。 (7) 阻害剤；本酵素は、１×10^-3のＭのHgCl₂、
AgNO、CuSO₄、NiSO₄により、それぞれ約85
％、約75％、約70％、約60％阻害された。ま
た、１×10^-3Mのｐ−クロロマーキユリベンゾ
エートにより約70％阻害された。 (8) 精製方法；本酵素は、液体培養液の上澄か
ら、硫安分画、DEAE−セフアロース カラム
クロマトグラフイー、同カラムによる再クロマ
トグラフイーとバイオゲルA0.5ｍによるカラ
ムクロマトグラフイーにより、デイスク電気泳
動的に均一まで精製することができる。 (9) 分子量；セフアデツクスＧ−200により測定
した分子量は約60000であつた。 (10) 力価測定法：0.1Mリン酸緩衝液に溶解させ
た２％可溶性澱粉0.5ｍに、適量の酵素を加
え、水で全量１mlとし、40℃で反応させる。こ
の条で、１分間に1μモルのグルコースに相当
する還元力を生成する酵素量を１単位とした。 以上の酵素的性質について、本発明以前に知ら
れている。植物起源のβ−アミラーゼ、バシルス
属細菌のβ−アミラーゼ及びバシルス ステアロ
サーモフイラスのマルトース生成アミラーゼと比
較した結果、第１表に示す通りである。 すなわち、植物系β−アミラーゼ及びバシルス
属のβ−アミラーゼはβ−マルトースのみを生成
するのに対し、本発明の酵素はα−マルトースの
みを生成する。バシルス ステアロサーモフイラ
スのアミラーゼは、本発明の酵素と同様、α−マ
ルトースを生成するが、反応初期には、マルトテ
トラオースやマルトトリオース及び微量のマルト
ヘキサオースやマルトペンタオースを生成すると
報告されている。従つて、これら酵素は本発明の
酵素とは本質的に異なつている。また、最適PH、
最適温度、分子量などの酵素的性質においても差
が認められることから、本発明の酵素は新規な酵
素ということができる。 本発明の酵素を生産する例示菌として、バシル
スメガテリウム（Bacillus megaterium）を挙げ
る。本菌の菌学的性質は下記に示す通りであり、
微工研菌寄第7978号として、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。 (1) 形態；巾0.7〜1.3×2.4〜5.0μ、通常、２個以
上連になり、短鎖状に生成する。グラム陰性。 (2) 胞子；両末端近くに２個。胞子をもつ細胞の
ふくらみは殆んど認められない。 (3) 生育；好気的に生育。嫌気下では殆んど生育
は認められない。 (4) 肉汁；混濁、沈降する。 (5) 肉汁寒天；生育良好、表面なめらか、淡褐色
を示すが、色素の生成なし。 (6) グルコース肉汁寒天；肉汁培地よりよく生育
する。 (7) グルコース硝酸塩寒天；よく生育する。 (8) チロシン寒天；褐色色素を生成する。

【表】 (9) グルコース・アスパラギン寒天；かなりよく
生育する。 (10) ポテト；生育良好、表面なめらかで、淡褐色
を示す。培地中に褐色色素を生成する。 (11) クエン酸の利用；陽性。 (12) 澱粉の加水分解；陽性。 (13) アセチルメチルカルビノール；生成しな
い。 (14) ゼラチン；分解する。 (15) ミルク；凝固し、ペプトン化する。 (16) 硝酸塩の還元；陽性。 (17) カタラーゼ；陽性。 (18) 炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−ソルビトール、マルトース、蔗糖など
を利用し、いずれもガスを生成することなく生
産する。 (19) 最適生育温度；40℃前後。 (20) 最高生育温度；約50℃。 (21) 死滅温度；100℃、20分間の加熱でも死滅
しない。 以上の菌学的性質について、バージエイス マ
ニユアル オブ デタミネーテイブ バクテリオ
ロジー（Bergey'sMamnual of Determinative
Bacteriology）の第７版及び第８版（ザ ウイ
リアムス アンド ウイルキンス カンパニー
（The Williams and Wilkins Company）、1957
年及び1974年）を参照し、本菌をバシルス、メガ
テリウム（Bacillus megaterium）Ｇ−２と命名
した。 バシルス メガテリウムG2を培養して、アミ
ラーゼG2を生産するための一般的培養は、次の
ようにして行われる。 培養は、通常、液体培地による通気、撹拌培養
により行われる。窒素源としては、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、カゼイン、コーン ステイ
ープ、リカー、大豆粕など、通常、微生物の培養
に際し、よく用いられる有機窒素源、あるいはこ
れに補足する窒素源として、塩化アンモン、リン
酸アンモン、硝酸塩などの無機窒素源が用いられ
る。炭素源としては、澱粉、デキストリン、マル
トース、グルコース、シユークロスなどが使用さ
れる。培養はPH５〜９、温度20〜60℃で好気的に
行われる。 アミラーゼG2は、菌体外に生産される酵素で
あるので、培養終了後、濾過または心分離により
除菌し、上澄液を回収する。 培養上澄液は、必要により濃縮し、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムなどにより塩析による
か、または、アセトン、イソプロパノール、エタ
ノール、メタノールなどの有機溶媒を加えて、酵
素を沈澱物とて収得し、乾燥、保存する。 アミラーゼG2を用いて、澱粉を糖化する反応
は、次のようにして行う。 澱粉は、先ず、酸または澱粉液化酵素α−アミ
ラーゼにより液化される。澱粉の液化度（DE）
は、マルトースの収量に著しく影響し、液化度の
小さい液化澱粉を使用する方が収量よくマルトー
スが得られる。（DEは固形分中の還元力をグルコ
ースとして表わした百分率）。基準濃度は、通常、
５〜40％、反応PHは５〜８、温度は50〜60℃で行
われる。 本酵素はアミロペクチンのα−１，６−グルコ
シド結合を分解することができないので、アミロ
ペクチン、あるいはこれを含む澱粉又はその派生
物を基質として用いるときには、α−１，６−グ
ルコシド結合を分解するイソアミラーゼやプルラ
ーゼなどのα−１，６−グルコシダーゼの存在下
で反応を行うと、糖化反応を促進し、収量よくマ
ルトースを製造することができる。 次に、実施例により、本発明の詳細を説明す
る。 実施例 １ 大豆タンパク２％、米ぬか２％、K₂HPO₄0.3
％、MgSO₄・7H₂O0.1％、可溶性澱粉２％、
CaCl₂1×10^-3M、MnCl₂×１×10^-4M、
CuSO₄2.5×10^-5M、FeCl₂2.5×10^-5M、ラウリル
硫酸ナトリウム2.5×10^-2％からなる培培地（PH
7.0）30mlを200ml容三角フラスコに入れ、120℃
で15分間殺菌後、バシルス メガテリウム（微工
研菌寄第7978号）を接種し、30℃で３日振盪培養
（160rpm）した。培養後、遠心分離して得た上澄
液について、生産されたアミラーゼG2活性を測
定した結果、培地１ml当り、9.0単位であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られた培養上澄液に、硫酸アンモ
ニウムを80％飽和になるように加え、生成した沈
澱物を遠心分離機により回収し、水に溶解、１×
10^-3MのＬ−システインを含む蒸留水に対し、一
夜透析したものを澱粉糖化用酵素液として使用し
た。酵素の回収率は約28％であつた。 DE1.83、5.81、8.05と12.6の液化デンプン各100
mgに、アミラーゼG2を１単位加え、全量１mlと
し、55℃で３日間反応を行つた。反応後、糖化液
の糖組成を液体クロマトグラフ法により分析した
結果は第２表に示す通りであつた。

【表】 実施例 ３ 実施例４で得られた培養上澄液に硫安を８％飽
和になるように添加し、生成した沈澱物を遠心分
離機により回収し、水に溶解、１×10^-3MのＬ−
システインを含む蒸留水に対し、一夜透析したも
のを澱粉糖化用酵素液とした酵素の回収率は約82
％であつた。） 可溶性澱粉、短鎖アミロース（DP17）、アミロ
ペクチン（トウモロコシ製）、グリコーゲン（カ
キ製）各20mgに、アミラーゼを６×10^-単位加え、
全量２mlとし、PH７、40℃で、６日間反応をおこ
なつた。反応後、糖化液の糖組成を液体クロマト
グラフ法により測定した結果は、第３表に示す通
りであつた。

【表】 実施例 ４ DE1.43の液化澱粉１ｇに、アミラーゼ2Gを５
単位と、クレブシラ ニユーモニア（Klebsiella
pneumoniae）の生産するプリラナーゼ（ナカゼ
生化学社製）を、１、２または３単位加え、PH
７、55℃で３日間反応を行つた。反応後、糖化液
の糖組成を分析した結果は第４表に示す通りであ
つた。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図ａ，ｂ，ｃとｄは、それぞれアミラーゼ
G2の最適温度、最適PH、熱安定性とPH安定性を
示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バシルス属細菌の生産するアミラーゼG2を、
   アミロース、アミロペクチン、澱粉、または、こ
   れらの部分分解物に作用させることを特徴とする
   アミラーゼG2によるマルトースの製造法。