JPH02124830A - ガングリオシドーリポソームビヒクル中の刺激因子の制御放出製剤 - Google Patents

ガングリオシドーリポソームビヒクル中の刺激因子の制御放出製剤

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JPH02124830A
JPH02124830A JP1188676A JP18867689A JPH02124830A JP H02124830 A JPH02124830 A JP H02124830A JP 1188676 A JP1188676 A JP 1188676A JP 18867689 A JP18867689 A JP 18867689A JP H02124830 A JPH02124830 A JP H02124830A
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ngf
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cholesterol
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Dikla G Roufa
デイクラ　ジー．ロウファ
Lucia G I Marshall
ルシア　ジー．アイ．マーシャル
Kanaiyalal R Patel
カナイヤラル　アール．パテル
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GD Searle LLC
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は薬剤送達システムの分野に属し、全身的治療目
的で薬剤を制御放出するための製剤に関する。とくに、
がングリオシドーリポソームげヒクルに捕捉された刺激
因子（ｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　、栄養因子とも
いうが、以下刺激因子と記す）を含有する制御放出製剤
に関する。
発明の背景 神経成長因子（ＮＧＦ　）のような刺激因子の全身的送
達は、ヒト生体が循環系内に刺激因子を急速に分解する
酵素を含有するため、困難である。刺激因子の送達に関
する生物学的検討は、現在までのところ、神経傷害の処
置におけるＮＧＦの効果を研究するため実験動物に大量
のＮＧＦを注射した場合に限られている。このような注
射は、急速な分解のために、通常、大量のＮＧＦを必要
とする。
タンパク質や他の化合物を動物に導入するための送達シ
ステムはよく知られている。と〈疋興味が増しているの
は、リポソームのような、薬剤送達システムに使用され
る脂質膜ビヒクルである。
たとえば、米国特許筒４，５２２，８０３号およびＰＣ
Ｔ出１１！！ｔｒｓ８５１００２２０号には、ホルモン
、タンパク質または糖タンパク質のような生物活性化合
物を捕捉し、生物活性化合物を標的組織に送達するため
の多層模胞の形のリポソーム製剤が記載されている。酵
素を標的臓器に送達するための糖脂質−リポソーム製剤
の研究では、糖脂質成分の糖残基が、標的臓器内の酵素
の分布に影響できることが甲らかにされた（　Ｍ、　Ｎ
ａｏｉら：　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｉｎｔ、、９：２６７〜２７２．１９８４）。日本特許
明細書筒５７−１４６，７１０号には、様々な成分たと
えばリン脂質、ゴングリオシｖ１セレプロシドおよびサ
ルファチｒからなる膜壁を有し、血液脳関門を通過して
送達させるための酵素を封入したリポソーム型マイクロ
カプセルが記載されている。
様々な種類の改良リポソームが、生物学的システムにお
ける送達ビヒクルとしで考案され、検討されている。た
とえば、リボノーム表面上に様々な種類のグリコシドを
接合させたリポソーム製剤の　１２５１−がンマグロプ
リンの組織分布への影響が検討されている（　Ｐ、　Ｇ
ｈｏｓｈら：　Ｂｉｏｃｈｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ＋　６３２　（４）　：　
５６２〜５７２゜１９８０）。様々なアシアログリコシ
「、がングリオシド、ジアール酸または脳リン脂質から
なるａｑｉ内にマーカー化合物（エチレンジアミン四酢
酸、ＥＤＴＡ　）が封入された多層リポソームが製造さ
れている。この場合、リポソーム模にシア口がングリオ
シｒ成分を含有させると肝組織にょかにされた（　Ｍ、
Ｍ、　Ｊｏｎａｈら：阻ｏｃｈｅｍ、阻ｏｐｈｖｓ。
Ａｃｔａ、５４１：３２１〜３３３．１９７８）。
がングリオシドと膜形成脂質材料の相互作用についても
検討が行われてきた。たとえば、二層膜構造は、円錐形
状のホスファチジルエタノールアミン材料と逆にした円
錐形状のがングリオシＹＧＤｌ、！Ｌの相補的バッキン
グによって形成でき、これらの二層構造は、センダイウ
ィルスによって誘発されるリポソームの漏出を検討する
ために、膜内のボンブリオシド濃度を変化させて膜の流
動性を調節するのに有用であると述べられている（Ｙ。
Ｔｓａｏら：　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｖｓ、　
Ａｃｔａｓ　９００　（１）７９〜８７．１９８７）。
イオノフオアグラミシジンＤを含有するモノシア口がン
グリオシド（ＣＭ工）ミセルと、リン脂質からなる人工
的な平面二層膜が作成されている。様々なイオノフオア
／がングリオシド比でＧＭ１ミセルを添加すると模コン
ダクタンスが上昇することが−らかにされている（Ｆ。
Ｇｉｍｂａｌｅら：　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅ
ａ、ｅ　１２　：　５５５〜５７５．１９８４）。
ある種のがングリオシド材料が、生物学的システムにお
いて薬理活性を示すことも知られている。
たとえば、イタリヤ特許第１，０４６，０５１号には、
％／−，シー　トリーおよびテトラ−シア口がングリオ
シｒが、中枢および末梢神経系の障害、たとえば動眼神
経麻痺、三叉神経痛、顔面神経麻痺（ベル麻痺）、急性
多発性神仔根炎（ｊＰシランレー症候群）、を髄神経根
炎、末梢神経の外傷性病変、毒性物質による末梢神経の
病変、アルコール性および糖尿病性多発神経炎、分娩麻
痺、坐骨神経麻痺、運動神経病変、筋萎縮性側索硬化症
、を髄病性筋萎縮、進行性球麻痺（ランバートイートン
症候群）、筋ジストロフィー　ＣＮＳ　ｉ？よびＰＮＳ
レベルにおける神経シナプス伝達の変化、二次性意識障
害、頭蓋部外偏性障害、脳血管障害、血栓症および塞栓
症の治療に有用であることが記載されている。
Ｒ，Ｗ、　Ｌｅｄｅｅｎの報告（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏ８ｃ
ｉ、　Ｒａ８−ｓ　１２：１４７〜１５９　、１９８４
　）には、がングリオシｒの軸索発生および神経栄養作
用の研究があり、外因性に投与されたがングリオシドが
軸索の形成を促進することが示されている。外因性が７
グリオシドが、ウシ胎仔血清の存在下ＰＣ１２細胞のＮ
ＧＦ誘発軸索レクし−トメントの開始潜時を変えること
が明らかにされている（　Ｒ，Ｋａ　ｔｏｈ−８ｅｍｂ
ａら：　Ｓａｃ＋Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓｔ、ｔ　
１０　（１）　；　３７　ｓｌ　９８４）。神経の成長
に対するボングリオシダの影響の研究では、ウサギ抗−
〇Ｍ１抗体がニワトリ胚のＮＧＦ誘発後根神経節の成長
を遮断することが明らかにされ、これはがングリオシド
による軸索形成の促進を示すものと推測されている（　
Ｍ。
Ｓｃｈｗａｒｔｚら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡｓ　７９：６０８０〜６０８
３，１９８２）。米国特許第４．５９３，０９１号には
、Ｎ−アセチルがラクトサミンもしくはＮ−アセチルグ
リコサミン残基およびグルコースもしくはがラクトース
残基からなる炭水化物のヒｒロキシ基にＮ−アセチルニ
ューラミン酸またはＮ−グリコリルニューラミン酸のカ
ルどキシル基が結合して生成したラクトン環全有するこ
とを特徴とする内部エステルがングリオシド誘導体が記
載され、このようながングリオシドの内部エステルは、
神経再生刺激および傷害神経組織の治癒に、母体のがン
グリオシドよりも有用であることが示されている。ヨー
ロッパ特許出８ｗｃ１８３，５７２号には、ウシ大脳皮
質から抽出され、とくに末梢性神経炎、三叉神経痛シよ
び帯状庖疹の治療に有用な鎮痛活性を有するボンブリオ
シド混合物（５ｖｅｎ−ｎｅｒｈｏ］−ｍ構造型０Ｍ１
．　ＧＤｌａ。
ＧＤｘｂ　−ＧＴｔｂ　）がＰ載されている。ヨーロッ
パ特許出願第１９５，１６９号には、虚血誘発脳卒中の
治療に、がングリオシドＧＭ１またはその内部エステル
を投与すると動脈血圧を上昇させることなく脳血流が増
大することが記載されている。米国特許第４，６３９．
４３７号には、外傷または疾病による神経傷害に基づく
末梢性および中枢性神経障害の、噴霧用液体または粉末
剤型としたがングリオシＶ内部エステステルの吸入によ
る呼吸器ｌ１ｌＫを介した全身投与での治療が記載され
ている。
発明の要約 神経成長因子（ＮＧＦ　）のような刺激因子の全身投与
または送達用製剤が、刺激因子と、この刺激因子と混合
するがングリオシ「含有リポソームからなる配合組成物
によって提供される。この配合組成物は、（ａ）神経変
性疾患の治療もしくは神経組織の再生、または化学物質
、代謝物、機械的原因、ウィルスもしくは放射線によっ
て生じる損傷からの神経組織の保護に治療的に有効な量
の刺激因子、卦よび（ｂ）脂質成分シよびがングリオシ
ｒ成分からなる担体から構成され、上記担体が刺激因子
と会合またはそれを含有していて、刺激因子の徐放およ
び／または刺激因子の分解酵素からの保護を可能にする
送達用ビヒクルを提供する。
これらの製剤はま之、担体が刺激因子を含有する嘆胞ま
たはリポソームの形状であることを特徴とする。このリ
ポソームは、脂質成分とボンブリオシド成分からなるま
たはそれらによって形成される壁膜または殻膜であるこ
とを特徴とする。このがングリオシド含有リポソームの
殻壁膜にはさらにステロイド化合物またはその誘導体の
ような安定化成分を含有させることもできる。
図面（大きさを示すものではない）は、以下のように本
発明の様々な態様を例示するものである。
第１図は、糖脂質担体中の成分として有用な代表的ボン
ブリオシＶの構造式である。
第２図は、数種の代表的がングリオシ「のブロックダイ
アダラムであり、標準記号を付しである。
第３図は、単層の脂質二重層とがングリオシｒ４を包含
するリボンーム成分１〜４を示する。すポソームと会合
またはそれに含有される刺激分子の存在の可能性を５〜
９で示す。
第４図は、多層の脂質二重層１とがングリオシド４′ｆ
：含有するリポソーム成分１および４を示す。
リポソーム内における刺激分子の存在の可能性を５．６
および９で示す。
第５図は、非封入”５Ｉ　−ＮＧＦ　（−）　、　ＤＰ
ＰＣ：コレステロール：がングリオシト（ｏ）　ｔたは
コレステロール−１：ボンブリオシド（・）に封入され
た”Ｉ　−ＮＧＦを静脈内投与内したのちに主要臓器に
残存する１２１５１−　ＮＧＦの注射用量に対する百分
率であり、ＮＧＦ封入の効果を示すグラフである。
第６図は、非封入１２５１−　ＮＧＦ　（ＩＩ）　、　
ＤＰＰＣ：コレステロール：ボングリオシト（ロ）ｔた
ｈコレステロール−１：がングリオシド（・）に封入さ
れた１２１５Ｉ−ＮＧＦを静脈内に投与したのち様４表
時点での、気管、腎臓および腸を除くすべての主要臓器
に残存する：Ｌ２５１−　ＮＧＦの注射用量に対する百
分率であり、ＮＧＦ封入の効果を示すグラフである。
第７図は、非封入１２ｓｒ　−ＮＧＦ　（ＩＩ）　、　
ＤＰＰＣ：　コレステロール：がングリオシ）？（ロ）
マたはコレステロール−１：ボンブリオシド（・）に封
入された１２５Ｉ　−ＮＧＦを静脈内に投与したのち様
々な時間間隔での、肝臓に存在する”’Ｉ　−Ｎ（）Ｆ
の注射用量に対する百分率であり、Ｎ（）Ｆ封入の効果
を示すグラフである。
第８図は、非封入”Ｉ　−ＮＧＦ　（−）　、　ＤＤＰ
Ｃ：コレステロール：がンクリオシｐ（ｏ）ｔたけコレ
ステロール−１：がングリオシ）′（・）に封入された
”５Ｉ　−ＮＧＰを静脈内に投与したのち様々な時点で
の、肝臓、気管、腎臓および腸を除くすべての主要臓器
に存在する１”５Ｉ　−ＮＧＦの注射用ｔｌＣ対する百
分率であり、ＮＧＦ封大の効果を示すグラフである。
第９図は、非封入”Ｉ　−ＮＧＦ　（０）　、コレステ
ロール−１：　５４がングリオシｐ（・）マたはコレス
テロール−１：２１：ｌがングリオシ「（Δ）に封入さ
れた１２’Ｉ　−ＮＧＦを静脈内に投与したのち様々な
時点での”５Ｉ　−ＮＧ！Ｆ脳／血液比を示すグラフで
あり、ＮＧＦ封入のその比に及ぼす効果を示すグラフで
ある。
好ましい態様の説明 有効な薬剤送達製剤は以下の４つの基準、す表わち（１
）送達すべき薬剤を封入する安定な模壁を形成する能力
、（２）肝臓において肝細胞による分解を最小限にする
のに十分大きく、肝鷹のクツパー細胞による分解を畢小
眼にするのに十分率さいサイズの胞嘆を形成する能力、
（３）刺激因子を急速力酵素分解から保護する能力およ
び（４）活性薬剤を治療的に有効な速度で標的組織に放
出する能力を満足しなければならな贋。がングリオシｒ
含有リポソームは、刺激因子の全身送達のための４つの
基準のすべてを満足することが明らかにされた。本発明
の製剤によって得られる他の利点は、標的臓器に、刺激
因子たとえばＮＧＦまたはＮＧＦ’様物質と、ボンブリ
オシＶの両者を同時に送達できることであり、この組合
せによって治療効果の増大が達成される。
刺激因子は細胞間の相互作用を仲介する。これらの相互
作用は、ホルモンおよび神経伝達物質が限局されるのと
ほぼ同じ方式で限局される。刺激分子、ホルモンおよび
神経伝達物質は、その作用様式によって一義的に区別さ
れる細胞外メツセンジャーである。刺激因子は細胞の生
存、成長および／または分化に必要な分子である。神経
刺激因子は神経組織に影響する相互作用を仲介する。ミ
リセカンドまたは秒の時間単位で測定される神経細胞間
の通常のシナプス伝達と鴨なり、神経刺激因子の相互作
用は、日、月の単位でまたは生体の生涯といった時間単
位で発現する。神経刺激因子の原型はＮＧＦである。ｒ
　ＮＧＦ様物質」の語は、神経組織の生存、成長および
／または分化を刺激または増強する能力を有することを
特徴とする分子を包含する。この語は原型刺激因子、Ｎ
ＧＦ、ならびにβ−ＮＧＦ　ｂよび生物学的に同等なＮ
ＧＦ　ｂよびβ−ＮＧＦの類縁体たとえばｄＪｓｌ−ｇ
　ＮＧＦを包含する。
ＮＧＦおよびＮＧＦ’様物質は、哺乳動物システム内で
、グリコシＶ成分を有することを特徴とする糖脂Ｅ担体
内に封入されると、酵素分解から保護される。これらの
がングリオシド含有糖脂質担体は、刺激因子を捕捉し、
ヒト生体の酵素による分解からＮＧＦ様タンパク質を保
護するシステム、−収約にはがングリオシド修飾ビヒク
ルを与える。
がングリオシド修飾すボンームピヒクルはＩｌ激因子の
全身的送達にとくに適していることが明らかにされた。
「ボンブリオシＶ修飾リポソームビヒクル」または「が
ングリオシＶ含有すボンームピヒクル」の語は、脂質成
分に挿入された約５チ〜約２０憾のボンブリオシド成分
を含有する単層ま念は多層の璧膜からなる珠状体を意味
する。
「ボンブリオシｒ」の語は、親水性オリゴ糖残基を１個
または２個以上のニューラミン醸基とともに含有する一
群の天然の酸性スフインデ糖脂質およびその任意の誘導
体を意味する。このようながングリオシドには、たとえ
ば、内部エステル、アミｈ４ｐ１アシル化誘導体、塩等
の生成によって化学的に修飾された天然のがングリオシ
ドも包含される。ボンブリオシドはほとんど大部の組織
の膜に見出され、神経組織とぐに脳皮質組織に高濃度に
存在する。哺乳動物の脳は一般に、第１図に示すように
、４種の基本構造単位、長鎖アミノアルコール、脂肪酸
、オリゴ糖残基および１個または２個以上のシアロシル
残基から構成される。
長鎖アミノアルコールは脳ゴングリオシド中に存在し、
４−スフインク９シンおよびその長鎖類縁体４−アイコ
ンスフィンｒニンとして同定される。
これらの化合物は通常、スフィンデシンと呼ばれる。相
当する飽和化合物もがングリオシＶ中に少普存在する。
脂肪酸は、スフィンデシン塩基にアミド結合によって連
結している。脳のがングリオシドではこの脂肪酸の９５
幅以上がステアリン酸である。少鎗存在する他の脂肪酸
には、アラキドン酸、パルミチン酸またはパルミトレイ
ン酸がある。アミノアルコールと脂肪酸で「セラミド」
と呼ばれる単位を形成し、これががングリオシド分子の
疎水性部分を提供する。
セラミｒに結合するオリ？糖は、がングリオシドが属す
るスフインデ糖脂質の大きな群を特性づける。スフィン
が脂質は、セラミドに直接連結する炭水化物に基づいて
２稲のサブグループに分類される。第一の小さなサブグ
ループはがラクトシルセラミドに由来するものである。
大部分のスフィンが糖脂質およびすべてのボンブリオシ
「はグルコシルセラミげに由来するサブグループに属す
る。
ジアール酸は、脳がングリオシｒ中では主にＮ−アセチ
ル型で存在するが、あるガングリオシド種ではＸ−グリ
コリル型が同定されている。この残基は一般にニューラ
ミン酸（ＮＡｒｚＡまたはＮ（）ＮＡ）と呼ばれている
。
がングリオシＶの親水性は、オリデ糖鎖とこの鎖【結合
したシアロシル残基の数に基づくものである。
哩乳動物脳の全がングリオシド含量の９０４を占める５
種の主要な哨乳動物脳がングリオシドを第２図にゾロツ
クダイアグラムの形で示す。これら５ａ！のがングリオ
シＶば、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏ１ｍ命名法に従った標準記
号で示される。この命名法ではルートオリ♂糖上の置換
基が名称の最初に、置換基が存在する単糖を示すロー寸
数字（セラミＦから数えて）によって与えられる。下付
きのアラビア数字はグリコシド結合の位置を示し、ＧＭ
ｌ、　０Ｍ２゜０Ｍ３　、　ＧＤｌおよびＧＴｌである
。Ｍ、ＤおよびＴの文字はシアル酸残基の数（それぞれ
、モノ、ジおよびトリ）ヲ示す。文字の後の数字は５か
ら非電荷糖残基の数を引いて決定される。ＮＡＮＡ　＝
　Ｎ　−７セチルニユーラミン（ジアール）酸、ＧａＬ
−；ｆｆラクトース、Ｇｌｃ−グルコース、Ｇａ１ＮＡ
Ｃ−Ｎ　−アセチルがラクトサミンである。Ｇａｌ　、
　Ｇｌｃ　ｆｒよびＧａ１ＮＡＣはすべて非電荷で、Ｎ
ＡＮＡは負の電荷をもっている。
リポソームは、捕捉した水相を囲む二重層膜からなる殻
壁を有する膿胞である。リポソーム膿胞は単一の嗅二重
Ｉ！１をもつものでも、また隣接する同心の嘆二重層が
水層で分離され、玉ねぎの皮のような構造をとってもよ
い。リポソームは通常、反応容器中でリン脂質を有機溶
媒に懸濁し、この混合物を蒸発乾固して反応容器の内壁
上にリン脂質残渣またはフイ失を形成させ、ついで水を
加えてリン脂質フィルムを膨潤させ、次にフィルムを機
械的に攪拌して殻壁二貫層膜を有する膿胞を生成させる
ことによって製造できる。この二重層膜は、脂質成分の
極性、親水性頭部が水相の方向を向き、一方、脂質成分
の非極性、疎水性編部が二重層膜の内側を向いて配列し
たものである。
第３図に例示したように、薬剤送達システムは、極性の
親水性頭部基２と非極性の疎水性炭化水素編部３をもつ
リン脂質を含有し、膜二重層と呼ばれる膜壁１を有する
膿胞から構成される。リン脂質と構造的に類似し、同様
に配列した極性および非極性部分を有するボンブリオシ
ｒは、リン脂質の間に散在する。上述のように配合する
と、リン脂質およびがングリオシド頭部および編部が膜
壁を形成する。第４図に例示するように、薬剤送達シス
テムは、２個または３個以上の脂質二重層１が多層リポ
ソームを形成している膿胞からなるものであってもよい
。刺激因子は、第３図および第４図に示すように、膜胞
の璧１に対して６．Ｔ。
８および９で示したような位置に、膿胞と会合してまた
はその内部に捕捉されて存在する。
リボソームは、脂質フィルムに水性溶液を加え、攪拌す
ることによって形成される。脂質の極性頭部基２はそれ
自体を水性環境に配合し、一方、非極性または疎水性編
部３は他の疎水性脂質または残基に隣接してそれ自体を
配列させる。
リボンーム膜を作るために用いられる脂質は一般に、リ
ン脂質、コレステロール、修飾コレステロール化合物た
とえばコレステリル−３−ポリオキシエチレン（ＣｈＯ
ｌ−１）である（　Ｋ、Ｒ，Ｐａｔｅｌら：　Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、　７９７　
：　２０〜２＜Ｓ、１９８４参照）。通常、脂質をがン
グリオシドと一緒に混合すると、がングリオシｒ含有脂
質フィルムが生成する。ついで、緩衝溶液中刺激因子た
とえばＮＧＦまたはＮＧＦ様タンパク質をがングリオシ
ド含有脂質フィルムに加えると刺激因子を含有する膿胞
が生成する。
がングリオシド含有リポソーム膜は、脂質フィルムの製
造時に作成される。保存脂質溶液に約５〜約２０重１−
＝１の量のがングリオシド材料を加えたのち、ロータリ
ーエバポレーターで蒸発させると脂質フィルムが生成す
る。−膜内に有用ながングリオシｒはＧＭ、　、　ＧＤ
ｌｉ−よびＧＴｌである。がングリオシド４は瞑二重層
中で極性頭部基とともに水性環境に配向し、疎水性編部
は非極性炭化水素環境内にそれ自体を配列させる。
刺激因子は、リポソーム生成時に約Ｉ　Ｑ／ａ／の刺激
因子を含む溶液（緩衝液中に溶解）を加えることにより
、脂質フィルムに導入される。刺激因子を脂質フィルム
に加え攪拌すると、脂質は添加された刺激因子を７，８
および９に捕捉し、また刺激因子が５に挿入されもしく
は６に封入された膜壁が生成する。
ボンブリオシｒ修飾リポソームビヒクルは以下に詳述す
る操作に従って製造された。これらのビヒクルの製造に
は、１１１ｔ″ｆ！たは２種以上の脂質材料と１種撞た
に２種以上のがングリオシＶ材料の混合工程が包含され
る。これらのビヒクルの作成に適当な脂質材料てはリン
脂質材料およびコレステロール誘導体が包含される。リ
ン脂質の例には、ジパルミトイルホスファチジルコリン
（ＤＰＰＣ。
レシチンとしても知られている）、ジステアロイルホス
ファチジルコリン（Ｄ８ＰＣ）　、シミリスチルホスフ
ァチジルコリン（ＤＭＰＣ）　、ジパルミトイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（Ｄｐｐｍ　）、ジステアロ
イルホスファチジルエタノールアミン（Ｄｓｐｇ　）　
、シミリスチルホスファチジルエタノールアミン、ホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＥ　）　、ホスファチ
ジルセリン（ＰＳ）、ジパルリストイルホスファチジル
セリン（ＤＭＰＳ　）がある。脂質の作成に使用するの
に適当なコレステロール誘導体には、コレステロール−
１（）　ＩＪエトキシコレステロールまたはコレステリ
ル−３−ポリオキシエチレンＣＨＯＬ　−１）が包含さ
れる。適当な糖脂質材料は、混合層−ウシがングリオシ
ドであり、これらのがングリオシＶは通常、ＧＭｌ。
（）ＤｌａおよびＧＴｌとして同定される。これらのが
ングリオシドの式は次のとおりである。
ＧＭ、　　ＩＩ３α−Ｎ８ｕＡＣ−Ｇｇ０８ｅｒＣ’ｅ
ｒ（）Ｄ１ａＩＩ’α−ＮｅｕＡｃ−ＩＶ３−α−Ｎｅ
ｕＡＣ−ＧｇＯ３８４ＣｅｒＧＤ１ｂＩＩ３α−（Ｎｅ
ｕＡｃ）２０ｇＯｓｅ４ＣｅｒＧＴ１ｂＩＩ”α−（Ｎ
ｅｕＡｃ″）２−１ｙ３−α−Ｎ８ｕＡＣ−ＧｇＯ５Ｉ
９４Ｃｅｒ脂質およびがングリオシｒを有機溶媒に溶解
した。ついで、脂質−がングリオシドフイルムを、４５
℃で有機溶媒を蒸発させて平滑な脂質膜を生成させるこ
とによって製造した。
ＮＧＦまたは１２５Ｉ　−ＮＧＦはリン酸緩衝食塩溶液
（ＰＢＳ　）に溶解させ、ついで乾燥脂質フィルムに添
加した。脂質フィルムをＮＧＦの水性溶液と攪拌するこ
とにより、ＮＧＦをリポソーム中に封入した。
洗浄および５０００　ｒｐｍでの２０分間の遠心分離を
何回も実施して、ＮＧＦ封入リポす−ム（ペレット）を
封入されなかったＮＧＦから分離した。
これらの操作によって製造された製剤を第１表に示す。
第 ■ 表 処 方 封入１２５　Ｉ　−ＮＧＦ’　％” ２０．００ηゴングリオシド １２．５０　ｍ９０Ｍ１ ＮＧＦが封入された、また封入されていない様々な処方
について粒子径の測定を行った。粒子径の均一度の測定
は、光散乱法によって行った。光散乱の測定の前にすべ
てのリポソーム処方を１．２ミクロンのセルロースフィ
ルターを通して濾過した。
第ｎ表には、ＮＧＦが封入されたまたはされていない様
々な処方について相互に比較した結果を示す。
有用な製剤は、がングリオシド修飾すボンームの粒子径
が約０．０１μから約１０μの範囲の製剤である。好ま
しい粒子径の範囲は約０．０１μ〜約５μであり、さら
に好ましい粒子径の範囲は約０．０１μ〜約２μである
。治療用量のＮＧＦ含有製剤は、少なくとも７５憾が約
０．０１μ〜２μの平均粒子径を有する粒子かなること
がとくに好ましい口 第■表のデータから明らかなように、試験したリポソー
ム製剤は、一般に、光散乱法で測定した平均粒子径に２
相性の分布を示した。膿胞のサイズの分布は、既知の方
法、たとえば超音波処理および微小流動化法の使用によ
って様々に変動させちことができる。
生物学的評価 本発明の製剤は、原型神経刺激因子ＮＧＦを、非封入Ｎ
ＧＦおよび各種の薬剤送達処方または担体と配合したＮ
ＧＦとして全身投与後の組織分布および生物学的利用性
を明らかにすることによって評価した。
封入の研究に使用したＮＧＦは、Ｂｏｃｃｈｉｎｉおよ
びＡｎｇｅｌｅｔｔｉの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　８ｃｉ。
ＵＳＡ　、　６４　：　７８７〜７９４．１９６９）に
従って成熟マウス顎下線から精製した２、５８サデユニ
ツトであった。組織分布の研究に使用した２、５８ＮＧ
ＦのヨーＶ化は、ラクトペルオキシド法（Ｍａｒｃｈａ
ｌｏｎｉｓ　：　Ｂｉｏ　Ｃｈｅｍ、　Ｊ、ｅ　１１３
　：　２９９〜り０５，１９６９）を使用して行った。
２．５８ＮＧＦ　１０　ｆｉ９を１ｍｃｉのＮａ”Ｉ　
（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）と反応させた。カウント数によ
って測定したタンパク質への１２１ｓＩの導入率は使用
した１２ＪＳ１の７０〜９（１１０範囲で、これは比活
性１．８〜２．３　Ｃ１／μｍｏｌｅ　ＮＧＦに相当し
た。標識タンパク質は１２５工が導入されていないタン
パク質から８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５Ｍ　　ＰＤ−１
０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用いたクロマトグ
ラフィーによって分離した。
放Ｈ標識”Ｓ　−ｒ　−神経成長因子（１”ｌＳｔ　−
ＮＧＦ）は各稽リポソーム製剤によって封入された。本
明細書に例示した生物学的研究に用いられた材料は、担
体を使用しないｌｚｓニー　ＮＧＦ　（Ａ）　、混合が
ングリオシ−（Ｓｉｇｍａ　）　５　％含有ＤＰＰＣ’
　：　ｊレスチロール（モル比２：１）に封入された１
２５Ｉ　−ＮＧＦ（処方Ｂ）、または混合がングリオシ
）”５４含有コレステロール−１（トリエトキシコレス
テロール）に封入されたＩＪ５１−　ＮＧＦであった。
各種製剤を、体重約５０９の２〜３月齢スイスーウニデ
スターマウスの尾静脈に注射した（ｉ、ｖ、）。各動物
には最大２μＣ１の標識りがンＶを総容ｔ　Ｏ，２ＯＮ
として注射した。試験製剤の１．ｖ、投与後与えられた
時間間隔で、動物に０．０５〜０．１０ｄのネンデター
ル（Ａｂｂｏｔｔ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ）　ｆ腹
腔内投与して麻酔した。動物の体重を測定し、以下の組
織、血液、肝臓、肺臓、腎臓、肺臓、腸、頚骨（骨髄）
、筋肉、気管および脳を採取した。各組織を秤量し、存
在する放射性標識の量を測定した。
各時点で得られた各臓器の放射能および組織重量を次の
ように表示した。
第■表には各種臓器の注射用量パーセント（チ１、Ｄ、
　）を示す。ある臓器におけるリポソームの総取り込み
には、報告されている操作に従って評価した。血中に存
在する膿胞の借は、血液は総体重の７．３　％　ｔ−占
めると仮定して計算した（　Ｍ、Ｒ。
ｕａｕｋら：　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｅ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　７７　：４４６０〜４４り４，１
９８０）。
総筋肉はマウスの総体重の１４幅である（ＩＣＲＰＲｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａｎｕａｌ　１９７５　ｅ　Ｗ＠Ｆ
＠８ｎｙｄｅｒ。
０ｘｆｏｒｄ、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　？ｒｅｓｓ、　２
３４頁）０骨髄の測定に際しては、各マウスからの両頚
骨についてカウントし、この値に４４を乗じた（Ｍ。
Ｗ、　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら：　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｈｖ
ａ、ｅ　２２　：　７４３〜７４８．１９７７）。
総骨髄（ＣＰＭ）　−（１対の頚骨のＣＰＭ）　Ｘ　４
４第■表には、処方Ａ、ＢまたはＣをマウスにｉ。
■、投与し、注射後１．２４および２９時間の間隔でサ
ンプリングした各穐組織における１２５ニーＮＧＦの分
布の結果を示す。
八−担体を使用しないＮＧＦ Ｂ麿ＮＧＦ　ＤＰＰＣ：　Ｃｈｏｌ二がングリオシドＣ
−ＮＧＦ’　Ｃｈｏｌ−１：がングリオシド畳各値は４
回の測定値の平均上標準偏差生体の主要臓器内に存在す
る”Ｉ　−ＮＣ）Ｆ　＠は、非封入”Ｉ　−ＮＧＦ　Ａ
の場合に比べて、処方ＢまたＣで１２５Ｉ　−ＮＧＦを
封入した場合の方が大であった。生物学的利用性の増大
は、封入１２’Ｉ　−ＮＧ１ｔ’の注射後少なくとも９
６時間維持された。測定したすべての臓器からの封入１
２５Ｉ　−ＮＧＦの回収量の増加は、ｉ、ｖ、投与後１
時間でほぼ２倍、２４時間でほぼ５倍、９６時間でほば
６倍であった（第５図）。
タンパク質および”Ｉ　−ＮＧＦの分解および／または
消失に関与する臓器は、陽、腎臓および気管である。第
６図に示すように、これらの臓器を１２５Ｉ　−ＮＧＦ
の回収率の計百に含めないと、注射後２４時間における
処方ＢまたはＣでの生物学的利用性の増加は、非封入”
’Ｉ　−ＮＧＦの場合に比べて約７倍を示した。処方Ｂ
およびＣの両者とも”５Ｉ　−ＮＧＦの生物学的利用性
全上昇させた。非封入１２５Ｉ　−ＮＧＦは投与後２４
時間以内にすべて分解または消失した。
第７図に示すように、ｉ、ｖ、投与１時間後に肝臓に存
在する１２５１−　ＮＧＦの４１．Ｄ、は、封入１２５
Ｉ−ＮＧＦの場合５０幅に達するのに対し、非封入の形
で注射した１”’Ｉ　−ＮＧＦでは１０％であった。し
かしながら、肝臓は供給された封入１２５Ｉ　−ＮＧＦ
をすべて貯蔵するわけではない。注射１時間後には封入
１”Ｉ　−ＮＧＦの３０〜４０釜１．Ｄ、は循環系内に
あるか、または他の臓器に取り込まれていたが、非封入
１２’Ｉ　−ＮＧＦ’の場合は２５慢１．Ｄ、であった
（第８図）。肝臓、気管、腎臓および腸を除く、測定し
た臓器のすべてに存在する”Ｉ　−ＮＧＦの量も、投与
２４および９６時間後に測定すると、封入１２５Ｉ　−
ＮＣ）Ｆ　ｔ？投与した場合の方が非封入ＮＧＦを投与
した場合に比べて有意に大であった（２４時間時１０チ
対１チ１．Ｄ、、　９６時間待３幅対０．６壬１．Ｄ、
　）。
血液脳関門を通過しての１２Ｊ　−ＮＧＦの送達は、１
１、Ｄ、脳／’Ｉ１．Ｄ、血液の式を用いて評価した。
使用した２８ｉのリポソーム処方は９５４　ＣＨｏＬ−
１と５憾がングリオシｌ、’　（ＮＧＦ　−１封入）お
よび８０チＣＩ（Ｏ’Ｌ　−１と２０幅がングリオシ）
？（ＮＧＦ−２封入）とした。ｌ”’Ｉ　−ＮＧＦ封入
製剤はすべて、非封入１２５Ｉ　−ＮＧＦに比べて脳／
血液比は有意に高値を示した。
以上、本発明を特定の態様について説明したが、これら
の態様の詳細は本発明を限定するものではない。本発明
の精神および範囲から逸脱することなく様々な均等な態
様、変化および修飾の具現が可能なことは自明であり、
このような均等な態様は本発明の一部を構成するものと
理解される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、糖脂質担体中の成分として有用な代表的がン
グリオシドの構造式である。 第２図は、数種の代表的がングリオシドのゾロツクダイ
アダラムである。 第６図は、単層の脂質二重層とがングリオシＶを含有す
るリポソームと、それに混合された刺激分子の配置を例
示する図である。 第４図は、多層の脂質二重層とボンブリオシｒを含有す
るリポソームと、それ和混合された刺激分子の配置を例
示する図である。 第５図、第６図、第７図および第８図は非封入１２Ｉｓ
Ｉ　−ＮＧＦ　（ｓ）　ｔ　タａＤＰＰＣ：　コｖスｆ
ａ−ルーがングリオシド（Ｃ１）もしくはコレステロー
ル−１：がングリオシド（・）に封入された１２５Ｉ−
ＮＧＦを静脈内に投与したのち、様々な時点で、それぞ
れ主要臓器、気管、腎臓、腸を除くすべての主要臓器、
肝臓、および肝臓、気管、腎臓、腸を除く主要臓器に存
在する”５Ｉ　−ＮＧＦ’の注射用量に対する百分率を
示すグラフである。 第９図は、非封入１２５ニー　ｕｏＦ（ロ）またはコレ
ステロール−１＝５チがングリオシ）Ｆ（・）もしくけ
コレステロール−１：２０％０％ボンブリオシド）に封
入された１２５Ｉ−ＮＧＦを静脈内に投与したのちの様
々な時点での”’Ｉ　−ＮＧＦの脳／血液比を示すグラ
フである。

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）神経変性疾患の処置、神経組織の再生また
    は神経組織の保護のための治療有効量の刺激因子、およ
    び（ｂ）脂質成分およびガングリオシド成分からなる担
    体から構成され、上記担体が上記刺激因子と会合または
    それを含有していて、刺激因子の徐放および／または刺
    激因子の分解酵素からの保護を可能にした、刺激因子の
    全身投与または送達用製剤
  2. （２）担体は刺激因子を含有する膜胞の形状であること
    をさらに特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製剤
  3. （３）膜胞は上記脂質成分および上記ガングリオシド成
    分によつて形成される殻壁膜を有することをさらに特徴
    とする特許請求の範囲第２項に記載の製剤
  4. （４）殻壁膜は安定化成分を含有する特許請求の範囲第
    ３項に記載の製剤
  5. （５）安定化成分はステロイド化合物である特許請求の
    範囲第４項に記載の製剤
  6. （６）ステロイド化合物はコレステロール誘導体である
    特許請求の範囲第５項に記載の製剤
  7. （７）コレステロール誘導体はコレステロール−１であ
    る特許請求の範囲第６項に記載の製剤
  8. （８）刺激因子はＮＧＦである特許請求の範囲第１項に
    記載の製剤
  9. （９）刺激因子はＮＧＦ様物質である特許請求の範囲第
    ８項に記載の製剤
  10. （１０）ＮＧＦ様物質は、ＮＧＦまたはβ−ＮＧＦの生
    物学的に同等な構造類縁体から選択される特許請求の範
    囲第９項に記載の製剤
  11. （１１）生物学的に同等な構造類縁体はｄｅｓ＿１＿−
    ＿９ＮＧＦである特許請求の範囲第１０項に記載の製剤
  12. （１２）ガングリオシドは混合ウシ−脳ガングリオシド
    である特許請求の範囲第１項に記載の製剤
  13. （１３）混合ウシ−脳ガングリオシドはＧＭ＿１、ＧＤ
    ＿１およびＧＴ＿１ガングリオシド型から選ばれる特許
    請求の範囲第１２項に記載の製剤
  14. （１４）混合ウシ−脳ガングリオシドはＧＭ＿１ガング
    リオシド型である特許請求の範囲第１３項に記載の製剤
  15. （１５）ガングリオシドは化学的に修飾されたガングリ
    オシドである特許請求の範囲第３項に記載の製剤
  16. （１６）脂質成分はリン脂質、コレステロールまたはコ
    レステロール誘導体から選択される特許請求の範囲第３
    項に記載の製剤
  17. （１７）リン脂質成分は、ジパルミトイルホスフアチジ
    ルコリン、ジステアロイルホスフアチジルコリン、ジミ
    リスチルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスフ
    アチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスフアチ
    ジルエタノールアミン、ジミリスチルホスファチジルエ
    タノールアミン、ジパルミトイルホスフアチジルセリン
    、ジステアロイルホスフアチジルセリンおよびジミリス
    トイルホスフアチジルセリンから選ばれる特許請求の範
    囲第１６項に記載の製剤
  18. （１８）リン脂質成分は、ジパルミトイルホスフアチジ
    ルコリン、ジステアロイルホスフアチジルコリン、ジパ
    ルミトイルホスフアチジルセリンおよびジステアロイル
    ホスフアチジルセリンから選ばれる特許請求の範囲第１
    ７項に記載の製剤
  19. （１９）リン脂質成分は、ジパルミトイルホスフアチジ
    ルコリンである特許請求の範囲第１８項に記載の製剤
  20. （２０）コレステロール誘導体は、コレステロール−１
    またはコレステロール−３−ポリオキシエチレンである
    特許請求の範囲第１６項に記載の製剤
  21. （２１）刺激因子とその刺激因子と混合するガングリオ
    シド含有リポソームからなる配合組成物
  22. （２２）刺激因子はＮＧＦまたはＮＧＦ様物質である特
    許請求の範囲第２１項に記載の製剤
  23. （２３）ＮＧＦまたはＮＧＦ様物質がガングリオシド含
    有リポソーム内に封入されている特許請求の範囲第２２
    項に記載の配合組成物
  24. （２４）ＮＧＦはβ−ＮＧＦである特許請求の範囲第２
    ３項に記載の配合組成物
  25. （２５）ＮＧＦ様物質は、ＮＧＦまたはβ−ＮＧＦの生
    物学的に同等な構造類縁体である特許請求の範囲第２３
    項に記載の配合組成物
  26. （２６）ガングリオシド含有リポソームのガングリオシ
    ドは混合ウシ−脳ガングリオシドである特許請求の範囲
    第２５項に記載の配合組成物
  27. （２７）混合ウシ−脳ガングリオシドはＧＭ＿１、ＧＤ
    ＿１およびＧＴ＿１ガングリオシド型から選ばれる特許
    請求の範囲第２６項に記載の配合組成物
  28. （２８）ガングリオシドはＧＭ＿１ガングリオシド型で
    ある特許請求の範囲第２７項に記載の配合組成物
  29. （２９）ガングリオシド含有リポソームのガングリオシ
    ドは化学的に修飾されたガングリオシドである特許請求
    の範囲第２５項に記載の配合組成物
  30. （３０）ガングリオシド含有リポソームは、ジパルミト
    イルホスフアチジルコリン、ジステアロイルホスフアチ
    ジルコリン、ジミリスチルホスファチジルコリン、ジパ
    ルミトイルホスフアチジルエタノールアミン、ジステア
    ロイルホスフアチジルエタノールアミン、ジミリスチル
    ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホス
    フアチジルセリン、ジステアロイルホスフアチジルセリ
    ン、およびジミリストイルホスフアチジルセリンから選
    ばれるリン脂質を含有する特許請求の範囲第２３項に記
    載の配合組成物
  31. （３１）リン脂質成分は、ジパルミトイルホスフアチジ
    ルコリン、ジステロイルホスフアチジルコリン、ジパル
    ミトイルホスフアチジルセリンおよびジステアロイルホ
    スフアチジルセリンから選ばれる特許請求の範囲第３０
    項に記載の配合組成物。
  32. （３２）ＧＭ＿１ガングリオシド型とジパルミトイルホ
    スフアチジルコリンからなるガングルオシド含有リポソ
    ーム内にβ−ＮＧＦが封入された特許請求の範囲第２３
    項に記載の配合組成物
  33. （３３）ガングリオシド含有リポソームは少なくともそ
    の７５％が約０．０１μ〜約２μの範囲の平均粒子径を
    有する膜胞であることをさらに特徴とする特許請求の範
    囲第３２項に記載の配合組成物
JP1188676A 1988-07-21 1989-07-20 ガングリオシドーリポソームビヒクル中の刺激因子の制御放出製剤 Pending JPH02124830A (ja)

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