JPH0156073B2 - - Google Patents
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- JPH0156073B2 JPH0156073B2 JP59190560A JP19056084A JPH0156073B2 JP H0156073 B2 JPH0156073 B2 JP H0156073B2 JP 59190560 A JP59190560 A JP 59190560A JP 19056084 A JP19056084 A JP 19056084A JP H0156073 B2 JPH0156073 B2 JP H0156073B2
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗腫瘍性物質SPF―140及び
その製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許第
1163865号）、溶連菌の菌体ゆ破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質が知られている（特公昭48−
43841、特開昭51−44617）に過ぎない。 本発明者らは、先にストレプトコツカス属細菌
の生産する抗腫瘍性有効成分を求めて研究した結
果、ストレプトコツカス属細菌の培養の適切な生
育期に、ペニシリンまたはその関連物質を添加
し、更に培養を継続することによつて、培地中に
分泌される生理活性物質SPF―１およびSPF―
２、抗腫瘍性物質SPF―100を培養液中から回
収し、精製を行ない、新規物質として採取した。
これらの物質は、高分子透過性大腸菌変異株MP
―２（FERM―P5432）（Agr.Birol.Chem，43，
371〜378（1979））（以下MP―２株という）に対
して生育阻止能を有していた。 本発明者らは、ストレプトコツカス属細菌のこ
の培養液中に、SPF―１、SPF―２或いは、
SPF―100とは別個に、MP―２株に対して生育
阻止作用を示さないが、抗腫瘍活性を有する画分
の存在することを見出すに至つたのである。本画
分の物質は、SPF―140と呼称する。 本発明の抗腫瘍性物質SPF―140は、培養液
中に分泌され、分子量が25000〜70000であり、
MP―２株に対する抗菌活性を示さないことによ
つて特徴ずけられる。 現在までに、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培
養液中に分泌、蓄積され、分子量数万以下のもの
は知られておらず、更に、本発明の抗腫瘍性物質
SPF―140は、元素分析、呈色反応等からペプチ
ド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトル
から、既知の抗腫瘍性物質とは、相異する新規な
物質と認められるものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質SPF―140生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性物質SPF―140を採取することを特徴と
する抗腫瘍性物質SPF―140の製造法を包含する
ものである。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性物質SPF―140生産菌が広く使用で
きる。次に抗腫瘍性物質SPF―140生産菌を記載
する。 Streptococcus pyogenes ATCC 21060 Streptococcus sp. ATCC 21597 Streptococcus pyogenes ATCC 21546 Streptococcus pyogenes ATCC 21547 Streptococcus pyogenes ATCC 21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性物質SPF―140の採取に重要な役割
をはたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間
は、37℃の培養で、対数増殖期にかかつて後、３
〜20時間の間、特に５〜10時間が好ましい。その
後１〜20時間、好ましくは、３〜15時間培養を継
続することにより、培養中に抗腫瘍性物質SPF―
140を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の活用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は、遠心分離によつて菌体を除去し、液に
硫安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取す
る。得られた抗腫瘍性物質SPF―140を含む硫安
塩析物は、凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性物質SPF―140を
抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、イオン
交換体を用いて回分法または流通法により吸着お
よび溶出を行ない、更にゲル過剤を用いるクロ
マトグラフイーにより、抗腫瘍性物質SPF―140
を分画する。 イオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオ
ン交換セルロース、イオン交換セフアデツクス
（フアルマシア社製）、ハイドロキシルアパタイト
等が用いられ、ゲル過剤としては、トヨパール
HW50FまたはHW50SF（東洋曹達(株)製）、セフア
デツクス（フアルマシア社製）等が用いられる。
イオン交換体への抗腫瘍性物質SPF―140の吸着
およびイオン交換体からの抗腫瘍性物質SPF―
140の溶出は、適切なPHと塩濃度の緩衝液が用い
られる。更に、イオン交換体およびゲル過剤は
２種類以上を組合せて用いることもできる。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140の
凍結乾燥標品は、淡黄色の粉末であり、次のよう
な理化学的性質を示す。 １ 元素分析 Ｃ：42.58％〜41.79％ Ｈ： 6.15％〜 5.92％ Ｎ：12.69％〜12.35％ ２ 分子量 ゲル過法による測定では、分子量約25000〜
70000である。 ３ 分解点 本物質は170℃で褐変し、245℃になると黒色と
なり分解する。 ４ 比旋光度 〔α〕20 D＝−70.0゜〜−80.0゜（Ｃ＝1.00） ５ 紫外線吸収スペクトル 本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクト
ルは第１図に示される。275nmに吸収極大がみら
れ特徴的である。 ６ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3270cm-1、2920cm-1、2850cm-1、1670cm-1、
1535cm-1、1260cm-1 に吸収が認められる。 ７ 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノールには一部溶解
し、エタノール、ｎ―プロパノール、ｎ―ブタノ
ール、イソブタノール、ｎ―ヘキサン、クロロホ
ルム、アセトン、メチルイソブチルケトン、エチ
ルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶である。 ８ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質の1.0％水溶液のPHは6.5である。 ９ 物質の色 淡黄色粉末状である。 10 呈色反応 ニンヒドリン反応 ＋ ビユウレツト反応 ＋ ローリー反応 ＋ モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化 本物質は特に安定化剤を必要としない。 次に本発明における抗菌活性は次の様にして測
定する。 抗菌活性 測定にはMP―２を使用して、MP―２に対す
る生育阻止能をもつて抗菌活性の指標とする。ま
た、この原理を利用した鵜高法（J.Antibiotics，
35，1319〜1325（1982））により、生理活性物質の
単位を決定する。 すなわち、バクト・アンチバイオチツクメデイ
アム３（デイフコ社製）1.75％、寒天1.3％より成
る培地（M3培地）を120℃、15分加熱殺菌し、20
mlずつシヤーレに分注し、放冷してプレート培地
を調製する。 一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、塩化ナ
トリウム0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、
15分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、
培地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17
時間培養したMP―２菌を１ml中に104個の細胞
が存在するように培地中に加える。ビペツトによ
つて２mlを採取し、あらかじめ作製して置いた
M3培地表面上に加え、すばやく均一にひろげ固
化させる。次いで被験液を適当に希釈して、その
溶液0.05mlをペーパー・デイスク（直径８mm）
（東洋紙(株)製）にしみ込ませる。このペーパ
ー・デイスクを前記作製プレート上に置き、37℃
で17時間培養し、被験物質によつてできる阻止円
の観察して抗菌活性を検査し、阻止円の直径10mm
mmを与える被験物質の生理活性を測定し、一単位
（1u）と定義する。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ Streptococcus pyogenes ATCC 21060をBHI
培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養をお
こなつて得た種培養液を第１表に示す培地A1
に接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を
行つた。 第１表 培地Ａ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ マルトース 0.5％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.5、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG5000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて、菌体を除去
した。 培養液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この沈澱
物はMP―２の生育を阻止する生理活性物質381.0
×104uを含有していた。この沈澱物を、１×
10-2M、PH7.0の燐酸緩衝液（KH2PO4―
Na2HPO4）300mlに溶解し、この水溶液をDEAE
セルローズカラム（５×70cm）に吸着させた後、
0.3M塩化ナトリウムを含む上記燐酸緩衝液を用
いて、段階的に溶出させ、283.4×104uの生理活
性画分を分取した。この生理活性画分をDEAEセ
フアデツクスＡ―25カラム（2.6×70cm）に吸着
させ、次いで上記燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム
濃度を直線的に上昇させて溶出を行ない、249.6
×104uの生理活性区分を分取した。更に、この溶
出液を濃縮し、ゲル過剤トヨパールHW50Fカ
ラム（2.6×100cm）に加えて、ゲル過を行な
い、非抗菌活性画分を分取して、凍結乾燥し抗腫
瘍性物質SPF―140 640mgを得た。 この抗腫瘍性物質SPF―140を被験物質として
抗腫瘍活性試験は、実験例１および２示す。 実施例 ２ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第２
表に示す培地Ｂを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合ペニシリンＧは、1000単位／
ml培養液となるように添加した。この培養液を
実施例１と同様にに精製して、抗腫瘍性物質SPF
―140 767mgを得た。 第２表 培地Ｂ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝6.7 実施例 ３ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第３
表に示す培地Ｃを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この培養液を実施例１と同様にして
精製して、抗腫瘍性物質SPF―140 527mgを得た。 第３表 培地Ｃ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ マルトース 0.5％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ 塩化ナトリウム 0.5％ PH＝6.5 実施例 ４ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第４
表に示す培地Ｄを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合、ペニシリンＧは、1000単
位／ml培養となるように添加した。この培養液
を実施例１と同様にして精製して抗腫瘍性物質
SPF―140 830mgを得た。 第４表 培地Ｄ マルトース 0.8％ ポリペプトン 0.1％ 酵母エキス 0.1％ 酸性第一燐酸カリウム 1.43％ 硫酸マグネシウム 0.585％ 硝酸カリウム 1.0％ PH＝6.5 実施例 ５ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第５
表に示す培地Ｅを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合、ペニシリンＧは、1000単
位／ml培養液となるように添加した。この培養
液を実施例１と同様にして精製して、抗腫瘍性物
質SPF―140 570mgを得た。 第５表 培地Ｅ マルトース 0.3％ カザミノ酸 0.5％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.5％ 硫酸マグネシウム 0.1％ 塩化ナトリウム 0.1％ 硝酸カリウム 0.5％ PH＝6.5 実験例 １ in vitroにおける被検薬の抗腫瘍活性測定試験
は細胞阻害度測定法にもとづいて実施した。 腫瘍細胞としてはＬ―5178Y（Leukemia）を用
い、これを10％FCS添加RPMI1640培地（５mg／
カナマイシン含有）に懸濁した。この培養液
0.45mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細胞
数が１×105cell／tubeになるようにした。次い
でこの培養液に所定量の被検薬（抗腫瘍性物質
SPF―140を0.05mlの培養液に溶解）を注加して、
37℃で５％CO2、存在下に培養した。被検薬を添
加して48時間後にトリパンブルーによる染色をお
こない、次式により細胞阻害度を算出した。 細胞阻害度（％）＝(A)−各実験群の細胞数／対照群の
細胞数(A)×100 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140を
被検薬とした結果を第６表に示す。 第６表 細胞阻害度（％） SPF―140（mg／ml） Ｌ―5178Y 2.0 15.3 1.0 11.3 実験例 ２ in vivoにおける被検薬の抗腫瘍活性試験は
CRJ―CD―１（ICR系、雌性、５週齢）マウスを
使用して実施した。 腫瘍細胞としてはSarcoma―180腹水癌細胞を
用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹
腔内に0.2ml（細胞数１×106cells）接種した。 この腫瘍細胞接種後、１日１回７日間連続して
被検薬の所定量を腹腔内に投与して、その生存数
を観察した。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140を
被検薬とした結果を第７表に示す。 【表】 また、延命率＝被検動物群の平均生存日数／対
照動物群の平均生存日数×100は270％であつた。
その製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許第
1163865号）、溶連菌の菌体ゆ破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質が知られている（特公昭48−
43841、特開昭51−44617）に過ぎない。 本発明者らは、先にストレプトコツカス属細菌
の生産する抗腫瘍性有効成分を求めて研究した結
果、ストレプトコツカス属細菌の培養の適切な生
育期に、ペニシリンまたはその関連物質を添加
し、更に培養を継続することによつて、培地中に
分泌される生理活性物質SPF―１およびSPF―
２、抗腫瘍性物質SPF―100を培養液中から回
収し、精製を行ない、新規物質として採取した。
これらの物質は、高分子透過性大腸菌変異株MP
―２（FERM―P5432）（Agr.Birol.Chem，43，
371〜378（1979））（以下MP―２株という）に対
して生育阻止能を有していた。 本発明者らは、ストレプトコツカス属細菌のこ
の培養液中に、SPF―１、SPF―２或いは、
SPF―100とは別個に、MP―２株に対して生育
阻止作用を示さないが、抗腫瘍活性を有する画分
の存在することを見出すに至つたのである。本画
分の物質は、SPF―140と呼称する。 本発明の抗腫瘍性物質SPF―140は、培養液
中に分泌され、分子量が25000〜70000であり、
MP―２株に対する抗菌活性を示さないことによ
つて特徴ずけられる。 現在までに、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培
養液中に分泌、蓄積され、分子量数万以下のもの
は知られておらず、更に、本発明の抗腫瘍性物質
SPF―140は、元素分析、呈色反応等からペプチ
ド様物質と考えられるが、紫外線吸収スペクトル
から、既知の抗腫瘍性物質とは、相異する新規な
物質と認められるものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質SPF―140生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性物質SPF―140を採取することを特徴と
する抗腫瘍性物質SPF―140の製造法を包含する
ものである。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性物質SPF―140生産菌が広く使用で
きる。次に抗腫瘍性物質SPF―140生産菌を記載
する。 Streptococcus pyogenes ATCC 21060 Streptococcus sp. ATCC 21597 Streptococcus pyogenes ATCC 21546 Streptococcus pyogenes ATCC 21547 Streptococcus pyogenes ATCC 21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性物質SPF―140の採取に重要な役割
をはたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間
は、37℃の培養で、対数増殖期にかかつて後、３
〜20時間の間、特に５〜10時間が好ましい。その
後１〜20時間、好ましくは、３〜15時間培養を継
続することにより、培養中に抗腫瘍性物質SPF―
140を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の活用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は、遠心分離によつて菌体を除去し、液に
硫安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取す
る。得られた抗腫瘍性物質SPF―140を含む硫安
塩析物は、凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性物質SPF―140を
抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、イオン
交換体を用いて回分法または流通法により吸着お
よび溶出を行ない、更にゲル過剤を用いるクロ
マトグラフイーにより、抗腫瘍性物質SPF―140
を分画する。 イオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオ
ン交換セルロース、イオン交換セフアデツクス
（フアルマシア社製）、ハイドロキシルアパタイト
等が用いられ、ゲル過剤としては、トヨパール
HW50FまたはHW50SF（東洋曹達(株)製）、セフア
デツクス（フアルマシア社製）等が用いられる。
イオン交換体への抗腫瘍性物質SPF―140の吸着
およびイオン交換体からの抗腫瘍性物質SPF―
140の溶出は、適切なPHと塩濃度の緩衝液が用い
られる。更に、イオン交換体およびゲル過剤は
２種類以上を組合せて用いることもできる。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140の
凍結乾燥標品は、淡黄色の粉末であり、次のよう
な理化学的性質を示す。 １ 元素分析 Ｃ：42.58％〜41.79％ Ｈ： 6.15％〜 5.92％ Ｎ：12.69％〜12.35％ ２ 分子量 ゲル過法による測定では、分子量約25000〜
70000である。 ３ 分解点 本物質は170℃で褐変し、245℃になると黒色と
なり分解する。 ４ 比旋光度 〔α〕20 D＝−70.0゜〜−80.0゜（Ｃ＝1.00） ５ 紫外線吸収スペクトル 本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクト
ルは第１図に示される。275nmに吸収極大がみら
れ特徴的である。 ６ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3270cm-1、2920cm-1、2850cm-1、1670cm-1、
1535cm-1、1260cm-1 に吸収が認められる。 ７ 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノールには一部溶解
し、エタノール、ｎ―プロパノール、ｎ―ブタノ
ール、イソブタノール、ｎ―ヘキサン、クロロホ
ルム、アセトン、メチルイソブチルケトン、エチ
ルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶である。 ８ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質の1.0％水溶液のPHは6.5である。 ９ 物質の色 淡黄色粉末状である。 10 呈色反応 ニンヒドリン反応 ＋ ビユウレツト反応 ＋ ローリー反応 ＋ モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化 本物質は特に安定化剤を必要としない。 次に本発明における抗菌活性は次の様にして測
定する。 抗菌活性 測定にはMP―２を使用して、MP―２に対す
る生育阻止能をもつて抗菌活性の指標とする。ま
た、この原理を利用した鵜高法（J.Antibiotics，
35，1319〜1325（1982））により、生理活性物質の
単位を決定する。 すなわち、バクト・アンチバイオチツクメデイ
アム３（デイフコ社製）1.75％、寒天1.3％より成
る培地（M3培地）を120℃、15分加熱殺菌し、20
mlずつシヤーレに分注し、放冷してプレート培地
を調製する。 一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、塩化ナ
トリウム0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、
15分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、
培地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17
時間培養したMP―２菌を１ml中に104個の細胞
が存在するように培地中に加える。ビペツトによ
つて２mlを採取し、あらかじめ作製して置いた
M3培地表面上に加え、すばやく均一にひろげ固
化させる。次いで被験液を適当に希釈して、その
溶液0.05mlをペーパー・デイスク（直径８mm）
（東洋紙(株)製）にしみ込ませる。このペーパ
ー・デイスクを前記作製プレート上に置き、37℃
で17時間培養し、被験物質によつてできる阻止円
の観察して抗菌活性を検査し、阻止円の直径10mm
mmを与える被験物質の生理活性を測定し、一単位
（1u）と定義する。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ Streptococcus pyogenes ATCC 21060をBHI
培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養をお
こなつて得た種培養液を第１表に示す培地A1
に接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培養を
行つた。 第１表 培地Ａ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ マルトース 0.5％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.5、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG5000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて、菌体を除去
した。 培養液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この沈澱
物はMP―２の生育を阻止する生理活性物質381.0
×104uを含有していた。この沈澱物を、１×
10-2M、PH7.0の燐酸緩衝液（KH2PO4―
Na2HPO4）300mlに溶解し、この水溶液をDEAE
セルローズカラム（５×70cm）に吸着させた後、
0.3M塩化ナトリウムを含む上記燐酸緩衝液を用
いて、段階的に溶出させ、283.4×104uの生理活
性画分を分取した。この生理活性画分をDEAEセ
フアデツクスＡ―25カラム（2.6×70cm）に吸着
させ、次いで上記燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム
濃度を直線的に上昇させて溶出を行ない、249.6
×104uの生理活性区分を分取した。更に、この溶
出液を濃縮し、ゲル過剤トヨパールHW50Fカ
ラム（2.6×100cm）に加えて、ゲル過を行な
い、非抗菌活性画分を分取して、凍結乾燥し抗腫
瘍性物質SPF―140 640mgを得た。 この抗腫瘍性物質SPF―140を被験物質として
抗腫瘍活性試験は、実験例１および２示す。 実施例 ２ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第２
表に示す培地Ｂを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合ペニシリンＧは、1000単位／
ml培養液となるように添加した。この培養液を
実施例１と同様にに精製して、抗腫瘍性物質SPF
―140 767mgを得た。 第２表 培地Ｂ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝6.7 実施例 ３ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第３
表に示す培地Ｃを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この培養液を実施例１と同様にして
精製して、抗腫瘍性物質SPF―140 527mgを得た。 第３表 培地Ｃ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ マルトース 0.5％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ 塩化ナトリウム 0.5％ PH＝6.5 実施例 ４ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第４
表に示す培地Ｄを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合、ペニシリンＧは、1000単
位／ml培養となるように添加した。この培養液
を実施例１と同様にして精製して抗腫瘍性物質
SPF―140 830mgを得た。 第４表 培地Ｄ マルトース 0.8％ ポリペプトン 0.1％ 酵母エキス 0.1％ 酸性第一燐酸カリウム 1.43％ 硫酸マグネシウム 0.585％ 硝酸カリウム 1.0％ PH＝6.5 実施例 ５ Streptococcus pyogenes ATCC 21060を第５
表に示す培地Ｅを用いて、実施例１と同様にして
培養した。この場合、ペニシリンＧは、1000単
位／ml培養液となるように添加した。この培養
液を実施例１と同様にして精製して、抗腫瘍性物
質SPF―140 570mgを得た。 第５表 培地Ｅ マルトース 0.3％ カザミノ酸 0.5％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.5％ 硫酸マグネシウム 0.1％ 塩化ナトリウム 0.1％ 硝酸カリウム 0.5％ PH＝6.5 実験例 １ in vitroにおける被検薬の抗腫瘍活性測定試験
は細胞阻害度測定法にもとづいて実施した。 腫瘍細胞としてはＬ―5178Y（Leukemia）を用
い、これを10％FCS添加RPMI1640培地（５mg／
カナマイシン含有）に懸濁した。この培養液
0.45mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細胞
数が１×105cell／tubeになるようにした。次い
でこの培養液に所定量の被検薬（抗腫瘍性物質
SPF―140を0.05mlの培養液に溶解）を注加して、
37℃で５％CO2、存在下に培養した。被検薬を添
加して48時間後にトリパンブルーによる染色をお
こない、次式により細胞阻害度を算出した。 細胞阻害度（％）＝(A)−各実験群の細胞数／対照群の
細胞数(A)×100 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140を
被検薬とした結果を第６表に示す。 第６表 細胞阻害度（％） SPF―140（mg／ml） Ｌ―5178Y 2.0 15.3 1.0 11.3 実験例 ２ in vivoにおける被検薬の抗腫瘍活性試験は
CRJ―CD―１（ICR系、雌性、５週齢）マウスを
使用して実施した。 腫瘍細胞としてはSarcoma―180腹水癌細胞を
用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹
腔内に0.2ml（細胞数１×106cells）接種した。 この腫瘍細胞接種後、１日１回７日間連続して
被検薬の所定量を腹腔内に投与して、その生存数
を観察した。 実施例１で得られた抗腫瘍性物質SPF―140を
被検薬とした結果を第７表に示す。 【表】 また、延命率＝被検動物群の平均生存日数／対
照動物群の平均生存日数×100は270％であつた。
第１図は抗腫瘍性物質SPF―140 0.1％水溶液
の紫外線線吸収スペクトルを示し、第２図は同じ
く赤外線吸収スペクトルを示す。
の紫外線線吸収スペクトルを示し、第２図は同じ
く赤外線吸収スペクトルを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性物質
SPF―140。 １ 元素分析 Ｃ：42.58％〜41.79％ Ｈ： 6.15％〜 5.92％ Ｎ：12.69％〜12.35％ ２ 分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量約25000〜
70000である。 ３ 分解点 本物質は170℃で褐変し、245℃になると黒色と
なり分解する。 ４ 比旋光度 〔α〕20 D＝−70.0゜〜−80.0゜（Ｃ＝1.00） ５ 紫外線吸収スペクトル 本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクト
ルは、275nmに吸収極大が認められる。 ６ 赤外線吸収スペクトル 3270cm-1、2920cm-1、2850cm-1、1670cm-1、
1535cm-1、1260cm-1に吸収が認められる。 ７ 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノールには一部溶解
し、エタノール、ｎ―プロパノール、ｎ―ブタノ
ール、イソブタノール、ｎ―ヘキサン、クロロホ
ルム、アセトン、メチルイソブチルケトン、エチ
ルエーテル等の溶剤には難溶又は不溶である。 ８ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質の1.0％の水溶液のPHは6.5である。 ９ 物質の色 淡黄色粉末状である。 10 呈色反応 ニンヒドリン反応 ＋ ビユウレツト反応 ＋ ローリー反応 ＋ モーリツシユ反応 − デイシエ反応 − アンスロン反応 − システイン硫酸反応 − 11 安定化 本物質は、特に安定化剤を必要としない。 ２ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF―140生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
物質SPF―140を採取することを特徴とする抗腫
瘍性物質SPF―140の製法。 ３ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF―140生産菌を培養するに際し、培養中の適
当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加し
て培養することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の抗腫瘍性物質SPF―140の製法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190560A JPS6169725A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 抗腫瘍性物質ｓｐｆ−１４０及びその製法 |
| GB08522309A GB2164338B (en) | 1984-09-13 | 1985-09-09 | Tumoricidal substance spf-140 and process for the preparation thereof |
| NL8502483A NL8502483A (nl) | 1984-09-13 | 1985-09-11 | Geneesmiddel spf-140 met een werking tegen tumoren, en werkwijze voor de bereiding hiervan. |
| DE3532321A DE3532321C2 (de) | 1984-09-13 | 1985-09-11 | Tumorizide Substanz SPF-140 und Verfahren zu deren Herstellung |
| SE8504228A SE461222B (sv) | 1984-09-13 | 1985-09-12 | Tumoerdoedande aemne spf-140 och foerfarande foer framstaellning daerav |
| FR8513603A FR2569983B1 (fr) | 1984-09-13 | 1985-09-13 | Substance tumoricide spf-140 et procede pour sa preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190560A JPS6169725A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 抗腫瘍性物質ｓｐｆ−１４０及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6169725A JPS6169725A (ja) | 1986-04-10 |
| JPH0156073B2 true JPH0156073B2 (ja) | 1989-11-28 |
Family
ID=16260095
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190560A Granted JPS6169725A (ja) | 1984-09-13 | 1984-09-13 | 抗腫瘍性物質ｓｐｆ−１４０及びその製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6169725A (ja) |
| DE (1) | DE3532321C2 (ja) |
| FR (1) | FR2569983B1 (ja) |
| GB (1) | GB2164338B (ja) |
| NL (1) | NL8502483A (ja) |
| SE (1) | SE461222B (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS557014A (en) * | 1978-06-29 | 1980-01-18 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Antitumor agent and its preparation |
| JPS5632492A (en) * | 1979-08-28 | 1981-04-01 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Antitumor active substance, its preparation and pharmaceutical |
| JPS58222026A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-23 | Masahiro Yoshimura | 抗ガン性物質 |
| JPS6092218A (ja) * | 1983-10-26 | 1985-05-23 | Juzo Udaka | 抗腫瘍性物質の製造法 |
| DE3581091D1 (de) * | 1984-03-09 | 1991-02-07 | Advance Kk | Anti-karies- oder anti-periodontitismittel. |
-
1984
- 1984-09-13 JP JP59190560A patent/JPS6169725A/ja active Granted
-
1985
- 1985-09-09 GB GB08522309A patent/GB2164338B/en not_active Expired
- 1985-09-11 NL NL8502483A patent/NL8502483A/nl not_active Application Discontinuation
- 1985-09-11 DE DE3532321A patent/DE3532321C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-09-12 SE SE8504228A patent/SE461222B/sv not_active IP Right Cessation
- 1985-09-13 FR FR8513603A patent/FR2569983B1/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2569983A1 (fr) | 1986-03-14 |
| JPS6169725A (ja) | 1986-04-10 |
| SE461222B (sv) | 1990-01-22 |
| DE3532321C2 (de) | 1994-04-07 |
| GB8522309D0 (en) | 1985-10-16 |
| FR2569983B1 (fr) | 1988-08-19 |
| DE3532321A1 (de) | 1986-03-27 |
| SE8504228L (sv) | 1986-03-14 |
| NL8502483A (nl) | 1986-04-01 |
| GB2164338B (en) | 1988-05-05 |
| GB2164338A (en) | 1986-03-19 |
| SE8504228D0 (sv) | 1985-09-12 |
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