JPH0213375A - ヒトｂ細胞分化因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） Ｂ細胞分化因子（以下、ＢＳＦ−２と略称する）は、Ｔ
リンパ球代替因子、ＴＲＦとしてマウスのリンパ球混合
物培養後の培養上清又は、抗原やマイトゲンにより刺激
を受けたマウスのリンパ球上滑中に、マウスのＴ細胞を
除去されたリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリン
パ球のヒツジ赤血球に対する一次免疫応答を増幅させる
物質として見出された。それ以来、ＴＲＦは抗原非特異
的に主要組織適合遺伝子複合体　（以下、ＭＨＣと略称
する。）の一致を必要としない様式で、Ｂ細胞に作用し
、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞
への分化を誘導する液性因子であると定義されている。

現在では、上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細
胞へ分化させる因子をＢＳＦ−２と称するようになった
。このようなり５Ｆ−２は、人の体内でＢ細胞の抗体産
生機能に重要な働きをしている。

ＢＳＦ−２の臨床への応用としては、１）Ｂ　Ｓ　Ｆ−
２によりＢＳＦ−２抗体を作り、ＢＳＰ−２と抗ＢＳＦ
−２抗体によるＢＳＦ−２のイムノアッセイ系を用いて
免疫学的な病態の解析に用いる、２）各種疾患の治療へ
の応用で、例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともな
うＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＳＦ
−２単独または、他のリンホカインと共に投与すること
により、抗体産生機能を正常にらどす、３）Ｂ細胞増殖
因子、その他のリンホカインを含むＴ細胞因子を培地に
加えることにより正常Ｂ細胞あるいは、ＥＢウィルスで
形質転換したＢ細胞に対し適当な時期にＢＳｌ”−２を
作用させることにより、生体外で抗体を産生させる等が
考えられる。さらに、特定の抗体、例えば、病原細菌、
病原ウィルス、病原原虫、癌細胞などの表面にある特定
抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細胞をモノクロナール
化し、クローン化正常Ｂ細胞または、ＥＢウィルスで形
質転換した細胞をＢＳＦ−２とその他のリンホカインを
組み合わせて培養し、有用なモノクロナール抗体を産生
させることが出来る。これらの抗体は感染症や癌の治療
および、診断に利用できる。

本発明は、このＢＳＦ−２の製造方法に関するものであ
る。

（従来の技術） ＢＳＦ−２を得る方法としては、人末梢血などより分離
した正常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＳ
Ｆ−２を産生させる方法、人Ｔ細胞を人癌と細胞融合し
て人Ｔ融合細胞を得、これによりＢＳＦ−２を産生させ
る方法、さらにＢＳＰ−２をコードするＤＮＡを大腸菌
で発現せしめる方法として、トリプトファンプロモータ
ー支配下にＢＳＦ−２を直接発現する方法と、ヒトＩＬ
−２の部分Ｎ末端ペプチドとの融合蛋白として発現する
方法が知られている。

本発明者は、以上のような状況に鑑み、ＢＳＦ−２をヒ
ト成長ホルモンと融合した形で製造する方法を完成させ
た。すなわち、本発明は構造遺伝子の発現を調節する制
御遺伝子の下流にリボゾーム結合部位、およびヒト成長
ホルモンＡドメインおよび、ヒト成長ホルモンＢドメイ
ンをコードする遺伝子、ＢＳＦ−２をコードする遺伝子
、終止コドンを含んだプラスミドで形質転換させた大腸
菌を培養し、発現したヒト成長ホルモンＡドメイン、ヒ
ト成長ホルモンＢドメイン、ＢＳＦ−２の融合蛋白を酵
素で処理してＢＳＦ−２を得ることを特徴とするＢＳＦ
−２の製造法に関するものである。以下、さらに本発明
の詳細な説明する。

（発明の構成） ｒ　ＢＳＦ−２遺伝子セグメントとその調製」即ち、本
発明は第一に、式 ％式％ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＧＡＣＣＣＡ　ＡＣＣＡ
ＣＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧＣ
ＴＧ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＣＧＧ　ＴＣ
Ｇ　ＧＡＣＧＡＣＴＧＣＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ
ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＣＣＡ
Ｇ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧＴＴＣＧＡＧ　ＧＴＣＣＧ
Ｔ　ＧＴＣＴＴＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＡＣＧＴＣＡｓｐ　
Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　５ｅｒＧＡＣＡＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　
ＣＡＴ　ＣＴＣＡＴＴ　ＣＴＴ　ＣＧＣＡＧＣＣＴＧ　
ＴＡＣＴＧＴ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＧＣＧ　ＴＣＧＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＴＴ
Ｔ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＡ
ＧＣＣＴＧ　ＡＧＧＡＡＡ　ＴＴＣＣＴＣＡＡＧ　ＧＡ
ＣＧＴＣＡＧＧ　ＴＣＧ　ＧＡＣＴＣＣＡｌａ　Ｌｅｕ
　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ＭｅｔＧＣＴ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　Ｃ
ＡＡ　ＡＴＧＣＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＴＴ　ＴＡＣ−
−−−一−−（１）で表される塩基配列からなるＢＳＦ
−２遺伝子セグメント［以下式（１）という、式中Ａは
デオキシアデニル酸の、Ｃはデオキシシチジル酸の、Ｇ
はデオキシグアニル酸の、Ｔはデオキシチミジル酸の各
残基を表しく以下同じ）、塩基配列上のアミノ酸略号は
この塩基配列によりコードされているアミノ酸配列を示
すコを提供するものである。

このＢＳＦ−２遺伝子セグメントは好ましくは、その上
流末端に、式 ％式％ （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏ　Ａｒｇで表されるアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列を、またその下流に停止
コドンを含み、さらに、その下流に制限酵素開裂末端で
終わる、式 ％式％ で表されるＤＮＡ配列をもつものを提供するものである
。

上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ−とじては、
式 ％式％ で表される配列を例示することかできる。

下流側に付加される、停止コドンを含み、さらにその下
流に制限酵素開裂末端で終わるＤＮＡ配列のＹ及びＹ゛
とじては制限酵素ＢａｍＨＩ　　の開裂末端の配列、式 ％式％ で表される配列を含むものを例示することができる。

上記（２）式では上流末端がＢａｍＨＩ　の末端で終イ
つっている。（１）の上流側に付加される、式％式％ で表されるＤＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチドは、以
下に述べる様な方法で調製することができる。

まずこれらのオリゴヌクレオチドの各−本鎖部分を合成
し、水素結合させればよい。この場合、リガーゼを用い
てオリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡ断片を結合
させる際には、あらかじめこれらの５゛側の反応ににあ
ずかる成分の５″末端はリン酸化させておく。リン酸化
は慣用の手法および条件で行うことができる。

得られたＢＳＦ−２遺伝子セグメントは適当なプラスミ
ド中へ挿入して大腸菌等に形質転換し、薬剤感受性など
の指標と、ラピッドアイソレーション等の手法を用いて
クロン化し増幅することができる。

「プラスミド及びその調製」 本発明の第二は、ＢＳＦ−２遺伝子セグメントを含む組
み換えプラスミドを提供するものである。

即ち、式（１）で表される塩基配列のＢＳＦ−２遺伝子
セグメントを含み、微生物中で自己増殖可能な組み換え
プラスミドを提供するものである。そして好ましくは、
ＢＳＦ−２遺伝子の上流にこの遺伝子を発現可能に支配
するプロモーター・オペレーター系を含み、そのプロモ
ーター・オペレーターの上流とＢＳＰ−２遺伝子の下流
との間に、プラスミドを自己増殖可能とする部分を含む
ものである。プロモーター・オペレーター系としては、
従来、トリプトファンプロモーター／オペレーター系、
ラクトースプロモーター／オペレーター系、あるいは、
トリプトファンプロモーター／ラクトースオペレーター
系を用いればよい。本発明の組み換えプラスミドは、Ｂ
ＳＦ−２遺伝子セグメントを慣用の方法で適当なベクタ
ープラスミドに組み込むことにより調製することができ
る。特に、その上流及び、下流に制限酵素開裂末端を持
っＢＳＦ−２遺伝子セグメントは、その様なプラスミド
の相当する開裂部位、例えば、ＢｇｌＩＩ　等の部位へ
容易に組み込むことができる。

本発明の組み換えプラスミドは大腸菌などの微生物に形
質転換して、本発明のヒトＢＳＦ−２遺伝子の産物を融
合蛋白質の形で産生させることができる。例えば、ＢＳ
Ｐ−２遺伝子セグメントで、上流に式（２）で表される
末端を持つものは、プラスミドの発現され得る蛋白質を
コードするＤＮＡ配列中に制限酵素ＢｇｌＩＩ　の部位
を持つ乙の、Ｂｇｌｌｌの部位へに読取位相の一致する
様に組み入れることによって、その蛋白質のＮ末端側の
一部とアミノ酸配列　Ｐｒｏ　Ａｒｇを介して連結され
た、ＢＳＦ−２蛋白質との融合蛋白を産生させることの
できるプラスミドを構築することができる。この様な蛋
白質としてはヒト成長ホルモンを例示することができ、
Ｂｇ１１１部位を含むＤＮＡ配列としては、特開昭６０
−２３４５８４号明細書中で開示されているｐ（Ｊ−Ｌ
ンリーズのプラスミドを例示することができる。

こうして構築される組み換えプラスミドのプロモーター
・オペレーター系のメツセンジャーＲＮＡ転写開始点よ
りＢＳＦ−２遺伝子までのＤＮＡ配列か、式 ％式％ （Ｘ及びＸ″は前記同様の意味を表す）であるものが特
に好ましい。この様な配列を持つプラスミドは、例えば
、ｐＧＨ−Ｌ９プラスミドをＢｇｌｌｌ消化したものに
ＢＳＦ−２遺伝子セグメントで上流側に式（２）で表さ
れる末端配列をもち、下流側に式（３）で表される末端
配列をもつものを接着閉環させることによって調製でき
る。第（１）図にこの調製を示した。この様にしてプラ
スミドｐＧＢｓ４調製することができる。なお、プラス
ミドｐＧＨ−Ｌ９を持つＥ、コリ菌株、Ｅ、ｃｏｌｉ　
ｐＧｆｌ−Ｌ９は通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に、微工研菌寄第７６０６号として寄託されてい
る。

「形質転換体」 本発明の組み換えプラスミドｐＧＢＳ４でＥ、　ｃｏｌ
ｉ株、例えば、Ｒ８７９１株等を形質転換し、これを栄
養培地中で培養することによってＢＳＦ−２遺伝子を効
率よく増幅することができる。また、本発明のｌ３ＳＦ
−２遺伝子の上流にその発現を支配するプロモーター・
オペレーター系、特にトリプトファン・プロモーター・
オペレーター系を持つものは、ＢＳＦ−２をヒト成長ホ
ルモンのＮ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現し、
菌体内に蓄積する。

この場合（トリプトファン・プロモーター・オペレータ
ー系のとき）ＢＳＦ−２の産生（ｍＲＮＡ合成）はイン
ドールアクリル酸の添加によって強く誘導される。

菌体内に蓄積されたＢＳＦ−２及びヒト成長ホルモンと
の融合蛋白質は菌体を溶菌させたのち、通常の生理活性
蛋白質回収法によって分離回収することができる。例え
ば培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、トリス−
塩酸緩衝液に！！！濁し、破砕後、尿素等の処理をして
得られる上清液をゲルろ過等により目的の蛋白質分画を
うる。

本発明の微生物によるヒト成長ホルモンとの融合蛋白質
はその融合部位にトロンビンの認識部位（Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ）を有し、この酵素で処理することによってＮ末端側
から三個のアミノ酸残基Ａｌａの付加したＢＳＦ−２と
することかできる。

実施例１ （オリゴヌクレオチドの調製） （１）　”　ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴ
ＣＣＧＣＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧ’。

（２）５°ＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＧ
ＣＧＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＧＡＴＧＡＧ”の調製 操作 上記のオリゴヌクレオチド（１）、（２）をＤＮＡシン
セサイザーｍ　ｏ　ｄ　ｅ　ｌ　−３８１Ａ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて合成した。合
成終了後、カラム中の担体に吸着したオリゴヌクレオチ
ドをアンモニア水１ｍｌで一時間処理し溶出した。スク
リューバイアル付きの容器にこのアンモニア溶液を入れ
５５℃で一夜反応させた。減圧下で溶媒を留去し、残さ
を蒸留水５００μｍに溶解し、三度ジエチルエーテル５
００μｌで不要物を抽出後、再び溶媒を減圧留去した。

残さを１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７，５）／
１ｍエチレンジアミンテトラアセテート２００μｌに溶
解し、アニ−リング２６０ｎｍで吸光度を測定し濃度検
定を行い、各々ＩＯｐｍｏｌ／μｌの溶液を調製した。

合成により得られた上述のオリゴヌクレオチド（１）、
（２）を用いて次の条件で反応を行い、合成フラグメン
トを得た。

合成オリゴヌクレオチド（ｌｏｐｍｏｌ）　　５μＱ５
×カイネーシヨン緩衝液　　　　１０μぐ０．０１Ｍ　
ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　５ｕＱＴ４ポリヌク
レオチドカイネース　　２μＱ（宝酒造社製、ＩＯＵ／
μｌ） カイネーション緩衝液の組成は、５０ｍＭ）リス塩酸緩
衝溶液（ｐＨ９，６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２
ｍＭスペルミジン、１０ｍＭジチオスレトール、１００
ｍＭ塩化カリウムで、３７”Ｃ２０分間インキュベート
した。インキュベート後、合成オリゴヌクレオチド（１
）、（２）溶液を混合し６５℃１０分間反応させ、それ
からゆっくり室温まで冷却しアニーリングを行った。こ
の操作により、５ｐｍｏｌ／μｍの濃度の合成フラグメ
ントを得た。

実施例２ （組換プラスミド及び形質転換株の調製）本発明の組換
プラスミドは融合蛋白質発現型であり、以下実施例で詳
細に述べる。

既知のプラスミドｐＢＳＦ２．３８を制限酵素Ａｌｕｌ
及びＢａｍＨＩで消化して約１０００塩基対のＡｌｕｌ
−ＢａｍＨＩ断片を取り出した。

一方、公知のプラスミドｐＧＥＭ４をＳｍａｌ及びＢａ
ｍＨＩで消化して開裂させた。切り出したＡ　Ｉ　ｕ　
Ｉ−ＢａｍＦ−１１断片をＴ、ＤＮＡリガーゼの存在下
でｐＧＥＭ４のＳｍａｌ、ＢａｒｎＨＩ切断部に挿入し
、プラスミドｐＢＳＦ２．３８−１を調製した。続いて
該プラスミドをＥｃｏＲＩＩ及びＢａｍＨＩで消化して
、約１０００塩基対の翻訳開始コドンを取り除いたＥｃ
ｏＲｎ　　ＢａｍＩＩ断片を得た。この断片をＡとする
。

次に翻訳開始コドンを含んだ式、 ５°ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧ＾＾ＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣ
ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＧ　”ＧＡＧＴＡＧＣＴＴ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣ人人ＧＧＣＧ
ＧＴＣＣで表されるオリゴヌクレオチドを合成した。こ
のオリゴヌクレオチドをＢとする。上記オリゴヌクレオ
チドは５−末端がＢａｍＨＩ構造、３′末端がＥ　ｃ　
ｏ　Ｒｎ構造を有し、Ｐｒｏ、Ａｒｇで表されるトロン
ビンの消化認識アミノ酸配列および、Ａｌａ　　Ｐｒｏ
　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏで表されるアミノ酸配
列をコードする。

（融合発現型　ｐＧＢＳ−４） プラスミドｐＧＨ−Ｌ、９　　（Ｅ、コリ　ｐＧＨ−Ｌ
９、微工研菌寄第７６０６号）３０μｇを１００ユニツ
トのＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）と３７℃、３時間反応さ
せた。反応液ｆｆ１ｌＯＯμｌで組成は、１０ｍＭ）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ　　２−メルカ
プトエタノール、ｌＯＯμｇ／ｍｌ牛血清アルブミンで
あった。エタノールにて沈澱させＤＮＡを回収後、１０
０μｍのトリス−塩酸緩衝溶液に溶解し、０．９ユニツ
トのアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）で６５℃
、３０分反応させ、５゛末端のリン酸基を除去した。さ
らに、フェノール処理、クロロフォルム処理を行い、エ
タノールにて沈澱させＤＮＡを回収し、ベクターＤＮＡ
ｐＧＨ−Ｌ９／Ｂｇ　ｌ　Ｉｆを得た。得られたベクタ
ーＤＮＡｐＧＨ−Ｌ９／ＢｇｌＩＩ　（０，５μｇ／ｍ
１）１μｌと断片Ａ（０５μｇ／ｍ１）１μｌとオリゴ
ヌクレオチドＢ（０，１ｇｇ／ｍ１）１μｌを混合しラ
イゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃３０
分反応させた。この反応溶液１０μｌを大腸菌に形質転
換し、形質転換株Ｅ、コリ／ｐＧＢＳ−４を得た（図１
）。

実施例３ （発現） 実施例１で得られたＥ、コリ／　ｐ　Ｃ，Ｂ　Ｓ　−４
をＬＢ培培地５ｍ社て３７℃−晩培養した。得られた培
養液５０μｌをＬ培地５ｍｌに加え培養し、アブソーバ
ンス６００　ｎｍで吸光度０．４〜０゜５となった時点
で、インドールアクリル酸（１０ｍｇ／ｍ１）５０μｌ
を加えさらに４時間培養した。培養終了後、遠心分離機
で１０．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心し菌体を集めた。

その一部をサンプルバッファー（６２，５ｍＭ　　）リ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）、２％ＳＤＳ、５ｍＭエ
チレンデアミンチトラアセテート、１０％グリセロ、　
　−ル、３５ｍＭ２−メルカプトエタノール、０゜００
１％ブロモフェノールブルー）に懸濁、沸騰水中で５分
間加熱した後、Ｑ、１％５ＤＳ−１２゜５％ＰＡＧＥで
電気泳動を行い、分子３３．６ｘ１０４のものが得られ
た。

実施例４ （トロンビンによる融合蛋白質からのＢＳＦ−２の切断
） ３ｇのＬＢＢ地中、Ｅ、コリ／　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｓ　−４
をインドールアクリル酸で誘導し１０時間培養後、集菌
し、約１５ｇ（湿重量）の菌体を得た。得られた菌体を
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８。

０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心し沈澱を得た。

得られた沈澱を５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９，０）に懸濁し、さらに尿素の最終濃度が
８ＭとなるようにＲ衝溶液を調製した。６０℃で１時間
加温し、ＩＭの尿素を含んだ透析液（１Ｍ尿素、５０ｍ
Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）、
２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型グルタチ
オン、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート）で１
２時間透析後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）、１Ｍ尿素で６時間透析した。透析内液を遠心し、
上滑を最終濃度１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化
カルシウム、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）になるように調製した。

この溶液に、トロンビン（ベーリンガーマンハイム山）
自社製）を蛋白質５０ｍｇあたり２ユニット加え、３７
℃１０時間反応させた。反応液を遠心後、その上清をＤ
ｉａｆｌｏ　　ＹＭ−１０（Ａｍ　ｉ　ｃ　ｏ　ｎ社製
）を用いて約１０倍濃縮し、最終的に５０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）、５０ｍＭジチオスレトール
、６Ｍグアニジン塩酸塩を調製した。この溶液をＴＳＫ
　　Ｇｅｔ　　Ｇ３ｏｏｏｓｗ　　カラム（２５ｍｍＸ
　６００　ｍｍ）にかけ、Ｂ細胞分化因子溶出画分を１
Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ８゜０）、１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート
、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型グルタ
チオン、続いて１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
５）で透析した。この透析液をＴＳＫＧｅｌ　　ＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷ　　カラム（２５ｍｍｘ　２００　ｍｍ）に
かけ、０から０．８Ｍの塩化ナトリウム溶液による直線
塩濃度勾配法により溶出した。溶出フラクションをアク
リルアミド電気泳動に付し、Ｂ細胞分化因子と推定され
る分子量２１．０００の画分を得た（図２）。

（発明の効果） 本発明の組換プラスミド（発現型）はＢＳＦ−２遺伝子
セグメントを効率よく増幅し、これによって形質転換さ
れた微生物に、ＢＳＰ−２蛋白質をヒト成長ホルモンと
の融合蛋白質の形での産生能を与えることができる。　
また、本発明のＢＳＦ−２融合蛋白質はトロンビンで処
理することにより、Ｎ末端側から一個のアミノ酸残基Ａ
ｌａの付加したＢＳＦ−２とすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヒ）ＢＳＦ−２融合発現型プラスミド
の調製を説明する図であり、第３図はＢＳＦ−２融合蛋
白質をトロンビンで処理後、精製して得られたＢＳＦ−
２蛋白質のアクリルアミド電気泳動パターンを説明する
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
   伝子セグメント。 （２）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、その下流側末端
   に停止コドンを含み、さらにその下流に制限酵素開裂末
   端で終わる、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
   開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
   、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
   ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１項記載のヒトＢ
   細胞分化因子遺伝子セグメント。 （３）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、
   式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列である特許請求の範囲第２項記載のヒト
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメント。 （４）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が停
   止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である特
   許請求の範囲第２項記載のヒトＢ細胞分化因子遺伝子セ
   グメント。（５）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及
   びＹ′の制限酵素開裂末端が、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列を含む特許請求の範囲第２項記載のヒト
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメント。 （６） 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
   伝子セグメントの製造法。 （７）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、その下流側末端
   に停止コドンを含み、さらにその下流に制限酵素開裂末
   端で終わる、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
   開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
   、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
   ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第６項記載のヒトＢ
   細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （８）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、
   式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列である特許請求の範囲第７項記載のヒト
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （９）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が停
   止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である特
   許請求の範囲第７項記載のヒトＢ細胞分化因子遺伝子セ
   グメントの製造法。 （１０）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
   制限酵素開裂末端が、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列を含む特許請求の範囲第７項記載のヒト
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントの製造法。 （１１） 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列からなる、ヒトＢ細胞分化因子遺
   伝子セグメントを含み、微生物中で自己増殖可能な組換
   プラスミド。 （１２）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、その下流側末端
   に停止コドンを含み、さらにその下流に制限酵素開裂末
   端で終わる、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
   開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
   、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
   ＤＮＡ配列を有するヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメン
   ト含むものである特許請求の範囲第１１項記載の組換プ
   ラスミド。 （１３）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
   、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
   ントを含むものである特許請求の範囲第１２項記載の組
   換プラスミド。 （１４）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
   停止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントを含むものである特許
   請求の範囲第１２項記載の組換プラスミド。 （１５）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
   制限酵素開裂末端が、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列を含むヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
   ントを含むものである特許請求の範囲第１２項記載の組
   換プラスミド。 （１６）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
   ーＲＮＡ転写開始点よりヒトＢ細胞分化因子遺伝子まで
   のＤＮＡ配列が、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表される配列である組換プラスミド。 （１７）式 【遺伝子配列があります】 で表される配列のヒトＢ細胞分化因子遺伝子を含み、微
   生物中で自己増殖可能な組換プラスミドを微生物中に保
   有するエシャリシャ属に属する微生物。 （１８）組換プラスミドのヒトＢ細胞分化因子遺伝子の
   上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、その下流側末端
   に停止コドンを含み、さらにその下流に制限酵素開裂末
   端で終わる、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
   開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
   、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
   ＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１７項記載の微生
   物。 （１９）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
   、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列であるヒト細胞分化因子遺伝子を含む組
   換プラスミドを保有する特許請求の範囲第１８項記載の
   微生物。 （２０）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
   停止コドンの第二、第三の塩基配列を含む組換プラスミ
   ドを保有するものである特許請求の範囲第１８項記載の
   微生物。 （２１）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
   制限酵素開裂末端が、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
   ントを含む組換プラスミドを保有する特許請求の範囲第
   １８項記載の微生物。 （２２）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
   ーＲＮＡ転写開始点よりヒトＢ細胞分化因子遺伝子まで
   のＤＮＡ配列が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表される配列である組換プラスミドを保有する
   微生物。 （２３）式 【遺伝子配列があります】 で表されるＤＮＡ配列のヒトＢ細胞分化因子遺伝子を含
   み、微生物中で自己増殖可能でかつヒトＢ細胞分化因子
   を発現することのできる組換プラスミドを細胞中に保有
   する、エシャリシャ属に属する微生物を栄養培地に培養
   して、ヒトＢ細胞分化因子蛋白を蓄積させてこれを採取
   し、必要に応じてトロンビンで消化することを特徴とす
   るヒトＢ細胞分化因子の製造法。 （２４）ヒトＢ細胞分化因子遺伝子の上流側末端に、式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＰｒｏＡｒｇで表されるアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
   示す）で表されるＤＮＡ配列を、また、その下流側末端
   に停止コドンを含み、さらにその下流に制限酵素開裂末
   端で終わる、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
   開裂末端の３′末端までを表し、Ｙ′はＹの相補配列で
   、制限酵素開裂末端の５′末端までを表す）で表される
   ＤＮＡ配列からなるプラスミドを保有する微生物を用い
   る特許請求の範囲第２３項記載の製造法。 （２５）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
   、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列であるヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
   ントを含む組換プラスミドを保有する微生物を用いる特
   許請求の範囲第２４項記載の製造法。 （２６）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
   停止コドンの第二、第三の塩基配列を含んだ配列である
   Ｂ細胞分化因子遺伝子セグメントを含む組換プラスミド
   を保有する微生物を用いる特許請求の範囲第２４項記載
   の製造法。 （２７）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′の
   制限酵素開裂末端が、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される配列を含むヒトＢ細胞分化因子遺伝子セグメ
   ントを含む組換プラスミドを保有する微生物を用いる特
   許請求の範囲第２４項記載の製造法。 （２８）ヒト成長ホルモンのＮ末端側の一部とＮ末端よ
   りＰｒｏＡｒｇで表されるＤＮＡの塩基配列を介して融
   合された蛋白質の形でヒトＢ細胞分化因子を得、これを
   トロンビンで消化することを特徴とする特許請求の範囲
   第２３項記載の製造法。 （２９）Ｎ末端側よりトロンビンの切断認識配列、Ｐｒ
   ｏＡｒｇで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
   列が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ であることを特徴とする特許請求の範囲第２８項記載の
   製造法。 （３０）プロモーター／オペレーター系のメッセンジャ
   ーＲＮＡ転写開始点よりトロンビンの認識部位をコード
   するＤＮＡ塩基配列までが、式 【遺伝子配列があります】 で表される配列であることを特徴とする特許請求の範囲
   第２８項記載の製造法。 （３１）式 【遺伝子配列があります】 で表されるヒトＢ細胞分化因子融合蛋白質。