JPH02149341A - 血清アミロイドｐ蛋白用吸着体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血液などに含まれる血清アミロイドＰ　（Ｓｅ
ｒｕｍ　Ａｍｙｌｏｉｄ　Ｐ　ｓ以下ＳＡＰという）蛋
白を除去するためのＳＡＰ蛋白用吸着体に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

アミロイド−シスはアミロイド物質と呼ばれるβ−フィ
ブリル状の蛋白が血管、臓器およびその他の組織に沈着
し、心、腎などの臓器不全、心刺激伝導障害、進行性痴
呆、脳血管障害、神経障害などの重篤な障害をひきおこ
す疾患である。

アミロイド−シスには原発性、持続性、家族性、老人性
などの病型が存在することが知られており、アミロイド
−シス沈着物質の蛋白組織は病型により異なる。また、
それぞれの病型において沈着するアミロイド物質に対応
する前駆物質が、患者血液中に存在することが明らかに
なりつつある。

１９６０年代になって、アミロイド物質には異なる２種
類のものがあり、一方はアミロイド特有の線維状のもの
（ａｍｙｌｏｉｄ　ｆ’１ｂｒｉｌｓ）と、他方は五角
形をした桿状のもの（Ｐ−ｃｏＩｌｐｏｎｅｎｔｘ　Ａ
Ｐ）とがあることが電子顕微鏡的検索により明らかにな
った。すなわち、アルツハイマー病と老人性痴呆におけ
る大脳内の斑を除いたすべての病型のアミロイド−シス
に、アミロイドＰ蛋白（ＡＰ）と呼ばれる物質がβ−フ
ィブリル状の蛋白と結合した状態で見出されている。Ａ
Ｐの構造については、分子量２３０００〜２５０００の
サブユニット５つから五角形のユニットができ、一対の
ユニットがパラレルになったｌＯ全量体形成していると
いったことが調−べられている。

このＡＰは、正常人血漿蛋白であるＳＡＰと同一である
ことが、種々の方法により確認されている。したがって
ＡＰは、循環しているＳＡＰが組織のところで沈着した
ものである、すなわちＳＡＰはＡＰの前駆物質であると
考えられている。生体内での機能、およびこれらの分子
と他のアミロイド物質の沈着との関係についてはよくわ
かっていないが、ＡＰはアミロイド線維の不可欠な部分
であるとの報告もあり、ＳＡＰの沈着がアミロイド−シ
スの発病に大きな意味を持っていると思われる。

アミロイド−シスは前記のごとく重篤な疾患であり、死
亡率も高いことからその治療法について盛んに研究され
てきたが、これまでのところ有効な治療法、とくに薬物
療法は見出されていない。

一方近年盛んに行われるようになってきた体外循環によ
る血液浄化法、とりわけプラズマフェレーシスによりア
ミロイド−シスを治療する試みがなされており、前記の
前駆物質を多量に含有する患者血漿を正常血漿と交換す
ることにより症状の軽快、病変の進行停止が見られると
の報告がなされている。

体外循環による血液浄化法とりわけ血漿交換法は現在の
ところもっとも有効な治療法であるが、高価かつ貴重な
正常血漿あるいは血漿製剤を大量に使用すること、また
患者血漿中に含まれる前駆物質以外の有用成分も同時に
廃棄されるなどの欠点を有しているため、ＳＡＰ蛋白な
どの前駆物質をより選択的に除去する方法の開発が強く
望まれている。

本発明は、斜上の問題点を解決し、ＳＡＰ　ｍ白を選択
的に除去しつる安価なＳＡＰ蛋白用吸着体を提供するこ
とを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化
合物が固定されてなるＳＡＰ蛋白用吸着体に関する。

〔実施例〕

本明細書において体液とは血液、血漿、血清、腹水、リ
ンパ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、
ならびにその他の生体由来の液性成分をいう。

本発明に用いる水不溶性担体は、多孔質体のもの、とく
に大きな径の連続した細孔を有するものが好ましい。す
なわちＳＡＰ蛋白はサブユニットが１０量体を形成して
おり、分子量が２８００００〜２５００００にも達して
いるので、これを効率よく吸着するためにはＳＡＰ蛋白
が容易に多孔質担体内に侵入しうることか必要である。

細孔径の目安として、排除限界分子量がよく用いられる
。排除限界分子量とは底置（たとえば波多野博行、花卉
俊彦著、実験高速液体クロマトグラフィー、化学同人）
などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子
のうちもっとも小さい分子量をもつ物の分子量をいう。

したがって本発明に用いる水不溶性多孔質担体は、その
排除限界分子量が２３００００以上（球状蛋白を用いて
えられた値、以下同様）の大きさであることが好ましい
。

一方、排除限界分子量が１億をこえるものは吸着体の機
械的強度が弱くなるかまたは吸着体の固形分含量が小さ
すぎて充分な吸着容量かえられないなどの理由から実用
に耐えなくなる傾向がある。したがって、排除限界分子
量は１億以下が好ましく、さらには５０００万以下が好
ましい。

つぎに水不溶性担体の多孔構造については表面多孔性よ
りも全多孔性が好ましく、空孔容積が吸着容量が大きい
という点から２０％以上であることが好ましい。水不溶
性担体の形状は、粒状、球状、繊維状、膜状、ホローフ
ァイバー状など任意の形状を選ぶことができる。粒子状
の水不溶性担体を用いるばあい、その粒子径は１遍未満
のばあい圧力損失が大きく　、５０００．１７１１１を
こえるばあい吸着容量が小さい点から１−以上５０００
ａｍ以下であるのが好ましい。

本発明に用いる水不溶性担体は有機性、無機性いずれで
あってもよいが、目的とするＳＡＰ蛋白以外の体液成分
の吸着（いわゆる非特異吸着）の少ないものが好ましい
。親水性である方が非特異吸着が少ないので水不溶性担
体は疎水性であるよりも、親水性であるほうが好ましく
、分子中に水酸基を有する化合物よりなる水不溶性担体
がより好ましい。

本発明に使用する水不溶性担体の代表例としては、アガ
ロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなどの軟質
多孔質担体、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの無
機多孔質担体、ポリメチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体など
の合成高分子および／またはセルロースなどの天然高分
子を原料とする多孔質ポリマーハードゲルなどがあげら
れるがこれらに限定されるわけではない。

本発明の吸着体を体外循環治療に用いる際には、血液、
血漿のごとき抗粘性流体を高速で流す必要があるため、
圧密化を引起こさない充分な機械的強度を有する硬質水
不溶性担体を用いるのが好ましい。すなわち硬質担体と
は後記参考例に示すごとく、水不溶性担体は円筒状カラ
ムに均一に充填し、水性流体を流通したばあいの圧力損
失と流速との関係が少なくとも０．３　ｋｇ／Ｃ−まで
直線関係にあるものをいう。

本発明に用いるアニオン性官能基はｐＨが中性付近で負
に帯電するような官能基であればいかなるものも使用し
うる。これらの代表例としては、カルボキシル基、スル
ホン酸基、スルホン基、硫酸エステル基、シラノール基
、リン酸エステル基、フェノール性水酸基などがあげら
れるがこれらに限定されるわけではない。

なかでもカルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル
基およびリン酸エステル基がＳＡＰ蛋白に対する親和性
が強く好ましい。

アニオン性官能基を有する化合物としては、分子内に１
つのアニオン性官能基を有するモノアニオン化合物であ
っても、複数のアニオン性官能基を有するポリアニオン
化合物であってもよい。ポリアニオン化合物はＳＡＰ蛋
白に対する親和性が大きく、また単位量の担体に多くの
アニオン性官能基を導入しやすいので好ましい。

なかでも分子量が１０００以上のポリアニオン化合物は
親和性、アニオン性官能基導入量の点で好ましい。ポリ
アニオン化合物が有するアニオン性官能基は１種類であ
ってもよいし、２種類であってもよい。

本発明に用いるポリアニオン化合物の代表例としては、
ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン
酸、ポリビニルリン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリ
スチレンリン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン
酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイ
ン酸共重合体などの合成ポリアニオン化合物、およびヘ
パリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロ
イチン硫酸、ホスホマンナン、キチン、キトサンなどの
アニオン性官能基含有多糖類があげられるがこれらに限
定されるわけではない。

本発明の吸着体に固定されているアニオン性官能基を有
する化合物は１種類であってもよいし、２種類以上であ
ってもよい。

本発明の吸着体は、水不溶性担体にアニオン性官能基を
有する化合物が固定された状態のものをいう。そのよう
なアニオン性官能基を有する化合物の固定された状態を
うるためのアニオン性官能基の吸着体への導入方法は種
々あり、いかなる方法で導入してもよいが、代表的な導
入方法としては （１）　　アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性
官能基に変換しうる官能基を含有する化合物をモノマー
あるいは架橋剤として用いる重合によって吸着体を形成
させる方法、 （２）アニオン性官能基を含有する化合物を水不溶性担
体に固定させる方法、 （３）　　アニオン性官能基を形成する化合物と水不溶
性担体を直接反応させることによって、水不溶性担体に
アニオン性官能基を有する化合物を固定させる方法 などがあげられる。

もちろんガラス、シリカ、アルミナなどもともとアニオ
ン性官能基を含有するアニオン性官能基含有化合物を吸
着体として用いてもよい。

（１）の方法において用いるアニオン性官能基あるいは
容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を含有する
モノマーあるいは架橋剤の代表例としては、アクリル酸
およびそのエステル、メタクリル酸およびそのエステル
、スチレンスルホン酸などがあげられるがこれらに限定
されるわけではない。

（２）の方法、すなわちアニオン性官能基を含有する化
合物を水不溶性担体に固定させる方法としては、物理的
吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合によ
り固定する方法などがあり、いかなる方法を用いてもよ
いが、治療目的に吸着体を用いるには、滅菌時あるいは
治療中にアニオン性官能基含有化合物が離脱しないこと
が重要であるので、強固な固定が可能な共有結合法が好
ましい。

共有結合によりアニオン性官能基含有化合物を固定させ
るばあい、アニオン性官能基含有化合物がアニオン性官
能基以外に固定に利用できる官能基を有するのが好まし
い。

固定に利用できる官能基の代表例としては、アミノ基、
アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシニルイ
ミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン
基、エポキシ基、シラノール基などがあげられるがこれ
らに限定されるわけではない。

これらの官能基を有するアニオン性官能基含有化合物は
多数存在するが、タウリン、スルファニル酸、グリシン
、ホスホリルエタノールアミン、チロシンなどはその一
例である。

また、アニオン性官能基を含有する化合物のうち硫酸エ
ステル基を含有する化合物の代表例としては、アルコー
ル、糖類、グリコールなどの水酸基含有化合物の硫酸エ
ステルがあげられるが、これらのなかでも多価アルコー
ルの部分硫酸エステル化物、とりわけ糖類の硫酸エステ
ル化物が硫酸エステル基、固定に必要な官能基の双方を
含んでいるうえに、生体適合性および活性ともに高く、
さらに硫酸化多糖類は容易に水不溶性担体に固定しうろ
ことからとくに好ましい。

つぎに（３）の方法、すなわちアニオン性官能基を形成
する化合物と水不溶性担体とを反応させることによって
、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を固
定させてアニオン性官能基を導入する方法の代表例とし
て水酸基含有担体に硫酸エステル基を導入する反応があ
げられる。このばあい、水酸基含有水不溶性担体とクロ
ロスルホン酸、濃硫酸などの試薬を反応させることによ
って直接硫酸エステル基を導入することができる。

本発明の吸着体を用いて体液からＳＡＰ蛋白を除去する
方法には種々あり、いかなる方法を用いてもよいが、流
体の流入口および流出口を有する容器、流体および該流
体に含まれる成分は通過できるが、水不溶性多孔質体に
アニオン性官能基を有する化合物が固定されてなるＳＡ
Ｐ蛋白の吸着体は通過できないフィルター、および前記
容器内に充填された前記ＳＡＰ蛋白の吸着体からなるＳ
ＡＰ蛋白の除去装置に体液を通液する方法が簡便で好ま
しい。

参考例 両端に孔径１５遍のフィルターを装着したガラス製カラ
ム（内径９ｍｌ１１１カラム長１５０ｍ）にアガロース
ゲル（Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ５ｍ　：商品名、バイオラド社
製、粒径５０〜１００メツシユ）、合成ポリマーよりな
るゲル、トヨパールｏｗｅ５（商品名、東ソー■製、粒
径５０〜１００　ｌ！ｍ’）　、および多孔質セルロー
スゲル、セルロファインＧＣ−７００（商品名、チッソ
■製、粒径４５〜１００ＪＩ）をそれぞれ均一に充填し
、ペリスタティックポンプによりカラム内に水を流通し
、流速と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を第
１図に示す。同図より明らかなように軟質ゲルであるア
ガロースゲルは一定の流速以上では圧密化を起こし、圧
力を増加させても流量が増加、しないのに対し、トヨパ
ール、セルロファインなどの硬質ゲルは圧力の増加にほ
ぼ比例して流量が増加する。

製造例１ 多孔質セルロース担体であるＣＫゲルＡ３　（商品名、
チッソ■製、球状蛋白質の排除限界分子量５０００万、
粒径８３〜１２５　ｌＪｍ）　１００　ｍｌに水１００
ｍ１゜２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５１ｍ１．エピクロ
ルヒドリン１８ｍ１を加え、４０℃で２時間撹拌した。

反応後ゲルを濾別、水洗してエポキシ化ＣＫゲルＡ３　
（以下、エポキシ化ゲルという）をえた。

実施例１ 製造例１でえたエポキシ化ゲル５　ｍｌに、スルファニ
ル酸０．１７ｇを１０ｍ１の水に溶解してｐＨ９，９に
調整した溶液を加え、室温で２４時間振盪し、０．５％
モノエタノールアミン水溶液を加えて振盪し未反応のエ
ポキシ基を封止してスルファニル酸が固定されたセルロ
ースゲルをえた。

実施例２ 製造例１でえたエポキシ化ゲル５　ｍｌに、分子量約５
０００、イオウ含有１８％のデキストラン硫酸ナトリウ
ム４ｇおよび水５　ｍｌを加え１）Ｈ９に調整して４５
℃で１８時間振盪した。その後、ゲルを濾別して、２Ｍ
食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液および水を用いてこの
順に洗浄し、０．５％モノエタノールアミン水溶液を加
えて室温で振盪し、未反応のエポキシ基を封止してデキ
ストラン硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲルを
えた。

製造例２ 製造例１で用いたものと同種の多孔質セルロース担体（
ＣＫゲルＡ３）　４０ｍ１をヘプタン中に懸濁させ全量
を７０ｍ１とした。これに２ｏ％ＮａＯＨ１０ｍｌおよ
びノニオン系界面活性剤トゥイーン２０（商品名、バイ
オラッド社製）　４０滴を加え４０’Ｃで３０分間振盪
した。続いてエピクロルヒドリン１０ｍ１を加え４０℃
で６時間振盪した。反応終了後ゲルを濾別し、エタノー
ル、水の順に洗浄してエポキシ化ゲルをえた。

実施例３ 製造例２でえたエポキシ化ゲル１０ｍ１に、片末端にア
ミノ基を有するポリアクリル酸（分子量約１０００）　
１　ｇを水５　ｍｌに溶かして加え、これに２Ｍ　Ｎａ
ＯＨ１ｍｌを加えて室温で４８時間放置した。

反応終了後ゲルを濾別水洗してポリアクリル酸を固定し
たセルロースゲルをえた。片末端にアミノ基を導入した
ポリアクリル酸は、２−アミノエタンチオールを連鎖移
動剤とし、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を
開始剤とするアクリル酸の低重合反応よりえた（「日本
化学会誌、１９７７．８８〜９２頁、「２−ヒドロキシ
エチル−メタクリラート−スチレン系ＡＢＡ型ブロック
共重合体の合成およびその構造とぬれ」、岡野光夫、他
」参照）。

実施例４ 製造例１でえたエポキシ化ゲル５ｍｌに水を加えて全量
を９　ｍｌとした。これにＬ−チロシン０．０９ｇを溶
かした後２Ｎ　ＮａＯＨを加えてｐＨ９とし、室温で２
日間放置した。反応終了後ゲルを濾別水洗し、チロシン
を固定したセルロースゲルをえた。

実施例５ 実施例１〜４でえられた吸着体およびＣＫゲルＡＳ　Ｏ
，５ｍｌをポリプロピレン製試験管にとり、ＳＡＰ蛋白
を含むヒト血清０．５ｍｌを加えた後３７°Ｃで２時間
振盪した。振盪後、上澄み液のＳＡＰ蛋白濃度を固相酵
素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により測定した。

すなわちプレートに、まず希釈した抗ＳＡＰ蛋白抗体（
ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）社製）を滴下し、プレート
に抗体を１晩４℃で静置して固定した。

つぎに抗ＳＡＰ蛋白抗体を固定したプレートに希釈した
検体を滴下し、抗原−抗体反応を室温で１時間行い、洗
浄後ペルオキシダーゼ標識抗ＳＡＰ蛋白抗体を滴下して
同様に抗原−抗体反応を室温で１時間行ない、洗浄後、
酵素発色反応を行ない、その発色の程度をＣ８−９３０
（商品名、■島津製作所製）にて測定（吸光度：　４９
２ｎｍ　）した。第１表に、各吸着体に固定されたアニ
オン性官能基を有する化合物乞および各吸着体のＳＡＰ
吸着率を示す。ＳＡＰ蛋白吸着率は、ＣＫゲルＡ３の上
澄みＳＡＰ蛋白濃度に対する各吸着体の上澄みＳＡＰ蛋
白濃度の減少率で示しである。第１表の結果から、本発
明の吸着体はＳＡＰ蛋白を非常によく吸着することがわ
かる。

第１表 〔発明の効果〕 本発明の吸着体は、安価であり、体液中に含まれるＳＡ
Ｐ蛋白を選択的に除去することができるという効果を奏
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係
を調べた結果を示すグラフである。 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物が
   固定されてなる血清アミロイドＰ蛋白用吸着体。 ２　水不溶性担体が多孔質体である請求項１記載の血清
   アミロイドＰ蛋白用吸着体。 ３　アニオン性官能基が硫酸エステル基、スルホン酸基
   、カルボキシル基およびリン酸エステル基からなる群よ
   り選ばれた少なくとも１種類よりなるものである請求項
   １または２記載の血清アミロイドＰ蛋白用吸着体。 ４　アニオン性官能基を有する化合物が、１分子内に複
   数のアニオン性官能基を有するポリアニオン化合物であ
   る請求項１または２記載の血清アミロイドＰ蛋白用吸着
   体。 ５　水不溶性担体が水酸基を有する化合物よりなる請求
   項１または２記載の血清アミロイドＰ蛋白用吸着体。