JPH0191780A - カルニチンアミドヒドロラ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｌ−カルニチンアミドを加水分解してＬ−力
ルニチンを生成する反応を触媒する新規酵素、カルニチ
ンアミドヒドロラーゼ（以下本酵素と略す）およびその
製造法に関するものである。この新規酵素の触媒反応に
よシ、合成的に安価に見られるＤＬ−カルニチンアミド
から有用物質であるＬ−カルニチンをえることができる
。Ｌ−カルニチンは、脂肪酸のミトコンドリアへの輸送
に必須の物質であり、ビタミンＢＴ　とも呼ばれる物質
で、輸液の成分として、あるいは心臓疾患や脂肪血症の
治療その他に応用される。また他の有用な物質（例えば
アセチ、Ｑ／−Ｌ−カルニチン）製造の中間体として極
めて有用な物質である。本酵素はＬ−力ルニチンの生産
に応用される（特願昭６１−１９８１７５号）産業上有
用なものであり、その効率的な製造法が産業上有用なこ
とも明白である。

従来の技術 従来、Ｌ−カルニチンの製法としては合成法により見ら
れたＤＬ−カルニチンをジアステレオマー法によ遵光学
分割したり、最近では若干の生化学的方法が提案されて
いる（公開特公昭５９−１８３６９４号、同５９−１１
８０９３号など）。しかし、これらの方法は、操作が繁
雑であったシ、原料、酵素が高価であっ；ｔ９、酵素が
不安定であったり、高価な補酵素を必要とするなど、工
業的には不満足なものといわされるをえない。ＤＬ−カ
ルニチン合成の中間体からも一カルニチンをえるために
使用する本発明の酵素カルニチンアミドヒドロラーゼに
ついては従来全く知見がなく、本発明者らによって発見
されたものである。当然のことながら本酵素の生産にカ
ルニチンアミド、カルニチン、γ−プチロペタインを培
地に添加することの効果も新知見である。

発明が解決しようとする問題点と問題を解決するための
手段 本発明者らはＬ−カルニチンの有用性に着目して、エピ
クロルヒドリンから出発する、もっとも効率的なりＬ−
カルニチン合成法の中間体であるＤＬ−カルニチンニト
リルあるいはＤＬ−カルニチンアミドから生化学的に直
接り一カルニチンをえる方法について研究を重ね、広く
保存微生物は勿論、自然界から新しく分離した微生物の
研究結果、新規酵素カルニチンアミドヒドロラーゼを発
見し、さらにこの酵素の生産方法について研究した結果
本発明を完成するに至った。

作用 本発明はｎ−カルニチンアミドを加水分解してＬ−カル
ニチンとアンモニアを生成する反応を触媒する新規酵素
カルニチンアミドヒドロラーゼおよびその効率的製造法
を提供するものである。

本酵素の基質はＬ−カルニチンアミドであり、Ｄ−カル
ニチンアミドには作用しないので、ＤＬ−カルニチンア
ミドに本酵素を作用せしめると、Ｌ−カルニチンアミド
がＬ−カルニチンとなり、作用されなかったＤ−カルニ
チンアミドは残留するので両者を適当な方法により分離
し、Ｌ−カルニチンおよびＤ−カルニチンアミド（さら
にはＤ−カルニチン）をえることができる。

本酵素を生産する微生物は、本酵素の生産能に基いて自
然界から分離し、使用できるが、具体例としてはシュー
ドモナス属の細菌、例えばシュードモナス属細菌０Ａ２
７Ｅ１（微工研菌寄第８９１２号）、シュードモナス属
細菌ＣＡ３０−１１Ｂ（微工研菌寄第８９１０号）、シ
ュードモナス属細菌ｃａｚａ−ｓｏＡ（微工研菌寄第８
９０９号）、シュードモナス属細菌ＯＡ１０−１−５　
（微工研菌寄第９８０８号）、シュードモナス属細菌０
Ａ３２−（！（微工研菌寄第８９１１号）、シュードモ
ナス属細菌ＣＡ３０−５５（微工研菌寄第８９０７号）
をあげることができる。これらの菌株の分類学的性質は
特願昭６１−１９８１７３号に記載した通りであるが次
の如くである。

これらの分離菌は、何れもダラム陰性、好気性の桿−菌
であり、バーゼーズ、マニュアル・オプ・システマチッ
ク・バクテリオロジー（Ｅｅｒ−ｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎ
ｕａｌ　　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｅａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　　）第１巻（１９８４年）に従うと以
下に記載する性質から、同書の分類セクション４のシュ
ードモナダシ工科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ
　）　　の中のシュードモナス（’Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　）属に属する。

以下、分離株の性質の共通性に基いて、若干のグループ
に分けて分類学的性質を記載する。

先ず全分離株に共通する性質を述べると、上記したとお
り、何れもダラム陰性、好気性の桿菌であり、大きさは
Ｏ，Ｓ〜０．８　Ｘ　０．７〜５．０ミクロンと比較的
小さいものから、１．２〜１．５×２．４〜４，２ミク
ロンと比較的大きいものまである（第１表参照）。通常
の条件で多形性は認められず、抗酸性もない。胞子をつ
くらず、運動性で極べん毛を有する。肉汁寒天培養でコ
ロニーは小さく、周縁は金縁、隆起は半レンズ−凸状、
表面は平滑で、光沢は半透明、乳白色〜灰白色（ＯＡ３
０−５５のみは別記するように菌体が黄色）、肉汁液体
培養で、表面の生育はなく中等度に濁った生育をする。

一部の菌（ＣＡ−５２０ｆ；ｒ：代表株とする第７群）
では葉片状の沈でんを生ずるが、他の株では沈でんはな
い。

ゼラチンを液化せず、ＭＲテスｌ−１ＶＰテスト、イン
ドールの生成、でん粉の加水分解は何れも陰性である。

無機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）の利用はコ
ハク酸培地で何れも陽性である。オキシダーゼ、カタラ
ーゼはともに陽性であり、Ｏ−Ｆテストは酸化的である
。

クエン酸の利用は８１ｍｏｎの培地で何れも陽性である
。リドマスミルクでは、０Ａ２７Ｅ１を代表株する１群
が反応をアルカリとし、リドマスを還元するが、他の株
では変化がない（凝固、液化ももちろんない）。

糖からの酸生成は第１表に示した以外に、０Ａ５０−３
５を除いて何れも、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース
、Ｄ−７ラクトース、シュクロース、マルトース、Ｄ　
−）　ＶＪＳＣＩ　−ス、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンノ
ース、Ｄ−フラクトース、グリセリン、でん粉に対して
陰性である。

以下、分離株の性質から更に共通の性質をもつものを群
別して、Ｉ、■、ｍ、ｙ、ｖ、　■の群に分けて分類的
性質を第１表に記載する。

以上のような性質を有する菌は夫々の群について数珠づ
つ分離されている。これらの菌をパーゼエーズ・マニュ
アル・オプ・システマチック・バクテリオロジー１、第
１巻（１９８４年）に従って同定すると、伺えもシュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属に属すると認
められた。

１群はシュードモナス・プチダ（Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ　
’）、およびシュードモナス・ブラフイルジー（Ｐ。

ｄθ１ａｆｉｅｌｄｉｉ　）と多くの性質を共有するが
、前者とはポリβ−・・イドロキシ酪酸の蓄積で、後者
とは水溶性色素の生成、４℃の生育で異なり、他にも該
当する菌種がないので、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　８ｐ、　’）　　と同定して、代表
法０Ａ２７Ｂ１を微生物工業技術研究所ｃ以下微工研と
省略す）に寄託した。■群はシュードモナス・ブラフイ
ルジーと多くの性質を共有するが、アルギニンの利用、
４℃の生育で異る。

硫化水素の生成が陽性でｐＨ５での生育が良好である。

該当する菌種がないのでシュードモナス属菌種（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　　と同定して翫代表株
（！Ａ３０−１１　Ｂを微工研に寄託した。■ソ 群もシュードモナス・ブラフイルキーと多くの性質を共
有するが、水溶性色素の生成、４℃の生育で異る。該当
する菌種がなく、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）と同定して一代表株０Ａ２８−
５ＯＡを微工研に寄託した。

■群はシュードモナス・ブラフイルジーとアルギニンの
利用、イノシトールの利用、４℃の生育で異り、該当す
る菌種がないのでシュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｅｐ、　”）　　と同定して１代表株Ｃ！
Ａ１０−１−５’ｌｊ微工研に寄託した。

■群はシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕ−ｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）に似た性質
を有するが、グルコース、アルギニンの利用で異り、該
当する菌種がないので、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　）　　と同定して代表法Ｃ
Ａ３２−Ｃを微工研に寄託した。■詳は生育に生育因子
を必要とし、菌体が黄色である点で、キサントモナス（
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　）属に属するともみられるが
色素の吸収がキサントモナスンと同定されないので、一
応シュードモナス属に属すると考えた。この群の菌株は
、第１表記載の糖以外にも多くの糖（Ｌ−アラビノース
、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、マルトース、シュクロース、トレノ１０−ス、’［
）−？ニトール、イノシトール）から酸を生成する。シ
ュードモナス属に該当する菌種全見出せず、シュードモ
ナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ８ｐ、）と同定し
て代表法Ｃ！Ａ３０−３５を微工研に寄託した。

微工研に寄託した菌株名と微工研の寄託番号を対応して
表すると次のとおりである。

ＣＡ２７Ｅ１　　・・・微工研菌寄第８９１２号（：！
Ａ３０−１１Ｂ・・・微工研菌寄第８９１０号０Ａ２Ｂ
−５ＯＡ・・・微工研菌寄第８９０９号Ｃ！Ａ１０−１
−５・・・微工研菌寄第８９０８号ＣＡ３２−０　　　
・・・微工研菌寄第８９１１号（：！Ａ３０−３５　　
・・・微工研菌寄第８９０７号これらの微生物の変異株
は勿論、本酵素の生産をコードす遺伝子を組み込んだ生
物も本酵素の生産に用いることができる。

カルニチンヒドロラーゼ生産微生物を培養して本酵素活
性をふくむ培養物をえるには、通常の培養法によればよ
く、特に説明を要しないが、活性の高い培養物をえるに
は、培地中にカルニチンアミド、カルニチン、γ−ブチ
ロベタインの群からなる化合物の１種または１種以上を
含ませることが必要である。これらの化合物の本酵素生
産に対する効果は実施例１に示す如くで、これらの化合
物の１種または１種以上を含む培地では、これらの化合
物を含まない培地に比して本酵素生産量が格段に増大す
ることが本発明により見いだされたのである。

本酵素生産の為の生産菌の培養の他の条件は、使用菌が
好適な生育がえられる条件を選べばよく、この分野の技
術者の常識であるので特に言及しない。

培養時間を長くしたり、遊離剤を加えると、菌体から酵
素が遊離されるが、普通では酵素活性は菌体中に主とし
て存在する。培養終了後、培養物より遠心分離またはデ
過により菌体および不溶物を除いて粗酵素液をえる。さ
らに、菌体中に含まれるカルニチンアミドヒドロラーゼ
は、菌体の磨砕もしくは超音波処理などの手段によって
菌体を破壊して酵素を抽出することによシ粗酵素液をえ
ることができる。勿論、菌体そのものを酵素標品として
使用することもできる。

粗酵素液から有機溶媒分別法、硫安分画比でん法、透析
、等電点沈でん法およびカラムクロマトグラフィーなど
、通常の酵素［！！方法を単独または組合せて用いるこ
とによシ、より精製された形のカルニチンアミドヒドロ
ラーゼをえることができる。固形培地を用いた場合は、
菌体を含む固形培地に水を加え、そのまま、または菌体
だけを集めて、先に述べた超音波処理などの手段により
粗酵素液をえることができる。

カルニチンアミドヒドロラーゼの活性の測定は、カルニ
チンアミドに酵素を作用させて生成するＬ−カルニチン
をＬ−カルニチンアセチルトランスフェラーゼを用いて
定量することにより行うことができる。また妨害物質の
ない場合ハ生成するアンモニアを定量することによって
も行える。

次に本発明の、および本発明の方法で見られる、カルニ
チンアミドヒドロラーゼの酵素化学的性質を示す。

（１）作用、特異性： Ｌ−カルニチンアミドを加水分解してＬ−カルニチンと
アンモニアを生成する反応を触媒する。Ｌ−カルニチン
アミドに作用するがＤ−カルニチンアミドには作用しな
い。またアセトアミド、ブチルアミド、アクリルアミド
、ニコチンアミド、ベンズアミドなどに作用せず既知の
一般的なアミダーゼと全くことなる。

（２）至適ｐＨ： 種々のｐＨでＤＬ−カルニチンアミド２係からのＬ−カ
ルニチン生成量を反応１時間後に測定した結果は第−表
に示した如くであった。この結果から至適ｐＨは６〜７
と判定される。

（３）　　ｐ）１安定性： 本酵素は一般にｐｎ　５〜８の範囲で安定性が高いが特
にｐＨ７〜８の範囲でもつとも安定である。

（４）至適作用温度： 本酵素は２６〜４０℃でよく作用し、その至適作用温度
は約４０℃である。２０℃以下、４５℃以上では活性が
低下する。

第　　２　　表 臀■゛：クエン酸−燐酸ナトリウム緩衝液■ニリン酸ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 ｍニホウ酸−塩化ナトリウム−炭酸ナトリウム緩衝液 （５）温度安定性： 本酵素は２６℃又は４℃で７日間保存してもかなり安定
であり、−７０℃での保存に比してそれぞれ６２％、９
２％の活性を保持していた。４５℃以上では活性は急速
に低下する。

（６）分子ｔニ ゲル濾過法（セルロファインＧＯ−７００ｍ使用）で算
出した分子量は約５６万である。

（７）阻害剤： １ｍＭでＡｇ　　イオンが僅かに阻害を示したが他の金
属イオ７　（ｃｕ　ＨＦｅ　＃　Ｍｎ　ｔ　’ｇ　ｒＺ
ｎ、　Ｇｏ、　Ｍｉ　’）　　による阻害はなかった。

１０ｍＭではＡｇイオンが顕著な阻害を示し、Ｆ’ｅ、
Ｎｉで僅かな阻害を認めた。ＥＤＴＡ、２−メルカプト
エタノールも１ｍＭ、１０ｍＭで阻害を示さなかった。

以下実施例についてより詳しく説明する。

実施例１ グルコース１ｑ６．ペプトンα５％、Ｋ、ＨＰＯ４（１
７５％、　ＫＨ，ＰＯ，０，２５％、　Ｍｇ１９０４　
・７　Ｈ２Ｏ０，０１％、ＦｅＳＯ４＠　７　Ｈ２Ｏ０
，００１％の組成の培地に第３表に示した化合物を加え
た各培地にシュードモナス属細菌菌抹Ｃ！Ａ２８−５Ｏ
Ａ（微工研菌寄第８９０９号）を植菌して、３日間振と
う培養してえた菌体ｉＤ？、−力ルニチンアミド１０憾
をふくむ反応液に、生育培養液中の濃度と同等の濃度に
けん濁して、２６℃で９６時間靜装反応させたときのＬ
−カルニチンアミドのＬ−カルニチンへの転換率は第３
表に示した如くであった。この結果からカルニチンアミ
ドヒドロラーゼ生成に対するカルニチンアミド、カルニ
チンおよびγ−ブチロベタインの効果は明らかである。

第　　３　　表 実施例２ ＤＬ−カルニチンアミド０．５％を含む実施例１の培地
で培養した菌株Ｃ！Ａ２８−５ＯＡの培養液８００−か
ら菌体を集め、１０ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中
で石英砂とともに菌体を磨砕して遠心分離して、無細胞
抽出液２０−をえた。これに５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液３
００−を加え、硫安を９０％飽和に加えて生ずる沈でん
を２０−の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にとか
し、５０　ｍ　Ｍ　＋）ン酸緩衝液に対して透析し、見
られた酵素液４０−をミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　
）膜（工ｍｍｅｒｓｉｂｌｅ　　ｃ　ｘ　１ｏ　）を通
して濃縮しく４℃、２４時間）′、４−の酵素液をえた
。これをセルロファインＧｏ−７００＝（チッソ株式会
社）（粒径４５〜１０５μｍ）によるゲルクロマトグラ
フィーにかけ（カラム、１０×５２０１１１１％ゲル容
積７０−）、０．０５Ｍ　）リス−塩酸（ＰＨ７，５）
＋αＩ　Ｍ　ＫＣｌ０液を通じて溶出し、０．５−宛分
画した。

その結果、溶出分画−５１でもつとも活性が高く、この
分画は２８０　ｍｐ　の０．Ｄ、が０．０３９で、２６
℃、６０分の反応でｏ、５ｑ６ｒｎｔ／−のＬ−カルニ
チンを生成し、比活性で（占位０．Ｄ。

あたり）１＆８であり、菌体抽出液の比活性の４１８１
倍の値であった。

実施例３ ＤＬ−カルニチンアミドα５％をふくむ実施例１の培地
で生育した菌株２８−５ＯＡの培養液３００−から菌体
を遠心分離により集めて、石英砂と５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）中で磨砕して、遠心分離により３０−
の無細、＠抽出液をえた。生菌体および無細胸抽出液を
もとの菌体量換算でそれぞれ生育培養中と同＠度でＤＴ
、＋−カルニチンアミド０．２　％の反応液中で反応さ
せ、反応時間とＬ−カルニチンの生成量の分析結果を表
示すると第４表の如くであった。

この分析値からα５時間迄反応が直線的に進むと考え、
この速度から菌体及び抽出液の酵素力価を国際単位で表
わすと、生育培養中の菌体の力価は培養液１−あたりａ
、１２２ｒｑ、／−÷１６１．２μ？　（カルニチンの
１ｐ　ｍｏｌ　’）÷６０＝　０．１２５　ｕ　／　ｒ
ｅｄ　；抽出液では（１，１，ａ　ｓ　ｍｙ、／　ｔｄ
÷１６１　ｐ？÷６０分＝ｏ、１ｓｕ／−と計算される
。

第　　４　　表 発明の効果 本発明は、上述したようにカルニチン合成の中間体で安
価に合成されるＤＬ−カルニチンアミドを不斉的に加水
分解してＬ−カルニチンを生成する反応を触媒する新規
酵素およびその効率的製法を提供するもので、光学活性
カルニチンの製法に効率的な手段を提供するものである
。

特許出願人　　パイオール株式会社 代表者　　中　山　　清 中央化成品株式会社 代表者　　水　島喜三部 手続補正書（自発） 昭和６２年２月ｌＳ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−カルニチンアミドを加水分解してＬ−カルニチ
   ンを生成する反応を触媒する新規酵素カルニチンアミド
   ヒドロラーゼ。 ２、下記の理化学的性質を有する特許請求の範囲第１項
   記載の酵素カルニチンアミドヒドロラーゼ。 記 １）作用及び基質特異性 Ｌ−カルニチンアミドを加水分解してＬ−カルニチンと
   アンモニアを生成する。 ２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ６〜７ 安定ｐＨ範囲７〜８ ３）作用適温の範囲 ２６℃〜４０℃でよく作用し、至適作用温度は４０℃で
   ある。 ４）ｐＨ、温度などによる失活の条件 ｐＨ７〜８でもつとも安定であり、低温ほど安定である
   が４℃では７日間で９０％ 以上の活性を保持する。 ４５℃以上では急速に失活する。 ５）分子量 ゲルろ過法による測定で約３．６万 （セルロフアインＧＣ−７００ｍ使用） ６）阻害剤 高濃度（１０ｍＭ）の銀イオンにより阻害される。ＥＤ
   ＴＡ、２−メルカプトエタノールは１０ｍＭでも阻害し
   ない。 ３、カルニチンアミド、カルニチン、γ−ブチロベタイ
   ンの群からなる化合物の１種または１種以上をふくむ培
   地中で微生物に培養することを特徴とするカルニチンア
   ミドヒドロラーゼの製造法。