JPH0667472B2 - 血清アミロイドｐ蛋白用吸着体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血液などに含まれる血清アミロイドＰ（Serum
Amyloid P、以下SAPという）蛋白を除去するためのSAP
蛋白用吸着体に関する。

〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕

アミロイド−シスはアミロイド物質と呼ばれるβ−フィ
ブリル状の蛋白が血管、臓器およびその他の組織に沈着
し、心、腎などの臓器不全、心刺激伝導障害、進行性痴
呆、脳血管障害、神経障害などの重篤な障害をひきおこ
す痴患である。

アミロイド−シスには原発性、持続性、家族性、老人性
などの病型が存在することが知られており、アミロイド
−シス沈着物質の蛋白組織は病型により異なる。また、
それぞれの病型において沈着するアミロイド物質に対応
する前駆物質が、患者血液中に存在するこが明らかにな
りつつある。

1960年代になって、アミロイド物質には異なる２種類の
ものがあり、一方はアミロイド特有の線維状のもの（am
yloid fibrils）と、他方は五角形をした桿状のもの
（Ｐ−component、AP）とがあることが電子顕微鏡的検
索により明らかになった。すなわち、アルツハイマー病
と老人性痴呆における大脳内の斑を除いたすべての病型
のアミロイド−シスに、アミロイドＰ蛋白（AP）と呼ば
れる物質がβ−フィブリル状の蛋白と結合した状態で見
出されている。APの構造については、分子量23000〜250
00のサブユニット５つから五角形のユニットができ、一
対のユニットがパラレルになった10量体を形成している
といったことが調べられている。

このAPは、正常人血漿蛋白であるSAPと同一であること
が、種々の方法により確認されている。したがってAP
は、循環しているSAPが組織のところで沈着したもので
ある、すなわちSAPはAPの前駆物質であると考えられて
いる。生体内での機能、およびこれらの分子と他のアミ
ロイド物質の沈着との関係についてはよくわかっていな
いが、APはアミロイド線維の不可欠な部分であるとの報
告もあり、SAPの沈着がアミロイド−シスの発病に大き
な意味を持っていると思われる。

アミロイド−シス前記のごとく重篤な疾患であり、死亡
率も高いことからその治療法について盛んに研究されて
きたが、これまでのところ有効な治療法、とくに薬物療
法は見出されていない。

一方近年盛んに行われるようになってきた体外循環によ
る血液浄化法、とりわけプラズマフェレーシスによりア
ミロイド−シスを治療する試みがなされており、前記の
前駆物質を多量に含有する患者血漿を正常血漿と交換す
ることにより症状の軽快、病変の進行停止が見られると
の報告がなされている。

体外循環による血液浄化法とりわけ血漿交換法は現在の
ところもっとも有効な治療法であるが、高価かつ貴重な
正常血漿あるいは血漿製剤を大量に使用すること、また
患者血漿中に含まれる前駆物質以外の有用成分も同時に
廃棄されるなどの欠点を有しているため、SAP蛋白など
の前駆物質をより選択的に除去する方法の開発が強く望
まれている。

本発明は、叙上の問題点を解決し、SAP蛋白を選択的に
除去しうる安価なSAP蛋白吸着体を提供することを目的
とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化
合物が固定されてなるSAP蛋白用吸着体に関する。

〔実施例〕 本明細書において体液とは血液、血漿、血清、腹水、リ
ンパ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、
ならびにその他の生体由来の液性成分をいう。

本発明に用いる水不溶性担体は、多孔質体のもの、とく
に大きな径の連続した細孔を有するものが好ましい。す
なわちSAP蛋白はサブユニットが10量体を形成してお
り、分子量が230000〜250000にも達しているので、これ
を効率よく吸着するためにはSAP蛋白が容易に多孔質担
体内に侵入しうることが必要である。

細孔径の目安として、排除限界分子量がよく用いられ
る。排除限界分子量とは成書（たとえば波多野博行、花
井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフィー、化学同
人）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグ
ラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）
分子のうちもっとも小さい分子量をもつ物の分子量をい
う。

したがって本発明に用いる水不溶性多孔質担体は、その
排除限界分子量が230000以上（球状蛋白を用いてえられ
た値、以下同様）の大きさであることが好ましい。

一方、排除限界分子量が１億をこえるものは吸着体の機
械的強度が弱くなるかまたは吸着体の固形分含量が小さ
すぎて充分な吸着容量がえられないなどの理由から実用
に耐えなくなる傾向がある。したがって、排除限界分子
量は１億以下が好ましく、さらには5000万以下が好まし
い。

つぎに水不溶性担体の多孔構造については表面多孔性よ
りも全多孔性が好ましく、空孔容積が吸着容量が大きい
という点から20％以上であることが好ましい。水不溶性
担体の形状は、粒状、球状、繊維状、膜状、ホローファ
イバー状など任意の形状を選ぶことができる。粒子状の
水不溶性担体を用いるばあい、その粒子径は１μｍ未満
のばあい圧力損失が大きく、5000μｍをこえるばあい吸
着容量が小さい点から１μｍ以上5000μｍ以下であるの
が好ましい。

本発明に用いる水不溶性担体は有機性、無機性いずれで
あってもよいが、目的とするSAP蛋白以外の体液成分の
吸着（いわゆる非特異吸着）の少ないものが好ましい。
親水性である方が非特異吸着が少ないので水不溶性担体
は疎水性であるよりも、親水性であるほうが好ましく、
分子中に水酸基を有する化合物よりなる水不溶性担体が
より好ましい。

本発明に使用する水不溶性担体の代表例としては、アガ
ロース、デキストラン、ポリアクリルアミドなどの軟質
多孔質担体、多孔質ガラス、多孔質シリカゲルなどの無
機多孔質担体、ポリメチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重体などの
合成高分子および／またはセルロースなどの天然高分子
を原料とする多孔質ポリマーハードゲルなどがあげられ
るがこれらに限定されるわけではない。

本発明の吸着体を体外循環治療に用いる際には、血液、
血漿のごとき抗粘性流体を高速で流す必要があるため、
圧密化を引起こさない充分な機械的強度を有する硬質水
不溶性担体を用いるのが好ましい。すなわち硬質担体と
は後記参考例に示すごとく、水不溶性担体は円筒状カラ
ムに均一に充填し、水性流体を流通したばあいの圧力損
失と流速との関係が少なくとも0.3kg／cm²まで直線関係
にあるものをいう。

本発明に用いるアニオン性官能基はpHが中性付近で負に
帯電するような官能基であればいかなるものも使用しう
る。これらの代表例としては、カルボキシル基、スルホ
ン酸基、スルホン基、硫酸エステル基、シラノール基、
リン酸エステル基、フェノール性水酸基などがあげられ
るがこれらに限定されるわけではない。

なかでもカルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル
基およびリン酸エステル基がSAP蛋白に対する親和性が
強く好ましい。

アニオン性官能基を有する化合物としては、分子内に１
つのアニオン性官能基を有するモノアニオン化合物であ
っても、複数のアニオン性官能基を有するポリアニオン
化合物であってもよい。ポリアニオン化合物はSAP蛋白
に対する親和性が大きく、また単位量の担体に多くのア
ニオン性官能基を導入しやすいので好ましい。なかでも
分子量が1000以上のポリアニオン化合物は親和性、アニ
オン性官能基導入量の点で好ましい。アニオン化合物が
有するアニオン性官能基は１種類であってもよいし、２
種類であってもよい。

本発明に用いるポリアニオン化合物の代表例としては、
ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン
酸、ポリビニルリン酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリ
スチレンリン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン
酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、スチレン−マレイ
ン酸共重合体などの合成ポリアニオン化合物、およびヘ
パリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン、コンドロ
イチン硫酸、ホスホマンナン、キチン、キトサンなどの
アニオン性官能基含有多糖類があげられるがこれらに限
定されるわけではない。

本発明の吸着体に固定されているアニオン性官能基を有
する化合物は１種類であってもよいし、２種類以上であ
ってもよい。

本発明の吸着体は、水不溶性担体にアニオン性官能基を
有する化合物が固定された状態のものをいう。そのよう
なアニオン性官能基を有する化合物の固定された状態を
うるためのアニオン性官能基の吸着体への導入方法は種
々あり、いかなる方法で導入してもよいが、代表的な導
入方法としては （１）アニオン性官能基あるいは容易にアニオン性官能
基に変換しうる官能基を含有する化合物をモノマーある
いは架橋剤として用いる重合によって吸着体を形成させ
る方法、 （２）アニオン性官能基を含有する化合物を水不溶性担
体に固定させる方法、 （３）アニオン性官能基を形成する化合物と水不溶性担
体を直接反応させることによって、水不溶性担体にアニ
オン性官能基を有する化合物を固定させる方法 などがあげられる。

もちろんガラス、シリカ、アルミナなどもともとアニオ
ン性官能基を含有するアニオン性官能基含有化合物を吸
着体として用いてもよい。

（１）の方法において用いるアニオン性官能基あるいは
容易にアニオン性官能基に変換しうる官能基を含有する
モノマーあるいは架橋剤の代表例としては、アクリル酸
およびそのエステル、メタクリル酸およびそのエステ
ル、スチレンスルホン酸などがあげられるがこれらに限
定されるわけではない。

（２）の方法、すなわちアニオン性官能基を含有する化
合物を水不溶性担体に固定させる方法としては、物理的
吸着による方法、イオン結合による方法、共有結合によ
り固定する方法などがあり、いかなる方法を用いてもよ
いが、治療目的に吸着体を用いるには、滅菌時あるいは
治療中にアニオン性官能基含有化合物が離脱しないこと
が重要であるので、強固な固定が可能な共有結合法が好
ましい。

共有結合によりアニオン性官能基含有化合物を固定させ
るばあい、アニオン性官能基含有化合物がアニオン性官
能基以外に固定に利用できる官能基を有するのが好まし
い。

固定に利用できる官能基の代表例としては、アミノ基、
アミド基、カルボキシル基、酸無水物基、スクシニルイ
ミド基、水酸基、チオール基、アルデヒド基、ハロゲン
基、エポキシ基、シラノール基などがあげられるがこれ
らに限定されるわけではない。

これらの官能基を有するアニオン性官能基含有化合物は
多数存在するが、タウリン、スルファニル酸、グリシ
ン、ホスホリルエタノールアミン、チロシンなどはその
一例である。

また、アニオン性官能基を含有する化合物のうち硫酸エ
ステル基を含有する化合物の代表例としては、アルコー
ル、糖類、グリコールなどの水酸基含有化合物の硫酸エ
ステルがあげられるが、これらのなかでも多価アルコー
ルの部分硫酸エステル化物、とりわけ糖類の硫酸エステ
ル化物が硫酸エステル基、固定に必要な官能基の双方を
含んでいるうえに、生体適合性および活性ともに高く、
さらに硫酸化多糖類は容易に水不溶性担体に固定しうる
ことからとくに好ましい。

つぎに（３）の方法、すなわちアニオン性官能基を形成
する化合物と水不溶性担体とを反応させることによっ
て、水不溶性担体にアニオン性官能基を有する化合物を
固定させてアニオン性官能基を導入する方法の代表例と
して水酸基含有担体に硫酸エステル基を導入する反応が
あげられる。このばあい、水酸基含有水不溶性担体とク
ロロスルホン酸、濃硫酸などの試薬を反応させることに
よって直接硫酸エステル基を導入することができる。

本発明の吸着体を用いて体液からASP蛋白を除去する方
法には種々あり、いかなる方法を用いてもよいが、流体
の流入口および流出口を有する容器、流体および該流体
に含まれる成分は通過できるが、水不溶性多孔質担体に
アニオン性官能基を有する化合物が固定されてなるSAP
蛋白の吸着体は通過できないフィルター、および前記容
器内に充填された前記SAP蛋白の吸着体からなるSAP蛋白
の除去装置に体液を通液する方法が簡便で好ましい。

参考例 両端に孔径15μｍのフィルターを装着したガラス製カラ
ム（内径9mm、カラム長150mm）にアガロースゲル（Biog
el A5m:商品名、バイオラド社製、粒径50〜100メッシ
ュ）、合成ポリマーよりなるゲル、トヨパールHW65（商
品名、東ソ−（株）製、粒径50〜100μｍ）、および多
孔質セルロースゲル、セルロファインGC−700（商品
名、チッソ（株）製、粒径45〜100μｍ）をそれぞれ均
一に充填し、ペリスタティックポンプによりカラム内に
水を流通し、流速と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。そ
の結果を第１図に示す。同図より明らかなように軟質ゲ
ルであるアガロースゲルは一定の流速以上では圧密化を
起こし、圧力を増加させても流量が増加しないのに対
し、トヨパール、セルロファインなどの硬質ゲルは圧力
の増加にほぼ比例して流量が増加する。

製造例１ 多孔質セルロース担体であるCKゲルA3（商品名、チッソ
（株）製、球状蛋白質の排除限界分子量5000万、粒径63
〜125μｍ）100mlに水100ml、2N水酸化ナトリウムロ水
溶液53ml、エピクロルヒドリン18mlを加え、40℃で２時
間攪拌した。反応後ゲルを濾別、水洗してエポキシ化CK
ゲルA3（以下、エポキシ化ゲルという）をえた。

実施例１ 製造例１でえたエポキシ化ゲル5mlに、スルファニル酸
0.17gを10mlの水に溶解してpH9.9に調整した溶液を加
え、室温で24時間振盪し、0.5％モノエタノールアミン
水溶液を加えて振盪し未反応のエポキシ基を封止してス
ルファニル酸が固定されたセルロースゲルをえた。

実施例２ 製造例１でえたエポキシ化ゲル5mlに、分子量約5000、
イオウ含有18％のデキストラン硫酸ナトリウム4gおよび
水5mlを加えpH9に調整して45℃で16時間振盪した。その
後、ゲルを濾別して、2M食塩水溶液、0.5M食塩水溶液お
よび水を用いてこの順に洗浄し、0.5％モノエタノール
アミン水溶液を加えて室温で振盪し、未反応のエポキシ
基を封止してデキストラン硫酸ナトリウムが固定された
セルロースゲルをえた。

製造例２ 製造例１で用いたものと同種の多孔質セルロース担体
（CKゲルA3）40mlをヘプタン中に懸濁させ全量を70mlと
した。これに20％NaOH10mlおよびノニオン系界面活剤ト
ゥイーン20（商品名、バイオラッド社製）40滴を加え40
℃で30分間振盪した。続いてエピクロルヒドリン10mlを
加え40℃で６時間振盪した。反応終了後ゲルを濾別し、
エタノール、水の順に洗浄してエポキシ化ゲルをえた。

実施例３ 製造例２でえたエポキシ化ゲル10mlに、片末端にアミノ
基を有するポリアクリル酸（分子量約1000）1gを水5ml
に溶かして加え、これに2M NaOH 1mlを加えて室温で48
時間放置した。反応終了後ゲルを濾別水洗してポリアク
リル酸を固定したセルロースゲルをえた。片末端にアミ
ノ基を導入したポリアクリル酸は２−アミノエタンチオ
ールを連鎖移動剤とし、アゾビスイソブチロニトリル
（AIBN）を開始剤とするアクリル酸の低重合反応よりえ
た（「日本化学会誌、1977、88〜92頁、「２−ヒドロキ
シエチル＝メタクリラート−スチレン系ABA型ブロック
共重合体の合成およびその構造とぬれ」、岡野光夫、
他」参照）。

実施例４ 製造例１でえたエポキシ化ゲル5mlに水を加えて全量を9
mlとした。これにＬ−チロシン0.09gを溶かした後2N Na
OHを加えてpH9とし、室温で２日間放置した。反応終了
後ゲルを濾別水洗し、チロシンを固定したセルロースゲ
ルをえた。

実施例５ 実施例１〜４でえられた吸着体およびCKゲルA3 0.5ml
をポリプロピレン製試験管にとり、SAP蛋白を含むヒト
血清0.5mlを加えた後37℃で２時間振盪した。振盪後、
上澄み液のSAP蛋白濃度を固相酵素抗体法（ELISA法）に
より測定した。

すなわちプレートに、まず希釈した抗SAP蛋白抗体（ヘ
キスト（Hoechst）社製）を滴下し、プレートに抗体を
１晩４℃で静置して固定した。

つぎに抗SAP蛋白抗体を固定したプレートに希釈した検
体を滴下し、抗原−抗体反応を室温で１時間行い、洗浄
後ペルオキシダーゼ標識抗SAP蛋白抗体を滴下して同様
に抗原−抗体反応を室温で１時間行ない、洗浄後、酵素
発色反応を行ない、その発色の程度をCS−930（商品
名、（株）島津製作所製）にて測定（吸光度:492nm）し
た。第１表に、各吸着体に固定されたアニオン性官能基
を有する化合物名および各吸着体のSAP吸着率を示す。S
AP蛋白吸着率は、CKゲルA3の上澄みSAP蛋白濃度に対す
る各吸着体の上澄みSAP蛋白濃度の減少率で示してあ
る。第１表の結果から、本発明の吸着体はSAP蛋白を非
常によく吸着することがわかる。

〔発明の効果〕 本発明の吸着体は、安価であり、体液中に含まれるSAP
蛋白を選択的に除去することができるという効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のゲルを用いて流速と圧力損失との関係
を調べた結果を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水不溶性担体にアニオン性官能基を有する
   化合物が固定されてなる血清アミロイドＰ蛋白用吸着
   体。
2. 【請求項２】水不溶性担体が多孔質体である請求項１記
   載の血清アミロイドＰ蛋白用吸着体。
3. 【請求項３】アニオン性官能基が硫酸エステル基、スル
   ホン酸基、カルボキシル基およびリン酸エステル基から
   なる群より選ばれた少なくとも１種類よりなるものであ
   る請求項１または２記載の血清アミロイドＰ蛋白用吸着
   体。
4. 【請求項４】アニオン性官能基を有する化合物が、１分
   子内に複数のアニオン性官能基を有するポリアニオン化
   合物である請求項１または２記載の血清アミロイドＰ蛋
   白用吸着体。
5. 【請求項５】水不溶性担体が水酸基を有する化合物より
   なる請求項１または２記載の血清アミロイドＰ蛋白用吸
   着体。