JPH028710B2

JPH028710B2 -

Info

Publication number: JPH028710B2
Application number: JP6539282A
Authority: JP
Inventors: Utako Okamoto; Yoko Nagamatsu; Hiroko Tsuda; Yoshio Okada
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority date: 1982-04-21
Filing date: 1982-04-21
Publication date: 1990-02-26
Also published as: JPS58183093A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は脾臓フイブリン分解酵素（以下SFPと
略す）並びに白血球顆粒中エラスターゼ様酵素
（以下GEと略す）の精製法に関するものである。

SFPは特異的にフイブリンおよびフイブリノー
ゲンを分解する中性プロテイナーゼであり、分子
量約30000の塩基性蛋白質である。SFPは無菌動
物には存在しない。細菌性内毒素投与により惹起
した血管内凝固症候群においては、血液凝固機能
亢進の発現と共に増加し、その消退と共に回復す
る。この酵素は網内系（以下RESと略す）細胞
による微細血栓除去機構と密接な関連を有するも
のと考えられる。一方、白血球顆粒中のエラスタ
ーゼ様酵素は肺気腫、関節疾患、炎症等の発症、
増悪の因子となることが知られている。

本発明等はSFP並びにGE特異的合成基質即ち、
サクシニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
バリン−Ｐ−ニトロアニリドを先に特許出願した
（特願昭55−131709号）がＬ−チロシル−Ｄ−ロ
イシル−Ｄ−バリンのアミノ酸配列がSFP、GE
の阻害剤としても最も有効であることを見出し本
発明を完成した。

本発明はサクシニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイ
シル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドを水不溶
性多糖類に固定化させたものに粗脾臓抽出液また
は白血球抽出液を吸着させることを特徴とする
SFPまたはGEの精製法である。

白血球顆粒中にはGEの他にもカテプシンＧ、
コラゲナーゼ等の蛋白分解酵素が含まれているた
め、GEの純化のためには、種々の方法が試みら
れてきたが十分な成果があげられていない。従来
行なわれてきた精製法には次のようなものがあ
る。

() 白血球顆粒分画をセルフアデツクスG75ゲ
ルクロマトグラフイー、ε−アミノカプロン酸
−セフアロ−スイオン交換クロマトグラフイー
により部分純化し、次いでエラステイン−セフ
アロースアフイニテイークロマトグラフイーに
かける方法（Eur.J.Biochem.、42巻、519頁、
1974年）。

() トラジロール−セフアロースを用いる方法
（Biochemistry、15巻、836頁、1976年）。

() フイブリノーゲン−セルフアロースを使用
する方法（Biochem.Biphys.Acta、630巻、47
頁、1980年）。

() Baugh and Travis法を行なつた後、
（Ala）₃−Ｐ−ニトロアニリド−セフアロース
（但し、Alaはアラニンを示す。）でアフイニテ
イークロマトグラフイーを行なう方法（J.
Chromatography、192巻、236頁、1980年）等
がある。

しかし、これらの方法は白血球から顆粒を分離
し、さらにその顆粒から酵素を部分純化した後に
アフイニテイークロマトグラフイーにかけるか、
又はアフイニテイークロマトグラフイー後、さら
に他の分離法を併用しなければならないため、操
作が煩雑であり且つ効率が落ちる。しかも()は
基質として弱いエラステインをリガンドとしてい
るため回収率が悪い。()はトラジロールによる
阻害がGEに選択的でないため、CM−セルロー
スクロマトグラフイー等を併用しなければならな
い。しかも溶出に酸性の緩衝液を使用するので、
酸性で不安定なGEの純化には好ましくない。

()はカテプシンＧ、プラスミン、フイブリン
モノマー等をも吸着する。また()の（Ala）₃−
Ｐ−ニトロアニリド−セフアロースはGEによる
分解速度が早いため、クロマトグラフイー中の基
質分解を避けるため−14℃付近で操作を行なわな
ければならないという煩わしさがある。

以上のように従来法は好ましい方法とは言難
い。

本発明者等は上記欠点を解決するため鋭意研究
を行ない、本発明を完成した。

本発明はサクシニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイ
シル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド（以下リ
ガンドと言う）がSFP及びGEに非常に高い選択
性と強い結合力を持つため、白血球顆粒を分離す
る必要がなく白血球の抽出液をそのままで使用で
きるため煩雑な操作を必要とせず、また回収率が
よくてしかもリガンドが酵素基質でないため操作
中に分解のおそれがなく、室温での操作が可能で
あり、リガンドと水下溶性多糖類との結合が強い
ため吸着した酵素の溶出、洗浄後、長期の保存に
堪えくり返し使用が可能である。

次に本発明について詳細に説明する。

本発明法を実施するにはカラム法及びバツチ法
のいずれでも行なうことができるがカラム法を例
にとり説明する。

先ずサクシニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル
−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド−水不溶性多
糖類（以下リガンド固定化物という）（但し、水
不溶性多糖類とはセルロース、架橋デキストラ
ン、アガロースまたは架橋アガロースを示す）を
過塩素酸ナトリウムを含む緩衝液に懸濁させたも
のをカラムに充填する。次いで該カラムに同緩衝
液に溶解したSFP又はGEを含む粗酵素液を流下
するとSFP又はGEがリガンド固定化物に吸着さ
れる。次いで、同緩衝液でリガンド固定化物を洗
浄し不純物を流下させた後、尿素を含む緩衝液を
流下すればSFP又はGEが溶出する。この溶出液
は過塩素酸ナトリウムを含む緩衝液で透析し尿素
を除去し、凍結することにより保存可能である。
なお、展開に用いる緩衝液は中性ないしは弱アル
カリ性の範囲が好ましくトリス緩衝液、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。

SFP又はGEの活性は得られた前記の溶出液を
サクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−
ロイシル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドを用
いてBiochemical and Biophysical Research
communicatons、97巻、28頁、1980年に記載の
方法に従つて酵素活性を測定した。なお、サクシ
ニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシ
ル−Ｌ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドは本発明者
等が特許出願（特願昭56−44745）した物質であ
り、これに記載されている製造法で得ることがで
きる。

本発明を実施するためのリガンド固定化物を得
るには、ペプタイドを水不溶性多糖類に結合させ
る通常の方法を用いれば得られる。即ち、カルボ
ジイミド法、ブロムシアン法又はグルタールアル
デヒド法等を用いてサクシニル−Ｌ−チロシル−
Ｄ−ロイシル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド
と水不溶性多糖類を結合できる。なお水不溶性多
糖類としてはセルロース、架橋デキストラン、ア
ガロース又は架橋アガロース等が使用できる。

以下にアガロース（商品名AH−セフアロース
4B、フアルマシア社発売）を用いたカルボジイ
ミド法を例にとりリガンドの固定化について説明
する。

AH−セフアロース4B5ｇを0.5モル塩化ナトリ
ウム溶液100mlで３時間膨潤させる。その後大量
の0.5塩化ナトリウム溶液で洗浄し、続いて大量
の蒸留水で洗浄した後AH−セフアロース4B20ml
を10mlの蒸留水に懸濁させる。この懸濁液にサク
シニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシン−Ｄ−バリ
ン−Ｐ−ニトロアニリド100mg（160マイクロモ
ル）を20mlジオキサンに溶解し加え、さらに１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド塩酸塩620mgを10mlの蒸留水に溶解
し加えた後PH4.5〜6.0範囲内で１時間保つ。次い
で室温で24時間低速振とう下で反応を行なう。そ
の後50％ジオキサン、蒸留水の順で洗浄すればサ
クシニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル−Ｄ−バ
リン−Ｐ−ニトロアニリドのカルボキシル基をセ
フアロース4Bの遊離アミノ基に結合させたサク
シニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル−Ｄ−バリ
ン−Ｐ−ニトロアニリド−セフアロースのリガン
ド固定化物を得る。なお、サクシニル−Ｌ−チロ
シル−Ｄ−ロイシル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロア
ニリドは本発明者等が先に特許出願した（特願昭
55−131709号）方法と同様にして得た。即ち、保
護されたアミノ基を持つＬ−チロシンとＤ−ロイ
シル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリドをＮ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドと１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールにて縮合し、この縮
合物のアミノ保護基を脱離させ、遊離したアミノ
基をトリエチルアミン存在下、酢酸エチル中無水
コハク酸にてサクシニル化すればよい。

なお、本発明に係る活性は１mlの酵素液を使用
し、0.3ミリモルの前記記載の基質に60分間作用
させて１マイクロモルのＰ−ニトロアニリンを遊
離した時１単位とした。比活性は活性／蛋白量と
し、精製度は比活性の比で表した。一方、蛋白量
はローリー法により求めた。

次に実施例により本発明を説明する。

実施例１ GEの精製血液200mlに1/10容の3.8％クエン酸ソーダを加
え、メトリゾ酸ソーダ（１容）（ナイガード社発
売）と６％デキストラン（２容）の混液の上に約
等量重層する。室温で１時間放置した後、白血球
を含む上層を取り、1000rpm、10分間遠心分離
し、沈査を得る。蒸留水を加えて混在している赤
血球を破懐した後、16000rpm、30分間遠心分離
して白血球沈査を得る。この沈査にトリスー塩酸
緩衝液（0.1モル、PH８）に溶解した２モル過塩
素酸ナトリウム40mlを加え、１時間撹拌しながら
抽出を行なう。この抽出液に等量のクロロホルム
を加え、数分間振とうして脱脂を行なつた後、
3000rpm、15分間遠心分離を行ない、上清40mlを
得る。この上清をトリスー塩酸緩衝液で４倍に希
釈して、0.5モル過塩素酸ナトリウムになるよう
に塩濃度を下げてサクシニル−Ｌ−チロシル−Ｄ
−ロイシル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロアニリド−
セフアロース20mlを詰めたカラムに流下させる。

次いで0.5モル過塩素酸ナトリウムを含むトリ
スー塩酸緩衝液でカラムを洗浄し、E₂₈₀の吸収が
0.02以下に下つた時、８モル尿素を含むトリスー
塩酸緩衝液（0.1モル、PH８）を流下させGEの溶
出を行なう。E₂₈₀で蛋白を測定し、サクシニル−
Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−バリン−Ｐ−ニトロアニリドで活性を測定し
た。

溶出液は0.5モル過塩素酸ナトリウムを含むト
リスー塩酸緩衝液で透析して尿素を除去し、−80
℃で保存した。

結果；精製度25倍、収率85％実施例２ SFPの精製脾臓組織を10倍の生理食塩水に分散させ、
40000rpmで100分間遠心分離した。沈査は10倍量
の２モル過塩素酸ナトリウムを含むトリスー塩酸
緩衝液（0.1モル、PH８）にさらに分散させ、４
℃で120分間抽出した後、40000rpmで100分間遠
心分離し、上層の粗脾臓抽出物を得た。粗脾臓抽
出物100mlをトリスー塩酸緩衝液（0.1モル、PH
８）で４倍に希釈した後、サクシニル−Ｌ−チロ
シル−Ｄ−ロイシル−Ｄ−バリン−Ｐ−ニトロア
ニリド−セフアロース20mlを詰めたカラムに流下
させる。次いで0.5モル過塩素酸ナトリウムを含
むトリスー塩酸緩衝液でカラムを洗浄し、E₂₈₀の
吸収が0.02以下に下つた時、８モル尿素を含むト
リスー塩酸緩衝液（0.1モル、PH８）を流下させ
SFPを溶出させる。

Claims

【特許請求の範囲】

１不純物を含有する脾臓フイブリン分解酵素液
または白血球顆粒中エラスターゼ様酵素液をサク
シニル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル−Ｄ−バリ
ン−Ｐ−ニトロアニリド−水不溶性多糖類（但
し、水不溶性多糖類とはセルロース、架橋デキス
トラン、アガロースまたは架橋アガロースを示
す。）に吸着させて溶出させることを特徴とする
脾臓フイブリン分解酵素または白血球顆粒中エラ
スターゼ様酵素の精製法。