JPH0378992B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0378992B2 JPH0378992B2 JP60265861A JP26586185A JPH0378992B2 JP H0378992 B2 JPH0378992 B2 JP H0378992B2 JP 60265861 A JP60265861 A JP 60265861A JP 26586185 A JP26586185 A JP 26586185A JP H0378992 B2 JPH0378992 B2 JP H0378992B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aminoacylase
- streptomyces
- valine
- enzyme
- twillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の技術分野）
本発明はＤ−アミノアシラーゼ生産能力を持つ
ストレプトミセス・ツイルス（Streptomyces
tuirus）の新規な突然変異株に関する。Ｄ−アミ
ノアシラーゼはＤ−アミノ酸の製造時に有用な酵
素である。
ストレプトミセス・ツイルス（Streptomyces
tuirus）の新規な突然変異株に関する。Ｄ−アミ
ノアシラーゼはＤ−アミノ酸の製造時に有用な酵
素である。
（従来技術）
Ｄ−アミノアシラーゼの製造方法として、これ
までにシユードモナス（Pseudomonas）属細菌
による方法（ネイチヤー（Naiture）、181，1225
（1952））、フアカルタテイブ・メタノール資化性
菌による方法（特開昭55−42534）および本発明
者の一人である杉江らのストレプトミセス
（Streptomyces）属放線菌による方法（特開昭53
−59092）が知られている。
までにシユードモナス（Pseudomonas）属細菌
による方法（ネイチヤー（Naiture）、181，1225
（1952））、フアカルタテイブ・メタノール資化性
菌による方法（特開昭55−42534）および本発明
者の一人である杉江らのストレプトミセス
（Streptomyces）属放線菌による方法（特開昭53
−59092）が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、これらいずれの方法もＤ−選択
性に問題がある。即ち、これらの微生物を用いて
Ｄ−アミノアシラーゼを生産する時、いずれも同
時にＬ−アミノアシラーゼが生産され、採取した
菌体あるいは菌体から超音波等により抽出した粗
酵素波を用いての反応で得られる目的生産物の光
学純度は十分に満足し得るものではない。
性に問題がある。即ち、これらの微生物を用いて
Ｄ−アミノアシラーゼを生産する時、いずれも同
時にＬ−アミノアシラーゼが生産され、採取した
菌体あるいは菌体から超音波等により抽出した粗
酵素波を用いての反応で得られる目的生産物の光
学純度は十分に満足し得るものではない。
（問題点を解決するための手段）
かかる事情を鑑がみ、本発明者らはＤ−アミノ
アシラーゼの工業生産を目的にＤ−アミノアシラ
ーゼ生産菌の改良につき鋭意検討の結果ストレプ
トミセス属のＤ−アミノアシラーゼ生産菌の変異
株の中からＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し
たままで、不要酵素であるＬ−アミノアシラーゼ
生産能が実質的に欠損した菌株を見いだし本発明
を完成した。従来、Ｄ−アミノアシラーゼ生産菌
に関する育種については全く報告はなく、本発明
者らにより、はじめて得られたものである。
アシラーゼの工業生産を目的にＤ−アミノアシラ
ーゼ生産菌の改良につき鋭意検討の結果ストレプ
トミセス属のＤ−アミノアシラーゼ生産菌の変異
株の中からＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し
たままで、不要酵素であるＬ−アミノアシラーゼ
生産能が実質的に欠損した菌株を見いだし本発明
を完成した。従来、Ｄ−アミノアシラーゼ生産菌
に関する育種については全く報告はなく、本発明
者らにより、はじめて得られたものである。
（本発明の微生物）
本発明での突然変異株は、Ｄ−アミノアシラー
ゼ生産能を持つストレプトミセス属に属する菌株
を親培養株に用い、本明細書に記載の、またはそ
の他の突然変異手順を使用して得ることができ
る。具体的には、紫外線、Ｘ−線照射あるいはＮ
−ニトロソグアニジン（NTGと略す）、亜硝酸等
の化学薬剤処理を施して得ることができる。本発
明に特定的に例示されているのはストレプトミセ
ス・ツイルスIFO13418を親株に変異誘導された
ストレプトミセス・ツイルス０−33であつて、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
8446号として寄託されている。ストレプトミセ
ス・ツイルス０−33の形態は親株のストレプトミ
セス・ツイルスIFO13418と区別できない。しか
し、ストレプトミセス・ツイルス０−33は、Ｌ−
アミノアシラーゼ生産能が実質的に欠損している
点で、ストレプトミセス・ツイルスIFO13418と
はつきりと区別できる。
ゼ生産能を持つストレプトミセス属に属する菌株
を親培養株に用い、本明細書に記載の、またはそ
の他の突然変異手順を使用して得ることができ
る。具体的には、紫外線、Ｘ−線照射あるいはＮ
−ニトロソグアニジン（NTGと略す）、亜硝酸等
の化学薬剤処理を施して得ることができる。本発
明に特定的に例示されているのはストレプトミセ
ス・ツイルスIFO13418を親株に変異誘導された
ストレプトミセス・ツイルス０−33であつて、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
8446号として寄託されている。ストレプトミセ
ス・ツイルス０−33の形態は親株のストレプトミ
セス・ツイルスIFO13418と区別できない。しか
し、ストレプトミセス・ツイルス０−33は、Ｌ−
アミノアシラーゼ生産能が実質的に欠損している
点で、ストレプトミセス・ツイルスIFO13418と
はつきりと区別できる。
（変異株の培養方法）
本発明の変異株は、通常の栄養源、即ち炭素
源、窒素源、無機塩類の存在下で行なわれる。こ
の酵素生産誘導物質として、Ｄ−またはDL−フ
エニルグリシン、Ｄ−またはDL−バリン、Ｄ−
またはDL−ロイシンなどのＤ−またはDL−アミ
ノ酸、またはＤ−またはDL−アミノ酸の誘導体、
例えばＮ−アセチル−Ｄ−またはDL−フエニル
グリシンなどを例示できる。また窒素源としては
有機窒素の添加が必要で、例えばポリペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーな
どを適宜添加し、また必要に応じて、培地１ml当
たり100μｇ程度の塩化コバルトを添加してもよ
い。培養はPH５〜８の範囲で可能であるが、PH６
〜７の範囲内で行なうのがより望ましく、また培
養温度は20〜37℃の範囲で可能であるが、30℃が
より望ましい。培養には酸素の供給が必要で、通
気攪はんを行なう必要がある。
源、窒素源、無機塩類の存在下で行なわれる。こ
の酵素生産誘導物質として、Ｄ−またはDL−フ
エニルグリシン、Ｄ−またはDL−バリン、Ｄ−
またはDL−ロイシンなどのＤ−またはDL−アミ
ノ酸、またはＤ−またはDL−アミノ酸の誘導体、
例えばＮ−アセチル−Ｄ−またはDL−フエニル
グリシンなどを例示できる。また窒素源としては
有機窒素の添加が必要で、例えばポリペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカーな
どを適宜添加し、また必要に応じて、培地１ml当
たり100μｇ程度の塩化コバルトを添加してもよ
い。培養はPH５〜８の範囲で可能であるが、PH６
〜７の範囲内で行なうのがより望ましく、また培
養温度は20〜37℃の範囲で可能であるが、30℃が
より望ましい。培養には酸素の供給が必要で、通
気攪はんを行なう必要がある。
（酵素の回収と反応方法）
本菌株から得られるＤ−アミノアシラーゼは主
に菌体内に生産されるので、得られた菌体を水洗
後、酵素剤として回収してもよく、あるいは、常
法により菌体を破砕またはリゾチーム等で溶菌し
て酵素を抽出し、これを酵素剤として回収しても
よい。酵素剤で連続酵素反応を行なうには、水洗
菌体をそのまま使用してもよく、またこれをポリ
アクリルアミド等で包括したり、菌体から抽出し
た酵素を常法により固定化したものも使用可能で
ある。
に菌体内に生産されるので、得られた菌体を水洗
後、酵素剤として回収してもよく、あるいは、常
法により菌体を破砕またはリゾチーム等で溶菌し
て酵素を抽出し、これを酵素剤として回収しても
よい。酵素剤で連続酵素反応を行なうには、水洗
菌体をそのまま使用してもよく、またこれをポリ
アクリルアミド等で包括したり、菌体から抽出し
た酵素を常法により固定化したものも使用可能で
ある。
（発明の効果）
本発明で得られた菌株により、Ｄ−アミノ酸等
の、有用な光学活性化合物の製造に際し、菌体か
らの抽出酵素、または菌体をそのまま酵素反応に
利用するいずれの方法でも高い光学純度のＤ−ア
ミノ酸等を得ることができ産業上の効果は極めて
大きい。
の、有用な光学活性化合物の製造に際し、菌体か
らの抽出酵素、または菌体をそのまま酵素反応に
利用するいずれの方法でも高い光学純度のＤ−ア
ミノ酸等を得ることができ産業上の効果は極めて
大きい。
以下、本発明を実施例により詳述するが本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。
はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
(a) ストレプトミセス・ツイルスIFO13418から
突然変異株ストレプトミセス・ツイルス０−33
の製造。
突然変異株ストレプトミセス・ツイルス０−33
の製造。
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418を第一
表に示す寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を
0.01％ツイーン80を含む生理食塩水に懸濁させ
る。これを無菌ガーゼでろ過し胞子懸濁液（106
〜107コ／mlの胞子を含む）を得る。これにNTG
を加え（濃度29μｇ／ml）、30℃で30〜90分イン
キユベートする。続いて胞子を生理食塩水で２回
洗浄した後、第一表に示す寒天平板培地に塗沫
し、30℃で、６〜12日培養した。生育したコロニ
ーを第二表に示す液体培地で30℃、２〜４日間培
養する。得られた菌体を集め0.1Mリン酸バツフ
アー（PH７）で洗浄した後、Ｎ−アセチル−Ｌ−
アミノ酸と共に30℃で24時間反応させる。菌体を
除いた反応液中のアミノ酸の有無をニンヒドリン
発色法でチエツクすることによりＬ−アミノアシ
ラーゼ生産能の低下または欠損した変異株を選抜
した。さらにＮ−アセチル−DL−アミノ酸を基
質にした反応で二次評価を行ない、親株と同等以
上のＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し、かつ
Ｌ−アミノアシラーゼ生産能の著しく低下した変
異株ストレプトミセス・ツイルス０−33（微工研
菌寄第8446号）を得た。
表に示す寒天斜面培地で培養し、生育した菌体を
0.01％ツイーン80を含む生理食塩水に懸濁させ
る。これを無菌ガーゼでろ過し胞子懸濁液（106
〜107コ／mlの胞子を含む）を得る。これにNTG
を加え（濃度29μｇ／ml）、30℃で30〜90分イン
キユベートする。続いて胞子を生理食塩水で２回
洗浄した後、第一表に示す寒天平板培地に塗沫
し、30℃で、６〜12日培養した。生育したコロニ
ーを第二表に示す液体培地で30℃、２〜４日間培
養する。得られた菌体を集め0.1Mリン酸バツフ
アー（PH７）で洗浄した後、Ｎ−アセチル−Ｌ−
アミノ酸と共に30℃で24時間反応させる。菌体を
除いた反応液中のアミノ酸の有無をニンヒドリン
発色法でチエツクすることによりＬ−アミノアシ
ラーゼ生産能の低下または欠損した変異株を選抜
した。さらにＮ−アセチル−DL−アミノ酸を基
質にした反応で二次評価を行ない、親株と同等以
上のＤ−アミノアシラーゼ生産能を維持し、かつ
Ｌ−アミノアシラーゼ生産能の著しく低下した変
異株ストレプトミセス・ツイルス０−33（微工研
菌寄第8446号）を得た。
(b) 変異株の評価
可溶性デンプン２％、マルトース１％、グリセ
リン１％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5
％、肉エキス1.5％、コーンスチープリカ−１％、
NaC10.5％、DL−バリン1.5％を含む栄養培地
（PH7.0）100mlに変異株０−33株（微工研菌寄第
8446号）の胞子を接種し30℃、毎分110回転で４
日間培養した。培養液から菌体を集め生理食塩水
で十分洗浄した後、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁し、超音波破砕器（19.5KHz）で細胞を破
砕する。遠心分離で細胞の破片を除去して、Ｄ−
アミノアシラーゼの粗酵素液を得た。酵素反応は
0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質とし
て培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて、30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は、
HPLCで行なつた。分析方法はダイセル化学工業
製光学分割カラムWHを用いる方法および、キラ
ルモビールフエイズ法（J.Am.Chem.Soc.102，
5115（1980））の二つの方法で行なつた。その結
果、24時間反応後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの
99.5％がＤ−バリンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−バリンは、ほとんど反応せず、わずか
に0.4％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第１図に示した。培
養液１ml中の酵素が１時間に1μモルのＤ−バリ
ンを生ずる酵素活性を１単位とするとき、Ｄ−ア
ミノアシラーゼ活性は37単位であつた。
リン１％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5
％、肉エキス1.5％、コーンスチープリカ−１％、
NaC10.5％、DL−バリン1.5％を含む栄養培地
（PH7.0）100mlに変異株０−33株（微工研菌寄第
8446号）の胞子を接種し30℃、毎分110回転で４
日間培養した。培養液から菌体を集め生理食塩水
で十分洗浄した後、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁し、超音波破砕器（19.5KHz）で細胞を破
砕する。遠心分離で細胞の破片を除去して、Ｄ−
アミノアシラーゼの粗酵素液を得た。酵素反応は
0.05MのＮ−アセチル−DL−バリンを基質とし
て培養液１mlに相当する粗酵素液を用いて、30
℃、24時間反応させた。反応生成物の分析は、
HPLCで行なつた。分析方法はダイセル化学工業
製光学分割カラムWHを用いる方法および、キラ
ルモビールフエイズ法（J.Am.Chem.Soc.102，
5115（1980））の二つの方法で行なつた。その結
果、24時間反応後、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの
99.5％がＤ−バリンに転換した。一方、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−バリンは、ほとんど反応せず、わずか
に0.4％がＬ−バリンに転換した。キラルモビー
ルフエイズ法での分析結果を第１図に示した。培
養液１ml中の酵素が１時間に1μモルのＤ−バリ
ンを生ずる酵素活性を１単位とするとき、Ｄ−ア
ミノアシラーゼ活性は37単位であつた。
一方、上記と同様の培養培地100mlに親株であ
るストレプトミセス・ツイルスIFO13418の胞子
を接種し30℃、毎分110回転の培養条件で４日間
培養した。このものから上記と同様の方法で粗酵
素液を得た。培養液１mlに相当するこの粗酵素液
をもちいて、0.05MのＮ−アセチル−DL−バリ
ンを基質として、30℃、24時間反応させた。反応
生成物を分析した結果、24時間反応後、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−バリンの90％がＤ−バリンに転換して
いた。一方のＮ−アセチル−Ｌ−バリンは48.6％
がＬ−バリンに転換していた。キラルモビールフ
エイズ法での分析結果を第２図に示した。
るストレプトミセス・ツイルスIFO13418の胞子
を接種し30℃、毎分110回転の培養条件で４日間
培養した。このものから上記と同様の方法で粗酵
素液を得た。培養液１mlに相当するこの粗酵素液
をもちいて、0.05MのＮ−アセチル−DL−バリ
ンを基質として、30℃、24時間反応させた。反応
生成物を分析した結果、24時間反応後、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−バリンの90％がＤ−バリンに転換して
いた。一方のＮ−アセチル−Ｌ−バリンは48.6％
がＬ−バリンに転換していた。キラルモビールフ
エイズ法での分析結果を第２図に示した。
第１図はストレプトミセス・ツイルス０−33を
用いて得られた酵素反応液の、HPLCによる分析
のクロマトグラムを示したものである。第２図は
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418を用いて
得られた酵素反応液の、HPLCによる分析のクロ
マトグラムを示したものである。 第一表 酵母エキス １ｇ 肉エキス １ｇ NZアミンタイプＡ ２ｇ マルトース 10ｇ 寒天 20ｇ 蒸留水 １ PH＝7.3 第二表 可溶性デンプン 20ｇ マルトース 10ｇ グリセリン 10ｇ ポリペプトン ５ｇ 酵母エキス ５ｇ 肉エキス 15ｇ コーンスチープリカー 10ｇ 食塩 ５ｇ DL−バリン 15ｇ 蒸留水 １ PH＝7.0
用いて得られた酵素反応液の、HPLCによる分析
のクロマトグラムを示したものである。第２図は
ストレプトミセス・ツイルスIFO13418を用いて
得られた酵素反応液の、HPLCによる分析のクロ
マトグラムを示したものである。 第一表 酵母エキス １ｇ 肉エキス １ｇ NZアミンタイプＡ ２ｇ マルトース 10ｇ 寒天 20ｇ 蒸留水 １ PH＝7.3 第二表 可溶性デンプン 20ｇ マルトース 10ｇ グリセリン 10ｇ ポリペプトン ５ｇ 酵母エキス ５ｇ 肉エキス 15ｇ コーンスチープリカー 10ｇ 食塩 ５ｇ DL−バリン 15ｇ 蒸留水 １ PH＝7.0
Claims (1)
- １ Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を持ち、かつＬ
−アミノアシラーゼ生産能が実質的に欠損するこ
とを特徴とするストレプトミセス・ツイルス。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60265861A JPS62126969A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | ストレプトミセス・ツイルス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60265861A JPS62126969A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | ストレプトミセス・ツイルス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62126969A JPS62126969A (ja) | 1987-06-09 |
| JPH0378992B2 true JPH0378992B2 (ja) | 1991-12-17 |
Family
ID=17423101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60265861A Granted JPS62126969A (ja) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | ストレプトミセス・ツイルス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62126969A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2593389B2 (ja) * | 1992-06-22 | 1997-03-26 | コ−ケンメディカル株式会社 | 経皮酸素・二酸化炭素分圧測定装置センサの自動較正装置及び自動較正方法 |
-
1985
- 1985-11-26 JP JP60265861A patent/JPS62126969A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62126969A (ja) | 1987-06-09 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |