JPH0140840B2 - - Google Patents
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- JPH0140840B2 JPH0140840B2 JP56040651A JP4065181A JPH0140840B2 JP H0140840 B2 JPH0140840 B2 JP H0140840B2 JP 56040651 A JP56040651 A JP 56040651A JP 4065181 A JP4065181 A JP 4065181A JP H0140840 B2 JPH0140840 B2 JP H0140840B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
- C07F9/3808—Acyclic saturated acids which can have further substituents on alkyl
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
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- C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は新規な生理活性物質およびその製造法
に関する。 本発明者らは、有用な医薬品またはその中間体
となり得る新規生理活性物質を提供するという目
的のもとに、天然界より入手した数多くの微生物
の生産物について研究を行つた。その結果、放線
菌に属する微生物の培養物中に降圧作用を有する
生理活性物質が生産される事実を見出した。つい
で、該培養物から該物質を単離、精製し、その理
化学的性質を調べたところ新規生理活性物質であ
ることが判明した。以下該物質をＫ−26と称し、
その物性ならびにその製造法について詳述する。 本発明の生理活性物質の生産には、放線菌に属
する微生物が用いられる。具体的に好適な一例と
して本発明者らが静岡県沼津市門池の土手の土壌
試料より単離したＫ−26株があげられる。以下
に、シアーリング等により、Intern.J.Syst.
Bacteriol.16 313−340（1966）に詳述された方
法にしたがつて得られた上記菌株の培養、生理
的、形態的特徴を記述する。 各種培地上での生育状態 各種培地上で28℃で、２週間培養したときの生
育および色の特徴を下記に示す。なお、色の表示
はColor Harmony Manual（Container
Corporation of America）による色の分類に従
つた。 １ シユクロース・硝酸塩寒天培地 生育：不良 ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：不良 ３ グルセロール・アスパラギン寒天培地 （ISP ５号） 生育：不良 ４ グリセロール・カルシウムマレイト寒天培地 生育：不良 ５ 卵・アルブミン寒天培地 生育：不良 ６ スターチ・無機塩寒天培地（ISP4号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6na） 基生菌糸の裏面の色：ブライト・コーラ
ル・ローズ（6ia） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ７ 栄養寒天培地 生育：貧弱ないし普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ブライト・シ
エル・ピンク（6ea）からブライト・ピー
チ（5ia） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ８ 酵母エキス・麦芽エキス寒天培地 （ISP2号） 生育：貧弱ないし普通、粒状 基生菌糸の表面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6na）からトマト・レツド
（６1/2pe） 基生菌糸の裏面の色：コーラル・レツド
（6nc）からダーク・ラクウエル・レツド
（6pe） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ９ オートミール寒天培地（ISP3号） 生育：良好、平滑 基生菌糸の表面・裏面の色：チヤイニー
ズ・レツド（6pc） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 10 グルコース・酵母エキス寒天培地 生育：普通ないし良好、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ブライト・コ
ーラル・レツド（6pa）からトマト・レツ
ド（６1/2pa） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 11 ベネツト氏寒天培地 生育：普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：アプリコツト
（4ga）からチヤイニーズ・レツド（6pd） 気中菌糸：貧弱、白色(a) 可溶性色素：なし 12 エマーソン氏寒天培地 生育：貧弱ないし普通 基生菌糸の表面の色：チヤイニーズ・レツ
ド（6pc） 基生菌糸の裏面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6pa） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 13 ヒツキー・トレスナー氏寒天培地 生育：普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ライト・チエ
リー・レツド（6la）からチヤイニーズ・
レツド（6pc） 気中菌糸：貧弱、白色(a) 可溶性色素：なし 14 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地（ISP6
号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面の色：ブライト・ピーチ
（5ia）からブライト・オレンジ（5na） 基生菌糸の裏面の色：ピーチ（5ga） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 15 チロジン寒天培地（ISP7号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面・裏面の色：フレツシユピ
ンク（5ca）からブライト・オレンジ
（5na） 生理的性質 Ｋ−26菌株の生理的諸性質を以下に示す。温
度、ゼラチン、ミルクおよび繊維素に対する作用
以外のものについては28℃で２週間後の観察結果
を、そして温度は５日後、ミルク、ゼラチンおよ
び繊維素については、４週間後の結果を記述す
る。なお、本菌株はプリドハム―ゴツトリーブの
無機培地（ISP9号）では生育しないので、ルー
デマンの培地（N.Y.Acad.Sci，33 207，1971）
で炭素源の資化性の試験を行つた。 １ 炭素源の資化性：Ｄ―キシロース、Ｄ―グル
コース、Ｄ―フラクトース、Ｄ―ガラクトー
ス、スターチをよく資化するが、Ｄ―アラビノ
ース、イノシトール、Ｌ―ラムノース、グリセ
ロール、Ｄ―ラクトース、α―メリビオースを
資化しない。ラフイノース、マンニトール、マ
ンノースの資化性は弱い。 ２ ゲラチンの液化作用：なし ３ ミルクに対する作用：凝固も液化もしない。 ４ 繊維素の分解作用：なし ５ 澱粉の加水分解作用：あり ６ 至適生育PH：6.5〜7.8 ７ 至適生育温度：28℃〜37℃ ８ チロシナーゼの生成：なし ９ メラノイド色素の生成：なし 細胞壁組成 細胞壁中のアミノ酸としてメソジアミノピメリ
ン酸、アラニンおよびグルタミン酸を含有する
が、LL―ジアミノピメリン酸およびグリシンを
含まない。一方、Lechevalierらの方法（The
Actinomycetales，Gustav Fister Verlag.
Jena.311−316頁 1970年）で全菌体中の糖を分
析すると、リボース、グルコース、ガラクトー
ス、マジユロースと若干のマンノースが検出され
るが、アラビノースおよびキシロースは検出され
ない。Leche―valierらの分類（Intern，J.
System.Bacteriol.20 435−443，1970）によれ
ば、Ｋ−26菌株の細胞壁は型であり、全菌体中
の糖はＢパターンとなる。 形態的性質 シユクロース・硝酸塩寒天培地、グルコース・
アスパラギン寒天培地など合成培地では本菌株は
極めて貧弱な生育しか示さないが、グルコース・
酵母エキス寒天培地、オートミール寒天培地など
の天然培地では旺盛な生育を示す。その基生菌糸
は比較的長く、また分枝も見られ、0.4〜0.6μmの
直径を有する。明瞭な菌糸の分裂は見られない。
一方ベネツト氏寒天培地およびヒツキー・トレス
ナー氏寒天培地で形成される気中菌糸は、白色を
呈し、よく伸長し、0.6〜0.8μmの直径を有し、隔
壁は認められない。本菌株は使用された培地の範
囲では、基生菌糸および気中菌糸上に胞子あるい
は胞子嚢を形成しなかつた。また菌核の形成も認
められなかつた。 以上狭い直径を有した比較的長い基生菌糸、気
中菌糸を形成することから、Ｋ−26菌株は放線菌
（アクチノミセーテ）に属する菌株である。細胞
壁組成が．Ｂ型であるからして、アクチノマデ
ユラ（Actinomadura）、ミクロバイスポラ
（Microbispora）、ストレプトスポランギウム
（Streptosporangium）、スピリロスポーラ
（Spirillospora）、プラノモノスポラ
（Planomonospora）などの属のどれかに分類す
ることもできるが、胞子あるいは胞子嚢が存在し
ないが故に新しい属に分類される可能性も否定で
きず、本菌株は放線菌（アクチノミセーテ）の一
種として、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄5889号で寄託されている。また、米国の
ARSカルチヤー・コレクシヨンにNRRL12379と
して寄託されている。 本菌株は、他の放線菌の場合にも見られるごと
く、例えば紫外線、Co60照射、エツクス線、種々
の変異誘起薬品などを用いる人工的変異手段で変
異し得るものであり、このような変異性があつて
もＫ−26物質の生産能をもつ株は、すべて本発明
において使用できるものである。 Ｋ−26生産菌株の培養 本発明のＫ−26生産菌株の培養においては通常
の放線菌の培養法が一般に用いられる。 炭素源としてはグルコース、デン粉、マンノー
ス、フラクトース、シユクロース、糖蜜などが単
独または組合わせて用いられる。さらに菌の資化
性によつては炭化水素、アルコール類、有機酸な
ども用い得る。無機および有機窒素源としては塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸
アンモニウム、硝酸ナトリウムなどが、また天然
窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、大豆粉、
カザミノ酸、ソリユブル、ベジタブル・プロテイ
ンなどが単独または組合わせて用いられる。その
ほか、必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシ
ウム、燐酸塩などの無機塩類を加えるほか、本菌
株の生育やＫ−26の生産を促進する有機物や無機
物を適宜添加することができる。 培養法としては、液体培養、とくに深部撹拌培
養法が最も適している。培養温度は25〜40℃、PH
は中性付近で培養することが望ましい。液体培養
で通常３日ないし５日培養を行なうと、Ｋ−26が
培養液中に生成蓄積される。培養液中の蓄積量が
最大に達したときに培養を停止し菌体を別して
得られる培養液中より目的物質を単離、精製す
る。 Ｋ−26の単離、精製 培養液からのＫ−26の単離、精製には、微生
物代謝産物をその培養液から単離するために通
常用いられる方法が利用される。Ｋ−26は後述す
るように水溶性酸性物質であるので、これらの性
質を利用した精製法が用いられる。 すなわち、活性炭、ダイヤイオンHP−10など
による吸脱着、各種陰イオン交換樹脂によるカラ
ムクロマトグラフイー、セルロースカラムクロマ
トグラフイー、シリカゲルカラムクロマトグラフ
イー、QAE―セフアデツクスカラムクロマトグ
ラフイー、DEAE―セフアデツクスＡ−25カラム
クロマトグラフイー、セフアデツクスLH−20カ
ラムクロマトグラフイーなどの方法を適当に組み
合わせて用いることができる。次にその一例を示
す。 培養液を塩酸でPH３に調整したあと、ダイヤ
イオンHP−10を充填したカラムに通塔する。Ｋ
−26を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、50％
のメタノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画
分を集め減圧下でメタノールを留去した後、２規
定水酸化ナトリウムでPH7.0に調整し、ダイヤイ
オンHPA−10（Cl-）のカラムに通塔する。Ｋ−
26を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、１モル
の食塩水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画分を集
め、２規定塩酸で再度PH３に調整し、ダイヤイオ
ンHP−10を充填したカラムに通塔する。Ｋ−26
を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、50％のメ
タノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画分を
集め減圧下で濃縮した後、凍結乾燥を行なうこと
により粗粉末を得る。この粗粉末にセルロース粉
末を加えてよく混ぜ合わせたものを、あらかじめ
70％イソプロパノール水溶液で懸濁し、カラムに
つめたセルロースの上端に乗せ、同じく70％イソ
プロパノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画
分を集め減圧下で濃縮した後凍結乾燥を行う。こ
の凍結乾燥標品を0.15モル、PH7.5のリン酸バツ
フアーに溶かし、同バツフアーを用いて充填した
DEAE−セフアデツクスＡ−25のカラムの上端に
乗せる。 Ｋ−26を樹脂に吸着させた後、同バツフアーで
溶出する。Ｋ−26を含む画分を集め、２規定塩酸
でPH３に調整し、ダイヤイオンHP−10のカラム
に通塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後、十分
に水洗し、50％のメタノール水溶液で溶出する。
この溶出液を減圧下に濃縮して凍結乾燥を行な
い、部分精製粉末を得る。 この標品を50％メタノール水溶液中、セフアデ
ツクスLH−20カラムクロマトグラフイーにより
さらに精製する。Ｋ−26を含む画分を集め、減圧
下で濃縮した後凍結乾燥を行なう。 さらに、この乾燥標品にシリカゲルを加えてよ
く混ぜ合わせたものを、ｎ−ブタノール：ｎ―プ
ロパノール：水＝２：１：３の上層を用いて充填
したシリカゲルカラムの上端に乗せ、同一溶媒で
溶出する。Ｋ−26を含む画分を集め、減圧下で溶
媒を留去した後乾固させる。内容物を少量の水で
溶かし、不溶物を除去した後凍結乾燥を行なうと
Ｋ−26の白色粉末が得られる。 上記精製工程中のＫ−26の検出はライドンスミ
スおよびヨウ素反応に陽性で、ニンヒドリン陰性
を指標にして行なつた。かくして得られたＫ−26
の理化学的性質は以下に示す通りである。 Ｋ−26の理化学的性質 性状：白色無定形粉末。水溶液は酸性を示す。 融点：300℃まで明確な融点を示さず褐変する。 比旋光度：〔α〕20 D＝−4.8゜（Ｃ＝0.1，H2O） 溶解性：アルカリ性水に易溶、水に可溶、メタ
ノール、エタノールに難溶、酢酸エチル、ク
ロロホルム、ヘキサンなどに不溶 呈色反応：ライドンスミスおよびヨウ素の各反
応に陽性、ニンヒドリン、アンスロン、アニ
リン・ジフエニルアミン、エールリツヒ、ニ
トロプルシドの各反応に陰性 構成アミノ酸：6N塩酸、105℃、16時間の加水
分解後アミノ酸自動分析計によつてイソロイ
シン、チロシンおよび未同定アミノ酸を検出
した。 イソロイシン／チロシン／未同定アミノ酸の
モル比は１：１：１である。 未同定アミノ酸はプロリンとは異なる。 末端アミノ酸分析：ヒドラジン分解法によるＣ
−末端分析で上述の未同定アミノ酸を検出し
た。DNP化法によるＮ−末端分析ではＮ−
末端アミノ酸は検出されなかつた。 紫外部吸収スペクトル：第１図 λH2O nax＝278nm（Ｅ１％ １cm＝46） 281nm（Ｅ１％ １cm＝42，sh） 中性および酸性 λH2O nax＝294nm（Ｅ１％ １cm＝56.5） アルカリ性 赤外部吸収スペクトル（KBr）：第２図 PMRスペクトル（D2O）：第３図 CMRスペクトル：第４図（pD4.0で測定）マ
ススペクトル：Ｋ−26をビストリメチルシリル
トリフルオロアセトアミドとピリジンで処理し
て得られるヘキサトリメチルシリル誘導体のマ
ススペクトルはM+＝ｍ／Z967を示した。 分子量：535 分子式：C25H34N3O8P 以上の結果より、Ｋ−26は下記の式 で表される新規生理活性物質であることが判明し
た。 次に各種展開溶剤によるＫ−26の簿層クロマト
グラフイーのRf値を第１表および第２表に示す。
検出はライドンスミス反応により行なつた。
に関する。 本発明者らは、有用な医薬品またはその中間体
となり得る新規生理活性物質を提供するという目
的のもとに、天然界より入手した数多くの微生物
の生産物について研究を行つた。その結果、放線
菌に属する微生物の培養物中に降圧作用を有する
生理活性物質が生産される事実を見出した。つい
で、該培養物から該物質を単離、精製し、その理
化学的性質を調べたところ新規生理活性物質であ
ることが判明した。以下該物質をＫ−26と称し、
その物性ならびにその製造法について詳述する。 本発明の生理活性物質の生産には、放線菌に属
する微生物が用いられる。具体的に好適な一例と
して本発明者らが静岡県沼津市門池の土手の土壌
試料より単離したＫ−26株があげられる。以下
に、シアーリング等により、Intern.J.Syst.
Bacteriol.16 313−340（1966）に詳述された方
法にしたがつて得られた上記菌株の培養、生理
的、形態的特徴を記述する。 各種培地上での生育状態 各種培地上で28℃で、２週間培養したときの生
育および色の特徴を下記に示す。なお、色の表示
はColor Harmony Manual（Container
Corporation of America）による色の分類に従
つた。 １ シユクロース・硝酸塩寒天培地 生育：不良 ２ グルコース・アスパラギン寒天培地 生育：不良 ３ グルセロール・アスパラギン寒天培地 （ISP ５号） 生育：不良 ４ グリセロール・カルシウムマレイト寒天培地 生育：不良 ５ 卵・アルブミン寒天培地 生育：不良 ６ スターチ・無機塩寒天培地（ISP4号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6na） 基生菌糸の裏面の色：ブライト・コーラ
ル・ローズ（6ia） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ７ 栄養寒天培地 生育：貧弱ないし普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ブライト・シ
エル・ピンク（6ea）からブライト・ピー
チ（5ia） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ８ 酵母エキス・麦芽エキス寒天培地 （ISP2号） 生育：貧弱ないし普通、粒状 基生菌糸の表面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6na）からトマト・レツド
（６1/2pe） 基生菌糸の裏面の色：コーラル・レツド
（6nc）からダーク・ラクウエル・レツド
（6pe） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし ９ オートミール寒天培地（ISP3号） 生育：良好、平滑 基生菌糸の表面・裏面の色：チヤイニー
ズ・レツド（6pc） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 10 グルコース・酵母エキス寒天培地 生育：普通ないし良好、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ブライト・コ
ーラル・レツド（6pa）からトマト・レツ
ド（６1/2pa） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 11 ベネツト氏寒天培地 生育：普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：アプリコツト
（4ga）からチヤイニーズ・レツド（6pd） 気中菌糸：貧弱、白色(a) 可溶性色素：なし 12 エマーソン氏寒天培地 生育：貧弱ないし普通 基生菌糸の表面の色：チヤイニーズ・レツ
ド（6pc） 基生菌糸の裏面の色：ブライト・コーラ
ル・レツド（6pa） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 13 ヒツキー・トレスナー氏寒天培地 生育：普通、粒状 基生菌糸の表面・裏面の色：ライト・チエ
リー・レツド（6la）からチヤイニーズ・
レツド（6pc） 気中菌糸：貧弱、白色(a) 可溶性色素：なし 14 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地（ISP6
号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面の色：ブライト・ピーチ
（5ia）からブライト・オレンジ（5na） 基生菌糸の裏面の色：ピーチ（5ga） 気中菌糸：なし 可溶性色素：なし 15 チロジン寒天培地（ISP7号） 生育：貧弱、平滑 基生菌糸の表面・裏面の色：フレツシユピ
ンク（5ca）からブライト・オレンジ
（5na） 生理的性質 Ｋ−26菌株の生理的諸性質を以下に示す。温
度、ゼラチン、ミルクおよび繊維素に対する作用
以外のものについては28℃で２週間後の観察結果
を、そして温度は５日後、ミルク、ゼラチンおよ
び繊維素については、４週間後の結果を記述す
る。なお、本菌株はプリドハム―ゴツトリーブの
無機培地（ISP9号）では生育しないので、ルー
デマンの培地（N.Y.Acad.Sci，33 207，1971）
で炭素源の資化性の試験を行つた。 １ 炭素源の資化性：Ｄ―キシロース、Ｄ―グル
コース、Ｄ―フラクトース、Ｄ―ガラクトー
ス、スターチをよく資化するが、Ｄ―アラビノ
ース、イノシトール、Ｌ―ラムノース、グリセ
ロール、Ｄ―ラクトース、α―メリビオースを
資化しない。ラフイノース、マンニトール、マ
ンノースの資化性は弱い。 ２ ゲラチンの液化作用：なし ３ ミルクに対する作用：凝固も液化もしない。 ４ 繊維素の分解作用：なし ５ 澱粉の加水分解作用：あり ６ 至適生育PH：6.5〜7.8 ７ 至適生育温度：28℃〜37℃ ８ チロシナーゼの生成：なし ９ メラノイド色素の生成：なし 細胞壁組成 細胞壁中のアミノ酸としてメソジアミノピメリ
ン酸、アラニンおよびグルタミン酸を含有する
が、LL―ジアミノピメリン酸およびグリシンを
含まない。一方、Lechevalierらの方法（The
Actinomycetales，Gustav Fister Verlag.
Jena.311−316頁 1970年）で全菌体中の糖を分
析すると、リボース、グルコース、ガラクトー
ス、マジユロースと若干のマンノースが検出され
るが、アラビノースおよびキシロースは検出され
ない。Leche―valierらの分類（Intern，J.
System.Bacteriol.20 435−443，1970）によれ
ば、Ｋ−26菌株の細胞壁は型であり、全菌体中
の糖はＢパターンとなる。 形態的性質 シユクロース・硝酸塩寒天培地、グルコース・
アスパラギン寒天培地など合成培地では本菌株は
極めて貧弱な生育しか示さないが、グルコース・
酵母エキス寒天培地、オートミール寒天培地など
の天然培地では旺盛な生育を示す。その基生菌糸
は比較的長く、また分枝も見られ、0.4〜0.6μmの
直径を有する。明瞭な菌糸の分裂は見られない。
一方ベネツト氏寒天培地およびヒツキー・トレス
ナー氏寒天培地で形成される気中菌糸は、白色を
呈し、よく伸長し、0.6〜0.8μmの直径を有し、隔
壁は認められない。本菌株は使用された培地の範
囲では、基生菌糸および気中菌糸上に胞子あるい
は胞子嚢を形成しなかつた。また菌核の形成も認
められなかつた。 以上狭い直径を有した比較的長い基生菌糸、気
中菌糸を形成することから、Ｋ−26菌株は放線菌
（アクチノミセーテ）に属する菌株である。細胞
壁組成が．Ｂ型であるからして、アクチノマデ
ユラ（Actinomadura）、ミクロバイスポラ
（Microbispora）、ストレプトスポランギウム
（Streptosporangium）、スピリロスポーラ
（Spirillospora）、プラノモノスポラ
（Planomonospora）などの属のどれかに分類す
ることもできるが、胞子あるいは胞子嚢が存在し
ないが故に新しい属に分類される可能性も否定で
きず、本菌株は放線菌（アクチノミセーテ）の一
種として、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄5889号で寄託されている。また、米国の
ARSカルチヤー・コレクシヨンにNRRL12379と
して寄託されている。 本菌株は、他の放線菌の場合にも見られるごと
く、例えば紫外線、Co60照射、エツクス線、種々
の変異誘起薬品などを用いる人工的変異手段で変
異し得るものであり、このような変異性があつて
もＫ−26物質の生産能をもつ株は、すべて本発明
において使用できるものである。 Ｋ−26生産菌株の培養 本発明のＫ−26生産菌株の培養においては通常
の放線菌の培養法が一般に用いられる。 炭素源としてはグルコース、デン粉、マンノー
ス、フラクトース、シユクロース、糖蜜などが単
独または組合わせて用いられる。さらに菌の資化
性によつては炭化水素、アルコール類、有機酸な
ども用い得る。無機および有機窒素源としては塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸
アンモニウム、硝酸ナトリウムなどが、また天然
窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、大豆粉、
カザミノ酸、ソリユブル、ベジタブル・プロテイ
ンなどが単独または組合わせて用いられる。その
ほか、必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシ
ウム、燐酸塩などの無機塩類を加えるほか、本菌
株の生育やＫ−26の生産を促進する有機物や無機
物を適宜添加することができる。 培養法としては、液体培養、とくに深部撹拌培
養法が最も適している。培養温度は25〜40℃、PH
は中性付近で培養することが望ましい。液体培養
で通常３日ないし５日培養を行なうと、Ｋ−26が
培養液中に生成蓄積される。培養液中の蓄積量が
最大に達したときに培養を停止し菌体を別して
得られる培養液中より目的物質を単離、精製す
る。 Ｋ−26の単離、精製 培養液からのＫ−26の単離、精製には、微生
物代謝産物をその培養液から単離するために通
常用いられる方法が利用される。Ｋ−26は後述す
るように水溶性酸性物質であるので、これらの性
質を利用した精製法が用いられる。 すなわち、活性炭、ダイヤイオンHP−10など
による吸脱着、各種陰イオン交換樹脂によるカラ
ムクロマトグラフイー、セルロースカラムクロマ
トグラフイー、シリカゲルカラムクロマトグラフ
イー、QAE―セフアデツクスカラムクロマトグ
ラフイー、DEAE―セフアデツクスＡ−25カラム
クロマトグラフイー、セフアデツクスLH−20カ
ラムクロマトグラフイーなどの方法を適当に組み
合わせて用いることができる。次にその一例を示
す。 培養液を塩酸でPH３に調整したあと、ダイヤ
イオンHP−10を充填したカラムに通塔する。Ｋ
−26を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、50％
のメタノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画
分を集め減圧下でメタノールを留去した後、２規
定水酸化ナトリウムでPH7.0に調整し、ダイヤイ
オンHPA−10（Cl-）のカラムに通塔する。Ｋ−
26を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、１モル
の食塩水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画分を集
め、２規定塩酸で再度PH３に調整し、ダイヤイオ
ンHP−10を充填したカラムに通塔する。Ｋ−26
を樹脂に吸着させた後、十分に水洗し、50％のメ
タノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画分を
集め減圧下で濃縮した後、凍結乾燥を行なうこと
により粗粉末を得る。この粗粉末にセルロース粉
末を加えてよく混ぜ合わせたものを、あらかじめ
70％イソプロパノール水溶液で懸濁し、カラムに
つめたセルロースの上端に乗せ、同じく70％イソ
プロパノール水溶液で溶出する。Ｋ−26を含む画
分を集め減圧下で濃縮した後凍結乾燥を行う。こ
の凍結乾燥標品を0.15モル、PH7.5のリン酸バツ
フアーに溶かし、同バツフアーを用いて充填した
DEAE−セフアデツクスＡ−25のカラムの上端に
乗せる。 Ｋ−26を樹脂に吸着させた後、同バツフアーで
溶出する。Ｋ−26を含む画分を集め、２規定塩酸
でPH３に調整し、ダイヤイオンHP−10のカラム
に通塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後、十分
に水洗し、50％のメタノール水溶液で溶出する。
この溶出液を減圧下に濃縮して凍結乾燥を行な
い、部分精製粉末を得る。 この標品を50％メタノール水溶液中、セフアデ
ツクスLH−20カラムクロマトグラフイーにより
さらに精製する。Ｋ−26を含む画分を集め、減圧
下で濃縮した後凍結乾燥を行なう。 さらに、この乾燥標品にシリカゲルを加えてよ
く混ぜ合わせたものを、ｎ−ブタノール：ｎ―プ
ロパノール：水＝２：１：３の上層を用いて充填
したシリカゲルカラムの上端に乗せ、同一溶媒で
溶出する。Ｋ−26を含む画分を集め、減圧下で溶
媒を留去した後乾固させる。内容物を少量の水で
溶かし、不溶物を除去した後凍結乾燥を行なうと
Ｋ−26の白色粉末が得られる。 上記精製工程中のＫ−26の検出はライドンスミ
スおよびヨウ素反応に陽性で、ニンヒドリン陰性
を指標にして行なつた。かくして得られたＫ−26
の理化学的性質は以下に示す通りである。 Ｋ−26の理化学的性質 性状：白色無定形粉末。水溶液は酸性を示す。 融点：300℃まで明確な融点を示さず褐変する。 比旋光度：〔α〕20 D＝−4.8゜（Ｃ＝0.1，H2O） 溶解性：アルカリ性水に易溶、水に可溶、メタ
ノール、エタノールに難溶、酢酸エチル、ク
ロロホルム、ヘキサンなどに不溶 呈色反応：ライドンスミスおよびヨウ素の各反
応に陽性、ニンヒドリン、アンスロン、アニ
リン・ジフエニルアミン、エールリツヒ、ニ
トロプルシドの各反応に陰性 構成アミノ酸：6N塩酸、105℃、16時間の加水
分解後アミノ酸自動分析計によつてイソロイ
シン、チロシンおよび未同定アミノ酸を検出
した。 イソロイシン／チロシン／未同定アミノ酸の
モル比は１：１：１である。 未同定アミノ酸はプロリンとは異なる。 末端アミノ酸分析：ヒドラジン分解法によるＣ
−末端分析で上述の未同定アミノ酸を検出し
た。DNP化法によるＮ−末端分析ではＮ−
末端アミノ酸は検出されなかつた。 紫外部吸収スペクトル：第１図 λH2O nax＝278nm（Ｅ１％ １cm＝46） 281nm（Ｅ１％ １cm＝42，sh） 中性および酸性 λH2O nax＝294nm（Ｅ１％ １cm＝56.5） アルカリ性 赤外部吸収スペクトル（KBr）：第２図 PMRスペクトル（D2O）：第３図 CMRスペクトル：第４図（pD4.0で測定）マ
ススペクトル：Ｋ−26をビストリメチルシリル
トリフルオロアセトアミドとピリジンで処理し
て得られるヘキサトリメチルシリル誘導体のマ
ススペクトルはM+＝ｍ／Z967を示した。 分子量：535 分子式：C25H34N3O8P 以上の結果より、Ｋ−26は下記の式 で表される新規生理活性物質であることが判明し
た。 次に各種展開溶剤によるＫ−26の簿層クロマト
グラフイーのRf値を第１表および第２表に示す。
検出はライドンスミス反応により行なつた。
【表】
【表】
展開〓室温、上昇法
１〜３は５時間、４〜７は1.5時間 次にＫ−26の酸加水分解物中に含まれる未同定
アミノ酸の簿層クロマトグラフイーのRf値を、
イソロイシン、チロシンおよびプロリンのRf値
とともに第３表に示す。
１〜３は５時間、４〜７は1.5時間 次にＫ−26の酸加水分解物中に含まれる未同定
アミノ酸の簿層クロマトグラフイーのRf値を、
イソロイシン、チロシンおよびプロリンのRf値
とともに第３表に示す。
【表】
この未同定アミノ酸は簿層上でチロシンとは明
らかに分離しているが、プロリンとは近接してい
る。しかし、プロリンはニンヒドリン反応によつ
て黄色を呈するのに対し、未同定アミノ酸は紫色
を呈する。したがつて、両者は異なるアミノ酸と
考えることができる。 Ｋ−26の降圧作用を示す実験結果を次に示す。 実験：観血的方法による降圧作用の測定 本実験は津田恭介ら編：薬効の評価(1)薬理試験
法（中）（医薬品開発基礎講座Ｖ）地文書館（昭
和46年10月10日発行）464〜468頁記載の方法に準
じて行つた。 実験動物としてSpontaneously Hypertensive
Rats（SHR）（雄性、体重300〜400g）１群３匹を
用いた。該ラツトにウレタン600mg／Kgおよびα
−クロラロース60mg／Kgを腹腔内投与して麻酔し
た。気管カニユーレで気道を確保し、血圧を左頚
動脈に挿入したポリエチレンカニユーレから圧ト
ランスデユーサ（日本光電MP−0.5）を介してイ
ンクーオシログラフイーに記録した。 薬物は、投与容量が0.1ml／100gとなるように
生理食塩水に溶解し、右股静脈に挿入したカニユ
ーレから静脈内投与し、麻酔下での血圧変化を測
定した。 平均血圧の変化を第４表に示す。尚投与直前の
４例の平均血圧は143.5±21.3mmHg（平均値±標準
誤差）を示す。
らかに分離しているが、プロリンとは近接してい
る。しかし、プロリンはニンヒドリン反応によつ
て黄色を呈するのに対し、未同定アミノ酸は紫色
を呈する。したがつて、両者は異なるアミノ酸と
考えることができる。 Ｋ−26の降圧作用を示す実験結果を次に示す。 実験：観血的方法による降圧作用の測定 本実験は津田恭介ら編：薬効の評価(1)薬理試験
法（中）（医薬品開発基礎講座Ｖ）地文書館（昭
和46年10月10日発行）464〜468頁記載の方法に準
じて行つた。 実験動物としてSpontaneously Hypertensive
Rats（SHR）（雄性、体重300〜400g）１群３匹を
用いた。該ラツトにウレタン600mg／Kgおよびα
−クロラロース60mg／Kgを腹腔内投与して麻酔し
た。気管カニユーレで気道を確保し、血圧を左頚
動脈に挿入したポリエチレンカニユーレから圧ト
ランスデユーサ（日本光電MP−0.5）を介してイ
ンクーオシログラフイーに記録した。 薬物は、投与容量が0.1ml／100gとなるように
生理食塩水に溶解し、右股静脈に挿入したカニユ
ーレから静脈内投与し、麻酔下での血圧変化を測
定した。 平均血圧の変化を第４表に示す。尚投与直前の
４例の平均血圧は143.5±21.3mmHg（平均値±標準
誤差）を示す。
【表】
この結果Ｋ−26は降圧作用を有することがわか
る。 実施例 １ 種菌として放線菌Ｋ−26（微工研菌寄第5889号）
を用い、第１種培地としてグルコース１％、溶性
デンプン１％、牛肉エキス0.3％、酵母エキス0.5
％、バクトトリプトン0.5％、炭酸カルシウム0.2
％、（殺菌前PH7.2）の培地を用いた。種菌一白金
耳を50ml太型試験管に入れた上記種培地14mlに植
菌し、30℃で11日間振盪培養する。 この種培養液14mlを２容バツフル付きエルレ
ンマイヤーフラスコに入つた300mlの第２種培地
に植菌する。第２種培地の組成は第１種培地の組
成と同じである。第２種培養は30℃で４日間行な
う。この第２種培養液300mlを５容ジヤーフア
ーメンター中の第３種培地2.7に植菌する。第
３種培地の組成は第１種培地の組成と同じであ
る。５ジヤーフアーメンターによる種培養は通
気撹拌方式（回転数300rpm、通気量３／min）
により30℃で２日間行なう。この第３種培養液２
を30容のステンレス製ジヤーフアーメンター
中の主発酵培地16に植菌する。主発酵培地組成
は溶性デンプン４％、ソイビンミール３％、コー
ンスチープリカー0.5％、燐酸二カリウム0.05％、
硫酸マグネシウム（７水塩）0.05％、塩化カリウ
ム0.03％、炭酸カルシウム0.3％（殺菌前PH7.8）
である。この主発酵培養は30℃で５日間通気撹拌
方式（回転数350rpm、通気量18／min）によ
り行なう。 かくして得られた発酵終了液35（上記30ジ
ヤーフアーメンター２基分）のPHを濃硫酸で3.0
に調整し、過助剤としてラジオライト＃600（昭
和化学工業社製）を約1.5Kg加え、菌体を別す
る。得られた液35をダイヤイオンHP−10
（三菱化成社製）２を詰めたカラムに通塔する。
Ｋ−26を樹脂に吸着させた後水15でカラムを洗
滌し、50％のメタノール水溶液12で溶出する。
最初の２を捨てて残り10を全て集める。これ
を減圧下で５に濃縮し、２規定水酸化ナトリウ
ムでPH7.0に調整した後、ダイヤイオンHPA−10
（Cl-）（三菱化成社製）500mlを詰めたカラムに通
塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後３の水で
洗滌し、つづいて１モルの食塩水溶液３で溶出
する。溶出液を全て集め、２規定塩酸でPH3.0に
調整した後、500mlのダイヤイオンHP−10のカ
ラムに通塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後３
の水で洗滌し、50％のメタノール水溶液３で
溶出する。最初の500mlを捨てて、残りの2.5を
全て集める。これを減圧下で約１に濃縮し、凍
結乾燥を行なうと、Ｋ−26の粗粉末約20gが得ら
れる。この粗粉末に、ほぼ等量のセルロース粉末
（アビセル：フナコシ薬品社製）を加えてよく混
ぜ合わせたものを、１のセルロースカラム（ア
ビセル：70％イソプロパノール水溶液）の上端に
のせる。ついでこのカラムと同じく70％イソプロ
パノール水溶液で溶出する。溶出画分を18mlずつ
分取するとフラクシヨン番号34から66にＫ−26が
溶出される。この画分を集め減圧下で約100mlに
濃縮し、凍結乾燥を行なう。この凍結乾燥標品を
0.15モル、PH7.5の燐酸バツフアーに溶かし、同
バツフアーで緩衝化した１のDEAE−セフアデ
ツクスＡ−25のカラムの上端にのせる。Ｋ−26を
セフアデツクスに吸着させた後、同バツフアーで
溶出する。溶出画分を18mlずつ分取するとフラク
シヨン番号83から126にＫ−26が溶出される。こ
の画分を集め６規定塩酸でPH3.0に調整した後、
200mlのダイヤイオンHP−10のカラムに通塔す
る。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後１の水で洗滌
し、50％メタノール水溶液１で溶出する。溶出
液を全て集め減圧下で約100mlに濃縮して凍結乾
燥を行ない、Ｋ−26の部分精製粉末450mgを得る。
これを50％メタノール水溶液５mlに溶かし、セフ
アデツクスLH−20カラムクロマトグラフイー
（50％メタノール水溶液、カラムサイズ：2.3cm×
90cm）によりさらに精製する。溶出画分を４mlず
つ分取するとフラクシヨン番号45から68にＫ−26
が溶出される。この画分を集め、減圧下で約20ml
に濃縮した後凍結乾燥を行なう。さらにこの乾燥
標品にシリカゲル（ワコーゲル：Ｃ−200）1.5g
を加えてよく混ぜ合わせたものを、ｎ−ブタノー
ル：ｎ−プロパノール：水＝２：１：３の上層を
用いて充填したシリカゲルカラム（ワコーゲル：
Ｃ−200、カラムサイズ：21cm×90cm）の上端に
のせ、同一溶媒で溶出する。溶出画分を３mlずつ
分取するとフラクシヨン番号30から55にＫ−26が
溶出される。この画分を集め、減圧下で溶媒を留
去した後乾固させる。内容物を10mlの水に溶か
し、不溶物を除去したのち、凍結乾燥を行なうと
Ｋ−26の白色粉末15mgが得られる。尚上記精製工
程中Ｋ−26の検出は、ライドンスミスおよびヨウ
素反応に陽性で、ニンヒドリン陰性を指標として
行なつた。
る。 実施例 １ 種菌として放線菌Ｋ−26（微工研菌寄第5889号）
を用い、第１種培地としてグルコース１％、溶性
デンプン１％、牛肉エキス0.3％、酵母エキス0.5
％、バクトトリプトン0.5％、炭酸カルシウム0.2
％、（殺菌前PH7.2）の培地を用いた。種菌一白金
耳を50ml太型試験管に入れた上記種培地14mlに植
菌し、30℃で11日間振盪培養する。 この種培養液14mlを２容バツフル付きエルレ
ンマイヤーフラスコに入つた300mlの第２種培地
に植菌する。第２種培地の組成は第１種培地の組
成と同じである。第２種培養は30℃で４日間行な
う。この第２種培養液300mlを５容ジヤーフア
ーメンター中の第３種培地2.7に植菌する。第
３種培地の組成は第１種培地の組成と同じであ
る。５ジヤーフアーメンターによる種培養は通
気撹拌方式（回転数300rpm、通気量３／min）
により30℃で２日間行なう。この第３種培養液２
を30容のステンレス製ジヤーフアーメンター
中の主発酵培地16に植菌する。主発酵培地組成
は溶性デンプン４％、ソイビンミール３％、コー
ンスチープリカー0.5％、燐酸二カリウム0.05％、
硫酸マグネシウム（７水塩）0.05％、塩化カリウ
ム0.03％、炭酸カルシウム0.3％（殺菌前PH7.8）
である。この主発酵培養は30℃で５日間通気撹拌
方式（回転数350rpm、通気量18／min）によ
り行なう。 かくして得られた発酵終了液35（上記30ジ
ヤーフアーメンター２基分）のPHを濃硫酸で3.0
に調整し、過助剤としてラジオライト＃600（昭
和化学工業社製）を約1.5Kg加え、菌体を別す
る。得られた液35をダイヤイオンHP−10
（三菱化成社製）２を詰めたカラムに通塔する。
Ｋ−26を樹脂に吸着させた後水15でカラムを洗
滌し、50％のメタノール水溶液12で溶出する。
最初の２を捨てて残り10を全て集める。これ
を減圧下で５に濃縮し、２規定水酸化ナトリウ
ムでPH7.0に調整した後、ダイヤイオンHPA−10
（Cl-）（三菱化成社製）500mlを詰めたカラムに通
塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後３の水で
洗滌し、つづいて１モルの食塩水溶液３で溶出
する。溶出液を全て集め、２規定塩酸でPH3.0に
調整した後、500mlのダイヤイオンHP−10のカ
ラムに通塔する。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後３
の水で洗滌し、50％のメタノール水溶液３で
溶出する。最初の500mlを捨てて、残りの2.5を
全て集める。これを減圧下で約１に濃縮し、凍
結乾燥を行なうと、Ｋ−26の粗粉末約20gが得ら
れる。この粗粉末に、ほぼ等量のセルロース粉末
（アビセル：フナコシ薬品社製）を加えてよく混
ぜ合わせたものを、１のセルロースカラム（ア
ビセル：70％イソプロパノール水溶液）の上端に
のせる。ついでこのカラムと同じく70％イソプロ
パノール水溶液で溶出する。溶出画分を18mlずつ
分取するとフラクシヨン番号34から66にＫ−26が
溶出される。この画分を集め減圧下で約100mlに
濃縮し、凍結乾燥を行なう。この凍結乾燥標品を
0.15モル、PH7.5の燐酸バツフアーに溶かし、同
バツフアーで緩衝化した１のDEAE−セフアデ
ツクスＡ−25のカラムの上端にのせる。Ｋ−26を
セフアデツクスに吸着させた後、同バツフアーで
溶出する。溶出画分を18mlずつ分取するとフラク
シヨン番号83から126にＫ−26が溶出される。こ
の画分を集め６規定塩酸でPH3.0に調整した後、
200mlのダイヤイオンHP−10のカラムに通塔す
る。Ｋ−26を樹脂に吸着させた後１の水で洗滌
し、50％メタノール水溶液１で溶出する。溶出
液を全て集め減圧下で約100mlに濃縮して凍結乾
燥を行ない、Ｋ−26の部分精製粉末450mgを得る。
これを50％メタノール水溶液５mlに溶かし、セフ
アデツクスLH−20カラムクロマトグラフイー
（50％メタノール水溶液、カラムサイズ：2.3cm×
90cm）によりさらに精製する。溶出画分を４mlず
つ分取するとフラクシヨン番号45から68にＫ−26
が溶出される。この画分を集め、減圧下で約20ml
に濃縮した後凍結乾燥を行なう。さらにこの乾燥
標品にシリカゲル（ワコーゲル：Ｃ−200）1.5g
を加えてよく混ぜ合わせたものを、ｎ−ブタノー
ル：ｎ−プロパノール：水＝２：１：３の上層を
用いて充填したシリカゲルカラム（ワコーゲル：
Ｃ−200、カラムサイズ：21cm×90cm）の上端に
のせ、同一溶媒で溶出する。溶出画分を３mlずつ
分取するとフラクシヨン番号30から55にＫ−26が
溶出される。この画分を集め、減圧下で溶媒を留
去した後乾固させる。内容物を10mlの水に溶か
し、不溶物を除去したのち、凍結乾燥を行なうと
Ｋ−26の白色粉末15mgが得られる。尚上記精製工
程中Ｋ−26の検出は、ライドンスミスおよびヨウ
素反応に陽性で、ニンヒドリン陰性を指標として
行なつた。
第１図は、Ｋ−26の紫外部吸収スペクトルであ
る。は中性、は酸性、はアルカリ性での測
定結果を示す。第２図は、Ｋ−26の赤外部吸収ス
ペクトルである。第３図は、Ｋ−26のPMRスペ
クトルである。（重水中で測定。）第４図は、Ｋ−
26のCMRスペクトルである。
る。は中性、は酸性、はアルカリ性での測
定結果を示す。第２図は、Ｋ−26の赤外部吸収ス
ペクトルである。第３図は、Ｋ−26のPMRスペ
クトルである。（重水中で測定。）第４図は、Ｋ−
26のCMRスペクトルである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 で表される新規生理活性物質Ｋ−26。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56040651A JPS57156498A (en) | 1981-03-20 | 1981-03-20 | Novel physiologically active substance k-26 |
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