JPH0156074B2 - - Google Patents
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- JPH0156074B2 JPH0156074B2 JP60152326A JP15232685A JPH0156074B2 JP H0156074 B2 JPH0156074 B2 JP H0156074B2 JP 60152326 A JP60152326 A JP 60152326A JP 15232685 A JP15232685 A JP 15232685A JP H0156074 B2 JPH0156074 B2 JP H0156074B2
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- antitumor
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- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗腫瘍性成分SPF―10及びそ
の製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48−43841、特開昭51−
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
−22026）が知られている程度である。 本発明者らは、先に、溶連菌の培養液中に抗腫
瘍性成分を溶出させる方法を求めて研究したとこ
ろ、培養中にペニシリン又はその関連物質を添加
することによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出
することを見出し（特開昭60−92218号）、培養液
中から生理活性物質SPF―１を分離するに至つた
のである。（特開昭60−30689号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中から
より有効な成分を分離する目的で鋭意研究したと
ころ、本発明において、癌化白血球培養細胞
L1210（以下培養細胞L1210という）の生育を阻止
し、かつ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性
の画分であることにより特徴づけられる抗腫瘍性
成分SPF―10を分離するに至つた。 本発明の抗腫瘍性成分SPF―10は、元素分析、
呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考えら
れるが、紫外線吸収スペクトルから、既知の抗腫
瘍性物質とは、相異する新規な物質と認められる
ものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF―10生産菌を培養し、培養物から抗
腫瘍性成分SPF―10を採取することを特徴とする
抗腫瘍性成分SPF―10の製造法を包含するもので
ある。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF―10生産菌が広く使用でき
る。次に抗腫瘍性成分SPF―10生産菌を記載す
る。 ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes） ATCC 21060 ストレプトコツカス・エスピー （Streptococcus sp.） ATCC 21597 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21546 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21547 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフニージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは6.1〜7.2であ
り、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜37
℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養を
行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF―10の採取に重要な役割を
はたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間は
35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて後、３
〜20時間の間、特に５〜10時間が好ましい。その
後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培養を継続
することにより、培養中に抗腫瘍性成分SPF―10
を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液に硫
安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取する。
得られた抗腫瘍性成分SPF―10を含む硫安塩析物
は、凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性成分SPF―10を抽
出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、この水溶
液をDEAEセルロースカラムに吸着させ、燐酸緩
衝液を用いて段階的に溶出させ、培養細胞Ｌ
1210の生育を阻害する活性画分を分取し、この活
性画分をDEAEセフアデツクスＡ―25カラムに吸
着させ、これを燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃
度を直線的に上昇させて溶出を行い、その緩衝液
非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取
し、これを脱塩し、凍結乾燥することによつて得
ることができる。 次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―
10の凍結乾燥標品は、次のような理化学的性質を
示す。 １ 元素分析 Ｃ 45.6〜46.1％ Ｈ 6.5〜6.6％ Ｎ 14.8〜15.4％ Ｏ 29.8〜32.2％ Ash 0.9〜2.1％ ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し、240℃になると黒色と
なり分解する。 ３ 比旋光度 〔α〕20 D＝−65゜.0〜−85.0゜（Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクトル
は第１図に示される。250nmから270nmにかけて
吸収が認められる。 ５ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3270cm-1付近、2900cm-1、1670cm-1、1535cm
-1、1450cm-1、1400cm-1、1330cm-1、1260cm-1、
1160cm-1、1090cm-1、1030cm-1に吸収が認めら
れる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質1.0％の水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡黄色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約1000〜
500000である。 10 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、
ｎ―プロパノール、アセトン、エチルエーテル、
ｎ―ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶
剤には、難溶又は不溶である。 次にin vitroにおける培養細胞Ｌ 1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。 抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ 1210の生育
阻止率（IR％）の測定により行つた。 Ｌ 1210細胞を10％FBS添加RPMI 1640培地
（５mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この
培養液0.5mlをフアルコン 2058 チユーブに注
加し、細胞数が１×105cells／tubeになるように
した。次いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍
性成分SPF―10）を目的濃度になるように培養液
に溶解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO2存
在下に培養した。標品を添加して48時間後にトリ
パンブルーによる染色をおこない、次式により
IR（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細胞
数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。 対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。 アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合
30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２ml
のアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes）ATCC 21060を
BHI培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養
をおこなつて得た種培養液を第１表に示す培地
A1に接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前
培養を行つた。 第１表 培地Ａ マルトース 0.25％ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら窒素置換し、嫌
気的に培養する。次いでペニシリンG1000単位／
ml培養液になるように添加して、培養を更に５時
間継続した。得られた培養液を遠心分離にかけて
菌体を除去した。 培養濾液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安
塩析標品を１×10-2M.PH7.0の燐酸緩衝液
（KH2PO4―Na2HPO4）300mlに溶解し、この水
溶液をDEAEセルロースカラム（５×70cm）に吸
着させた後、0.3M 塩化ナトリウムを含む上記
燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、アンス
ロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞
Ｌ 1210の生育を阻害する活性画分を分取した。 この活性画分を、DEAEセフアデツクスＡ―25
カラム（2.6×70cm）に吸着させ、次いで上記燐
酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇
させて溶出を行い、アンスロン硫酸法による呈色
反応陽性でかつ培養細胞 Ｌ 1210の生育を阻害
する活性画分を分取した。 この溶出曲線は第３図に示される。第３図にお
いて点線部分は緩衝液の非吸着部分で、実線部分
は塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて溶出
する部分である。Ａは培養細胞 Ｌ 1210生育阻
害活性画分であり、Ｂは高分子透過性大腸菌変異
株MP―２（特開昭60−30689）生育阻害活性画分
である。 Ａの活性画分の溶出液は、硫酸アンモニウムを
90％飽和度まで添加し沈澱画分として、上記燐酸
緩衝液に溶解し、透析膜を用いて脱塩後凍結乾燥
して、SPF―10 6.5grを得た。 この抗腫瘍性成分SPF―10を標品とした抗腫瘍
活性試験は実験例１および２に示される。 実施例 ２ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―10 4.1grを得た。 実施例 ３ ストレプトコツカス・ビオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合ペニシリンＧは3000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を３時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―10 6.8grを得た。 実施例 ４ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 5.6grを得た。 第２表 培地Ｂ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例 ５ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第３表に示す培地Ｃを用いて、実施例１と同様
に35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは
1000単位／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 5.5grを得
た。 第３表 培地Ｃ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 0.5％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 0.5％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例 ６ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第４表に示す培地Ｄを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 5.9grを得た。 第４表 培地Ｄ マルトース 0.25％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例 ７ ストレプトコツカス・エスピーATCC 21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 3.2grを得た。 実施例 ８ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21546
を第１表に示す培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―10 3.8grを得た。 実施例 ９ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様様
に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 4.6grを得た。 実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―10 2.3grを得た。 実施例 11 ストレプトコツカス ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μｇ／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 2.4grを得
た。 実験例 １ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―10のイ
ンビトロ（in vitro）における抗腫瘍活性試験
は、本文中に記載した抗腫瘍活性の測定方法によ
り行い、その結果を表―５に示す。 表―５ SPF―10の抗腫瘍活性の結果 SPF―10（mg／ml） IR％ 2.0 100 1.0 98 0.5 89 実験例 ２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―10のイ
ンビボ（in vivo）における抗腫瘍活性試験は
CRJ―CD―１（ICR系、雌性７週齢）マウスを使
用して実施した。 腫瘍細胞としてはサルコーマ―180腹水癌細胞
を用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの
腹腔内に５×105cells／マウス接種した。 癌細胞接種24時間後から１日１回５日間連続し
てSPF―10を腹腔内に投与してその生存数を観察
し、その結果を表―６に示す。 【表】
の製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48−43841、特開昭51−
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
−22026）が知られている程度である。 本発明者らは、先に、溶連菌の培養液中に抗腫
瘍性成分を溶出させる方法を求めて研究したとこ
ろ、培養中にペニシリン又はその関連物質を添加
することによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出
することを見出し（特開昭60−92218号）、培養液
中から生理活性物質SPF―１を分離するに至つた
のである。（特開昭60−30689号） 本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中から
より有効な成分を分離する目的で鋭意研究したと
ころ、本発明において、癌化白血球培養細胞
L1210（以下培養細胞L1210という）の生育を阻止
し、かつ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性
の画分であることにより特徴づけられる抗腫瘍性
成分SPF―10を分離するに至つた。 本発明の抗腫瘍性成分SPF―10は、元素分析、
呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考えら
れるが、紫外線吸収スペクトルから、既知の抗腫
瘍性物質とは、相異する新規な物質と認められる
ものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF―10生産菌を培養し、培養物から抗
腫瘍性成分SPF―10を採取することを特徴とする
抗腫瘍性成分SPF―10の製造法を包含するもので
ある。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF―10生産菌が広く使用でき
る。次に抗腫瘍性成分SPF―10生産菌を記載す
る。 ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes） ATCC 21060 ストレプトコツカス・エスピー （Streptococcus sp.） ATCC 21597 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21546 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21547 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC 21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフニージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは6.1〜7.2であ
り、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜37
℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養を
行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF―10の採取に重要な役割を
はたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間は
35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて後、３
〜20時間の間、特に５〜10時間が好ましい。その
後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培養を継続
することにより、培養中に抗腫瘍性成分SPF―10
を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液に硫
安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取する。
得られた抗腫瘍性成分SPF―10を含む硫安塩析物
は、凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性成分SPF―10を抽
出するには、塩析物を緩衝液に溶解し、この水溶
液をDEAEセルロースカラムに吸着させ、燐酸緩
衝液を用いて段階的に溶出させ、培養細胞Ｌ
1210の生育を阻害する活性画分を分取し、この活
性画分をDEAEセフアデツクスＡ―25カラムに吸
着させ、これを燐酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃
度を直線的に上昇させて溶出を行い、その緩衝液
非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取
し、これを脱塩し、凍結乾燥することによつて得
ることができる。 次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―
10の凍結乾燥標品は、次のような理化学的性質を
示す。 １ 元素分析 Ｃ 45.6〜46.1％ Ｈ 6.5〜6.6％ Ｎ 14.8〜15.4％ Ｏ 29.8〜32.2％ Ash 0.9〜2.1％ ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し、240℃になると黒色と
なり分解する。 ３ 比旋光度 〔α〕20 D＝−65゜.0〜−85.0゜（Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクトル
は第１図に示される。250nmから270nmにかけて
吸収が認められる。 ５ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3270cm-1付近、2900cm-1、1670cm-1、1535cm
-1、1450cm-1、1400cm-1、1330cm-1、1260cm-1、
1160cm-1、1090cm-1、1030cm-1に吸収が認めら
れる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質1.0％の水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡黄色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約1000〜
500000である。 10 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、
ｎ―プロパノール、アセトン、エチルエーテル、
ｎ―ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶
剤には、難溶又は不溶である。 次にin vitroにおける培養細胞Ｌ 1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。 抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ 1210の生育
阻止率（IR％）の測定により行つた。 Ｌ 1210細胞を10％FBS添加RPMI 1640培地
（５mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この
培養液0.5mlをフアルコン 2058 チユーブに注
加し、細胞数が１×105cells／tubeになるように
した。次いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍
性成分SPF―10）を目的濃度になるように培養液
に溶解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO2存
在下に培養した。標品を添加して48時間後にトリ
パンブルーによる染色をおこない、次式により
IR（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細胞
数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。 対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。 アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合
30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２ml
のアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes）ATCC 21060を
BHI培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養
をおこなつて得た種培養液を第１表に示す培地
A1に接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前
培養を行つた。 第１表 培地Ａ マルトース 0.25％ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら窒素置換し、嫌
気的に培養する。次いでペニシリンG1000単位／
ml培養液になるように添加して、培養を更に５時
間継続した。得られた培養液を遠心分離にかけて
菌体を除去した。 培養濾液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安
塩析標品を１×10-2M.PH7.0の燐酸緩衝液
（KH2PO4―Na2HPO4）300mlに溶解し、この水
溶液をDEAEセルロースカラム（５×70cm）に吸
着させた後、0.3M 塩化ナトリウムを含む上記
燐酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、アンス
ロン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞
Ｌ 1210の生育を阻害する活性画分を分取した。 この活性画分を、DEAEセフアデツクスＡ―25
カラム（2.6×70cm）に吸着させ、次いで上記燐
酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇
させて溶出を行い、アンスロン硫酸法による呈色
反応陽性でかつ培養細胞 Ｌ 1210の生育を阻害
する活性画分を分取した。 この溶出曲線は第３図に示される。第３図にお
いて点線部分は緩衝液の非吸着部分で、実線部分
は塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させて溶出
する部分である。Ａは培養細胞 Ｌ 1210生育阻
害活性画分であり、Ｂは高分子透過性大腸菌変異
株MP―２（特開昭60−30689）生育阻害活性画分
である。 Ａの活性画分の溶出液は、硫酸アンモニウムを
90％飽和度まで添加し沈澱画分として、上記燐酸
緩衝液に溶解し、透析膜を用いて脱塩後凍結乾燥
して、SPF―10 6.5grを得た。 この抗腫瘍性成分SPF―10を標品とした抗腫瘍
活性試験は実験例１および２に示される。 実施例 ２ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―10 4.1grを得た。 実施例 ３ ストレプトコツカス・ビオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合ペニシリンＧは3000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を３時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―10 6.8grを得た。 実施例 ４ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 5.6grを得た。 第２表 培地Ｂ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例 ５ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第３表に示す培地Ｃを用いて、実施例１と同様
に35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは
1000単位／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 5.5grを得
た。 第３表 培地Ｃ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 0.5％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 0.5％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例 ６ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第４表に示す培地Ｄを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 5.9grを得た。 第４表 培地Ｄ マルトース 0.25％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例 ７ ストレプトコツカス・エスピーATCC 21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合ペニシリンＧは1000単位／ml
培養液となるように添加し、更に培養を５時間継
続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF―10 3.2grを得た。 実施例 ８ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21546
を第１表に示す培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―10 3.8grを得た。 実施例 ９ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様様
に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 4.6grを得た。 実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―10 2.3grを得た。 実施例 11 ストレプトコツカス ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μｇ／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―10 2.4grを得
た。 実験例 １ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―10のイ
ンビトロ（in vitro）における抗腫瘍活性試験
は、本文中に記載した抗腫瘍活性の測定方法によ
り行い、その結果を表―５に示す。 表―５ SPF―10の抗腫瘍活性の結果 SPF―10（mg／ml） IR％ 2.0 100 1.0 98 0.5 89 実験例 ２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―10のイ
ンビボ（in vivo）における抗腫瘍活性試験は
CRJ―CD―１（ICR系、雌性７週齢）マウスを使
用して実施した。 腫瘍細胞としてはサルコーマ―180腹水癌細胞
を用い、これを生理食塩水に浮遊させ、マウスの
腹腔内に５×105cells／マウス接種した。 癌細胞接種24時間後から１日１回５日間連続し
てSPF―10を腹腔内に投与してその生存数を観察
し、その結果を表―６に示す。 【表】
第１図は抗腫瘍性成分SPF―10の紫外線吸収ス
ペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペ
クトルを示す。第３図は実施例１における活性画
分のDEAEセフアデツクスＡ―25カラムの溶出曲
線を示す図である。
ペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収スペ
クトルを示す。第３図は実施例１における活性画
分のDEAEセフアデツクスＡ―25カラムの溶出曲
線を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分
SPF―10。 １ 元素分析 Ｃ 45.6〜46.1％ Ｈ 6.5〜6.6％ Ｎ 14.8〜15.4％ Ｏ 29.8〜32.2％ Ash 0.9〜2.1％ ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し、240℃になると黒色と
なり分解する。 ３ 比旋光度 〔α〕20 D＝−65.0゜〜−85.0゜（Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペクト
ルは、250nmから270nmにかけて吸収が認められ
る。 ５ 赤外線吸収スペクトル 3270cm-1付近、2900cm-1、1670cm-1、1535cm
-1、1450cm-1、1400cm-1、1330cm-1、1260cm-1、
1160cm-1、1090cm-1、1030cm-1 に吸収が認められる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質の1.0％の水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡褐色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量約1000〜
500000である。 10 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノール、
ｎ―プロパノール、アセトン、エチルエーテル、
ｎ―ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル等の溶
剤には難溶又は不溶である。 ２ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF―10生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性成
分SPF―10を採取することを特徴とする抗腫瘍性
物質SPF―10の製法。 ３ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF―10生産菌を培養するに際し、培養中の適当
な時期にペニシリン又はその関連物質を添加して
培養することを特徴とする特許請求の範囲第２項
に記載の抗腫瘍性成分SPF―10の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60152326A JPS6216426A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ−１０及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60152326A JPS6216426A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ−１０及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6216426A JPS6216426A (ja) | 1987-01-24 |
| JPH0156074B2 true JPH0156074B2 (ja) | 1989-11-28 |
Family
ID=15538081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60152326A Granted JPS6216426A (ja) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ−１０及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6216426A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63212980A (ja) * | 1988-02-12 | 1988-09-05 | 松下電器産業株式会社 | 透過型液晶マトリックス表示装置 |
-
1985
- 1985-07-12 JP JP60152326A patent/JPS6216426A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6216426A (ja) | 1987-01-24 |
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