JPH0948817A

JPH0948817A - 血漿カリクレイン精製用アフィニティー樹脂

Info

Publication number: JPH0948817A
Application number: JP7200931A
Authority: JP
Inventors: Akiyoshi Okamoto; 彰祐岡本; Yoshio Okada; 芳男岡田; Utako Okamoto; 歌子岡本; Hiroko Tsuda; 裕子津田; Keiko Wanaka; 敬子和中; Mayako Yasuda; まや子安田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1995-08-07
Filing date: 1995-08-07
Publication date: 1997-02-18

Abstract

(57)【要約】【解決手段】 N-(トランス-4- アミノメチルシクロヘキ
シルカルボニル)-L-フェニルアラニン-4- カルボキシメ
チルアニリドが固定化された支持体からなる血漿カリク
レイン分離・精製用のアフィニティー樹脂；並びに、該
アフィニティー樹脂を用いた血漿カリクレインの分離・
精製方法。【効果】血漿試料から効率的かつ簡便に血漿カリクレ
インを分離・精製することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は血漿カリクレインの
分離・精製に用いるアフィニティー樹脂に関するもので
ある。また、本発明は、アフィニティー・クロマトグラ
フィーの手法に従って、上記アフィニティー樹脂を用い
て血漿タンパクから高純度の血漿カリクレインを簡便に
分離・精製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】キニノーゲンからキニンを特異的に遊離
する酵素は、血漿のほか各種臓器および尿・汗などの体
液に広く存在しており、一般的にカリクレインと総称さ
れている。これらのうち、血漿に存在するカリクレイン
（血漿カリクレインまたはプラズマ・カリクレイン）は
前駆体のプレカリクレインとして存在しており、血液凝
固系のXII 因子(Hageman因子）によって活性化される
(Nagasawa, S., et al.,Biochem. Biophys. Res. Commu
ns., 32, pp.644-649)。血漿カリクレインは血液凝固に
おいて重要な役割をはたしており、凝固系の増幅や内因
性線溶の活性化に作用している。

【０００３】血漿からの血漿カリクレインの分離・精製
は、一般的には、カゼイン沈殿や20% アセトン添加によ
って血漿中のプレカリクレインを活性化した後、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、あるいはp-アミ
ノベンツアミジンや大豆トリプシンインヒビターなどを
リガンドとしたアフィニティー・クロマトグラフィーな
どの手法により行われている（総説として、例えば、
(1) 青木延雄ら編、「凝固・線溶・キニン」、株式会社
中外医学社発行、1979年、第６章：キニン系酵素および
蛋白質、pp.389-396；(2) 守屋寛ら編、「カリクレイン
・キニン」、株式会社講談社発行、1982年、第２章：血
漿性カリレイン・キニン系、pp.42-46などを参照のこ
と）。

【０００４】ヒト血漿カリクレインの精製方法について
は多くの報告があるが、活性化された血漿カリクレイン
は速やかにα₂-マクログロブリンと複合体を形成するの
で、高純度カリクレインの回収率は一般的には非常に低
いという問題がある。例えば、ヒト血漿をエタノール沈
殿分画した後、等電点沈殿と CM-及び DEAE-セルロース
・クロマトグラフィーを行うことにより、ヒト血漿カリ
クレインが分離・精製されたことが報告されている(Col
man, R.W., et al., J. Clin. Invest., 48, pp.11-22,
1969)。上記方法では３種のヒト血漿カリクレインの存
在が確認されており、最も陽イオン性の血漿カリクレイ
ン（分子量 100,000, 沈降係数S₂₀=5.7)はカリクレイン
I 、分子量 163,000及び分子量 124,000のやや酸性のカ
リクレインはそれぞれカリクレインII及びカリクレイン
III と呼ばれている。

【０００５】一方、血漿カリクレインの阻害剤として、
例えば、大豆トリプシン・インヒビター(SBTI)、アプロ
チニン（トラジロール）、ジイソプロピルフルオロホス
フェート(DFP) 、膵トリプシン・インヒビター(BBTI)な
どが知られている。また、最近になって、特異的かつ強
力な阻害剤である N-(トランス-4- アミノメチルシクロ
ヘキシルカルボニル)-L-フェニルアラニン-4- カルボキ
シメチルアニリド[N-(trans-4-aminomethylcyclohexylc
arbonyl)-L-phenylalanine-4-carboxymethylanilide]が
報告されている (Wanaka, K., et al., Chem. Pharm. B
ull., 40, pp.1814-1817, 1992) 。なお、ヒト血漿由来
のカリクレインIII は大豆トリプシン・インヒビターや
膵トリプシン・インヒビターやアプロチニンでは阻害さ
れないという報告もある(Colman, R.W., et al., J. Cl
in. Invest., 48, pp.11-22, 1969)。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、血漿
から血漿カリクレインをクロマトグラフィーの手法によ
り簡便に分離・精製する方法を提供することにある。ま
た、本発明の別の課題は、上記方法に用いるクロマトグ
ラフィー用の樹脂及びその製造方法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決すべく鋭意努力した結果、血漿カリクレインに対
する特異的かつ強力な阻害剤である N-(トランス-4- ア
ミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェニルアラ
ニン-4- カルボキシメチルアニリド(PKSI-527)をリガン
ドとして固定化したアフィニティー樹脂を用いることに
より、アフィニティー・クロマトグラフィーの手法に従
って血漿カリクレインを簡便に分離・精製することがで
き、極めて高純度の血漿カリクレインを容易かつ大量に
製造できることを見い出した。本発明は上記の知見を基
にして完成されたものである。

【０００８】すなわち本発明は、リガンドである N-(ト
ランス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-
フェニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリドを固定
化した支持体からなるアフィニティー樹脂；及び、アフ
ィニティー・クロマトグラフィーによる血漿カリクレイ
ンの分離・精製に用いる上記アフィニティー樹脂を提供
するものである。これらの発明の好ましい態様によれ
ば、該リガンドのカルボキシル基と該支持体のアミノ基
とが縮合により共有結合した上記アフィニティー樹脂；
該支持体がアミノ基を有する親水性ビニルポリマーであ
る上記アフィニティー樹脂；該支持体中のアミノ基量が
150〜200 μmol/ml-gelである上記アフィニティー樹
脂；並びに、血漿カリクレインがヒト血漿カリクレイン
である上記アフィニティー樹脂が提供される。

【０００９】また、本発明の別の態様によれば、アミノ
基を有する支持体と N-(トランス-4- アミノメチルシク
ロヘキシルカルボニル)-L-フェニルアラニン-4- カルボ
キシメチルアニリドのアミノ保護体とを縮合剤の存在下
に反応させる工程；及びアミノ保護基の脱保護を行う工
程を含む上記アフィニティー樹脂の製造方法が提供され
る。この発明の好ましい態様によれば、アミノ基が Boc
基で保護された N-(トランス-4- アミノメチルシクロヘ
キシルカルボニル)-L-フェニルアラニン-4- カルボキシ
メチルアニリドを反応させる上記方法；該支持体が親水
性ビニルポリマーである上記方法；並びに、さらに該支
持体の未反応のアミノ基をアセチル化する工程を含む上
記方法が提供される。

【００１０】本発明のさらに別の態様により、血漿から
血漿カリクレインを分離・精製する方法であって、以下
の工程：(a) 血漿試料に含まれる血漿カリクレインを N
-(トランス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニ
ル)-L-フェニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリド
が固定化された支持体からなるアフィニティー樹脂に吸
着させる工程；及び、(b) 該支持体に吸着された血漿カ
リクレインを溶出させる工程；を含む方法が提供され
る。この発明の好ましい態様によれば、工程(a) におい
て実質的に中性の洗浄液によりアフィニティー樹脂を洗
浄した後に工程(b)の溶出を行う上記方法；工程(b) に
おいて実質的に弱酸性の溶離液により溶出を行う上記方
法；プレカリクレインの活性化処理を行った血漿試料を
用いる上記方法；並びに、カリクレイン・インヒビター
の除去処理を行った血漿試料を用いる上記方法が提供さ
れる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明により提供されるアフィニ
ティー樹脂は、血漿カリクレインの阻害剤である N-(ト
ランス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-
フェニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリドがリガ
ンドとして固定化されていることを特徴としており、ア
フィニティー・クロマトグラフィーの手法に従って、血
漿カリクレインの効率的かつ簡便な分離・精製を可能に
するものである。本明細書において、分離・精製は最も
広義に解釈すべきであり、天然物である血漿から低純度
の血漿カリクレインを分離する工程、分離された低純度
血漿カリクレインから高純度の血漿カリクレインを精製
する工程、及び血漿から一段階で高純度の血漿カリクレ
インを分離及び精製工程などを含む概念である。

【００１２】リガンドとして用いる N-(トランス-4- ア
ミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェニルアラ
ニン-4- カルボキシメチルアニリドは文献記載の方法(C
hem.Pharm. Bull., 40, pp.1814-1817, 1992)により容
易に製造可能である。いかなる特定の理論に拘泥するわ
けではないが、上記化合物が血漿カリクレインに対して
阻害作用を示す理由の一つは、アミノ基及びカルボキシ
ル基を有する上記化合物のアミノ末端部分（トランス-4
- アミノメチルシクロヘキシル部のアミノ基）と血漿カ
リクレインのアスパラギン酸(Asp) との相互作用である
ことが示唆されている（上掲文献参照）。従って、この
化合物をリガンドとして支持体に固定する場合には、化
合物中のカルボキシル基と支持体中の反応性官能基とを
反応させることが好ましい。

【００１３】上記リガンドを固定すべき支持体（リガン
ド固定化用の支持体）としては、一般にアフィニティー
・クロマトグラフィーの手法においてリガンド固定化用
の支持体として用いられているものを利用することがで
きる。支持体の種類は特に限定されず、上記のリガンド
を共有結合により十分量固定でき、かつ、固定化された
リガンドが血漿カリクレインと実質的に相互作用できる
ものであればいずれも利用可能である。好ましくは、リ
ガンドとして用いる上記化合物のカルボキシル基と反応
してアミド基、エステル基、チオエステル基などを形成
可能な反応性官能基（例えば、アミノ基、水酸基、又は
チオール基など）を有するリガンド固定化用の支持体を
用いることができる。

【００１４】より具体的には、支持体としては、例え
ば、親水性ビニルポリマー、アガロース、セルロースな
どを用いることができ、これらにアミノ基が導入された
支持体をリガンド固定化用の支持体として好適に用いる
ことができる。このようなリガンド固定化用の支持体は
種々市販されており、分離・精製の目的や条件などに応
じて適宜の種類のものを選択して容易に入手可能であ
る。

【００１５】例えば、親水性ビニルポリマーとして東ソ
ー株式会社から市販されている AF-アミノトヨパール 6
50などの支持体は、本発明に最も好適に使用できるリガ
ンド固定化用の支持体である (TSK-GEL for Affinity C
hromatography, AF-トヨパール 650, 技術カタログ, 東
ソー株式会社）。アミノ基を有するリガンド固定化用の
支持体を用いる場合には、支持体中のアミノ基量が、例
えば、50〜500 μmol/ml-gel, 好ましくは 100〜300 μ
mol/ml-gel, 特に好ましくは 150〜200 μmol/ml-gel程
度のものを用いることができる。

【００１６】上記リガンドとリガンド固定化用の支持体
とを反応させて、上記のリガンドが固定化されたアフィ
ニティー樹脂を製造する方法は、当業者に周知の方法に
従えばよい。一例として、AF- アミノトヨパール 650を
リガンド固定化用の支持体として用いる場合について説
明すると、一般的には、ゲルを水およびpH 4.5-6.0に調
整した 0.5 M NaCl 水溶液で洗浄した後、リガンドを溶
解した 0.5 M NaCl 水溶液をゲルに加え、縮合剤を加え
て室温で 24-48時間攪拌する。この反応によって、上記
リガンドのカルボキシル基と AF-アミノトヨパール 650
のアミノ基とが反応してアミド結合が形成され、上記リ
ガンドが支持体に固定化される。その後、得られたゲル
を水、1 M NaCl水溶液、水、適宜の緩衝液で洗浄するこ
とによりアフィニティー樹脂を製造することができる。

【００１７】縮合剤としては、例えば、N-エチル-N'-(3
- ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロ
クロライド(EDC) などを好適に用いることができる。な
お、アフィニティー樹脂中に残存するアミノ基をアセチ
ル化しておくことが好ましいが、アセチル化は公知の方
法に従って行うことが可能である（例えば、O'Carra,
P., et al., FEBS Letters, 21, 281, 1972) 。具体的
には、上記のゲルを蒸溜水で洗浄した後、0.2 M の酢酸
ナトリウムと無水酢酸を加えて 0℃で30分間インキュベ
ートし、さらに無水酢酸を加えて室温でインキュベート
して、アミノ基を完全にアセチル化する。反応終了後、
ゲルを蒸溜水、0.1 N NaOH、蒸留水、適宜の緩衝液の順
に洗浄する。

【００１８】上記のアフィニティー樹脂を用いて血漿か
ら血漿カリクレインを分離・精製する方法は、一般的に
アフィニティー・クロマトグラフィーの手法として当業
者に周知の方法に従って行えばよい。本発明の方法によ
り分離・精製可能な血漿カリクレインの種類は特に限定
されず、例えば、ヒトを含む哺乳類動物（例えば、ヒ
ト、チンパンジー、サル、ブタ、モルモット、マウス、
ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、シャチ、イル
カなど）由来の血漿に含まれる血漿カリクレインなど
は、いずれも本発明の方法により分離・精製することが
できる。また、例えば、ヒト血漿カリクレインにはサブ
クラス（カリクレイン I, II, 及びIII)の存在が知られ
ているが、このようなサブクラスの血漿カリクレインの
任意の混合物や特定のサブクラスの血漿カリクレインも
本発明の分離・精製方法により製造可能である。

【００１９】原料として用いる血漿は、カゼイン沈殿、
20% アセトン添加、カオリン添加、アルコール分画など
の方法によって前処理を行い、予め血漿中のプレカリク
レインを十分に活性化しておくことが好ましい。また、
分離・精製に先立って血漿カリクレイン・インヒビター
を除去しておくことが望ましい。この目的のためには例
えば酸処理を行うことができる。一例を挙げれば、クエ
ン酸添加血漿をpH 2.0に調整し、37℃で15分間処理した
後、氷中で NaOH によりpH 7.4に調整すればよい (これ
らの前処理について、Sampaio, C., et al., Arch. Bio
chem. Biophys., 165, pp.133-139, 1974 を参照) 。

【００２０】本発明の方法に従って分離・精製を行うに
は、一般的には、上記のアフィニティー樹脂を適宜の緩
衝液に懸濁してカラムに充填し、緩衝液で平衡化したも
のを用いることができる。クエン酸ナトリウムを添加し
た血漿を酸処理して血漿カリクレイン・インヒビターを
除去し、続いてカオリンを添加して 37 ℃で20分程度反
応させることにより、プレカリクレインの活性化を行
い、反応液を遠心分離して上清を分離して上記のカラム
に付し、血漿カリクレインをアフィニティー樹脂に吸着
させる。

【００２１】続いて、pH 7.0程度の中性洗浄液、好まし
くは中性緩衝液（例えば、 0.01 Mリン酸緩衝液, pH 7.
0など）でカラムを十分に洗浄した後、弱酸性、好まし
くはpH 3.0程度の緩衝液（例えば、 0.01 M リン酸緩衝
液, pH 3.0など）を溶離液として用いて血漿カリクレイ
ンを含む蛋白分画を溶出する。溶離液としては、血漿カ
リクレインと固定化リガンドとの結合力ないしは親和性
を低下させる性質を有するものならばいかなるものも利
用可能であるが、一般的には、アフィニティー樹脂の種
類や血漿試料の種類などに応じて溶離液のpH、塩濃度、
又は尿素濃度などを適宜選択すべきである。

【００２２】好ましくは、弱酸性、例えばpH 2.0〜4.0
程度の溶離液を用いることによりアフィニティー樹脂か
ら効率的に血漿カリクレインを回収することができる。
また、溶離液にリガンドとして用いる N-(トランス-4-
アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェニルア
ラニン-4- カルボキシメチルアニリドを添加することも
好ましい。上記の分離・精製工程は、一般的には室温、
好ましくは 15 〜25℃、より好ましくは20℃程度の温度
で行うことができる。蛋白分画の検出は紫外線吸収スペ
クトル測定により行うことができる。

【００２３】本発明の血漿カリクレインの分離・精製法
は、従来血漿カリクレインの分離・精製に用いられてい
る任意の方法と組み合わせて用いることが可能である。
例えば、本発明の方法により血漿カリクレインを精製し
た後に、セファデックス G-150などを用いた精製を行う
ことにより、極めて高純度の血漿カリクレインを製造す
ることができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。例１：本発明のアフィニティー樹脂の製造 N-(トランス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニ
ル)-L-フェニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリド
（以下、実施例において単に「リガンド」という)(1 g)
を水に溶解し、氷冷下にトリエチルアミン(0.7 ml)を加
えた。この溶液に氷冷下で (Boc)₂CO (0.48 g)を加えて
3〜4 時間攪拌した。溶媒を留去した後、酢酸エチルと
クエン酸を加えて pH 4 に調整し、飽和食塩水、水で洗
浄した。酢酸エチル層を無水 Na₂SO₄で乾燥し、酢酸エ
チルを留去した。残査を石油エーテルより結晶化して濾
取し、アミノ基が Boc化されたリガンドを得た。

【００２５】リガンド固定化用の支持体である AF-アミ
ノトヨパール(AF-Amino Toyopearl)650 M（東ソー株式
会社）を 0.5 M NaCl 溶液(pH 4.5-6.0)で洗浄した後、
ジオキサン（40 ml)に溶解した上記の Boc化リガンド
(0.4 g) を加え、さらに 1- エチル-(3-ジメチルアミノ
プロピル)-カルボジイミド塩酸塩(0.18 g)を添加して室
温で 24-48時間振とう攪拌した。反応終了後、ジオキサ
ン、水、1M NaCl 溶液、水の順で支持体を洗浄し、アミ
ノ基がBoc 基で保護されたリガンドが固定化された支持
体を得た。その後、Boc 基をトリフルオロ酢酸で除去
し、支持体中の残存アミノ基を 0.2M 酢酸ナトリウムと
無水酢酸によりアセチル化して、本発明のアフィニティ
ー樹脂を得た。

【００２６】例２：アフィニティー樹脂に対する血漿カ
リクレインの結合例１で得たアフィニティー樹脂を 0.01 M 燐酸緩衝液
(pH 7.0, 0.15 M NaClを含む）で洗浄した後に遠心分離
し、残査に上記の緩衝液を加えて懸濁液を作成した。こ
の懸濁液 0.4 ml に 2 mM S-2302 [H-D-Pro-Phe-Arg-pN
A, 0.05 ml, カビ（現クロモジェニックス (Chromogeni
x); 以下同様）社製] 及び 0.12 U/mlヒト血漿カリクレ
イン(0.05 ml, カビ社製）を加えて37℃で 4分間加温し
た後、50% 酢酸(0.05 ml) を加えて反応を停止し、遊離
パラニトロアニリン量を 405 nmの吸光度で測定した。
対照としてリガンドを固定化していない AF-アミノトヨ
パール 650 Mを用いた。この結果、本発明のアフィニテ
ィー樹脂は濃度依存的に血漿カリクレインを阻害し、 5
0 % 阻害を示す濃度は 2.0 mg/mlであった。対照として
用いた AF-アミノトヨパール 650 Mには、血漿カリクレ
インに対する阻害活性は認められなかった。

【００２７】例３：ヒト血漿カリクレイン試料の精製例１で製造したアフィニティー樹脂を 0.01 M 燐酸緩衝
液 (pH 7.0, 0.15 M NaCl を含む）に懸濁し、カラム
（直径 1.6 cm ×2.1 cm) に充填して 0.01 M 燐酸緩衝
液 (pH 7.0, 0.15 M NaCl を含む）で平衡化してアフィ
ニティーカラムを調製した。

【００２８】市販のヒト血漿カリクレイン（0.4 ml, カ
ビ社製, 0.24 U/ml)を上記カラムに吸着させ、0.01 M燐
酸緩衝液 (pH 7.0, 0.15 M NaCl を含む）及び 0.01 M
燐酸緩衝液 (pH 3.0, 0.15M NaClを含む）を溶離液とし
て用いて、20℃でヒト血漿カリクレインを溶出させた。
流速0.20 ml/分で1 mlずつ分取し、ローリー(Lowry)法
と吸光度(UV 280 nm) とによる蛋白定量、及び血漿カリ
クレインの活性測定を行った。

【００２９】その結果、血漿カリクレインはカラムに吸
着され、活性をほとんど有しない蛋白が最初に溶出され
た。0.01 M燐酸緩衝液 (pH 7.0) で充分に洗浄した後に
0.01 M 燐酸緩衝液(pH 3)で溶出すると、血漿カリクレ
イン活性を有する蛋白分画が得られた。結果を図１に示
す。この方法による血漿カリクレインの回収率は 61%で
あり、比活性は14倍に上昇した（表１）。対照としてリ
ガンドが固定されていない AF-アミノトヨパール 650を
用いて同様の操作を行ったところ、血漿カリクレインの
吸着は認められなかった。

【００３０】

【表１】 ───────────────────── 回収率等精製前精製後 ───────────────────── 総蛋白量(mg) 0.790 0.035 総活性(nmol/min) 67.6 41.1 比活性(nmol/min/mg) 85 1174 回収率(%) 100 61 比活性上昇（倍） 1 14 ─────────────────────

【００３１】血漿カリクレイン活性の測定は S-2302 (H
-D-Pro-Phe-Arg-pNA, 終濃度 0.2 mM,カビ社製）を含む
0.01 M 燐酸緩衝液 (pH 7.0）にフラクションを添加
し、１分間当たりの遊離パラニトロアニリン量を 405 n
m の吸光度で測定した。なお、0.01 M 燐酸緩衝液に塩
酸または水酸化ナトリウムを加えて種々のpHを有する溶
液を作成し、血漿カリクレイン活性に対するpHの影響を
検討したところ、血漿カリクレイン活性は、 pH 7.0 〜
9.0 で最も高い活性を示したが、pH 3.0ではほとんど活
性が認められなかった。

【００３２】例４：ヒト血漿試料からの血漿カリクレイ
ンの分離・精製ヒト血漿にクエン酸ナトリウムを添加し、塩酸で pH 2.
0 に調整し、37℃で15分間処理した後、氷中で NaOH を
用いてpH 7.4に調整し、血漿カリクレイン・インヒビタ
ーを除去した。その後、カオリン（山善薬品、最終濃度
0.2 mg/ml）を添加し、37℃で20分間反応させることに
より血漿中のプレカリクレインを活性化させた。反応液
を遠心分離（3.000 rpm, 10 min)し、得られた上清(2.5
ml)を上記のカラムに付して、20℃で血漿試料から血漿
カリクレインを分離した（流速 0.50 ml/min, 分取量
2.5 ml)。溶離液としては、 0.01 M 燐酸緩衝液 (pH 7.
0,0.15 M NaCl を含む）と 0.01 M 燐酸緩衝液 (pH 3.
0, 0.15 M NaCl を含む）とを用い、蛋白定量および血
漿カリクレインの活性測定は上記例３の方法に準じて行
った。

【００３３】その結果、血漿カリクレイン活性をほとん
ど持たない蛋白が 0.01 M 燐酸緩衝液 (pH 7.0）で最初
に溶出され、その後 0.01 M 燐酸緩衝液(pH 3.0)を溶離
液として用いることにより、血漿カリクレイン活性を有
する蛋白分画が得られた。得られた溶出プロファイルは
上記例３とほぼ同様な溶出プロファイルであった。結果
を図２に示す。この方法による血漿カリクレイン活性の
回収率は 74%であり、比活性は34倍に上昇し、上記例３
において用いた市販のヒト血漿カリクレインとほぼ同様
な純度の精製ヒト血漿カリクレインが得られた（表
２）。

【００３４】

【表２】 ───────────────────── 回収率等活性化血漿精製後 ───────────────────── 総蛋白量(mg) 170 4 総活性(nmol/min) 520 386 比活性(nmol/min/mg) 3 102 回収率(%) 100 74 比活性上昇（倍） 1 34 ─────────────────────

【００３５】例５：ヒト血漿試料からの血漿カリクレイ
ンの分離・精製例４と同様にして反応液上清をカラムに付した後、0.01
M燐酸緩衝液 (pH 7.0, 0.15 M NaCl を含む）で洗浄し
た後、0.05 Mグリシン緩衝液 (pH 3.0, 0.15MNaClを含
む）を溶離液としてヒト血漿カリクレインを溶出した。
結果を図３に示す。血漿カリクレイン活性を有する蛋白
画分を集めて、セファデックス(Sephadex)G-150 カラム
に付し、0.05 Mグリシン緩衝液 (pH 3.0, 0.15M NaClを
含む）で溶出して、血漿カリクレイン活性を有する蛋白
画分を集めた。上記の２段階精製による回収率は70% で
あり、比活性は109 倍に上昇した（表３）。

【００３６】

【表３】 ─────────────────────────── 回収率等活性化アフィニティー Sephadex 血漿カラム後カラム後 ─────────────────────────── 分取量(ml) 2.0 7.5 - 総蛋白量(mg) 160 11.3 1.1 総活性(nmol/min) 780 725 545.6 比活性(nmol/min/mg) 4.9 64.3 529.1 回収率(%) 100 93 70 比活性上昇（倍） 1 13 109 ───────────────────────────

【００３７】例６：血漿カリクレインの基質特異性の検
討例４でヒト血漿試料から精製されたヒト血漿カリクレイ
ンの基質特異性と市販のヒト血漿カリクレイン（例３で
用いたもの，カビ社製, 0.24 U/ml)の基質特異性を特異
的合成酵素を用いて比較したところ、両者は類似した基
質特異性を示した。すなわち、血漿カリクレイン基質を
よく分解し、トロンビン、腺性カリクレイン、プラスミ
ン、ウロキナーゼ、及び凝固因子Xa基質をほとんど分解
しなかった〔表４：表中、かっこ内は S2302基質分解活
性を100 として換算した値を示す）。

【００３８】

【表４】 ──────────────────────────── 基質市販精製品例４の精製品 ΔO.D.405/min ΔO.D.405/min ──────────────────────────── S2302(血漿カリクレイン） 0.13 (100) 0.13 (100) S2238(トロンビン) 0.026 (20) 0.033 (26) S2266(腺性カリクレイン) 0.0196 (15) 0.0170 (13) S2251(プラスミン) 0.004 (3) 0.004 (4) S2444(ウロキナーゼ) 0.0096 (7) 0.00825 (6) S2222(凝固因子Ｘａ) 0.0032 (2) 0.0016 (1) ────────────────────────────

【００３９】

【発明の効果】本発明のアフィニティー樹脂を用いるこ
とにより、効率的かつ簡便に血漿カリクレインを分離・
精製することができる。また、上記のアフィニティー樹
脂を用いることにより、血漿試料から高純度の血漿カリ
クレインを大量かつ簡便に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に従ってヒト血漿カリクレイン
試料の精製を行った際のアフィニティー・クロマトグラ
フィーの溶出プロファイルを示す図である。図中の矢印
は、pH 3.0の溶離液に置換したことを示す。

【図２】本発明の方法に従ってヒト血漿試料からヒト
血漿カリクレインの分離・精製を行った際のアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す図
である。図中の矢印は、pH 3.0の溶離液に置換したこと
を示す。

【図３】本発明の方法に従ってヒト血漿試料からヒト
血漿カリクレインの分離・精製を行った際のアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す図
である。図中の矢印は、溶離液であるグリシン緩衝液(G
lycine buff. pH3.0)に置換したことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者津田裕子兵庫県明石市魚住町清水1440−１ (72)発明者和中敬子兵庫県神戸市垂水区旭が丘三丁目15−18 血栓止血研究神戸プロジェクト委員会内 (72)発明者安田まや子兵庫県神戸市垂水区旭が丘三丁目15−18 血栓止血研究神戸プロジェクト委員会内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リガンドである N-(トランス-4- アミノ
メチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェニルアラニン
-4- カルボキシメチルアニリドを固定化した支持体から
なるアフィニティー樹脂。
【請求項２】アフィニティー・クロマトグラフィーに
よる血漿カリクレインの分離・精製に用いる請求項１に
記載のアフィニティー樹脂。
【請求項３】該リガンドのカルボキシル基と該支持体
のアミノ基とが縮合により共有結合した請求項１又は２
に記載のアフィニティー樹脂。
【請求項４】該支持体がアミノ基を有する親水性ビニ
ルポリマーである請求項３に記載のアフィニティー樹
脂。
【請求項５】該支持体中のアミノ基量が 150〜200 μ
mol/ml-gelである請求項１ないし４のいずれか１項に記
載のアフィニティー樹脂。
【請求項６】血漿カリクレインがヒト血漿カリクレイ
ンである請求項１ないし５のいずれか１項に記載のアフ
ィニティー樹脂。
【請求項７】アミノ基を有する支持体と N-(トランス
-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェニ
ルアラニン-4- カルボキシメチルアニリドのアミノ保護
体とを縮合剤の存在下に反応させる工程；及びアミノ保
護基の脱保護を行う工程を含む請求項１ないし６のいず
れか１項に記載のアフィニティー樹脂の製造方法。
【請求項８】アミノ基が Boc基で保護された N-(トラ
ンス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フ
ェニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリドを反応さ
せる請求項７に記載の方法。
【請求項９】該支持体が親水性ビニルポリマーである
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】さらに該支持体の未反応のアミノ基を
アセチル化する工程を含む請求項７ないし９のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項１１】血漿から血漿カリクレインを分離・精
製する方法であって、以下の工程： (a) 血漿試料に含まれる血漿カリクレインを N-(トラン
ス-4- アミノメチルシクロヘキシルカルボニル)-L-フェ
ニルアラニン-4- カルボキシメチルアニリドが固定化さ
れた支持体からなるアフィニティー樹脂に吸着させる工
程；及び、(b) 該支持体に吸着された血漿カリクレイン
を溶出させる工程；を含む方法。
【請求項１２】工程(a) において実質的に中性の洗浄
液によりアフィニティー樹脂を洗浄した後に工程(b) の
溶出を行う請求項10に記載の方法。
【請求項１３】工程(b) において実質的に弱酸性の溶
離液により溶出を行う請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】プレカリクレインの活性化処理を行っ
た血漿試料を用いる請求項11ないし13のいずれか１項に
記載の方法。
【請求項１５】カリクレイン・インヒビターの除去処
理を行った血漿試料を用いる請求項11ないし14のいずれ
か１項に記載の方法。