JPH02142470A - バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法 - Google Patents

バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法

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JPH02142470A
JPH02142470A JP63297807A JP29780788A JPH02142470A JP H02142470 A JPH02142470 A JP H02142470A JP 63297807 A JP63297807 A JP 63297807A JP 29780788 A JP29780788 A JP 29780788A JP H02142470 A JPH02142470 A JP H02142470A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、土壌から分離された新規微生物に関する。さ
らに詳細には、本発明は、ヘパリン及びヘパリチンを分
解する能力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産するバ
チルス属に属する新規微生物に関する。さらに、本発明
は、新規な菌体外ヘパリナーゼ及びその製法に関する。
〔従来の技術〕
ヘパリナーゼは、ヘパリン、つまり、主要繰返し単位と
して、−４）−２−デオキシ−２−スルファミノ−α−
Ｄ−グルコビラノース−６−スルフェート−（１−４）
−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸−２−硫酸−（１ を有する硫酸化ムコ多糖のある種のグリコシド結合を切
断する酵素である。該酵素活性による生産物はヘパリン
の鎖の短くなった断片である。
ヘパリナーゼはへパリチン（ヘパリンモノスルフェート
又はヘパランスルフェートとして知られている）、つま
りヘパリンに似類の構造を有する硫酸化ムコ多糖を切断
し、ヘパリチンの鎖が短くなった断片を生成するもので
ある。
基質であるヘパリンは抗凝血剤として広く使用されてい
るので、ヘパリナーゼはヘパリンの構造研究、血液凝固
メカニズムの研究及び体Ｍ１織と体液中のヘパリンの検
出のためのバイオアッセイと多様な用途がある。
また、ヘパリナーゼは、抗トロンビン剤又は抗腫瘍剤と
して潜在的な治療上の価値がある低分子ヘパリン断片の
調製にも用いられる。
ヘパリンを分解できる酵素は、フラボバクテリウム　へ
バリナム、フラボバクテリウムＳρ６．　バクテロイデ
ス　３１１．＋バクテロイデス　ヘパリノリティカス、
ベプトストレブトコッカス及びニーバクテリウムの培養
物に見いだされている。これらのヘパリナーゼは、ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー〔第２３３巻　第８
５３頁１９５６年〕（先例１）。
エクスペリエンティア［第４１巻　第１５４１頁１９８
５年］（先例２）、松本歯科大学報（日本）〔第８巻第
１５頁　１９８２年］（先例３）、　ジャーナル・オブ
・アプライド・アンド・エンバイロメンタル　マイクロ
バイオロジー〔第４６巻　第１２５２頁（１９８３年）
〕（先例４）１　　ジャーナル・オブ・クリニカル・マ
イクロバイオロジー〔第２６巻　第１０７０頁（１９８
８年）〕（先例５）、　　ジャーナル・オブ・ザ・サウ
ス・アフリカン・ベテリナリー・アソシエーション〔第
５３巻　第２１４頁（１９８２））　（先例６）に開示
されている。
バチルス属の微生物によるヘパリナーゼの生産性は従来
検出されていない。
これらの従来からの全てのヘパリナーゼは１以上の欠点
、たとえば、低熱安定性及び酵素の生産と回収のコスト
高などその実際上の使用を制限する欠点があった。現在
、フラボバクテリウム　へパリナム由来のヘパリナーゼ
だけが商業的に入手可能である。
〔発明が解決しようとする課題〕
フラボバクテリウム属又はバタテロイデス属の微生物に
より生産される従来からのヘパリナーゼは菌体に結合し
た酵素で醗酵培養液中へ放出されない。したがって、こ
れらの酵素の回収には菌体破壊が必要であり、該酵素の
精製にはかなりのコストがかかる。醗酵培養液中へ放出
される菌体外ヘパリナーゼは回収のための菌体破壊の必
要がなく低コストで酵素の回収・精製ができるので有用
である。
菌体外にヘパリナーゼを創製することを目的とし、本発
明者らは菌体外に該ヘパリナーゼを生産する性質を有す
る微生物を自然界から純粋に分離することを試みた。そ
の結果、上記の好ましい性質を有するバチルス属に属す
る新規微生物を見出し、本発明を完成した。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の目的は、ヘパリン及びヘパリチンを分解する能
力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産する新規微生物
を提供することにある。
本発明の他の目的は新規なヘパリナーゼ（以下、本酵素
と呼ぶ）を提供することにある。
本発明の別の目的は、本酵素の製造法を提供することに
ある。
つまり、ヘパリン及びヘパリチンを分解する能力を有し
、菌体外にヘパリナーゼを生産するバチルス属に属する
新規微生物を提供すること及び活性至適温度４５〜５０
℃を有する新規ヘパリナーゼ並びに菌体外ヘパリナーゼ
を産生ずるバチルス属に属する微生物を培養し、該ヘパ
リナーゼを回収することを特徴とする上記新規ヘパリナ
ーゼの新規な製法を提供することを意図するものである
。
本発明により新規なヘパリナーゼを得ることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
（１）微生物の入手 本発明者らは、土壌から、４５℃で無機塩、微量のビタ
ミン及びヘパリンを主要栄養素とする液体培地中での成
長によるセレクションにより多数の微生物を分離した。
培養１週間後に微生物の成長の証拠を示す試料から、微
生物が生物学的に純粋な形で分離され、４５℃で活性を
有するヘパリナーゼの産生がテストされた。その結果、
所望のヘパリナーゼ活性を存し、その上このヘパリナー
ゼを発酵培養液中へ放出する１つの細菌の分離株が見出
された。この新規ヘパリナーゼ生産菌株は８０１００株
と命名された。
８１１１００株の分類学上の特性は、バーシーズ　マニ
ュアル　オブ　システマチック　バクテリオロジー第２
巻に記載された方法に従って調べられた。
そして該株はダラム陽性、胞子形成、桿状、通性嫌気性
、運動性、カタラーゼ陽性で成育温度が２０〜５５℃で
あることが見つけられ、そのことから該株はバチルス属
に属する微生物であることは明らかとなった。バチルス
属の公知種と比較して、８１１１００株の分類学上の特
性はいくつかの点でバチルス　サーキュランスの特性と
類似していると認められた。
しかしながら、Ｂ）１１００株はバチルスサーキュラン
スとは、２．３の重要な特性、もっとも顕著なのは、５
５℃での成長する点、ｖＰ培地でのｐＨが６．０以上と
なる点、ＤＮＡ中のグアニン＋シトシン含量が５５５８
ｍｏ１％である点、及びヘパリンとへパリチンの分解能
を有する点において相違する。したがって、Ｂ）１１０
０株はバチルス属に属する既知の微生物とは相違する新
規微生物と判断された。
本発明者らは、このバチルス属エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｐ、）の８１１１００株を工業技術院微生物工業
技術が与えられた。
このＢ）１１００株の分類学的性質は次の通りである。
１、形態学的性質 ダラム染色 細胞サイズ 胞子形状 胞子嚢の膨潤 胞子配置 バラ胞子クリスタル 運動性 ２、成長特性 好気的成長 嫌気的成長 陽性 ０．６−０．８　ｕ　ｍ　Ｘ３−６　ａ　ｍ円筒形 陽性 末端 陰性 陽性 陽性 陽性 成長温度　最高 最低 ５５℃ ２０℃ アジド（ａｚｉｄｅ、ｏ、０２χ） 存在下での成長 ＮａＣ１存在下での成長　２％ ５％ ７％ １０％ ｐＨ６，８（栄養培地）での成長 ｐＨ５，７（ｔブロー培地）での成長 ＮａＣ１及びＫＣＩの要求性 成長因子の要求性 ３、生化学的性質 カタラーゼ ｖ−Ｐテスト （フオーゲスーブＤスカウェ＋ｔ　ｉ＆　験＞陽性 陰性 ｖ−ｐ培地でのｐＨ 酸生成　Ｏ−リボースから Ｄ−キシロースから ６．５−７．０ 陽性 陽性 Ｌ〜ラムノースから Ｄ−ガラクトースから ローフルクトースから ローアラビノースから し一アラビノースから ラフィノースから Ｄ−マンノースから マルトースから シュークロースから ラクトースから Ｄ−グルコースから Ｄ−トレハロースから グリセロールから ローマンニトールから ソルビトールから トエリトリトールから イノシトールから マドニトールから 発酵炭水化物からのガス生成 インドール生成 ジヒドロキシアセトン生成 結晶性デキストリン生成 硝酸塩の還元 クエン酸塩の資化性 プロピオン酸塩の資化性 チロシンの分解 デンプンの加水分解 カゼインの加水分解 −・バリンの分解 ヘパリチンの分解 コロンドロイチンへの分解 コロンドロイチンＢの分解 コロンドロイチンＣの分解 ヒアルロン酸の分解 ポリガラクチュロン酸 ＤＮＡ　中のり７ニン＋シトシン含量 陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 陰性 陰性 陽性 陰性 陰性 ５７モル％ ８１１１００株の培養用培地としては、炭素源、窒素源
及び無機塩類を含有する通常の培地が用いられる。炭素
源としては、同化できるものいずれのものも用いること
ができ、たとえば、Ｄ−グルコース。
マルトース、Ｄ−キシロース、シュークロース、ヘパリ
ン、クエン酸塩、コハク酸塩、グルタミン酸塩１　トリ
プトン又はペプトンが典型例として例示できる。窒素源
としては多種の通常の原料が使用され、たよえば、イー
スト抽出物、ペプトン、内袖出物、コーンステイープリ
カー、アミノ酸溶液等、又は、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム等の無機窒素源が容易に入手できるものと
して例示できる。
さらに、上記の炭素及び窒素源に加えて、Ｖ通に使用さ
れる種々の塩類、たとえば、硫酸マグネシウム、塩化マ
グネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化
カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。
ビタミンや他の成長因子は必須ではないがしかし、葉酸
、パントテン酸カルシウム、ビオチン、リボフラビン、
チアミン等を添加することも可能である。さらに、望ま
れれば、アガー（寒天）、　ゼチラン、ゲルライト等の
ゲル化剤を添加することも可能である。培地は、最終的
にｐＨ５，５〜８．５、好適にはｐ　Ｈ６，５〜８．０
に、適当な酸又は塩基の添加により調整される。
８１１１００株によるヘパリナーゼ合成は、培養培地中
におけるヘパリンの存在によりＢＡＲされる。ヘパリナ
ーゼ生産のために、１２あたり０．０５〜１０ｇ、好適
には１ｆｆｉあたり１．０〜２．０ｇのヘパリンが培養
培地に添加される。
適当な培地の具体例として、１１あたりにトリプトン１
０ｇ、イースト抽出物］、　ｇ＋　Ｋ２ＨＰ０．３．５
ｇ。
ＭｇＣＩｚ　・６１１ｚＯ２ｇ、　ヘパリン１ｇを含有
し、Ｎａ０１１でｐ　Ｈ８，０に調整された液体培地が
例示できる。
８１１１００株は、好適には好気的条件下に３０〜５０
゛Ｃで培養される。
（２）本酵素の取得法 本酵素を産生ずる株は、適当な培地、たとえば、上述の
１！あたり０．０５−１０ｇ、好適には１βあたり１．
　Ｏ−２，０ｇのインデューサーとしてヘパリンを含有
する培地で培養され、１２−７２時間３０〜５０゛Ｃで
好気的にインキュへ−１−された。
本酵素の分離１精製は、たとえば以下のように行なわれ
る。ヘパリナーゼ活性の大部分を含有している培養液か
ら、菌体が遠心分離、マイクロフィルトレージョン、又
は他の通常の方法により分離される。
この段階で、６Ａ　Ｍアンモニウム又はアセトンによる
沈澱、ポリエチレングリコールによる透析、又は限外濾
過などの従来方法により、粗ヘパリナーゼは濃縮される
。他の方法として、粗ヘパリナーゼ活性は、該濃縮工程
なしにさらに処理される。
該ヘパリナーゼ活性物は、イオン交換及びゲル濾過メデ
ィアのようなりロマトグラフィーメディアにかけられ、
及び／又はクロマトフォー力スイング、調製用等電点泳
動法、電気泳動法のような、酵素精製の分野の当業者に
周知の種々の従来法により分画され、それにより本酵素
が得られる。
本酵素の好適な取得方法は以下に例示される。
バチルス属ｓｐ、ＢＩ１１００株は、１１あたり１〜２
ｇの濃度でインデューサーとしてのヘパリンを含有する
上述の適当な培地で培養され、３６〜４０時間、４０〜
４５℃で好気的にインキュベートされた。得られた培養
物は培養物上清から菌体を除去するためにｌＯｏＣ８０
００Ｘ　ｇで３０分間遠心分離された。固形硫酸アンモ
ニウムが該培養液上清に飽和度７０％まで加えられ、粗
ヘパリナーゼ含有沈澱を形成させるために、溶液は５℃
で３時間放置された。該沈澱は１０℃８０００　Ｘ　ｇ
で３０分間の遠心分離により回収され、ｐＨ７，８の１
０ｍＭヘベス（ｌ（ＥＰＥＳ）バッファーに溶解された
。粗ヘパリナーゼ溶液はｐＨ７，ｌｌＩ　１０ｍＭヘペ
ス（ｌＥＰｆ！Ｓ）バッファーの１００倍量（２回交換
）に対して５℃で２４時間透析された。透析物は１０℃
１２０００Ｘｇで３０分間遠心分離され、沈澱した蛋白
質は捨てられた。粗ヘパリナーゼ溶液は、ｐＨ７，８１
０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）バッファーで平衡化された
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬのカラムにかけられ、同
じバッファーで溶出された。溶出物は一つの活性分画と
して回収され、この酵素溶液は同じバッファーで平衡化
されたセルロファインーサルフエートのカラムにかけら
れた。この酵素は、ｐＨ７，８１０ｍＭ　ヘペス（ＩＩ
ＥＰＢｓ）バッファー中０〜０．３Ｍ　ＮａＣ１の線形
濃度勾配で溶出された。約０．１９Ｍ　ＮａＣ１で溶出
された活性分画が回収され、アミコンＰＭＩＯ膜を用い
る限外濾過により濃縮された。このように処理された酵
素溶液は、ｐＨ７，４５０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）、
１００ｍＭ　ＮａＣ１のバッファーで平衡化されたＳｉ
ｌ。
ＤＥＸ　ＷＳ−２００３のカラムを用いるゲル濾過にか
けられた。このようにして得られた活性分画は合わせら
れ、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による検査により一つの蛋白質バン
ドであると示された精製ヘパリナーゼのみを含有してい
る。
（３）本酵素の特性 本方法により製造された本酵素の酵素学上の特性は以下
のとおりである。
（ａ）作　用 ヘパリン及びヘパリチンのエリミネーティブな切断を触
媒し、それぞれ、ヘパリンとへバリチンの鎖の短かくな
った断片を生成する。これらは、２３２ｎｍに紫外線吸
収を示す。
（ｂ）基質特異性 ヘパリンとへパリチンを切断するが、コンドコイキンＡ
、コンドロイチンＢ、コンドロイチンＣ。
ヒアルロン酸、デキストラン硫酸及びポリガラクチュロ
ン酸は切断しない。
（Ｃ）最適ｐＨ及び安定なｐＨ範囲 活性に最適なｐＨは、第１図に示されるように、７、２
−７．８である。３０℃における２４時間活性保持の条
件下では、ｐＨ７，０−８，０の範囲で安定である。
（ｄ）耐熱性（熱安定性） ｐＨ７，４で５．抛Ｍ　ＣａＣ１，の存在下で、４５℃
３０分間加熱後１００％の酵素活性が残存し、４５℃３
時間の加熱後１０％の活性が残存した。
カルシウムイオンが安定性のためには必要である。
（ｅ）最適温度範囲 ５、ＯｍＭ　ＣａＣ１ｔ存在下で活性に最適な温度は、
用いたアッセイ時間の長°さに依存し、４５℃　（３０
分間アッセイ、（第２図参照）又は５０″Ｃ（１０分間
アッセイ）である。
げ）無機イオンの影古 ２．５ｍＭのＣａ”　＋　Ｍｇ”又はＢａ”の塩化物存
在下で酵素活性は５０％増加する。最ｉａ濃度である５
ｍＭ　Ｃａ”の存在下で、活性は１００％増加する。０
゜５　ｍＭのｃｏ！ｏ　、　ｚｎ２＋　、　（、ｕ２＊
　、　Ｎｉ！＋及びＰｂｔ＋の塩化物の存在下で活性は
それぞれ３８％、６６％、９０％、８０％及び１００％
低下する。２．５ｍＭのＦｅ”Ｍｎ”　　及びｌ　ｉｔ
　＋の塩化物は、該活性に影響　しない。ＮａＣ１は３
０ｍＭ、　１００ｍＭ、　２００ｍＭ、　３００ｍＭの
濃度でそれぞれ１０％、４４％、８８％及び１００％活
性を阻害する。
（濁分子量 本酵素の分子量は、ＳＯ３（ドデシル硫酸ナトリウム）
ポリアクリルアミド電気泳動で４〜２０％の線形勾配ゲ
ルを用いて分子量標準蛋白質を参照した見積りによると
１２００００である。
本酵素の理化学的性質を従来公知のヘパリナーゼのそれ
と比較すると第１表の通りである。
本酵素の活性の測定及び指示方法は以下のとおりである
。
トルイデン・ブルー・メタクロマジー・アッセイ本酵素
液（適宜希釈）２０μｉ、、　　５０ｍＭヘペス（ＨＥ
ＰＨＳ）バッファー、　　ｐＨ７，４８０μ！、及びヘ
パリン（ナトリウム塩）を―あたり１００μｇ（含む溶
液）２０μ！、を含有する反応溶液が蒸発を防ぐため密
封され、４５℃で３０分間保持された。そして０．０２
５ｍｇ／ｍ　トルイデン　ブルー溶液２０μｌが添加さ
れ、６２０μｍにおける該溶液の吸光度が測定された。
反応混合物中の残存ヘパリン総量は、既知のヘパリン濃
度の一連の標ｆ＄（試料）溶液を参照し、その吸光度か
ら算出された。酵素活性１単位は、４５℃で時間あたり
１．０■のヘパリンを分解するのに必要な量とされた。
紫外吸光アッセイ 本酵素（適宜希釈）２０μＣ及びｐＨ７，４５０ｍＭヘ
ベス（ＩＩＥＰＥｓ）バッファーで１０ｍｇ／ｍ！ヘパ
リンを含有するバッファー５０μｌを含有する反応混合
物が４５℃で３０分間保持された。その後、ｐ）１２．
０の２０ｍＭ　ＫＣｌ−１１ｃＩを２．０ｒＲ１添加す
ることで反応が停止され、該溶液の２３２μｍにおける
吸光度が測定された。酵素活性の１国際車位（１，１）
は、分解物の分子吸光度係数が５１００ｃｍ−’　Ｍ−
１であるのに基づき、４５℃で１分間あたり二重結合を
１マイクロモル生成するのに必要な酵素量とされた。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、この実施例は本発明の単なる例であって、本発明
がこれにより制限されるものでない。
実施例１ 新規に見出された菌株、バチルス属Ｓρ、　ＢＨｌｏｏ
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０８）は土壌から次の方法で分
離された。
約０．１ｇの土壌試料が１．５−の培地（１！あたり）
ヘパリン２．０ｇ、に１１１ＰＯ４０，３５ｇ、　Ｎｌ
ＩｎＣｌ　Ｏ，２７ＬＭｇＣ１ｚ・６１１□００．２ｇ
、　　　リジン０．００１ｇ、　　ヒスチジン０．００
１ｇ、　　メチオニン０．００１ｇ、　　クエン酸第−
鉄０．００２５ｍｇ、　　微量元素溶液０．１ｍ１（Ｉ
ｆあたりにＺｎＳＯ４０，１２ｇ、　ＭｎＳＯ４０，５
ｇ、　ＩＩＪＯ＊　０．１３ｇ、　ＣｕＳＯ４゜０．０
０４ｇ、　ＮａＪｏ０４０．００６ｇ、及びＣｏＣｌ２
・６１１ｘＯ０，０１２ｇを含有］、及びビタミン溶液
０．１ｍ／（Ｉｆあたり、葉酸及びビオチン各１０ｍｇ
、　　リボフラビン２５ｍｇ、チアミン２５ｍｇ、ニコ
チン酸２５ｍｇ　、　　パントテン酸カルシウム２５ｍ
ｇ、　　パラアミノ安息香酸２５ｍｇ及びピリドキシン
塩酸塩を含有］に添加された。該培養液は、滅菌された
２４穴のマイクロタイタートレーに蒸発を最小限におさ
えるためにプラスチックラップを密封されたものに、４
５℃で振とうすることなく保持された。−週間の培養後
、微生物の成長の証拠を示したこれら試料から、（ｉ！
、あたり）２．０ｇヘパリン、　　０．１８　Ｋ２１１
ＰＯ４，１，０ｇ　ＭｇＣＩｚ　、６ＬＯ。
及び８．０ｇゲルライトを含有する固体培地にｐＨ８，
０，４５℃で繰返し継代することにより該微生物学、生
物学的に純粋な形で分離された。
実施例２ 実施例１に示されるようにして得られた生物学的に純粋
な分離株は、（ＩＮあたり）　１４ｇ　　トリプトン、
１．０ｇ酵母抽出物、　３．５ｇ　ＫｔｔｌＰＯ４，２
ｇ　ＭｇＣｈ及び１．０ｇヘパリンを含有し、ＮａＯＨ
でｐＨ８，０に調節された液体培地２０−で該菌株を培
養することにより、ヘパリナーゼ活性の生産性がテスト
された、該培養物は４５℃で６５ｒｐｍで回転振とうし
インキュベートされた。７２時間の培養後、菌体は２０
分間８０００Ｘｇの遠心分離により回収され、上清はト
ルイデン　ブルー　メタクロマジー　アッセイにより残
存ヘパリンが測定された。バチルスｓｐ　Ｂ１１１ＯＯ
株（ＦＩ！ＲＭ　Ｐ−１０４０８）を含有する培養物で
は該培養物上清に残存するヘパリン量は−あたりゼロ■
と定量された。ヘパリナーゼ活性は４５℃でトルイデン
　ブルー　メタクロマジー　アッセイにより定量され、
該培養物上清は―あたり０．０７４単位ヘパリナーゼを
含有すると認められた。
実施例３ バチルス属ｓｐ、　８１１１００株は、ＩＮあたりに、
ヘペルス（）ＩＥＰＲ９）緩衝液７．０ｇ、イースト抽
出物２．０ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ、　ＭｇＣ１□１
．Ｑｇ、ヘパリン１．０ｇ及び以下に示される炭素源１
０ｇを含有し、Ｎ　ａ　ＯＩＩでｐＨ８，０に調整され
た液体培地２〇−中で培養された。該培養物は、６５ｒ
ｐｍで回転振とうさせつつ４５℃でインキュベートされ
た。培養４０時間、６４時間及び７２時間後に各培養物
から１．　Ｏａｔｆの試料が取り出され、菌体は遠心分
離により集められ、培養物上清は、実施例２に示された
ようなトルイデンブルー　メタクロマジー　アッセイに
よりヘパリナーゼ活性がステト　（定量）された。結果
を第２表に示す。
（１，Ｕ、／ｉｆ） 実施例４ バチルス属ｓｐ、ＢＨ１００株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４
０８）によりヘパリナーゼ合成の誘導は以下のようにし
て調べられた。８１１１００株、は、（Ｉｎあたり）１
０ｇ　　トリプトン。
１．０ｇ酵母抽出物、３．５ｇ　ＫｚｌｌＰＯ４，２，
０ｇ　ＭｇＣ１ｇ・６■２０．及びそれぞれ１２あたり
ＩｇのコンドロイチンＡ、コンドロイチンＢ、コンドロ
イチンＣＩ　ヒアルロン酸、ポリガラクチュロン酸、硫
酸デキストラン、グルコサミン又はグルクロン酸、又は
下に示される濃度のヘパリンを含有する液体培地２゜−
に培養された。培養物は、６５ｒｐ−の回転振とうしつ
つ４５℃でインキュベートされた。培養３６時間後、菌
体は遠心分離により除去され、培養物上清が以下のよう
に更に処理された。固定硫酸アンモニウムが７０％飽和
度まで添加され、該溶液は沈澱生成のために５℃で３時
間保持された。該沈澱は１０℃で３０分間８０００ｘｇ
の遠心分離により回収され、ｐＨ７，４（７）　２０ｍ
Ｍ　ヘヘ、ＩＪＩＥＰＥｓ）　ハｔ　７　ｙ　−２，０
−に溶解された。この溶液は、ｐＨ７，４２０ｍＭヘベ
ス（ＩＩＥＰＥＳ）バッファー４１に対して４℃で１６
時間透析され、そして紫外線吸収アッセイ法を用いて４
５℃でヘパリナーゼ活性が定量された。結果は第３表に
要約されている。
第３表 上記データに示されるようにバチルス属ｓｐ、　８１１
１００株によるヘパリナーゼ合成は、培地中のヘパリン
の存在により誘導される。該酵素の生産はコンドロイチ
ンＡ、Ｂ、又はＣ，ヒアルロン酸、ポリガラクチュロン
酸、硫酸デキストラン、グルコサミン、又はグルクロン
酸の存在によっては誘導されない。
実施例５ ヘパリナーゼの精製法は以下に示される。
バチルス属ｓｐ、ＢＨ１００株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４
０８）は、（ｌあたり）　１０ｇ　トリプトン、　　１
．０ｇ酵母抽出物、　３．５ｇＫｚＨＰＯ４，２，Ｏｇ
　ＭｇＣｈ・６Ｈ２０及び２．０ｇヘパリンを含有し、
ＮａＯＨでｐＨ７，４に調節された液体培地６！中に５
％接種物から培養され、４０℃３６時間、好気的にイン
キュベートされた。得られた培養物は培養物上清から菌
体を除去するために１０℃で３０分間８０００　Ｘ　ｇ
で遠心分離された。全ヘパリナーゼ活性の１４％と見積
もられた活性は菌体に結合したもので捨てられた。固体
硫酸アンモニウム（２６５２ｇ）が７０％飽和度に達す
るように、該培養物上清に添加され、該溶液は、粗ヘパ
リナーゼを含有する沈澱を形成するように、５℃で３時
間放置された。
該沈澱は１０℃で８０００Ｘｇ　３０分間の遠心分離に
より回収され、ｐＨ７，８１０ｍＭ　ヘペス（ＩＩＥＰ
ｔ！Ｓ）バー）ハアー５０ｍ／に溶解された。該粗ヘパ
リナーゼ溶液はｐＨ７，８１０ｍＭ　ヘペス（ＨＥＰＥ
Ｓ）バッフｙ−１０１（５！を２回交換）に対して５℃
で２４時間透析された。
透析物は１０“Ｃで１２０００Ｘｇ　３０分間遠心分離
され、沈澱蛋白質は捨てられた。その後の精製は室温、
つまりおよそ２２℃で行なわれた。ヘパリナーゼ活性は
各工程で紫外線吸収アッセイを用いてモニターされた。
粗ヘパリナーゼ？容液はｐＨ７，８１０ｍＭヘヘス（Ｉ
ＩＥＰｃｓ）　ハラ７　ｙ　−テ平衡化されたＤＥＡＲ
−ＴＯＹＰＥＡＲＬのカラムにかけられ、同じバッファ
ーで溶出された。溶出物は一つの活性分画として回収さ
れ、この酵素溶液は同じバイファーで平衡化されたＣＥ
ＬＬＶＯＦＩＮＥ−ＳＵＬＦＡＴＥ（７）カラムニかけ
られた。該酵素はｐＨ７，８１０１ｎＭヘベス（ＩＩＥ
ＰＥＳ）バッファー中０−０．３Ｍ　ＮａＣ１の線形濃
度勾配により溶出された。約０．１９Ｍ　ＮａＣｌで溶
出した活性分画は回収され、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）
　ＰＭＩＯ膜を用いる限外濾過により濃縮された。この
ように処理された酵素溶液は、ｐＨ７，４５０ｍＭ　ヘ
ベス（ＩＩＥＰＥｓ）バッファーで１００ｍＦＩＮａＣ
１を含有するバッファーで平衡化された５ＩＩＯＤＥＸ
ＷＳ−２００３のカラムを用いてゲル濾過された。この
ようにして得られた活性分画は合わせられ、ＳＯ５（ド
デシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法
により調べられたところ一つの蛋白質バンドとして示さ
れた精製ヘパリナーゼのみを含有第１図
【図面の簡単な説明】
第１図は本酵素活性に対するｐＨの影響を示すＨ 手続補正書 第２図 １変（℃） 昭和６３年１２月２７日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）次の理化学的性質を有するヘパリナーゼ （１）最適ｐＨ範囲：ｐＨ７．２〜７．８ （２）最通温度範囲：４５〜５０℃ （３）活性化：Ｃａ＾２＾＋ （２）バチルス属に属する請求項１記載のヘパリナーゼ
    生産菌を培地に培養し、菌体外に該ヘパリナーゼを蓄積
    せしめ、次いで該ヘパリナーゼを培養液から回収するこ
    とを特徴とする前記ヘパリナーゼの製造法。 （３）ヘパリン及びヘパリチンを分解する能力を有し、
    ヘパリナーゼを菌体外に生産するバチルス属ｓｐ．。 （４）バチルス属ｓｐ．が、バチルス属ｓｐ．ＢＨ１０
    ０（微工研菌寄第１０４０８号）であることを特徴とす
    る請求項３記載のバチルス属ｓｐ．
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5290695A (en) * 1991-03-06 1994-03-01 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0693836B2 (ja) * 1988-11-25 1994-11-24 新技術事業団 バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法
US5262325A (en) * 1991-04-04 1993-11-16 Ibex Technologies, Inc. Method for the enzymatic neutralization of heparin
US5599659A (en) * 1993-03-11 1997-02-04 Breonics, Inc. Preservation solution for ex vivo, warm preservation of tissues, explants,organs and vascular endothelial cells comprising retinal-derived fibroblast growth factor, cyclodextrin and chondroitin sulfate
US6198958B1 (en) 1998-06-11 2001-03-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Method and apparatus for monitoring a magnetic resonance image during transcranial magnetic stimulation
JP2003527822A (ja) * 1998-08-27 2003-09-24 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ヘパリナーゼｉおよびｉｉ由来の合理的に設計されたヘパリナーゼ
CA2402160C (en) * 2000-03-08 2012-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Heparinase iii and uses thereof
DE60334220D1 (de) * 2002-06-03 2010-10-28 Massachusetts Inst Technology Rationell konstruierte, von chondroitinase b abgeleitete lyasen
US20050277826A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-15 Conopco, Inc. Apparatus and method for reducing interference
US7767420B2 (en) 2005-11-03 2010-08-03 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Heparan sulfate glycosaminoglycan lyase and uses thereof
US7691612B2 (en) 2005-11-03 2010-04-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Heparan sulfate glycosaminoglycan lyase and uses thereof
US7691613B2 (en) * 2006-11-03 2010-04-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Glycosaminoglycan lyase IV and uses thereof
CN102586217A (zh) * 2011-12-16 2012-07-18 深圳市海普瑞药业股份有限公司 肝素黄杆菌肝素酶ⅰ、ⅱ、ⅲ的冻干保存方法
CN104593347B (zh) * 2015-03-05 2018-08-28 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用
EP3561048A4 (en) 2016-12-22 2020-08-12 Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co., Ltd. PSEUDOMONAS STUTZERI-PRODUCING STRAIN OF HEPARINASE AND Heparinase derived from it
CN113249277B (zh) * 2021-07-05 2021-09-24 广东海洋大学 一株贝雷斯芽孢杆菌在水产品肝素提取中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4341869A (en) * 1980-08-25 1982-07-27 Massachusetts Institute Of Technology Process for producing heparinase
JPH0693836B2 (ja) * 1988-11-25 1994-11-24 新技術事業団 バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5290695A (en) * 1991-03-06 1994-03-01 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same

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