JPH0220945B2 - - Google Patents
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- JPH0220945B2 JPH0220945B2 JP55075681A JP7568180A JPH0220945B2 JP H0220945 B2 JPH0220945 B2 JP H0220945B2 JP 55075681 A JP55075681 A JP 55075681A JP 7568180 A JP7568180 A JP 7568180A JP H0220945 B2 JPH0220945 B2 JP H0220945B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hepatitis
- antibody
- antigen
- sample
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
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- Communicable Diseases (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は肝炎の抗原および抗体（目じるし即ち
ヌーカー）の検出および測定に用いる固相免疫試
験改良法に関する。
ヌーカー）の検出および測定に用いる固相免疫試
験改良法に関する。
ビールス性肝炎に少なくともはつきりした２種
の型がある。肝炎Ａは肝炎Ａ抗原（HAVAg）に
よつて起るとされており一般に２乃至６週間の培
養期間、軽い前微および比較軽い臨床病を特徴と
している。この病気は一般に汚染された食物又は
液体によつて感染するが、また全身的接種によつ
ても感染するといわれている。肝炎Ａはしばしば
“伝染性肝炎”と呼ばれ、米国においては年間
50000以上の報告例がある。
の型がある。肝炎Ａは肝炎Ａ抗原（HAVAg）に
よつて起るとされており一般に２乃至６週間の培
養期間、軽い前微および比較軽い臨床病を特徴と
している。この病気は一般に汚染された食物又は
液体によつて感染するが、また全身的接種によつ
ても感染するといわれている。肝炎Ａはしばしば
“伝染性肝炎”と呼ばれ、米国においては年間
50000以上の報告例がある。
肝炎Ｂビールスはおそらく“血清肝炎”の病原
体であると信じられている。肝炎Ｂ伝染病は一般
に血液生成物又は針の様な汚染された器具によつ
て感染するが、他の方法によつても感染するだろ
う。従来肝炎Ｂ伝染病は６週間から６ケ月にわた
る培養期間を要した。しかし２週間の様な短期培
養が実証された。この病気は軽く又は徴候がない
が、もし徴候があれば、病状は特に重いだろう。
前徴には関接痛、関節炎、発疹、発熱、食慾不
振、疲労症および掻痒症があり黄だんを伴なつた
り伴なわなかつたりする。
体であると信じられている。肝炎Ｂ伝染病は一般
に血液生成物又は針の様な汚染された器具によつ
て感染するが、他の方法によつても感染するだろ
う。従来肝炎Ｂ伝染病は６週間から６ケ月にわた
る培養期間を要した。しかし２週間の様な短期培
養が実証された。この病気は軽く又は徴候がない
が、もし徴候があれば、病状は特に重いだろう。
前徴には関接痛、関節炎、発疹、発熱、食慾不
振、疲労症および掻痒症があり黄だんを伴なつた
り伴なわなかつたりする。
少なくも３種の異なる抗原―抗体系：表面
（HBsAg：抗―HBs）、“芯”（HBcAg：抗―
HBc）、およびｅ―抗原（HBeAg：抗―HBe）が
肝炎ビールスＢと連合できる。肝炎Ｂ表面抗原
（HBsAg）は血液中に22nm球および直径22nmで
長さは種々の細管として発見され、肝炎Ｂビール
スの蛋白質膜を表わすと信じられる。
（HBsAg：抗―HBs）、“芯”（HBcAg：抗―
HBc）、およびｅ―抗原（HBeAg：抗―HBe）が
肝炎ビールスＢと連合できる。肝炎Ｂ表面抗原
（HBsAg）は血液中に22nm球および直径22nmで
長さは種々の細管として発見され、肝炎Ｂビール
スの蛋白質膜を表わすと信じられる。
DNAおよびDNAポリメラーゼをもつ42nm粒
子は伝染性ビールス（デイン粒子）を表わすと思
われる。デイン粒子表面はHBsAgと似ている又
は同じである。界面活性剤中でデイン粒子は
27nmの電子密度の芯、HBcAgに解離せられる。
後者は真の感染段階中血清肝炎をもつ患者の肝細
胞核中に見られる。
子は伝染性ビールス（デイン粒子）を表わすと思
われる。デイン粒子表面はHBsAgと似ている又
は同じである。界面活性剤中でデイン粒子は
27nmの電子密度の芯、HBcAgに解離せられる。
後者は真の感染段階中血清肝炎をもつ患者の肝細
胞核中に見られる。
したがつてＢ型ビールス性肝炎の患者は表面抗
原に対する抗体（抗―HBs）、また蛋白質芯に対
する抗体（抗―HBc）を生成すると期待される。
血清中のHBsAgは肝炎Ｂビールスの存在した一
貫したマーローであり、また抗―HBcは普通早期
ビールス血症中ひどい肝不調においてまた抗―
HBs出現前にしばしば抗原血（HBsAg）を伴な
つて現われる。抗―HBcは一般にHBsAgの長時
間循環を伴ない、抗―HBcがビールスの活性反応
に応じて生成されることを示唆している。
原に対する抗体（抗―HBs）、また蛋白質芯に対
する抗体（抗―HBc）を生成すると期待される。
血清中のHBsAgは肝炎Ｂビールスの存在した一
貫したマーローであり、また抗―HBcは普通早期
ビールス血症中ひどい肝不調においてまた抗―
HBs出現前にしばしば抗原血（HBsAg）を伴な
つて現われる。抗―HBcは一般にHBsAgの長時
間循環を伴ない、抗―HBcがビールスの活性反応
に応じて生成されることを示唆している。
1972年肝炎ｅ抗原（HBeAg）が検出され特徴
づけられた。ｅマーカーはHBsAg―陽性血清中
に発見されており、普通健康体よりも活性肝病を
もつ慢性HBsAg患者の血清中により普通におこ
ると施われる。肝炎Ｂの培養期間中患者のｅ抗原
はHBsAgの出現直後または臨床的に明らかな肝
障害の現われる前に現われるとわかつた。この様
な血清中のその存在は論理上不十分な予後および
肝障害進行を示すものであろう。逆にｅ抗体（抗
―HBe）の存在はよい予後の表示であろう。こ
れらの関係は絶対的なものでないが、臨床ガイド
には有用であろう。
づけられた。ｅマーカーはHBsAg―陽性血清中
に発見されており、普通健康体よりも活性肝病を
もつ慢性HBsAg患者の血清中により普通におこ
ると施われる。肝炎Ｂの培養期間中患者のｅ抗原
はHBsAgの出現直後または臨床的に明らかな肝
障害の現われる前に現われるとわかつた。この様
な血清中のその存在は論理上不十分な予後および
肝障害進行を示すものであろう。逆にｅ抗体（抗
―HBe）の存在はよい予後の表示であろう。こ
れらの関係は絶対的なものでないが、臨床ガイド
には有用であろう。
肝炎の血清学マーカーが感染、発病および回復
の経過中一貫して連続した順序で現われるので２
又は３以上のマーカーの分析が病気の時間経過を
調べるに価値あるであろう。
の経過中一貫して連続した順序で現われるので２
又は３以上のマーカーの分析が病気の時間経過を
調べるに価値あるであろう。
１より多いマーカーの試験はまたＢ型肝炎の影
響減少の努力における給血者又は患者中のHBs
Agの重要な２重チエツクを可能とする。この必
要なゴールドフイールドらのAm.J.Med.Sci.，
270：335―342（1975）に発表されており、著者ら
はHBsAgに陰性の血液の受血者を注意して調査
し465患者中７人が肝炎抗原に暴露された証拠を
発見した。明らかに肝炎Ｂビールスに対する１よ
り多くのマーカーの検査法が偽陰性の発生を減少
又は防止するにちがいない。同様に多くの場合２
試験に対する陽性応答は１試験において発見され
た偽陽性の可能性を最小とする。
響減少の努力における給血者又は患者中のHBs
Agの重要な２重チエツクを可能とする。この必
要なゴールドフイールドらのAm.J.Med.Sci.，
270：335―342（1975）に発表されており、著者ら
はHBsAgに陰性の血液の受血者を注意して調査
し465患者中７人が肝炎抗原に暴露された証拠を
発見した。明らかに肝炎Ｂビールスに対する１よ
り多くのマーカーの検査法が偽陰性の発生を減少
又は防止するにちがいない。同様に多くの場合２
試験に対する陽性応答は１試験において発見され
た偽陽性の可能性を最小とする。
本発明の試薬（複数）および方法は（複数）ビ
ールス性肝炎に対する種々のマーカー検査用の既
知市販製品および方法と同様であるが、従来上記
マーカーを同時に検査する方法については発表又
は示唆されていないのである。
ールス性肝炎に対する種々のマーカー検査用の既
知市販製品および方法と同様であるが、従来上記
マーカーを同時に検査する方法については発表又
は示唆されていないのである。
したがつて本明細書は試料中の肝炎ビールスに
さらされたことを立証する少なくとも２の異なる
マーカーを同時に検出する試薬と方法を詳細に記
述するものである。
さらされたことを立証する少なくとも２の異なる
マーカーを同時に検出する試薬と方法を詳細に記
述するものである。
その方法は未知マーカーにコンプリメンタリー
（complim―entary）な少なくとも２種の異なる
ノンコンプリメンタリーな免疫反応体で被覆され
ている固体支持体と試料を接触させ、試料をその
固体支持体と共に24時間までの時間培養し、試料
から被覆固体支持体を分離し、上記支持体を洗
い、各々未知肝炎マーカーの一種と反応又は競合
いづれかする様選ばれかつ検出できる異なるラベ
ルをつけられた少なくとも２種の異なる肝炎マー
カー又は免疫反応体より成る液体試薬と上記洗つ
た支持体を接触させ、試薬液から固相を分離し、
かつ固体支持体上のラベルされたマーカーの存在
を各々異なるラベル検出によつて測定することよ
り成る。
（complim―entary）な少なくとも２種の異なる
ノンコンプリメンタリーな免疫反応体で被覆され
ている固体支持体と試料を接触させ、試料をその
固体支持体と共に24時間までの時間培養し、試料
から被覆固体支持体を分離し、上記支持体を洗
い、各々未知肝炎マーカーの一種と反応又は競合
いづれかする様選ばれかつ検出できる異なるラベ
ルをつけられた少なくとも２種の異なる肝炎マー
カー又は免疫反応体より成る液体試薬と上記洗つ
た支持体を接触させ、試薬液から固相を分離し、
かつ固体支持体上のラベルされたマーカーの存在
を各々異なるラベル検出によつて測定することよ
り成る。
上記においてコンプリメンタリーとはお互いの
存在下に反応する抗原及び抗体を意味し、肝炎Ｂ
芯抗原は肝炎Ｂ芯抗体にコンプリメンタリーであ
る。ノンコンプリメンタリーは上記の逆であり、
肝炎Ｂ表面抗原は肝炎Ｂ芯抗体にノンコンプリメ
ンタリーである。
存在下に反応する抗原及び抗体を意味し、肝炎Ｂ
芯抗原は肝炎Ｂ芯抗体にコンプリメンタリーであ
る。ノンコンプリメンタリーは上記の逆であり、
肝炎Ｂ表面抗原は肝炎Ｂ芯抗体にノンコンプリメ
ンタリーである。
次の実施例は本発明の範囲内の代表試薬の製法
および用法を示すものである。実施例は肝炎に
対する露出を立証するマーカーにコンプリメンタ
リーな２種の異なるノンコンプリメンタリーな免
疫反応体で被覆した固体支持体の製法を記述して
いる。
および用法を示すものである。実施例は肝炎に
対する露出を立証するマーカーにコンプリメンタ
リーな２種の異なるノンコンプリメンタリーな免
疫反応体で被覆した固体支持体の製法を記述して
いる。
詳述すれば、固体支持体（小粒）はその反応性
を保持しかつ未知試料中のコンプリメンタリーな
マーカーと結合できる様に２種の異なるノンコン
プリメンタリーな免疫反応体で被覆されている。
を保持しかつ未知試料中のコンプリメンタリーな
マーカーと結合できる様に２種の異なるノンコン
プリメンタリーな免疫反応体で被覆されている。
実施例においてポリスチレン小粒はHBsAg
に対する抗体および芯抗原、HBsAgで被覆され
ている。抗体はその反応性を保持し未知試料中の
どんなHBsAgとも反応しまた添付した芯抗原は
アンチジエニシテイを保持し未知試料中の芯（抗
―HBc）に対するどんな抗体とも反応する。本発
明の要点は両免疫反応が単一固相試薬と同時にお
こる点である。
に対する抗体および芯抗原、HBsAgで被覆され
ている。抗体はその反応性を保持し未知試料中の
どんなHBsAgとも反応しまた添付した芯抗原は
アンチジエニシテイを保持し未知試料中の芯（抗
―HBc）に対するどんな抗体とも反応する。本発
明の要点は両免疫反応が単一固相試薬と同時にお
こる点である。
実施例
被覆支持体の製造
トリス―EDTA―塩溶液（TSE）緩衝液中に
２％２―メルカプトエタノール（２―ME）およ
び５％トウイーン80の溶液にデイン粒子を37℃で
２時間さらしてHBsAg生成を行なつた。この溶
液を５％2ME―TSEで10倍に稀釈し一夜放置し
た後TSE中に１：8000の最終濃度に稀釈した。
別にポリスチレン小粒（1/4″）をりん酸塩で緩衝
した塩溶液（PBS）中抗―HBs血清（モルモツ
ト）の１：2000稀釈液中に２時間浸漬してそれを
被覆した。小粒をとり出し水洗乾燥した。次いで
芯調合液を被覆粒上に注入し室温で２日間おいて
芯抗原を小球に付着させた。小粒を緩衝液から取
出し、水洗し、付着物を安定化するため10％蔗糖
溶液で被覆し風乾した。
２％２―メルカプトエタノール（２―ME）およ
び５％トウイーン80の溶液にデイン粒子を37℃で
２時間さらしてHBsAg生成を行なつた。この溶
液を５％2ME―TSEで10倍に稀釈し一夜放置し
た後TSE中に１：8000の最終濃度に稀釈した。
別にポリスチレン小粒（1/4″）をりん酸塩で緩衝
した塩溶液（PBS）中抗―HBs血清（モルモツ
ト）の１：2000稀釈液中に２時間浸漬してそれを
被覆した。小粒をとり出し水洗乾燥した。次いで
芯調合液を被覆粒上に注入し室温で２日間おいて
芯抗原を小球に付着させた。小粒を緩衝液から取
出し、水洗し、付着物を安定化するため10％蔗糖
溶液で被覆し風乾した。
ポリスチレン小粒が被覆し易くまた取扱い易い
ので好ましいが、種々のプラスチツクス、金属お
よびガラスから成る大きなもの又は小さなものい
づれのどんな固体支持体も容易に被覆できまた本
発明の証明に使用できる。
ので好ましいが、種々のプラスチツクス、金属お
よびガラスから成る大きなもの又は小さなものい
づれのどんな固体支持体も容易に被覆できまた本
発明の証明に使用できる。
小球を先づ芯抗原で被覆した後抗―HBsで被覆
できるが、小球を最初にギニア豚抗―HBs血清で
被覆すると芯抗原の付着が著しく増加することが
認められている。
できるが、小球を最初にギニア豚抗―HBs血清で
被覆すると芯抗原の付着が著しく増加することが
認められている。
また重要なことは肝炎ビールスに関するノンコ
ンプリメンタリーな免疫反応体の他の組合せも使
用できることである。コンプリメンタリーな親和
力は試薬のアンチゲニシテイ（an―tigenicity）
および反応性を減少するであろうから免疫反応体
はもちろんノンコンプリメンタリーでなければな
らない。
ンプリメンタリーな免疫反応体の他の組合せも使
用できることである。コンプリメンタリーな親和
力は試薬のアンチゲニシテイ（an―tigenicity）
および反応性を減少するであろうから免疫反応体
はもちろんノンコンプリメンタリーでなければな
らない。
次の実施例は免疫反応体、放射性ラベル（
125I）された抗―HBsおよびマーカー、反応性酵
母ラベル（山葵ペルオキシダーゼ）された抗―
HBcを含む液相試薬の製法を示すものである。
125I）された抗―HBsおよびマーカー、反応性酵
母ラベル（山葵ペルオキシダーゼ）された抗―
HBcを含む液相試薬の製法を示すものである。
“マーカー”と“免疫反応体”は相互交換的に
使用できるが、“マーカー”とは未知試料中の検
査しようとする抗原又は抗体およびそれと同等の
ものをいう時に使うのがよい。“免疫反応体”と
は検査されるマーカーにコンプリメンタリーな抗
原又は抗体いづれかを説明するに使われる。
使用できるが、“マーカー”とは未知試料中の検
査しようとする抗原又は抗体およびそれと同等の
ものをいう時に使うのがよい。“免疫反応体”と
は検査されるマーカーにコンプリメンタリーな抗
原又は抗体いづれかを説明するに使われる。
したがつて次の実施例では固体支持体上に使わ
れる抗原および抗体は常に未知マーカーの一つに
対し相的であり、したがつて免疫反応体といわれ
る。
れる抗原および抗体は常に未知マーカーの一つに
対し相的であり、したがつて免疫反応体といわれ
る。
液相試薬中のラベルされた表面抗原抗体は未知
マーカー（HBsAg）に対しコンプリメンタリー
であり、したがつてルベルされた免疫反応体とい
う。しかしラベルされた芯抗原は検査されるマー
カーと同一であり、したがつてラベルされたマー
カーという。
マーカー（HBsAg）に対しコンプリメンタリー
であり、したがつてルベルされた免疫反応体とい
う。しかしラベルされた芯抗原は検査されるマー
カーと同一であり、したがつてラベルされたマー
カーという。
実施例
ラベルされた抗体試薬
1/8オンスびんに0.5Mりん酸塩緩衝液（PH7.5）
約0.1ml、少量の５―6mciのNa 125Iおよび精製し
た抗―HBs100mgを加え、全成分を混合しPH7.5―
8.0としてHBsAgに対する抗体（抗―HBs）のよ
う素化（ 125I）を行なつた。この混合物に新し
く生成したクロラミンＴ（PH7.5の0.05Mりん酸塩
緩衝液10ml中に35mg）の溶液50μを加えた。添
加混合後室温で60秒間反応させた。新しく生成し
たメタ亜硫酸ナトリウム溶液（PH7.5の0.05Mり
ん酸塩緩衝液10ml中に35mg）50μを反応混合物
に加えてクロラミンＴを還元しここで反応を停止
させた。
約0.1ml、少量の５―6mciのNa 125Iおよび精製し
た抗―HBs100mgを加え、全成分を混合しPH7.5―
8.0としてHBsAgに対する抗体（抗―HBs）のよ
う素化（ 125I）を行なつた。この混合物に新し
く生成したクロラミンＴ（PH7.5の0.05Mりん酸塩
緩衝液10ml中に35mg）の溶液50μを加えた。添
加混合後室温で60秒間反応させた。新しく生成し
たメタ亜硫酸ナトリウム溶液（PH7.5の0.05Mり
ん酸塩緩衝液10ml中に35mg）50μを反応混合物
に加えてクロラミンＴを還元しここで反応を停止
させた。
反応混合物5μをホワツトマンNo.１紙片上に
おき70％メタノール中で混合物をクロマトグラフ
法にかけ反応効率を検査した。よう素化蛋白質は
元にそのまま残つたが、遊離 125Iは溶媒に移つ
た。蛋白質中の 125Iのパーセントは反応効率パ
ーセントと判断される。
おき70％メタノール中で混合物をクロマトグラフ
法にかけ反応効率を検査した。よう素化蛋白質は
元にそのまま残つたが、遊離 125Iは溶媒に移つ
た。蛋白質中の 125Iのパーセントは反応効率パ
ーセントと判断される。
セフアデツクスＧ―50ゲルカラムを用いて粗よ
う素化抗体を0.9％塩化ナトリウムを含むPH7.8の
0.1Mトリス緩衝液で精製した。カラムを予め牛
血清アルブミンの30％水溶液少量で処理した後
0.9％塩化ナトリウムを含むPH7.0の0.1Mトリス緩
衝液の追加等量で処理した。カラムの上からよう
素化抗体を入れ塩溶液で緩衝したトリス溶液を使
つて洗い出した。カラムから先づラベルされた抗
体が溶離液として得られた。
う素化抗体を0.9％塩化ナトリウムを含むPH7.8の
0.1Mトリス緩衝液で精製した。カラムを予め牛
血清アルブミンの30％水溶液少量で処理した後
0.9％塩化ナトリウムを含むPH7.0の0.1Mトリス緩
衝液の追加等量で処理した。カラムの上からよう
素化抗体を入れ塩溶液で緩衝したトリス溶液を使
つて洗い出した。カラムから先づラベルされた抗
体が溶離液として得られた。
メタ過よう化ナトウムを使つてペルオキシダー
ゼを活性化して肝炎Ｂ芯に対する抗体と山葵ペル
オキシダーゼ（HRP）の結合がなされた。過剰
の過よう化物と副成物はゲル過（セフアデツク
スＧ―25）カラムによつて活性ペルオキシダーゼ
から分離された。次いで活性ペルオキシダーゼは
抗体（抗―HBc）と反応させ自然に反応した。ペ
ルオキシダーゼと抗体の結合を安定化するためほ
う水素化ナトリウムを加えた後残留ほう水素化ナ
トリウムを分解するためアセトンを加えた。
ゼを活性化して肝炎Ｂ芯に対する抗体と山葵ペル
オキシダーゼ（HRP）の結合がなされた。過剰
の過よう化物と副成物はゲル過（セフアデツク
スＧ―25）カラムによつて活性ペルオキシダーゼ
から分離された。次いで活性ペルオキシダーゼは
抗体（抗―HBc）と反応させ自然に反応した。ペ
ルオキシダーゼと抗体の結合を安定化するためほ
う水素化ナトリウムを加えた後残留ほう水素化ナ
トリウムを分解するためアセトンを加えた。
本発明の方法によりラベルされた２抗体を使用
する場合、それらを次の組成：胎牛血清50％、通
常人の血清15％、0.005M EDTA、トウイーン―
20 0.1％、PBS中のチオメルサル0.01％を含む稀
釈液に入入れ稀釈する。
する場合、それらを次の組成：胎牛血清50％、通
常人の血清15％、0.005M EDTA、トウイーン―
20 0.1％、PBS中のチオメルサル0.01％を含む稀
釈液に入入れ稀釈する。
検出できる種々のラベルが使用できること明白
である。当然ながら唯一の必要事項はこれらが別
個に検出できる点である。
である。当然ながら唯一の必要事項はこれらが別
個に検出できる点である。
125Iが容易であるとおり種々のアイソトープ
が使用できる。異種アイソトープそれ自体別個の
検出できるので１マーカー又は免疫反応体が放射
性ラベルされまた他が酵素又は蛋光体でラベルさ
れる必要はない。同様に試薬のラベルされた成分
はすべて異なる基質を必要とする異なる酵素を同
様に容易に使用できて別個に検出できる反応生成
物を生ずる。
が使用できる。異種アイソトープそれ自体別個の
検出できるので１マーカー又は免疫反応体が放射
性ラベルされまた他が酵素又は蛋光体でラベルさ
れる必要はない。同様に試薬のラベルされた成分
はすべて異なる基質を必要とする異なる酵素を同
様に容易に使用できて別個に検出できる反応生成
物を生ずる。
重要なことは肝炎ＡとＢの抗体と抗原はいづれ
も本発明によつてラベルできることである。免疫
化学的に必要な唯一のことはラベルされた成分が
互いに又は測定するマーカーにコンプリメンタリ
ーでないことである。
も本発明によつてラベルできることである。免疫
化学的に必要な唯一のことはラベルされた成分が
互いに又は測定するマーカーにコンプリメンタリ
ーでないことである。
実施例
HBsAgおよび抗―HBcの同時検出
“未知”肝炎マーカーを含む血清試料を反応ト
イレの個々のウエルに加えまた実施例により被
覆したポリスチレン小球を各試料に加えて45℃で
２時間培養した。小球を反応ウエルからとり出し
水洗して過剰の試薬を全部除き実施例によつて
製造した液相試薬0.2mlに加えた。固相と液相を
45℃で１時間培養した。次いで固相を抗体試薬か
ら分離し４回水洗して過剰の試薬を除去した。Ｏ
―フエニレンジアミン（PH5.5の0.1Mくえん酸塩
緩衝液10ml中30mg）を含む試験管に洗つた小球を
入れ30分間培養した。次いで1M HCl1mlを加え
て酵素反応を停止し、試験管を見てラベルされた
酵素と基質の反応から生ずる色の有無を調べた。
色がないか又はうすければ抗―HBcが未知試料中
に存在しかつ被覆した支持体上の反応位置のラベ
ルされた目じるしと競合したことを示したのであ
る。次に小粒上の放射能をガンマー計数管でしら
べCMPを記録した。小粒上の放射能は添付した
抗体に付着しまた放射性ラベルされた抗体の結合
位置を与えた未知試料中にHBsAgがあることを
示した。
イレの個々のウエルに加えまた実施例により被
覆したポリスチレン小球を各試料に加えて45℃で
２時間培養した。小球を反応ウエルからとり出し
水洗して過剰の試薬を全部除き実施例によつて
製造した液相試薬0.2mlに加えた。固相と液相を
45℃で１時間培養した。次いで固相を抗体試薬か
ら分離し４回水洗して過剰の試薬を除去した。Ｏ
―フエニレンジアミン（PH5.5の0.1Mくえん酸塩
緩衝液10ml中30mg）を含む試験管に洗つた小球を
入れ30分間培養した。次いで1M HCl1mlを加え
て酵素反応を停止し、試験管を見てラベルされた
酵素と基質の反応から生ずる色の有無を調べた。
色がないか又はうすければ抗―HBcが未知試料中
に存在しかつ被覆した支持体上の反応位置のラベ
ルされた目じるしと競合したことを示したのであ
る。次に小粒上の放射能をガンマー計数管でしら
べCMPを記録した。小粒上の放射能は添付した
抗体に付着しまた放射性ラベルされた抗体の結合
位置を与えた未知試料中にHBsAgがあることを
示した。
本発明は今や前記のとおり詳細に示した種々の
方法に実施できるし、またこれらの方法はすべて
特許請求の範囲に説明されている。
方法に実施できるし、またこれらの方法はすべて
特許請求の範囲に説明されている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) 肝炎Ｂ芯抗原、および肝炎Ｂ表面抗原に
対する抗体、の両者を同一表面上に被覆した固
相と試料を接触させ、 (b) 試料を上記固相と共に１乃至24時間培養し、 (c) 上記固相を試料から分離し、 (d) 上記固相を洗つて非結合試料を除去し、 (e) 各々検出できる別個のラベルを付けた肝炎Ｂ
表面抗原に対する抗体および肝炎Ｂ芯抗原に対
する抗体を含む液体試薬と上記洗つた固体支持
体を接触させ、 (f) 上記固相をラベルされた抗体試薬から分離
し、かつ (g) 別個のラベルを検出することにより上記固体
支持体上のラベルされた抗体類の存在を決定す
る ことを特徴とする肝炎Ｂ表面抗原、および肝炎Ｂ
芯抗原に対する抗体を試料中に同時検出する方
法。 ２ 表面抗原に対する抗体が放射性ラベルを付け
られておりかつ芯抗原に対する抗体が酵素でラベ
ルをつけられている特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 ３ 放射性ラベルが 125Iでありかつ酵素が山葵
ペルオキシダーゼである特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 ４ 同一表面が、肝炎Ｂ芯抗原、および肝炎Ｂ表
面抗原に対する抗体で被覆された固体支持体から
なる固相免疫試薬。
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| JP2004676A Pending JPH02276969A (ja) | 1979-06-14 | 1990-01-16 | 肝炎の異なるマーカーの同時検出用試薬 |
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