JPH0156077B2

JPH0156077B2 -

Info

Publication number: JPH0156077B2
Application number: JP60227720A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Shikishima Boseki KK
Current assignee: Shikishima Boseki KK
Priority date: 1985-10-15
Filing date: 1985-10-15
Publication date: 1989-11-28
Also published as: JPS6287520A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ
及びその製法に関するものである。

従来、溶連菌の生菌体を弱毒化して製剤化した
ものは、すでに制癌剤として使用されている。

また、ストレプトコツカス・ピオゲネスの菌体
を破砕後水または塩類溶液で有効成分を抽出し、
有機溶媒を加えて、抗腫瘍性成分を沈澱として、
回収する方法（特公昭38―1647）、溶連菌を溶菌
酵素、リゾチーム、セルラーゼまたは蛋白質分解
酵素により、溶菌し、活性画分を水溶性区分とし
て分画する方法（英国特許第1163865号）などが
知られている。

このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水可溶性もしくは不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理
によれば、精製は複雑となり、有効成分の単離は
きわめて困難であつた。実際に分離し、有効成分
として測定された例では分子量200000の蛋白質
（特公昭48―43841、特開昭51―44617）及び分子
量150000の糖蛋白質（特開昭58―22026）が知ら
れている程度である。

本発明者らは、先に溶連菌の培養濾液中に抗腫
瘍性成分を溶出させる方法を求めて研究したとこ
ろ、培養中に、ペニシリン又は、その関連物質を
添加することによつて抗腫瘍性成分が培養液中に
溶出することを見出し（特開昭60―92218号）培
養液中から生理活性物質SPF―１を分離するに至
つたのである。（特開昭60―30689）本発明者らは、よりすぐれた抗腫瘍性有効成分
を溶連菌に求めて鋭意研究した結果、全く新規な
抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆを培養中から分画
した。

本発明の抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆは培養
中菌体外に排出され、培養液中に存在するように
なるので、菌体を濾過して除去し、培養濾液を精
製すればよいので、単離はかなり容易なものとな
る。

本発明の抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆは培養
液中に排出されるとともに、分子量が9000〜
11000であることによつて特徴づけられる。

従来、溶連菌関連の抗腫瘍性物質で、培養液中
に蓄積されたものはなく、また分子量も数万以下
のものは知られておらず、本発明の抗腫瘍性物質
SPF―100―FIは全く新規な物質と認められる。

また、本発明の抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ
は、元素分析、呈色反応等からペプチド性物質と
認められるが、紫外線吸収スペクトルで特異な吸
収があり、従来広く知られた抗腫瘍活性物質など
とも明らかに相違する物質であつて、物質として
新規なものと認められるものである。

本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性物質SPF―100―Ｆ生産菌を培養し、培養
物から抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆを採取する
ことを特徴とする抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ
の製法を包含するものである。

本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ生産菌が広く
使用されるが、その一例としてストレプトコツカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）
ATCC 21060、ストレプトコツカス・エスピー
（Streptococcus sp.）ATCC 21597、ストレプト
コツカス・ピオゲネス（Streptococcus
pyogenes）ATCC 21546、ストレプトコツカ
ス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）
ATCC 21547、ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）ATCC 21548があげ
られる。

培養液は、肉エキス培地、酷母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌が有効に生育する培地であれ
ば炭素源、窒素源等含んだ一般培地も使用するこ
とができる。

培養はPH5.0〜8.0、好ましくは6.1〜7.2で30〜
40℃好ましくは35〜37℃であり嫌気的に静置培養
をおこなうのが一般的であるが、その他撹拌培養
等の変法も採用することができる。

本発明においては、培養中の適当な時期にペニ
シリン又はその関連物質を添加することが、抗腫
瘍性物質SPF―100―Ｆの取得に重要な役割を
はたすことになる。

ペニシリン又はその関連物質の添加時期は37℃
の培養で対数増殖期にかかつて後３〜20時間の
間、特に５〜10時間の間が好ましい。その後１時
間乃至20時間好ましくは３〜15時間そのまま培養
を続けることによつて、培養液中に抗腫瘍性物質
SPF―100―Ｆを多量蓄積させることができる。

ペニシリン又はその関連物質としてはすでに知
られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物質で
あればいかなるものでもよいが、ペニシリンＧが
普通用いられる。添加量はペニシリンＧで100〜
3000単位／ml、好ましくは300〜1500単位／ml培
養液程度で十分である。

得られた培養液は、遠心分離によつて菌体を除
去し、濾液に硫安を添加し50〜90％飽和度の画分
を分取して得られた沈澱物を緩衝液に溶解する。

抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ含有液は凍結状
態で又は凍結乾燥して保存することができる。こ
の物質は必要に応じてイオン交換体あるいはゲル
濾過剤と接触せしめてさらに精製することができ
る。イオン交換体としてはイオン交換樹脂、イオ
ン交換セルロース、イオン交換セフアデツクス
（フアルマシア社製）、ハイドロキシアパタイト等
が用いられ、ゲル濾過剤としては、トヨパール
HW50F（東洋曹達(株)製）、セフアデツクス（フア
ルマシア社製）等が用いられる。本精製過程にお
いて、上記担体を用いる回分法、又は担体をカラ
ムに充てん後流通法により精製される。抗腫瘍性
物質SPF―100―FIは、上記精製法により得られ
た標品をG3000SWカラム（東洋曹達(株)製）を用
いた高速液体クロマトグラフイーを行うことによ
り得られる。

実施例１で得られた本発明の抗腫瘍性物質SPF
―100―FIはペプチド性物質で、凍結乾燥すると
淡黄色の粉末となる。

次に、抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆの理化学
的性質を示す。

１元素分析Ｃ 45.22―45.46 Ｈ 6.15―6.22 Ｎ 11.23―11.48 Ｏ 36.26―34.48 Ash 1.14―2.36 ２分子量ゲル濾過法による測定では、分子量9000〜
11000である。

３分解点本物質は160℃で褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。

４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−80〜−84（Ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは第１図に示される。320nm，280nmに吸
収を有しており特徴的である。

６赤外線吸収スペクトル第２図に示される。

3300cm^-1，2970cm^-1，1640cm^-1，1530cm
^-1， 1450cm^-1，1400cm^-1，1320cm^-1，1260cm
^-1， 1090cm^-1，540cm^-1 に吸収が認められる。

７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、ｎ―ブタノール、イソブタノール、ｎ―プ
ロパノール、ｎ―ヘキサン、クロロホルム、ア
セトン、メチルイソブチルケトン、エチルエー
テル等の溶剤には難溶又は不溶である。

８塩基性、酸性、中性の区別本物質の0.1％水溶液のPHは6.95である。

９物質の色淡黄色粉末状である。

10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋モーリツシユ反応 ± オルシン塩酸反応 − アンスロン反応＋システイン硫酸反応 ± モーリツシユ反応、オルシン塩酸反応、アン
スロン反応、システイン硫酸反応の各呈色反応
は、0.1％水溶液を用いて行つた。

11 安定化本物質はＬ―システイン、ジチオスレイトー
ル（DDT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α―およびβ―サイクロデキストリ
ン、（NH₄）₂SO₄、食塩等の添加によつて安定
化される。

次に本発明の実施例を示す。

なお実施例における抗腫瘍性物質SPF―100―
Ｆの活性単位の測定は鵜高法（Journal of
Antibiotics vol 35(10)，1312―1318（1982）；
Journal of Antibiotics vol 35No.10 1319―1325
OCT 1982）によつた。測定には高分子透過性大
腸菌変異株UR―３を使用してUR―３に対する
抗菌活性を指標としてバイオ・アツセイする。

すなわち、バクト・アンチバイオチツクメデイ
アム３（デイフコ社製）1.75％、寒天1.3％より成
る培地（M₃培地）を120℃、15分加熱殺菌し、20
mlずつシヤーレに分注し、放冷してプレート培地
を調整する。

一方、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、
NaCl0.3％、寒天0.8％より成る培地を120℃、15
分加熱殺菌する。その後42℃の恒温槽に保ち、培
地の温度が42℃になつたらあらかじめ37℃で17時
間培養したUR―３菌を１ml中に10⁴個の細胞が存
在する様に培地中に加える。ピペツトによつて２
mlを採取し、あらかじめ作製して置いたM₃培地
表面上に加え、すばやく均一にひろげ固化させ
る。抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆを含む被験液
を適当に希釈して、その溶液0.05mlをペーパー・
デイスク（直径８mm）（東洋濾紙）にしみ込ませ
る。このペーパー・デイスクを前記作製プレート
上に置き、37℃で17時間培養し、抗腫瘍性物質
SPF―100―Ｆによつてできる阻止円の大きさ
を測定する。阻止円の直径10mmを与える抗腫瘍性
物質SPF―100―Ｆの濃度を１単位（1U）と定
義する。

抗腫瘍活性の測定方法抗腫瘍活性の測定は、培養細胞Ｌ 1210の生育
阻止率（IR％）の測定により行つた。Ｌ 1210
細胞を10％ FBS添加RPMI 1640培地（５mg／
カナマイシン含有）に懸濁した。この培養液
0.5mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細胞
数が１×10⁵cells／tubeになるようにした。次い
でこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍性物質SPF
―100―Ｆ）を目的濃度になるように培養液に
溶解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO₂存在
下に培養した。標品を添加して48時間後にトリパ
ンブルーによる染色をおこない、次式によりIR
（％）を算出した。

IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細
胞数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。

対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。

実施例１第１表培地Ａマルトース 0.25％肉エキス 1.0％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％リン酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％塩化ナトリウム 0.1％ PH6.7 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）ATCC 21060をBHI
培地100mlに接種して37℃８時間静置培養をおこ
なつた種培養液100mlを培地A1に接種し種培養
と同じ条件で前培養する。

この前培養液を培地A8に接種し、10のジ
ヤーフアーメンターを用いて、37℃14.5時間
300rpmで嫌気的に培養後、ペニシリンG1000単
位／mlまで添加し、更に５時間培養を継続する。
得られた培養液を遠心分離し菌体を除去する。

培養液に硫安を添加して、50〜90％飽和度の画
分を分取して抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆを含
む沈殿物を得る。この沈殿物全量を安定化剤含有
緩衝液300mlに溶解し、DEAE―セルローズカラ
ム（5.0×70cm）に加えて吸着させる。これに
0.3M塩化ナトリウムを含む緩衝液で段階的に溶
出させ、UR―３活性部分を分取する。

更に、この溶出液を濃縮しゲル濾過剤トヨパー
ルHW 50Fカラム12.6×100cm）に吸着させ、緩
衝液で溶出しUR―３活性部分を分取し濃縮す
る。この濃縮液をTSK―GEL Ｇ 3000SW（東洋
曹達工業(株)0.75×60cm）カラムを用いた高速液体
クロマトグラフイーを行つた。この溶出曲線は第
３図に示される。

ここでＡの画分をSPF―100―Ｆとし、Ｂの
画分をSPF―100―Ｆとした。Ａの画分を凍結
乾燥した。この凍結乾燥商品は抗腫瘍性物質SPF
―100―Ｆであり、43mgを得た。SPF―100―Ｆ
を被験薬とした抗腫瘍性活性は実験例１に示す
ようにインビトロ（in vitro）実験でその効果を
確認した。

実施例２ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC
21060を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１
と同様に培養した。この場合、ペニシリンＧは
300単位／ml培養液となるように添加し、更に培
養を10時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ
18mgを得た。

実施例３ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは3000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を３
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 61mgを
得た。

実施例４ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 32mgを得た。

第２表培地Ｂマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例５ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第３表に示す培地Ｃを用いて実施例１と同様に
35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは1000
単位／ml培養液となるように添加し、更に培養を
５時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様
に精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 14mg
を得た。

第３表培地Ｃマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 0.5％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 0.5％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例６ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第４表に示す培地Ｄを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 49mgを得た。

第４表培養Ｄマルトース 0.25％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 1.0％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例７ストレプトコツカス・エスピーATCC 21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ 39mgを得た。

実施例８ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21546
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 51mgを
得た。

実施例９ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 38mgを
得た。

実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ 47mgを
得た。

実施例 11 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC 21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
6000μｇ／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF―100―Ｆ
13ｍｇを得た。

実験例１実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF―100―
Ｆのインビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本
文中に記載した抗腫瘍活性の測定方法により行
い、その結果を表―５に示す。

表―５ SPF―100―Ｆの抗腫瘍活性の結果 SPF―100―Ｆ（mg／ml） IR％ 0.125 100.0 0.05 45.2 0.025 36.6 0.013 24.2

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆの紫外
線吸収スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線
吸収スペクトルを示す。第３図は実施例１におけ
る活性画分のTSK―GEL Ｇ 3000 SWカラムを
用いた高速液体クロマトグラフイーにおける溶出
曲線を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性物質
SPF―100―FI。１元素分析Ｃ 45.22〜45.46％Ｈ 6.15〜6.22％Ｎ 11.23〜11.48％Ｏ 36.26〜34.48％ Ash 1.14〜2.36％２分子量ゲル濾過法による測定では、分子量約9000〜
11000である。３分解点本物質は160℃で褐変し、200℃になると黒色
となり分解する。４比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−80゜〜−84゜（Ｃ＝1.00）５紫外線吸収スペクトル本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは、320nm，280nmに吸収が認められる。６赤外線吸収スペクトル 3300cm^-1，2970cm^-1，1640cm^-1， 1530cm^-1，1450cm^-1，1400cm^-1， 1320cm^-1，1260cm^-1，1090cm^-1， 540cm^-1 に吸収が認められる。７溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、ｎ―ブタノール、イソブタノール、ｎ―プ
ロパノール、ｎ―ヘキサン、クロロホルム、ア
セトン、メチルイソブチルケトン、エチルエー
テル等の溶剤には難溶又は不溶である。８塩基性、酸性、中性の区別本物質の0.1％の水溶液のPHは6.95である。９物質の色淡黄色粉末状である。 10 呈色反応ニンヒドリン反応＋ビユウレツト反応＋モーリツシユ反応 ± オルシン塩酸反応 − アンスロン反応＋システイン硫酸反応 ± 11 安定化本物質はＬ―システイン、ジチオスレイトー
ル（DTT）、グリセロール、アルブミン、グロ
ブリン、α―およびβ―サイクロデキストリン
（NH₄）₂SO₄、食塩等の添加によつて安定化さ
れる。２ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF―100―Ｆ生産菌を培養し、培養物から抗
腫瘍性物質SPF―100―Ｆを採取することを特
徴とする抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆの製法。３ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性物質
SPF―100―Ｆ生産菌を培養するに際し、培養
中の適当な時期にペニシリン又はその関連物質を
添加して培養することを特徴とする特許請求の範
囲第２項に記載の抗腫瘍性物質SPF―100―Ｆ
の製法。