JPH05501264A - 充実性腫瘍治療法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 充実性腫瘍治療法及び組成物 ためのものに関する。

Ｊｏｎａｈ、　Ｍ、　Ｍ、、等（ｉ９７５）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　ＡＣｔａ　４０１．３３６−３４８゜ノコリアー／　スタンプ Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，Ｌ、、及びＳｔａｍｐ、　Ｄ、（＋９７５）　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、ｐｐ、１−７４゜キメルバーグ Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｋ、、等（１０７６）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　 ３６．２９４９−２９５７゜キルピー Ｋｉｒｂｙ、　Ｃ，Ｊ、及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｊｓ　（１９８４）、　１．ｉ ｌ）ｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　３゜５ｅｎｉｏｒ、　Ｊ 、、及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ、　（１９８２）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ 、ユ４５．　＋０９−１１４゜血管外腫瘍診断及び治痕に、結像又は治療化合物 か血流を介する腫瘍を選択的に標的とすることか望まれている。診断学に於て、 以前この様な標的は、腫瘍部位で結像剤の比較的大きい濃度を及び体の他の部分 でこの剤の低下された目立たないレベルを提供することかできた。部位−特異的 標的は、腫瘍の冶療処菫て、毒性副作用を低下させ、腫瘍部位に安全に運ばれる 薬用量を増加することに有用である。

リポソームは、結像及び治療化合物共に包含する静脈内（ＩＶ）投与化合物に対 する薬剤キャリヤーとして提案されている。しかし血流を介する部位−特異的標 的にリポソームを使用することは、網内細胞系（ＲＥＳ）の細胞によるリポソー ムの急速なりリアランスによって厳しく制限される。一般に、ＲＥＳは１時間以 内に■注射されたリポソームの量８０−９５％を除去し、選択された標的とリポ ソームの吸収のため有効的に張り合う。

リポソームのＲＥＳ吸収率を左右する種々のファクターは、報告されている（た とえばＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　＋９７５；　Ｊｏｎａｈ；　Ｇｒｅｇｏｒｉ ａｄｉｓ、　！９７２；　Ｊｕｌｉａｎｏ；’　Ａ１１ｅｎA　１９８３； Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ、　＋９７６；　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ；　Ｌｏｐｅｚ−Ｂ ｅｒｅｓｔｅｉｎ；　Ａ１１ｅｎ、　１９８１；　５ｃｈｅ窒垂■盾■G Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１９８０；　Ｐａｔｅｌ、　１９８３；　５ｅｎｉｏ ｒ、　１９８５；　Ａ１１ｅｎ、　＋９８３；　Ｅｌｌｅｎ刀G ５ｅｎｉｏｒ、　１９Ｂ２；　Ｈｗａｎｇ；　Ａｓｈｗｅｌｌ；　Ｈａｋｏｍｏ ｒｉ；　Ｋａｒｌｓｓｏｎ：　５ｃｈａｕｅｒ；　Ｄｕｒｏモ■■秩G Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ；　Ｗｏｏｄｒｕｆｆ：　Ｃｚｏｐ；　及びｏｋａｄａ）、 簡単に、リポソームサイズ、電荷脂質飽和の度合、及び表面部分は、Ｉ？ＥＳに よるリポソームクリアランスに関与する。しかし現在まで確認されている唯一の ファクターは、長い血液半減期、及び更に特に注射後２４時間で血流中のリポソ ームの比較的高い百分率を提供するのに存効である。

長い血液半減期に加えて、腫瘍部位に到達する存効な薬剤は、リポソームか連続 内皮細胞層及び腫瘍に血液を供給する血管のまわりの基礎となる基底膜に浸透す ることができることも要求される。腫瘍は、損傷を受けた、もれる内皮細胞を育 するが、有効量で腫瘍細胞に達するリポソームに対してリポソームは内皮細胞バ リヤー及び隣接基底膜へのその通過を容易にするメカニズムを有しなければなら ない。それは特に腫瘍への低い血液の流れ及びしたかって循環するリポソームに 制限された露出に関する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）。はとんとの腫瘍内に見い出さ れる通常の介在性圧より高いことは、腫瘍から液体の血管外への移動を生じるこ とによって、リポソームの盛土の機会を減少させる傾向もある（Ｊａｉｎ）。指 摘した用に、腫瘍中での盛土に対するこれらのバリヤーを克服する、及び同時に ＲＥＳ　ｉ認及び吸収を回避するリポソームを形成しそうもない（Ｐｏｚｎａｎ ｓｋｉ　）。

事実、今まで報告されている研究は、血管の透過性か増加する場合てさえ、血管 を通る従来のリポソームの盛土は、著しく増加しないと示されている（Ｐｏｓｔ ｅ）。これらの知見に基づき、疾病によって損なわれた毛管からリポソームの盛 土か、検出レベル以下に制限された尺度を生じるが、その治療ポテンシャルは最 小になる（Ｐｏｓｔｅ）。

４、発明の概要 本発明の全体的目的の１つは、腫瘍標的に有効であるリポソーム組成物及び方法 を提供することであり、これによって全身性血管外腫瘍中に治療薬用量レベルで 結像又は抗−腫瘍剤を選択的に局在化する。

本発明は、１つの観点によれば血流を介して下記の第■欄に示す様に充実性腫瘍 中に化合物を局在化するのに使用するためのリポソーム組成物を包含する。これ は次のことから成る：リポソームを形成する組成物は、（ｉ）小胞−形成脂質及 び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成脂質１−２０モルパーセントか ら成り、かつ（１１）選択された平均粒子直径を約０．０７〜０．１２ミクロン のサイズ範囲内に存する。化合物は取り込まれる形でリポソーム中に含有される （すなわちリポソーム膜と結びつく又はリポソームの内部水性分画内に内包され る）。これに関連して、小胞−形成脂質は、それ自体で又は他の脂質と組合せで 二重層構造を形成するすべての脂質として定義される。

好ましい具体例として、親水性ポリマーは、約１　、０００−５．０００ダルト ンの分子量を有するポリエチレングリコール、ポリ乳酸、グリコール酸であり、 リン脂質に導かれる。

腫瘍処置に使用するために、ある具体例中の化合物は、アントラサイクリン抗生 物質又は植物アルカロイドであり、化合物の少なくとも約８０％は、リポソーム −取り込まれる形であり、薬剤は、リポソーム中にアントラサイクリン抗生物質 の場合、少なくとも約２０μｇ化合物／μｍｏｌ　リポソーム脂質の濃度で及び 植物アルカロイドの場合１μ／μｍｏｌ脂質の濃度で存在する。

５！Ｊ連する観点で、本発明は、 （ａ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成脂質１ −２０モルパーセントから成るリポソーム、（ｂ）誘導された脂質の不在下のリ ポソームのパーセントより数倍大きい静脈内投与後２４時間で血液中に存在する リポソームマーカーのパーセントによって測定される血液寿命、 （Ｃ）約０．０７−０．＋２ミクロンの選択されたサイズ範囲内の平均リポソー ムサイズ、及び （ｄ）リポソーム−取り込まれる形の化合物によって特徴づけられる。

剤か■注射によって投与される場合、充実性腫瘍中に局在化するための剤を製造 する方法も述へる。この場合■投与の後に、剤を注射後最初の４８時間の間、薬 剤の少量のもれを存するリポソーム−取り込まれる形で血流によって運ぶ。この 期間中ＲＥＳ吸収の低割合の理出で、リポソームは、腫瘍に分配され、腫瘍中に 入る。腫瘍の間質空隙内であっても、腫瘍細胞は実際にリポソームを吸収するこ とは必要でない。取り込まれる剤を、何日間から何週間にわたって腫瘍細胞のす ぐ近くてリポソームから遊離し、更に腫瘍塊に（拡散法によって）自由に浸透し 、腫瘍細胞に直接入る−その抗−激増する活性を使用する。この方法は上記タイ プのリポソーム中に剤を取り込まれることを含む。アントラサイクリン抗生物質 又は植物アルカロイド抗〜腫瘍剤を全身性充実性腫瘍に移すのくこ好ましい、あ るリポソーム組成物は、ハイファーゼトラジンションホスホリピドを含有し、リ ポソームのこのタイプとしてのコレステロールは、この薬剤を投与後最初の２４ 時間で血流によって循環しながら遊離する傾向がない。

もう一つの観点によれば、本発明は患者の充実性腫瘍中に化合物を局在化する方 法を含む。この方法は、（ｉ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された 両極性小胞−形成脂質１−２０モルパーセントから成り、かつ（ｉ　ｉ）選択さ れた平均粒子直径を約０．０７−０．１２　ミクロンのサイズ範囲内に有し、か つ（ｉｉｉ）リポソーム−おびき入れる形で化合物を含有するリポソームの組成 物の製造を含む。組成物を、充実性腫瘍中に剤の治療上有効な薬用量の局在化す るの（こ十分な量で患者に■注射する。

本発明のこれらの及び他の目的及び特色は、次の本発明の詳細な記載を添付図面 と結びつけて読んだ場合に、一層十分に明らかとなる。

第２図は、シアヌルクロライド結合剤を介してポリエチレングリコールて誘導化 されるホスファチジルエタノールアミン（ＰＨ）を製造する反応式である：第３ 図は、ジイミダゾール活性化剤によってポリエチレングリコールで誘導されたホ スファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式を示す。

第４図は、トリフルオロメタンスルホナート試剤によってポリエチレングリコー ルて誘導されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式を示 す。

′Ｍ５図は、ペプチド（Ａ）、エステル（Ｂ）及びジスルフィド（Ｃ）結合によ ってポリエチレングリコールで誘導される小胞−形成脂質を示す；第６図は、ポ リ乳酸で誘導化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応 式を示す； 第７図は、血液中のリポソーム存在時間のプロットであり、これは種々の量のホ スファチジルグリセロールを含有するＰＥＧ−ＰＥリポソームに関して■注射後 時間の関数として注射された薬用量パーセントで表わされる；第８図は、第７図 のプロットに類似するプロットであり、これは著しく不飽和のリン脂質成分から 成るリポソームの血液存在時間を示す。

第９図は、第７図のプロットに類似するプロットであり、これはＰＥＧ−被覆さ れたリポソーム（黒三角）及び従来の、被覆されていないリポソーム（黒まる） の血液存在時間を示す。

第１０図は、第７図のプロットと類似するプロットであり、これはポリ乳酸−被 覆されたリポソーム（黒四角）、ポリグリコール酸−被覆されたリポソーム（白 三角）の血液存在時間を示す： 第１１１Ｎは、ピーグル犬の血液からドキソルビシンクリアランスの運動を示す ブＧで被覆されたリポソーム中に■投与された薬剤に関してである。

第１２Ａ及び１２Ｂ図は、心臓（黒菱形）、筋肉（黒まる）、及び腫瘍（黒三角 ）によって血流からのトキソルビン吸収の時間経過のプロットであり、これは遊 離の（＋２Ａ）及びＰＥＧ−リブゾマール（１２Ｂ）の形で■投与された薬剤に 関してである。

第１３図は、マウス中で腹腔内（ＩＰ）に移植されたＪ−６４５６腫瘍細胞によ って血流からドキソルビシン吸収の時間経過のプロットであり、これは腫瘍細胞 に結びついた薬剤（黒まる）及びリポソーム−結びつく形（黒三角）の薬剤全体 （黒菱形）として測定する： ４Ｄ）に移植された活発に分裂するＣ−２６１１！瘍細胞の領域で肝臓に移植さ れたＣ−２６結腸癌の間質性液体にリポソームが局在化（小さい濃く着色された 粒子）することを示す。

第１５Ａ−Ｃ図は、Ｃ−２６結腸癌の皮下移植後の日数で腫瘍サイズ生長を示す プロットである。これは生理食塩水コントロール（白まる）　、　６ｍｇ／ｋｇ てドキソルビシン（黒まる）　、６ｍｇ／ｋｇでエビルビシン（白三角）、又は ２つの薬用量、６ｍｇ／ｋｇ　（黒三角）又は１２ｍｇ／ｋｇ（白四角）でＰＥ Ｇ−リポソーム−取り込まれるエビルビシンを用いて１．８及び１５日日目処理 されたマウス：生理食塩水（実線）　、６ｍｇ／ｋｇエビルビシン（黒まる）　 、６ｍｇ／ｋｇエビルビシンプラスからのリポソーム、　（白まる）、又は２つ の薬用量、６ｍｇ／ｋｇ　（黒三角）及び９ｍｇ／ｋｇ　（白四角）で３及びｌ Ｏ日ＩＣ１５Ｂ）あるいは１０及び１７日日目１５Ｃ）で取り込まれたＰＥＧリ ポソームで処理されたマウスに関してである。

第１６図は、リンパ腫の腹腔内移植後の日数で生存率を示すプロットてあり、こ れは遊離形のドキソルビシン（黒まる）又はＰＥＧ−リポソーム形（黒三角）で 処理された動物、又は未処理動物（自三角）に関する；及び第１７図は、第１５ 図中のプロットと類似するプロットであり、これはい２Ｇ結腸癌の皮下移植後の 日数で腫瘍サイズ生長を示し、これは生理食塩水コントロール（黒まる）で処理 された動物、又は遊離形で（黒四角）又は従来のりボノーム（白まる）で１０ｍ ｇ／ｋｇ　ドキソルビシンで処理された動物に関する。

発明の詳細な説明 １、誘導化された脂質の製造 第１図は、小胞−形成脂質を誘導する生物適合性親水性ポリマーを製造するため の一般の反応式を示し、これはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、ポリ酢酸 、及びポリグリフール酸が挙げられ、これらのすべては容易に水に溶解し、小胞 −形成脂質と結合することかでき、里庄蟲で毒性作用なしに耐性である。使用さ れる親水性ポリマーは、末端かメトキノ、エトキシ又は他の非反応性基によって 覆う、あるいはその代りに他の末端よりもはるかに反応性である末端にある化学 基を有するのか好ましい。ポリマーを、その末端の１つで適する活性剤、たとえ はノアヌル酸、ジイミダゾール、下記酸無水物試剤等々との反応によって活性化 する。

次いて活性化された化合物を、小胞−形成脂質、たとえばジアシルグリセロール と反応させる。このグリセロールは、２個の炭化水素鎖が主として長さ炭素原子 数１４−２２であり、誘導される脂質を生じるために、飽和の度合か変化するシ アツルホスホグリセロールを含む。ホスファチジルエタノール−アミン（ＰＥ） は、この目的に有利であるリン脂質の例である。というのは活性化されたポリマ ーに結合するのに有利である反応性アミノ基を存するからである。あるいは、脂 質基はポリマーとの反応に活性化される又は２個の基が公知カップリング法に従 って、協調したカップリング反応に加わる。メトキシ又はエトキシ基で末端が覆 われたＰＥＧは、種々のポリマーサイズ、たとえば５００−２０．０００ダルト ン分子量で市場て得ることができる。

小胞−形成脂質は、２個の炭化水素鎖、主としてアシル鎖、及び極性ヘット基を 有するものが好ましい。このクラス中にリン脂質、たとえばホスファチジルクロ リン（ＰＣ）、ＰＥ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール （ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）が含まれ、そこでは２個の炭化水素 鎖が主として長さ炭素原子数約１４−２２であり、不飽和の度合を変化する。ま たこのクラスの中には、グリコ脂質、たとえばセレブロサイド及びカングリオサ イドが含まれる。

使用される他の小胞−形成脂質は、コレステロール及び関連するステロールであ る。一般にコレステロールは、特に、高分子量ポリマー、たとえはポリアルキル エーテルでこれが誘導される場合、脂質二重層膜にあまりきつく固定されず、そ してそれ故に血流中にＲＥＳのリポソーム回避を促進するのにあまり有効ではな 更に一般的に、及びここで記載する様に、“小胞−形成脂質”は、疎水性及び極 性ヘッド基部分を有するすべての両極性脂質を包含し、そして（ａ）これはそれ 自体で水中で二重層小胞に自発的に変わることができ、たとえばこれはリン脂質 であり、あるいは（ｂ）これはリン脂質二重層膜の内部の疎水性領域と接触する その疎水性部分、及び膜の外部の極性表面に適応するその極性ヘット基と組合せ て脂質二重層中に安定的に導入される。後者のタイプの小胞−形成脂質の例は、 コレステロール及びコレステロール及びコレステロールへミサクソナートである 。

本発明の１つの重要な特徴によれば、小胞−形成脂質は、比較的流動的液体てび 安定性に寄与することは知られている。長鎖（たとえばＣ−１８）飽和脂質プラ スコレステロールは、充実性腫瘍にアントラサイクリン抗生物質及び植物アルカ ロイド抗腫瘍剤を供給するのに好ましい組成物である。というのはこれらのリポ ソームは、血流を循環し、注射後最初の４８時間の間腫瘍に入るので、薬剤を血 しょうに放出する傾向かないからである。アシル鎖が種々の飽和度合を存するリ ン脂質か、市場で得られるか又は公知方法に従って製造することかできる。

第２図は、ＰＥ−ＰＥＧ脂質を製造する反応式を示し、そこではＰＥＧをシアヌ ルクロライド基によってＰＨに誘導化する。反応の詳細は、例１中に示す。簡単 に、メトキン−覆ったＰＥＧを、シアヌルクロライドで炭酸ナトリウムの存在下 に、図中に示した活性化されたＰＥＧ化合物を生じる条件下で活性化する。この 材料は精製して、未反応シアヌルクロライドを除去する。活性化ＰＥＧ化合物を ＰＥとトリエチルアミンの存在下に反応させ、図中に示した所望のＰＨ−ＰＥＧ 化合物を生しる。収率は、ＰＥＧの最初の量に対して約８−１０９６である。

記載の方法は、ＰＥ、コレステリルアミン、及び糖−アミン基を有するグリコ脂 質を包含する種々の脂質アミンに適用することかできる。

ポリアルキルエーテル、たとえば覆われたＰＥＧを、脂質アミンにカップリング させる第二方法を、第３図に示す。ここでは覆われたＰＥＧを、カルボニルジイ ミダゾールカップリング試剤で活性化し、第３図中に示された活性化されたイミ ダゾールを形成する。脂質アミン、たとえばＰＥとの反応は、図に示されている ＰＥＧ−ＰＥ化合物中に表わされている様に、アミド結合によって脂質と結合す るＰＥＧを導く。反応の詳細は、例２に示す。

覆われたポリアルキルエーテルを脂質アミンにカップリングさせる第三反応方法 は、第４図中に示す。この場合ＰＥＧを、先ずトリメチルシリル基によってその ０末端で保護する。末端−保護反応を図中に示し、トリメチルシリルクロライド とＰＥＧとをトリエチルアミンの存在下に反応させることを含む。その際保護さ れたＰＥＧをトリフルオロメチルスルホナートの無水物は反応させて、トリフル オロメチルスルホナートで活性化されたＰＥＧ化合物を生じる。活性化された化 合物と膠質アミン、たとえばＰＥをトリエチルアミンの存在下に反応させること は、所望され、誘導された脂質ｆｌ製物、たとえばＰＥＧ−ＰＥ化合物を生じ、 この化合物中で脂質アミン基を、ポリエーテルポリマー中の末端メチレン炭素に よってポリエーテルと結合させる。トリメチルシリル保護基は、図に示した様に 酸処理によって、又はその代りに第４級アミンフルオライド塩、たとえばテトラ ブチルアミンのフルオライドとの反応によって離脱することができる。

記載された反応に加えて、種々の公知のカップリング反応は、親水性ポリマー、 たとえばＰＥＧで誘導された小胞−形成脂質を製造するのに適する。たとえば第 ４図に示した無水スルホンナートカップリング試剤を、活性化されたポリアルキ ルエーテルを、両極性脂質のヒドロキシル基、たとえばコレステロールの５’− ＯＨに結合させて使用することができる。他の反応性脂質基、たとえば酸又はエ ステル脂質基も、公知のカップリング法に従ってカップリングに使用することか できる。

たとえばホスファチジン酸の酸基を、適当な無水物、たとえば無水酢酸と反応さ せて活性化し、活性な脂質無水物を形成し、次いで反応性脂質を、イソチオソア ナート試剤の存在下に反応させて保護されたポリアルキルアミンに結合させるこ とができる。

他の具体例に於て、誘導された脂質成分を、不安定な脂質−ポリマー結合、たと えばペプチド、エステル、又はジスルフィド結合を含んで製造する。この結合は 、選択的生理的条件下で、たとえばペブチターセ又はエステラーゼ酵素又は還元 剤、たとえば血流中に存在するグルタチオンの存在下に分解することができる。

第５図は、結合を有する（Ａ）ペプチド、（Ｂ）エステル、及び（Ｃ）ジスルフ ィドて結合した脂質の例を示す。ペプチド−結合化合物を、たとえば第３図中に 示した反応を経て、先ず示したトリペプチドのＮ−末端アミンでポリアルキルエ ーテルをカップリングして製造することかできる。次いでペブチトカルボキシル 基を、カルボジイミドカップリング試剤で脂質アミン基に常法で結合させること かできる。

エステルを結合した化合物を、たとえば脂質酸、たとえばホスファチジン酸をポ リアルキルエーテルの末端アルコール基に無水カップリング剤によるアルコール を用いて結合して製造することかできる。あるいは、内部エステル結合及び適す る末端基、たとえば第一アミン基を育する短い結合断片を、ポリアルキルエーテ ルを両極性脂質にアミド又はカーバマート結合によって結合させるのに使用する ことができる。同様に、結合断片は、第５図中にＣで示した化合物の形成に使用 される内部ジスルフィド結合を含有する。この様な可逆的結合によってリン膠質 に結合されるポリマーは、注射後最初の数時間これを含有するリポソームの高い 血液レベルを提供するのに有用である。この期間の後、血しょう成分は、ポリマ ーを離脱する可逆的結合を分解し、　“非保護“のリポソームを、ＲＥＳによっ て速やかに吸収する。

第６図は、ＰＥてポリ乳酸を誘導する方法を示す。ポリ乳酸を、ＰＥの存在下に 、ジシクロへキンル力ルポイミド（ＤＣＣＩ）と例４中に詳述した様に反応させ る。同様に、ポリグリコール酸で誘導された小胞−形成脂質を、例４中にも詳述 した様に、適当なカップリング剤、たとえばＤＣＣＩの存在下に、ポリグリコー ル酸又はグリコール酸とＰＥとの反応によって形成する。ポリ乳酸又はポリグリ コール酸で誘導された小胞−形成脂質は、本発明の一部である。また本発明を構 成する部分は、この誘導された脂質を１−２０モルパーセント含有するリポソー ムである。

本発明のリポソームを形成するのに使用される脂質成分を、主としてリン脂質、 スフィンゴ脂質及びステロールを含む、種々の小胞−形成脂質から選択する。示 した様に、本発明のリポソームの１つの要求は、長い血液循環寿命である。それ 故に血液半減期で脂質成分の作用を評価するのに使用することができる血液寿命 の標準化された測定を確立するのに有用である。

生体内でリポソーム循環時間を評価するのに使用される１つの方法は、血流及び 注射後選択された時間でＲＥＳの第−器官中に■注射されたリポソームの分布を 、測定する。ここで使用される標準化されたモデルに於て、ＲＥＳ吸収を、血流 中の全リポソームと肝臓、膵臓、ＲＥＳの主な器官中の全リポソームとの割合に よって測定する。実際に、年令及び性別合わせたマウスに、放射性標識されたり ボノームを尾静脈で■注射し、各時間ポイントを例５中に詳述する様に全血液及 び−緒にされた肝臓及び膵臓放射性標識カウントを測定して決定する。

肝臓及び膵臓は、ＲＥＳによってほぼ１００％のリポソームの最初の吸収を示す ので、記載された血液／ＲＥＳ割合は、生体内で血液からＲＥＳへの吸収程度の 良好な近似値を提供する。たとえば約１又はこれより大きい割合は、血液中に残 存する注射されたリポソームの優勢を示し、約１以下の割合は、ＲＥＳ中のリポ ソームの優勢を示す。本発明の脂質組成物のほとんどに関して、血液／ＲＥＳ割 合を注射後ｌ、２゜３．４及び２４時間で算出する。

本発明のリポソームは第１種に記載した、親水性ポリマーで誘導された小胞−形 成脂質の１−２０モルパーセントを含む。本発明の観点によれば、本発明者は、 このリポソーム中で血液循環半減期がリポソームを構成するリン脂質成分の飽和 度合に大いに依存しないことを見い出した。すなわちリン脂質成分は、主に流動 性の、比較的不飽和のアシル鎖、又はより飽和された、硬化するアソル鎖成分か ら成る。本発明のこの特徴は、ＰＥＧ−ＰＥ、コレステロール及び変化する飽和 度合を育するＰＣ（表４）で形成されるリポソーム中の血液／ＲＥＳ割合を調べ る例６中に示される。その例中の表５中のデータから明らかな様に、高い血液／ ＲＥＳ割合がバルクＰＣ脂質中の脂質不飽和の程度に関係なく実質上すべてのリ ポソーム形成を達成し、脂質飽和の度合の作用として、系統的な傾向は全く観察 されない。

したがって、小胞−形成脂質を、流動性又は硬度性の選択された度合を達成し、 血清中のリポソームの安定性及び血流及び／又は腫瘍中にリポソームから取り込 まれられた薬剤を放出する割合をコントロールする様に選択する。小胞−形成脂 質をまた、脂質飽和特徴に於て所望のリポソーム製造性質を達成する様に選択す る。一般に、たとえばより流動性脂質は、より硬い脂質組成物よりも抽出及び均 質化方法によって成形及び小型化するのか容易であることである。

同様に、本発明者は、リポソーム中のコレステロールの百分率か観察された血液 ／ＲＥＳ割合で著しい効果なしに広い範囲を変化することを見い出した。表６に 関連する例７人中に示した研究は、０−３０モルパーセントのコレステロール範 囲て血液／ＲＥＳ割合に於て実際に変化を示さない。

更に本発明者は、本発明に従って導かれる研究に於て、血液／ＲＥＳ割合か電荷 脂質成分、たとえばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の存在によって比較的 影響を及ぼさないことを見い出した。これは第７図から明らかであり、これは４ ．７モルパーセントＰＧ　（三角形）又は１４モルパーセントＰＧ　（まる）の どちらかを含有するＰＥＧ−ＰＥリポソームに関する内包マーカーの損失率をプ ロットする。２４時間に渡って血液流中のリポソーム保持の差は、実際に全く観 察されない。ＲＥＳ吸収を悪化させることなくリポソーム中に負電荷を有する選 択は、多くのボテンシャル利点を提供する。負電荷を含有するリポソーム懸濁液 は、高いイオン強度緩衝液中の凝集にあまり敏感でない傾向を示し、それ故に物 理的安定性を増加する。更に、リポソーム膜中に存在する負電荷は、カチオン性 薬剤の高い量を効果的に結合するのに、成形手段として使用することができる。

親水性ポリマーで誘導された小胞−形成脂質は、小胞形成脂質の全モルの百分率 として誘導された脂質のモルに基づいて好ましくは約１−２０モルパーセントの 量で存在する。より低いモル割合、たとえば０．０モル％は大きい分子量のポリ マーたとえば１００キロダルトンの分子量を有するポリマーを有する脂質誘導体 に適切であることが分る。第工欄に示した様に、誘導された脂質中の親水性ポリ マーは、約２００−２０．０００ダルトン、好ましくは約５００−５．０００ク ルトンの分子量を存するのが好ましい。血液／ＲＥＳ割合に関して極めて短いエ トキンエーテル部分の作用を調へる例７Ｂは、約５個の炭素以上のエーテルのポ リエーテル部分が血液／ＲＥＳ割合の著しい増加の達成を要求することを示す。

Ｂ　リポソーム組成物を製造 リポソームを、５ｚｏｋａ等１９８０に詳述されている様な種々の技術によって 製造する。薬剤−含有リポソームを製造する１つの方法は、５ｚｏｋａ等によっ て及び米国特許第４．２３５．８７１号中に記載された逆相蒸発法（ｒｅｖｅｒ ｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔＩｏｎｍｅｔｈｏｄ）である。逆相蒸発小 胞（ＲＥＶｓ）は、約２−４ミクロンの典型的平均サイズを有し、主にオリゴラ メラ、であり、すなわち１つ又は数個の脂質二重層数を有する。この方法を、例 ４Ａ中に詳述する。

多重膜小胞（ＭＬＶｓ）を、簡単な脂質−フイルム水和技術によって形成するこ とかできる。この操作で、適する有機溶剤中に溶解された、上記タイプのりボノ ーム形成脂質の混合物を、容器中で蒸発し、薄いフィルムを形成する。このフィ ルムは、例４Ｂ中に詳述する様に水性媒体によってその時覆われる。脂質フィル ムは水和されて、主に約０．１ないし１０ミクロンのサイズを有するＭＬＶｓを 形成する。

本発明の１つの重要な観点に従って、リポソームを、約０．０７と０．１２ミク ロンの間の選択されたサイズ範囲中に実質上均一なサイズを存するように製造す る。特に、このサイズ範囲中のリポソームは、第■欄中に記載した様に、充実性 腫瘍中に容易に盛土することができ、同時に実質上の薬剤積載物を腫瘍に運ぶこ とができる（薬剤−積載能力が厳しく制限された小さな単ラメラ小胞と異なる） 。

ＲＥＶｓ及びＭＬＶｓに関する有効な造粒法は、０．０３ないし０．２、主とし て０．０５．０．０８．０．１、又は０．２ミクロンの範囲で選択された単一細 孔サイズを有する一連のポリカルボナート膜を通してリポソームの水性懸濁液を 抽出することにある。　膜の細孔サイズは、その膜を通して抽出して製造される リポソームの最も大きいサイズにほぼ相当する。特にその場合その処理法は、同 −膜を２又は数回通して抽出する。リポソーム造粒のこの方法を、下記例中に記 載された均一・サイズＲＥＶ及びＭＬＶ組成物の製造に使用する。比較的最近の 方法は、非対称セラミックフィルターを通す抽出を含む。その方法は、１９８８ 年、４月１２８＋二発行されたりボノーム抽出に関する米国特許第４．７３７． ３２３号明細所中に詳述されている。均質化方法は、］ＯＯｎｍ又はそれ以下の サイズに小型するリポソームにも有用である（マーチン）。

Ｃ化合物積載 具体例に於て、本発明の組成物を結像剤、たとえば８７Ｇａ及び１１１ｉｎを存 する放射性同位元素、あるいは常磁性化合物を腫瘍部位に局在化するために、使 用する。

放射性標識を比較的低い濃度で検出することができる。適用法で一般に結像剤を 受動積載によって、すなわちリポソーム形成の間に内包するのに十分である。こ れは、たとえば内包される剤の水性溶液で脂質を水和して行われる。典型的な放 射性標識された剤は、キレート形で放射性同位元素、たとえば＠　７　Ｇａ−デ スフエラルであり、実質上取り込まれる形でリポソーム中に保持される。リポソ ーム形成及び造粒の後、非内包材料を種々の方法の１つで、たとえばイオン交換 体又はゲル濾過クロマトグラフィーによって除去する。受動積載によって得るこ とかてきるキレート金属の濃度を、永和媒体中での剤の濃度によって限定する。

放射性結像剤の活性負荷は、リポソームの水性部分内に高い親和性、水溶性キレ ート剤（たとえばＥＤＴＡ又はデスフェロオキサミン）を取り込まれ、取り込ま れていないキレート剤を透析又はゲル排除カラムクロマトグラフィーによって除 去し、リポソームを低い親和性にキレートされる金属放射性元素、脂質溶解性キ レート剤、たとえば８−ヒドロキシキノリンの存在下にリポソームを温度するこ とによって可能である。金属放射性同位元素を、脂質可溶性キレート剤によって リポソームに運び入れる。リポソーム中で一度、放射性同位元素を、取り込まれ た、水溶性キレート剤によってキレート化するーリポソーム内部中に放射性同位 元素を効果的に取り込む（ギャビゾン）。

受動積載を、両極性抗−腫瘍化合物、たとえばアルカロイドビンブラスチン及び ビンクリスチンに対して使用する。この化合物は比較的低い薬用量で、たとえば 約１−１５ｍｇ／ｍ’で治療上活性である。ここで薬剤は、脂質を水和するのに 使用される水性相中に溶解されるか又は化合物の溶解度に応してリポソーム形成 工程て脂質に入れられる。リポソーム形成及び造粒の後に、遊離（非結合）薬剤 を、上述の様に、たとえばイオン交換体又はゲル排除クロマトグラフィーによっ て除去することができる。

抗−腫瘍化合物は、ペプチド又はタンパク質薬剤、たとえばインターロイキン２ （ＩＬ−２）又は組織壊死因子（ＴＮＦ）を含むか又はリポソームはペプチド免 疫調節タンパク質、たとえばムルアミルージー又はトリーペプチド誘導体又はタ ンパク質免疫調節タンパク質、たとえばマツロファージコロニー刺戟因子（Ｍ− Ｃ３Ｆ）を含有する様に形成する場合、リポソームを、上記逆相法によって又は タンパク質と小さい単ラメラ小胞の懸濁液と水との凍結乾燥混合物を脱水して製 造するのか好ましい（キルビー）。２つの方法は、比較的高い内包効率、たとえ ば５０％効率まで受動的積載と結びつ（。非内胞材料を、リポソーム懸濁液から 、たとえば透析、透析濾過又は排除クロマトグラフィーによって容易に除去する ことかできる。

リポソームに収容されうる疎水性薬剤の濃度は、膜中て薬剤／脂質相互作用に基 づく、しかし一般に約２０μｇ薬剤／ｍｇ脂質よりも少ない薬剤濃度に限定する 。更に特に、種々のアントラサイクリン抗生物質、たとえばドキソルビシン及び エビルビシンに関して、リポソームの水性部分に受動積載することによって達成 されつる内包された材料の最も高い濃度は、（これらの化合物の低い固有水溶性 に基づいて）約１０−２０μｇ〜μｍｏｌ脂質である。アニオン性リン脂質、た とえばＰＧの２０−３０モルパーセントが膜中に含まれる場合、装填因子は約４ ０μｇ／μｍｏｌ脂質に増加することかできる。というのはアントラサイクリン を、陽性に電荷し、膜界面で負に電荷されたＰＧと゛イオン対”錯体を形成する 。しかしこの様に電荷し、錯体化したアントラサイクリン形成と、本発明の範囲 で限定された有用性を存する（これは薬剤をリポソームを取り込まれる形で■投 与後最初の２４−４８時間血液流によって運ばねばならないことを要求する）。

というのは薬剤が血しように導入する場合リポソーム膜から迅速に放出される傾 向があるからである。

本発明の他の観点によれば、本発明者は、種々の両極性抗−腫瘍薬剤の治療上有 効な薬用量の腫瘍への放出にとって、活性薬剤積載法によって高い薬剤濃度にリ ポソームに積載されることが必要であることを見い出した。たとえばアントラサ イクリン抗生物質薬剤、たとえばドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシ ン、カルジノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミ ドダウノマイノン、及びＮ−アセチルダウノマイシンに関して、約２５μｇ／μ ｍｏｌ脂質よりも大きい及び好ましくは５０μｇ／μｍｏｌ脂質のリポソーム− 取り込まれる薬剤の最終濃度が望ましい。１００−２００μｇ／μｍｏｌ　と同 じほど高い内部薬剤濃度力・予想される。

両極性薬剤のリポソームへの活性装填の１つの方法は、１９８８年９月２８日に 発行された共有の米国特許出願第４１３．０３７号明細書中に記載されている。

この方法で、リポソームを、アンモニウムイオン、たとえば０．１２５Ｍ硫酸ア ンモニウムの比較的高い濃度の存在下に製造する。リポソームを所望のサイズに 造粒後、リポソーム懸濁液を、リポソーム膜を横切って内側から外側へのアンモ ニウムイオウ勾配を作って処理する。勾配は、アンモニウム不含媒体、たとえば 等張のグルコース媒体に対する透析によって、あるいはゲル濾過、たとえば０． 　＋５Ｍ　ＮａＣ１又はＫＣＩて平衡させたセファデックスＧ−５０カラム上で 、効果的にはナトリウム又はカリウムイオンで外−相中のアンモニウムイオンを 置き代えて、つくられる。ある０は、１ノホソーム懸濁液を非−アンモニウム溶 液で希釈し、それによってアンモニウムイオンの外−相濃度を下げる。リポソー ム内部のアンモニウム濃度は、外部リポソ−ム膜の濃度の好ましくは少なくとも １０倍、より好ましくは少なくとも　１００　ｆｉいし１０００倍である。　。

同様にリポソームを横切るアンモニウムイオン勾配は、ｐＨ勾配を生しる。とし ）うのはアンモニアがリポソーム膜を横切って放出され、かつプロトンがリボ゛ ノームの内部水性相中につかまるからである。リポソームに選択された薬剤を積 載させるために、リポソーム懸濁液、たとえばリビド２０−２００＋ｎｇ／ｍｌ を薬剤の水性溶液と混合し、混合物をある期間、たとえば数時間にわたって室温 ないし６０°Ｃの範囲の温度で平衡させ→用される脂質の相転移温度に応じて、 リポソームを形成させる。１つの典型的方法で、脂質濃度５０μｍｏｌ／ｍｌを 有するリポソーム懸濁液を、同容量のアントラサイクリン薬剤と約５−８ｍｇ／ ｍｌの濃度で混合する。温度期間の終了後、懸濁液を遊離（非結合）の薬剤を除 去処理する。アントラサイクリン薬剤に関する薬剤除去の好ましい方法は、イオ ン交換樹脂、たとえばドヴエックス５０ＷＸ−４を通過させて行われる。この樹 脂は薬剤を結合することができる。

上述の様に、植物アルカロイド、たとえばヴインクリスチンは、その本質的（＝ 高い抗−腫瘍活性のゆえにリポソーム中に高い積載因子を要求せず、受身の取り 込み技術によって積載することができるので、活性法によってこれらの薬剤を装 填する二ともてきる。ヴインクリスチンは両極性であり、弱塩基であり、同様な 分子をアントラサイクリン抗生物質に対する上記硫酸アンモニウムを取り込むこ とによって形成されるｐＨ勾配を用いてリポソームに積載すること力１できる。

記載された間接的積載法は例１Ｏ中に示される。そこには約８Ｏ−１ｏｏμｇ／ μｍｏｌ脂質の最終薬剤濃度となす、ドキソルビシンで積載された０、１ミツ０ ２ＭＬＶｓの製造か記載されている。リポソームは、４°Ｃで貯蔵した場合、極 めてイ氏Ｕ）薬剤１漏れＡ、延長された血液流半減期 本発明によれば、目標腫瘍中にポリソーム局在の要求の１つ（ま、ＩＶＩＪボ゛ ノーム投与後の血流中の延長されたリポソーム寿命である。血液／ＲＥＳ割合で 血液流中のリポソーム寿命の１つの測定は、上述の様にリボノーム投与後選択さ れｔこ時間で検出される。種々のリポソーム組成物に対する血液／ＲＥＳ割合と 、（ＰＩ５の表３中（二記載する。ＰＥＧ−誘導された脂質の不在下に、血液／ ＲＥＳ割合（よ、０．０３又（よそれ以下である。ＰＥＧ−誘導された脂質の存 在下に、血液／ＲＥＳ割合は、低分子量ＰＥＧ　＋二関して０．２ないし形成物 のいくつかに関して１．７−４である。この形成物の１つ（よ、コレステロール かなく、あとの３つは付加的に電荷されたｌＪ：／＋１旨質（たとえ（ヨＰＧ） かない。

例６中の表５に示したデータは、約１，２６と３．２７の間の血液／ＲＥＳ割合 （低０回１１ｉ百分率を育する２つのボンドを除く）を示し、これは表３中（こ 示しｔこデータと一致する。上記第■欄に示した様に血液寿命値は、実質上リボ ゛ノーム月旨質の飽和度、コレステロールの存在及び電荷された脂質の存在に無 関係である。

上述の血液／ＲＥＳ値を、共有の米国特許第４．９２０．０１６号明細書中（こ 開示された血液／ＲＥＳ値と比較することかできる。これは表３及び５中（こ記 載されたデータを記述するのに使用された方法と同一の血液／ＲＥＳ測定法を使 用する。上記特許中（こ開示された最良の２４時間血液／ＲＥＳ割合は、ＧＭ、 　、飽和ＰＣ１及びコレステロール力Ａら成る形成物に対して０．９である。次 の最良の形成物は、約０．５の２４時間血液／ＲＥＳ値を生じる。かくて、多数 の現在の形成物中に得られる典型的な２４時間血液／ＲＥＳはデータに開示され ている最良の形成物の高さの２倍以上である。更（こＧＭ、又（よＨＰＩ脂質を 有する高い血液／ＲＥＳを達成する能力は、リポソーム中の主に飽和脂質及びコ レステロールの存在に関係する。

血流中のリポソームマーカーの血しょう薬物動態は、本発明のリポソーム形成物 によって達成される増加されたリポソーム寿命の他の測定を提供することができ る。上記第７図及び第８図は、マーカーが脂質であるか又は内包された水溶性化 合物であるかに実質上関係なく（第８図）、典型的なＰＥＧ−リポソーム形成物 中で２４時間にわたる血流からのリポソームマーカーの損失を示す。両方のプロ ット中で、リポソーム注射後２４時間で存在するリポソームマーカーの量は、通 常注射される材料の１０％より大きい。

第９図は、ＰＥＧ−誘導された脂質の不在下に典型的ＰＥＧ−リポソーム形成物 及び同一リポソームに関して血流からのリポソーム損失の速度を示す。２４時間 後、ＰＥＧ−リポソーム中に残存するマーカー百分率は、約２０％より大きいが 、通常のリポソームは３時間後車液中で５％保持より小さく、２４時間でほとん ど検出可能なマーカーを示さない。

第７−９図に示した結果は、種々のリポソーム形成物に対して測定され、かつ下 記例５−８中の表３及び５−７に開示された２４時間血液リポソーム値と一致す る。例５中の表３に示される様に、２４時間で残存する薬用量百分率はＰＥＧ− リポソームに関して少なくとも５％であるのに対して通常のりポノームに関して １％より小さい。

最良の形成物で、約２０−４％の間の値が得られる。例６からの表５と同様に、 ２４時間後の血液中のリポソームレベル（低い回復値を有する２つの記載事項を 再び無視する）は、投与された全薬用量に対して１２と約２５パーセントの間で ある。

同様な結果が、例７の表６及び７中に開示されている。

リポソームが全身性腫瘍に達する及び侵入する機会を与えるのに必要な２４−４ ８時間にわたって血液流中で両極性抗−腫瘍薬剤を維持するためのリポソームの 能力も、調べられている。例１１に開示した研究でＰＥＣ−リポソーム中に局在 化されたドキソルビシン、遊離形で生じるドキソルビシン及び水素化ホスファチ ジルイノシトール（ＨＰＩ）を含有するリポソームに局在化されたドキソルビシ ンの血しょう薬物動態をピーグル犬で調べた。ＨＰＩ　リポソームを、主に飽和 ＰＣ脂質及びコしステロール形成し、前記共育米国特許中に開示された最適形成 物の１つあ示す。薬剤投与後２７時間までの血液中のドキソルビシン速度を第１ １図に示す。２つのリポソーム形成物は、二次−指数関数的パターンを示す遊離 薬剤と対照的に、薬剤の単−一モード指数関数損失を示す。しかし７２時間で血 液流中で保持される薬剤の量は、ＰＥＧ−リポソーム中で約８−１０倍大きい。

２つの血液／ＲＥＳ割合、及び血液流中のリポソーム保持時間に関して、モデル 動物システムから得られるデータを、ヒト及び家畜用動物でかなり推定すること ができる。これは、肝臓及び膵臓によるリポソームの吸収をマウス、ラット、サ ル及びヒトを含むいくつかの哺乳類種牛で類似の割合で生じることが分ったから であるｏ　（Ｇｒｅｇｏｒｉｏａｃｌｉｓ、＋９７４　：　Ｊｏｎａｈ　；　Ｋ ｉｍｅｌｂｅｒｇ、１９７６　；　Ｊｕｌｉａｎｏ　；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　 ：　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｊｎ）　ｅこの結果は、ＲＥＳによるリポソー ム吸収で最も重要であると考えられる生化学因子−血清リボタンバク質、サイズ に依存する吸収効果、及び表面部分による細胞保護によるオプシン化を含む−が 試験されるすべての哺乳類種の通常の特色である事実を恐らく反映する。

Ｂ、ｌＩ！瘍への濡出 リンパ腫リポソームである。この特色は、０．０７と０．１２ミクロンの間のサ イズを育された研究から示しことができる。この場合、マウスを、ｌ−２週間後 約　１ｃ＋ｎ”の充実性腫瘍塊を形成するＪ−６４５６リンパａｍ胞で皮下に接 種する。次いで動物に、ドキソルビシンか又は体重ｋｇにつき１０ｍｇ薬剤の薬 用量でＰＥＧ−リポソームに局在化されるドキソルビシンのどちらかを注射する 。次いで薬剤の組織分布（心臓、筋肉、及び腫瘍）を、薬剤投与後４．２４及び ４８時間で検定する。第１２Ａ図は、遊離薬剤に対して得られた結果を示す。Ｈ 瘍中への非選択的薬剤蓄積が生じ、事実、最も高い最初の薬剤レベルは、心臓中 であり、そこで最も重要な毒性を生しる。

対比によって、ＰＥＧ−リポソーム中の薬剤放出は、４−２４時間の間腫瘍への 増加する薬剤蓄積、及び２４と４８時間の間高い選択的腫瘍レベルを示す。心臓 と筋肉組織ともによる薬剤吸収は、対比して、遊離薬剤を用いたよりも低い。第 １２Ｂ図中にプロットされたデータから分る様に、８倍多い薬剤を含有する腫瘍 は、健康な筋肉と比較して、注射後２４時間で心臓中６倍である。ＰＥＧ−リポ ソームかもっとも抗−腫瘍薬剤を腸腔内腫瘍に放出することを確認するために、 マウスグループに、１０＠Ｊ−６４５６１Ｊンバ細胞で腸腔内注射する。５日後 、ＩＰ＠瘍が認められ、次いて動物にドキソルビシンｌ０ｍｇ／ｋｇを遊離薬剤 形でＰＥＧ−含有リポソーム中に取り込まれた形のとららかで■処置する。薬剤 の組織分布を、例１２、表９で表わす。示されている様に、腫瘍／心臓割合は、 ２４時間で遊離薬剤に対するよりもリポソーム放出に対して約２７２大きい、そ して４８時間で約４７倍大きい。

表９中に示した結果が腫瘍の血管外領域へそのままリポソームを入れるはずであ ることを例示するために、腫瘍組織を細胞の及び上澄み（細胞間液体）分画に分 離し、２つの分画中のリポソーム−結合及び遊離薬剤の存在を検出する。第１３ 図は、薬剤の全量（黒部形）及び腫瘍細胞中に存在する薬剤の量（黒まる）及び 上澄み（黒部形）を注射後４８時間にわたって示す。リポソーム−結合薬剤を検 出するために、上澄みを、イオン交換樹脂に通して遊離薬剤を除去し、上澄み中 に残存する薬剤を検出する（黒三角）。明らかな様に、腫瘍中のほとんどの薬剤 は、リポソーム−結合である。

更に腫瘍細胞へのリポソーム濡出の例示は、例１４中に記載する様に正常肝組織 と充実性腫瘍中でのリポソーム分布を直接の顛微鏡観察することによって得られ る。第１４図は、ＰＥＧ−リポソームの■注射後２４時間の正常肝組織中でリポ ソームの分布（小さい、暗く着色したかたまり）を示す。リポソームをもっばら クツパー細胞に閉じ込め、肝細胞中又は正常肝組織の細胞液体中のどちらにも存 在しない。

第１４Ｂ図は、ＰＥＧ−リポソームの注射後２４時間でマウスの肝臓中に移植さ れたＣ−２６結腸癌の領域を示す。リポソームの濃度は、内皮細胞バリヤー及び 基底膜の腫瘍組織側で、図中の毛管領域中で全く明らかである。リポソームは、 Ｂ瘍細胞の細胞内液体中に豊富であり、更に毛管内腔から腫瘍へ通過することか 明らかである。第１４Ｃ図の写真は、腫瘍の他の領域を示し、そこで細胞内液体 中の大量のリポソームも明らかである。同様な知見が、第１４Ｄ図から明らかな 様に皮下注射されたＣ−２６結腸癌細胞の領域へリポソーム濡出によって得られ る。

５０−２００ｍｇ／ｍりを含むアルキル化剤も、これに関連して有用である。上 述の様に、い薬剤／膠質割合を達成する。また、上述の様に、リポソームは、内 包された腫瘍−治療ペプチド及びタンパク質薬剤、たとえばＴＬ−２、及び／又 はＴＮＦ、及び／又は免疫変調成分、たとえばＭ−Ｃ３Ｆを含有し、この成分は 単独で又は抗−腫瘍薬剤、たとえばアントラサイクリン抗生物質薬剤と組合せた 形で存在する。

本発明によれば充実性腫瘍を効果的に処理する能力を、種々の生体内システムで 示す。例１５中に開示された方法は、Ｃ−２６結腸癌を皮下に移植された動物中 で腫瘍生長の割合を比較する。処置をエビルビシンで、遊離形で又は本発明によ るＰＥＧ−リポソーム中に取り込まれた形でのどちらかで行い、その結果を第１ ５Ａ−Ｃ図に示す。例１５中に十分に示され、議論されている様に、エビルビシ ンを積載されたＰＥＧ−リポソームでの処理は、腫瘍生長の著しい抑制を生じ、 腫瘍細胞の通常の致死量で接種された動物グループのうちで長い期間の生存を導 く。更に、エピルビノン装填リポソームによる動物への遅延処置は、確立された 皮下腫瘍の良化を生じ、遊離薬剤処置では見られない結果である。

同様な結果が、例１６に詳述した様に、マウス中に腹腔内に移植されたリンパ腫 の処理で得られる。この場合動物を遊離の形で又はＰＥＧ−リポソーム中に取り 込まれた形でのドキソルビシンによって処理する。腫瘍移植及び薬剤処理後１０ ０日間にわたる生存率を第１６図に示す。その結果は、上述の結果と類似し、遊 離薬剤処理にったってＰＥＧ−リポソームによる中間の生存時間及び生存率に於 て著しい増加を示す。

減少した毒性は、モデル動物システムで及び通常のリポソーム中に取り込まれた ドキソルビシンによる腫瘍処理で臨床環境で観察されるので（たとえば米国特許 第　中に開示されている様に）、本発明の腫瘍処理法中に提供された毒性保護度 合を決定するのが重要である。例１７中に開示された研究中で、動物に遊離形又 は通常の又はＰＥＧ−リポソーム中に取り込まれた形でドキソルビシン又はエビ ルビシンの増加する薬用量を■注射する。種々の薬剤形に対して最大許容薬用量 を例中の表１０に示す。２つの薬剤に関して、ＰＥＧ−リポソーム中の取り込み は、薬剤のＭＴＤをほぼ２倍にする。同様な保護を通常のリポソームで達成する 。

減少した毒性は、上記腫瘍処理の増加した有効性に寄与するのて、リボノーム盛 土による薬剤の選択的局在化は、改良された薬剤有効性にとっても重要である。

これを、例１８中に記載された薬剤処理法中に例示する。この場合ドキソルビシ ンを含有する通常のリポソーム（■投与した場合、濡出によってほとんど又は全 く腫瘍吸収を示さない）を、皮下に移植された腫瘍の生長の割合を減少させる同 一薬用量（ＩＯｍｇ／ｋｇ）で遊離薬剤と比較する。第１７図は、生理食塩水コ ントロール（実線）、遊離薬剤（黒まる）及び通常のリポソーム（黒三角）に関 して、ｉ瘍移植後の日数で時間による腫瘍サイズをプロットする。明らかな様に 、通常のリポソームは、腫瘍生長を同一薬用量で遊離薬剤よりも大きい程度て抑 制しない。

この知見は、第＋５Ａ−Ｃ及び１６図中に示された結果に著しい対比を示す。そ の図中、改良された生存及び腫瘍生長抑制を、遊離の薬剤に比較して示す。その 際腫瘍−待った動物を、ＰＥＧリポソーム中に取り込まれたアントラサイクリン 抗−腫瘍薬剤で処理する。

かくて、腫瘍−処理法は、リポソーム中の減少した薬剤毒性のゆえに、投与され る薬剤のより一層高いレベル及び腫瘍の細胞間液体中に選択的にリポソーム局在 化するために、より一層大きい薬剤有効性を与える。

腫瘍中にリポソーム書出によって化合物を選択的に局在化する能力は結像剤の腫 瘍への改良された攻撃に、すなわち腫瘍診断に利用することもできることが分る 。この場合、結像剤、主にキレート形での同位体元素又は常磁性分子がリポソー ムに取り込まれ、次いで検査される患者に■投与される。選択された期間の後、 主に２４−４８時間後、次いで患者を、たとえば放射性同位体の場合、ガンマシ ンチレーソヨンラジオグラフィーによって又は常磁性剤の場合ＮＭＲによって追 跡し、結像剤の局在吸収の領域を検出する。

次の例は、増大する循環時間でもってリポソームを製造する、及び里庄貴及び試 験管内で循環時間を利用する方法を示す。例は、本発明の具体的なリポソーム組 成物及び方法を示すものであって、これによって本発明の範囲は限定されない。

材料 コレステロール（Ｃｈｏりが、シグマ（セントルイス、ＭＯ）から得られる。ス フィンゴミエリン（ＳＭ）、卵ホスファチジルコリン（レシチン又はＰＣ）、組 成物ＩＶ４０、ｌＶ３Ｏ、ｌＶ２Ｏ、ＩＶＩＯｌ及び■１を有する部分的に水素 化されたＰＣ、ホスファチジルグリセロール（Ｐの、ホスファチジルエタノール アミン（ＰＥ〉、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、 ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ）、ジオレイルＰＣ（ＤＯＰＣ）及びジステアロ イルＰＣ（ＤＳＰＣ）が、アバンチ極性脂質（バーミンガム、ＡＬ）又はオース チンケミカル社（シカゴ、ル）から得られる。

（Ｉｔｊｌ）−チラミニルーイヌリンを、公知処理に従って製造する。＠７ガリ ウムー８〜ヒドロキシキノリンを、ＮＥＮネオスカン（ボストン、ＭＡ）によっ て供給する。

ドキソルビシンＨＣＩ及びエビルビシンＨＣＬが、アトリア研究所（コロンバス 、ＯＨ）又はフエルミタリアカルロエバ（ミラノ、イタリー）から得られる。

シアヌルクロライドによって接合されたＰＥＧ−ＰＥの製造Ａ、活性化されたＰ ＥＧの製造 活性化されたＰＥＧと前もって呼ばれる２−０−メトキンポリエチレングリコー ル１９００−４．６−ジクｏロー１．３．５トリアジンを、次の変法を伴うＪ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５２３５８２（１９７７）中に記載した様に製造 する。

シアヌルクロライド（５，５ｇ：０．０３モル）を、無水炭酸ナトリウム１０ｇ を含有する無水ベンゼン４００ｍ１中に溶解し、ＰＥＧ−１９００（１９ｇ；０ ．０１モル）を加え、混合物を一晩室温で撹拌した。溶液を濾過し、石油エーテ ル６００ｍ１　（沸騰範囲、３５−６０°）を、徐々に撹拌しながら加える。細 かく分れた沈殿をフィルター上に集め、ベンゼン４００ｍ１中に再溶解する。沈 殿及び濾過工程を、石油エーテルか残存シアヌルクロライドを含有しなくなるま で数回くり返す。これは５−ｍ“リクロノルブ　（Ｌｉｃｈｒａｓｏｒｂ）”　 （イー・メルク社）のカラム（２５０ｘ　３．２ｍｍ）上でヘキサンで展開され 、紫外線検出器で検出される高圧液体クロマトグラフィーによって測定される。

水性緩衝液中でｐＨ１０，０、室温で一晩の加水分解の後活性化されたＰＥＧ− １９００を硝酸銀で滴定して、ＰＥＧモルあたり離脱したクロライド１．７モル の値が得られる。

精製物のＴＬＣ分析を、Ｂａｋｅｒから得られたＴＬＣ逆相プレートで、展開剤 としてメタノール−水、４・ｌｖ／ｖを用いて視覚化のためにヨウ素蒸気にさら して行う。この条件下で、出発メトキシポリグリコール１９００はＲｆ＝０．５ ４ないし０．６０で現われる。

活性化されたＰＥＧはＲｆ＝０．４１で現われる。未反応シアヌルクロライドは 、Ｒｆ＝０．８８で現われ、除かれる。

活性化されたＰＥＧを、窒素で分析し、適当な修正を、次の合成工程に使用する 反応成分の量の選択に利用する。かくて、生成物が理論量の２０％しか窒素を含 有しない場合、次の合成工程で使用される材料の量を、＋００／２０まで、又は ５−倍まで増加させる。生成物が理論量の５０％しか窒素を含有しない場合、１ ００１５０又は２−倍の増加しか必要としない。

Ｂ、　Ｎ−（４−クロロ−ポリグリコール１９００）−１，３，５−トリアジニ ルｅｇｇホスファチジルエタノールアミンの製造 ねじブタ付き試験管中に、クロロホルム中に卯ホスファチジルエタノールアミン を存する１００ｍｇ／ｍ１（０，１００ｍｍｏｌ）貯蔵溶液の０．７４ｍ１を、 窒素蒸気下に蒸発乾固し、Ａｉ！に記載した活性化されたＰＥＧの残部に２０５ ｍｇ（０，ｌｏＯｍｍｏｌ）を生しる量で加える。

この混合物に、無水ジメチルホルムアミドを加える。トリエチルアミン２７マイ クロリツトル（０，２００ｍｍｏｌ）を混合物に加え、空気を窒素ガスと入れ代 える。混合物を、　１１０°Ｃで保った砂浴中で一晩加熱する。

次いて混合物を減圧下に蒸発乾固し、結晶性固体ののり状塊か得られる。この固 体を、アセトン４容量及び酢酸１容量の混合物５ｍｌ中に溶解する。生じる混合 物を、シリカゲル（メルクシリカゲル６０．７０−２３０３メンユ）で装填され た２１ｍｍＸ２４０Ｍクロマトグラフィー吸着カラムの頭部に置く。このシリカ ゲルは先にアセトン酢酸、８０／２０；ｖ／ｖから成る溶剤で湿らせる。

カラムクロマトグラフィーを、同一溶剤混合物で展開し、別々の溶離液の一部２ ０ないし５０ｍ１を集める。溶離液の夫々の部分を、シリカゲル被覆されたプレ ート上でＴＬＣによって展開剤として２−ブタノン／酢酸／水；　４０２２５２ ５：ｖ／ｖ／ｖを用いて及び視覚化のためにヨウ素蒸気さらして検定する。Ｒｆ ・約０．７９の材料しか含有しない分画を一緒にし、減圧下に蒸発乾固する。高 減圧下で乾燥して一定の重量にすることは、リンを含有するほとんと無色の固体 Ｎ−（４−クロロ−ポリグリコール＋９００）−１，３，５−１−リアジニル卵 ホスファチジルエタノールアミン８６ｍｇ（３１，２マイクロモル）を与える。

固体化合物を、２４ｍ１エタノール／クロロホルム：　５０１５０クロロホルム 中に取り、遠心分離して、不溶性材料を除く。澄明化された溶液の減圧下での蒸 発乾固は、無色固体２Ｉｎ＋ｇ（７，６２マイクロモノ）を与える。

Ａ、ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のイミダゾールカルバマー トの製造 アルトリヒ（Ａｌｄｒｊｃｈ）ケミカル社から得られたポリエチレングリコール メチルエーテル１９００９．５グラム（５ｍｍｏｌ）を分子ふるい上で乾燥され たヘン上２４５ｍ１中に溶解する。純粋なカルボニルジイミダゾール０９８９グ ラム（５，５髄ｏ１）を加える。

純度を赤外線スペクトルで調べる。反応容器中の空気を窒素と入れ代える。容器 を密封し、砂浴中で７５°Ｃで１６時間加熱する。

反応混合物を冷却し、澄明な溶液が室温で生じる。溶液を乾燥ベンゼンで５０． ０ｍｌに希釈し、ＰＥＧエーテル１９００のイミダゾールカルバマートの１００ マイクロモル／ｍｌ貯蔵溶液として冷蔵庫中に保存する。

Ｂ　ポリエチレングリコールメチルエーテル１９ＧＯのホスファチジルエタノー ルアミンカルバマートの製造 ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のイミダゾールカルバマートの １００ｍｍｏｌ／ｍｌ貯蔵溶液１０．０ｍｌ　（１髄ｏ１）を１０ｍ１ナス型フ ラスコ中にピペットで入れる。

溶剤を減圧下に除去する。クロロホルム（０，５ｍｍｏｌ）中の８ｇｇホスファ チジルエタノールアミンを有する＋００ｍｇ／ｎ＋１溶液３．７ｍｌを加える。

溶剤を減圧下に蒸発する。

］、］、］］２．２−テトラクロロエチレン２ｍｌトリエチルアミン■１３９マ イクロリットル（１，０ｍｍｏｌ）を加える。容器を閉し、９５°Ｃで保たれた 砂浴中で６時間加熱する。

この時、薄層クロマトグラフィー分析を上記混合物を用いて行い、ブタノン／酢 酸／水；　４０１５１５；ｖ／ｖ／ｖ；を展開剤として使用して、５ｉｆｔ被覆 されたＴＬＣプレート上に結合する程度を測定する。Ｉ２蒸気視覚化は、Ｒｆ＝ ０．６８の遊離ホスファチジルエタノールアミンのほとんどが反応し、リン含有 脂室によってＲｆ＝０．７８ないし０゜８０で入れ代ることを示す。

残存する反応混合物中の溶剤を、減圧下に蒸発する。残留物をメチレン２０５４ １０ｍｌ中に取り、予めメチレンクロライドで洗浄されたメルクシリカゲル６０ （７０−２３０メツシユシリカゲル）で装填されたクロマトグラフィー吸着カラ ム２１ｇ　Ｘ　２７０ｍｍの頭部に置く。混合物を下記の溶剤を順番に用いてカ ラムに通過させる。

１００　１００％　０％ ２００　９５％　５％ ２００　９０％　１０％ ２００　８５％　１５％ ２００　６０９６４０’）６ 溶離液を５０ｍ１ずつ集め、夫々の部分を、Ｓ】０２−被覆されたプレート上で ＴＬＣによって検定する。その際クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アン モニウム；　１３０／７０／８１０．５％；ｖ／ｖ／ｖ／ｙで展開後、視覚化の ために１２蒸気吸着を用いる、ホスファートのはとんとか、分画１１．１２．１ ３及び１４中に見い出される。

これらの分画を一緒にし、減圧下に蒸発乾固し、高減圧で乾燥して一定の重量と なす。これは、ポリエチレングリコールメチルエーテルのホスファチノルエタノ ールアミンの無色のロウ６６９ｍｇを生じる。これは２６３マイクロモル及びホ スファチジルエタノールアミンに対して５２．６％の収率を示す。

ジューテロ−クロロホルム中に溶解された生成物のＮＭＲスペクトルは、デルタ ・３．４ｐｐｍでエチレンオキサイド鎖のメチレン基のゆえに強いジグレットと 共に、ｅｅｇ　ＰＥに対するスペクトルに対応してピークを示す。エチレンオキ サイドからのメチレンプロトンとＰＥアンノルの末端メチルプロトンの割合は、 所望の生成物ポリエチレングリコールを共役したホスファチジルエタノールアミ ンカルバマート、分子量２．６５４の分子のポリエチレンオキサイド部分にとっ て約２０００の分子量を確認するのに十分大きい。

Ｃホスファチジルエタノールアミンのポリ酢酸の製造ポリ（乳酸）、分子量＝　 ２．０００　（ＩＣＮ、クリ−グランド、オハイオ州）２００ｍｇ（０，１ｍｍ ｏ　ｌ　）を、ジメチルスルホキシド２．０ｍｌ中に、材料か完全に溶解する様 に撹拌しながら加熱して溶解する。次いで溶液を直ちに６５°Ｃに冷却し、ジス テアリルホスファチジル−エタノールアミン（Ｃａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ）７５ｍｇ（０，１ｍｍｏｌ）とシンクロへキシルカルボジイミ ド４１ｍｇ（０，２ｍｍｏｌ）の混合物上に注ぐ。次いでトリエチルアミン２８ ｍ１　（０，２ｍｍｏｌ）を加え、空気を窒素ガスでチューブから追い出し、チ ューブに栓をし、６５℃で４８時間加熱する。

この時間の後に、チューブを室温に冷却し、クロロホルム６ｍｌを加える。クロ ロホルム溶液を、３回続けて６ｍｌ容量の水で洗滌し、各々の洗滌の後に、遠心 分離し、相をパスツールピペットで分離する。残存するクロロホルム相を、吸引 濾過して、浮遊するジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを除去する 。

濾液を、減圧下に乾燥し、半−結晶性固体２１２ｍｇか得られる。

この固体を、エタノール４容量と水ｌ容量の混合物１５ｍ１中に溶解し、深さ５ ０ｍｍ及び直径２１ｍｍの吸着床のＨＤｏｗｅｘ　５０カチオン交換樹脂を通過 させ、同一溶剤１００ｍ１で洗滌する。

濾液を、蒸発乾固し、無色ロウ１３１ｍｇが得られる。

この様なロウ２９１ｍｇを、クロロホルム２．５ｍｌ中に溶解し、クロロホルム で湿らせたシリカゲルの２１ｍｍＸ２８０ｍｍカラムの頭部に移す。連続して、 下記クロロホルム各々ｌｏＯｍｌをカラムに通して、クロマトグラムを展開する １００％クロロホルム、０９６（メタノール中１％Ｎ＋（，０）１）；９０９６ クロロホルム、１０％（メタノール中１％ＮＨ，ＯＨ）；８５％クロロホルム、 １５％（メタノール中１％ＮＨ４０Ｈ）；８０％クロロホルム、２０％（メタノ ール中１％ＮＨ４０Ｈ）；７０％クロロホルム、３０％（メタノール中１％ＮＨ ４０１（）。

個々に２５ｍＩずつの溶離液をとっておき、５ＦＯ２−被覆されたプレート上で ＴＬＣＩコよって検定し、その際展開剤としてＣＨＣｌ、　、ＣＨ，ＯＨ５Ｈ２ ０，１ｌＮＨ，ＯＨ、１３０，７０，８，０，５ｖ／ｖ及び視覚化のために１２ 蒸気吸収を使用する。

カラム溶離液２７５−３２５ｍ１ずつは、Ｒｆ＝０．８９の単一材料Ｐ０４＋、 を含有する。

−緒にし、蒸発乾固した場合、これらは無色ロウ３１９ｍｇを生じる。

ホスファート分析は、可能な限り１１５．　（１００の分子量と一致する。

明らかに、ポリ（乳酸）の重合は、ホスファチジルエタノールアミンと反応させ る割合での重合と同等の割合で生じる。

この副反応を、より希釈された反応成分溶液を用いて行うことによって恐らく最 小にすることができる。

Ｄ、　ＤＳＰＥのポリ（グリコール酸）の製造グリコール酸２６６ｍｇ（３，５ ０ｍｍｏｌ）　、ジシクロへキシルカルボジイミド７４５ｍｇ（３，６０ｍｍｏ ｌ）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７５ｍｇ（０，ｌＯｍｍｏ ｌ）、トリエチルアミン３２マイクロリツトル（０，２３ｍｍｏｌ　、及び乾燥 ジメチルスルホキシド５．０ｍｌの混合物を窒素雰囲気下に７５゛Ｃで加熱し、 室温に冷却し、次いで同容量のりａロホルムで希釈し、次いで３回続けて同量の 水で洗滌し、ジメチルスルホキッドを除く。遠心分離し、相をパスツールピペッ トでその都度分離する。

クロロホルム相を吸引濾過し、浮遊する材料の少量を除き、濾液を減圧で蒸発乾 固し、青白いアンバーワックス５７２ｍｇが得られる。

クロロホルム２．５ｍｌ中にこの材料を再溶解し、クロロホルムで湿らせたシリ カゲル（メルクシリカゲル６０）の２１ｍｍ　Ｘ　２７０ｍｍカラムの頭部に移 す。

連続して、下記クロロホルム各々１００ｍ１をカラムに通して、クロマトグラム を展開する。

１００％クロロホルム、０％（メタノール中１％ＮＨ４０Ｈ）；９０９６クロロ ホルム、１０％（メタノール中］％Ｎ８．０）１）；８５％クロロホルム、１５ ％（メタノール中１％ＮＨ４０）１）；８０％クロロホルム、２０％（メタノー ル中１％Ｎ１（４０１（）　；７０％クロロホルム、３０％（メタノール中Ｉ％ ＮＨ，ＯＨ）。

個々に２５ｍ１ずつの溶離液を集め、５ｉ）２−被覆されたプレート上てＴＬＣ によって夫々検定し、その際展開剤としてＣＨＣｌ、　、ＣＨ２０）（、Ｈ２Ｏ 、濃−Ｎ）１４０Ｈ；　１３０．７ｏ、８．０．５ｖ／ｖを使用する。

はとんどすべてのＰＯ４＋材料は、溶離液２７５−３００ｍｌずつ中に存在する 。これを減圧下に蒸発乾固し、高−減圧乾燥し、無色ロウ２８１ｇを生しる。

ホスファート分析は、分子量９２４．０００を示す。反応の間の溶剤容量の操作 及びゲルコール酸とジシクロへキンル力ルポジイミドのモル割合は、恐らく他の 大きさの分子を生じる。

Ａ、　Ｉ−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールの製造は、第３図に 示した反応式中に示される。

ポリエチレングリコール、分子量１５００（Ａｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ） 　１５．０グラム（１０ｍｍｏｌ）をベンゼン８０ｍ１中に溶解する。クロロト リメチルシラン（Ａｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）１、４０ｍ１　（Ｉ　１ ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１．５３ｍ１　（１ｍｍｏｌ）を加える。混合 物を、室温で不活性雰囲気下で５時間撹拌する。

混合物を、吸引濾過して、トリエチルアンモニウムクロライドの結晶を分離し、 結晶をベンゼン５ｍｌで洗滌する。濾液及びベンゼン洗滌液体を一緒にする。二 の溶液を、減圧下に蒸発乾固し、無色油状物１５．８３グラムが得られ、これは 放置すると固まる。

展開剤としてエタノール４容量と水１容量の混合物を用いてＳｒ−Ｃａｍ逆相プ レート上での生成物のＴＬＣ、及びヨウ素蒸気視覚化は、すべてのポリグリコー ル１５００（Ｒｆ＝０．９３）が使い果され、Ｒｆ＝０．８２の材料に代ってい ることを示す。赤外線スペクトルは、ポリグリコールのみの特徴とある吸収ピー クを示す。

Ｉ−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール分子Ｊ１１５００の収量は 、はぼ定量的である。

Ｂ、　ｌ−トリメチルシリルオキシーポリエチレングリコールのトリフルオロメ タン、スルホニルエステルの製造 上記得られた、結晶性１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５ ．７４グラム（１０（イ）０１）を、無水ベンゼン４０ｍＩ中に溶解し、かき氷 の洛中で冷却する。トリエチルアミン１．５３ｍｌ（Ｉｌｍｍｏｌ）及びアルト リヒケミカル社から得られる無水トリフルオロメタンスルホン酸１．８５ｍ１　 （ｌｌｍｍｏｌ）を加え、反応混合物か褐色に変わるまで、混合物を不活性雰囲 気下で一晩撹拌する。

次いで溶剤を減圧下に蒸発し、残存するシロップ状ベースＩ・をメチレンクロラ イドで希釈して１００．０ｍｌとなす。トリフルオロメタンスルホン酸エステル の大きい反応性のために、１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール のトリフルオロメタンスルホニルエステルの更なる精製は行わない。

Ｃ，Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＨの製 造１−１−ツメチルシリルオキシポリエチレングリコールのトリフルオロメタン スルホニルエステルのメチレンクロライド貯蔵溶液１０ｍ１を減圧下に蒸発乾固 し、残留物約１．２グラム（約０．７ｍｍｏｌ）か得られる。この残留物中に、 卵ＰＥ３７２ｍｇ　（０，５ｍｍｏｌ）を含有するクロロホルム溶液３．７２ｍ １を加える。生じる溶液に、トリエチルアミン１３９マイクロリツトル（１，０ ｍｍｏｌ）を加え、溶剤を減圧下に蒸発する。得られた残留物に、乾燥ツメチル ホルムアミド５１１＋１及びトリエチルアミン（■シクロマイクロリットル（０ ，５０ｍｍｏｌ）を加える。反応容器の空気を、窒素に代える。容器を閉し、砂 浴中で＋１０°Ｃで２２時間加熱する。溶剤を減圧下に蒸発し、帯褐色油状物１ ．５８グラムか得られる。

シリカゲル６０ノリカフ０−２３０メツシユて充填された２１　Ｘ　２６０ｍｍ クロマトグラフィー吸着カラムを調製し、ブタノン４０容量酢酸２５容量及び水 ５容量から成る溶剤で洗浄する。粗生成物を、同一溶剤３ｍｌ中に溶解し、クロ マトグラフィーカラムの頭部に移す。クロマトグラムを同一溶剤て展開し、連続 して溶離液３０ｍ１ずつを夫々ＴＬＣによって検出する。

ＴＬＣ検出システムは、ブタノン／酢酸／水の溶剤混合物、４０／２５１５；ｖ ／ｖ／ｖを用いて、シリカゲル被覆されたガラスプレートを使用する。ヨウ素蒸 気吸収は、視覚化に役立つ。この溶剤系で、Ｎ〜１−トリメチルシリルオキシポ リエチレングリコール１５００ＰＥは、Ｒｆ＝０．７８で現われる。未変化ＰＥ はＲｆ＝０．６８で現われる。所望のＮ−のカラム溶離液の主たる成分である。

減圧で蒸発乾固した場合、この部分は化合物の青白い黄色油状物１１１ｍｇを生 じる。

Ｄ、　Ｎ−ポリエチレングリコール１５００　ホスファチジル−エタノールアミ ン酢酸脱保護の製造 一度一クロマトグラフィー分離されたＰＥ化合物を、テトラヒドロフラン２＋ｎ ｌ中に溶解する。これに酢酸６ｍｌ及び水２ｍｌを加える。生じる溶液を３日間 、２３°Ｃで放置する。反応混合物からの溶剤を、減圧で蒸発し、重量を一定に 保ちながら乾燥し、青色い黄色ロウ７５ｍｇが得られる。エタノール４容量部と 水１容量部の混合物で展開された５ｉ−Ｃｐｓ逆相上でのＴＬＣは、いくつかの 遊離ＰＥ及びいくつかのポリグリコール様材料が加水分解中に形成されることを 示す。

残留物をテトラヒドロフラン０．５ｍｌ中に溶解し、エタノール水；　８０；２ ０；ｖ；ｖの溶液３ｍｌで希釈する。混合物を、オクタデシル結合されたファー ゼシリカゲルで充填された１０ＭＸ２５０ｍｌｌｌクロマトグラフィー吸着カラ ムの頭部に供給し、カラムをエタノール水８０　：　２０容量％で展開し、連続 して溶離液２０ｍ１ずつを集める。溶離液を、逆相ＴＬＣによって検定する。Ｒ ｆ＝０．０８ないし０．１５の生成物しか含有しない分画を一緒にする。これは 、主として溶離液の２０２０−１ｏ０部分である。減圧で蒸発乾固した場合、こ れらの部分は無色ロウＰＥＧ−ＰＥ３３ｇを生じこれは出発ホスファチジルエタ ノールアミンに対してほんの３％の収率に相当する。

ＮＭＲ分析は、生成物がＰＥ残留物もポリエチレングリコール残留物も含んでい るが、最適−出現元素分析にかかわらずポリグリコール鎖の鎖長を約３ないし４ 個のエチレンオキシド残基に減少させることを示す。

製造された生成物を、ＰＥＧ−ＰＥ異性体の製造に使用する。

Ｅ、フルオライドＮ−ポリエチレングリコールｌ　５（ＩＯＰ、ε、の製造粗Ｎ −］−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールＰＥ５００ｍｇを、テト ラヒドロフラン５ｍｌ中に溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオライド１８ ９ｍｇ（０，ａｏｏ　ミリモル）を加え、溶解するまで撹拌する。反応成分を、 室温（２０°Ｃ）で−晩装置する。

溶剤を減圧下に蒸発し、残留物をクロロホルムＩＯ＋＋＋Ｉ中ｌ二溶解し、２回 続けて１０ｍ１ずつの水で洗滌し、遠心分離してクロロホルムと水相を分ける。

クロロホルム相を減圧下に蒸発し、橙−褐色ロウ３９０ｍｇか得られ、これは不 純なＮ−ポリエチレングリコール１５００ＰＥ化合物であることを示す。

ロウを、クロロホルム５ｍｌ中に再溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカゲル を有する２１Ｘ２７０ｍｍカラムの頭部に移す。

溶剤１００ｍ１をカラムに通してカラムを展開する。表２の溶剤を、順番に使用 する。

表２ 容量％　２％濃水酸化アンモニウム／メタノールをクロロホルム　含有するメタ ノール容１％１００％　０％ ９５％　５％ ９０％　１０％ ８５％　１５％ ８０％　２０％ ７０％　３０％ ６０％　４０％ ５０％　５０％ ０％　１００％ カラム溶離液の分画５０ｍ１を分離し、とっておく。カラムの分画を、ＴＬＣに よって５ｉ−Ｃｐｓ逆相プレート上で分離する。ＴＬＣプレートを、水ｌ容量と 混合された工タノール４容量で展開する。視覚化を、ヨウ素蒸気にさらすことに よって行う。

Ｒｆ約０．２０のヨウ素−吸収脂質を含有するこれらの分画のみを一緒にし、減 圧下に蒸発乾固し、高圧で乾燥して、一定の重量となす。この方法でロウ結晶性 固体９４ｍｇか、分子量２２２６で得られる。ジューテロクロロホルム中に溶解 されたこの材料のプロトンＮＭＲスペクトルは、ポリエチレングリコールに帰す ると考えられるいくつかのメチレンプロトンと共に分子のホスファチジルエタノ ールアミンプロトンか原因で予期されたピークを示す。（デルタ・３．７）。

例４ ＲＥＶｓ及びＭＬＶｓの製造 Ａ　造粒されたＲＥＶｓ 下記の例中に示されるモル割合で、選択された脂質成分Ｉ５μｍｏｌ全部をクロ ロホルム中に溶解し、回転蒸発器によって薄いフィルムとして乾燥する。この脂 質フィルムを、蒸留水で洗滌されたジエチルエーテル１ｍｌ中に溶解する。二の 脂質溶液に５ｍＭ　トリス、１００ｍＭ　ＮａＣ１，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡを含 有する水性緩衝溶液、ｐＨ７，４，０，３４ｍ１を加え、混合物を、１分間音波 処理によって乳化し、溶液の温度を室温で又はそれ以下に保つ。リポソームを製 造し、内包された（１２’Ｉ）チラミニルーイヌリンを含有する場合、それをホ スファート緩衝液中で約４μＣｉ／ｍｌ緩衝液の濃度で含む。

エーテル溶剤を減圧下に室温で除去し、生じるゲルを、上記緩衝液０，１ｍｌ中 （二取り、激しく振る。生じるＲＥＶ懸濁液は、顕微鏡検査によって測定される 約０．１ないし２０ミクロンの粒子サイズを有し、１個又はほんの僅かの二重層 ラメラを有する比較的大きい（１ミクロンより大きい）小胞から主に成る。

リポソームを、選択された細孔サイズ０，４ミクロン又は０．２ミクロンを有す るポリカルボナートフィルター（Ｓｚｏｋａ、　１９７８）を２回通して抽出す る。０，４ミクロンフィルターを通して抽出されたリポソームは、０１１７　（ ０，０５）ミクロン直径、０．２ミクロンフィルターを通したものは、０．１６ （０，０５）ミクロン直径を平均とする。

非−内包Ｃ１２’ｌ）チラミニルーイヌリンを、リポソームのセファテックスＧ −５０（ファルマシア）通過によって除去する。

Ｂ　造粒されたＭＬＶｓ 多重膜小胞（ＭＬＶ）リポソームを、標準操作に従って、脂質混合物を第一級Ｃ ＨＣｌ、を含有する有機溶剤中に溶解し、減圧下回転によって薄いフィルムとし て脂質を乾燥して、製造する。ある場合、脂質層に関する放射性標識を、乾燥前 に脂質溶液に加える。脂質フィルムを、所望の水性層及び３Ｍガラスピーズの添 加によって水和し、次いで渦をつ（うて撹拌し、少なくとも１時間リン脂質成分 の相転移温度を振って上げる。ある場合、水性層に対する放射性標識を、緩衝液 中に含有させる。ある場合、水和された脂質を、しばしば凍結し、３回解かして 、次の抽出工程に容易に供給する。

リポソームサンプルのサイズを、加圧された窒素ガスを用いて、定められた細孔 ボリカーボナートフィルターを通して抽出してコントロールする。ある操作で、 リポソームを細孔０．４μｍを有するフィルターを１回通し、次いて細孔０．１ 　μｍを有するフィルターを１０回通し抽出する。

粒子の平均直径がＤＬＳによって決定された様に１１００ｎ以下になるまで、０ ．０５μｍ細孔てくり返し抽出する。非内包水性成分を、抽出されたサンプルの ケルパーミエーンヨンカラムの通過によって除去し、排気容量中のリポソームを 包含容量中の小分子から分離する。

Ｃ，”ＧａをＤＦ−含有リポソームに装填公知処理から改めて作られたＧａ６７ −ＤＦ標識されたリポソームの製造用プロトコル（ガビゾン、１９８９）。簡単 に、リポソームを内部水性相中に内包されたイオンキレーターデスフエラルメン ラートで処理し、ヒドロキシキノリンによって二重層を通って運搬されるＧａを 逆行することなく結合する（オキシン） Ｄ、動的光散乱 リポソーム粒子サイズ分布測定が、プルックヘブン機器Ｂ１−２０３０ＡＴオー トコレレータ−を備えたＮＩＣＯＭＰモデル２００を用いてＤＬＳによって得ら れる。機器を、製造業者用指示書に従って操作する。ＮＩＣＯＭＰ結果は、平均 直径及び相対容量によって小胞のガウス分布の標準偏差として表わされる。

Ａ　血液循環時間及び血液／ＲＥＳ割合を測定。

リポソームの生体内試験を、２つの異なる動物モデルで行う：夫々２５ｇのスイ ス−ウェブスターマウス及び夫々２００−３００１ｉの実験用ラット。マウス試 験は、１μＭリン脂質／マウスでリポソームサンプルの尾静脈注射を行い、次い て動物を一定の時間後殺し、ガンマカウンティングによって標識量に対して組織 除去する。

夫々組織中で注射された薬用量の重量及びパーセントを測定する。ラットの試験 は、大腿静脈中の長時間持続するカテーテルを３−４μＭリン脂質／ラットで他 の大腿動脈中にカテーテル中にリポソームサンプルを注射した後の一定の時間で 血液サンプルの除去に関して証明する。２４時間までの数倍ポイントで血液中に 残存する注射された薬用量のパーセントを測定する。

Ｂ、血液流中のリポソーム保持の時間経過メトキンＰＥＧ　、分子量１９００及 び１〜バルミトイル−２−才レイル−ＰＥ（ＰＯＰＥ）から成るＰＥＧ−ＰＥを 例２と同様に製造する。ＰＥＧ−ＰＯＰＥ脂質を約０．１　：　２の脂質　脂質 モル割合で部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）と−緒し、脂質混合物を 水和し、例４中に記載した様に０．１ミクロンボリカーポナート膜を通して抽出 し、平均サイズ約０．１ミクロンのＭＬＶ’　ｓを生じる。ＭＬＶ脂質は少量の 放射性標識された脂質マーカー＋４０−コレステリルオレアート、及び内法され たマーカー３Ｈ−イヌリンを含む。

リポソーム組成物を注射し、マウス中に最初に注射された薬用量パーセントを、 注射後１．２．３．４及び２４時間て例４中に記載した様に測定する。放射性標 識された材料の損失の時間経過を第７図に示す。この図は、内包されたイヌリン （黒まる）、　１００％の最初の注射ボンドに修正されたイヌリンマーカー（白 まる）、及び脂質マーカー（黒三角）に関して注射後２４時間にわたって注射さ れた薬用量パーセントのプロットである。明らかな様に、脂質も、内包されたマ ーカーも２４時間後本来注射された薬用量の１０％より大きいことを示す。

Ｃ３２４時間血液リポソームレベル 血液中に注射される薬用量パーセント、及びリポソームマーカーの血液／ＲＥＳ 割合を静脈内リポソーム注射後２４時間で測定するための試験を、上述の様に実 施する。下記表３中の左欄に示した組成物を有するリポソーム形成物を上述の様 に製造する。特に明記しない限り、脂質−誘導されたＰＥＧはＰＥＧ−１９００ てあり、リポソームサイズは０．１ミクロンである。静脈内投与後２４時間で血 液中に残存する薬用量パーセント、及び測定された２４時間血液／ＲＥＳ割合を 、表の中央及び右欄に夫々示す。

表３ 脂質組成物　％血液　中に注射された薬用量　Ｂ／ＲＥＳＰＧ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ （、７５：９．２５：５）　０．２　０．０１ＰＣ：Ｃｈｏｌ（１０・５）　０ ．．８　０．０３ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ　２３．０　３．０ＰＥＧ −ＤＳＰＥ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ　（２５０ｎｍ）　９．０　０．５ＰＥＧｓｏｏｏ −ＤＳＰＥ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ　２１．０　２．２ＰＥＧ、２．−ＤＳＰＥ：ＰＣ ：Ｃｈｏｌ　５．０　２．０ＰＥＧ−ＤＳＰＥ・ＰＣ（０，７５・９．２５）　 ２２．０　０．２ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：ＰＧ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ　４０．０　４．０ （０，７５：２．２５ニア：５） ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：ＮａＣｈｏｌＳＯ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ　２５．０　２．５（０ ，７５：０．７５：９．２５：４．２５）＊すべでの形成物は、３３％コレステ ロール及び７．５％充填される成分を含有し、記述する以外はｌｏＯｎｍ平均直 径である。ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、記述する以外はＰＥＧ、、。。から成る。

明らかな様に、注射後２４時間の血液中に残存する薬用量パーセントは、ＰＥＧ −誘導された脂質を含有するリポソームに関して５−４０％の間である。対比と して、ＰＥＧ−誘導された脂質のない２つのリポソーム形成物に於て、２４時間 後に残存するリポソームマーカーは、１％より小さい。また表３から明らかな様 に、血液／ＲＥＳ割合は、コントロールリポソーム中で０．０１−０．０３から 少なくとも０．２に増加し、ＰＥＧ−誘導されたリポソームを含有するリポソー ム中で４，０の高さである。

Ｃ，ポリ乳酸誘導されたＰＥを用いる血液寿命測定静脈内リポソーム注射後数時 間で血液中の注射された薬用量パーセントを測定するための試験を、上述の様に 実施する。２：３．５：１又はｌ・３．５：１重量％のどちらかで組成物ポリ乳 酸−ＰＥ：）ＩＳＰＣ：Ｃｈｏｌを有する抽出されたＭＬＶリポソーム形成物に よる典型的結果を、第１Ｏ図中に示す（黒四角）。１５分て標準化された残存薬 用量パーセントを、２４時間にわたって示す。

このデータは、ポリ乳酸−被覆リポソームのクリアランスかポリ乳醋誘導された ＰＥ不含の類似形成物よりも数倍大きいことを示す。

Ｄ、ポリグリコール酸誘導されたＰＥを用いる血液寿命測定静脈内リポソーム注 射後数時間血液中の注射された薬用量パーセントを測定するための研究を、上述 の様に実施する。２：３．５：１重量％で組成物ポリグリコール酸−ＰＥ：Ｈ３ ＰＣ：ＣｈＯｌを有する抽出され°たＭＬＶリポソーム形成物による典型的な結 果を第１０図中に示す（白三角）。１５分で標準化された残存する薬用量パーセ ントを２４時間にわたって示す。

これらのデータは、ポリグリコール酸−被覆されたリポソームのクリアランスか ポリグリコール酸誘導されたＰＥ不含の類似形成物よりも数倍大きいことを示す 。

と同様に製造する。ＰＥＧ−ＰＥ脂質を、スフィンゴミエリン（ＳＭン、十分に 水素化された豆ＰＣ（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈａｔ）、部分的に水素化さ れた豆ＰＣ（ＰＩ−１３Ｐｃ）　、及び表４中にＰＣＩＶＩ　、ＩＶｌｏ、ｌＶ ２Ｏ、ｌＶ３Ｏ、及びｌＶ４Ｏとして同定される一部水素化されたＰＣ脂質のう ちから選択された脂質を用いて形成する。脂質成分を、表５中の左欄に示される モル割合で混合し、例４中に示した様に０．１ミクロンに合わせて作られたＭＬ Ｖ’　ｓを形成するのに使用する。

表４ 卵ＰＣ相転移温度範囲　モル％脂肪酸組成物形　’＋３Ｃ，１８：０　１８＋１ 　＋８：２　２０：０　２０：ｌ−４２２１０２２：ｌ−そのまま　＜０　１２ 　３０　＋５　０　３　０　５ＩＶ４０　＜０　１４３２４　０　３　０　４’ ｆＶ３ｏ　＜２０−３０　２０　３９　ｏ　１２　３　４ＩＶ２０　２３−４５ 　３０　１０　０　２　１　３　３ＩＶＩ０　３７−５０　４２４　０　３　１ 　４　２ＩＶＩ　４９−５４　５６０　０　５　０　６　０ＰＥＧ−ＰＥ：ＳＭ ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ ｏ、２：ｌ・１：１　１９．２３　６．５８　２．９２　４９．２３ＰＥＧ−Ｐ Ｅ：Ｐ）（ＳＰＣ：ＣｈｏｌＯ，１５：１．８５・Ｉ　２０．５４　７．１７　 ２．８６　５５．１４ＰＥＧ−ＰＨ：ＰＣ：ＩＶＩ　：Ｃｈｏｌｏ、１５・１． ８５：１　１７．２４　１３．７１　１．２６　６０．４４ＰＥＧ−ＦＥ：ＰＣ Ｎ１：Ｃｈｏｌ　（２匹動物）０．１５：１．８５：ｌ　１９．１６　１０．０ ７　１．９０　．６１．８７ＰＥＧ−ＰＥ：ＰＣＩＶＩＯ：Ｃｈａｔ　（２匹動 物）０．１５＋１．８５：１　１２．１９　７．３１　１．６７　４０．７３Ｐ ＥＧ−ＰＥ：ＰＣＩＶＩＯ：Ｃｈｏｌｌ、１５：１．８５＋１　２．４　３．５ 　０．６９　１２．８５ＰＥＧ−ＰＥ：ＰＣｌｌ７２０：Ｃｈｏｌｏ、１５＋１ ，８５二１２４．５６７．５２３．２７６２．７５ＰＥＧ−ＰＥ：ＰＣｌＶ２Ｏ ：ＣｈｏｌＯ１１５・１．８５：Ｉ　５．２　５．７　０．９１　２２．１ＰＥ Ｇ−ＰＥ：ＰＣｌＶ４Ｏ：Ｃｈｏｌｏ、１５＋１．８５＋１　１９．４４　８． ８７　２．１９　５３．８８ＰＥＧ−ＰＥ：ＰＣ■：Ｃｈｏｌ Ｏ，１５：１．８５：０．５　２０．３　８．８　２．３＋　４５．５ＰＥＧ− ＰＥ：ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ Ｏ，１５：１．８５：ｌ　１５．３　９．６　＋、５９　４５．９タリンを用い て製造する。

投与後２及び２４時間で血液中に残存する内包されたイヌリンパーセントは、下 記表６の右に示す様に０−３０モルパーセントの範囲でコレステロールの」り定 できる作用を示さない。

３Ｈ水性標識（漏出）１４Ｃ−脂質標識１）　ＳＭ：ＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ− ＤＳＰＥｌ：　ｌ：　１：　０．２ １００　ｎｍ　ＭＬＶ　１９　５　４８　２４３００　ｎｍ　ＲＥＶ　２３　１ ５　６７　２０２）　ＳＭ：ＰＣ・Ｃｈｏ　ｌ　：　ＰＥＧ−ＤＳＰＥｌ、１・ ０．５：０．２ ３０ＯＮＭＲＥＶ　２３　１５　７１　１７３）ＳＭ：ＰＣ：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ ｌ：　１：　０．２ １００ｎｍ　ＭＬＶ　１９　６　５８　２４３００　ｎｍ　ＲＥＶ　３２　２３ 　７６　４３Ｂ　エトキシレート化コレステロールの作用メトキシ−エトキシ− コレステロールを、第１欄で記載したトリフルオロスルホナートカップリング法 を経てメトキシエタノールをコレステロールにカップリングすることによって製 造する。ＰＥＧ−ＰＥはメトキンＰＥＧ　、分子量１９００から成り、例６に記 載した様にＤＳＰＥを誘導する。ＰＥＧ−ＰＥ脂質を表７の右に示す様なジスア リルＰＣ（ＤＳＰＣ）、部分的に水素化された豆ＰＣ（ＰＨ３ＰＣ）　、コレス テロール及びエトキンレート化コレステロールの中から選択された脂質を用いて 形成する。データは、（ａ）エトキシレート化コレステロールは、ＰＥＧ−ＰＥ と比較して、ＰＥＧ−ＰＨ単独とほぼ同一の血液中のリポソーム寿命の増加度を 生じることを示す。単独でエトキシレート化コレステロールは、リポソーム寿命 のおだやかな増加度を生しるか、実質上ＰＥＧ−ＰＥによって得られるものより も小さい。

”　Ｃ−Ｃｈｏｌ−オレアート ２時間　２４時間 ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ　５５　９１．８５：Ｉコ０，１５ ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ：ＰＥＧｓ−Ｃｈｏｌ　５７　９１． ８５：　０，８５：　０．＋５：　０．１５Ｈ３ＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＨＰＣ：Ｐ ＥＧｓ−Ｃｈｏｌ　１５　２１．８５：　０．８５：　０．１５：　０．＋５Ｈ ５ＰＣ：Ｃｈｏｌ　：ＨＰＧ　４　１１．８５＋　１：　０．１５ 例８ ＰＥＧ−ＰＥリポソーム中、血液／ＲＥＳ割合で積載された脂質成分の作用ＰＥ Ｇ−ＰＥはメトキシＰＥＧ　、分子量１９００から成り、例６に記載した様にＤ ＳＰＥを誘導する。ＰＥＧ−ＰＥ脂質を第７図中に示した様に卵ＰＧ（ＰＧ）、 部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）　、及びコレステロール（Ｃｈｏｌ ）の中から選択された脂質を用いて形成する。

図中に示された２つの形成物は、約４．７モルパーセント（三角）又は１４モル パーセント（まる）ＰＧを含有する。脂質を、例４に於けると同様に０．　ｌ　 ミクロンの大きに合わせたＭＬＶ’　Ｓとして製造する。

注射後０．２５、■、２．４及び２４時間で存在する注射されたリポソーム薬用 量のパーセントは、第７図に２つの形成物に関してプロットする。明らかな様に 、組成物中のＰＧパーセントは、血液流中リポソーム保持に関してはとんと又は 全く作用を有しない。また示された内包されたマーカーの損失割合は、ＰＧを含 有する、同様に製造されたリポソームに対して観察されたのと似ている。

例９ ＰＥＧ−被覆かつ非被覆リポソームの血しょう運動メトキシＰＥＧ　、分子量１ ９００及びジステアリルＰＲ（ＤＳＰＥ）から成るＰＥＧ−ＰＥを、例２に於け る様に製造する、ＰＥＣｒＰＥｔｌｆ質をＰＨＥＰＣ、及びコレステロールを用 いて０．＋５：　１．８５：ｌのモル割合で形成する。第二脂質混合物は、同一 脂質を含有するか、ＰＥＧ−ＰＥは含まない。リポソームを、例５に記載した様 にデスフエラルメシラートの存在下に脂質水和によって２つの脂質混合物から製 造し、０．１ミクロンに造粒し、ゲル濾過によって取り込まれなかったデスフエ ラルを除去し、リポソームに＠　ｌＧａ−オキシンを引き続き積載する。非内包 １７Ｑａを、セファデックスＧ−５０ゲル排除カラムの通過の間に除く。２つの 組成物は０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，５ｍＭデスフエラル中に１０μｍｏｌ／ｍ ｌを含有する。

２つのリポソーム組成物（０，４ｍ１）を例６に記載した様に動物に■注射する 。注射後０．２５．１．３又は５及び２４時間で、血液サンプルを除き、血液中 に残存するイヌリン量を検出し、注射直後に測定された量の百分率として表わす 。結果を、第９図中に示す。明らかな様に、ＰＥＧ−被覆リポソームは、約１１ 時間の血液半減期を有し、注射された材料のほぼ３０％は、２４時間後の血液中 に存在する。対照的に、非被覆リポソームは、１時間より少ない血液中の半減期 を示す。２４時間で、注射された材料の量は、検出不可能である。

０、３：０．３：１．４：ｌのモル割合で、ＰＥＧ−ＰＥＳＰＧ、　ＰＨＥＰＣ 、及びコレステロールを含有する小胞−形成脂質をクロロホルム中に溶解し、２ ５μｍｏｌ／リン脂質／ｍｌの最終脂質濃度となす。遊離塩基形でアルファート コフェロール（α−ＴＣ）ヲ、クロロホルム８メタノール（２＋１）溶液中に加 え、０，５％の最終モル割合とです。脂質溶液を、乾燥して薄い脂質フィルムと なし、次いで１＋ｎＭデスフエラルを含有する１２５ｍＡｌ硫酸アンモニウムを 含有する熱い（６０°Ｃ）溶液で水和する。水和を、リン脂質５０μｍａｔにつ き水性溶液１ｍｌを用いて実施する。脂質材料を１０凍結／解凍サイクルで、液 体窒素及び熱い水浴を用いて水和する。

リポソーム造粒を、２個の核細孔ポリカーホナート膜によって、３サイクル０． ２ミクロンフィルターによって、次いでＩＯプサイル０．０５ミクロンフィルタ ーによって押出して実施する。最終リポソームサイズはｌｏＯｎｍである。次い て造粒されたリポソームを、２４時間のｒＩ！１３回５％グルコース５０−１０ ０容量に対して透析する。第４サイクルを１時間ｐＨ６，５−７，０に滴定され た５％グルコースに対して実施する。

０．９％ＮａＣ１及びｌ−デスフエラル中にドキソルビシン、１０ｍｇ／ｍｌを 含有する溶液を製造し、透析されたリポソーム調製物の等容量と混合する。混合 物中の薬剤の濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ薬剤５０μｍｏｌ／ｍｌリン脂質である。

混合物を１時間６０°Ｃて水浴中で振とうしながら温室する。取り込まれていな い薬剤を、小さいカラム中に充填されたドヴ工−（Ｄｏｗｅｘ）５０ＷＸを通し て除去する。カラムをベンチレノブ遠心分離器中で５分間遠心分離して、完全に リポソーム懸濁液を溶離する。混合物の滅菌を、０．４５　ミクロン膜の通過に よって行い、リポソームを５°Ｃで保存する。

と同様に製造する。ＰＥＧ−ＰＥ脂質を水素化された大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ）及び コレステロールで０．１５・１．８５：Ｉ（ＰＥＧ−ＤＯＸ）のモル割合で形成 する。第二脂質混合物は、水素化されたホスファチジルイノシトール（ＨＰＩ） 　、Ｈ３ＰＣコレステロールを１・ＩＯ：５（ＨＰＩ−ＤＯりのモル割合で含有 する。夫々の脂質形成物を、例１０と同様にアンモニウムイオン勾配を含有する 、造粒されたＭＬＶｓの製造に使用する。

リポソームに、例１５と同様にドキソルビシン溶液の等容量、１０ｍｇ／ｍ！プ ラス１−デスフエラルと混合して、ドキソルビシンを積載する。２つの組成物を 、第１１１Ｎ及び下記表７にＰＥＧ−ＤＯＸ及びｌ（Ｐ　ｌ−１）ＯＸリポソー ムとして夫々示す。ドキソルビシンＨＣＩ溶液（標識された生成物、遊離Ｄｏｘ ）は、病院薬局から得られる。遊離ＤＯＸ、　ＰＥＧ−Ｄｏｘ及びＨＰＩ−Ｄｏ ｘを、注射日に非緩衝の５％グルコースを用いて同一濃度（１，８ｍｇ／ｍｌ　 ）に希釈する。犬を３つのグループ（雌２匹、雄１匹）に無作為に選び体重をは かる。１８ケージフエンフロン（Ｖｅｎｆｌｏｎ）　ＩＶカテーテルを、夫々の 動物の表面の四肢静脈に押入する。薬剤及びリポソーム懸濁液を、急速濃縮塊（ １５秒）によって注射する。４ｍｌ血液サンプルを、注射前に及び注射後５．　 ＋０．１５．３０．４５分、Ｉ、　２．４．６．８．１０．１２．２４．４８及 び７２時間で採取する。リポソームグループ血液を９６．１２０．１４４．及び １６８時間後採取する。血しょうを、遠心分離によって全血液の形成成分及び標 準蛍光技術によって検出されるドキソルビシンに分離する。血液中に残存するド キソルビシンの量を、注射直後に測定された標識された薬剤のピーク濃度の百分 率として表わす。その結果を、第１１図中にプロットし、ＰＥＧ−ＤＯＸ及びＨ ＰＩ−ＤＯＸ組成物ともに線状対数プロット（シングル−モート指数関数）を生 し、遊離薬剤は下記表８中に示す様な二次モデル指数関数曲線を生じる。これら の曲線から測定される２つのリポソーム形成物の半減期を表８中に示す。

また表８中に示される様に、７２時間のテスト期間にわたって血しょう運動曲線 を積分することによって決定される曲線（ＡＵＧ）下にその領域はある。ＡＵＧ 結果は、注射後７２時間でＰＥＧ−ＤＯＸリポソームから薬剤の全有効性がＨＰ Ｉ−ＤＯＸリポソームの存効性のほぼ２倍であることを示す。このことはＰＥＧ −ＤＯＸリポソームのほぼ２倍大きい半減期と一致する表９中の“ＣＬ”記載は ０．１．を示す。

表８ 運動パターン　遊離ＤＯＸ　ＨＰＩ−ＤＯＸ　ＰＥＧ−ＤＯＸピーク濃度　二次 −指数関数　−次一指数関数　−次一指数関数（ｍｇ／Ｉ）　０．４−２．２　 ４．３−６．０　４．５−５．０ＵＧ （ｍｇ／ｌ）　７．１−１０．０　７３．９−９７．５　１３２．９−３２９． ９１７２時Ｍ　１．９−３．３　１１．１−１２．０　１９．６−４５．５ＣＬ 　（ｍｇ／ｈｒ）　０．６−０．９　１．１−１．６　１．３−２．２Ａ、皮下 腫瘍 ドキソルビシンが積載されたＰＥＧ−リポソームを、例１１と同様に製造する（ ＰＥＧ−ＤＯＸ　ＩＪポソーム）。使用される遊離薬剤を、病院薬局から得られ る臨床材料であ１２匹のマウスを有する２つのグループに、１０＠Ｊ−６４５６ 腫瘍細胞を皮下注射する。

１４日後、腫瘍が皮下範囲で約１ｃｍ”サイズに生長し、動物に遊離薬剤として （グループｌ）又はＰＥＧリポソーム中に内包された形で（グループ２）ドキソ ルビシンｌ０ｍｇ／ｋｇを■注射（尾静脈）する。薬剤注射後４．２４．及び４ ８時間で、夫々のグループ中の４匹の動物を殺害し、腫瘍、心臓及び筋肉組織の 箇所を切除する。各組織をはかり均質化し、標準蛍光検定処理（ガビゾン、１９ ８９）を用いてドキソルビシン濃度の測定に抽出する。各均質物中で測定された 全薬剤を、グラムｍ織につきμｇ薬剤として表わす。

心臓、筋肉及び肝臓中の薬剤分布に関するデータを、第＋２Ａ及び１２日図中に 遊離及びリポソーム−伴うドキソルビシン夫々に介してプロットする。第１２Ａ 図中、最初に薬剤は心臓中に優先的に吸収されるので、すべての３の組織タイプ は薬剤／ｇ組織のほぼ同一量を吸収することか分る。対照的に、ＰＥＧ−リポソ ーム中に取り込まれる時、薬剤は心臓及び筋肉組織中で減少したレベルを有しな がら、腫瘍中に強い選択的局在化を示す。

Ｂ、腹水腫瘍 １５匹マウスを有する２つのグループに、ＩＯ’Ｊ−６４５６リンパ腫細胞を腹 腔的注射する。腫瘍をＩ−２週間生長させ、その時腹水液体５ｍｌか蓄積する。

次いでマウスにドキソルビシンｌ０ｍｇ／ｋｇを遊離薬剤形で（グループ１）又 は例】】に記載された様ｔＰＥＧリポソーム中に取り込まれた形のどちらかで■ 注射する。腹水液体を、処理後１．４．１５．２４及び４８時間で各グループ中 の３匹の動物が採取する。更に腹水腫瘍を細胞と液体成分に遠心分離（１５分、 ５０００ｒｐｍ）によって分画する。上澄み中の遊離及びリポソーム−結合薬剤 を、上述のドヴ、−ＷＸ樹脂に液体を通して遊離薬剤を除去して測定する。腹水 液体、腫瘍細胞、上澄み、及び樹脂−処理された上澄み中のドキソルビシン濃度 を次いで測定し、これらの値からμｇドキソルビシン／グラム組織を算出する。

全腹水液体上澄み（黒菱形）、遊離薬剤除去後の上澄み（黒三角）、及び単離さ れた腫瘍細胞（黒まる）に関する値を第１３図中にプロットする。明らかな様に 、腹水液体中の全ドキソルビシンは、約２４時間まで一定に増加し、次いで次の ２４時間にわたって僅かに減少する。腫瘍中のはとんとのドキソルビシンは、リ ポソーム−取り込まれた形であり、リポソームかそのままの形で充実性腫瘍中に 濡出することかできることを示す。

同様な実験で、１２匹のマウスを有する２つのグループに、Ｊ−６４５６リンパ 腫をＩＰ注射し、腫瘍を上述の様に生じさせる。いったん腹水腫瘍は約５ｍｌに 達すると、動物の１グループに、遊離ドキソルビシンｌ０ｍｇ／ｋｇを、及び他 のグループにＰＥＧリポソーム中に取り込まれたドキソルビシンｌ０ｍｇ／ｋｇ を注射する。処理？＆４．２４及び４８時間で、腹水液体及び血液サンプルを、 夫々のグループの動物４匹から採取し、動物を殺害する。肝臓及び心臓組織の部 分を切除し、均質化し、上述の様に薬剤濃度を検出する。血しょうを、遠心分離 によって全血液から分離し、薬剤濃度を上述の様に検出する。腹水液体中のドキ ソルビシン濃度も測定する。結果を表９中に表わす。血しょう及び腹水液体レベ ルを、ｍｌにつきμｇドキソルビノンとして、肝臓及び心臓組織値をダラム組織 につきμｇトキソルビンンとして表わす。夫々の測定に関して標準偏差をかっこ 内に示す。示されている様に、すべての時間点でＰＥＧリポソームに取り込まれ た形で薬剤を受け入れるグループに関して、血しょう中にかなり多くのドキソル ビシンが存在する。腹水腫瘍レベルも、特により長い時間点（２４及び４８時間 ）でリポソームグループに於てより一層高い。

これらのデータから、ＰＥＧリポソームによって薬剤が腫瘍に選択的に放出され るのを確認する。

表９ 血しょうμｇ／ｍ１（ＳＤ） 時間　遊離　ＰＥＧ−ＤＯＸ ４　０、９　（０，０）　２３２．４　（９５，７）２４　０．０　１１８．３ 　（６，７）４８　０、０　８４．２　（２０，３）腹水腫瘍　（＠瘍、液体） ４　０．３（０，１）　３．８　（２，の２４　０．１　（０，１）　２３．０ 　（８，９）４８　０．４　（０，３）　２９．１　、（２，０）肝臓　μｇ／ グラム（ＳＤ） ４８、ｌ（１，４）　検出不可能 ２４　６．２（４，８）　９．８　（５，９）４８　６．１　（３，６）　１０ ．２　（０，１）心臓 ４　５．７（３，４）　２．４　（０，９）２４　２．５（０，３）　２．１　 （０，４）４８　１．５（０，６）　２．３　（０，１）腫瘍／心臓 ４８　０、２６６　１２．６ された通常のリポソーム（１００ｎｍＤｓＰｃ／Ｃｈｏｌ、　ｌ１１）又はＰＥ Ｇリポソーム（１００ｎｍＤｓＰｃ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、　］Ｏ：３ ：］）のどちらかの０．５ｍｇを注射する。各グループからマウス３匹を、処理 後２．２４及び４８時間で殺害し、腫瘍を切除し、体重をはかり、ガンマカウン ターを用いて放射能の量を定量する。結果を次表中に示し、ダラム組織につき注 射された薬用量のパーセントとして表わす。

表１０ ２時間　３８．２　７．２　３．８　３４．１　１＋、０　３．７　１．０２４ 時間　１５．１　１４．６　４．２　７．６　２＋、６　３．９　１．１量とし て表わす。

例Ｉ４ 無傷腫瘍へのリポソーム温圧・ 直接顕微鏡視覚化 メトキンＰＥＧ　、分子量１９００及びジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）から成る ＰＥＧ−ＰＥを例２の様に製造する。ＰＥＧ−ＰＥ脂質をＨ３ＰＣ，及びコレス テロールで、０．１５：１．８１　：ｌのモル割合て形成する。ＰＥＧ−リポソ ームを製造し、コロイド状金色粒子を含有する（ホンダ）。生じるＭＬＶｓを、 上述の様に押出しによって造粒し、平均０．１ミクロンサイズとなす。非取り込 み材料をゲル濾過によって除去する。懸濁液中の最終リポソーム濃度は約１０μ ｍｏｌ／ｍｌである。

最初の実験で、正常マウスに上記リポソーム形成物０．４ｍｌを■注射する。注 射後２４時間で、動物を殺害し、除去された肝臓の切片を、標準水溶性プラスチ ック樹脂中で固定する。厚い部分をミクロトームて切断し、ヤンセンライフサイ エンス社による“インデンス２″システムキツトで提供される説明書に従って硝 酸銀溶液を用いてその切片を着色する。更にその切片をエオシン及びヘマトキシ リンで着色する。

第１４Ａ図は、主として肝臓切片の写真であり、より小さい、不規則な形のクツ パー細胞、たとえば細胞２０を、より大きいもっと規則的な形の肝細胞、たとえ ば肝細胞２２の間に示す。クツパー細胞は、無傷のリポソームの大きい濃度を示 し、小さい、暗く着色されたかたまり、たとえば第１４Ａ図中の２４として示さ れる。肝細胞は、予想される様に全くリポソームを含まない。

第二実験で、Ｃ−２６結腸癌（約１０’細胞）を、マウス肝臓中に移植する。移 植後１４日で、動物に上記リポソーム０．５＋ｎｇを■注射する。２４時間後、 動物を殺害し、肝臓を潅流し、包埋し、切開し、上述の様に着色する。切片を毛 管−供給腫瘍域に関して調べる。１つの例となる域を、第１４Ｂ図中に示し、そ れは癌細胞、たとえば細胞２８の域に供給する毛管２６を示す。これらの細胞は 、特徴的に着色するパターンを有し、しばしば有糸分裂の種々の段階で暗く着色 された核を含む。図中の毛管は、内皮バリヤー３０、及び下記の様に基底膜３２ に浴って並ぶ。

リポソーム、たとえばリポソーム３４は、内皮バリヤー及び基底膜上の毛管に隣 接した腫瘍域中て濃密に濃縮され、多くのリポソームも、腫瘍細胞のまわりの細 胞間液体中に分散されることを、第１４８図中に示すことかできる。

第１４ｃ図は、上記動物から肝臓腫瘍の他の域を示す。リポソームは、癌細胞を 浸した細胞間液体中に見られる。

第三実験に於て、Ｃ２６癌細胞を、動物に皮下注射し、２８日間動物中で生長さ せる。その後、動物に上記リポソーム０．５＋ｎｇを■注射する。２４時間後、 動物を殺害し、腫瘍塊を切除する。包埋後、腫瘍塊をミクロトームで切開し、上 述の様に着色する。第１４図は腫瘍細胞の域を示し、育糸分裂の終りの段階であ る図中の中央に細胞３６を有する。小さい、暗く着色されたリポソームは、細胞 間液体中に見られる。

ＰＥＧ−ＰＥ、　ＰＧ、　ＰＨＥＰＣ及びコレステロール及びα−ＴＣをモル割 合０．３：０，３：１．４：１０．２で含有する小胞−形成脂質を、クロロホル ム中に溶解し、２５μｍｏｌ　リン脂質／ｍｌの最終脂質濃度となす。脂質混合 物を乾燥し、減圧下に薄いフィルムとなす。

フィルムを、１２５Ｍ硫酸アンモニウム溶液で水和し、ＭＬＶｓを形成する。Ｍ ＬＶ　９濁液を、ドライアイスアセトン浴中で凍結し、３回解凍し、造粒して８ ０−＋００ｎｍとなす。アンモニウムイオン勾配を例１０に記載した様に実質玉 虫じる。リポソームにエビルビシンを装填し、ドキソルビシンに関して例ＩＯに 記載した様に、遊離のもの（未結合薬剤）を除く。取り込まれた薬剤の最終濃度 は、約５０−１００μｇ薬剤／μｍｏｌ脂質である。エビルビシンＨＣＩ及びド キソルビシンＨＣＩ、市販生成物は、病院薬局から得られる。

約１０′細胞Ｃ−２６結腸癌細胞を、マウス３５匹を存する３つのグループに皮 下注射する。グループを５つの７匹−動物サブグループに分ける。第１５Ａ図中 に示めされた腫瘍懸濁液実験に関して、各サブグループに腫瘍細胞移植後１．８ 及び１５日目に生理食塩水媒体コントロール（白まる）、エビルビシン６ＭＧ／ ｋｇ　（白玉角）ドキソルビシン６ｍｇ／ｋｇ　（黒まる）又は２つの薬用量で 薬剤−積載されたリポソーム（ＰＥＧ−ＤＯＸリポソーム）　、６ＭＧ／ｋｇ　 （黒三角）及び１２ｍｇ／ｋｇ（白四角）のどれかを　０．５ｍ１■注射する。

各グループを２８日間継続する。腫瘍サイズを、各動物て５．７．１２゜１４、 １７．２１．２４及び２８日目で測定する。各時間点で、各サブグループ中の腫 瘍の生長（個々の動物の平均腫瘍サイズとして表わす）を、第１５Ａ図中にプロ ットする。

この図に関して、６ｍｇ／ｋｇ著しく抑制された腫瘍生長で遊離ドキソルビシン も遊離エビルビシンも、生理食塩水フントロールと比較しない。対照的に２つの 薬用量でエビルビシンを取り込んだＰＥＧリポソームは、著しく腫瘍生長を抑制 する。

腫瘍移植後１２０日で動物の生存に関して、生理食塩水、エビルビシン又はドキ ソルビシングループ中の動物は生き残らず、しかも７匹のうち５匹及び７匹のう ち７匹は、夫々６ｍｇ／ｋｇリポソームエピルビシングループ中で生存する。

同一の腫瘍モデルを用いて遅延処理実験の結果を、第１５Ｂ及び１５Ｃ図中に示 す。

同一数の動物に、上述の様に同一数の腫瘍細胞を接種する。第１５Ｂ及び１５Ｃ 図中の処理グループは、生理食塩水（実線）、エビルビシン６ＭＧ／ｋｇ　（黒 三角）、遊離エビルビシンプラスからのＰＥＧリポソーム６ｍｇ／ｋｇ　（白ま る）及びＰＥＧ　リポソーム中に取り込まれたエビルビシンの２つの薬用量、６ ｍｇ／ｋｇ　（黒三角）及び９ｍｇ／ｋｇ（白四角）から成る。第１５Ａ図中に 示した結果と対照的に、２つの処理しかこの実験で行わない　第１５Ｂ図中にプ ロットされた結果に関して３及び１０日回目：１５０図中にプロットされた結果 に介してｌＯ及び１７日目。更に重要なことは、薬剤を取り込んだＰＥＧリポソ ームの場合、２つの薬用量レベルで２つの遅延処理スケジュールは、腫瘍退化を 生じるが、遊離薬剤及び遊離薬剤プラスからのリポソーム処理グループは、腫瘍 生長の割合でおだやかな抑制しか示さない。

ＰＥＧ−ＤＯＸリポソームを、例１５と同様に製造するが、ドキソルビシンをリ ポソームに積載して、６０−８０μｇ／μｍｏｌ全脂質の最終レベルとなす。遊 離薬剤コントロールとして使用される。ドキソルビシンＨＣ１溶液は、病院薬局 で得られる。全部て３０匹マウスに、ＩＯ’Ｊ−６４５６リンパ腫細胞をＩＰ注 射する。動物を３つの１０匹動物グループに分け、夫々にドキソルビシン溶液１ ０ｍｇ／ｋｇ又はｌｏｍｇ／ｋｇてトキソルヒソンー装填されたリポソームのど ちらか０．４ｍｌを■注射する。各グループを、１００日間生き残る動物の数に 関して追跡する。各処理グループに対する生存率を、第１６図中にプロットする 。

明らかな様に、遊離薬剤（黒まる）は、生理食塩水グループ（黒四角）より生存 の点で僅かに有利である。しかしドキソルビノン積載ＰＥＧ−リポソーム（黒三 角形）で処理された動物に於て、４０日間生き残った動物約５０％、７０日間２ ０％、実験を１００日で終了するまで生き残ったもの１０％を示す。

即 ＰＥＧ−リポソームの減少された毒性 遊離ドキソルビシンＨＣＩ　、エビルビシンＨＣＩを有する溶液を、上述の様に して得る。薬剤濃度７０−９０μｇ化合物／μｍｏｌ　リポソーム脂質てドキソ ルビシン又はエビルビシンのとちらかを含有するＰＥＧ−リポソーム形成物を、 例１６中に記載した様に製造する。通常のリポソーム（ＰＥＧ−誘導された脂質 不含）に、ドキソルビシンを標準技術を用いて４０μｇ／μｍｏｌ脂質の薬剤濃 度で積載する。

５つの形成物夫々を、３５匹のマウスに５ｍｇ／ｋＧ増加量で、ＩＯと４０ｍｇ 薬剤／ｋｇ体重の間の薬用量で、投与し各薬用量に対して５匹をあてる。投与す る下記表ＩＩ中に示した最大許容薬用量は、１４日以内に注射された動物中で死 又は劇的な体重損失を生しない最高薬用量である。データから明らかな様に、Ｄ ＯＸ−リポソームもＰＥＧ−ＤＯＸリポソームも遊離形での薬剤のドキソルビシ ンの許容薬用量の２倍以上であり、一方ＰＥＧ−ＤＯＸリポソームは、少し高い 許容薬用量を示す。同様な結果か、許容エビルビシンの薬用量に関して遊離及び ＰＥＧ−リポソーム形で得られる。

表１Ｉ ＤＸＮの最大許容薬用量（マウス中ｍｇ／ｋｇ）ＤＸＮ　１Ｏ−１２ ＤＯＸ−Ｌｉｐ　２５−３０ ＰＥＧ−ＤＸＮ−Ｌｉｐ　２５−３５ ＥＰ［１０ ＰＥＧ−ＥＰＩ　２０ 通常のドキソルビシンリポソーム（Ｌ−ＤＯＸ）を、公知方法に従って製造する 。簡単にモル割合０．３・１．４：１：０．２で卵ＰＧ、卵、ＰＣ、コレステロ ール及びα−ＴＣを存する混合物をクロロホルム中で製造する。溶剤を、減圧下 に除き、乾燥脂質フィルムを２−５ｍｇ　ドキソルビシンＥｌを含有するＮａＣ ｌ＋５５ｍＭの溶液と共に加熱する。

生しるＭＬＶ調製物を一連のポリカーホナート膜を通して小型化し、約２５０ｎ ｍの最終サイズとなす。遊離の（取り込まれていない）薬剤を懸濁液のトヴー樹 脂の床上の通過によって除く。最終ドキソルビシン濃度は、脂質μｍｏｌにつき 約４０である。

マウス７匹の３つのグループに、例１５に詳述した様に１０’−１０’Ｃ−２６ 結腸癌細胞を皮下接種する。動物を３つの７匹動物処理グループに分け、グルー プのｊつはコントロールとして生理食塩水媒体０．５ｍｌを与える。他の２つの グループに、ドキソルビシンを遊離薬剤溶液として又はＬ−ＤＯＸリポソームの 形で薬用１１０ｍｇ／ｋｇで処理する。処理を、腫瘍細胞接種後、８，１５及び ２２日目に行う。腫瘍サイズを処理した日及び２８日目に測定する。第１７図か ら明らかな様に、遊離薬剤（黒まる）は腫瘍生長を生理食塩水コントロール（実 線）に比して穏やかな程度で抑制する。Ｌ−Ｄｏｘ−処理されたグループ（黒三 角）中の腫瘍は、遊離−薬剤−処理グループに比して僅かに速く、かつ未処理グ ループ中のものよりもほんの少し遅く生長する。この結果は、Ｌ−ＤＯＸ調製物 の抗−腫瘍活性が遊離薬剤とほぼ同一であり、確かに遊離薬剤の同一薬用量より も良好でないことを示す。これはＰＥＧ−リポソーム中に同等の薬用量で取り込 まれたエビルビシンが、この同一腫瘍モデル中で遊離薬剤よりも極めて良好な抗 −腫瘍活性を有することを示す例１５（及び第１５Ａ−Ｃ図）に示した結果と著 しく対照的である。

本発明は、特に誘導された膠質組成物、リポソーム組成物、及びその使用に関し て記載し、かつ描写か、種々の変更及び変化を本発明から離れることなく行って よいことは明白である。

Ｆｉｇ、５Ａ ＨＯ−（ＣＩ！２−Ｃ！Ｉ、−０層ＣＩ！、−Ｃ１ｌ！２−５−５−Ｃ五、−Ｃ Ｉ！、−Ｈ−Ｐ、！。

Ｆｉｇ、５Ｃ Ｈ３ Ｉｒ３Ｆ Ｆｉｇ、４ 又１よブリコール隙ポリマーに間マるＨｎ＝Ｉｏ−５０ 時間　（１−ＩＲ） 時間（ＨＲＩ Ｆｉｇ、８ 時間（ＨＲＩ ｊ１射後の時間 Ｆｉ　、ＩＩ Ｆｉｇ、１２Ａ　注射後の時閉 Ｆｉｇ、　１２Ｂ　ｊ主身寸了支の時間Ｆｉｇ、　１３　ン主身寸イ支の時間 Ｆｉｇ、１４Ａ Ｆｉｇ、１４Ｂ Ｆｉｇ、１４ｃ Ｆｉｇ、１４Ｄ 国際調査報告 ｌｌｌｌ−鱈Ｉ−＾−１Ｃ１槽１・　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６２１１ｍ＋−１ １１＋＋１１１１１喝＾１１・４＋−１−（１１ぽ、、ＰＣＴ／Ｕｓ９０１０６ ２１１国際調査報告　。５．。。６，１、 Ｓ＾　４２７１５

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．血流を介して充実性腫瘍に化合物を局在化するのに使用するリポソーム組成 物に於て、（ｉ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞− 形成脂質１−２０モルパーセントから成り、かつ（ｉｉ）選択された平均粒子直 径を約０．０７−０．１２ミクロンのサイズ範囲内に有するリポソーム、並びに 上記化合物をリポソームー取り込まれる形で含有する、上記リポソーム組成物。
2. ２．親水性ポリマーは、分子量約１，０００−５，０００ダルトンを有するポリ エチレングリコールである、請求の範囲１記載の組成物。
3. ３．親水性ポリマーは、ポリ乳酸及びポリグリコール酸より成る群から選ばれる 、請求の範囲２記載の組成物。
4. ４．化合物は抗−腫瘍剤であり、化合物の少なくとも約８０％は、リポソームー 取り込まれる形である、請求の範囲１記載の組成物。
5. ５．抗−腫瘍剤はアントラサイクリン抗生物質であり、リポソーム中に取り込ま れる化合物の濃度は、５０μｇ化合物／μモルリポソーム脂質よりも大きい、請 求の範囲４記載の組成物。
6. ６．アントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、及びダウノルジシ ン並びにその薬学的に妥当な塩及びその酸より成る群から選ばれる、請求の範囲 ４記載の組成物。
7. ７．血流を介して充実性腫瘍にアントラサイクリン抗−腫瘍薬剤を局在化するの に使用するリポソーム組成物に於て、（ｊ）小胞−形成脂質及びポリエチレング リコールで誘導された両極性小胞−形成脂質１−２０モルパーセントから成り、 かつ（ｉｉ）選択された平均粒子直径を約０．０７−０．１２ミクロンのサイズ 範囲内に有するリポソーム並びに少なくとも約８０％がリポソームー取り込まれ る形であり、かつリポソーム中のその濃度が５０μｇ剤／μｍｌｏリポソーム脂 質よりも大きい薬剤を含有する、上記リポソーム組成物。
8. ８．薬剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、及びダウノルジシン並びにその薬 学的に妥当な塩及びその酸より成る群から選ばれる、請求の範囲７記載の組成物 。
9. ９．剤のＩＶ投与によって充実性腫瘍中に化合物を局在化するのに使用するリポ ソーム組成物に於て、 （ａ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成脂質１ −２０モルパーセントから成るリポソーム、（ｂ）誘導された脂質の不在下のリ ポソームのパーセントより数倍大きい静脈内投与後２４時間で血液中に存在する リポソームマーカーのパーセントによって測定される血液寿命、 （ｃ）約０．０７−０．１２ミクロンの選択されたサイズ範囲内の平均リポソー ムサイズ、及び （ｄ）リポソームー取り込まれる形の化合物によって特徴づけられる、上記リポ ソーム組成物。
10. １０．親水性ポリマーは、約１，０００−５，０００ダルトンの分子量を有する ポリエチレングリコールである、請求の範囲９記載の組成物。
11. １１．化合物はアントラサイクリン抗生物質であり、リポソーム中に取り込まれ る化合物の濃度は、約５０μｇ化合物／μｍｏｌリポソーム脂質よりも大きい、 腫瘍を処置するのに使用する請求の範囲９記載の組成物。
12. １２．アントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、及びダウノルジ シン並びにその薬学的に妥当な塩及びその酸より成る群から選ばれる、請求の範 囲１１記載の組成物。
13. １３．アントラサイクリン抗生物質薬剤の静脈内投与によって充実性腫瘍を処置 するのに使用するリポソーム組成物に於て、（ａ）小胞−形成脂質及びポリエチ レングリコールで誘導された両極性小胞−形成脂質１−２０モルパーセントから 成るリポソーム、（ｂ）誘導された脂質の不在下のリポソームのパーセントより 数倍大きい静脈内投与後２４時間で血液中に存在するリポソームマーカーのパー セントによって測定される血液寿命、 （ｃ）約０．０７−０．１２ミクロンの選択されたサイズ範囲内の平均リポソー ムサイズ、及び （ｄ）リポソームー取り込まれる形の薬剤少なくとも約８０％、及び（ｅ）リポ ソーム中の薬剤濃度少なくとも約５０μｇ薬剤／μｍｏｌ脂質によって特徴ずけ られる、上記ポリソーム組成物。
14. １４．（ａ）親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成脂質１−２０モルパ ーセントを有する組成物、及び （ｂ）約０．０７−０．１２ミクロンの選択されたサイズ範囲の平均リポソーム サイズによって特徴すけられるリポソーム中に剤を取り込まれることから成る、 剤がＩＶ注射によって投与される時に、充実性腫瘍中に局在化する剤を製造する 方法。
15. １５．剤はアントラサイクリン抗生物質薬剤であり、取り込まれは、前もって形 成されたリポソームにイオン又はＰＨ勾配を越えてはるかに離れた積載による積 載を含み、リポソームー取り込まれる材料の最終濃度は約５０μｇ剤／μｍｏｌ リポソーム脂質よりも大きくなる、請求の範囲１４記載の方法。
16. １６．薬剤は、ドキソルビシン、エピルビシン、及びダウノルジシン並びにその 薬学的に妥当な塩及びその酸より成る群から選ばれる、請求の範囲１５記載の組 成物。
17. １７．（ｉ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成 脂質１−２０モルパーセントから成り、かつ（ｉｉ）選択された平均粒子直径を 約０．０７−０．１２ミクロンのサイズ範囲内に有し、かつ（ｉｉｉ）化合物を リポソームー取り込まれる形で含有するリポソーム組成物を製造し、次いで充実 性腫瘍中に治療に有効な量の剤を局在化するのに有効な量で患者に組成物を静脈 内注射することから成る、患者の充実性腫瘍に化合物を局在化する方法。
18. １８．親水性ポリマーは、約１，０００−５，０００ダルトンの分子量を有する ポリエチレングリコールである、請求の範囲１７記載の組成物。
19. １９．（ｉ）小胞−形成脂質及び親水性ポリマーで誘導された両極性小胞−形成 脂質１−２０モルパーセントから成り、かつ（ｉｉｉ）選択された平均粒子直径 を約０．０７−０．１２ミクロンのサイズ範囲内に有し、かつ（ｉｉｉ）リポソ ーム中に取り込まれるアントラサイクリン抗生物質薬剤を、リポソーム脂質約５ ０μｇ剤／μｍｏｌよりも大きい取り込まれる剤の濃度で含有する、少なくとも ８０％のリポソーム中に取り込まれる剤含有リポソームの組成物を製造し、治療 上有効な量の剤を局在化するのに有効な量で患者に静脈内注射することから成る 、充実性腫瘍を有する患者を治療する方法。
20. ２０．親水性ポリマーは、約１，０００−５，０００ダルトンの分子量を有する ポリエチレングリコールであり、剤はドキソルビシン、エピルビシン、及びダウ ノルジシン並びにその薬学的に妥当な塩及びその酸より成る群から選はれる、請 求の範囲１９記載の方法。